JP2001270900A - フィブリノゲンのウイルス不活化法 - Google Patents
フィブリノゲンのウイルス不活化法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ウイルス夾雑の危惧のあるフィブリノゲンの乾
燥加熱によるウイルス不活化法において、加熱によるフ
ィブリノゲンの変性、失活率が低く、且つ得られたフィ
ブリノゲンの溶解性や溶状が良好であるウイルス不活化
法の提供。 【解決手段】フィブリノゲン、塩基性アミノ酸および塩
化ナトリウムを共存させた水溶液を凍結乾燥し、加熱す
ることにより前記課題を解決した。
燥加熱によるウイルス不活化法において、加熱によるフ
ィブリノゲンの変性、失活率が低く、且つ得られたフィ
ブリノゲンの溶解性や溶状が良好であるウイルス不活化
法の提供。 【解決手段】フィブリノゲン、塩基性アミノ酸および塩
化ナトリウムを共存させた水溶液を凍結乾燥し、加熱す
ることにより前記課題を解決した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ウイルス夾雑の危
惧のあるフィブリノゲン水溶液を乾燥し、乾燥状態で加
熱してウイルスを不活化する方法に関する。さらに詳し
くは、乾燥加熱によるウイルス不活化の際、フィブリノ
ゲンの変性、失活の割合が極めて低く、ウイルス不活化
後のフィブリノゲンの水に対する溶解性が良好で、且つ
其の溶状も安定したものとなる、フィブリノゲンのウイ
ルス不活化法に関する。
惧のあるフィブリノゲン水溶液を乾燥し、乾燥状態で加
熱してウイルスを不活化する方法に関する。さらに詳し
くは、乾燥加熱によるウイルス不活化の際、フィブリノ
ゲンの変性、失活の割合が極めて低く、ウイルス不活化
後のフィブリノゲンの水に対する溶解性が良好で、且つ
其の溶状も安定したものとなる、フィブリノゲンのウイ
ルス不活化法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒト血漿、その誘導画分等の血液製剤
は、エイズウイルス、各種肝炎ウイルス、ヒトパルボウ
イルスＢ１９などのウイルスにより汚染されている可能
性がある。したがって、これらを使用した治療用薬剤の
製造に際しては、ウイルスを充分に不活化する工程を組
み込むことが必須である。血液製剤中に夾雑してくる危
惧のあるウイルスを不活化する方法としては、水溶液状
態での加熱処理方法（以下、液状加熱法という。）がMu
rrayら（The NewYork Academy of Medicine，３１
巻（５），３４１〜３５８（１９５５））により提案さ
れ、以来この方法は血液製剤のウイルス不活化法として
広く使用されている。しかしこの液状加熱法に耐え得る
熱に対する安定性の高い血漿蛋白としては、アルブミン
など極く一部に限られ、他の多くの血漿蛋白は熱に不安
定で、この方法によっては変性，失活する割合が高い。
そこで液状加熱法とは別に、乾燥状態で血漿蛋白を加熱
処理してウイルスを不活化する方法（以下、乾燥加熱法
という。）が提案された（特表昭５８−５００５４
８）。この方法は、液状加熱法に比して血漿蛋白の変
性、失活が多少低く抑えられるものの、未だ充分なもの
ではない。また、乾燥加熱時に或る種の安定化剤を添加
する方法も試みられているが満足の行く結果は得られて
いない。さらに、加熱後フィブリノゲンの水に対する溶
解性が悪くなったり、一旦溶解した後、時間の経過とと
もに一部再凝集が起こるなど溶状が不安定になるという
問題があった。
は、エイズウイルス、各種肝炎ウイルス、ヒトパルボウ
イルスＢ１９などのウイルスにより汚染されている可能
性がある。したがって、これらを使用した治療用薬剤の
製造に際しては、ウイルスを充分に不活化する工程を組
み込むことが必須である。血液製剤中に夾雑してくる危
惧のあるウイルスを不活化する方法としては、水溶液状
態での加熱処理方法（以下、液状加熱法という。）がMu
rrayら（The NewYork Academy of Medicine，３１
巻（５），３４１〜３５８（１９５５））により提案さ
れ、以来この方法は血液製剤のウイルス不活化法として
広く使用されている。しかしこの液状加熱法に耐え得る
熱に対する安定性の高い血漿蛋白としては、アルブミン
など極く一部に限られ、他の多くの血漿蛋白は熱に不安
定で、この方法によっては変性，失活する割合が高い。
そこで液状加熱法とは別に、乾燥状態で血漿蛋白を加熱
処理してウイルスを不活化する方法（以下、乾燥加熱法
という。）が提案された（特表昭５８−５００５４
８）。この方法は、液状加熱法に比して血漿蛋白の変
性、失活が多少低く抑えられるものの、未だ充分なもの
ではない。また、乾燥加熱時に或る種の安定化剤を添加
