BRPI0212266B1 - anticorpos humanizados anti-ccr4, método de produção dos mesmos, medicamento, e agentes terapêuticos e de diagnóstico - Google Patents

Abstract

"anticorpo enxertado com cdr humano e fragmento de anticorpo do mesmo". anticorpo enxertado com cdr humano ou fragmento de anticorpo do mesmo que especificamente reage com a região extracelular do receptor de quimiocina cc humano (ccr4) mas não reage com uma plaqueta sangüínea humana; um anticorpo enxertado com cdr humano ou fragmento de anticorpo do mesmo que especificamente reage com a região extracelular de ccr4 e tem atividade citotóxica contra uma célula expressando ccr4; e um medicamento, um agente terapêutico ou um agente de diagnóstico compreendendo pelo menos um dos anticorpos e seus fragmentos de anticorpo como um ingrediente ativo.

Description

[001] A presente invenção refere-se a um anticorpo enxertado com CDR que especificamente reage com a região extracelular do receptor de quimiocina CC humano 4 (daqui em diante referido como CCR4), mas não reage com uma plaqueta sangüínea e ao fragmento de anticorpo do mesmo. Ainda, a presente invenção refere-se a um anticorpo enxertado com CDR humano que especificamente reage com a região extracelular de CCR4 humano mas não tem uma atividade inibidora de um ligante de CCR4, tal como TARC ou MDC que se liga a CCR4 e o fragmento de anticorpo do mesmo. Além disso, a presente invenção refere-se a um anticorpo enxertado com CDR humano que especificamente reage com a região extracelular do CCR4, tem uma atividade citotóxica e uma atividade de inibição de produção de citocina pelas células Th2, e compreendendo uma região de determinação de complementaridade específica (daqui em diante referida como CDR) e ao fragmento de anticorpo do mesmo. Também, a presente invenção refere-se a um DNA codificando o anticorpo ou fragmento de anticorpo do mesmo. Ainda, a presente invenção refere-se a um vetor compreendendo o DNA, e um transformante transformado com o vetor. Além disso, a presente invenção refere-se a um método para produção do anticorpo ou fragmento de anticorpo do mesmo usando o transformante e a um medicamento, tal como um agente terapêutico, um agente de diagnóstico e similar, para as doenças imunes mediadas por Th2, tais como doenças alérgicas e similares, que compreendem uso do anticorpo ou fragmento de anticorpo do mesmo. Adicionalmente, a presente invenção refere-se a um medicamento, tal como um agente terapêutico, um agente de diagnóstico e similar, para cânceres, tais como cânceres do sangue, por exemplo, leucemia e linfomatose, que compreende usar o anticorpo ou fragmento de anticorpo do mesmo.

TÉCNICA ANTERIOR

Vários fatores, tais como eosinófilos, mastócitos, IgE e similares

Petição 870190061215, de 01/07/2019, pág. 8/23 desempenham um papel em doenças alérgicas, tais como asma brônquica. Os eosinófilos infiltram no sitio inflamatório e liberam proteínas básicas citotóxicas, tais como MBP (proteína básica principal) ou similar através de desgranulação e os tecidos circundantes são danificados por tais proteínas bá5 sicas citotóxicas. Mastócitos são ligados a um complexo imune de antígeno com IgE que é produzido pelas células B e libera histamina de modo que uma reação alérgica imediata é induzida. A reação alérgica é controlada por moléculas biologicamente funcionais, tais como citocinas, quimiocmas e similares, que fazem parte na transdução de sinal entre as células. IL-5 mduz 10 diferenciação, sobrevivência e desgranulação de eosinófilos. IL-4 induz ativação de célula B e produção de IgE. O IgE produzido forma um complexo imune com o antígeno e causa desgranulação dos mastócitos. Foi constatado que a IL-4, IL-13 e similares são também produzidas pelos mastócitos e contribuem para a produção de IgE pelas células B (Am. J. Respir. Crit. Care 15 Med., 152, 2059 (1995), Immunol. Today, 15, 19 (1994)). Desse modo, uma rede de citocina-quimiocina elaborada está presente entre as células infla matérias e mantém equilíbrios complicados.

As citocinas e quimiocinas são produzidas por células T auxiliares que expressam CD4 na superfície celular (daqui em diante referidas 20 como células CD4+Th). Na verdade, foi constatado que a infiltração de células T auxiliares é encontrada no sítio de inflamação das vias aéreas dos pacientes com asma brônquica, onde um número consideravelmente grande de células T é ativado e que a gravidade e a hipersensibilidade das vias aereas do paciente asmático relacionam-se com o número de células T ativa25 das, bem como as células T ativadas são também aumentadas no sangue periférico (Am. Rev. Respir. Dis., 145, S22 (1992)).

As células T auxiliares são classificadas em células Th1 e células Th2, dependendo do tipo de citocina a ser produzido por elas (Annu. Rev. Immunol., 7, 145 (1989)). As células Th2 produzem IL-4, IL-5, IL-13 e 30 similares. As citocinas produzidas pelas células Th2 são citocinas Th2.

Foi constatado que um clone de célula T específica de antígeno isolado de um paciente com doença atópica libera citocinas Th2 quando es o C φ ο ο ® · timulado in vitro (Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A, 88, 4538 (1991)), e as células Th2 estão presentes em fluido de lavagem broncoalveolar (daqui em diante referido como BAL) e mucosa das vias aéreas de pacientes asmáticos (Ν. Engl. J. Med., 326, 298 (1992), Eur. J. Immunol., 23, 1445 (1993)). Os mveis 5 de expressão de mRNAs de IL-4 e IL-5 das citocinas Th2 são aumentados quando as expressões dos mRNAs de várias citocinas nas células em BAL são examinados usando um modelo de animal de inflamação alérgica (Clm. Immunol. Immunopathol., 75, 75 (1995)). Também, quando células Th2 são intravenosamente ou intranasalmente administradas a camundongos, inflate mação asmática é induzida nos pulmões de maneira específica de antígeno (J. Exp. Med., 186, 1737 (1997), J. Immunol., 160, 1378 (1998)) e eosmofiha é observada (J. Immunol., 161, 3128 (1998)). A expressão de IL-5 é observada no muco das vias aéreas de pacientes com asma e nas lesões de pele de pacientes com dermatite atópica (J. Clin. Invest., 87, 1541 (1991), J. Exp.

Med., 173, 775 (1991)) e o nível de expressão de IL-5 no muco de nnite alérgica crônica se relaciona ao nível de expressão de IL-13, e as quantidades de IgE e IgE específico de antígeno totais no soro (Therapeutics, 32, 19(1998)).

Quimiocina é um termo geral para proteínas de ligação de hepa20 rina básicas que induzem quimiotaxia e ativação de leucócito, e classificadas em subfamílias de CXC, CC, C e CX₃C dependendo da posição dos resíduos de cisteína na estrutura principal. 16 dos receptores de quimiocina foram identificados até agora (Curr. Opi. Immunol., H, 626 (1999)), e foi mostrado que a expressão de cada receptor de quimiocina é diferente dentre os leuco25 citos, tais como célula Th1, célula Th2 ou similar (Cell Engineering, 17, 1022 (1998)).

CCR4 humano é uma proteína G acoplada a sete receptores de transmembrana clonados como K5-5 de um tipo de célula basófila imatura humana KU-812. As regiões de transmembrana de CCR4 são consideradas 30 serem posições 40 a 67, posições 78 a 97, posições 113 a 133, posições 151 a 175, posições 207 a 226, posições 243 a 270 e posições 285 a 308 na sequência de aminoácido, as regiões extracelulares são consideradas as posições 1 a 39, posições 98 a 112, posições 176 a 206 e posições 271 a 284 na seqüência de aminoácido, e as regiões intracelulares são as posições 68 a 77, posições 135 a 150, posições 227 a 242 e posições 309 a 306 na seqüência de aminoácido (J. Biol. Chem., 2Z2, 19495 (1995)). Primeiro, 5 foi descrito que o ligante de CCR4 é MIP-1a (proteína 1a inflamatória de macrófago), RANTES (regulada na ativação de célula T normal expressa e secretada) ou MCP-1 (proteína quimiotática de monócito) (Biochem. Biophys. Res. Commun., 218, 337 (1996), WO 96/23068). No entanto, foi constatado que TARC (quimiocina regulada pelo timo e ativação) produzida 10 de células mononucleares de sangue periférico humano estimuladas (daqui em diante referidas como PBMC) e células do timo (J. Biol. Chem., 271, 21514 (1996)) especificamente se liga a CCR4 (J. Biol. Chem., 271, 15036 (1997)) Foi também descrito que MDC (quimiocina derivada de macrófago) isolada de macrófago (J. Exp. Med., 185, 1595 (1997)), também conhecida 15 como STCP-1 (proteína 1 quimiotática de célula T estimulada) (J. Biol. Chem., 272, 25229 (1997)), se liga a CCR4 mais fortemente do que a TARC (J. Biol. Chem., 273, 1764 (1998)).

Foi mostrado que CCR4 é expresso em células CD4+Th que produzem citocina ou quimiocina (J. Biol. Chem., 212, 15036 (1997)), e foi 20 descrito que CCR4 é expresso seletivamente em células Th2 entre células CD4+Th (J. Exp. Med., 187, 129 (1998), J. Immunol., 161, 5111 (1998)). Em adição, células CCR4+ foram encontradas em células T efetoras/de memória (CD4+/CD45RO+) e quando células CCR4+ foram estimuladas, IL-4 e IL 5 foram produzidas mas IFN-γ não foi produzido (Int. Immunol., 11, 81 (1999)).

Também, foi descrito que células CCR4+ pertencem a um grupo CLA (antígeno de linfócito cutâneo)-positivo e um α4β8 integrina negativo entre as células T da memória, e CCR4 é expresso nas células T da memória relacionadas não com a imunidade do intestino mas à imunidade sistêmica da pele e similares (Nature, 400, 776 (1999). Esses resultados sugerem forte30 mente que quando inflamação é induzida, a células T de memória sao ativadas para expressar CCR4 e são migradas para o sítio inflamatorio através de MDC e TARC de ligantes de CCR4, e aceleram a ativação de outras cé lulas inflamatórias.

Foi recentemente constatado que CCR4 é também expresso em células assassinas naturais (Journal of Immunology, 164, 4048-4054 (200), Blood, 97, 367-375 (2001) e plaquetas (Thrombosis Research, 101, 279-289 5 (2001), Blood, 96, 4046-4054 (2000), Blood, 97, 937-945 (2001)) em seres humanos.

Sabe-se que um antagonista de TARC ou MCD com urn ligante de CCR4, a saber antagonista de CCR4, inibe a agregação de plaqueta (WO 99/15666). Sabe-se que tal agente que modula o funcionamento do CCR4 10 também afeta o funcionamento de plaquetas.

A expressão de CCR4 é encontrada em plaquetas. Por exemplo, Adrian e outros (Blood, 97, 937-945 (2001)) e Abi-Younes e outros (Thrombosis Research, 101, 279-289 (2001), WO 00/42074, WO 00/41724) detectaram a expressão de CCR4 em plaquetas humanas usando anticorpos anti15 CCR4. Um anticorpo tendo reatividade com CCR4, mas não sendo capaz de se ligar a plaquetas humanas não é conhecido até agora.

Também, sabe-se que quando um auto-anticorpo capaz de ligação a plaquetas é produzido, trombopenia auto-imune é induzida (Blood, 70, 428-431 (1987), Transfusion Science, 19, 245-251 (1998)). Agentes tendo 20 influências sobre trombocitopenia e funcionamento de plaquetas nao sao geralmente desejáveis como medicamentos porque eles frequentemente causam efeitos colaterais graves, tais como sangramento e formação de trombo. Particularmente, uma vez que os anticorpos têm meia-vida sanguínea longa, um anticorpo que afeta o funcionamento de plaqueta é difícil de 25 ser desenvolvido como um medicamento. Por exemplo, desenvolvimento de anticorpos de ligante anti-CD40 que foram desenvolvidos como agentes para tratamento de doenças auto-imunes foi suspenso por causa da geração de efeitos colaterais que são considerados como sendo devido ao reconhecimento de antígeno expresso em plaquetas ativadas (Nature Medicine, 6, 114 30 (2000), BioCentury, A8 de 18 (20/06/2002)).

Sabe-se que proteínas são submetidas a várias reações de modificação após tradução. Uma das reações de modificação conhecidas e

uma reação sulfatada de resíduos de tirosina. Foi descrito que muitas proteínas são sulfatadas em resíduos de tirosina (Chemistry and Biology, !, R57-R61 (2000)). O resíduo de tirosina que é sulfatado tem característica que muitos resíduos de aminoácido ácidos estão presentes em sua vizi5 nhança, e uma proteína tendo uma possibilidade de ser sulfatada e sua região foram sugeridas (Cell, 96, 667-676 (1999)). Com relação ao CCR4. 4 resíduos de tirosina estão presentes próximo ao terminal N, mas nao ha quaisquer relatos de que os resíduos de tirosina são sulfatados.

Como o método atual para tratamento de doenças imunes mediO 10 adas por Th2, o que segue foi desenvolvido: (1) antagonistas para citocinas e quimiocinas, tais como anticorpo anti-IL-5 humanizado (SB-240563: Smith Kline Beecham, Sch-55700 (CDP-835); Shehling Plough/Celltech), um anticorpo de IL-4 humanizado (Patente U.S. 5.914.110), um receptor de quimiocina solúvel (J. Immunol., 160, 624 (1998)), etc; (2) inibidores de produção

- 15 de citocina/quimiocina, tais como um inibidor de produção de lL-5 (Pedido de

Patente Japonês Não-examinado Publicado N° 53355/96), um antagonista de retinóide (WO 99/24024), tosilato de esplatasto (IPD-1151T, fabricado pela Taiho Pharmaceutical), etc; (3) agentes agindo sobre o eosmofilo, I mastócito e similares como células inflamatórias finais, tais como anticorpo de receptor de IL-5 humanizado (WO 97/10354), um antagonista de receptor I O 3 de quimiocina CG (CCR3) (Pedido de Patente Japonês Não-examinado

Publicado N° 147872/99), etc; (4) inibidores de molécula inflamatona, tais como um anticorpo anti-lgE humanizado (Am. J. Respir. Crit. Care. Med., 157, 1429 (1998)), etc; e similares. Mas eles inibem apenas uma parte da 25 rede elaborada entre as citocina, quimiocina e células inflamatórias. Doenças imunes mediadas por Th2 não devem ser curadas por esses agentes. Anticorpos anti-CD4 têm uma atividade para controlar células T, e têm efeitos sobre a asma grave dependente de esteróide. No entanto, uma vez que a molécula de CD4 é amplamente expressa em várias células imunes, ela não tem especificidade e tem um inconveniente de acompanhar efeito ] imunossupressor forte (Int. Arch. Aller. Immunol., 118, 133 (1999)).

Desse modo, a fim de inibir todos eles, é necessário controlar

especificamente a origem da reação alérgica problemática, a saber células Th2.

O método comum atualmente usado para tratamento de pacientes com doenças imunes mediadas _PorTh2 é administração de esteróide, 5 mas efeitos colaterais de esteróides não podem ser evitados. Também, existem inconvenientes de que as condições de cada paciente retornam para o estado anterior quando a administração do esteróide é suspensa, e que a resistência à droga é adquirida quando o esteróide é administrado por um longo tempo.

I o Até agora, nenhum anticorpo enxertado com CDR humano e seu fragmento que possa detectar células expressando CCR4 e também tenha citotoxidez contra células expressando CCR4 foi encontrado. Em adição, nenhum agente terapêutico que possa inibir a produção de citocina de Th2 e conhecido até agora.

₁₅ Embora tenha sido descrito que CCR4 é também expresso nas células cancerígenas de pacientes com leucemia (Blood, 96, 685 (2000)), nenhum agente terapêutico que acabe com as células leucêmicas é conhecido.

Sabe-se que, em geral, quando um anticorpo derivado de um 20 animal não-humano, por exemplo, um anticorpo de camundongo, é administrado a ser humano, ele é reconhecido como uma substância estrangeira e induz um anticorpo humano contra o anticorpo de camundongo (anticorpo anticamundongo humano: daqui em diante referido como HAMA) no corpo humano. Sabe-se que o HAMA reage com o anticorpo de camundongo ad25 ministrado para causar efeitos colaterais (J. Clin. Oncol., 2, 881 (1984), Blood, 65, 1349 (1985), J. Natl. Cancer Inst., 80, 932 (1988), Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 82,1242 (1985)), para acelerar o desaparecimento do anticorpo de camundongo administrado do corpo (J. Nucl. Med., 26, 1011 (1985), Blood, 65, 1349 (1985), J. Natl. Cancer Inst., 80, 937 (1988) e para reduzir os 30 efeitos terapêuticos do anticorpo de camundongo (J. Immunol., 135, 1530 (1985), Cancer Res., 46, 6489 (1986)).

A fim de resolver esses problemas, foram feitas tentativas de se converter um anticorpo derivado de um animal não-humano em um anticorpo enxertado com CDR humano usando técnica de engenharia genetica.

O anticorpo enxertado com CDR humano é um anticorpo onde a seqüência de aminoácido da CDR na região variável (daqui em diante refen5 da como região V) derivada de um anticorpo de animal não-humano é enxertada em uma posição apropriada de um anticorpo humano (Nature, 321, 522 (1986)). Em comparação com os anticorpos derivados de animais não humanos, tais como anticorpos de camundongo e similares, esses anticorpos enxertados com CDR humanos têm várias vantagens para aplicações 10 químicas a ser humano. Por exemplo, foi descrito que a imunogenicidade foi reduzida e sua meia-vida no sangue se tornou longa comparada com um anticorpo de camundongo usando um macaco (Cancer Res., 56, 1118 (1996), Immunol., 85, 668 (1995)). Desse modo, é esperado que os anticorpos enxertados com CDR humanos tenham menos efeitos colaterais em se15 res humanos e seus efeitos terapêuticos continuem por um tempo mais longo do que os anticorpos derivados de animais não-humanos.

Ainda, uma vez que anticorpo enxertado com CDR humano é preparado usando técnica de engenharia genética, moléculas em várias formas podem ser preparadas. Por exemplo, quando a subclasse de γ1 é usa20 da como uma região constante (daqui em diante referida como região C) de cadeia pesada (daqui em diante referida como cadeia H) (a região C da cadeia H é referida como CH) de um anticorpo humano, um anticorpo humanizado tendo uma função efetora alta, tal como atividade citotóxica mediada por célula dependente de anticorpo (daqui em diante referida aqui como 25 ADCC) pode ser preparado (Cancer Res., 56, 1118 (1996)) e uma meiavida no sangue prolongada comparada com um anticorpo de camundongo e esperada (Immunol., 85, 668 (1995)). Também, no tratamento particularmente para redução do número de células expressando CCR4, atividades citotóxicas mais altas, tais como atividade citotóxica dependente de com30 plemento (daqui em diante referida como atividade CDC) e atividade ADCC através da região Fc (a região na e após a região de impedimento de uma cadeia pesada de anticorpo) de um anticorpo são importantes para os efeiI

I

tos terapêuticos. Desse modo, esses resultados mostram claramente que anticorpos enxertados com CDR humanos são preferidos a anticorpos derivados de animais não-humanos, tais como anticorpos de camundongo.

Ainda, de acordo com avanços recentes na engenharia de pro5 teina e engenharia genética, fragmentos de anticorpo tendo um peso molecular menor, tais como Fab, Fab', F(ab’)₂, um anticorpo de cadeia única (daqui em diante referido como scFv) (Science, 242, 423 (1988)), um fragmento da região V dimerizada (daqui em diante referido como Diacorpo ) (Nature Biotechnol., 15, 629 (1997)), um fragmento de região V estabilizada 10 com dissulfeto (daqui em diante referido como “dsFv) (Molecular Immunol., 32, 249 (1995)), um peptídeo contendo CDR (J. Biol. Chem., 271, 2966 0996)) e similares, podem ser preparados como anticorpos enxertados com CDR humanos. Os fragmentos de anticorpo são excelentes na atividade transicional em tecidos alvo comparado com moléculas de anticorpo com15 pletas (Cancer. Res., 52, 3402 (1992)).

É considerado que esses fragmentos derivados de anticorpos enxertados com CDR humanos e seus fragmentos de anticorpo são mais desejáveis do que aqueles derivados de anticorpos derivados de animais não-humanos, tais como anticorpos de camundongo, quando usados em aplicações clínicas a seres humanos.

Conforme acima descrito, efeitos de diagnóstico e terapêuticos podem ser esperados de anticorpos enxertados com CDR humanos e seus fragmentos de anticorpo quando usados sozinhos, mas foram feitas tentativas de se melhorar os efeitos usando outras moléculas em combinação. Por 25 exemplo, citocina pode ser usada como uma de tais moléculas. Citocina é um termo geral para vários fatores solúveis que controlam as funções mutuas intercelulares em reações imunes. A atividade da CDC e a atividade da ADCC, por exemplo, são conhecidas como as atividades citotóxicas de anticorpos, e a atividade da ADCC é controlada por células efetoras tendo 30 receptores Fc na superfície celular, tais como monócitos, macrófagos, células NK e similares (J. Immunol., 138, 1992 (1987)). Uma vez que várias citocinas ativam essas células efetoras, elas podem ser administradas em com10 binação com um anticorpo a fim de melhorar a atividade de ADCC do anticorpo.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se aos itens (1) a (59) que seguem. (1) Um anticorpo enxertado com CDR humano que especificamente reage com uma região extracelular de receptor de quimiocina de CC humano 4 (CCR4) mas não reage com uma plaqueta humana, ou fragmento de anticorpo do mesmo.

(2) Um anticorpo enxertado com CDR humano que especificauma região extracelular de receptor de quimiocina de CC humano 4 (CCR4) e tem uma atividade citotóxica contra uma célula expresmente reage com sando CCR4, ou um fragmento de anticorpo do mesmo.

(3) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com (1), o qual tem uma atividade citotóxica contra uma célula expressando CCR4.

(4) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (3), onde a região extracelular é uma região extracelular selecionada do grupo consistindo nas

39, 98 a 112, 176 a 206 e 271 a 284 na seqüência de aminoáposições 1 a cido representada pela SEQ ID N°: 48.

(5) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (4), onde a região epítopo presente nas posições 2 a 29 na sequência de extracelular é um aminoácido representada pela SEQ ID N°: 48.

(6) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (5), onde a região extracelular é um epítopo presente nas posições 13 a 29 na sequencia de aminoácido representada pela SEQ ID N . 48.

(7) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (6), onde a região epítopo presente nas posições 13 a 25 na seqüência de extracelular é um aminoácido representada pela SEQ ID N°: 48.

(8) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (7), que especificamente reage com uma célula expressando CCR4.

(9) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (8), o qual tem uma atividade citotóxica maior contra uma célula expressando CCR4 do que um anticorpo monoclonal produzido por um hibridoma de animal nãohumano.

(10) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de ,O 10 anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (2) a (9), onde a ativi dade citotóxica é uma atividade citotóxica mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC).

(11) 0 anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com (10), onde a atividade ADCC é uma ati-

- 15 vidade de indução de apoptose de uma célula expressando CCR4.

(12) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (11), o qual tem uma atividade de depleção de uma célula expressando CCR4.

(13) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (8) a (12), onde a célula O expressando CCR4 é uma célula Th2.

(14) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (13), o qual tem uma atividade de inibição de produção de citocina de uma célula Th2.

(15) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com (14), onde a citocina é IL-4, IL-5 ou IL-

13.

(16) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (15), o qual per- | 30 tence a um anticorpo IgG humano.

(17) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de

I anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (16), o qual com- i i

I i

!

I

I preende regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de uma região variável (região V) de cadeia pesada (cadeia H) e uma região V de cadeia leve (L) de um anticorpo monoclonal contra CCR4.

(18) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de 5 anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (17), o qual compreende regiões de determinação de complementaridade (CDR) de uma região variável (região V) de cadeia pesada (cadeia H) e uma região V de cadeia leve (L) de um anticorpo monoclonal contra CCR4, e regiões de estrutura (FRs) de região V de cadeia H e região V de cadeia L de um anticorpo humano.

(19) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (18), o qual compreende regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de uma região variável (região V) de cadeia pesada (cadeia H) e uma região V de 15 cadeia leve (L) de um anticorpo monoclonal contra CCR4, regiões de estrutura (FRs) de região V de cadeia H e região V de cadeia L de um anticorpo humano, e região constante de cadeia H (região C) e região C de cadeia L de um anticorpo humano.

