BRPI0112928B1 - A composition comprising preparations comprising outer membrane vesicles (OMV), microvesicles (MV) or both MVO and MV - Google Patents

Abstract

"vacinas para proteção de amplo espectro contra doenças causadas por neisseria meningitidis". a presente invenção refere-se a métodos e vacinas para a prevenção de doenças causadas por bactérias neisseria meningitidis, particularmente pelas cepas do sorogrupo b.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO PREPARAÇÕES COMPREENDENDO VESÍCULAS DE MEMBRANA EXTERNA (OMV), DE MICROVESÍCULAS (MV) OU DE AMBAS AS OMV E AS MV".

Referência Cruzada Aos Pedidos de Patentes Relacionados Este pedido de patente reivindica o benefício do pedido de patente U.S. provisória depositada anteriormente n° de série 60/221,495, depositada em 27 de julho de 2000, cujo pedido de patente é incorporado aqui como referência em sua totalidade.

Citação Em Relação à Pesquisa Sustendada Federalmente Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob as concessões η— AI46464 e AI45642 concedido pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas e pelo Instituto Nacional de Saúde. O governo pode possuir certos direitos sobre esta invenção.

Campo da Invenção Esta invenção refere-se a vacinas de amplo espectro para a prevenção de doenças causadas por Neissería meningitidis, especialmente do sorogrupo B.

Fundamento da Invenção Neissería meningitidis é uma bactéria Gram-negativa que coloniza o trato respiratório superior humano e é responsável por surtos epidêmicos esporádicos e cíclicos por todo o mundo, mais notavelmente, de meningite e septicemia. As taxas de ataque e de morbidade são as maiores em crianças abaixo da idade de 2 anos.

Como outras bactérias Gram negativas, a Neissería meningitidis possui tipicamente uma membrana citoplasmática, uma camada de peptidio-glicanas, uma membrana externa que junto com o polissacarídeo capsular constituem a parede bacteriana e pili que se projetam para o ambiente externo. Estas estruturas de superfície medeiam a infecção e interagem com o sistema imunológico do hospedeiro. Por exemplo, uma primeira etapa na infecção com Neissería é a aderência às células alvo, que acredita-se que seja mediada pelos pili e, possivelmente, outras adesinas tal como Opc. Foi relatado que os componentes protéicos, fosfolipídicos e polissacarídicos da membrana externa ativam uma resposta imunológica.

Neisseria meningitidis spp. pode ser dividida em grupos soroló-gicos, tipos e subtipos com base nas reações com anticorpos policlonais (Frasch, C. E. e Chapman, 1973, J. Infect. Dis. 127: 149-154) ou monoclo-nais (Hussein, A., MONOCLONAL ANTIBODIES AND N. MENINGITIDIS. Proefschrift. Utrecht, Holanda, 1988) que interagem com antígenos de superfície diferentes. A divisão em sorogrupos é baseada nas variações de-tectáveis imunologicamente no polissacarídeo capsular. São conhecidos aproximadamente 12 sorogrupos: A, B, C, X, Y, Z, 29-E, W-135, Η, I, K e L (Ashton, F. E. e outros, 1938, J. Clin. Microbiol. 17: 722-727; Branham, S. E., 1956, Can. J. Microbiol. 2: 175-188; Evans, A. C., 1920, Lab. Bull. 1245: 43-87; Shao-Qing e outros, 1972, J. Biol. Stand. 9: 307-315; Slaterus, K. W., 1961, Ant. v. Leeuwenhoek, J. Microbiol. Serol. 29:265-271). Atualmente, o sorogrupo B (MenB) é responsável por aproximadamente a metade até 80% das doenças invasivas de Neisseria meningitidis relatadas. A sorotipagem é baseada nas diferenças antigênicas definidas por anticorpos monoclonais em uma proteína de membrana externa chamada Porina B (PorB). São conhecidos atualmente anticorpos que definem aproximadamente 21 sorotipos (Sacchi e outros, 1998, Clin. Diag. Lab. Im-munol. 5:348). A sorossubtipagem é baseada nas variações antigênicas de-findadas por anticorpos em uma proteína de membrana externa chamada Porina A (PorA). São atualmente conhecidos anticorpos que definem aproximadamente 18 sorossubtipos. A sorossubtipagem é especialmente importante em cepas de Neisseria meningitidis onde a imunidade pode ser específica ao sorossubtipo. A maior parte da variabilidade entre as proteínas PorA ocorre em duas das supostas oito voltas expostas à superfície (voltas I e IV). As voltas variáveis I e IV foram denominadas VR1 e VR2, respectivamente. Uma vez que existe mais variações das seqüências de VR1 e de VR2 da PorA que não foram definidas por anticorpos específicos, foi proposta uma nomenclatura alternativa baseada na tipagem de VR da seqüên-cia de aminoácidos deduzida do seqüenciamento do DNA (Sacchi e outros, 2000, J. Infect. Dis. 182:1169; ver também o site da internet Multi Locus Se- quence Typing). Os lipopolissacarídeos podem ser também utilizados como antígenos de tipagem, dando origem aos assim chamados imunotipos: L1, L2 etc.