する方法も試みられているが満足の行く結果は得られて
いない。さらに、加熱後フィブリノゲンの水に対する溶
解性が悪くなったり、一旦溶解した後、時間の経過とと
もに一部再凝集が起こるなど溶状が不安定になるという
問題があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】フィブリノゲンは、他
の血漿蛋白製剤に比べてウイルス夾雑の危険性が高いと
云われている。このためウイルスの不活化については他
の血液製剤より更に厳重に処理する必要がある。ウイル
スの不活化法としては、上述の液状加熱法、乾燥加熱法
やソルベント・デタージエント（ＳＤ）法などがあり、
また、ウイルス除去法としては、ウイルス除去フィルタ
ーによるウイルス除去処理などが知られている。これら
の方法を複数組み合わせることはウイルス不活化の完璧
を期すための有効な手段と考えられるが、そのためには
各処理工程におけるフィブリノゲンの変性、失活を極力
抑えること、およびそれら一連の工程におけるフィブリ
ノゲンの溶解性が常に良好に保たれることが重要となっ
てくる。本発明の課題は、ウイルス夾雑の危惧のあるフ
ィブリノゲンのウイルス不活化法において、これまでの
どの方法よりも、変性、失活率を低く抑えることができ
る方法を提供することにある。さらに他の課題はウイル
ス不活化後も、水に対する溶解性や溶解状態が良好なフ
ィブリノゲンを提供することにある。
の血漿蛋白製剤に比べてウイルス夾雑の危険性が高いと
云われている。このためウイルスの不活化については他
の血液製剤より更に厳重に処理する必要がある。ウイル
スの不活化法としては、上述の液状加熱法、乾燥加熱法
やソルベント・デタージエント（ＳＤ）法などがあり、
また、ウイルス除去法としては、ウイルス除去フィルタ
ーによるウイルス除去処理などが知られている。これら
の方法を複数組み合わせることはウイルス不活化の完璧
を期すための有効な手段と考えられるが、そのためには
各処理工程におけるフィブリノゲンの変性、失活を極力
抑えること、およびそれら一連の工程におけるフィブリ
ノゲンの溶解性が常に良好に保たれることが重要となっ
てくる。本発明の課題は、ウイルス夾雑の危惧のあるフ
ィブリノゲンのウイルス不活化法において、これまでの
どの方法よりも、変性、失活率を低く抑えることができ
る方法を提供することにある。さらに他の課題はウイル
ス不活化後も、水に対する溶解性や溶解状態が良好なフ
ィブリノゲンを提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するため種々研究を重ねた結果、フィブリノゲン
水溶液の凍結乾燥およびそれに続く加熱処理時に、塩基
性アミノ酸、特にリジンおよび／またはアルギニンと塩
化ナトリウムを共存させておくと、フィブリノゲンは凍
結乾燥や長時間の加熱処理に対しても極めて高い安定性
を示し、且つ加熱処理によりウイルスが不活化されたフ
ィブリノゲンは水に対する溶解性及び溶状が極めて良好
なことを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成し
た。すなわち、本発明は、（１）ウイルス夾雑の危惧の
あるフィブリノゲン、塩基性アミノ酸および塩化ナトリ
ウムを含む水溶液を乾燥した後、ウイルスが不活化され
るまで加熱するフィブリノゲンのウイルス不活化法、
（２）塩基性アミノ酸がリジンまたはアルギニンである
前記（１）記載のウイルス不活化法、（３）塩基性アミ
ノ酸がリジンである前記（１）記載のウイルス不活化
法、（４）塩基性アミノ酸がリジンおよびアルギニンで
ある前記（１）記載のウイルス不活化法、（５）水溶液
がフィブリノゲンと、フィブリノゲンに対し４〜４０ｗ
／ｗ％の塩基性アミノ酸および５〜２５ｗ／ｗ％の塩化
ナトリウムを含有するものである前記（１）記載のウイ
ルス不活化法、（６）水溶液がフィブリノゲンと、フィ
ブリノゲンに対し、２〜２０ｗ／ｗ％のリジンおよび５
〜２５ｗ／ｗ％の塩化ナトリウムを含有する前記（１）
記載のウイルス不活化法、（７）水溶液がフィブリノゲ
ンと、フィブリノゲンに対し、２〜２０ｗ／ｗ％のリジ
ン、２〜２０ｗ／ｗ％のアルギニンおよび５〜２５ｗ／
ｗ％の塩化ナトリウムを含有する前記（１）記載のウイ
ルス不活化法、（８）加熱を５０〜８０℃、２４〜１９
２時間行う前記（１）記載のウイルス不活化法、（９）
乾燥したフィブリノゲンが水分３ｗ／ｗ％以下のもので
ある前記（１）記載のウイルス不活化法、および（１
０）前記（１）〜（９）のいずれかに記載のウイルス不
活化法によりウイルスが不活化されたフィブリノゲン、
である。
を解決するため種々研究を重ねた結果、フィブリノゲン
水溶液の凍結乾燥およびそれに続く加熱処理時に、塩基
性アミノ酸、特にリジンおよび／またはアルギニンと塩