(20) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de 20 anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (19), o qual compreende região de determinação de complementaridade (CDR) 1, CDR 2, CDR 3 de uma região variável (região V) de cadeia pesada (cadeia H) de anticorpo tendo as sequências de aminoácido representadas pelas SEQ ID N°s: 1,2 e 3, respectivamente.

(21) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (20), o qual compreende região de determinação de complementaridade (CDR) 1, CDR2, CDR3 de uma região variável (região V) de cadeia leve (cadeia L) de anticorpo tendo as sequências de aminoácido representadas pelas SEQ ID N°s.

5, 6 e 7, respectivamente.

(22) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (21), o qual com .JM preende região de determinação de complementaridade (CDR) 1, CDR2, CDR3 de uma região variável (região V) de cadeia pesada (cadeia H) de anticorpo tendo as seqüências de aminoácido representadas pelas SEQ ID N°s: 1, 2 e 3, respectivamente, e região de determinação de complementaridade (CDR) 1, CDR 2 e CDR 3 de uma região V de cadeia leve (cadeia L) de anticorpo tendo as seqüências de aminoácido representadas pelas SEQ ID N°s: 5, 6 e 7, respectivamente.

(23) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (22), o qual compreende uma região variável (região V) de cadeia pesada (cadeia H) de anticorpo compreendendo uma sequência de aminoácido onde pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado de Ala na posição 40, Gly na posição 42, Lys na posição 43, Gly na posição 44, Lys na posição 76 e Ala na posição 97 na seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N . 4 é substituí do com um outro aminoácido.

(24) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (22), o qual compreende uma região variável (região V) de cadeia pesada (cadeia H) de anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido onde pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado de Thr na posição 28 e Ala na posição 97 na seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 39 e substituído com um outro aminoácido.

(25) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (24), o qual compreende uma região variável (região V) de cadeia leve (cadeia L) de anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido onde pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado de lie na posição 2, Vai na posição 3, Gin na posição 50 e Vai na posição 88 na seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 8 é substituído com um outro aminoácido.

(26) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (23) e (25), o qual compreende uma região variável (região V) de cadeia pesada (cadeia H) de

anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido onde pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado de Ala na posição 40, Gly na posição 42, Lys na posição 43, Gly na posição 44, Lys na posição 76 e Ala na posição 97 na seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 4 é substituído com um outro resíduo de aminoácido; e a região V de cadeia leve (cadeia L) de anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido onde pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado de lie na posição 2, Vai na posição 3, Gin na posição 50 e Vai na posição 88 na seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 8 é substituído com um outro resíduo de aminoácido.

(27) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (22), (24) e (25), o qual compreende uma região variável (região V) de cadeia pesada (cadeia H) de anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido onde pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado de Thr na posição 28 e Ala na posição 97 na seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 38 é substituído com um outro resíduo de aminoácido; e uma região V (de cadeia leve de anticorpo (cadeia L) compreendendo uma seqüência de aminoácido onde pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado de lie na posição 2, Vai na posição 3, Gin na posição 50 e Vai na posição 88 na seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 8 é substituído com um outro resíduo de aminoácido.

(28) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (22) e (25), o qual compreende uma região variável (região V) de cadeia pesada (cadeia H) de anticorpo compreendendo a seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 4,9, 10, 11,38, 39, 40 ou 41.

(29) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (24) e (28), o qual compreende uma região variável (região V) de cadeia leve (cadeia L) de anticorpo compreendendo a seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 8, 12, 13 ou 14.

(30) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (22), o qual compreende uma região variável (região V) de cadeia pesada (cadeia H) de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 4, 9, 10, 11, 38, 39, 40 ou 41; e uma região V de cadeia leve (cadeia L) compreendendo a seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 8, 12, 13 ou 14.

(31) O anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (22), o qual compreende uma região variável (região V) de cadeia pesada (cadeia H) de anticorpo compreendendo a seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 9 ou 10; e uma região V de cadeia leve (cadeia L) de anticorpo compreendendo a seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 14.

(32) Fragmento de anticorpo de acordo com qualquer um de (1) a (31), onde o fragmento de anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado de Fab, Fab’, F(ab')2, um anticorpo de cadeia simples (scFV), um fragmento de região variável (região V) dimerizada (Diacorpo), um fragmento de região V estabilizada com dissulfeto (dsFv) e um peptídeo compreendendo uma região de determinação de complementaridade (CDR).

(33) Anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo, o qual é produzido por um transformante KM8759 (FERM BP-8129) ou KM8760 (FERM BP-8130), ou fragmento de anticorpo do mesmo.

(34) Um transformante que produz o anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (33).

(35) Transformante de acordo com (34), onde o transformante é KM8759 (FERM BP-8129) ou KM8760 (FERM BP-8130).

(36) Processo para a produção de um transformante capaz de produzir o anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (33), o qual compreende cultura do transformante de acordo com (34) ou (35) em um meio para for mar e acumular o anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo na cultura; e recuperação do anticorpo ou o fragmento de anticorpo da cultura.

(37) Anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo onde o anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (33) é quimicamente ou geneticamente conjugado com um radioisótopo, uma proteína ou um agente.

(38) Um DNA que codifica o anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (í) a (33).

(39) Vetor recombinante que compreende o DNA de acordo com (38).

(40) Um transformante que pode ser obtido através da introdução do vetor recombinante de acordo com (39) em uma célula hospedeira.

(41) Um medicamento que compreende pelo menos um selecionado do anticorpo enxertado com CDR humano e o fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (33) e (37) como um ingrediente ativo.

(42) Um agente terapêutico para tratamento de doenças relacionadas a CCR4, o qual compreende pelo menos um selecionado de anticorpo enxertado com CDR humano e o fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (33) e (37) como um ingrediente ativo.

(43) O agente terapêutico de acordo com (42), onde a doença relacionada com CCR4 é um câncer ou doenças inflamatórias.

(44) o agente terapêutico de acordo com (43), onde o câncer é um câncer do sangue.

(45) O agente terapêutico de acordo com (44), onde o câncer de sangue é leucemia ou linfomatose.

(46) O agente terapêutico de acordo com (43), onde a doença inflamatória é supersensibilidade das vias aéreas aguda ou crônica ou asma brônquica, doença da pele atópica, rinite alérgica ou polinose.

(47) Um agente de diagnóstico para doenças relacionadas com CCR4, o qual compreende pelo menos um selecionado do anticorpo enxertado com CDR humano e o fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (33) e (37) como um ingrediente ativo.

(48) O agente de diagnóstico de acordo com (47), onde a doença relacionada com CCR4 é um câncer ou uma doença inflamatória.

(49) O agente diagnóstico de acordo com (48), onde o câncer é um câncer do sangue.

(50) O agente de diagnóstico de acordo com (48), onde o câncer de sangue é ieucemia ou linfomatose.

(51) O agente de diagnóstico de acordo com (48), onde a doença inflamatória é supersensibilidade das vias aéreas crônica, asma brônquica, doença da pele atópica, rinite alérgica ou polinose.

(52) Um agente terapêutico para tratamento de doenças imunes mediadas por Th2, o qual compreende pelo menos um selecionado do anticorpo enxertado com CDR humano e fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (33) e (37) como um ingrediente ativo.

(53) Um agente terapêutico de acordo com (52), onde a doença imune mediada com Th2 é supersensibilidade das vias aéreas crônicas, asma brônquica, doença da pele atópica, rinite alérgica ou polinose.

(54) Um agente de diagnóstico para doenças imunes mediadas por Th2, o qual compreende pelo menos um selecionado do anticorpo enxertado com CDR humano e fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (33) e (37) como um ingrediente ativo.

(55) O agente de diagnóstico de acordo com (54), onde a doença imune mediada por Th2 é supersensibilidade das vias aéreas crônica, asma brônquica, doença da pele atópica, rinite alérgica ou polinose.

(56) Um método para detecção imunológica de CCR4, o qual usa o anticorpo enxertado com CDR humano e o fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (33) e (37).

(57) Um método para detecção imunológica de uma célula que expressou CCR4 na superfície celular, o qual compreende uso do anticorpo enxertado com CDR humano ou o fragmento de anticorpo do mesmo acordo com qualquer um de (1) a (33) e (37).

(58) Um método para redução ou retirada de uma célula que expressou CCR4 na superfície celular, o qual compreende uso do anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (33) e (37).

(59) Um método para inibição de produção de citocina de uma célula Th2, o qual compreende uso do anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer um de (1) a (33) e (37).

Na presente invenção, as doenças relacionadas com CCR4 incluem cânceres, doenças inflamatórias e similares.

Na presente invenção, os cânceres incluem cânceres de sangue, particularmente leucemia, linfomatose e similares.

Na presente invenção, as doenças inflamatórias incluem supersensilidade das vias aéreas aguda ou crônica ou asma bronquial; doenças da pele atópicas, tais como dermatite atópica; rinite alérgica; polinose; e similares.

Na presente invenção, as doenças imunes mediadas por Th2 podem ser quaisquer doenças imunes às quais a célula Th2 está relacionada, e incluem supersensibilidade das vias aéreas aguda ou crônica ou asma bronquial; doenças da pele atópicas, tais como dermatite atópica; rinite alérgica; polinose; pneumonia intersticial; fibrose pulmonar; doenças autoimunes, tais como lúpus eritematoso sistêmico; e similares.

O anticorpo enxertado com CDR humano que especificamente reage com CCR4 (anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4) e um fragmento de anticorpo do mesmo da presente invenção (daqui em diante, ambos serão referidos em geral como o anticorpo da presente invenção em alguns casos) não são limitados, contanto que ele seja um anticorpo enxertado com CDR humano que especificamente reage com a região extracelular de CCR4 humano mas não reage com uma plaqueta humana ou um fragmento de anticorpo do mesmo. O termo não reage com uma plaqueta hu mana significa que o anticorpo não mostra substancialmente nenhuma atividade de ligação com uma plaqueta humana. Especificamente, isso significa que a atividade de ligação não é mostrada quando medida por um citômetro de fluxo.

Também, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo que especifica mente reage com a região extracelular de CCR4 humano e tem uma atividade citotóxica para células expressando CCR4.

A atividade de citotoxidez inclui atividade CDC e atividade ADCC.

Também, o anticorpo da presente invenção inclui anticorpos que especificamente reagem, de preferência, com uma região compreendendo as posições 1 a 39, 98 a 112, 176 a 206 ou 271 a 284 na seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 48, com mais preferência uma região compreendendo as posições 2 a 29 na seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 48 (SEQ ID N°: 36), com mais preferência ainda uma região compreendendo as posições 12 a 29 na seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 48 (SEQ ID N°: 37), e com mais preferência uma região compreendendo as posições 12 a 25 na seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 48.

O anticorpo enxertado com CDR humano representa um anticorpo onde as seqüências de aminoácido da CDR de VH e VL no anticorpo derivado de um animal não-humano são enxertadas em posições apropriadas da VH e da VL de um anticorpo humano.

O anticorpo enxertado com CDR humano da presente invenção pode ser produzido construindo cDNAs codificando regiões V onde as seqüências de aminoácido de CDR da VH e da VL em um anticorpo derivado de um animal não-humano, que especificamente reage com CCR4, são enxertadas em FR de VH e VL em um anticorpo humano, inserindo-as respectivamente em um vetor de expressão para célula animal tendo DNA codificando CH e região C de cadeia H (daqui em diante referida como CL”) de um anticorpo humano para construir um vetor de expressão de anticorpo enxertado com CDR humano e então sua introdução em uma célula de ani mal para expressar o anticorpo enxertado com CDR humano.

Como o método para seleção de seqüências de aminoácido FR de VH e VL de um anticorpo humano, qualquer método pode ser usado, contanto que elas sejam derivadas de anticorpos humanos. Exemplos incluem seqüências de aminoácido FR de VH e VL em anticorpos humanos registrados em bases de dados, tais como o Protein Data Bank e similares, ou seqüências de aminoácido comuns em cada subgrupo de FR de VH e VL em anticorpos humanos (Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dep. Health and Human Services, 1991).

Qualquer CH no anticorpo da presente invenção pode ser usada, contanto que ela pertença à imunoglobulina humana (daqui em diante referida como hlg”). De preferência, uma classe de hlgG e qualquer um das subclasses γ1, γ2, γ3 e γ4 pertencentes à classe de hlgG podem ser usadas. Também, qualquer CL no anticorpo enxertado com CDR humano pode ser usada, contanto que ela pertença a hlg e aquelas da classe κ ou da classe λ podem ser usadas.

O anticorpo da presente invenção inclui anticorpos enxertados com CDR humano ou seus fragmentos de anticorpo que compreendem anticorpo CDR1, CDR2 e CDR3 de HV compreendendo as seqüências de aminoácido representadas pelas SEQ ID N°s: 1, 2 e 3, respectivamente e/ou CDR1, CDR2 e CDR3 de VL compreendendo as seqüências de aminoácido representadas pelas SEQ ID N°s: 5, 6 e 7, respectiva mente.

Os exemplos preferidos incluem anticorpos enxertados com CDR humanos onde VH no anticorpo compreende a seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 4 ou 38 e/ou VL compreende a seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 8.

Com mais preferência, os exemplos incluem:

um anticorpo enxertado com CDR humano que compreende VH do anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido onde pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado de Ala na posição 40, Gly na posição 42, Lys na posição 43, Gly na posição 44, Lys na posição 76 e Ala na posição 97 na seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 4 é substituído com um outro resíduo de aminoácido, um anticorpo enxertado com CDR humano que compreende VH no anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido onde pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado de Thr na posição 28 e Ala na 5 posição 97 na seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 38 é substituído com um outro resíduo de aminoácido, um anticorpo enxertado com CDR humano que compreende VL no anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido onde pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado de lie na posição 2, Va! na posi10 ção 3, Gin na posição 50 e Vai na posição 88 na seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 8 é substituído com um resíduo de aminoácido, um anticorpo enxertado com CDR humano que compreende VH no anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido onde pelo me15 nos um resíduo de aminoácido selecionado de Ala na posição 40, Gly na posição 42, Lys na posição 43, Gly na posição 44, Lys na posição 76 e Ala na posição 97 na seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 4 é substituído com um outro resíduo de aminoácido; e VL no anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido onde pelo menos um resíduo de 20 aminoácido selecionado de lie na posição 2, Vai na posição 3, Gin na posição 50 e Vai na posição 88 na seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 8 é substituído com um outro resíduo de aminoácido.

um anticorpo enxertado com CDR humano que compreende VH no anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido onde pelo me25 nos um resíduo de aminoácido selecionado de Thr na posição 28 e Ala na posição 97 na seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 38 é substituído com um outro resíduo de aminoácido; e VL no anticorpo VL compreendendo a seqüência de aminoácido onde pelo menos um resíduo de aminoácido selecionado de lie na posição 2, Vai na posição 3, Gin na posi30 ção 50 e Vai na posição 88 na seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 8 é substituído com um outro resíduo de aminoácido.

A presente invenção inclui anticorpos que compreendem a sequência de aminoácido onde um ou mais aminoácido são deletados, substituídos, inseridos ou adicionados e especificamente reagem com CCR4 conforme acima descrito e seus fragmentos de anticorpo.

Na presente invenção, uma ou mais de deleção, substituição, inserção ou adição na seqüência de aminoácido significam que um ou mais aminoácidos são deletados, substituídos, inseridos e/ou adicionados a uma ou mais posições na seqüência de aminoácido. A deleção, substituição, inserção e/ou adição pode ser causada na mesma seqüência de aminoácido simultaneamente. Também, o resíduo de aminoácido substituído, inserido ou adicionado pode ser natural ou não-natural. O resíduo de aminoácido natural inclui L-alanina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-glutamina, ácido Lglutâmico, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, Lfenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, L-valina, L-cisteína e similares.

A partir de agora, exemplos preferidos de resíduos de aminoácido que são substituídos um com o outro são mostrados. Os resíduos de aminoácido no mesmo grupo podem ser substituídos um com o outro.

Grupo A:

leucina, isoleucina, norleucina, valina, norvalina, alanina, ácido 2-aminobutanóico, metionina, O-metilserina, t-butilglicina, t-butilalanina, cicloexilalanina;

Grupo B:

ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido isoaspártico, ácido isoglutâmico, ácido 2-aminoadípico, ácido 2-aminossubérico;

Grupo C:

asparagina, glutamina;

Grupo D:

lisina, arginina, ornitina, ácido 2,4-diaminobutanóico, ácido 2,3diaminopropiônico;

Grupo E:

prolina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina;

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Grupo F:

serina, treonina, homoserina;

Grupo G: fenilalanina, tirosina.

O fragmento de anticorpo da presente invenção inclui Fab, Fab¹,

F(ab')₂, scFv, Diacorpo, dsFv, um peptídeo compreendendo CDR, e similares.

Um Fab é um fragmento de anticorpo tendo um peso molecular de cerca de 50.000 e atividade de ligação de antígeno, onde cerca de metaθ 10 de do lado N-terminal da cadeia H e toda a cadeia L, dentre os fragmentos obtidos através de tratamento de IgG com protease, papaína (cortada no resíduo de aminoácido na posição 224 da cadeia H), são ligadas através de uma ligação dissulfeto.

O Fab da presente invenção pode ser obtido através de trata15 mento de um anticorpo enxertado com CDR humano da presente invenção que especificamente reage com CCR4 com uma protease, papaína. Também, o Fab pode ser produzido inserindo DNA codificando Fab do anticorpo em um vetor de expressão para procarionte ou um vetor de expressão para eucarionte, e introdução do vetor em um procarionte ou eucarionte para ex20 pressar Fab.

O Um F(ab’)₂ é um fragmento de anticorpo tendo um peso molecular de cerca de 100.000 e atividade de ligação de antígeno, o qual é ligeiramente maior do que o Fab ligado através de uma ligação dissulfeto da região ligada, dentre os fragmentos obtidos através de tratamento de IgG com uma i 25 protease, pepsina.

O F(ab')₂ da presente invenção pode ser obtido através de tratamento de um anticorpo enxertado com CDR humano que especificamente reage com CCR4 com uma protease, pepsina. Também, o F(ab')₂ pode ser produzido ligando Fab¹ descrito abaixo através de uma ligação tioéter ou 30 uma ligação dissulfeto.

! Um Fab’ é um fragmento de anticorpo tendo um peso molecular i de cerca de 50.000 e atividade de ligação de antígeno, o qual é obtido cor tando uma ligação dissulfeto da região ligada do F(ab')₂.

O Fab¹ da presente invenção pode ser obtido tratando o F(ab')₂ que especificamente reage com CCR4 com um agente de redução, ditiotreitol. Também, o Fab’ da presente invenção pode ser produzido inserindo 5 DNA codificando um Fab’ de um anticorpo enxertado com CDR humano da presente invenção que especificamente reage com CCR4 em um vetor de expressão para procariontes ou um vetor de expressão para eucariontes e introdução do vetor em um procarionte ou eucarionte para expressar o Fab'.

Um scFV é um polipeptídeo de VH-P-LV ou VL-P-VH onde uma Q 10 cadeia VH e uma cadeia VL são ligadas usando um ligante de peptídeo apropriado (P) de 12 ou mais resíduos e que tem uma atividade de ligação de antígeno.

O scFv da presente invenção pode ser produzido obtendo-se cDNAs codificando VH e VL de um anticorpo enxertado com CDR humano 15 que especificamente reage com CCR4 da presente invenção, construindo DNA codificando scFv, inserindo o DNA no vetor de expressão para procarionte ou um vetor de expressão para eucarionte, e então introduzindo o vetor de expressão em um procarionte ou eucarionte para expressar o scFv.

Um diacorpo é um fragmento de anticorpo onde scFv's tendo a 20 mesma ou uma diferente especificidade de ligação de antígeno formam um O dímero, e tem uma atividade de ligação de antígeno dívalente para o mesmo antígeno ou duas atividades de ligação de antígeno específicas para antígenos diferentes.

O diacorpo da presente invenção, por exemplo, um diacorpo di25 valente que especificamente reage com CCR4, pode ser produzido obtendo cDNAs codificando VH e VL de um anticorpo que especificamente reage com CCR4, construindo DNA codificando scFv tendo um ligante de polipeptídeo de 3 a 10 resíduos, inserindo o DNA em um vetor de expressão para procarionte ou um vetor de expressão para eucarionte, e então introdu30 ção do vetor de expressão em um procarionte ou eucarionte para expressar I o diacorpo.

| Um dsFv é obtido ligando polipeptídeos onde um resíduo de |

aminoácido de cada um de VH e VL é substituído com um resíduo de cisteína através de uma ligação dissulfeto entre os resíduos de cisteína. O resíduo de aminoácido que é substituído com um resíduo de cisteína pode ser selecionado com base em uma estimativa de estrutura tridimensional do an5 ticorpo de acordo com o método mostrado por Reiter e outros (Protein Engineering, 7, 697 (1994)).

O dsFV da presente invenção pode ser produzido obtendo-se cDNAs codificando VH e VL de um anticorpo enxertado com CDR humano que especifica mente reage com CCR4 da presente invenção, construindo O 10 DNA codificando dsFv, inserindo DNA no vetor de expressão para procarionte ou um vetor de expressão para eucarionte, e então introdução do vetor de expressão em um p roca rio nte ou eucarionte para expressar o dsFv.

Um peptídeo compreendendo CDR é constituído incluindo pelo menos uma região de CDRs de cadeia H e de cadeia L. CDRs plurais po15 dem ser ligadas diretamente ou através de um ligante de peptídeo apropriado.

O peptídeo compreendendo CDR da presente invenção pode ser produzido obtendo-se cDNA codificando CDR de VH e VL de um anticorpo enxertado com CDR humano que especificamente reage com CCR4, cons20 truindo DNA codificando CDR, inserindo o DNA no vetor de expressão para procarionte ou um vetor de expressão para eucarionte, e então introduzindo o vetor de expressão em um procarionte ou eucarionte para expressar o peptídeo. Também, o peptídeo compreendendo CDR pode ser produzido através de um método de síntese química, tal como um método Fmoc (mé25 todo de trifluormetoxicarbonila), um método tBoc (método t-butiloxicarbonila) ou similar.

O anticorpo da presente invenção inclui derivados de anticorpo onde um radioisótopo, uma proteína, um agente ou similar é quimicamente ou geneticamente conjugado ao anticorpo da presente invenção.

Os derivados de anticorpo da presente invenção podem ser produzidos conjugando quimicamente um radioisótopo, uma proteína ou um agente ao lado N-terminal ou lado C-terminal de uma cadeia H ou cadeia L de um anticorpo ou fragmento de anticorpo que especificamente reage com CCR4, a um grupo substituinte apropriado ou cadeia lateral do anticorpo ou fragmento de anticorpo ou a uma cadeia de açúcar no anticorpo ou fragmento de anticorpo (Antibody Engineering Handbook, editado por Osamu Kanemitsu, publicado pela Chijin Shokan (1994)).

Também, ele pode ser geneticamente produzido ligando um DNA codificando o anticorpo ou fragmento de anticorpo da presente invenção que especificamente reage com CCR4 a um outro DNA codificando uma proteína a ser ligada, inserindo o DNA em um vetor de expressão, e introduzindo o vetor de expressão em uma célula hospedeira.

O radioisótopo inclui ¹³¹l, ¹²⁵l e similares, e ele pode ser conjugado ao anticorpo através de, por exemplo, um método de cloramina T.

O agente é de preferência um composto de baixo peso molecular. Exemplos incluem agentes anticâncer tal como agentes de alquilação (por exemplo, mostarda de nitrogênio, ciclofosfamida), antagonistas metabólicos (por exemplo, 5-fluoracila, metotrexato), antibióticos (por exemplo, daunomicina, bleomicina, mitomicina C, daunorrubicina, doxorrubicina), alcalóides de planta (por exemplo, vincristina, vinblastina, vindesina), drogas de hormônio (por exemplo, tamoxifen, dexametasona) e similares (Clinica! Oncology, editado pela Japanese Society of Clinical Oncology, publicado por Cancer and Chemoterapy (1996)); agentes antiinflamatórios tal como agentes esteróides (por exemplo, hidrocortisona, prednisona), drogas nãoesteroidais (por exemplo, aspirina, indometacina), imunomoduladores (por exemplo, aurotiomalato, penicilamina), agentes de imunossupressão (por exemplo, ciclofosfamida, azatioprina) e agentes anti-histamínicos (por exemplo, maleato de clorfeniramida, clemastina) (Inflammation and Antiinflammatory Therapy, Ishiyaku Shuppan (1982)); e similares. O método para conjugação de daunomicina a um anticorpo inclui um método onde a daunomicina e um grupo amino de um anticorpo são conjugados através de glutaraldeído, um método onde um grupo amino da daunomicina e um grupo carboxila de um anticorpo são conjugados através de uma carbodiimida solúvel em água, e similares.