Neisseria meningitidis pode ser também dividida em grupos ou subgrupos clonais, utilizando várias técnicas que caracterizam diretamente ou indiretamente o genoma bacteriano. Estas técnicas incluem a eletrofore-se de enzimas multilocus (MLEE), baseada na variação da mobilidade ele-troforética de uma enzima, que reflete o polimorfismo que se situa em um locus genético particular. Através da caracterização das variações de um número de tais proteínas, pode ser inferida a "distância" genética entre duas cepas partindo da proporção de pareamentos mal feitos. Similarmente, a clonalidade entre dois isolados pode ser inferida se os dois possuírem padrões idênticos de variações eletroforéticas em um número de loci. Mais recentemente, a tipagem de sequências multilocus (MLST) substituiu a MLEE como o método de escolha para a caracterização dos microorganismos. Utilizando a MLST, a distância genética entre dois isolados ou a clonalidade é inferida partindo da proporção de pareamentos mal feitos nas seqüências de DNA de 11 genes "de manutenção da casa" em cepas de Neisseria meningitidis (Maiden e outros 1998, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:3140).

Fornecidas a prevalência e a importância econômica das infecções invasivas por Neisseria meningitidis, não é surpreendente que têm sido feitas muitas tentativas para o desenvolvimento de tratamentos. Embora estas infecções possam ser tratadas com antibióticos, aproximadamente 10 até 20% de pacientes tratados morrem e muitos sobreviventes ficam com seqüelas neurológicas permanentes, tais como amputação, perda de pêlos neurossensoriais e paralisia. Ainda, os microorganismos podem desenvolver resistência aos antibióticos. Assim, a prevenção com vacinas é um modo preferível para conter o espalhamento da infecção.