化ナトリウムを共存させておくと、フィブリノゲンは凍
結乾燥や長時間の加熱処理に対しても極めて高い安定性
を示し、且つ加熱処理によりウイルスが不活化されたフ
ィブリノゲンは水に対する溶解性及び溶状が極めて良好
なことを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成し
た。すなわち、本発明は、（１）ウイルス夾雑の危惧の
あるフィブリノゲン、塩基性アミノ酸および塩化ナトリ
ウムを含む水溶液を乾燥した後、ウイルスが不活化され
るまで加熱するフィブリノゲンのウイルス不活化法、
（２）塩基性アミノ酸がリジンまたはアルギニンである
前記（１）記載のウイルス不活化法、（３）塩基性アミ
ノ酸がリジンである前記（１）記載のウイルス不活化
法、（４）塩基性アミノ酸がリジンおよびアルギニンで
ある前記（１）記載のウイルス不活化法、（５）水溶液
がフィブリノゲンと、フィブリノゲンに対し４〜４０ｗ
／ｗ％の塩基性アミノ酸および５〜２５ｗ／ｗ％の塩化
ナトリウムを含有するものである前記（１）記載のウイ
ルス不活化法、（６）水溶液がフィブリノゲンと、フィ
ブリノゲンに対し、２〜２０ｗ／ｗ％のリジンおよび５
〜２５ｗ／ｗ％の塩化ナトリウムを含有する前記（１）
記載のウイルス不活化法、（７）水溶液がフィブリノゲ
ンと、フィブリノゲンに対し、２〜２０ｗ／ｗ％のリジ
ン、２〜２０ｗ／ｗ％のアルギニンおよび５〜２５ｗ／
ｗ％の塩化ナトリウムを含有する前記（１）記載のウイ
ルス不活化法、（８）加熱を５０〜８０℃、２４〜１９
２時間行う前記（１）記載のウイルス不活化法、（９）
乾燥したフィブリノゲンが水分３ｗ／ｗ％以下のもので
ある前記（１）記載のウイルス不活化法、および（１
０）前記（１）〜（９）のいずれかに記載のウイルス不
活化法によりウイルスが不活化されたフィブリノゲン、
である。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明のウイルス不活化の対象と
なるフィブリノゲン水溶液は、たとえば、ヒト血漿由来
のコーンフラクションＩまたはクリオペーストをクエン
酸ナトリウム水溶液に溶解し、必要により濾過助剤を使
用した濾過、濃度の異なるエタノールによる精製、ウイ
ルス除去フィルターによるウイルス除去処理などを行っ
て得られた精製フィブリノゲンであることが好ましい。
このフィブリノゲンは、上述の特殊な濾過、精製法によ
りウイルス夾雑の可能性は低くはなっているものの、そ
の存在を完全に否定することはできない。本発明におい
ては、フィブリノゲン水溶液に、塩基性アミノ酸および
塩化ナトリウムを添加し、必要によりウイルス除去フイ
ルターよるウイルス除去処理や限外濾過濃縮を行った
後、好ましくは室温以下の低温で乾燥、さらに好ましく
は凍結乾燥する。塩基性アミノ酸としては、リジン、ア
ルギニンなどが挙げられる。フィブリノゲンに対する塩
基性アミノ酸の添加率は４〜４０ｗ／ｗ％、好ましくは
６〜３５ｗ／ｗ％である。特に、リジン、アルギニンを
用いる場合、それぞれを２〜２０ｗ／ｗ％、好ましくは
３〜１７．５ｗ／ｗ％配合するのがよい。またフィブリ
ノゲンに対する塩化ナトリウムの添加率は５〜２５ｗ／
ｗ％、好ましくは８〜１８ｗ／ｗ％である。塩基性アミ
ノ酸および食塩を添加する時期は、加熱する前のどの工
程でもかまわないが、濃度の異なるエタノールによる精
製後で、ウイルス除去フィルターによる処理の前が好ま
しい。
なるフィブリノゲン水溶液は、たとえば、ヒト血漿由来
のコーンフラクションＩまたはクリオペーストをクエン
酸ナトリウム水溶液に溶解し、必要により濾過助剤を使
用した濾過、濃度の異なるエタノールによる精製、ウイ
ルス除去フィルターによるウイルス除去処理などを行っ
て得られた精製フィブリノゲンであることが好ましい。
このフィブリノゲンは、上述の特殊な濾過、精製法によ
りウイルス夾雑の可能性は低くはなっているものの、そ
の存在を完全に否定することはできない。本発明におい
ては、フィブリノゲン水溶液に、塩基性アミノ酸および
塩化ナトリウムを添加し、必要によりウイルス除去フイ
ルターよるウイルス除去処理や限外濾過濃縮を行った
後、好ましくは室温以下の低温で乾燥、さらに好ましく
は凍結乾燥する。塩基性アミノ酸としては、リジン、ア
ルギニンなどが挙げられる。フィブリノゲンに対する塩
基性アミノ酸の添加率は４〜４０ｗ／ｗ％、好ましくは
６〜３５ｗ／ｗ％である。特に、リジン、アルギニンを
用いる場合、それぞれを２〜２０ｗ／ｗ％、好ましくは
３〜１７．５ｗ／ｗ％配合するのがよい。またフィブリ
ノゲンに対する塩化ナトリウムの添加率は５〜２５ｗ／
ｗ％、好ましくは８〜１８ｗ／ｗ％である。塩基性アミ
ノ酸および食塩を添加する時期は、加熱する前のどの工
程でもかまわないが、濃度の異なるエタノールによる精