3ύ

A proteína é de preferência citocina que ativa células imune. Exemplos incluem interleucina 2 humana (daqui em diante referida como hlL2), fator de estimulação de colônia de macrófago de granulócito humano (daqui em diante referido como hGM-CSF), fator de estimulação de colônia 5 de macrófago humano (daqui em diante referido como hM-CSF), interleucina 12 humana (daqui em diante referida como hlL-12), e similares. Também, a fim de inibir as células cancerosas diretamente, uma toxina tal como ricina, toxina da difteria e similares, pode ser usada. Por exemplo, um anticorpo de fusão com uma proteína pode ser produzido ligando um cDNA co10 dificando um anticorpo ou um fragmento de anticorpo a um outro cDNA codificando a proteína, construindo DNA codificando o anticorpo de fusão, inserindo o DNA em um vetor de expressão para procarionte ou um vetor de expressão para eucarionte, e então introdução dele em um procarionte ou eucarionte para expressar o anticorpo de fusão.

Métodos para produção de anticorpo enxertado com CDR humano e o fragmento de anticorpo do mesmo que especificamente reage com CCR4, métodos para avaliação da sua atividade e métodos para usá-los são explicados abaixo.

1. Preparação de anticorpo enxertado com CDR humano (1) Construção de vetor de expressão de anticorpo humanizado

Um vetor de expressão de anticorpo humanizado é um vetor de expressão para célula animal onde genes codificando CH e CL de anticorpo humano foram inseridos, e é construído clonando cada um de CH e CL de um anticorpo humano em um vetor de expressão para célula animal.

A região C de um anticorpo humano pode ser CH e CL de qualquer anticorpo humano. Exemplos incluem CH de subclasses γ e CL de classe κ de um anticorpo humano, e similares. Também, cDNA pode ser usado. Como o vetor de expressão para célula animal, qualquer vetor de expressão pode ser usado, contanto que uma região C de um anticorpo hu30 mano possa ser inserida e expressa. Exemplos incluem pAGE107 (Cytotechnology, 3, 133 (1990)), pAGE103 (J. Biochem., 101, 1307 (1987)), pHSG274 (Gene, 27, 223 (1984)), pKCR (Proc. Natl. Acad. Sc/., USA, 78,

1527 (1981)), pSGIp2-4 (Cytotechnology, 4, 173 (1990)), pSE1 UK1Sed1-3 (CytotechnoL 13, 79, 1993)) e similares. Um promotor e um realçador usados para um vetor de expressão para célula animal incluem um promotor e um realçador SV40 inicial (J. Biochem., 101, 1307 (1987)), um promotor e realçador de virus de leucemia de camundongo Moloney LTR (Biochem. Biophys. Res. Common., 149, 690, (1987)), um promotor de cadeia H de imunoglobulina (Cell, 41,479 (1985)) e um realçador (Cell, 33, 717 (1983)) e similares.

O vetor de expressão de anticorpo humanizado pode ser ou de um tipo onde um gene codificando uma cadeia H de anticorpo e um gene codificando uma cadeia L de anticorpo existem em vetores separados ou de um tipo onde ambos genes existem no mesmo vetor (tipo tandem). Com relação à facilidade de construção de um vetor de expressão de anticorpo humanizado, facilidade de introdução em células animais, e equilíbrio entre as quantidades de expressão de anticorpo de cadeias H e L em células animais, um tipo em tandem do vetor de expressão de anticorpo humanizado é mais preferido (J. Immunol. Methods., 167, 271 (1994)). O tipo em tandem do vetor de expressão de anticorpo humanizado inclui pKANTEX93 (WO 97/10354), pEE18 (HYBRIDOMA, 17, 559 (1998)) e similares.

O vetor de expressão de anticorpo humanizado construído pode ser usado para expressão de um anticorpo enxertado com CDR humano em células animais.

(2) Construção de cDNA codificando região V de anticorpo enxertado com CDR humano cDNAs codificando VH e VL de um anticorpo enxertado com CDR humano podem ser obtidos como segue. Primeiro, sequências de aminoácido de FRs em VH e VL de um anticorpo humano ao qual seqüências de aminoácido de CDRs em VH e VL de um anticorpo derivado de um anticorpo de animal não-humano são enxertadas são selecionadas. Quaisquer seqüências de aminoácido de FRs em VH e VL de um anticorpo humano podem ser usadas, contanto que elas sejam derivadas de seres humanos. Exemplos incluem seqüências de aminoácido de FRs em VH e VL de anti33 corpos humanos registrados em bases de dados tal como Protein Data Bank e similares, e sequências de aminoácido comuns a subgrupos de FRs em VH e VL de anticorpos humanos (Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health and Human Services (1991)), e similares. A firn de produzir um anticorpo enxertado com CDR humano tendo atividade potente, seqüências de aminoácido tendo alta homologia (pelo menos 60% ou mais) com seqüência de aminoácido de FRs em VH e VL de um anticorpo alvo derivado de um animal não-humano são de preferência selecionadas.

Então, seqüências de aminoácido de CDRs em VH e VL do anticorpo derivado de um animal não-humano são enxertadas nas seqüências de aminoácido selecionadas de FRs em VH e VL de um anticorpo humano para projetar seqüências de aminoácido de VH e VL de um anticorpo enxertado com CDR humano. As seqüências de aminoácido projetadas são convertidas em seqüências de DNA considerando a freqüência de uso do códon encontrado em seqüências de nucleotídeo de genes de anticorpos (Sequence of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health and Human Services (1991)), e as seqüências de DNA codificando as seqüências de aminoácido de VH e VL de um anticorpo enxertado com CDR humano são projetadas. Vários DNAs sintéticos tendo um comprimento de cerca de 100 a 200 nucleotídeos são sintetizados, e PCR é realizado usando-os. Neste caso, é preferido em cada uma de VH e VL que 4 ou 6 DNAs sintéticos sejam designados em vista da eficiência de reação de PCR e dos comprimentos de DNAs que podem ser sintetizados. Ainda, eles podem ser facilmente clonados no vetor de expressão de anticorpo humanizado construído no item 1(1) introduzindo a seqüência de reconhecimento de uma enzima de restrição apropriada na extremidade 5' dos DNAs sintéticos presentes em ambas extremidades. Após o PCR, um produto amplificado é clonado em um plasmídeo tal como pBluescript SK (-) (fabricado pela Stratagene) ou similar, e as seqüências de nucleotídeo são determinadas para se obter um plasmídeo tendo seqüências de DNA codificando VH e VL de anticorpo enxertado com CDR humano designado.

(3) Modificação de seqüência de aminoácido de região V de anticorpo en-

............ φ xertado com CDR humano

Sabe-se que quando um anticorpo enxertado com CDR humano é produzido simplesmente enxertando apenas CDRs em VH e VL de um anticorpo derivado de um animal não-humano nas FRs em VH e VL de um anticorpo humano, sua atividade de ligação de antígeno é menor do que aquela do anticorpo original derivado de um animal não-humano (BIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)). Como a razão, é considerado que vários resíduos de aminoácido não são apenas CDRs mas também FRs diretamente ou indiretamente relacionadas à atividade de ligação de antígeno em VH e VL do anticorpo original derivado de um animal não-humano, e que eles são mudados para resíduos de aminoácido diferentes de FRs diferentes em VH e VL de um anticorpo humano. A fim de resolver o problema, em anticorpos enxertados com CDR humano, dentre as seqüências de aminoácido de FRs em VH e VL de um anticorpo humano, um resíduo de aminoácido que diretamente se relaciona à ligação a um antígeno, ou um resíduo de aminoácido que indiretamente se relaciona à ligação a um antígeno interagindo com um resíduo de aminoácido em CDR ou mantendo a estrutura tridimensional de um anticorpo é identificado e modificado para um resíduo de aminoácido que é encontrado no anticorpo de animal não-humano original para desse modo aumentar a atividade de ligação de antígeno que foi diminuída (BIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)). Na produção de um anticorpo enxertado com CDR humano, como eficientemente identificar os resíduos de aminoácido que se relacionam com a atividade de ligação de antígeno em FR é mais importante, de modo que a estrutura tridimensional de um anticorpo é construída e analisada através de cristalografia de raio X (J. Mol. Biol., 112, 535 (1977)), modelagem por computador (Protein Engineering, 7, 1501 (1994)) ou similar. Embora a informação da estrutura tridimensional de anticorpos tenha sido útil na produção de um anticorpo enxertado com CDR humano, nenhum método para produção de um anticorpo enxertado com CDR humano que possa ser aplicado a quaisquer anticorpos foi ainda estabelecido. Desse modo, várias tentativas devem ser atualmente necessárias, por exemplo, vários anticorpos modificados de cada anticorpo são produzi31 dos e a relação entre cada um dos anticorpos modificados e sua atividade de ligação de anticorpo é examinada.

A modificação da seqüência de aminoácido selecionada de FRs em VH e VL de um anticorpo humano pode ser realizada usando vários DNA sintéticos para modificação de acordo com PCR. Com relação ao produto amplificado obtido através de PCR, a seqüência de nucleotídeo é determinada de acordo com o método conforme descrito no item 1(2) de modo que se a modificação alvo foi realizada é confirmado.

(4) Construção de vetor de expressão de anticorpo enxertado com CDR humano

Um vetor de expressão de anticorpo enxertado com CDR humano pode ser construído clonando cDNAs codificando VH e VL do anticorpo enxertado com CDR humano construído nos itens 1(2) e 1(3) a montante dos genes codificando VH e VL do anticorpo humano no vetor de expressão de anticorpo humanizado conforme descrito no item 1(1). Por exemplo, quando sítios de reconhecimento para enzimas de restrição apropriadas são introduzidos no terminal 5' de DNAs sintéticos posicionados em ambas extremidades entre DNAs sintéticos usados na construção de VH e VL do anticorpo enxertado com CDR humano nos itens 1(2) e (3), clonagem pode ser realizada de modo que eles são expressos em uma forma apropriada a montante dos genes codificando CH e CL do anticorpo humano no vetor de expressão de anticorpo humanizado conforme descrito no item 1(1).

(5) Expressão transiente de anticorpo enxertado com CDR humano

De modo a eficientemente avaliar a atividade de ligação de antígeno de vários anticorpos enxertados com CDR humanos produzidos, os anticorpos enxertados com CDR humanos podem ser expressos transientemente usando o vetor de expressão de anticorpo enxertado com CDR humano conforme descrito no item 1(4) ou seu vetor de expressão modificado. Qualquer célula pode ser usada como uma célula hospedeira, contanto que a célula hospedeira possa expressar um anticorpo enxertado com CDR humano. Em geral, célula COS-7 (ATCC CRL1651) é usada em vista de sua alta quantidade de expressão (Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, p.

283 (1991)). O método de introdução do vetor de expressão em célula COS7 inclui um método de DEAE-dextrano (Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, p. 283 (1991)), um método de lipofecção (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413 (1987)), e similares.

Após introdução do vetor de expressão, a quantidade de expressão e a atividade de ligação de antigeno do anticorpo enxertado com CDR humano no sobrenadante de cultura podem ser determinadas através do imunoensaio de enzima (ELISA); Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Capítulo 14 (1988), Monoclonal Antibodies: Prin~ 10 ciples and Practice, Academic Press Limited (1996)) e similares.

(6) Expressão estável de anticorpo enxertado com CDR humano

Um transformante que produz um anticorpo enxertado com CDR humano estavelmente pode ser obtido introduzindo em uma célula hospedeira apropriada o vetor de expressão de anticorpo enxertado com CDR huma15 no descrito no item 1(4).

O método para introdução do vetor de expressão em uma célula hospedeira inclui eletroforação (Cytotechnology, 3, 133 (1990)) e similares.

Qualquer célula pode ser usada como a célula hospedeira onde o vetor de expressão de anticorpo enxertado com CDR humano deve ser 20 introduzido, contanto que ela possa expressar um anticorpo enxertado com CDR humano. Exemplos incluem célula SP2/0-Ag14 de camundongo (ATCC CRL1581), célula P3X63-Ag8.653 de camundongo (ATCC CRL1580), célula CHO onde um gene de diidrofolato redutase (defr) pode ser detectado (Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 77, 4216 (1980)), célula YB2/3HL.P2.G11.16Ag.2O 25 de rato (célula YB2/0; ATCC CRL1662) e similares.

Após introdução do vetor de expressão, transformantes que expressam um anticorpo enxertado com CDR humano estavelmente são selecionados através de cultura em um meio para cultura de célula animal contendo um agente tal como sulfato de G418 (G418; fabricado pela Sigma) ou 30 similar (J. Immunol. Methods., 167, 271 (1994)). O meio para cultura de célula animal inclui meio PRMI640 (fabricado pela Nissui Pharmaceutical), meio GIT (fabricado pela Nissui Pharmaceutical), meio EX-CELL302 (fabri-

cado pela JRH), meio IMDM (fabricado pela GIBCO BRL), meio de hibridoma-SFM (fabricado pela GIBCO BRL), meio obtido através da adição de vários aditivos tal como FBS a esses meios e similares. O anticorpo enxertado com CDR humano pode ser produzido e acumulado em um meio de cultura culturando os transformantes selecionados em um meio. A quantidade de expressão e atividade de ligação de antígeno do anticorpo humanizado no sobrenadante de cultura podem ser medidas através de ELISA ou similar. Também, no transformante, a quantidade de expressão do anticorpo enxertado com CDR humano pode ser aumentada usando sistema de amplificação de dhfr ou similar (J. Immunol. Methods., 167, 271 (1994)).

O anticorpo enxertado com CDR humano pode ser purificado a partir do sobrenadante da cultura do transformante usando uma coluna de proteína A (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Capítulo 8 (1988), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)). Quaisquer outros métodos convencionais para purificação de proteína podem ser usados. Por exemplo, o anticorpo humanizado pode ser purificado através de uma combinação de filtragem de gel, cromatografia de troca de íon, ultrafiltragem e similares. O peso molecular da cadeia H ou cadeia L do anticorpo humanizado purificado ou da molécula de anticorpo como um todo é determinado através de eletroforese de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE; Nature, 227, 680 (1970)), Western blotting (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Capítulo 12 (1988), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996)) e similares.

2- Preparação de fragmento de anticorpo

O fragmento de anticorpo pode ser preparado baseado no anticorpo humanizado descrito no item 1 usando engenharia genética ou engenharia de proteína. O fragmento de anticorpo inclui Fab, F(ab')2, Fab', sdFv, diacorpo, dsFv, um peptídeo compreendendo CDR, e similares.

(1) Preparação de Fab

Fab pode ser preparado tratando IgG com uma papaína de enzima proteolítica. Após o tratamento com papaína, quando o anticorpo origi34

nal é uma subclasse de IgG tendo uma atividade de ligação de proteína A, Fab uniforme pode ser recuperado separando-o de moléculas de IgG e fragmentos de Fc passando por uma coluna de proteína A (Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, terceira edição (1995)). Quando o anticorpo original é um anticorpo da subclasse de IgG não tendo nenhuma atividade de ligação de proteína A, Fab pode ser recuperado através de cromatografia de troca de íon em uma fração eluída em uma concentração de sal baixa (Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, terceira edição (1995)). Em adição, Fab pode ser também preparado através de técnicas de engenharia genética usando Escherichia coli. Por exemplo, um vetor de expressão de Fab pode ser preparado através de clonagem do DNA codificando a região de anticorpo V descrita nos itens 1(2) e 1(3) em um vetor de expressão de Fab. Como o vetor de expressão de Fab, qualquer vetor pode ser usado, contanto que um DNA para Fab possa ser inserido e expresso. Exemplos incluem plT106 (Science, 240, 1041 (1988)) e similares. Fab pode ser formado e acumulado em um corpo de inclusão ou espaço periplásmico através de introdução do vetor de expressão de Fab em uma Escherichia coli apropriada. Fab ativo pode ser obtido do corpo de inclusão através de um método de redobra geralmente usado para proteína, e quando ele é expresso no espaço periplásmico, Fab ativo é gotejado no sobrenadante de cultura. Fab uniforme pode ser purificado após a redobra ou do sobrenadante de cultura usando uma coluna ligada a anticorpo (Antibody Engineering, A Practical Guide, W.H. Freeman and Company (1992)).

(2) Preparação de F(ab')₂

F(ab')₂ pode ser preparado tratando IgG com papaina de uma enzima proteolítica. Após o tratamento com papaina, ele pode ser recuperado como F(ab’)₂ uniforme através de um procedimento de purificação similar ao caso de Fab (Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, terceira edição, Academic Press (1995)). Em adição, ele pode ser também preparado através do método descrito no item 2(3) onde Fab’ é tratado com maleimida tal como o-PDM, hexano bismaleimida ou similar para formar uma ligação tioéter, ou um método onde ele é tratado com DTNB para formar uma ligação S-S (Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press (1996)).

(3) Preparação de Fab'

Fab’ pode ser preparado através de técnicas de engenharia genética usando Escherichia coli. Por exemplo, um vetor de expressão de Fab¹ pode ser construído clonando o DNA codificando a região V de anticorpo conforme descrito nos itens 1(2) e (3) em um vetor para expressão de Fab'. Como o vetor para expressão de Fab', qualquer vetor pode ser usado, contanto que um DNA para Fab' possa ser inserido e expresso. Exemplos incluem pAK19 (Bio/Technology, 10, 163 (1992)) e similares. Fab' pode ser formado e acumulado em um corpo de inclusão ou espaço periplásmico introduzindo o vetor de expressão de Fab'em uma Escherichia coli apropriada. Fab’ ativo pode ser obtido do corpo de inclusão através de um método de redobra geralmente usado para proteína, e quando ele é expresso no espaço periplásmico, ele pode ser convertido em porção extracelular rompendo as células com tratamento tal como digestão parcial de lisozima, choque de pressão osmótica, sonificação ou similar.· Fab' uniforme pode ser purificado após redobra ou da suspensão de célula rompida usando uma coluna de proteína G ou similar (Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press (1996)).

(4) Preparação de scFv scFv pode ser preparado usando um fago ou Escherichia coli através de técnicas de engenharia genética. Por exemplo, um DNA codificando scFv é produzido ligando DNAs codificando o anticorpo de VH e VL descrito nos itens 1(2) e (3) através de um DNA codificando um ligante de polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido de 12 resíduos ou mais. Um vetor de expressão de scFv pode ser construído clonando o DNA resultante em um vetor para expressão de scFv. Como o vetor de expressão de scFv, qualquer vetor pode ser usado, contanto que um DNA para scFv possa ser inserido e expresso. Exemplos incluem pCANTAB5E (fabricado pela Pharmacia), Phfa (Hum. Antibody Hybridoma, 5, 48 (1994)) e similares. O vetor de expressão de scFv foi introduzido em uma Escherichia coli apropriada e infectado com um fago auxiliar para desse modo obter um fago que expressa scFv na superfície do fago em uma forma fundida com a proteína de superfície do fago. Também, scFv pode ser formado e acumulado no corpo de inclusão ou espaço periplásmico de Escherichia coli onde vetor de expressão de scFv é introduzido. scFv ativo pode ser obtido do corpo de inclusão através de um método de redobra geralmente usado para proteína, e quando ele é expresso no espaço periplásmico, ele pode ser recuperado extracelularmente através de rompimento das células com um tratamento tal como digestão parcial de lisozima, choque de pressão osmótica, sonificação ou similar. scFv uniforme pode ser purificado após a redobra ou a partir da suspensão de célula rompida através de cromatografia de troca de íon ou similar (Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press (1996)).

(5) Preparação de diacorpo

Diacorpo pode ser preparado mudando o tamanho do ligante de polipeptídeo para preparação de scFv para cerca de 3 a 10 resíduos. Um diacorpo divalente pode ser preparado quando VH e VL das espécies de anticorpo forem usadas, e um diacorpo tendo duas especificidades diferentes quando VH e VL de duas espécies de anticorpo forem usadas (FEBS Letters, 453, 164 (1999), Int. J. Cancer., 77, 763 (1998)).

(6) Preparação de dsFv dsFv pode ser preparado usando Escherichia coli através de técnica de engenharia genética. Primeiro, DNAs onde um resíduo de aminoácido codificado é substituído com um resíduo de cisteína são produzidos através de introdução de mutação em posições apropriadas dos DNAs codificando as VH e VL de anticorpo descrito nos itens 1 (2) e 1 (3). Vetores de expressão de VH e VL podem ser produzidos clonando cada um dos DNAs resultantes em um vetor para expressão de dsFv. Como o vetor para expressão de dsFv, qualquer vetor pode ser usado, contanto que um DNA para dsFv possa ser inserido e expresso. Exemplos incluem pULI9 (Protein Engeneering, 7, 697 (1994)) e similares. Os vetores de expressão de VH e VL são introduzidos em uma Escherichia coli apropriada para desse modo formarem e acumularem a VH e VL no corpo de inclusão ou espaço periplás υ|_Ύ mico. As VH e \ZL são obtidas do corpo de inclusão ou espaço periplásmico e misturadas, e dsFv ativo pode ser obtido através de um método de redobra geralmente usado para proteína. Após a redobra, ele pode ser adicionalmente purificado através de cromatografia de troca de íon e filtragem de gel ou similar (Protein Engeneering, 7, 697 (1994)).

(7) Preparação de peptídeo compreendendo CDR

Um peptídeo compreendendo CDR pode ser preparado através de um método de síntese química tal como Fmoc, tBoc ou similar. Também, um DNA codificando um peptídeo compreendendo CDR é preparado, e o DNA resultante é clonado em um vetor apropriado para expressão para desse modo preparar o peptídeo compreendendo CDR. Como o vetor para expressão, qualquer vetor pode ser usado, contanto que um DNA codificando um peptídeo compreendendo CDR seja inserido e expresso. Exemplos incluem pLEX (fabricado pela Invitrogen), pAX4a+ (fabricado pela Invitrogen) e similares. O vetor de expressão é introduzido em uma Escherichia coli apropriada de modo que o peptídeo compreendendo CDR possa ser formado e acumulado no corpo de inclusão ou espaço periplásmico. O peptídeo compreendendo CDR pode ser obtido do corpo de inclusão ou espaço periplásmico, e ele pode ser purificado através de cromatografia de troca de íon e filtragem em gel ou similar (Protein Engineering, 7, 697 (1994)).

3. Avaliação da atividade e propriedade do anticorpo da presente invenção (1) Avaliação da atividade de ligação para antígeno

Uma atividade de ligação do anticorpo da presente invenção para um antígeno pode ser medida através de ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), técnica de anticorpo fluorescente (Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993), ressonância de plasmônio de superfície usando tal como BIAcore® e similares. Especificamente, um peptídeo sintético compreendendo uma seqüência parcial de CCR4 é produzido e um conjugado é preparado através de ligação química a uma proteína veículo tal como albumina de soro bovino ou similar. Uma atividade de ligação de CCR4 do anticorpo da presente invenção pode ser medida imobilizando o conjugado em uma placa de ELISA, permitindo que ele reaja com o anticorpo da pre sente invenção, permitindo ainda que ele reaja com um anticorpo ou fragmento de ligação marcado tal como anticorpo ou fragmento de ligação marcado com peroxidase ou biotina, e então medição de um corante colorido usando um fotômetro de absorção.

(2) Reatividade para células expressando CCR4

A fim de examinar a reatividade para células expressando CCR4, é preferível usar um método para detectar eficiente mente CCR4 expresso na superfície celular. O método inclui citometria de fluxo usando técnica de anticorpo fluorescente e similares. Em adição, quando a reatividade 10 com células do corpo vivas tal como plaqueta e similares é examinada, é preferível realizar o exame sob condições tão próximas quanto possíveis do corpo vivo. Por essas razões, quando a reatividade do anticorpo anti-CCR4 da presente invenção é examinada, é mais desejável realizar o exame através de citometria de fluxo usando técnica de anticorpo fluorescente.