Devido ao fato de que a cápsula polissacarídica é uma das estruturas principais da Neisseria meningitidis patogênica, esta foi um foco primário de tentativas para o desenvolvimento de vacinas. Preparações dife- rentes de polissacarídeos capsulares foram utilizadas para controlar os surtos e as epidemias dos sorogrupos A, C, Y e W-135, na forma de vacinas mono, di, tri ou tetravalentes (Gold e outros, 1969-1970, Bull. WHO 45: 272-282; Gotschlich e outros, 1969, J. Exp. Meai. 129: 134-136; Hankins, 1982, Proc. Soc. Biol. Med. 169: 54-57; Patente U.S. Ne 6.080.589). Entretanto, as vacinas de polissacarídeos capsulares sofrem de: resposta fraca ou nenhuma ao polissacarídeo C em crianças com menos de 2 anos de idade; ter-molabilidade do polissacarídeo A; dificuldades em relação à indução da tolerância imunológica após a vacinação ou a revacinação com o polissacarídeo C (Granoff e outros, 1998, J. Infect. Dis. 160: 5028-5030; MacDonald e outros, 1998, JAMA 280: 1685-1689; MacDonald e outros, 2000, JAMA 283: 1826-1827). Para evitar estas propriedades imunológicas, os polissacarídeos dos sorogrupos A e C foram acoplados covalentemente a veículos protéicos para produzir vacinas "conjugadas". Em contraste às vacinas de polissacarídeos puros, estas vacinas conjugadas são altamente imunogêni-cas em bebês, após a reinjeção ativam aumentos que podem sofrer reforço nas concentrações de anticorpo anticapsular no soro e fornecem a capacidade de gerar respostas de anticorpos de memória para uma injeção sub-seqüente de polissacarídeos puros (Campagne e outros 2000, Pediat. Infect. Dis. J. 19: 144-150; Maclennan e outros, 2000, JAMA 283: 2795-2801). Vacinas conjugadas com propriedades similares têm sido altamente eficazes na prevenção de doenças invasivas causadas por outras bactérias encap-suladas, tal como Haemophilus influenzae do tipo b ou Streptococcus pneumoniae. O polissacarídeo capsular (PS) da Neisseria meningitidis do so-rogrupo B é um imunógeno muito fraco em seres humanos (Wyle e outros, 1972, J. Infect. Dis. 126: 514-522; Zollinger e outros, 1979, J. Clin. Invest. 63: 836-834; Jennings e outros, 1981, J. Immunol. 127: 104-108). Tentativas adicionais para aumentar a imunogenicidade dos polissacarídeos através da conjugação com proteínas não foram bem sucedidas (Jennings e outros, 1981, J. Immunol. 127: 104-108). Para aumentar a imunogenicidade, o polissacarídeo da cápsula do sorogrupo B meningocóccico (MenB PS) foi mo- dificado químicamente (o grupo N-propionilado foi substituído pelo grupo N-acetila do polissacarídeo B) e foi acoplado covalentemente a um conjugado de veículo protéico (N-Pr-MenB PS-proteína). A vacina induz em camun-dongos altos títulos de anticorpos IgG que são bactericidas e protetores (este conceito é descrito e reivindicado na Patente U.S. Ns 4.727.136, concedida em 23 de fevereiro de 1988 a Jennings e outros). Esta vacinas é também imunogênica em primatas subumanos, induzindo anticorpos no soro que ativam a bacteriólise mediada pelo complemento (Fusco e outros, 1997, J. Infect. Dis. 175: 364-372). Em seres humanos, é sabido que tais anticorpos conferem proteção contra o desenvolvimento de doença meningocócci-ca (Goldschneider e outros, 1969, J. Exp. Med. 129: 1307). Entretanto, um subconjunto dos anticorpos induzidos por esta vacina possui atividade auto-anticorpo para MenB PS não modificado (isto é N-acetil-MenB PS), Granoff e outros, 1998, J. Immunol/, 160: 5028-5036, que provoca graves preocupações de segurança em relação ao uso desta vacina em seres humanos. Portanto, os pesquisadores buscaram abordagens alternativas para desenvolver uma vacina segura e eficaz para a prevenção da doença causada pelas cepas do sorogrupo B.

Outros grupos se concentraram nas proteínas de superfície como vacinas. Por exemplo, o componente protéico principal do pilus, a pili-na, ativa uma resposta imunológica; entretanto, existe tantas variações anti-gênicas e continuam se desenvolvendo que as vacinas contra a proteína do pilus não têm sido altamente eficazes. Ver, a Patente U.S. N5 5.597.572. Em outros exemplos, as vacinas foram focalizadas na proteína A de superfície de Neisseria altamente conservada (NspA) (ver, por exemplo, a Publicação PCT Ne W096/29412). Embora o gene seja altamente conservado e expresso em virtualmente todas as cepas, tanto os anticorpos policlonais quanto os monoclonais preparados contra a NspA são bactericidas e/ou fornecem proteção, contra somente 50% das cepas distintas geneticamente (Moe e outros (1999 Infect. Immun. 67: 5664; Moe e outros Infect. Immun. 2001 69:3762). Estas observações sugerem que a NspA recombinante sozinha não fornecerá proteção adequada contra um amplo espectro de cepas de Neisseria.