製後で、ウイルス除去フィルターによる処理の前が好ま
しい。
【０００６】より具体的には、溶液中の精製フィブリノ
ゲンの濃度が９〜１１ｗ／ｖ％、塩基性アミノ酸の濃度
が０．７〜３．５ｗ／ｖ％、塩化ナトリウムの濃度が
０．７〜１．６ｗ／ｖ％となるよう調製するのがよい。
このフィブリノゲン、塩基性アミノ酸および塩化ナトリ
ウムを含む水溶液は、水分が３ｗ／ｗ％以下、好ましく
は１．５ｗ／ｗ％以下となるよう乾燥する。乾燥条件は
低温における乾燥が望ましく、特に凍結乾燥が好まし
い。乾燥により得られる組成物の形状は粉末状、塊状、
鱗片状などがあるがそのいずれでもよい。このようにし
て得られた乾燥フィブリノゲンを、ウイルスが不活化さ
れるまで加熱する。加熱の方法はどのような手段でもよ
いが、赤外線照射、砂浴、水浴、オーブンによる加熱等
が挙げられる。加熱時の雰囲気は通常大気圧の空気が用
いられるが、必要により減圧空気、窒素、その他の不活
性ガスであっても差し支えない。加熱温度は通常５０〜
８０℃、好ましくは５５〜７５℃、さらに好ましくは６
０〜７０℃である。加熱時間は通常２４〜１９２時間、
好ましくは４８〜１６８時間、さらに好ましくは７２〜
１４４時間である。
ゲンの濃度が９〜１１ｗ／ｖ％、塩基性アミノ酸の濃度
が０．７〜３．５ｗ／ｖ％、塩化ナトリウムの濃度が
０．７〜１．６ｗ／ｖ％となるよう調製するのがよい。
このフィブリノゲン、塩基性アミノ酸および塩化ナトリ
ウムを含む水溶液は、水分が３ｗ／ｗ％以下、好ましく
は１．５ｗ／ｗ％以下となるよう乾燥する。乾燥条件は
低温における乾燥が望ましく、特に凍結乾燥が好まし
い。乾燥により得られる組成物の形状は粉末状、塊状、
鱗片状などがあるがそのいずれでもよい。このようにし
て得られた乾燥フィブリノゲンを、ウイルスが不活化さ
れるまで加熱する。加熱の方法はどのような手段でもよ
いが、赤外線照射、砂浴、水浴、オーブンによる加熱等
が挙げられる。加熱時の雰囲気は通常大気圧の空気が用
いられるが、必要により減圧空気、窒素、その他の不活
性ガスであっても差し支えない。加熱温度は通常５０〜
８０℃、好ましくは５５〜７５℃、さらに好ましくは６
０〜７０℃である。加熱時間は通常２４〜１９２時間、
好ましくは４８〜１６８時間、さらに好ましくは７２〜
１４４時間である。
【０００７】このようにして加熱した乾燥フィブリノゲ
ンは、夾雑するウイルスを完全に不活化し、しかも加熱
前のフィブリノゲンの生物活性、すなわち血液凝固能は
加熱後も殆どそのまま維持されており、活性の残存率は
９８％以上である。また得られたウイルス不活化フィブ
リノゲンは、特に塩基性アミノ酸としてリジンまたはリ
ジンとアルギニンを含むものは水に溶け易く、したがっ
てたとえば８ｗ／ｖ％以上といった極めて高濃度のフィ
ブリノゲン水溶液の調製が可能であり、溶解後の溶状も
安定している。
ンは、夾雑するウイルスを完全に不活化し、しかも加熱
前のフィブリノゲンの生物活性、すなわち血液凝固能は
加熱後も殆どそのまま維持されており、活性の残存率は
９８％以上である。また得られたウイルス不活化フィブ
リノゲンは、特に塩基性アミノ酸としてリジンまたはリ
ジンとアルギニンを含むものは水に溶け易く、したがっ
てたとえば８ｗ／ｖ％以上といった極めて高濃度のフィ
ブリノゲン水溶液の調製が可能であり、溶解後の溶状も
安定している。
【０００８】
【実施例】以下実施例および試験例をあげて本発明を具
体的に説明する。 実施例１ ヒト血漿由来のコーンフラクションＩ １．６ｋｇを５
５ｍＭのクエン酸ソーダ水溶液（ｐＨ７．０）３３リッ
トルに溶解して得られた溶液（Ａ２８０の吸光度＝約１
４）に硫酸バリウム３．８ｋｇを添加し、２５℃で９０
分間撹拌した後不溶物を除去した。得られた液に５５ｍ
Ｍクエン酸水溶液を加えてｐＨを６．４に調整し、さら
に塩化ナトリウムを濃度が０．９ｗ／ｖ％となるように
添加した。ついで液を０℃まで冷却し、エタノール濃度
が７．５ｖ／ｖ％となるように２５ｖ／ｖ％エタノール
を２４ｋｇ添加した。そのまま１時間静置し、生じた沈
澱を再度０．９ｗ／ｖ％塩化ナトリウムを含む５５ｍＭ
クエン酸ソーダ水溶液（ｐＨ７．０）２２リットルに溶
解した。その後エタノール濃度が２ｖ／ｖ％となるよう
に、１５ｖ／ｖ％エタノールを３６ｋｇ添加し、１０分
間静置した後、沈澱を除去し、エタノール濃度が８ｖ／
ｖ％になるように２５ｖ／ｖ％エタノールを９．９ｋｇ
添加し、精製フィブリノゲンの８ｖ／ｖ％エタノール沈
殿物０．６ｋｇを得た。上記８ｖ／ｖ％エタノール沈殿
物０．６ｋｇを１．２ｗ／ｖ％リジンおよび０．９ｗ／
ｖ％塩化ナトリウムを含んだ溶液２１リットル（沈澱物
の３５倍量）で溶解して得られたフィブリノゲン溶液
（５．４ｍｇ／ｍｌ）２２リットルを１．２μ及び０．