O anticorpo usado na técnica de anticorpo fluorescente pode ser ou um anticorpo marcado com um material fluorescente tal como FITO, biotina ou similar, ou um anticorpo não-marcado. Dependendo da presença ou ausência de um marcador do anticorpo usado e seu tipo, avidina marcada com fluorescência, um anticorpo de imunoglobulina anti-humano marcado 20 com fluorescência e similares são usados. A reatividade pode ser avaliada realizando a reação adicionando uma quantidade suficiente de um anticorpo anti-CCR4 (geralmente de a partir de 0,1 a 10 pg/ml como a concentração final) a uma amostra testada e comparando sua reatividade com aquela de um anticorpo de controle negativo e um anticorpo de controle positivo.

(3) Atividade citotóxica

A atividade citotóxica para células expressando CCR4 pode ser avaliada medindo a atividade de CDC, atividade de ADCC e similares (Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)). Mudanças na quantidade de citocina produzida podem ser medidas através do método ELISA, técnica de 30 anticorpo fluorescente e similares usando um anticorpo para citocina.

(4) Atividade de inibição de ligação de ligante

Uma atividade de inibição de ligação de ligante do anticorpo antiCCR4 da presente invenção pode ser examinada usando um marcador de TARC ou MDC como um ligante tendo uma atividade de ligação para CCR4 e uma célula expressando CCR4 ou uma fração de membrana celular dela. TARC ou MDC pode ser marcado através de qualquer técnica que possam 5 ser detectado, e exemplos incluem marcação fluorescente, marcação de enzima, marcação com radiação e similares. Exemplos específicos incluem o método através de medição da atividade de inibição de ligação usando um marcador de radiação descrito no WO 00/42074.

Também, uma atividade de inibição de ligação de ligante do an10 ticorpo anti-CCR4 da presente invenção pode ser examinada usando uma resposta celular induzida por ligação de um ligante a CCR4 como um índice. A resposta celular pode ser de qualquer tipo, contanto que ela seja induzida através de contato de um ligante com uma célula expressando CCR4, e exemplos incluem mudanças na concentração de cálcio intracelular, migra15 ção celular e similares. Exemplos específicos incluem o método de medição de inibição de migração de uma célula expressando CCR4 induzida por um ligante de CCR4 descrito no WO 00/42074.

(5) Exame de seqüência de reconhecimento

Uma seqüência de aminoácido reconhecível através do anticor20 po da presente invenção pode ser determinada usando um peptídeo sintético designado com base na seqüência primária de sua proteína de antígeno correspondente.

Uma seqüência primária do peptídeo sintético é designada com base na seqüência primária da proteína de antígeno. A fim de preparar uma 25 proteína onde o peptídeo sintético é reticulado com uma proteína veículo, um resíduo de cisteína pode ser adicionado ao terminal carboxila ou terminal amino do peptídeo sintético. A proteína resultante pode ser usada no ELISA que será descrito mais tarde. Também, se necessário, o terminal N e o terminal C do peptídeo sintético podem ser acetilados e amidados, respectiva30 mente.

Um peptídeo pode ser sintetizado através de um método de sintetização de peptídeo de fase líquida ou fase sólida geral, e qualquer método combinado dele ou um método modificado dele (International Journal of Peptide Protein Research, 35, 161-214 (1990), Solid-Phase Peptide Syntheis, Methods in Enzymology, vol. 289, editado por Gregg B. Fields, Academic Press (1997), Peptide Synthesis Protocols, Methods in Molecular 5 Biology, vol. 35, editado por Michael W. Pennington e Bem M. Dunn., Humana Press (1994)).

Em adição, um sintetizador de peptídeo automático pode ser também usado. Síntese de um peptídeo por um sintetizador de peptídeo pode ser realizada por um sintetizador de peptídeo comercialmente disponí10 vel tal como um sintetizador de peptídeo fabricado pela Shimadzu Corp., o sintetizador de peptídeo fabricado pela Advanced ChemTech Inc., USA (daqui em diante referido como ACT) ou similar, usando Na-Fmoc-aminoácidos, Nci-Boc-aminoácidos ou similar cujas cadeias laterais são apropriadamente protegidas e de acordo com os respectivos programas de síntese. 15 Os aminoácidos protegidos usados como material de partida e resinas veículo podem ser comprados da ABI Inc., Shimadzu Corp., Kokusan Kagaku, K.K., NovaBiochem, Watanabe Kagaku K.K., ACT, AnaSpec Inc., Peptide Research Institute e similares.

Como o método para determinação de uma seqüência de ami20 noácido reconhecível pelo anticorpo da presente invenção usando peptídeo sintético, qualquer técnica pode ser usada, contanto que ele seja um método que possa detectar ligação do peptídeo sintético ao anticorpo. Por exemplo, a seqüência de aminoácido reconhecível pelo anticorpo pode ser determinada marcando o peptídeo sintético com um material fluorescente, um material 25 radioativo ou similar e exame da atividade de ligação do peptídeo marcado resultante com o anticorpo. Também, ele pode ser realizado reticulando o peptídeo sintético com uma proteína tal como albumina de soro bovino (BSA) ou similar e avaliação da reatividade da proteína resultante com o anticorpo através de ELISA ou similar. Em adição, uma seqüência de aminoá30 cido reconhecível pelo anticorpo da presente invenção pode ser também determinada usando uma substância já confirmada que o anticorpo se liga a ela, tal como uma proteína de anticorpo, e exame de um peptídeo sintético que inibe ligação do anticorpo à substância.

4. Método para a detecção e quantificação de CCR4 usando anticorpo antiCCR4

A presente invenção refere-se a um método para detectar e de5 terminar imunologicamente CCR4 ou uma célula expressando CCR4 sobre a sua superfície usando o anticorpo da presente invenção.

Os métodos para detectar e determinar imunologicamente CCR4 ou uma célula expressando CCR4 na sua superfície usando o anticorpo da presente invenção incluem um método imunofluorescente, um ensaio 10 imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), um imunoensaio marcado com material radioativo (RIA), um método de fingimento imunoistoquímico tal como um método de fingimento de imunócito, um método de fingimento de imunotecido, ou similar (método ABC, método CSA, etc), o imunoensaio de enzima acima, um ELISA intercalado (Monoclonal Antibody Experiment Ma15 nual (publicado por Kodansha Scientific, 1987), Second Series Biochemical Experiment Course, Vol. 5, Immunobiochemistry Research Method, publicado por Tokyo Kagaku Dojin (1986)).

O método imunofluorescente compreende reagir uma célula, tecido ou similar separado com o anticorpo da presente invenção, reagindo o 20 reagente com um anticorpo antiimunoglobulina ou fragmento de ligação marcado com uma substância fluorescente tal como isocianato de fluoresceína (FITC) ou similar, e então medição da substância de fluorescência com um citômetro de fluxo.

O ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) compreende reação de uma célula separada ou seu lisato de célula, tecido ou seu lisato de tecido, sobrenadante de cultura celular, soro, fluido preural, fluido de ascites, fluido ocular ou similar com o anticorpo da presente invenção, reação do reagente com um anticorpo anti-imunoglobulina ou fragmento de ligação marcado com uma enzima tal como peroxidase, biotina ou similar, e então medição do corante resultante desenvolvido com um fotômetro de absorção.

O imunoensaio marcado com material radioativo (RIA) compreende reação de uma célula separada ou lisato de célula, tecido ou lisato de tecido, sobrenadante de cultura celular, soro, fluido preural, fluido de ascites, fluido ocular ou similar com o anticorpo da presente invenção, reagindo ainda o reagente com um anticorpo anti-imunoglobulina ou fragmento de ligação marcado com radioisótopo, e então medição da radioatividade com um 5 contador de cintilação ou similar.

Os métodos de tingimento de imunócito ou fingimento de imunotecido compreendem reação de uma célula separada, tecido ou similar com o anticorpo da presente invenção, reação do reagente com um anticorpo antiimunoglobulina ou fragmento de ligação marcado com uma substân10 cia fluorescente tal como isocianato de fluoresceína (FITC) ou similar, ou uma enzima tal como peroxidase, biotina ou similar, e então observação da célula, tecido ou similar com um microscópio.

O ELISA ensanduichado é um método que compreende adsorção, em uma placa, de um de dois anticorpos tendo um epítopo diferente 15 dentre os anticorpos da presente invenção; modulação de um outro anticorpo com uma substância fluorescente tal como FITC ou similar, ou uma enzima tal como peroxidase, biotina ou similar; reação em separado de uma célula ou lisato de célula, tecido ou lisato de tecido sobrenadante de cultura celular, soro, fluido preural, fluido de ascites, fluido ocular, ou similar com a 20 placa de adsorção de anticorpo; e então reação dele com o anticorpo marcado para realizar a reação de acordo com a substância marcada.

5. Método para uso de anticorpo enxertado com CDR humano ou fragmento de anticorpo do mesmo

Uma vez que o anticorpo da presente invenção especificamente 25 se liga a CCR4 que é expresso em um tipo de célula cultivada e mostra atividade citotóxica tal como atividade CDC, atividade ADCC e similares, ele será útil no diagnóstico e tratamento de doenças relacionadas a CCR4 tal como doenças mediadas por Th2 e similares. Também, uma vez que a proporção de seqüência de aminoácido derivada de anticorpo humano é maior 30 do que aquela em anticorpo de um animal não-humano, é esperado que ele mostre atividade citotóxica forte no corpo humano, ele não mostra imunogenicidade, e seus efeitos continuam por um longo tempo.

Em adição, a produção de citocinas Th2 que são produzidas por células tal como IL-4, IL-5, IL-13 e similares, pode ser inibida através da administração do anticorpo da presente invenção a células ou tecidos de um indivíduo experimental.

Como a célula expressando CCR4 relacionada à presente invenção, célula de Th2 e similares são exemplificadas. A célula de Th2 usada na presente invenção é de preferência célula Th2 ativada ou célula Th2 de memória. Exemplos incluem células tendo propriedades de CD45RA- ou CD45RO+ e CD4+.

As atividades citotóxicas do anticorpo da presente invenção são geradas, por exemplo, quando o anticorpo da presente invenção se liga a células expressando CCR4 tal como célula Th2 para desse modo induzir apoptose na célula. Também, a célula pode ser obstruída e destruída através de indução de apoptose.

Também, o método para diagnóstico de doenças ou cânceres imunes mediados por Th2 inclui um método onde uma célula humana CCR4 positiva existindo em células ou tecidos de um indivíduo experimental é imunologicamente detectada conforme acima descrito.

Ainda, o anticorpo da presente invenção pode ser usado como um agente de diagnóstico para doenças relacionadas a CCR4 tal como doenças imunes ou cânceres mediados por Th2, ou doenças onde os estados mórbidos avançam devido ao aumento ou diminuição anormal de células Th2.

Além disso, uma vez que anticorpo da presente invenção pode reduzir ou destruir as células expressando CCR4 através de sua atividade citotóxica, ele pode prover um método de diagnóstico ou método terapêutico para doenças relacionadas a CCR4 tal como doenças imunes ou cânceres mediados por Th2, que usa o anticorpo da presente invenção, e agentes terapêuticos e preventivos para doenças relacionadas a CCR4 tal como doenças imunes ou cânceres mediados por Th2, que compreende o anticorpo da presente invenção como um ingrediente ativo.

As doenças imunes mediadas por Th2 incluem, independente de se suave ou grave, doenças inflamatórias tal como hipersensibilidade das vias aéreas aguda ou crônica ou asma brônquica, doenças da pele atópicas incluindo dermatite atópica, rinite alérgica, polinose e similares; doenças causadas por células competentes inflamatórias tal como eosinófilo, mastó5 cito e similares que podem ser propagadas ou ativadas por citocina e quimiocina liberada de células Th2, moléculas biologicamente funcionais tal como IgE e similares que são produzidas por citocina e quimiocina liberada de células Th2, e similares; e doenças imunes onde os estados mórbidos avançam devido a mudanças anormais nas células Th2.

1θ O anticorpo da presente invenção pode ser administrado sozinho, mas é geralmente preferido provê-lo na forma de uma formulação farmacêutica produzida misturando com pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável de acordo com um método bem conhecido no campo da técnica de farmacêuticos.

É preferido selecionar uma via de administração que seja a mais eficaz para realizar o tratamento pretendido tal como administração oral ou administração parenteral, por exemplo, administração intraoral, administração traqueal, administração retal, injeção subcutânea, injeção intramuscular, injeção intravenosa, e similares. Injeção intravenosa é preferida em uma 20 formulação de anticorpo ou peptídeo.

A forma de dosagem inclui sprays, cápsulas, comprimidos, grânulos, xaropes, emulsões, supositórios, injeções, ungüentos, fitas e similares.

As formulações adequadas para administração oral incluem 25 emulsões, xaropes, cápsulas, comprimidos, pós, grânulos e similares.

Preparações líquidas, tal como emulsões e xaropes, podem ser produzidas usando aditivos tal como água; sacarídeos, por exemplo, sucrose, sorbitol, frutose; glicóis, por exemplo, polietileno glicol, propileno glicol; óleos, por exemplo, óleo de sésamo, óleo de oliva, óleo de soja; anti30 sépticos, por exemplo, p-hidroxibenzoato; e aromatizantes, por exemplo, aroma de morango, hortelã-pimenta.

Cápsulas, comprimidos, pós, grânulos e similares podem ser produzidos usando aditivos tal como cargas, por exemplo, lactose, glicose, sacarose, manitol; agentes de desintegração, por exemplo, amido, alginato de sódio; lubrificantes, por exemplo, estearato de magnésio, talco; ligantes, por exemplo, álcool de polivinila, hidroxipropilcelulose, gelatina; tensoativos, por exemplo, ésteres de ácido graxo; e plastificantes, por exemplo, glicerina.

Formulações adequadas para administração parenteral incluem injeções, supositórios, sprays e similares.

Injeções podem ser preparadas usando um veículo tal como solução de sal, solução de glicose ou sua mistura, ou similar.

Supositórios podem ser preparados usando um veículo tal como manteiga de cacau, gordura hidrogenada, um ácido carboxílico ou similar.

Também, sprays podem ser preparados a partir do próprio anticorpo ou usando um veículo ou similar que não estimule as membranas da mucosa oral ou das vias aéreas de pacientes e possa facilitar a absorção do anticorpo ou fragmento de anticorpo do mesmo dispersando-o como partículas minúsculas.

O veículo inclui lactose, glicerina e similares. Dependendo das propriedades do anticorpo ou do peptídeo e do veículo a serem usados, aerossóis, pós secos e similares podem ser produzidos. Os aditivos exemplificados nas preparações orais podem ser também adicionados ás preparações parenterais.

A dose e a frequência de administração variam dependendo do efeito terapêutico pretendido, métodos de administração, período de tratamento, idade, peso do corpo e similares, mas a dose é geralmente de a partir de 0,01 mg/kg a 20 mg/kg por dia por adulto.

A presente invenção é descrita abaixo com base mas a presente invenção não é limitada a eles.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra as etapas de construção de pKM2160Ga10.

A Figura 2 mostra as etapas de construção de pKM2160Ga!1. O símbolo nos

Exemplos, um plasmídeo um plasmídeo mostra a posição do código genético mutante modificando um resíduo de aminoácido.

A Figura 3 mostra as etapas de construção de um plasmídeo pKM2160Gal3. O símbolo * mostra a posição do código genético mutante modificando um resíduo de aminoácido.

A Figura 4 mostra as etapas de construção de um plasmídeo pKM2160LV0.

A Figura 5 mostra as etapas de construção de um plasmídeo PKM2160LV1. O símbolo * mostra a posição do código genético mutante modificando um resíduo de aminoácido.

A Figura 6 mostra as etapas de construção de um plasmídeo PKANTEX2160VN0 e plasmídeo pKANTEX2160Ga!0LV0.

A Figura 7 mostra reatividade de um sobrenadante de cultura obtido expressando transientemente um vetor de expressão de cada anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 em célula COS-7, com um peptídeo parcial de CCR4 de acordo com ELISA.

A Figura 8 mostra reatividade de um sobrenadante de cultura obtido expressando transientemente um vetor de expressão de cada anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 preparado usando outros FRs em célula COS-7, com peptídeo parcial de CCR4 de acordo com ELISA.

A Figura 9 mostra a reatividade de um anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 com um peptídeo parcial de CCR4.

A Figura 10 mostra reatividade de um anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 com uma célula de alta expressão de CCR4 (CCR4/EL-4).

A Figura 11 mostra afinidade de um anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 com um peptídeo parcial de CCR4 medida usando um sensor de ressonância de plasmon de superfície.

A Figura 12 mostra cítotoxídez de acordo com a atividade de ADCC contra célula CCR4/EL-4.

A Figura 13 mostra o efeito sobre a inibição de produção de IL-4, IL-13 e IFN-γ de PBMC humano.

A Figura 14 mostra atividade de ligação de cada anticorpo a uma plaqueta humana.

A Figura 15 mostra as etapas de construção dos plasmídeos pKM2160VH41 e pKM2160VL61.

A Figura 16 mostra a etapa de construção de urn plasmideo pKANTEX2160H.

A Figura 17 mostra a etapa de construção de urn plasmideo pKANTEX2160.

MELHOR MODO DE REALIZAR A INVENÇÃO

Exemplo 1

Produção de anticorpo enxertado com CDR humano para CCR:

(1) Denominação do cDNA codificando VH e VL de anticorpo enxertado com CDR humano para CCR4 (1) Denominação da seqüência de aminoácido de VH de anticorpo enxertado com CDR humano para CCR4.

Primeiro, uma seqüência de aminoácido da VH de um anticorpo enxertado com CDR humano para CCR4 (anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4) foi denominada como segue. Uma seqüência de aminoácido de FR de VH de um anticorpo humano foi selecionada para enxerto de seqüências de aminoácido de CDR1,2 e 3 de VH representadas pelas SEQ ID N°s: 1, 2 e 3 usando o anticorpo de camundongo anti-CCR4 KM2160 (Int. Immunol., 11, 81 (1999)) estabelecido no Exemplo de Referência 1. Anticorpos humanos tendo alta homologia com KM2160 foram recuperados de bases de dados de seqüência de aminoácido de proteínas existentes através do método BLASTP (Nucleic Acid Res., 25, 3389 (1997) usando o pacote GCG (fabricado pela Genetics Computer Group) como um sistema de análise de seqüência. Quando a homologia da seqüência de aminoácido real foi comparada com os registros de homologia, base de dados SWISSPROT número de acesso P01781, Gal de região V-lll de cadeia pesada de Ig (Hoppe. Sey/ers. Z. Physiol. Chem., 354, 1505-1509 (1973); daqui em diante referido como Gal·¹) era um anticorpo humano mostrando a homologia mais alta de 82,5%, de modo que a seqüência de aminoácido FR do anticorpo foi selecionada. No entanto, posições onde os resíduos de aminoácido não podem ser determinados unicamente (posições 28 e 30 do N-terminal de um anti-

corpo de secreção) e um resíduo de aminoácido que tem frequência de ge~ ração baixa em seqüências de anticorpos humanos (Thr como o resíduo final da região V) foram encontradas na seqüência de aminoácido de FR de Gal da base de dados. Desse modo, lie e Ser como resíduos encontrados no camundongo KM2160 foram selecionados nas posições 28 e 30, e Thr como o resíduo final de região V foi substituído com Ser. Uma vez que os resíduos de aminoácido são encontrados em freqüências altas em seqüências de quaisquer anticorpos humanos (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services, 1991), eles não desviam das seqüências de anticorpo humano.

A seqüência de aminoácido de VHGalO de anticorpo enxertado com CDR humano anti-CCR4 representada pela SEQ ID N°: 4 foi designada enxertando seqüências de aminoácido de CDR1, 2 e 3 de VH do anticorpo de camundongo anti-CCR4 KM2160 representadas pelas SEQ ID N°s. 1,2 e 3, respectivamente, em posições apropriadas na seqüência de aminoácido de FR anticorpo humano determinada. Uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 4 é representada pela SEQ ID N°: 49.

Também, uma seqüência de aminoácido de VH do anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 foi designada com base nas seqüências comuns classificadas por Kabat e outros.

Kabat e outros classificaram a VH de vários anticorpos humanos já conhecidos nos três subgrupos (HSG I a 111) com base na homologia de suas seqüências de aminoácido e descreveram seqüências comuns em cada subgrupo (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services, 1991). Há a possibilidade de que a imunogenicidade das seqüências humanas seja reduzida no humano. Desse modo, a fim de preparar um anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 tendo alta atividade, dentre as seqüências de aminoácido FR das seqüências comuns de três subgrupos da VH de anticorpo humano, uma seqüência de aminoácido FR tendo a homologia mais alta com a seqüência de aminoácido FR de VH de KM2160 foi selecionada no projeto. A Tabela 1 mostra um resultado da recuperação de homologia entre a seqüência de aminoácido de FR das seqüências comuns de cada subgrupo da VH do anticorpo humano e a seqüência de aminoácido de FR de VH de KM2160. Conforme mostrado na Tabela 1, a seqüência de aminoácido de FR da região VH do KM2160 mos5 trou a mais alta homologia com o subgrupo III.

Tabela 1

HSG I	HSG II	HSG III
57,47%	50,58%	77,01%

Com base nos resultados acima, a seqüência de aminoácido da VH HVO de anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 representada pela SEQ ID N°: 38 foi determinada enxertando seqüência de aminoácido de 10 CDR de VH do anticorpo KM2160 de camundongo anti-CCR4 em uma posição apropriada da seqüência de aminoácido de FR da seqüência comum do subgrupo II da VH de anticorpo humano. Uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 38 é representada pela SEQ ID N°: 57.

(2) Determinação da seqüência de aminoácido de VL de anticorpo enxertado com CDR humano para CCR4

Em seguida, uma seqüência de aminoácido de VL de um anticorpo enxertado com CDR humano anti-CCR4 foi determinada como segue. Uma seqüência de aminoácido de FR de VL de um anticorpo humano foi 20 selecionada para enxerto de seqüências de aminoácido de CDR1, 2 e 3 de VL de anticorpo KM2160 de camundongo anti-CCR4 representadas pelas SEQ ID N°s: 5, 6 e 7, respectivamente. Kabat e outros classificaram a VL em vários anticorpos humanos já conhecidos em quatro subgrupos (HSG a IV) com base na homologia de suas seqüências de aminoácido e descreveram 25 seqüências comuns em cada subgrupo (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services, 1991). Desse modo, dentre as seqüências de aminoácido de FR das seqüências comuns de quatro subgrupos da VL de anticorpo humano, uma seqüência de aminoácido de FR tendo a mais alta homologia com a seqüência de aminoácido de FR de 30 VL do KM2160 foi selecionada. A Tabela 2 mostra um resultado da recupe-

ração de homologia entre as sequências de aminoácido de FR da seqüência comum de cada subgrupo da VL de anticorpo humano e da seqüência de aminoácido de VL do KM2160. Conforme mostrado na Tabela 2, a seqüência de aminoácido de FR de VL do KM2160 mostrou a homologia mais alta com o subgrupo II.

Tabela 2

HSGI	HSG II	HSG III	HSG IV
65,00%	82,50%	65,00%	72,50%

Com base nos resultados acima, a seqüência LVO de aminoácido de VL de anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 representada pela SEQ ID N°: 8 foi determinada enxertando as seqüências de aminoácido de CDR1, 2 e 3 de VL de anticorpo de camundongo anti-CCR4 KM2160 representadas pelas SEQ ID N°s: 5, 6 e 7, respectivamente, a posições apropriadas na seqüência de aminoácido de FR da seqüência comum de subgrupo II da VL de anticorpo humano. Uma seqüência de nucleotídeo codificando a seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 8 é representada pela SEQ ID N°: 53.

(3) Modificação de VH e VL de anticorpo enxertado com CDR humano para CCR4

As seqüências de aminoácido de VH GalO e HVO, e a seqüência LVO de aminoácido de VL de anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 determinadas acima são anticorpos onde a seqüência de aminoácido de CDR do anticorpo de camundongo anti-CCR4 KM2160 sozinho é enxertada nas seqüências de aminoácido de FR de anticorpo humano. No entanto, quando enxerto com apenas seqüência de aminoácido de CDR de um anticorpo de camundongo é realizado, a atividade de um anticorpo enxertado com CDR humano é freqüentemente diminuída de modo que, a fim de evitar a diminuição, certos resíduos de aminoácido dentre os resíduos de aminoácido de FR diferentes entre um anticorpo humano e um anticorpo de camundongo, que são considerados ter influências sobre a atividade, são geralmente enxertados juntos com a seqüência de aminoácido de CDR. Desse modo, neste Exemplo, um exame foi realizado para identificar os resíduos de aminoácido • b · · · ο · ♦ · · * · ♦ ο ® · ♦ to» « · · Ο 9 0 οοο©· • ·9Ο 0· &·Ο· ΟβΜΟΟΟίβΟ ·· ··

61 de FR considerados por ter influências sobre a atividade.