Ainda outros grupos utilizaram preparações de membrana para induzir a imunidade. Em geral, as tentativas para produzir uma vacina para meningococos do tipo B baseada nas vesículas da membrana externa utilizavam imunizações repetidas com material preparado partindo de uma única cepa ou imunizações repetidas com uma vacina contendo antígenos de vesícula provenientes de várias cepas. Quando a vacina continha antígenos de vesículas provenientes de mais de uma cepa, os títulos de anticorpos bactericidas resultantes de bebês ou crianças que receberam duas ou três doses eram baixos (Cartwright K e outros, 1999, Vaccine; 17:2612-2619; de Kleinjn ED e outros, 2000, Vaccine, 18:1456-1466). Nestes estudos e em um estudo feito em macacos Cynomolgus (Rouupe van der Voort ER, 2000, Vaccine, 18:1334-1343) havia ainda uma evidência de interferência imuno-lógica entre as respostas aos antígenos diferentes. Quando eram utilizadas as imunizações repetidas com vesículas provenientes de uma única cepa, eram produzidos títulos de anticorpos mais altos mas o espectro de reativi-dade de anticorpos era limitado somente a algumas cepas que tendiam a ser sorologicamente similares uma às outras (Tappero e outros, 1999, JAMA 281:1520; e Rouupe van der Voort ER, 2000, Vaccine, 18:1334-1343). Os experimentos em modelos animais de laboratório, que são descritos abaixo confirmaram esta última observação. Os antisoros provenientes dos animais de controle que receberam duas imunizações sequenciais de uma vacina de vesícula de membrana externa preparada no Instituto Nacional de Saúde Pública, Oslo, Noruega, proveniente de uma única cepa de Neisseria me-ningitidis do sorogrupo B, H44/76 (B:15:P1.7,16; "Vacina Norueguesa"), reagiram por citometria de fluxo e eram bactericidas somente cepas do sorogrupo B que eram do mesmo sorossubtipo (isto é, P1.7.16) ou cepas que possuíam um epitopo similar ao epitopo P1.16 (tais como as cepas P1.10-4).

Os seres humanos são o único reservatório conhecido para Neisseria meningitidis spp. Conseqüentemente, as espécies de Neisseria evoluíram uma ampla variedade de estratégias altamente eficazes para in- vadir o sistema imunológico humano. Estas incluem a expressão de uma cápsula polissacarídica que reagem de forma cruzada com o ácido polissiá-lico do hospedeiro (isto é o sorogrupo B) e a mutabilidade altamente antigê-nica em relação aos epitopos não capsulares imunodominantes, isto é epi-topos de antígenos que estão presentes na superfície em quantidades relativamente altas, podem ser acessados pelos anticorpos e ativam uma forte resposta de anticorpos.

Os esforços anteriores para desenvolver vacinas de amplo espectro foram dificultados pela grande variedade de estratégias altamente eficazes utilizadas pelas espécies de Neisseria para invadir o sistema imunológico humano. Devido a estas estratégias, uma resposta imunológica a uma certa cepa não irá com freqüência conferir imunidades eficaz contra outras cepas de Neisseria. A presente invenção supera as desvantagens das abordagens da técnica anterior para vacinação e ativa uma imunidade protetora contra um amplo espectro de cepas de Neisseria meningitidis, notavelmente (mas não exclusivamente) incluindo cepas que pertencem ao sorogrupo B.

Sumário da Invenção A presente invenção fornece de forma geral métodos e vacinas para a prevenção de doenças causadas pelas bactérias Neisseria meningitidis, particularmente das cepas do sorogrupo B.

Em uma modalidade, o método da invenção compreende: a administração a um mamífero de uma primeira preparação de i) vesículas da membrana externa (OMV) de uma primeira Neisseria meningitidis spp. e/ou ii) microvesículas (MV) liberadas em um meio de cultura durante o cultivo de uma primeira Neisseria meningitidis spp., a dita administração de OMV e/ou de MV sendo em uma quantidade suficiente para prover e/ou ativar imuno-logicamente uma resposta imunológica aos epitopos presentes na dita primeira preparação; a administração de pelo menos uma segunda preparação de i) OMVs de uma segunda Neisseria meningitidis spp. e/ou ii) MVs liberadas em um meio de cultura durante o cultivo uma segunda Neisseria meningitidis spp., a dita administração de OMV e/ou de MV sendo em uma quanti- dade suficiente para prover e/ou ativar imunologicamente uma resposta imunológica para os epitopos presentes na dita segunda preparação; e opcionalmente, mas preferencialmente, a administração de uma terceira preparação de i) OMV de uma terceira Neisseria meningitidis spp. e/ou ii) MV que são liberadas em um meio de cultura durante o cultivo de uma terceira Neisseria meningitidis spp., a dita administração de OMV e/ou MV sendo em uma quantidade suficiente para ativar uma resposta imunológica para os epitopos presentes na dita terceira preparação. A administração da primeira, da segunda e (opcionalmente) da terceira preparações resulta na indução de uma resposta imunológica aos epitopos presentes nas preparações, onde a dita resposta confere imunidade protetora contra uma doença causada por Neisseria meningitidis spp.