２μのフィルターで順次濾過した後、０．８ｋｇｆ／ｃ
ｍの一次圧でウイルス除去フィルター（プラノバ３５
Ｎ、旭化成（株）製）を通過させた。得られたウイルス
除去フイルター通過液を限外濾過器を用いて濃縮して９
３ｍｇ／ｍｌの精製フィブリノゲン溶液を得た。この溶
液を二つに分け、それぞれ凍結乾燥して得られた凍結乾
燥粉末（いずれも水分含有率１ｗ／ｗ％）を、６５℃で
１２０時間加熱処理して、試料（１−１）及び（１−
２）とした。
体的に説明する。 実施例１ ヒト血漿由来のコーンフラクションＩ １．６ｋｇを５
５ｍＭのクエン酸ソーダ水溶液（ｐＨ７．０）３３リッ
トルに溶解して得られた溶液（Ａ２８０の吸光度＝約１
４）に硫酸バリウム３．８ｋｇを添加し、２５℃で９０
分間撹拌した後不溶物を除去した。得られた液に５５ｍ
Ｍクエン酸水溶液を加えてｐＨを６．４に調整し、さら
に塩化ナトリウムを濃度が０．９ｗ／ｖ％となるように
添加した。ついで液を０℃まで冷却し、エタノール濃度
が７．５ｖ／ｖ％となるように２５ｖ／ｖ％エタノール
を２４ｋｇ添加した。そのまま１時間静置し、生じた沈
澱を再度０．９ｗ／ｖ％塩化ナトリウムを含む５５ｍＭ
クエン酸ソーダ水溶液（ｐＨ７．０）２２リットルに溶
解した。その後エタノール濃度が２ｖ／ｖ％となるよう
に、１５ｖ／ｖ％エタノールを３６ｋｇ添加し、１０分
間静置した後、沈澱を除去し、エタノール濃度が８ｖ／
ｖ％になるように２５ｖ／ｖ％エタノールを９．９ｋｇ
添加し、精製フィブリノゲンの８ｖ／ｖ％エタノール沈
殿物０．６ｋｇを得た。上記８ｖ／ｖ％エタノール沈殿
物０．６ｋｇを１．２ｗ／ｖ％リジンおよび０．９ｗ／
ｖ％塩化ナトリウムを含んだ溶液２１リットル（沈澱物
の３５倍量）で溶解して得られたフィブリノゲン溶液
（５．４ｍｇ／ｍｌ）２２リットルを１．２μ及び０．
２μのフィルターで順次濾過した後、０．８ｋｇｆ／ｃ
ｍの一次圧でウイルス除去フィルター（プラノバ３５
Ｎ、旭化成（株）製）を通過させた。得られたウイルス
除去フイルター通過液を限外濾過器を用いて濃縮して９
３ｍｇ／ｍｌの精製フィブリノゲン溶液を得た。この溶
液を二つに分け、それぞれ凍結乾燥して得られた凍結乾
燥粉末（いずれも水分含有率１ｗ／ｗ％）を、６５℃で
１２０時間加熱処理して、試料（１−１）及び（１−
２）とした。
【０００９】実施例２ ロットを異にするコーンフラクションＩを使用し、実施
例１と同様の方法で得た４種類の８ｖ／ｖ％エタノール
沈殿物０．６ｋｇを、〔表１〕に示す濃度のアルギニン
および塩化ナトリウム溶液２１リットル（沈殿物の３５
倍量）で溶解し、５．１〜５．５ｍｇ／ｍｌのフィブリ
ノゲン溶液各２１．５リットルを得た。各溶液を１．２
μ及び０．２μのフィルターで順次濾過した後、０．８
ｋｇｆ／ｃｍの一次圧でウイルス除去フィルター（プラ
ノバ３５Ｎ、旭化成（株）製）を通過させた後、限外濾
過器により濃縮してそれぞれ８５，９３，９９及び１０
１ｍｇ／ｍｌ精製フィブリノゲン溶液を調製した。これ
らの試料を凍結乾燥して得られた凍結乾燥粉末（いずれ
も水分含有率１ｗ／ｗ％）を、６５℃で１２０時間加熱
処理し、試料（２−１）〜（２−４）とした。
例１と同様の方法で得た４種類の８ｖ／ｖ％エタノール
沈殿物０．６ｋｇを、〔表１〕に示す濃度のアルギニン
および塩化ナトリウム溶液２１リットル（沈殿物の３５
倍量）で溶解し、５．１〜５．５ｍｇ／ｍｌのフィブリ
ノゲン溶液各２１．５リットルを得た。各溶液を１．２
μ及び０．２μのフィルターで順次濾過した後、０．８
ｋｇｆ／ｃｍの一次圧でウイルス除去フィルター（プラ
ノバ３５Ｎ、旭化成（株）製）を通過させた後、限外濾
過器により濃縮してそれぞれ８５，９３，９９及び１０
１ｍｇ／ｍｌ精製フィブリノゲン溶液を調製した。これ
らの試料を凍結乾燥して得られた凍結乾燥粉末（いずれ
も水分含有率１ｗ／ｗ％）を、６５℃で１２０時間加熱
処理し、試料（２−１）〜（２−４）とした。
【００１０】比較例１ 実施例１と同様の方法で得た精製フィブリノゲンの８ｖ
／ｖ％エタノール沈殿物をフィブリノゲンに対して１
２．９ｗ／ｗ％のリジンのみ、１１．８ｗ／ｗ％のアル
ギニンのみおよび９．６８ｗ／ｗ％の塩化ナトリウムの
みを含んだ水溶液に溶かし、フィブリノゲンを９．３ｗ
／ｖ％含む液を調製したが、溶解後の安定性が低く、
１．２μ及び０．２μのフィルターによる濾過が困難に
なったため以後の実験を行わなかった。
／ｖ％エタノール沈殿物をフィブリノゲンに対して１
２．９ｗ／ｗ％のリジンのみ、１１．８ｗ／ｗ％のアル
ギニンのみおよび９．６８ｗ／ｗ％の塩化ナトリウムの
みを含んだ水溶液に溶かし、フィブリノゲンを９．３ｗ
／ｖ％含む液を調製したが、溶解後の安定性が低く、
１．２μ及び０．２μのフィルターによる濾過が困難に
なったため以後の実験を行わなかった。