Primeiro, estruturas tridimensionais de regiões V de anticorpo (GalOLVO e HVOVLO) compreendendo seqüências de aminoácido GalO e HVO de VH e seqüência de aminoácido LVO de VL no anticorpo enxertado 5 com CDR anti-CCR4 determinadas acima foram construídas usando uma técnica de modelagem por computador. As coordenadas de estrutura tridimensionais foram preparadas usando um programa AbM (fabricado pela Oxford Molecular) e mostra das estruturas tridimensionais usando um programa Pro-Explore (fabricado pela Oxford Molecular) ou RasMol (fabricado q 10 pela Glaxo) de acordo com as respectivas instruções anexas do fabricante.

Também, modelos de computador das estruturas tridimensionais das regiões V de anticorpo de camundongo anti-CCR4 KM2160 foram construídos da mesma maneira. Em adição, modelos de estrutura tridimensionais compreendendo seqüências de aminoácido modificadas foram construídos da mesma maneira, onde certos resíduos das seqüências de aminoácido de FR de VH e VL de GalOLVO ou HV0LV0, diferentes do anticorpo de camundongo anti-CCR4 KM2160, foram substituídos com outros resíduos encontrados em posições correspondentes no anticorpo de camundongo anti-CCR4 KM2160, e as estruturas tridimensionais das regiões V do anticorpo de camundongo anti-CCR4 KM2160, GalOLVO ou HV0LV0 e do produto modificado foram θ comparadas.

Como um resultado, a estrutura tridimensional da região de ligação de antígeno foi mudada de modo que Ala na posição 40, Gly na posição 42, Lys na posição 43, Gly na posição 44 e Lys na posição 76 e Ala na posi25 ção 97 em GalO, Thr na posição 28 e Ala na posição 97 para HVO e lie na posição 2, Vai na posição 3, Gin na posição 50 e Vai na posição 88 em LVO foram selecionados como resíduos considerados ter influência sobre a atividade de anticorpo entre os resíduos de aminoácido de FR de GalOLVO ou HV0LV0. Dentre esses resíduos de aminoácido selecionados, pelo menos um aminoácido é modificado em um resíduo(s) de aminoácido encontrado(s) ί no anticorpo de camundongo KM2160 de modo que VH e VL do anticorpo enxertado com CDR humano tendo várias modificações foram determinadas.

i

I

Primeiro, com relação à VH, por exemplo, Gall representado pela SEQ ID N°: 9 onde Ala na posição 97 de GalO foram modificados, Gal2 representado pela SEQ ID N°: 10 onde Gly na posição 42 e Gly na posição 44 de GalO foram modificados, Gal3 representado pela SEQ ID N°: 11 onde Ala na posição 97, Gly na posição 42 e Gly na posição 44 de GalO foi modificado, HV1 representada pela SEQ ID N°: 39 onde Thr na posição 28 de HVO foi modificado, HV2 representada pela SEQ ID N°: 40 onde Ala na posição 97 de HVO foi modificado, e HV3 representada pela SEQ ID N°: 41 onde Thr na posição 28 e Ala na posição 97 de HVO foram modificados foram determinados. Ainda, com relação à VL, por exemplo, LV1 representada pela SEQ ID N°: 12 onde lie na posição 2 foi modificado, LV2 representado pela SEQ ID N°: 13 onde Vai na posição 3 foi modificado, e LV3 representada pela SEQ ID N°: 14 onde lie na posição 2 e Vai na posição 3 foram modificados foram determinadas. Seqüências de nucleotídeo codificando as seqüências de aminoácido representadas pelas SEQ ID N°s: 9 a 11, 39 a 41 e 12 a 14 são representadas pelas SEQ ID N°s: 50 a 52, 58 a 60 e 54 a 56, respectivamente.

2. Construção de

CCR4 (1) Construção de anti-CCR4 cDNA

CDR anticDNA codificando anticorpo enxertado com com CDR cDNA codificando VH de anticorpo enxertado da VH do codificando a seqüência de aminoácido GalO anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 determinada em 1(1) do Exemplo 1 foi construído usando PCR como segue.

Primeiro, uma seqüência de aminoácido de anticorpo completa através de ligação da seqüência de aminoácido determinada com a seqüência de sinal de secreção de cadeia H de anticorpo de camundongo antiCCR4 KM2160 representada pela SEQ ID N°: 15. Em seguida, a seqüência de aminoácido foi convertida em códons genéticos. Quando dois ou mais códons genéticos estão presentes para um resíduo de aminoácido, um códon genético correspondente foi determinado levando em consideração o uso de códon encontrado nas seqüências de nucleotídeo de genes de anti53 corpo (Sequences of Proteins of Immunological Interest, Us Dep. Health and Human Services, 1991). Uma seqüência de nucleotídeo de cDNA codificando a seqüência de aminoácido da região V de anticorpo completa foi determinada ligando os códons genéticos determinados, e seqüências de nucleo5 tídeo de ligação de iniciadores para amplificação de PCR (incluindo seqüências de reconhecimento de enzima de restrição para clonagem em um vetor para expressão de anticorpo humanizado) foram adicionadas ao seu terminal 5' e terminal 3'. A seqüência de nucleotídeo determinada foi dividida em um total de 6 seqüências de nucleotídeo cada uma tendo cerca de 100 nu10 cleotídeos contando do terminal 5' (seqüências de nucleotídeo adjacentes são projetadas de modo que elas tenham uma seqüência complementar de cerca de 20 nucleotídeos em seu terminal), e 6 oligonucleotídeos sintéticos das SEQ ID N°s: 16, 17, 18, 19, 20 e 21 foram sintetizados em ordens recíprocas de uma cadeia de sentido e uma cadeia de anti-sentido (fabricado 15 pela GENSET).

PCR foi realizado adicionando cada oligonucleotídeo a uma solução de reação contendo 0,2 mM de dNTPs e 1 mM de cloreto de magnésio para dar uma concentração final de 0,1 pM, e ajustando o volume total de 50 μΜ usando 0,4 pM de iniciador RV M13 (fabricado pela Takara Shuzo), 0,4 20 pM de primeirs M3 M13 (fabricado pela GENSET) e 2,5 unidades de polimeθ rase de KOD (fabricada pela TOYOBO). A reação foi realizada por 30 ciclos, cada ciclo consistindo em 94°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos e 74°C por 60 segundos, e então 1 ciclo a 74°C por 10 minutos. A solução de reação foi purificada usando o kit de purificação de PCR rápida QIA (fabrica25 do pela QIAGEN) e finalmente dissolvida em água estéril. A solução de reação foi deixada reagira 37°C por 1 hora usando 10 unidades de uma enzima de restrição Apal (fabricada pela Takara Shuzo) e 10 unidades de uma enzima de restrição Notl (fabricada pela Takara Shuzo). A solução de reação foi fracionada através de eletroforese de gel de agarose e um fragmento de 30 Apal -Notl de cerca de 0,47 kb foi recuperado.

I Em seguida, 3 pg de plasmídeo pBluescript ll SK(-) (fabricado | pela Stratagene) foram deixados reagir com o fragmento usando 10 unidai

I des de uma enzima de restrição Apal (fabricada pela Takara Shuzo) e 10 unidades de uma enzima de restrição Notl (fabricada pela Takara Shuzo) a 37°C por 1 hora. A dita solução de reação foi fracionada através de eletroforese de gel de agarose e um fragmento de Apal-Notl de cerca de 2,95 kb foram recuperados.

Em seguida, o fragmento de Apal-Notl resultante do produto de PCR de VH do anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 e o fragmento de Apal-Notl do plasmídeo pBluescript II SK(-) foram ligados usando Solução l do Kit de Ligação de DNA ver. 2 (fabricado pela Takara Shuzo) de acordo 10 com as instruções do fabricante. DH5a de Escherichia coli (fabricado pela TOYOBO) foi transformada usando a solução de DNA de plasmídeo recombinante obtida desta maneira, cada DNA de plasmídeo foi preparado a partir dos clones transformantes e as seqüências de nucleotídeo foram analisadas usando o Big Dye Terminator Kit ver. 2 (fabricado pela Applied Biosystems).

Como um resultado da análise de seqüência de nucleotídeo, um plasmídeo pKM2160Gal0 mostrado na Figura 1 tendo a seqüência de nucleotídeo objeto foi obtido. Escherichia coli transformada com pKM2160Gal0, DH5a/ pKM2160Ga!0 de Escherichia coli, foi depositada em 22 de agosto de 2001, como FERM BP-7709 no International Patent Organism Depositary, National

Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6,1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japão).

Em seguida, resíduos de aminoácido de FR determinados em 1(3) do Exemplo 1 foram modificados como segue. Os códons genéticos para resíduos de aminoácido após a modificação foram modificados para ter 25 códons genéticos encontrados no anticorpo KM2160 de camundongo.

Na modificação de Ala na posição 97 para Gly, o PCR foi realizado usando 25 ng do plasmídeo pKM2160Gal0 preparado neste item como o molde, primeiro aquecendo a 94°C por 2 minutos e então realizando 35 ciclos da reação, cada ciclo consistindo em 94°C por 15 segundos, 55°C por 30 30 segundos e 68°C por 40 segundos, em 50 μΙ de um sistema de reação preparado adicionando cada um dos DNAs sintéticos para transferência de gene compreendendo as seqüências de nucleotídeo representadas pelas

SEQ ID N°s: 22 e 23 (fabricado pela GENSET) como iniciadores para dar uma concentração final de 0,4 μΜ e usando 2,5 unidades de KOD mais polimerase (fabricado pela TOYOBO) de acordo com as instruções do fabricante. A solução de reação foi purificada usando o kit de purificação de PGR rápida QIA (fabricado pela QIAGEN) e finalmente dissolvida em água estéril. O volume total foi deixado reagir por 1 hora a 37°C usando 10 unidades de uma enzima de restrição Pstl (fabricada pela Takara Shuzo) e então deixado reagir por 1 hora a 37°C usando 10 unidades de uma enzima de restrição Dralll (fabricada pela New England Biolabs). A solução de reação foi fracionada através de eletroforese de gel de agarose e um fragmento de PstlDralll de cerca de 0,58 kb foi recuperado.

Em seguida, 3 pg do plasmídeo pKM2160Gal0 foram deixados reagir a 37°C por 1 hora usando 10 unidades de uma enzima de restrição Pstl (fabricada pela Takara Shuzo) e então sofrer a reação a 37°C por 1 hora usando 10 unidades de uma enzima de restrição Dralll (fabricada pela New England Biolabs). A solução de reação foi fracionada através de eletroforese de gel de agarose e um fragmento de Pstl-Dralll de cerca de 2,7 kb foi recuperado.

Em seguida, o fragmento de Pstl-Dralll desse modo obtido derivado do produto de PCR e o fragmento de Pstl-Dralll derivado do plasmídeo pKM2160Gal0 foram ligados usando Solução I do Kit de Ligação de DNA Ver. 2 (fabricado pela Takara Shuzo) de acordo com as instruções do fabricante. DH5a de Escherichia coli (fabricado pela TOYOBO) foi transformada usando a solução de DNA de plasmídeo recombinante obtida desta maneira, cada DNA de plasmídeo foi preparado a partir dos clones transformantes e as sequências de nucleotídeo foram analisadas usando o Big Dye Terminator Kit ver. 2 (fabricado pela Applied Biosystems). Como um resultado da análise de seqüência de nucleotídeo, um plasmídeo pKM2160Ga!1 mostrado na Figura 2 tendo a seqüência de nucleotídeo objeto foi obtido. Escherichia co//transformada como plasmídeo pKM2160Ga!1, DH5a/pKM2160Gal1 de Escherichia coli, foi depositada em 22 de agosto de 2001, como FERM BP7710 no International Patent Organism Depositary, National Institute of Ad vanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japão).

Nas modificações de Gly na posição 42 para Asp e Gly na posição 44 em Arg, um plasmídeo pKM2160Gal2 foi obtido realizando o método basicamente similares ao acima, exceto que o DNA sintético para transferência de gene compreendendo a seqüência de nucleotídeo representada pela SEQ ID N°: 24 (fabricada pela GENSET) e iniciador RV M13 (fabricado pela Takara Shuzo) foram usados como os iniciadores de PCR. Escherichia coii transformada com o plasmídeo pKM2160Gal2, DH5cc/pKM2160Gal2 de Escherichia coii, foi depositada em 22 de agosto de 2001, como FERM BP7711 no International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japão).

Também, modificação de todos os três resíduos acima foi realizada como segue. Cerca de 0,5 pg de cada um de pKM2160Gal1 e pKM2160Gal2 obtidos acima foi deixado reagir a 37°C por 1 hora usando 10 unidades de Nhel (fabricada pela Takara Shuzo) e então deixado reagir a 37°C por 1 hora usando Scai (fabricada pela Takara Shuzo). A solução de reação foi fracionada através de eletroforese de gel de agarose, e um fragmento de Nhel-Scal de cerca de 1,3 kb derivado de pKM2160Gal1 e um fragmento de cerca de 2,0 kb derivado de pKM2160Gal2 foram recuperados. Os dois fragmentos resultantes foram ligados usando Solução I do Kit de Ligação de DNA Ver. 2 (fabricado pela Takara Shuzo) de acordo com as instruções do fabricante. DH5ot de Escherichia coii (fabricado pela TOYOBO) foi transformada usando a solução de DNA de plasmídeo recombinante obtida desta maneira, cada DNA de plasmídeo foi preparado a partir dos clones transformantes e seqüências de nucleotídeo foram analisadas usando o Big Dye Terminator Kit ver. 2 (fabricado pela Applied Biosystems). Como um resultado da análise de seqüência de nucleotídeo, um plasmídeo pKM2160Ga!3 mostrado na Figura 3 tendo a seqüência de nucleotídeo objeto foi obtido. Escherichia coii transformada com o plasmídeo pKM2160Gal3, DH5a/pKM2160Gal3 de Escherichia coii, foi depositada em de agosto de 2001, como FERM BP-7712 no International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AISTTsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japão).

Em seguida, um dNA codificando a seqüência de aminoácido HV0 de VH do anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 determinado em 1(1) do Exemplo 1 foi construído usando PCR como segue.

Primeiro, uma seqüência de aminoácido de anticorpo completa através de ligação da seqüência de aminoácido determinada com a seqüência de sinal de secreção de cada H de anticorpo de camundongo anti-CCR4 KM2160 representado pela SEQ ID N°: 15. Em seguida, a seqüência de aminoácido foi convertida em códons genéticos. Quando dois ou mais códons genéticos estão presentes para um resíduo de aminoácido, um códon genético correspondente foi determinado levando em consideração o uso de códon encontrado em seqüências de nucleotídeo de genes de anticorpo (Sequences of Proteins of Immunological Interest, Us Dep. Health and Human Services, 1991). Os códons genéticos determinados foram ligados de modo que uma seqüência de nucleotídeo de cDNA codificando a seqüência de aminoácido da região V de anticorpo completa foi determinada, e seqüências de nucleotídeo de adição de iniciadores para amplificação de PCR (incluindo as seqüências de reconhecimento de enzima de restrição para clonagem em um vetor para uso de expressão de anticorpo humanizado) foram adicionadas ao seu terminal 5' e terminal 3'. A seqüência de nucleotídeo determinada foi dividida em um total de 6 seqüências de nucleotídeo cada uma tendo cerca de 100 nucleotídeos contando a partir do terminal 5 (seqüências de nucleotídeo adjacentes são projetadas de modo que elas tenham uma seqüência de duplicação de cerca de 20 nucleotídeos em seus terminais) e 6 oligonucleotídeos sintéticos das SEQ ID N°s: 16, 42, 43, 44, 45 e 21 foram sintetizados em ordens recíprocas de uma cadeia de sentido e uma cadeia de anti-sentido (fabricada pela GENSET) e então pMK2160HV0 foi obtido através do método similar ao pMK2160Ga!0 descrito neste item. Escherichia coli transformada com o plasmídeo, DH5a/pKM2160HV0 de Es58 cherichia coli, foi depositada em 27 de agosto de 2001, como FERM BP7718 no International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japão).

Na modificação de Thr na posição 28 para lie, pKM2160HV1 tendo a seqüência de nucleotídeo objetiva foi obtido realizando a reação si milar à construção do plasmídeo pKM2160HV0 acima, usando um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo representada pela SEQ ID N°. 69, ao invés do oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo representada pela SEQ ID N°: 42, e usando um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo representada pela SEQ ID N°: 46 ao invés do oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo representada pela SEQ ID N . 43. Escherichia coli transformada com o plasmídeo pKM2160HV1, DH5a/pKM2160HV1 de Escherichia coli, foi depositada em 27 de agosto de 2001, como FERM BP-7719 no International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 3058566, Japão).

Na modificação de Thr na posição 28 para lie e Ala na posição 97 para Gly, pKM2160HV3 tendo a seqüência de nucleotídeo objetiva foi obtido realizando a reação similar à construção do plasmídeo pKM2160HV0 acima, usando um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo representada pela SEQ ID N°: 69, ao invés do oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo representada pela SEQ ID N°: 42, usando um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo representada pela SEQ ID N°: 46 ao invés do oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo representada pela SEQ ID N°: 43 e usando um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo representada pela SEQ ID N°: 47 ao invés do oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotídeo representada pela SEQ ID N°: 45. Escherichia coli transformada com o plasmídeo pKM2160HV3, DH5a/ pKM2160HV3 de Escherichia coli, foi depositada em 27 de agosto de 2001, como FERM BP-7721 no International Patent Organism Depositary, National :^Q * : : ι · * ·· » · ο · » ι • ······ »»·········· ··

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Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japão).

Na modificação de Ala na posição 97 para Gly, o plasmídeo foi construído como segue. Cerca de 0,5 pg de cada um dos pKM2160HV0 e 5 pKM2160HV3 obtidos foi deixado reagir a 37°C por 1 hora usando 10 unidades de uma enzima de restrição A/rte/ (fabricado pela Takara Shuzo) e então deixado reagir a 37°C por 1 hora usando Seal (fabricado pela Takara Shuzo). A solução de reação foi fracionada através de eletroforese de gel de agarose e um fragmento de Nhel-Scal de cerca de 1,3 kb derivado de 10 pKM2160HV3 e um fragmento de cerca de 2,0 kb derivado de pKM2160HV0 foram recuperados. Os dois fragmentos resultantes foram ligados usando Solução I do Kit de Ligação de DNA Ver. 2 (fabricado pela Takara Shuzo) de acordo com as instruções do fabricante. DH5a de Escherichia coli (fabricado pela TOYOBO) foi transformado usando a solução de DNA de plasmídeo 15 recombinante obtida desta maneira, cada DNA de plasmídeo foi preparado a partir dos clones transformantes e seqüências de nucleotídeo foram analisadas usando o Kit Big Dye Terminator Rev. 2 (fabricado pela Applied Biosystems). Como um resultado da análise de seqüência de nucleotídeo, urn plasmídeo pKM2160HV2 tendo a seqüência de nucleotídeo objeto foi obtido.

Escherichia coli transformada com o plasmídeo pKM2160HV2, DH5a/ pKM2160HV2 de Escherichia coli, foi depositada em 27 de agosto de 2001, como FERM BP-7720 no International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6,1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japão).

(2) Construção de cDNA codificando VL de anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4

Um cDNA codificando a seqüência de aminoácido LV0 da VL do anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 determinado em 1(2) do Exemplo 1 foi construído usando PCR similar ao caso de VH como segue. Neste 30 caso, a seqüência de cadeia L de anticorpo de camundongo anti-CCR4 KM2160 tendo a seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 25 foi usada como a seqüência de sinal de secreção.

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Primeiro, 6 oligonucleotídeos sintéticos tendo as seqüências de nucleotídeo descritas nas SEQ ID N°s: 26, 27, 28, 29, 30 e 31 foram sintetizadas (fabricado pela GENSET). PCR foi realizado adicionando cada oligonucleotídeo a 50 pl de uma solução de reação para dar uma concentração 5 final de 0,1 μΜ e usando 0,4 pM de iniciador RV M13 (fabricado pela Takara Shuzo) e 0,4 pM de iniciador M4 M3 (fabricado pela Takara Shuzo) ou iniciador M3 M13 (fabricado pela GENSET) representados pela SEQ ID N°: 32 e 2,5 unidades de polimerase KOD (fabricada pela TOYOBO). A reação foi realizada em 30 ciclos, cada ciclo consistindo em 94°C por 30 segundos, 10 55°C por 30 segundos e 74°C por 60 segundos, e subseqüente 1 ciclo a

72°C por 10 minutos. A solução de reação foi purificada usando o kit de purificação de PCR rápida QIA (fabricado pela QIAGEN) e finalmente dissolvida em água estéril. A solução de reação foi deixada reagir usando 10 unidades de uma enzima de restrição EcoRI (fabricada pela Takara Shuzo) e 10 uni15 dades de uma enzima de restrição Xhol (fabricada pela Takara Shuzo) a 37°C por 1 hora. A solução de reação foi fracionada através de eletroforese de gel de agarose, e um fragmento de EcoRI-Xhol de cerca de 0,44 kb foi recuperado.

Em seguida, 3 pg do plasmídeo pBluescript II SK(-) (fabricado 20 pela Stratagene) foram deixados reagir usando 15 unidades de uma enzima de restrição EcoRI (fabricada pela Takara Shuzo) e 15 unidades de uma enzima de restrição Xhol (fabricada pela Takara Shuzo) a 37°C por 1 hora. A solução de restrição foi fracionada através de eletroforese de gel de agarose, e um fragmento de EcoRI-Xhol de cerca de 2,95 kb foi recuperado.

Em seguida, o fragmento de EcoRI-Xhol resultante do produto de PCR de VL do anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 e o fragmento de EcoRI-Xhol de plasmídeo pBluescript II SK(-) foram ligados usando Solução I do Kit de Ligação de DNA Ver. 2 (fabricado pela Takara Shuzo) de acordo com as instruções do fabricante. DH5ci de Escherichia coli (fabricado pela TOYOBO) foi transformado usando a solução de DNA de plasmídeo recombinante obtida desta maneira, cada DNA de plasmídeo foi preparado a partir de clones transformantes e seqüências de nucleotídeo foram analisa61 das usando o kit Big Dye Terminator ver. 2 (fabricado pela Applied Biosystems). Como um resultado da análise de seqüência de nucleotideo, urn plasmídeo pKM2160LV4 mostrado na Figura 4 tendo a seqüência de nucleotideo objeto foi obtido. Escherichia coli transformada com pKM2160LV0, DH5a/pKM2160LV0 de Escherichia coli, foi depositada em 22 de agosto de 2001, como FERM BP-7713 no International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 3058566, Japão).

Em seguida, resíduos de aminoácido de FR determinados em 1(3) do Exemplo 1 foram modificados como segue. Os códons genéticos para os resíduos de aminoácido após a modificação foram modificados para dar códons genéticos encontrados no anticorpo de camundongo KM2160.

Na modificação de Ile na posição 2 para Val, um plasmídeo pKM2160LV1 mostrado na Figura 5 tendo a seqüência de nucleotideo objeto foi obtido realizando a reação similar à construção do plasmídeo pKM2160LV0 acima, usando um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotideo representada pela SEQ ID N°: 33 ao invés do oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotideo representada pela SEQ ID N°. 27. Escherichia coli transformada com o plasmídeo pKM2160LV1, DH5a/pKM2160LV1 de Escherichia coli, foi depositada em 22 de agosto de 2001, como FERM BP-7714 no International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japão).

Da mesma maneira, cada um dos plasmídeos objeto pKM2160LV2 e pKM2160LV3 foi obtido usando um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotideo representada pela SEQ ID N°: 34 ao invés do oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotideo representada pela SEQ ID N°: 27, quando Val na posição 3 foi modificado em Leu, e usando um oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotideo representada pela SEQ ID N°: 35 ao invés do oligonucleotídeo tendo a seqüência de nucleotideo representada pela SEQ ID N°: 27, quando ambos resíduos acima foram modifica-

dos. Escherichia coli transformada com o plasmideo pKM2160LV2, DH5a/pKM2160LV2 de Escherichia coli, e Escherichia coli transformada com o plasmideo pKM2160LV3, DH5a/pKM2160LV3 de Escherichia coli, foram depositadas em 22 de agosto de 2001, como FERM BP-7715 e FERM 5 BP-7716, respectivamente, no International Patent Organism Depositary,

National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 3058566, Japão).