Em modalidades preferidas, a primeira, a segunda e a terceira cepas de Neisseria são geneticamente distintas uma às outras, por exemplo, a primeira cepa é geneticamente distinta da segunda cepa, da terceira cepa ou tanto da segunda quanto da terceira cepas.

Em modalidades relacionadas, a administração das preparações é em série. A administração em série das preparações pode ser conduzida em qualquer ordem. Por exemplo, as ordens de administração a seguir estão dentro do âmbito da invenção (da esquerda para a direita, com a terceira administração sendo opcional): OMV-OMV-OMV; OMV-OMV-MV; OMV-MV-MV; MV-MV-MV; MV-MV-OMV; MV-OMV-OMV; OMV-MV-OMV; e MV-OMV-MV. Preferencialmente, a ordem de administração é MV-MV-OMV.

Em outras modalidades relacionadas, as preparações são administradas na forma de uma mistura, onde a administração inicial da mistura pode ser seguida por uma ou mais administrações adicionais da mesma ou de uma mistura diferente para servirem como reforços.

Em uma modalidade específica, a invenção envolve a administração em série de microvesículas (MV) que se formam naturalmente durante o crescimento de Neisseria meningitidis e são liberadas no meio de cultura (coletadas através da separação das células maiores das vesículas menores e então peletizando as vesículas) e/ou vesículas de membrana externa (OMV, preparadas diretamente partindo de frações isoladas de membrana externa). As OMVs e as MVs são preparadas partindo de cepas "geneticamente distintas" de Neisseria meningitidis, por exemplo, cepas que diferem uma das outras pelo menos no sorotipo ou no sorossubtipo e podem ser distintas em vários loci genéticos, por exemplo, diferem tanto no sorotipo quanto no sorossubtipo, por exemplo, possuindo a Porina de membrana externa diferente, as proteínas PorA e PorB. Ainda, as preparações de OMV e/ou de MV podem ser fornecidas em seqüência em pelo menos duas e preferencialmente em pelo menos três administrações (por exemplo, injeções) de OMVs ou MVs provenientes de cepas geneticamente distintas; são também consideradas quatro, cinco, seis ou mais administrações.

Em uma outra modalidade específica, a primeira Neisseria meningitidis spp. é um membro de um primeiro sorossubtipo; a segunda Neisseria meningitidis spp. é um membro de um segundo sorossubtipo, cujo segundo subsorotipo é diferente do subsorotipo da primeira Neisseria meningitidis spp. e quando utilizado, a terceira Neissería meningitidis spp. é um membro de um terceiro sorossubtipo, cujo terceiro subsorotipo é diferente do subsorotipo pelo menos da primeira e preferencialmente tando da primeira quanto da segunda, Neisseria meningitidis spp.

Ainda em uma outra modalidade específica, a primeira Neisseria meningitidis spp. é um membro de um primeiro sorotipo e de um primeiro sorossubtipo; a segunda Neisseria meningitidis spp. é um membro de um segundo sorotipo e de um segundo sorossubtipo, cujo segundo sorotipo e o segundo subsorotipo são diferentes do sorotipo e do subsorotipo da primeira Neisseria meningitidis spp. e, quando utilizada, a terceira Neisseria meningitidis spp. é um membro de um terceiro sorotipo e de um terceiro sorossubtipo, cujo terceiro sorotipo e o terceiro subsorotipo são diferentes do sorotipo e do subsorotipo pelo menos da primeira e preferencialmente tanto da primeira quanto da segunda, Neisseria meningitidis spp.