【００１１】試験例１ フィブリノゲンの濃度及び純度
の測定 Ｌａｋｉ法及びＢｌｏｍｂａｃｋ法を組み合わせて実施
例１および２で得られた試料中に含まれるフィブリノゲ
ンの濃度を測定した。すなわち、試料Ｎｏ．（１−１）
〜（２−４）を希釈してフィブリノゲン濃度を３〜５ｍ
ｇ／ｍｌに調整し、これを試料液とした。試料液２．０
ｍｌに０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を０．１ｍ
ｌ、０．２Ｍ塩化カリウム溶液を１．２５ｍｌおよび精
製水を０．２５ｍｌ加えた。次いで２５０ＮＩＨ ＵＮ
ＩＴＳ／ｍｌトロンビン（生理的食塩水）溶液を０．１
ｍｌ加えて混和し、３７℃で１時間静置すると凝固塊が
生成した。この凝固塊を濾取し精製水で２回洗浄し、
２．５Ｍ水酸化ナトリウム溶液２．０ｍｌを含んだ２０
ｍｌ容メスフラスコに加え、６０℃に加温して溶解後、
精製水で正確に２０ｍｌとし、２８７ｎｍ及び３２５ｎ
ｍの吸光度を測定し、それぞれの値をＡ２７８及びＡ３
２５とした。得られた各値から、以下の計算式に従って
各試料中のフィブリノゲンの濃度（ｍｇ／ｍｌ）を算出
した。
の測定 Ｌａｋｉ法及びＢｌｏｍｂａｃｋ法を組み合わせて実施
例１および２で得られた試料中に含まれるフィブリノゲ
ンの濃度を測定した。すなわち、試料Ｎｏ．（１−１）
〜（２−４）を希釈してフィブリノゲン濃度を３〜５ｍ
ｇ／ｍｌに調整し、これを試料液とした。試料液２．０
ｍｌに０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を０．１ｍ
ｌ、０．２Ｍ塩化カリウム溶液を１．２５ｍｌおよび精
製水を０．２５ｍｌ加えた。次いで２５０ＮＩＨ ＵＮ
ＩＴＳ／ｍｌトロンビン（生理的食塩水）溶液を０．１
ｍｌ加えて混和し、３７℃で１時間静置すると凝固塊が
生成した。この凝固塊を濾取し精製水で２回洗浄し、
２．５Ｍ水酸化ナトリウム溶液２．０ｍｌを含んだ２０
ｍｌ容メスフラスコに加え、６０℃に加温して溶解後、
精製水で正確に２０ｍｌとし、２８７ｎｍ及び３２５ｎ
ｍの吸光度を測定し、それぞれの値をＡ２７８及びＡ３
２５とした。得られた各値から、以下の計算式に従って
各試料中のフィブリノゲンの濃度（ｍｇ／ｍｌ）を算出
した。
【数１】 また、凝固塊を除去した残液（以下、残液という。）
と、試料液２．０ｍｌに０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）０．１ｍｌとを加えて３７℃で１時間静置して
得た溶液（以下、対照液と云う）のそれぞれの２７８ｎ
ｍおよび３２５ｎｍの吸光度を測定し、残液からの値を
Ｂ２７８とＢ３２５とし、対照液からの値をそれぞれＣ
２７８とＣ３２５とした。得られたそれぞれの値から以
下の計算式に従って、試料中のフィブリノゲンの純度を
算出した。
と、試料液２．０ｍｌに０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）０．１ｍｌとを加えて３７℃で１時間静置して
得た溶液（以下、対照液と云う）のそれぞれの２７８ｎ
ｍおよび３２５ｎｍの吸光度を測定し、残液からの値を
Ｂ２７８とＢ３２５とし、対照液からの値をそれぞれＣ
２７８とＣ３２５とした。得られたそれぞれの値から以
下の計算式に従って、試料中のフィブリノゲンの純度を
算出した。
【数２】 以上の結果を〔表１〕に示す。
【００１２】
【表１】 〔表１〕から明らかなように、本発明の方法により得ら
れた実施例１及び２の試料はいずれも６５℃、１２０時
間の加熱処理の後のフィブリノゲンの純度、つまり凝固
能は加熱前と殆ど変化がなく、このことからフィブリノ
ゲンは非常に熱に対して安定であることが証明された。
またこれらの試料はいずれも、日本薬局方注射用水に溶
かして約８ｗ／ｖ％のフィブリノゲン溶液を調製するこ
とができ、溶状は安定していた。
れた実施例１及び２の試料はいずれも６５℃、１２０時
間の加熱処理の後のフィブリノゲンの純度、つまり凝固
能は加熱前と殆ど変化がなく、このことからフィブリノ
ゲンは非常に熱に対して安定であることが証明された。
またこれらの試料はいずれも、日本薬局方注射用水に溶
かして約８ｗ／ｖ％のフィブリノゲン溶液を調製するこ
とができ、溶状は安定していた。
【００１３】試験例２ ウイルスの感染価の測定 マイクロプレートを用い、３７℃、５％炭酸ガス培養液
で培養したＥＳＫ（Embryonic Swine Kidney）細胞で
ブタパルボウイルスの感染価の測定を行った。試料は日
本薬局方注射用水で溶解した。ウイルス感染価の測定と
してはブタパルボウイルスのＥＳＫ細胞に対する細胞変
性効果を確認することにより行った。すなわち、ウイル
スを含む試料をＥＳＫ細胞培養用培地で１０倍段階希釈