(3) Construção de vetor de expressão de anticorpo enxertado com CDR an10 ti-CCR4

Um vetor de expressão de anticorpo enxertado com CDR antiCCR4 pKANTEX2160GalOVLO foi construído usando um vetor para expressão de anticorpo humanizado pKANTEX93 (Mol. Immunol., 37, 1035 (2000)) e os plasmideos pKM2160Ga!0 e pKM216OLV0 obtidos em 2(1) e (2) do 15 Exemplo 1 como segue.

O plasmideo pKM2160LV0 (3 pg) obtido em 2(2) do Exemplo 1 foi deixado reagir com 10 unidades de uma enzima de restrição BsiWI (fabricada pela New England Biolabs) a 55°C por 1 hora e então com 10 unidades da enzima de restrição EcoRI (fabricada pela Takara Shuzo) a 37°C por 1 20 hora. A solução de reação foi fracionada através de eletroforese de gel de agarose, e um fragmento de BsiWI-EcoRI de cerca de 0,44 kb foi recuperado.

Em seguida, 3 pg do vetor para expressão de anticorpo humanizado pKANTEX93 foram deixados reagir com 10 unidades de enzima de 25 restrição BsiWI (fabricada pela New England Biolabs) a 55°C por 1 hora e então com 10 unidades da enzima de restrição EcoRI (fabricada pela Takara Shuzo) a 37°C por 1 hora. A solução de reação foi fracionada através de eletroforese de gel de agarose, e um fragmento de BsiWI-EcoRI de cerca de 12,75 kb foi recuperado.

3Q Em seguida, o fragmento de BsiWI-EcoRI resultante derivado de pKM2160LV0 e o fragmento de BsiWI-EcoRI derivado de pKANTEX93 foram ligados usando Solução I do Kit de Ligação de DNA Ver. 2 (fabricado pela

Takara Shuzo) de acordo com as instruções do fabricante. DH5a de Escherichia coli (fabricado pela TOYOBO) foi transformado usando a solução de DNA de plasmídeo recombinante obtida desta maneira para desse modo se obter um plasmídeo pKANTEX2160LV0 mostrado na Figura 6.

Em seguida, 3 pg do plasmídeo pKM2160Ga!0 obtido em 2(1) do

Exemplo 1 foram deixados reagir com 10 unidades de uma enzima de restrição Apal (fabricado pela Takara Shuzo) a 37°C por 1 hora e então com 10 unidades de uma enzima de restrição Notl (fabricada pela Takara Shuzo) a 37°C por 1 hora. A solução de reação foi fracionada através de eletroforese 10 de gel de agarose, e um fragmento de Apal-Notl de cerca de 0,47 kb foi recuperado.

Em seguida, 3 pg do plasmídeo pKANTEX2160LV0 obtido acima foram deixados reagir com 10 unidades de uma enzima de restrição Apal (fabricado pela Takara Shuzo) a 37°C por 1 hora e então com 10 unidades 15 de uma enzima de restrição Notl (fabricada pela Takara Shuzo) a 37 C por 1 hora. A solução de reação foi fracionada através de eletroforese de gel de agarose, e um fragmento de Apal-Notl de cerca de 0,45 kb foi recuperado.

Em seguida, o fragmento de Apal-Notl resultante derivado do pKM2160Gal0 e o fragmento de Apal-Notl derivado do plasmídeo pKAN20 TEX2160LV0 foram ligados usando Solução I do Kit de Ligação de DNA Ver.

(fabricado pela Takara Shuzo) de acordo com as instruções do fabricante. DH5a de Escherichia coli (fabricado pela TOYOBO) foi transformado usando a solução de DNA de plasmídeo recombinante obtida desta maneira, cada DNA de plasmídeo foi preparado a partir dos clones transformantes.

Como um resultado do fato das seqüências de nucleotídeo dos plasmídeos desse modo obtidos terem sido analisadas usando o Kit Big Dye Terminator ver. 2 (fabricado pela Applied Biosystems), foi confirmado que um vetor de expressão pKANTEX2160Gal0LV0 mostrado na Figura 6 onde o DNA objeto foi clonado foi obtido.

₃₀ Em adição, vetores de expressão foram preparados usando o mesmo método em VH e VL onde os resíduos de aminoácido de outro FR foram modificados, incluindo HV0.

Especificamente, 22 vetores de expressão pKM2160Gal0LV0, pKM2160Gal0LV1, pKM216OGalOLV2, pKM2160Gal0LV3, pKM2160Gal1LV1, pKM2160Gal1LV3, pKM2160Ga!2L\/1, pKM2160Gal2LV3, pKM2160Gal3LV1, _PKM2160Gal3LV3, pKM2160HV0LV0, pKM2160HV0LV1, pKM2160HV0LV2, pKM2160HV0LV3, pKM2160HV1LV0, pKM2160HV1 LV1, pKM2160HV1LV2, pKM2160HV1LV3, pKM2160HV2LV0, pKM2160HV2LV3, pKM2160HV3LV0 e pKM2160HV3LV3 foram construídos respectivamente combinando pKM2160Gal0, pKM2160Gal1, _PKM2160Gal2, _PKM2160Gal3, pKM2160HV0, pKM2160HV1, pKM2160HV2 e pKM2160HV3 construídos em 2(1) do Exemplo 1 com pKM2160LV0, pKM2160LV1, pKM2160LV2 e pKM2160LV3 construídos em 2(2) do Exemplo 1.

Exemplo 2

Expressão de anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 em células de animais:

1- Expressão transiente de anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 usando célula COS-7 (ATCC CRL 1651) (1) Expressão transiente em célula COS-7

Em uma placa de 6 cavidades (fabricada pela Iwaki Glass), 1x10⁵ células/ml de célula COS-7 foi dispensado a 2 ml/cavidade usando meio DMEM (fabricado pela Bibco) contendo FCS a 10% e cultivado da noite para o dia a 37°C. Por 100 pl de meio OPTl-MEM (fabricado pela Bibco), 3 pl de Reagente de Transferência 6 Fu-GENETM (fabricado pela Roche) foram adicionados e 1 pg de cada um dos vetores de expressão de anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 obtidos no artigo 2(3) do Exemplo 1 foi adicionalmente adicionado, e a mistura foi deixada descansar em temperatura ambiente por 15 minutos para formar um complexo de DNA-lipossoma. Cada uma das soluções de reação foi adicionada em gotas à célula COS-7 acima e totalmente misturada, seguido por cultura a 37°C. Após a cultura por 72 horas, os sobrenadantes de cultura foram recuperados e a atividade do anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 nos sobrenadantes de cultura foi avaliada.

(2) Avaliação de reatividade de anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 para CCR4 humano

A atividade dos sobrenadantes de cultura resultantes de 22 anticorpos foi avaliada como segue.

O composto 1 (SEQ ID N°: 37) foi selecionado como um peptídeo de região extracelular de CCR4 humano que pode reagir com o anticorpo quimérico anti-CCR4 KM2760 produzido pelo transformante KM2760 (FERM BP-7054) preparado no Exemplo de Referência 2. A fim de usar o Composto 1 na medição da atividade através de ELISA, seu conjugado com BSA (albumina de soro bovino) (fabricada pela Nakalai Tesque) foi preparado e usado como o antígeno. Isto é, 100 ml de solução de 25 mg/ml de éster de N-hidroxissuccinimida do ácido SMCC (4-(N-maleimidometil)cicloexano-1carboxílico) (fabricado pela Sigma)-DMSO foram adicionados em gotas a 900 ml de solução de PBS contendo 10 mg de BSA sob vórtex e gentilmente agitados por 30 minutos. A uma coluna de filtragem de gel, tal como coluna NAP-10 ou similar, equilibrada com 25 ml de PBS, 1 ml da solução de reação foi aplicado, e o eluato eluído com 1,5 ml de PBS foi usado como uma solução de BSA-SMCC (a concentração de BSA foi calculada através de medição de A₂₈o)- Em seguida, 250 ml de PBS foram adicionados a 0,5 mg do Composto 1 que foi então completamente dissolvido adicionando 250 ml de DMF, e então a solução de BSA-SMCC (teor de BSA: 1,25 mg) foi adicionada sob vórtex e gentilmente agitada por 3 horas. A solução de reação foi dializada da noite para o dia a 4°C contra PBS, azida de sódio foi adicionada a ela para dar uma concentração final de 0,05% e então a mistura resultante foi filtrada usando filtro de 0,22 mm para dar uma solução de BSA-Composto

1.

Em uma placa de ELISA de 96 cavidades (fabricada pela Greiner), 0,05 pg/ml do conjugado preparado foi dispensado em 50 pl/cavidade e deixado descansar a 4°C da noite para o dia para adsorção. Após lavagens com PBS, PBS contendo BSA a 1% (daqui em diante referido como BSAPBS a 1%) foi adicionado a ela a 100 μΙ/cavidade e deixado reagir em temperatura ambiente por 1 hora para bloquear os grupos ativos restantes. Após lavagem de cada cavidade com PBS contendo Tween 20 a 0,05% (daqui em diante referido como Tween-PBS), um sobrenadante de cultura do transformante foi adicionado a 50 μΙ/cavidade e deixado reagir em temperatura ambiente por 1 hora. Após a reação e lavagem subseqüente de cada cavidade com Tween-PBS, uma solução de anticorpo IgG(y) anti-humano de cabra marcado com peroxidase (fabricada pela American Qualex) diluída 6.000 vezes com BSA-PBS a 1% foi adicionada como uma solução de anticorpo secundária em porções de 50 μΙ/cavidade e deixada reagir em temperatura ambiente por 1 hora. Após a reação e subseqüente lavagem com TweenPBS, uma solução de substrato de ABTS (uma solução preparada dissolvendo 0,55 g de ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfônico)amônio em 1 litro de tampão de citrato 0,1 M (pH 4,2) e adição de 1 μΙ/ml de peróxido de hidrogênio um pouco antes do uso) foi adicionada a 50 μΙ/cavidade para desenvolver cor, e a reação foi parada 20 minutos em seguida adicionando solução de SDS a 5% em 50 μΙ/cavidade. Em seguida, absorbância a 415 nm foi medida.

Também, a fim de comparar as concentrações de um anticorpo IgG humano produzido nos sobrenadantes de cultura, um anticorpo IgG(y) anti-humano de cabra (fabricado pela American Qualex) diluído 2.000 vezes com PBS foi usado como antígeno.

Os resultados são mostrados na Figura 7 e na Figura 8. Cada anticorpo enxertado com CDR CCR4 humano mostrou quase a mesma atividade do anticorpo quimérico humano KM2760.

2. Expressão estável de anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 usando células de animais

Um anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 foi expresso em células animais usando o vetor de expressão de anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 obtido em 2(3) do Exemplo 1 como segue.

1) Expressão estável em célula YB2/0 do tipo de célula mieloma de rato (ATCC CRL1581)

Cada plasmídeo de expressão de anticorpo enxertado com CDR humano foi levado para um estado linear digerindo-o com uma enzima de • ·· * OOOÍ οο« :°^β : : : .° : _β° _ο° : :

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restrição Aatll (fabricada pela TOYOBO), 10 pg do produto digerido foram introduzidos em 4x10⁶ células de célula YB2/0 do tipo de célula mieloma de rato (ATCC CRL 1581) através de eletroporação (Cytotechnology, 3, 133 (1990)), e então as células foram suspensas em 40 ml de meio H-SFM (fa5 bricado pela GIBCO-BRL) (suplementado com soro bovino fetal a 5% (FBS)) e dispensadas a 200 pl/cavidade em uma placa de microtitulação de 96 cavidades (fabricada pela Sumitomo Bakelite). Após cultura a 37°C por 1 a 3 dias em um incubador de CO₂ a 5%, G418 (fabricado pela Nakalai Tesque) foi adicionado a ela para dar uma concentração de 1 mg/ml e a cultura foi 10 continuada por 1 a 2 semanas para se obter transformantes resistentes a

G418.

Sobrenadantes de cultura foram recuperados das cavidades onde as colônias dos transformantes mostrando resistência a G418 se tornaram confluentes, e atividades de ligação de antígeno de anticorpos cnxerta\ 15 dos com CDR humano anti-CCR4 nos sobrenadantes de cultura foram medidas através de ELISA mostrado em 1(2) do Exemplo 2.

A fim de aumentar a quantidade de expressão de anticorpo usando um sistema de amplificação de gene dhfr, os transformantes nas cavidades onde a expressão de um anticorpo quimérico anti-CCR4 foi verifi20 cada nos sobrenadantes de cultura foram suspensos para dar uma densidaz-x de de 1 a 2x10⁵ células/ml em meio H-SFM contendo 1 mg/ml de G418 e 50 θ nM de metotrexato (daqui em diante referido como MTX) que é um inibidor da diidrofolato redutase do produto de gene dhfr e dispensados em porções de 1 ml em uma placa de 24 cavidades (fabricada pela Greiner). Transfor25 mantes mostrando resistência a MTX 50 nM foram induzidos por cultura a 37°C por 1 a 2 semanas em um incubador de CO₂ a 5%. Quando os transformantes se tornaram confluentes nas cavidades, atividades de ligação de antígeno de anticorpo enxertados com CDR humano anti-CCR4 nos sobrenadantes de cultura foram medidas através de ELISA mostrada em 1(2) do 30 Exemplo 2. Com relação aos transformantes das cavidades onde a expresI são de anticorpos enxertados com CDR humano anti-CCR4 foi verificada

I nos sobrenadantes de cultura, a concentração de MTX foi aumentada para i

I

I

100 nM e então 200 nM através do método acima, e um transformante capaz de crescer em meio H-SFM contendo 1 mg/ml de G418 e 200 nM de MTX e também capaz de expressar altamente o anticorpo enxertado com CDR humano anti-CCR4 foi finalmente obtido. Para o transformante desse modo obtido, isolamento de célula única (clonagem) foi realizado limitando a análise de diluição para se obter um clone de célula transformante mostrando a mais alta expressão do anticorpo enxertado com CDR humano anti-CCR4. Um anticorpo produzindo célula KM8760 obtido através de transferência de gene de um vetor de expressão pKANTEX2160Gal1LV3 e um anticorpo produzindo célula KM8759 obtido através de transferência de gene de um vetor de expressão pKANTEX2160Gal2LV3 foram depositados em 30 de julho de 2002, como FERM BP-8130 e FERM BP-8129, respectivamente, no International Depositary Authority at Iternational Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6,1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japão).

(2) Purificação de anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 a partir do sobrenadante de cultura

Quando um transformante mostrando resistência a G418 apareceu e se tornou confluente, o meio foi mudado para 300 a 1.100 ml de meio H-SFM contendo Daigo's GF21 (fabricado pela Wako Pure Chemical Industries) em uma concentração de 5%, seguido por cultura por 3 a 5 dias. Quando ele se tornou confluente, o sobrenadante da cultura foi recuperado. Uma proteína purificada foi obtida purificando o anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 de a partir de cerca de 300 a 1.100 ml do sobrenadante de cultura usando coluna Prosep-A (fabricada pela Millipore) de acordo com as instruções anexas.

3. Avaliação da atividade de anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4

A atividade foi avaliada usando anticorpos enxertados com CDR anti-CCR4 derivados de células produzindo anticorpos obtidas introduzindo vetores de expressão de GalOLVO, GalOLVI, GalOLV3, Gal1LV1, Gal1LV3, Gal2LV1, Gal2LV3, Gal3LV1 e Gal3LV3 em YB2/0 (daqui em diante referido simplesmente como GalOLVO, GalOLVI, GalOLV3 , Gal1LV1 ,

Gal1LV3, Gal2LVT', GalZLVS”, Gal3LVr e Gal3LV3, respectivamente).

(1) Medição da atividade de ligação de anticorpo enxertado com CDR antiCCR4 para CCR4 humano (método ELISA)

A medição foi realizada da mesma maneira que o método descrito no artigo 1(2) do Exemplo 2. Os resultados são mostrados na Figura 9. Cada anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 mostrou quase a mesma atividade que aquela do anticorpo quimérico KM2760.

(2) Reatividade de anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 com célula de alta expressão de CCR4 (técnica de anticorpo fluorescente) θ A uma placa de 96 cavidades, 2x10⁵ ou mais células CCR4/EL-

4, células com alta expressão de CCR4 obtidas no Exemplo de Referência 3, foram dispensadas. Uma solução de anticorpo foi preparada diluindo cada um dos anticorpos purificados e uma imunoglobulina humana (fabricada pela \ 15 Welfide) para prevenção de fingimento não-específico para dar concentrações de 10 pg/ml e 3,75 mg/ml, respectivamente, com um tampão para FACS, e a solução de anticorpo foi adicionada a 100 μΙ/cavidade e deixada reagir por 30 minutos em gelo. Como um controle negativo, 10 pg/ml de um anticorpo de cadeia α de receptor de IL-5 anti-humano (WO 97/10354) foram 20 usados. Após lavar duas vezes com 200 μΙ/cavidade do tampão para FACS, z-x um anticorpo IgG anti-humano marcado com PE (fabricado pela Coulter) di- luído 100 vezes foi adicionado a 50 μΙ/cavidade. Após a reação em gelo sob agitação e subsequente lavagem três vezes com 200 μΙ/cavidade do tampão para FACS, o produto de reação foi suspenso em 50 μΙ do tampão para 25 FACS e a intensidade de fluorescência foi medida usando um citômetro de fluxo. Os resultados são mostrados na Figura 10. Todos os anticorpos enxertados com CDR anti-CCR4 mostraram quase a mesma atividade que o anticorpo quimérico humano KM2760.

(3) Medição da atividade do anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 em se 30 ligar a CCR4 humano (método BIAcore)

A fim de medir a atividade de ligação em mais detalhes, a ativi] dade de ligação de vários anticorpos purificados foi medida usando BIAcoI rem 2000 (fabricado pela BIACORE) como segue. Neste caso, HBS-EP (fabricado pela BIACORE) foi usado como o tampão para diluição de amostras e para a medição. Primeiro, 5 pl de 0,05 pg/ml de solução do Composto 1 como um peptídeo parcial de CCR4 biotinilado foram adicionados à ponta de um sensor SA (fabricado pela BIACORE) em uma taxa de fluxo de 5 μΙ/minuto e imobilizados na ponta do sensor.

À ponta do sensor imobilizada com composto 1 biotinilado preparado, 20 pl de 4 pg/ml de solução de cada um dos anticorpos purificados foram adicionados em uma taxa de fluxo de 5 μΙ/minuto, e após o término da adição, a reação de dissociação foi monitorada por 4 minutos e então a superfície da ponta do sensor foi regenerada adicionando 5 pl de HCI 10 mM duas vezes. Desse modo, uma curva de reação de ligação (sensorgrama) para o Composto 1 foi obtida.

Os resultados são mostrados na Figura 11.0 ordinal representa uma unidade de ressonância (RU) que significa uma mudança na massa na ponta do sensor. Por exemplo, 1.000 RU corresponde a uma mudança na massa de cerca de 1 ng/mm² de proteína. Foi mostrado que KM2760 tem uma atividade de ligação acentuadamente estável e alta, porque ele mostrou uma atividade de ligação dependente do tempo para o Composto 1 e dissociação de sua ligação foi dificilmente encontrada através da reação de dissociação. Por outro lado, cada um dos anticorpos enxertados com CDR antiCCR4 mostrou quase a mesma reação de dissociação que o anticorpo quimérico humano KM2760, mas uma ligeira diminuição na atividade foi verificada na reação de ligação com o peptídeo parcial CCR4, Composto 1. O anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 GalOLVO onde CDR sozinho foi enxertado mostrou a mais baixa atividade de ligação, e a atividade de ligação foi aumentada através de modificação do resíduo de aminoácido de FR. Os resultados mostram que um anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 que mantém a atividade de ligação de antígeno e especificidade de ligação de um anticorpo de camundongo pode ser preparado enxertando CDR do anticorpo de camundongo KM2160 em um anticorpo de FR humano apropriado, e que um anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 tendo atividade de ligação mais alta pode ser preparado identificando os resíduos de aminoácido de FR importantes para a atividade de ligação baseada na estrutura tridimensional e similares de regiões V de anticorpo e enxertando-os junto com o CDR. É esperado que os anticorpos enxertados com CDR anti-CCR4 preparados neste Exemplo tenham alta atividade de ligação a CCR4, tenham menor imunogenicidade em ser humano em comparação com aquela de anticorpos de camundongo e também aquela de anticorpos quiméricos humanos e tenham alta segurança e efeitos terapêuticos acentuados.

2. Atividade citotóxica in vitro de anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 (atividade ADCC)

A fim de avaliar a atividade citotóxica in vitro do anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 obtido em 2(2) do Exemplo 2, sua atividade ADCC foi medida como segue.

(1) Preparação de suspensão de célula alvo

A célula CCR4/EL-4 com alta expressão de CCR4 humano obtida no Exemplo de Referência 3 foi posta em cultura em meio RPMI 1640 contendo FCS a 10% (fabricado pela GIBCO) contendo 0,5 mg/ml de G418 para dar uma densidade de 1x10⁶ células/0,5 ml, 1,85 MBq equivalente de cromato de sódio radioativo (Na2⁵¹CrO4) (fabricado pela Daiichi Pure Chemicals) foi adicionado a ela e a mistura foi deixada reagir a 37°C por 1,5 hora para marcar com isótopo as células. Após a reação, as células foram lavadas três vezes por sua suspensão em meio RPMI 1640 e centrifugação, ressuspensas no meio e então incubadas em gelo a 4°C por 30 minutos para espontaneamente liberar a substância radioativa. Após centrifugação, 5 ml de meio RPMI 1640 contendo FCS a 10% foram adicionados a elas para dar uma densidade de 2x10⁵ células/ml como uma suspensão de célula alvo.

(2) Preparação de suspensão de célula efetora

Sangue periférico humano saudável (60 ml) foi coletado usando uma seringa contendo 200 unidades (200 pl) de uma injeção de heparina de sódio (fabricada por Takeda Pharmaceutical). A quantidade total foi enchida em até 120 ml diluindo-a duas vezes com o mesmo volume de solução salina fisiológica (fabricada pela Otsuka Pharmaceutical). Linfoprep (fabricado pela NYCOMED) foi dispensado em 5 ml em 12 tubos de centrifugação de capacidade de 15 ml (fabricados pela Sumitomo Bakelite), os sangues periféricos diluídos foram postos em camada sobre ele a 10 ml, e a mistura foi centrifugada a 800 x g por 20 minutos em temperatura ambiente. Frações de PBMC entre a camada de plasma sangüínea e a camada de Linfoprep foram coletadas de todos os tubos de centrifugação, suspensas em meio RPMI 1640 contendo FCS a 1% (daqui em diante referido como FCS-RPMI a 1 %), lavadas duas vezes através de centrifugação a 400 x 4°C por 5 minutos e então ressuspensas para dar uma densidade de 5 x 10⁶ células/ml a serem usadas como células efetoras.

(3) Medição da atividade ADCC

A suspensão de célula alvo preparada em (1) foi dispensada a 50 pl (1x10⁴ células/cavidade) em cavidades de uma placa inferior U de 96 cavidades (fabricada pela Falcon). Em seguida, a suspensão de célula efetora preparada em (2) foi dispensada a 100 pl (5x10⁵ células/cavidade, a razão de células efetoras para células alvo ficou 50: 1). Em seguida, cada anticorpo quimérico anti-CCR4 foi adicionado para dar uma concentração final de 0,1 ng/ml a 10 ng/ml e a mistura foi deixada reagir a 37°C por 4 horas. Após a reação, a placa foi centrifugada e a quantidade de ⁵¹Cr em 100 μΐ do sobrenadante em cada cavidade foi medida por um contador γ. A quantidade do ⁵¹Cr espontaneamente dissociado foi calculada da mesma maneira que acima usando o meio sozinho ao invés da suspensão de célula efetora e solução de anticorpo e medição da quantidade de ⁵¹Cr no sobrenadante. A quantidade do ⁵¹Cr dissociado total foi calculada da mesma maneira como acima adicionando o meio sozinho ao invés da solução de anticorpo, e ácido clorídrico 1N ao invés da suspensão de célula efetora, e medição da quantidade de ⁵¹ Cr no sobrenadante. A atividade ADCC foi calculada através da equação que segue:

(quantidade de ⁵¹Cr no sobrenadante de amostra) -(quantidade de ⁵¹Cr espontaneamente liberado) * Atividade de ADCC (%) = ------------------------------------------ x 100 (quantidade de ⁵¹Cr total)

-(quantidade de ⁵¹Cr espontaneamente liberado)

Os resultados são mostrados na Figura 12. Conforme mostrado na Figura 12, o anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 tinha atividade citotóxica forte dependentemente da concentração de anticorpo.