Em uma modalidade específica da invenção, uma primeira administração é feita com microvesículas (MVs) preparadas partindo de uma cepa do sorogrupo C (por exemplo RM1090 (C:2a:P1.5,2:L3,7)). A segunda administração é feita com MVs preparadas partindo de uma segunda cepa (por exemplo BZ198 (B:NT:P1.4)) e a terceira administração é feita com vesículas de membrana externa (OMVs) preparadas partindo de uma terceira cepa (por exemplo Z1092 (A:4,21:P1.10)). A imunização seqüencial com vesículas e/ou microvesículas preparadas partindo de cepas de Neisseria meningitidis distintas geneticamente é referida posteriormente aqui como a "vacina CHORF ou o "antígeno CHORI". A imunização com uma mistura das primeira, segunda e terceira preparações da vacina CHOR é referida como a "mistura CHORI".

Em outros aspectos, a invenção caracteriza uma composição que compreende uma primeira preparação selecionada do grupo que consiste em vesícula da membrana externa (OMV), de microvesículas (MV) ou tanto de OMV quanto de MV provenientes de uma primeira espécie de Neisseria meningitidis; uma segunda preparação selecionada do grupo que consiste em vesícula da membrana externa (OMV), de microvesículas (MV) ou tanto de OMV quanto de MV provenientes de uma segunda espécie de Neisseria meningitidis, em que a segunda Neisseria meningitidis spp é geneticamente distinta da primeira espécie de Neisseria meningitidis; e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em modalidades relacionadas, a composição compreende ainda uma terceira preparação selecionada do grupo que consiste em vesícula de membrana externa (OMV), microvesículas (MV) ou tanto OMV quanto MV provenientes de uma terceira espécie de Neisseria meningitidis, em que a terceira espécie de Neisseria meningitidis é geneticamente distinta da primeira espécie de Neisseria meningitidis. Em modalidades específicas, a primeira preparação da composição compreende MV, a segunda preparação compreende MV; e a terceira preparação compreende OMV. Preferencialmente, a primeira e a segunda espécies de Neisseria meningitidis são geneticamente distintas pelo fato de que diferem pelo menos em um sorotipo ou sorossubtipo e, quando incluído, a terceira e a primeira espécies de Neisseria meningitidis são geneticamente distintas pelo fato de que diferem pelo menos em um sorotipo ou sorossubtipo.

Ainda em outros aspectos, a invenção caracteriza uma composição que compreende pelo menos um antígeno isolado de Neisseria me-ningitidis, o antígeno isolado estando presente na composição em uma quantidade eficaz para ativar uma resposta imunológica em um hospedeiro mamífero e sendo caracterizado com uma proteína imunoprecipitada com antisoros produzidos após a vacinação com a vacina CHORI e que possui uma massa molecular aparente selecionada do grupo que consiste em aproximadamente 80 kDa, aproximadamente 59,5 kDa, aproximadamente 40,7 kDa, aproximadamente 39,6 kDa, aproximadamente 33 kDa, aproximadamente 27,9 kDa e 14,5 kDa; e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Em um outro aspecto, a invenção caracteriza uma composição que compreende pelo menos um antígeno isolado de Neisseria meningitidis, o antígeno isolado estando presente na composição em uma quantidade eficaz para ativar uma resposta imunológica em um hospedeiro mamífero e sendo caracterizado como uma proteína detectada por Western blot com antisoros produzidos após a vacinação de um mamífero com a vacina CHORI e que possui uma massa molecular aparente selecionada do grupo que consiste em aproximadamente 53 kDa até 57 kDa; aproximadamente 46-47 kDa, aproximadamente 33 kDa, aproximadamente 20 kDa até 21 kDa; e aproximadamente 18 kDa; e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Em um outro aspecto a invenção caracteriza uma composição que compreende pelo menos um antígeno isolado de Neisseria meningitidis, o antígeno isolado estando presente na composição em uma quantidade eficaz para ativar uma resposta imunológica em um hospedeiro mamífero, em que o antígeno é proveniente de uma proteína que se liga especificamente a um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em 1D9, 4B11, 9B8 e 14C7 (cujos anticorpos são descritos aqui e depositados na ATCC); e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Em modalidades preferidas, as composições que possuem antí-genos isolados compreende pelo menos dois antígenos isolados de Neisseria meningitidis.