してＥＳＫ細胞に接種した。引き続き炭酸ガス培養器で
７日間培養し細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察してウイル
ス感染価（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を算出した。またウイ
ルスの不活化効果を次式によりＬＲＶ（Log Reduction
Value）として示した。
で培養したＥＳＫ（Embryonic Swine Kidney）細胞で
ブタパルボウイルスの感染価の測定を行った。試料は日
本薬局方注射用水で溶解した。ウイルス感染価の測定と
してはブタパルボウイルスのＥＳＫ細胞に対する細胞変
性効果を確認することにより行った。すなわち、ウイル
スを含む試料をＥＳＫ細胞培養用培地で１０倍段階希釈
してＥＳＫ細胞に接種した。引き続き炭酸ガス培養器で
７日間培養し細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察してウイル
ス感染価（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を算出した。またウイ
ルスの不活化効果を次式によりＬＲＶ（Log Reduction
Value）として示した。
【数３】
【００１４】試験例３ 乾燥フィブリノゲンの加熱によ
るブタパルボウイルス（ＰＰＶ）の不活化実験 実施例１で調製した凍結乾燥前の精製フィブリノゲン溶
液９容にブタパルボウイルス液１容を加えて少量のモデ
ル実験を実施した。すなわち、ウイルス含有試料（ウイ
ルス感染価１０６．２５）を凍結乾燥した後、加熱処理
を施し、前述のウイルス感染価の測定方法に従って試料
中のウイルス感染価およびＬＲＶを算出した。その結果
を〔表２〕に示す。
るブタパルボウイルス（ＰＰＶ）の不活化実験 実施例１で調製した凍結乾燥前の精製フィブリノゲン溶
液９容にブタパルボウイルス液１容を加えて少量のモデ
ル実験を実施した。すなわち、ウイルス含有試料（ウイ
ルス感染価１０６．２５）を凍結乾燥した後、加熱処理
を施し、前述のウイルス感染価の測定方法に従って試料
中のウイルス感染価およびＬＲＶを算出した。その結果
を〔表２〕に示す。
【００１５】
【表２】 〔表２〕から明らかなように、フィブリノゲンは凍結乾
燥により１．０のＬＲＶが得られ、その後の９６時間の
加熱処理により３．０、１２０時間加熱処理により３．
５のＬＲＶが得られた。このことよりすでに発病のない
ことが認められているアルブミンの６０℃、１０時間の
液状加熱処理と比較して、同等以上のウイルス不活化効
果が確認された。
燥により１．０のＬＲＶが得られ、その後の９６時間の
加熱処理により３．０、１２０時間加熱処理により３．
５のＬＲＶが得られた。このことよりすでに発病のない
ことが認められているアルブミンの６０℃、１０時間の
液状加熱処理と比較して、同等以上のウイルス不活化効
果が確認された。
【００１６】実施例３ 実施例１で得られた試料に、アルギニンを添加して、フ
ィブリノゲン９．３ｗ／ｖ％、リジン１．２ｗ／ｖ％、
アルギニン１．２ｗ／ｖ％および塩化ナトリウム０．９
ｗ／ｖ％を含む精製フィブリノゲン溶液を調製した。こ
の溶液を凍結乾燥し、得られた粉末（水分含有率１．０
ｗ／ｗ％）を６５℃、１２０時間加熱処理した。フィブ
リノゲンの純度は、加熱前が９５．２％、加熱後が９
５．０％であった。また、加熱後の粉末１．２５ｇを試
験管内で日本薬局方注射用水８ｍｌに溶解し、２５℃で
撹拌を続けたところ約３０分で完全に溶解して澄明な液
となり、溶状は安定していた。
ィブリノゲン９．３ｗ／ｖ％、リジン１．２ｗ／ｖ％、
アルギニン１．２ｗ／ｖ％および塩化ナトリウム０．９
ｗ／ｖ％を含む精製フィブリノゲン溶液を調製した。こ
の溶液を凍結乾燥し、得られた粉末（水分含有率１．０
ｗ／ｗ％）を６５℃、１２０時間加熱処理した。フィブ
リノゲンの純度は、加熱前が９５．２％、加熱後が９
５．０％であった。また、加熱後の粉末１．２５ｇを試
験管内で日本薬局方注射用水８ｍｌに溶解し、２５℃で
撹拌を続けたところ約３０分で完全に溶解して澄明な液
となり、溶状は安定していた。
【００１７】
【発明の効果】本発明によれば、フィブリノゲンの変
性、失活をほとんど伴うことなく、夾雑するウイルスを
不活化することができる。また得られたウイルス不活化
フィブリノゲンは、フィブリノゲンを８ｗ／ｖ％以上の
高濃度溶液とすることができ、且つ溶解後の溶状も安定
している。
性、失活をほとんど伴うことなく、夾雑するウイルスを
不活化することができる。また得られたウイルス不活化
フィブリノゲンは、フィブリノゲンを８ｗ／ｖ％以上の
高濃度溶液とすることができ、且つ溶解後の溶状も安定