5. Efeito de produção de inibição de citocina de PBMC humano

Um efeito de inibição de produção de citocina foi examinado usando um anticorpo Gal1LV3 enxertado com CDR anti-CCR4 e um anticorpo KM2760 quimérico. Um anticorpo anti-IL-5R foi usado como o controle negativo.

PBMC foi separado da mesma maneira como em 4(2) do exemplo 2 e dispensado a 1x10⁶ células/cavidade em uma placa inferior U de 96 cavidades, um anticorpo de avaliação foi adicionado a ele para dar uma concentração final de 1 pg/ml, e o volume total foi ajustado para 200 pl/cavidade. A atividade de ADCC foi induzida através de co-cultura a 37°C por 24 horas em uma corrente de CO₂ a 5%. Após cultura, 100 pl do sobrenadante foram removidos, 100 μΙ de um meio contendo 100 ng/ml de PMA (acetato de miristato de forbol) e 2 pg/ml de ionomicina (fabricada pela SIGMA) foram adicionados a ele para dar uma concentração final de 50 ng/ml de PMA e 1 pg/ml de ionomicina, e as células foram estimuladas para induzir produção de citocina. Após introdução de cada estimulante, cultura foi realizada por 24 horas, os sobrenadantes da cultura foram recuperados e IL-4, IL-13 e interferon (IFN-γ) foram medidos usando um kit de ensaio de citocina (fabricado pela Biosource). A razão de inibição de produção foi calculada definindo cada produção de citocina na ausência de anticorpo como razão de inibição de 0%, e os resultados são mostrados na Figura 13. Conforme mostrado na Figura 13, similar ao anticorpo quimérico KM2760, o grupo adicionado com anticorpo Gal1LV3 enxertado com CDR anti-CCR4 significantemente inibiu a produção das citocinas IL-4 e IL-13 de Th2 mas tinha pouca influência sobre a citocina IFN-γ Th1.

Os resultados mostram que cada anticorpo enxertado com CDR anti-CCR4 pode esgotar ou eliminar células Th2 expressas em CCR4 ativando células efetoras eficientemente e, como um resultado, tem um efeito de inibição de produção da citocina Th2 a partir das células Th2 e desse modo é útil no diagnóstico ou tratamento de doenças imunes mediadas por Th2 humana tal como asma brônquica, dermatite atópica e similares.

6. Análise de reatividade para plaqueta humana (1) Separação de plaqueta humana

Um volume de 1/10 de citrato de sódio a 3,2% foi adicionado a | uma amostra de sangue coletada de uma pessoa saudável e totalmente misturada. O sangue foi dispensado a 5 ml em tubos de capacidade de 15

I ml (fabricado pela Greiner) e centrifugado a 90 x g por 10 minutos em temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram coletados e adicionalmente centrifugados a 1.950 x g por 10 minutos em temperatura ambiente. Após descarga do sobrenadante, os péletes foram suspensos no tampão para FACS e centrifugados a 1.190 x g por 5 minutos em temperatura ambiente | para lavar os péletes. Os péletes foram novamente suspensos no tampão para FACS e centrifugados da mesma maneira, e então as plaquetas na forma de pélete foram ajustadas para dar uma densidade de cerca de 1 x | ’ 10⁷ péletes/ml usando o tampão para FACS.

i (2) Tingimento de plaqueta

Cada um dos anticorpos enxertados com CDR humano antij CCR4 purificados obtidos em 3 no Exemplo 2 foi adicionado a 100 pl da suspensão de plaqueta obtida no item 6(1) para dar uma concentração de 10 I θ pg/100 μΙ e deixado reagir em temperatura ambiente por 30 minutos no escuro. Como controles comparativos, cada um de um anticorpo quimérico humano anti-CCR4 KM2760 e um anticorpo 1G1 anticamundongo (fabricado pela Pharmingen) foi deixado reagir com 100 ml da suspensão de plaqueta 25 na mesma concentração. Após a reação, 2 ml de tampão para FACS foram adicionados a cada um dos tubos de 15 ml de capacidade, e a mistura foi agitada e então lavada através de centrifugação a 840 x g por 5 minutos a 4 C. Após descarga do sobrenadante, a mesma operação foi realizada novamente. Um anticorpo IgG anticamundongo marcado com PE (fabricado 30 pela Coulter) diluído 50 vezes com o tampão para FACS foi adicionado a 20 μΙ ao tubo contendo uma amostra reagida com cada um dos anticorpos enI xertados com CDR humano e KM2760 e deixado reagir em temperatura am

I biente por 30 minutos no escuro. Com relação ao tubo contendo a amostra reagida com o anticorpo 1G1, 20 pl de um anticorpo IgG anticamundongo marcado com PE diluído 50 vezes (fabricado pela DAKO) foram adicionados e deixados reagir em temperatura ambiente por 30 minutos no escuro.

Após a reação, 2 ml do tampão para FACS foram adicionados a cada tubo, seguido por agitação, e a mistura foi lavada através de centrifugação a 840 x g por 5 minutos a 4°C. Após descarga do sobrenadante, a mesma operação foi realizada novamente. Após suspensão do resíduo em 500 μΙ do tampão para FACS, a intensidade de fluorescência foi medida 10 usando um citômetro de fluxo EPICS XL-MCL (fabricado pela Beckman

Coulter).

Os resultados são mostrados na Figura 14. O anticorpo 1G1 como um controle comparativo mostrou reatividade com plaquetas, mas todos os anticorpos enxertados com CDR humano anti-CCR4 não mostraram 15 reatividade específica com plaquetas humanas similar ao anticorpo quimérico humano anti-CCR4 KM2760.

Exemplo de Referência 1

Preparação de célula hibridoma que produz anticorpo monoclonal anti-CCR4 de camundongo:

Células hibridoma que produzem anticorpo monoclonal antiCCR4 de camundongo KM2160 (Int. Immunol., 11, 81 (1999)) foram produzidas de acordo com o procedimento que segue.

(1) Preparação de antígeno

A seqüência de aminoácido (SEQ ID N°: 48) de proteína de

CCR4 humana (daqui em diante referido como hCCR4) foi analisada usando Genetyx Mac, e o Composto 2 (SEQ ID N°: 36) foi selecionado como uma seqüência parcial considerada ser apropriada como o antígeno dentre as partes tendo alta hidrofobicidade, N-terminal e C-terminal.

(2) Preparação de imunógeno

O peptídeo parcial de hCCR4 obtido em (1) do Exemplo de Referência 1 foi usado como o imunógeno após preparação de seu conjugado com KLH (Calbiochem) através do método que segue a fim de aumentar sua imunogenicidade. Especificamente, KLH foi dissolvido em PBS para dar uma concentração de 10 mg/ml, 1/10 volume de 25 mg/ml de MBS (fabricado por Nakalai Tesque) foi adicionado em gotas a ele, e a mistura foi deixada reagir através de agitação por 30 minutos. MBS livre foi removido através de uma coluna de filtragem de gel tal como coluna Shephadex G-25 que tinha sido equilibrada previamente com PBS ou similar, e 2,5 mg de KLH-MB resultante foram misturados com 1 mg do peptídeo dissolvido em tampão de fosfato 0,1 M (pH 7,0), seguido por agitação em temperatura ambiente por 3 horas. Após a reação, a mistura foi dialisada contra PBS.

(3) Imunização de animal e produção de células de produção de anticorpo

Camundongos fêmea de 5 semanas de vida (Balb/c), 100 pg de conjugado de peptídeo-KLH preparado em (2) do Exemplo de Referência 1 foram administrados junto com 2 mg de gel de alumínio e 1 χ 10⁹ células de vacina de coqueluche (fabricada pela Chiba Serum Institute) e 2 semanas mais tarde 100 pg do conjugado foram administrados uma vez por semana em um total de 4 vezes. Uma amostra de sangue foi tomada de cada animal do plexo venoso do fundo do olho, seu título de soro foi examinado através de um imunoensaio de enzima descrito acima, e o baço foi excisado 3 dias após a imunização final de um camundongo que mostrou um título de anticorpo suficiente. O baço foi excisado de um camundongo no 3^o dia após a administração final e cortado em pedaços em MEM (fabricado por Nissui Pharmaceutical), e as células foram separadas usando um par de fórceps e centrifugadas (1.200 rpm, 5 minutos), o sobrenadante foi removido, seguido através de tratamento com 3 ml de um tampão de cloreto de Tris-amônio (pH 7,65) por 1 a 2 minutos para eliminar eritrócitos. As células restantes foram adicionalmente lavadas três vezes com MEM e usadas para fusão de célula.

(4) Preparação de célula mieloma de camundongo

Um tipo de célula mieloma de camundongo resistente à 8azaguanina, P3X63Ag8U.1, (ATCC CRL-1597, daqui em diante referido como P3-U1), foi cultivado e usado como o tipo de célula de origem na fusão celular.

Ο (5) Preparação de célula hibridoma

As células de baço e células de mieloma obtidas em (3) e (4) no Exemplo de Referência 1 foram misturadas para uma razão de 10: 1, seguido por centrifugação (1.200 rpm, 5 minutos) para remover o sobrenadante, 0,5 ml de uma solução de polietileno glicol (uma solução contendo 2 g de polietileno glicol-1000, 2 ml de MEM e 0,7 ml de DMSO) foi adicionado às células desse modo precipitadas por 10⁸ de células de baço a 37°C, seguido por suspensão total. Em seguida, 1 a 2 ml de MEM foram adicionados várias vezes a 1 a 2 minutos de intervalo, e o volume final foi ajustado para 50 ml com MEM. Após remoção do sobrenadante através de centrifugação (900 rpm, 5 minutos), o precipitado foi suspenso em 100 ml de meio HAT, dispensado a 100 μΙ/cavidade em uma placa de microtitulação de 96 cavidades (fabricada por Sumitomo Bakelite), seguido por cultura em uma incubadora de CO₂ a 5% a 37°C por 10 a 14 dias. Usando cavidades onde a propagação da célula fundida foi observada, a atividade de ligação ao peptídeo parcial hCCR4 (Composto 2) no sobrenadante de cultura foi medida através de ELISA (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Capítulo 14 (1988), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited (1996), etc). Cada cavidade onde a atividade foi confirmada foi clonada em um total de 2 vezes de diluição de limitação, uma vez mudando o meio para o meio HT e então mudando o meio para o meio normal. Desse modo, uma célula de hibridoma KM2160 que produz o anticorpo de camundongo de camundongo KM2160 foi obtida. KM2160 especificamente reagiu com o peptídeo parcial hCCR4 (Composto 2).

Exemplo de Referência 2

Preparação de anticorpo quimérico anti-CCR4:

1. Isolamento e análise de cDNA codificando região V de anticorpo de camundongo anti-CCR4:

(1) Preparação de mRNA de célula hibridoma que produz anticorpo de camundongo anti-CCR4

Um mRNA foi preparado a partir da célula hibridoma KM2160 descrita no Exemplo de Referência 1. Cerca de 48 pg de mRNA foram pre78 parados a partir de 8 x 10⁷ células da célula hibridoma KM2160 usando um kit de preparação de mRNA, Fast Track mRNA Isolation Kit (fabricado por Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.

(2) Preparação de biblioteca de cDNA de cadeia H e cadeia L de anticorpo 5 de camundongo anti-CCR4 cDNA tendo adaptadores de EcoRI-Notl em ambos terminais foi sintetizado de 5 pg do mRNA de KM2160 obtido em 1(1) do Exemplo de Referência 2 usando o kit de síntese de cDNA (fabricado pela Amersham Pharmacia Biotech) de acordo com as instruções do fabricante. O cDNA 10 desse modo preparado foi dissolvido em 20 pl de água estéril e fracionado através de eletroforese de gel de agarose, e cerca de 1,5 kb de fragmentos de cDNA correspondendo à cadeia H do anticorpo do tipo IgG e cerca de 1,0 kb de fragmentos de cDNA correspondendo à cadeia L do tipo κ foram respectivamente recuperados usando o kit de Extração de Gel QIA QUICK (fa15 bricado pela QIAGEN). Em seguida, usando o Kit de Vetor Tratado com λΖΑΡΙΙ pré-digerido com EcoR//CIAP (fabricado pela Stratagene), cada um de 0,1 pg dos 1,5 kb de fragmentos de cDNA e 0,1 pg de cerca de 1,0 kb de fragmentos de cDNA foi ligado a 1 pg do vetor λΖΑΡΙΙ que tinha sido digerido com uma enzima de restrição EcoRI e desfosforilado no terminal com Fos20 fatase Alcalina de Intestino de bezerro de acordo com as instruções do fabricante. No fago λ, 2,5 pl de cada solução de reação após a ligação foram embalados usando o Extrato de Embalagem de Ouro Gigapacklll (fabricado pela Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante, e então Escherichia coli XL1-Blue (Biotechniques, 5, 376 (1987)) foi infectada com uma 25 quantidade apropriada do fago para se obter 9,3 x 10⁴ de clones de fago como a biblioteca de cDNA de cadeia H de KM2160 e 7,4 x 10⁴ de clones de fago como a biblioteca de cDNA de cadeia L. Em seguida, cada fago foi fixado em um filtro de membrana de náilon Hybond-N+ (fabricado pela Amersham Pharmacia Biotech) de acordo com as instruções do fabricante.

(3) Clonagem de cDNAs de cadeia H e cadeia L de anticorpo de camundongo anti-CCR4

Usando Sistema de Detecção e Marcação de Ácido Nucléico

Direta ECL (fabricado pela Amersham Pharmacia Biotech), de acordo com as instruções do fabricante, clones em filtros de membrana de náilon da biblioteca de cDNA de cadeia H e biblioteca de cDNA de cadeia L de KM2160 preparados em 1(2) do Exemplo de Referência 2 foram detectados usando 5 cDNA da região C de um anticorpo de camundongo (a cadeia H é um fragmento de BamHI-EcoRI de cDNA CÁ1 de camundongo (EMBO J., 3, 2047 (1984)), a cadeia L é um fragmento de Hpal-EcoRI de cDNA Ck (Ce//, 22, 197 (1980)) como a sonda, e clones de fago fortemente ligados à sonda foram obtidos como 10 clones para cada uma da cadeia H e cadeia L. Em se10 guida, cada clone de fago foi convertido em plasmídeo através do método de excisão in vivo usando o Kit de Clonagem de λΖΑΡΙΙ de acordo com as instruções do fabricante (fabricado pela Stratagene). Usando o Kit de Reação Imediata de FS de Seqüenciamento de Ciclo de Terminador BigDye (fabricado pela PE Biosystems), a seqüência de nucleotídeo de cDNA contida em 15 cada plasmídeo obtido desta maneira foi analisada através de um seqüenciadorde DNA ABI PRISM 377 do mesmo fabricante de acordo com as instruções do fabricante. Como um resultado, um plasmídeo pKM2160H4 contendo um cDNA de cadeia H funcional de comprimento longo e um plasmídeo pKM2160L6 contendo o cDNA de cadeia L de comprimento longo, onde uma 20 seqüência ATG considerada ser o códon de iniciação está presente no terminal 5' do cDNA, foram obtidos.

(4) Análise de seqüência de aminoácido da região V de anticorpo de camundongo anti-CCR4

Uma seqüência de nucleotídeo completa da região V da cadeia 25 H contida no plasmídeo pKM2160H4, uma seqüência de aminoácido de comprimento completo da região V da cadeia H deduzida dele, uma seqüência de nucleotídeo completa da região V da cadeia L no plasmídeo pKM2160L6 e uma seqüência de aminoácido completa da região V da cadeia L deduzida dele são representadas pelas SEQ ID N°s: 61, 62, 63 e 64, 30 respectivamente. Com base na comparação com dados de seqüência de anticorpos de camundongo conhecidos (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)) e comparação com os resultados da análise das seqüências de aminoácido N-terminais da cadeia H e da cadeia L do anticorpo de camundongo anti-CCR4 purificado KM2160 realizada usando um seqüenciador de proteína (PPSQ-10, fabricado pela Shimadzu), foi verificado que cada cDNA desse modo isolado é um 5 cDNA de comprimento completo que codifica o anticorpo de camundongo anti-CCR4 KM2160 contendo seqüências de sinal de secreção que são aminoácidos de posições 1-19 na seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 15 na cadeia H e aminoácidos de posições 1-19 na seqüência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 25 na cadeia L.

Em seguida, a inovação das seqüências de aminoácido das regiões V da cadeia H e cadeia L do anticorpo de camundongo anti-CCR4 KM2160 foi examinada. Usando o Pacote GCG (versão 9,1, fabricado pela Genetics Computer Group) como o sistema de análise de seqüência, a base de dados de seqüência de aminoácido de proteínas conhecidas foi pesqui15 sada através do método BLAST (Nucleic. Acids Res., 25, 3389 (1997)).

Como resultado, seqüências completamente coincidentes não foram encontradas para ambas cadeia H e cadeia L, de modo que foi confirmado que a região V da cadeia H e a região V da cadeia L do anticorpo de camundongo anti-CCR4 KM2160 eram seqüências de aminoácido novas.

Também, CDRs da região V da cadeia H e região V da cadeia L do anticorpo de camundongo anti-CCR4 KM2160 foram identificadas comparando com seqüências de aminoácido de anticorpos conhecidos. As seqüências de aminoácido de CDR1, CDR2 e CDR3 na região V da cadeia H do anticorpo de camundongo anti-CCR4 KM2160 são representadas pelas SEQ 25 ID N°s: 1,2 e 3, respectivamente, e as seqüências de aminoácido de CDR1,

CDR2 e CDR3 na região V da cadeia L nas SEQ ID N°s: 5, 6 e 7, respectivamente.

2. Expressão estável de anticorpo quimérico anti-CCR4 usando célula animal (1) Construção de vetor de expressão de anticorpo quimérico anti-CCR4 pKANTEX2160

Um vetor de expressão de anticorpo quimérico anti-CCR4

Θ·1 ρΚΑΝΤΕΧ2160 foi construído como segue, usando um vetor de expressão de anticorpo humanizado pKANTEX93 que expressa um lgG1 humano e anticorpo do tipo κ e os plasmídeos pKM2160H4 e pKM2160L6 obtidos em 1(3) do Exemplo de Referência 2.

Um DNA sintético tendo as seqüências de nucleotídeo representadas pelas SEQ ID N°s: 65 e 66 foi projetado a fim de se obter cDNA da região V da cadeia H de KM2160 através de PCR, e um outro DNA sintético tendo as seqüências de nucleotídeo representadas pelas SEQ ID N°s: 67 e 68 para obtenção de cDNA da região V da cadeia L. Cada DNA sintético contém uma seqüência de reconhecimento de enzima de restrição no terminal 5' para sua clonagem no pKANTEX93, e síntese do DNA foi depositado para a Genset Inc. O plasmídeo pKM2160H4 (20 ng) obtido em 1(3) do Exemplo de Referência 2 foi adicionado a um tampão contendo 50 pl de Tampão de PCR N° 1 ligado à DNA Polimerase KOD (fabricado pela TOYOBO), 0,2 mM de dNTPS, 1 mm de cloreto de magnésio e 0,5 μΜ do DNA sintético tendo as seqüências de nucleotídeo representadas pelas SEQ ID N°s: 11 e 12, e a mistura foi aquecida a 94°C por 3 minutos. Após 2,5 unidades de DNA Polimerase KOD (fabricada pela TOYOBO) serem adicionadas, a mistura foi submetida a 25 ciclos da reação, cada ciclo consistindo em aquecimento a 94°C por 30 segundos, a 58°C por 30 segundos e a 74°C por 1 minuto, usando um Sistema de PCR de ciclizador térmico de DNA GeneAmp 9600 (fabricado pela PERKIN ELMER). Da mesma maneira, 20 ng do plasmídeo pKM2160L6 obtido em 1(3) do Exemplo de Referência 2 foram adicionados a um tampão contendo 50 μΙ de Tampão de PCR N° 1 ligado à DNA Polimerase KOD (fabricada por TOYOBO), dNTPS 0,2 mM, cloreto de estearato de magnésio 1 mM e 0,5 μΜ do DNA sintético tendo as seqüências de nucleotídeo representadas pelas SEQ ID N°s: 67 e 68, e PCR foi realizado da mesma maneira conforme acima descrito. A solução de reação (10 μΙ) foi submetida à eletroforese de gel de agarose, e então um produto de PCR da região V da cadeia H de cerca de 0,46 kb e um produto de PCR da região V da cadeia L de cerca de 0,43 kb foram, cada um, recuperados usando o Kit de Extração de GEL QIA QUICK (fabricado pela QIAGEN).

Em seguida, 0,1 pg de DNA obtido através de digestão de um plasmídeo pBluescript SK(-) (fabricado pela Stratagene) com uma enzima de restrição Smal (fabricada por Takara Shuzo) e cerca de 0,1 pg de cada um dos produtos de PCR obtidos acima foram adicionados à água estéril para dar um volume final de 7,5 pl, e 7,5 pl da solução I do Kit de Ligação de DNA TAKARA Ver. 2 (fabricado pela Takara Shuzo) e 0,3 pl de uma enzima de restrição Smal foram adicionados a ela, e a mistura foi deixada reagir a 22°C da noite para o dia. Usando a solução de DNA de plasmídeo recombinante resultante, DH5a de E. coli (fabricado por TOYOBO) foi transformada. Cada DNA de plasmídeo foi preparado a partir dos clones transformantes e submetido à reação usando O Kit de Reação Imediata de FS de Seqüenciamento de Ciclo de Terminador BigDye (fabricado pela Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante, e a seqüência de nucleotídeo foi analisada através do seqüenciador de DNA ABI PRISM 377 do mesmo fabricante. Desse modo, os plasmídeos pKM2160VH41 e pKM2160VL61 mostrados na Figura 15 tendo as seqüências de nucleotídeo desejadas foram obtidos.

Em seguida, 3 pg do vetor de expressão de anticorpo humanizado pKANTEX93 e 3 pg do pKM2160VH41 obtidos acima foram adicionados a um tampão contendo 30 pl de Tris-HCt 10 mM (pH 7,5), cloreto de magnésio 10 mM e DTT 1mM, 10 unidades de uma enzima de restrição Apal (fabricada por Takara Shuzo) foram adicionadas a ele, e a mistura foi deixada reagir a 37°C por 1 hora. A solução de reação foi submetida à precipitação de etanol, e o precipitado resultante foi adicionado a um tampão contendo 10 pl de Tris-HCI 50 mM (pH 7,5), cloreto de sódio 100 mM, cloreto de magnésio 10 mM, DTT 1 mM, BSA 100 pg/ml e Triton X-100 a 0,01%, 10 unidades de uma enzima de restrição Notl (fabricada por Takara Shuzo) foram adicionados a ele, e a mistura foi deixada reagir a 37°C por 1 hora. A mistura de reação foi fracionada através de eletroforese de gel de agarose e cerca de 12,75 kb e cerca de 0,44 kb de fragmentos de Apal-Notl de pKANTEX93 e pKM2160VH41, respectivamente, foram recuperados. Os dois fragmentos desse modo obtidos foram ligados usando o Kit de Ligação de DNA TAKARA Ver. 2 de acordo com as instruções do fabricante e DH5a de £. coli (fa83 bricado pela TOYOBO) foi transformado usando a solução de DNA de plasmídeo recombinante resultante. Cada DNA de plasmídeo foi preparado a partir de clones transformantes e confirmado através de um tratamento de enzima de restrição para desse modo se obter um plasmídeo pKANTEX2160H mostrado na Figura 16, onde cerca de 0,44 kb do fragmento de Apal-Notl desejado foi inserido.