Em aspectos relacionados, a invenção caracteriza métodos para ativar uma imunidade protetora de amplo espectro contra uma doença causada por uma espécie de Neisseria meningitidis, o dito método compreendendo a administração a um mamífero de pelo menos uma das composições que compreendem antígenos isolados como descrito anteriormente.

Preferencialmente, as composições de antígenos (por exemplo, preparações de OMV/MV, preparações de proteínas isoladas) podem ser administradas a mamíferos, especialmente seres humanos, que são imuno-logicamente simples em relação à Neisseria meningitidis (isto é, não foram expostos aos antígenos de Neisseria meningitidis ou foram expostos à quantidades insuficientes para ativar uma resposta imunológica protetora). Uma modalidade específica da invenção envolve a administração a crianças humanas que têm aproximadamente cinco anos de idade ou menos, especialmente dois anos de idade ou menos.

Em algumas modalidades da invenção, antes da administração de composições de antígenos de Neisseria meningitidis, os indivíduos podem ter sido preparados através da exposição (através de infecção natural ou administração) a uma espécie de Neisseria sem ser Neisseria meningitidis (ou uma composição de antígenos preparada partindo de uma espécie de Neisseria).

Os antisoros obtidos de camundongos imunizados como é descrito anteriormente se ligam à superfície das células bacterianas de um grupo de cepas de Neisseria meningitidis do sorogrupo B geneticamente distintas, que é determinado pela detecção por citometria de fluxo de imunoflu-orescência indireta. Em um exemplo, os soros de camundongos imunizados eram positivos para onze de 12 cepas testadas. Estas 11 incluíam 3 cepas meningocóccicas B em relação às proteínas PorA e PorB que eram heteró-logas àquelas das cepas meningocóccicas utilizadas para preparar os imunógenos utilizados para vacinação. (Para fim de contraste, os antisoros de animais imunizados com duas injeções da "vacina de OMV Norueguesa" descrita anteriormente reagiram através da citometria de fluxo com somente 5 das 11 cepas. Todas as 5 possuíam proteínas PorA e/ou PorB que eram as mesmas ou eram proximamente relacionadas àquelas na vacina de OMV "Norueguesa".) Os antisoros de animais imunizados com a "vacina CHORI" também ativaram bacteriólise mediada pelo complemento em 11 das 12 cepas, um bom prognosticador de proteção contra doença em seres humanos (Goldschneider e outros, 1969, J. Exp. Med. 129:1307). A ligação de anticorpos à superfície das células bacterianas ou a bacteriólise mediada pelo complemento, não era inibida pela presença do polissacarídeo solúvel do sorogrupo B em excesso, evidência de que os anticorpos protetores estavam direcionados contra antígenos não capsulares.

Os antisoros de camundongos imunizados em um segundo exemplo utilizando a vacina CHORI eram bactericidas contra 14 de 14 cepas testadas incluindo oito cepas com sorossubtipos que eram heterólogos aos das utilizadas nas preparações para vacinas. Em um terceiro exemplo, os antisoros preparados partindo de porquinhos-da-índia imunizados com a vacina CHORI eram bactericidas contra 9 de 10 cepas testadas incluindo 5 cepas com sorossubtipos que eram heterólogos aos expressos pelas cepas vacinais. Os antisoros para a vacina CHORI preparados em camundongos no primeiro exemplo e em porquinhos-da-índia no terceiro exemplo eram também altamente protetores contra a bacteremia nos ratos bebês desafiados com as bactérias do sorogrupo B. O protocolo de imunização utilizado aqui induz geralmente o sistema imunológico a convergir nos antígenos não capsulares que são comuns para as cepas das quais as MVs e as OMVs são obtidas. A vacina CHORI ativa anticorpos contra vários epitopos de superfície celular, incluindo, PorA, possivelmente PorB e proteínas conservadas tais como a proteína A de superfície de Neisseria (NspA), a proteína de classe 4, (a proteína modificável de redução, Rmp) e outros antígenos não capsulares ainda não identificados.