している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 金子 健二 千葉県成田市新泉３番地の１ 日本製薬株 式会社成田工場内 Ｆターム(参考） 4B065 AA95X BD08 BD13 BD22 BD33 BD39 CA44 CA56 4C084 AA02 AA06 BA44 DC11 NA06 ZA542 ZC022 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 DA65 EA29 GA01 GA05 GA10
Claims (10)
- 【請求項１】ウイルス夾雑の危惧のあるフィブリノゲ
ン、塩基性アミノ酸および塩化ナトリウムを含む水溶液
を乾燥した後、ウイルスが不活化されるまで加熱するフ
ィブリノゲンのウイルス不活化法。 - 【請求項２】塩基性アミノ酸がリジンまたはアルギニン
である請求項１記載のウイルス不活化法。 - 【請求項３】塩基性アミノ酸がリジンである請求項１記
載のウイルス不活化法。 - 【請求項４】塩基性アミノ酸がリジンおよびアルギニン
である請求項１記載のウイルス不活化法。 - 【請求項５】水溶液がフィブリノゲンと、フィブリノゲ
ンに対し４〜４０ｗ／ｗ％の塩基性アミノ酸および５〜
２５ｗ／ｗ％の塩化ナトリウムを含有するものである請
求項１記載のウイルス不活化法。 - 【請求項６】水溶液がフィブリノゲンと、フィブリノゲ
ンに対し、２〜２０ｗ／ｗ％のリジンおよび５〜２５ｗ
／ｗ％の塩化ナトリウムを含有する請求項１記載のウイ
ルス不活化法。 - 【請求項７】水溶液がフィブリノゲンと、フィブリノゲ
ンに対し、２〜２０ｗ／ｗ％のリジン、２〜２０ｗ／ｗ
％のアルギニンおよび５〜２５ｗ／ｗ％の塩化ナトリウ
ムを含有する請求項１記載のウイルス不活化法。 - 【請求項８】加熱を５０〜８０℃、２４〜１９２時間行
う請求項１記載のウイルス不活化法。 - 【請求項９】乾燥したフィブリノゲンが水分３ｗ／ｗ％
以下のものである請求項１記載のウイルス不活化法。 - 【請求項１０】請求項１〜９のいずれかに記載のウイル
ス不活化法によりウイルスが不活化されたフィブリノゲ
ン。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000082066A JP2001270900A (ja) | 2000-03-23 | 2000-03-23 | フィブリノゲンのウイルス不活化法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000082066A JP2001270900A (ja) | 2000-03-23 | 2000-03-23 | フィブリノゲンのウイルス不活化法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001270900A true JP2001270900A (ja) | 2001-10-02 |
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ID=18598914
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2000082066A Pending JP2001270900A (ja) | 2000-03-23 | 2000-03-23 | フィブリノゲンのウイルス不活化法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001270900A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002112765A (ja) * | 2000-08-01 | 2002-04-16 | Nihon Pharmaceutical Co Ltd | ウイルス不活化法 |
| JP2007516187A (ja) * | 2003-07-09 | 2007-06-21 | ラボラトワール、フランセ、デュ、フラクショヌマン、エ、デ、ビオテクノロジ | ウイルス不活性化熱処理へ供するための血漿タンパク質の寒冷沈降物を安定化する方法 |
| US7816495B2 (en) | 2002-07-10 | 2010-10-19 | Nhs Blood And Transplant | Processes for the preparation of fibrinogen |
| CN113577295A (zh) * | 2021-09-06 | 2021-11-02 | 成都蓉生药业有限责任公司 | 一种人纤维蛋白原干热处理稳定剂及其用途 |
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