Em seguida, 3 pg do pKANTEX2160H e 3 pg do pKM2160VL61 obtidos acima foram adicionados a um tampão contendo Tris-HCI 50 mM (pH 7,5), cloreto de sódio 100 mM, cloreto de magnésio 10 mM, DTT 1mM e 100 pg/ml de BSA, a solução foi ajustada para dar um volume total de 30 pl, 10 unidades de enzima de restrição BsiWI (fabricada pela New England Biolabs) foram adicionadas a ela, e a mistura foi deixada reagir a 55°C por 1 hora. Então, a enzima de restrição EcoRI (fabricada pela Takara Shuzo) foi adicionada a ela, e a mistura foi deixada reagir a 37°C por 1 hora. A mistura de reação foi fracionada através de eletroforese de gel de agarose, e cerca de 13,20 kb e cerca de 0,41 kb de fragmentos de EcoRI-fís/WI de pKANTEX2160H e pKM2160VL61, respectivamente, foram recuperados. Os dois fragmentos desse modo obtidos foram ligados usando o Kit de Ligação de DNA TAKARA Ver. 2 de acordo com as instruções do fabricante, e DH5a de E. coii (fabricada pela TOYOBO) foi transformada usando a solução de DNA de plasmídeo recombinante resultante. Cada DNA de plasmídeo foi preparado a partir dos clones transformantes e confirmado através de um tratamento de enzima de restrição para desse modo se obter um plasmídeo pKANTEX2160 mostrado na Figura 17, onde cerca de 0,41 kb do fragmento de EcoRI-Bs/WI desejado foi inserido. Quando o plasmídeo foi submetido à reação usando o Kit de Reação Imediata FS de Seqüenciamento de Ciclo de Terminador BigDye (fabricado pela Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante, e a seqüência de nucleotídeo foi analisada através de um seqüenciador de DNA ABI PRISM 377 do mesmo fabricante, foi confirmado que o plasmídeo desejado onde o cDNA codificando as regiões V de cadeia H e cadeia L KM2160 tinha sido clonado foi obtido.

5'H

(2) Expressão estável de anticorpo quimérico anti-CCR4 usando célula animal

O anticorpo quimérico anti-CCR4 foi expresso em células animais conforme descrito abaixo usando o vetor de expressão de anticorpo quimérico anti-CCR4 pKANTEX2160 obtido em 2(1) do Exemplo de Referência 2.

O plasmídeo pKANTEX2160 foi convertido em uma forma linear digerindo com uma enzima de restrição Aatll (fabricada pela TOYOBO) e 10 pg dela foram introduzidos em 4 χ 10⁶ células do tipo de célula mieloma de rato YB2/0 (ATCC CRL 1662) através de eletroforação (Cytotechnology, 3, 133 (1990)), e as células foram suspensas em 40 ml de meio H-SFM (fabricado pela GIBCO-BRL) (suplementado com FCS a 5%) e dispensadas a 200 pl/cavidade em uma placa de titulação de 96 cavidades (fabricada pela Sumitomo Bakelite). Vinte e quatro horas após incubação a 37°C em uma incubadora de CO₂ a 5%, G418 foi adicionado para dar uma concentração de 1 mg/ml, seguido por 1 a 2 semanas. Um sobrenadante de cultura foi recuperado de uma cavidade onde uma colônia de transformante resistente a G418 apareceu e tornou-se confluente, e atividade de ligação de antígeno do anticorpo quimérico anti-CCR4 no sobrenadante foi medida através de ELISA mostrado em 2(3) do Exemplo de Referência 2 (um anticorpo IgG(y) anti-humano de cabra marcado com peroxidase foi usado como o anticorpo secundário).

A fim de aumentar a quantidade expressa do anticorpo usando um sistema de amplificação de gene dhfr, o transformante em uma cavidade onde a expressão do anticorpo quimérico anti-CCR4 foi verificada no sobrenadante de cultura foi suspenso para dar uma densidade de 1 a 2x10⁵ células/ml em meio H-SFM contendo 1 mg/ml de G418 e 50 nM de metotrexato (daqui em diante referido como MTX: fabricado pela Sigma) que é o inibidor de uma diidrofolato redutase de produto de gene dhfr, e a suspensão foi dispensada em 1 ml nas cavidades de uma placa de cavidade de 24 cavidades (fabricada pela Greiner). A mistura foi cultivada a 37°C por 1 a 2 semanas em uma incubadora de CO₂ a 5%, de modo que um transformante mos85 trando resistência a MTX 50 nM foi induzido. Quando o transformante tornou-se confluente em uma cavidade, a atividade de ligação de antígeno do anticorpo quimérico anti-CCR4 no sobrenadante de cultura foi medida através de ELISA mostrado em 2(3) do Exemplo de Referência 2. Com relação aos transformantes em cavidades onde a expressão do anticorpo quimérico anti-CCR4 foi verificada nos sobrenadantes de cultura, a concentração de MTX foi aumentada para 100 nM e então para 200 nM da mesma maneira para finalmente para se obter um transformante que pode crescer em meio H-SFM contendo 1 mg/ml de G418 e 200 nM de MTX e pode também expressar altamente o anticorpo quimérico anti-CCR4. O transformante desse modo obtido foi submetido a isolamento de célula única (clonagem) por duas vezes de ensaio de diluição limitada, e um clone de transformante tendo a expressão mais alta de anticorpo quimérico anti-CCR4 foi chamado KM2760. A quantidade expressa do anticorpo quimérico anti-CCR4 pelo KM2760 era cerca de 5 pg/10⁶ células/24 horas. Em adição, a região C da cadeia H do anticorpo do KM2760 pertence à subclasse de lgG1 humano. KM2760 foi internacionalmente depositado como FERM BP-7054 em 24 de fevereiro de 2000, no National Institute of Bioscience e Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, o Ministry of International Trade and Industry (nome atual: International Patente Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) (Higashi 1-1-3, Tsukuba-shi, Ibaraki Prefecture, Japão (endereço atual: AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japão). Exemplo de Referência 3

Estabelecimento de célula com alta expressão de hCCR4 (1) Construção do vetor de expressão CAG-pcDNA3 para célula animal

Um vetor de expressão foi construído conforme descrito abaixo produzindo um vetor de expressão (CAG-pcDNA3) onde a região promotora de um vetor de expressão para célula animal, pcDNA (fabricado pela INVlTROGEN), foi mudada do promotor de citomegalovírus (CMV) para promotor de CAG (AG (β actina de galinha modificada) com realçador CMV-IE) e inserindo o gene de CCR4 no vetor.

% pcDNA3 (5 pg) foi deixado reagir com uma enzima de restrição Nrul (fabricada pela Takara Shuzo) a 37°C por 1 hora, e então fragmentos de DNA foram recuperados através de precipitação de etanol. Em seguida, eles foram deixados reagir com uma enzima de restrição Hindlll (fabricada 5 pela Takara Shuzo) a 37°C por 1 hora e então fracionado através de eletroforese de gel de agarose para recuperar um fragmento de DNA de cerca de 5,8 kb não contendo nenhuma região promotora de CMV. Plasmídeo HKS(+) (3 pg) tendo a região de promotor de CAG (Nuc. Acid. Res., 23, 3816 (1995)) foi deixado reagir com uma enzima de restrição Sail (fabricada pela 10 Takara Shuzo) a 37°C por 1 hora e então fragmentos de DNA foram recuperados através de precipitação de etanol. Suas extremidades foram tornadas cegas com o Kit de Cegação de DNA (fabricado pela Takara Shuzo), deixados reagir mais com Hindlll a 37°C por 1 hora, e então fracionados através de eletroforese de gel de agarose para recuperar um fragmento de DNA de 15 cerca de 1,8 kb contendo a região de promotor de CAG. Os respectivos fragmentos de DNA desse modo obtidos foram ligados usando o Kit de Ligação de DNA (fabricado pela Takara Shuzo) e DH5a de E. coli foi transformada usando o DNA de plasmídeo recombinante para se obter o plasmídeo de CAG-pcDNA3.

(2) Construção do vetor de expressão de hCCR4

Um vetor de expressão de hCCR4 foi construído conforme descrito abaixo usando o CAG-pcDNA3 obtido em 3(1) do Exemplo de Referência 2 e pcDNA3 inserido no DNA de hCRR4 (CCR4/pcDNA3). Ambos CAGpcDNA3 e CCR4/pcDNA3 foram deixados reagir com Hindlll a 37°C por 1 25 hora e fragmentos de DNA foram recuperados através de precipitação de etanol. Em seguida, eles foram deixados reagir com Bglll (fabricada peta Takara Shuzo) a 37°C por 1 hora e então fracionados através de eletroforese de gel de agarose para recuperar um fragmento de DNA de cerca de 2,0 kb contendo a região do promotor de CAG e um fragmento de DNA de cerca 30 de 5,5 kb contendo a região de gene de hCCR4. Em seguida, o plasmídeo de CAG-CCR4/pcDNA3 foi obtido usando ambos fragmentos de DNA da mesma maneira que em 3(1) do Exemplo de Referência 2.

(3) Expressão de hCCR4 em célula animal

O plasmídeo foi introduzido em células animais através de eletroforação da mesma maneira conforme descrito em 2(2) do Exemplo de Referência 2. Células EL-4 (ATCC TIB-39) foram suspensas em PBS(-) (fabricado pela GIBCO-BRL) para dar uma densidade de 1x10⁷ células/500 pl, 10 pg de CAG-CCR4/pcDNA obtidos em 3(2) do Exemplo de Referência 2 foram adicionados a elas, e a mistura foi incubada em gelo por 10 minutos e então posta em uma cubeta para uso exclusivo (fabricada pela Bio-Rad) para realizar a introdução do gene a 260 V e 500 pFD. Após a mistura ter sido adicionalmente incubada em gelo por 10 minutos, as células foram suspensas em 200 ml de meio FCS-RPMI a 10% e dispensadas a 200 μΙ/cavidade em uma placa de 96 cavidades para cultura de célula. Vinte e quatro horas após cultura, 100 pl do sobrenadante de cultura foram removidos de cada cavidade, e meio FCS-RPMI a 10% contendo 1 mg/ml de G418 foi dispensado a 100 pl/cavidade para dar uma concentração final de 0,5 mg/ml. Duas semanas depois, clones únicos entre 10 e 100 foram selecionados e cultivados novamente.

(4) Seleção de célula de alta expressão de hCRR4

Elas foram selecionadas através de um método imunofluorescente usando KM2160 preparado em (5) do Exemplo de Referência 1. Em uma placa de formato em U de 96 cavidades, 2x10⁵ células de cada uma das várias dezenas selecionadas dos clones introduzidos em gene foram dispensadas. KM2160 marcado com biotina através de um método conhecido (Enzyme Antibody Method, publicado por Gakusai Kikaku) foi diluído para 5 pg/ml com um tampão para FACS (BSA-PBS a 1%, EDTA a 0,02%, NaN3 a 0,05%, pH 7,4), IgG humano (fabricado pela Welfide) foi diluído para 3,75 mg/ml para prevenir fingimento não-específico, cada uma das então soluções de anticorpo diluído foi dispensada a 200 pl/cavidade, e a mistura foi deixada reagir em gelo por 30 minutos. Como um controle negativo, anticorpo anti-IL-5R biotinilado (WO 97/10354) foi usado na mesma concentração. Após lavagem duas vezes com 200 pl/cavidade de tampão, estreptoavidinaPE (fabricada pela Becton Dickinson, Japão) foi dispensada a 20 μΙ/cavidade. Trinta minutos após a reação em gelo no escuro, as células foram lavadas três vezes com 200 μΙ/cavidade e finalmente suspensas para 50 μΙ, e a intensidade da fluorescência foi medida através de um citômetro de fluxo para selecionar um tipo de célula tendo a intensidade de fluorescência 5 mais alta. O tipo de célula tendo a mais alta intensidade de fluorescência foi usado como CCR4/EL-4.

Embora a invenção tenha sido descrita em detalhes e com referência às suas modalidades específicas, ficará aparente para uma pessoa versada na técnica que várias mudanças e modificações podem ser feitas 10 nela sem se afastar do seu espírito e escopo. Todas as referências citadas aqui são incorporadas a título de referência em sua totalidade.

Este pedido é baseado no Pedido Japonês N° 2001-265144 depositado em 31 de agosto de 2001, cujo conteúdo em sua totalidade é incorporado aqui a título de referência.

\ 15 APLICABILIDADE INDUSTRIAL

Conforme acima discutido, de acordo com a presente invenção, um anticorpo recombinante e um fragmento de anticorpo do mesmo, que se liga especificamente a CCR4 humano e contém novas CDRs para CCR4, são providos. O anticorpo da presente invenção é útil para o diagnóstico ou 20 tratamento de doenças relacionadas a CCR4. Especificamente, ele é útil para a detecção imunológica de uma célula Th2 humana através de tingimento de imunócito e para o diagnóstico ou tratamento de todas as doenças imunes mediadas por Th2, incluindo asma bronquial e doenças atópicas da pele, doenças onde os estados mórbidos avançam devido a equilíbrio anor25 mal de células Th2 e cânceres incluindo cânceres de sangue tal como leucemia.

TEXTO LIVRE DA LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

SEQ ID N°: 4-Explicação da seqüência artificial: Peptídeo sintético SEQ ID N°: 8-Explicação da seqüência artificial: Peptídeo sintético 30 SEQ ID N°: 9-Explicação da seqüência artificial: Peptídeo sintético

SEQ ID N°: 10-Explicação da seqüência artificial: Peptídeo sintético SEQ ID N°: 11-Explicação da seqüência artificial: Peptídeo sintético

SEQ ID N°: 12-Explicação da seqüência artificial: Peptídeo sintético

SEQ ID N°: 13-Explicação da seqüência artificial: Peptídeo sintético

SEQ ID N°: I4-Explicação da seqüência artificial: Peptídeo sintético

SEQ ID N°: 16-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético

SEQ ID N°: 17-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético

SEQ ID N°: 18-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético

SEQ ID N°: 19-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético

SEQ ID N°: 20-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético

SEQ ID N°: 21-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético

SEQ ID N°: 22-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético SEQ ID N°: 23-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético

SEQ ID N°: 24-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético

SEQ ID N°: 26-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético

SEQ ID N°: 27-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético \ 15 SEQ ID N°: 28-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético SEQ ID N°: 29-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético

SEQ ID N°: 30-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético SEQ ID N°: 31-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético

SEQ ID N°: 32-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético

SEQ ID N°: 33-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético

SEQ ID N°: 34-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético

SEQ ID N°: 35-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético

SEQ ID N°: 38-Explicação da seqüência artificial: Peptídeo sintético

SEQ ID N°: 39-Explicação da seqüência artificial: Peptídeo sintético 25 SEQ ID N°: 40-Explicação da seqüência artificial: Peptídeo sintético

SEQ ID N°: 41-Explicação da seqüência artificial: Peptídeo sintético SEQ ID N°: 42-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético SEQ ID N°: 43-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético SEQ ID N°: 44-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético 30 SEQ ID N°: 45-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético | SEQ ID N°: 46-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético

I SEQ ID N°: 47-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético

I

I

I ! ·_ο,· · ; ·^β .· ’· ’ ,** .T’cT*. J '

SEQ ID N°: 49-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético SEQ ID N°: 50-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético SEQ ID N°: 51-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético SEQ ID N°: 52-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético SEQ ID N°: 53-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético SEQ ID N°: 54-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético SEQ ID N°: 55-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético SEQ ID N°: 56-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético SEQ ID N°: 57-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético SEQ ID N°: 58-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético SEQ ID N°: 59-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético SEQ ID N°: 60-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético SEQ ID N°: 65-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético SEQ ID N°: 66-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético SEQ ID N°: 67-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético SEQ ID N°: 68-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético SEQ ID N°: 69-Explicação da seqüência artificial: DNA Sintético SEQ ID N°: 70-Explicação da seqüência artificial: Peptídeo sintético SEQ ID N°: 71-Explicação da seqüência artificial: Peptídeo sintético SEQ ID N°: 72-Explicação da seqüência artificial: Peptídeo sintético SEQ ID N°: 73-Explicação da seqüência artificial: Peptídeo sintético SEQ ID N°: 74-Explicação da seqüência artificial: Peptídeo sintético SEQ ID N°: 75-Explicação da seqüência artificiai: Peptídeo sintético SEQ ID N°: 76-Explicação da seqüência artificial: Peptídeo sintético SEQ ID N°: 77-Explicação da seqüência artificial: Peptídeo sintético SEQ ID N°: 78-Explicação da seqüência artificial: Peptídeo sintético.

Claims (37)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Anticorpo humanizado anti-CCR4, caracterizado pelo fato de que reage especificamente com uma região extracelular de receptor de quimiocina de CC humano 4 (CCR4), mas não reage com uma plaqueta humana, e que compreende (a) uma região variável (região V) da cadeia pesada (cadeia H) do anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 4 e uma região variável (região V) da cadeia leve (cadeia L) do anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 8;

   (b) uma região variável (região V) da cadeia pesada (cadeia H) do anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 4 e uma região variável (região V) da cadeia leve (cadeia L) do anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12;

   (c) uma região variável (região V) da cadeia pesada (cadeia H) do anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 4 e uma região variável (região V) da cadeia leve (cadeia L) do anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 14;

   (d) uma região variável (região V) da cadeia pesada (cadeia H) do anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 9 e uma região variável (região V) da cadeia leve (cadeia L) do anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12;

   (e) uma região variável (região V) da cadeia pesada (cadeia H) do anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 9 e uma região variável (região V) da cadeia leve (cadeia L) do anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 14;

   (f) uma região variável (região V) da cadeia pesada (cadeia H) do anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos representada pe

   Petição 870190061215, de 01/07/2019, pág. 9/23 la SEQ ID NO: 10 e uma região variável (região V) da cadeia leve (cadeia L) do anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12;

   (g) uma região variável (região V) da cadeia pesada (cadeia H) do anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 10 e uma região variável (região V) da cadeia leve (cadeia L) do anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 14;

   (h) uma região variável (região V) da cadeia pesada (cadeia H) do anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 11 e uma região variável (região V) da cadeia leve (cadeia L) do anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12; ou (i) uma região variável (região V) da cadeia pesada (cadeia H) do anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 11 e uma região variável (região V) da cadeia leve (cadeia L) do anticorpo compreendendo a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 14;

   ou fragmento de anticorpo do mesmo selecionado do grupo que consiste em Fab, Fab', F(ab')2, um anticorpo de cadeia simples (scFv), um fragmento da região variável (região V) dimerizada (Diacorpo) e um fragmento da região V estabilizada por dissulfureto (dsFv).
2. 2. Anticorpo humanizado anti-CCR4 ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tem uma atividade citotóxica contra uma célula expressando CCR4.
3. 3. Anticorpo humanizado anti-CCR4 ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a região extracelular é uma região extracelular das posições 1 a 39 na sequência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 48.
4. 4. Anticorpo humanizado anti-CCR4 ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a região extracelular é um epítopo presente nas posi-

   Petição 870190061215, de 01/07/2019, pág. 10/23 ções 2 a 29 na sequência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 48.
5. 5. Anticorpo humanizado anti-CCR4 ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a região extracelular é um epítopo presente nas posições 13 a 29 na sequência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 48.
6. 6. Anticorpo humanizado anti-CCR4 ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a região extracelular é um epítopo presente nas posições 13 a 25 na sequência de aminoácido representada pela SEQ ID N°: 48.
7. 7. Anticorpo humanizado anti-CCR4 ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que reage especificamente com uma célula expressando CCR4.
8. 8. Anticorpo humanizado anti-CCR4 ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que tem uma atividade citotóxica maior contra uma célula expressando CCR4 do que um anticorpo monoclonal produzido por um hibridoma de animal não-humano.
9. 9. Anticorpo humanizado anti-CCR4 ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 8, caracterizado pelo fato de que a atividade citotóxica é uma atividade citotóxica mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC).
10. 10. Anticorpo humanizado anti-CCR4 ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a atividade ADCC é uma atividade de indução de apoptose de uma célula expressando CCR4.
11. 11. Anticorpo humanizado anti-CCR4 ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que tem uma atividade de depleção de uma célula expressando CCR4.
12. 12. Anticorpo humanizado anti-CCR4 ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracte

    Petição 870190061215, de 01/07/2019, pág. 11/23 rizado pelo fato de que a célula expressando CCR4 é uma célula Th2.
13. 13. Anticorpo humanizado anti-CCR4 ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que tem uma atividade de inibição da produção de citocina de uma célula Th2.
14. 14. Anticorpo humanizado anti-CCR4 ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a citocina é IL-4, IL-5 ou IL-13.
15. 15. Anticorpo humanizado anti-CCR4 ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que pertence a um anticorpo IgG humano.
16. 16. Anticorpo humanizado anti-CCR4 ou fragmento de anticorpo do mesmo, caracterizado pelo fato de que é produzido por um transformante KM8759 (Número de depósito: FERM BP-8129, depositado no International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) ou KM8760 (Número de depósito: FERM BP-8130, depositado no International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology).
17. 17. Anticorpo humanizado anti-CCR4 ou fragmento de anticorpo do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo humanizado antiCCR4ou fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 é quimicamente ou geneticamente conjugado com um radioisótopo, uma proteína ou um agente.
18. 18. Processo para a produção de um anticorpo humanizado antiCCR4 ou fragmento de anticorpo do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um transformante não humano KM8759 (Número de depósito: FERM BP-8129, depositado no International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) ou KM8760 (Número de depósito: FERM BP-8130, depositado no International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) em um meio para formar e acumular o anticorpo humanizado

    Petição 870190061215, de 01/07/2019, pág. 12/23 anti-CCR4 ou fragmento de anticorpo do mesmo na cultura; e recuperar o anticorpo ou o fragmento de anticorpo da cultura.
19. 19. Medicamento, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um selecionado dentre o anticorpo humanizado anti-CCR4 e o fragmento de anticorpo do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17 como um ingrediente ativo.
20. 20. Agente terapêutico para uso no tratamento de doenças relacionadas a CCR4, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um selecionado dentre o anticorpo humanizado anti-CCR4 e o fragmento de anticorpo do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17 como um ingrediente ativo.
21. 21. Agente terapêutico de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a doença relacionada com CCR4 é um câncer ou doenças inflamatórias.
22. 22. Agente terapêutico de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer do sangue.
23. 23. Agente terapêutico de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o câncer de sangue é leucemia ou linfomatose.
24. 24. Agente terapêutico de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a doença inflamatória é supersensibilidade das vias aéreas aguda ou crônica ou asma brônquica, doença da pele atópica, rinite alérgica ou polinose.
25. 25. Agente terapêutico para uso no tratamento de doenças imunes mediadas por Th2, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um selecionado dentre o anticorpo humanizado anti-CCR4 e o fragmento de anticorpo do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17 como um ingrediente ativo.
26. 26. Agente terapêutico de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a doença imune mediada com Th2 é supersensibilidade das vias aéreas crônica, asma brônquica, doença da pele atópica, rinite alérgica ou polinose.
27. 27. Agente de diagnóstico para doenças relacionadas com

    Petição 870190061215, de 01/07/2019, pág. 13/23

    CCR4, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um selecionado dentre o anticorpo humanizado anti-CCR4 e o fragmento de anticorpo do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17 como um ingrediente ativo.
28. 28. Agente de diagnóstico de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a doença relacionada com CCR4 é um câncer ou uma doença inflamatória.
29. 29. Agente de diagnóstico de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer do sangue.
30. 30. Agente de diagnóstico de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o câncer de sangue é leucemia ou linfomatose.
31. 31. Agente de diagnóstico de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a doença inflamatória é supersensibilidade das vias aéreas crônica, asma brônquica, doença da pele atópica, rinite alérgica ou polinose.
32. 32. Agente de diagnóstico para doenças imunes mediadas por Th2, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um selecionado dentre o anticorpo humanizado anti-CCR4 e o fragmento de anticorpo do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 17 como um ingrediente ativo.
33. 33. Agente de diagnóstico de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a doença imune mediada por Th2 é supersensibilidade das vias aéreas crônica, asma brônquica, doença da pele atópica, rinite alérgica ou polinose.
34. 34. Anticorpo humanizado anti-CCR4 ou o fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que é para uso na detecção imunológica de CCR4.
35. 35. Anticorpo humanizado anti-CCR4 ou o fragmento de anticorpo do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que é para uso na detecção imunológica de uma célula que expressa CCR4 na superfície celular.
36. 36. Anticorpo humanizado anti-CCR4 ou o fragmento de anticor

    Petição 870190061215, de 01/07/2019, pág. 14/23 po do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que é para uso na redução ou depleção de uma célula que expressa CCR4 na superfície celular.
37. 37. Anticorpo humanizado anti-CCR4 ou o fragmento de anticor-

    5 po do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que é para uso na inibição da produção de citocinas de uma célula Th2.