Em geral, as vacinas da presente invenção que empregam a imunização seqüencial com o material antigênico preparado partindo de cepas diferentes (geneticamente distintas) possuem o potencial de conferir proteção contra a maioria das cepas de Neisseria meningitidis do sorogrupo B. Esta abordagem possui também ampla aplicabilidade para a vacinação contra as cepas de Neisseria meningitidis representantes de outros sorogru- pos tal como A, C, Y ou W-135 e também contra outros membros do gênero Neissería.

Breve Descrição das Figuras O Quadro 1 (Figura 1) resume os resultados dos testes de eficiência das vacinas de vesícula de membrana externa meningocóccica. A Figura 2 é uma fotografia de um gel de SDS-PAGE a 15% de preparações de vacinas de microvesículas (MV), de microvesículas extraídas com desoxicolato (DOC MV), de vesículas de membrana externa (OMV) e de vesículas de membrana externa extraída com desoxicolato (DOC OMV) das cepas meningocóccicas Z1092 (A:4,21:P1.10), BZ198 (B:NT:P.1.4) e RM1090 (C:2a:P1.2), respectivamente. Faixa 1, padrões de massa molecular. Faixa 2, MV de Z1092. Faixa 3, DOC MV de Z1092. Faixa 4, OMV de Z1092. Faixa 5, DOC OMV de Z1092, Faixa 6, MV de BZ198. Faixa 7, DOC MV de BZ198. Faixa 8, OMV de BZ198. Faixa 9, DOC OMV de BZ198, Faixa 10, MV de RM1090. Faixa 11, DOC MV de RM1090. Faixa 12, OMV de RM1090. Faixa 13, DOC OMV de RM1090. A Figura 3 é uma série de gráficos que mostra a ligação de anti-soros vacina anti-CHORI, anti vacina Norueguesa e de controle e mAb para as cepas meningocóccicas B encapsuladas vivas MC58 (B:15:P1.7,16) e S3446 (B:19,14:P1.23,14), que é determinada pela citometria de fluxo de fluorescência indireta. Todos os antisoros foram testados em diluições de 1:20. O mAb de controle é um mAb murino específico anticápsula (Granoff e outros, 1998, J. Immunol. 160: 5028-5036). Os antisoros de controle eram soros agrupados de camundongos imunizados com proteínas do sobrena-dante de cultura da cepa BL21 de E. coli ou de porquinhos-da-índia imunizados com o adjuvante, hidróxido de alumínio, sozinho. Observe que a cepa MC58 possui os mesmos sorotipo e sorossubtipo que a cepa utilizada para preparar as OMV para a vacina Norueguesa. O sorotipo e o sorossubtipo da cepa S3446 são heterólogos aos das cepas utilizadas para preparar ambas as vacinas. O Quadro 2 (Figura 4) apresenta os dados em relação à ligação à superfície das células bacterianas de antisoros determinados pela citome- tria de fluxo de fluorescência indireta. O Quadro 3 (Figura 5) apresenta os dados que ilustram a reati-vidade de antisoros de CHORI contra as cepas dos sorogrupos A e C de Neisseria meningitidis. O Quadro 7 (Figura 6) resume os resultados de um ensaio bac-tericida que testa os antisoros vacina anti-CHORI, antirNspA e anti vacina Norueguesa contra a cepa meningocóccica B 2996. O Quadro 5 (Figura 7) fornece os dados que mostram a atividade bactericida mediada pelo complemento dos antisoros e dos anticorpos. O Quadro 6 (Figura 8) fornece os dados que mostram a atividade bactericida mediada pelo complemento dos antisoros de camundongos imunizados com as vacinas indicadas. O Quadro 7 (Figura 9) fornece os dados que mostram a atividade bactericida mediada pelo complemento dos antisoros de porquinhos-da-índia imunizados com as vacinas indicadas. O Quadro 8 (Figura 10) fornece os dados que mostram a proteção passiva em ratos bebês contra a bacteremia da cepa meningocóccica B 8047 por antisoros e anticorpos. O Quadro 9 (Figura 11) fornece os dados que mostram a proteção passiva em ratos bebês contra a bacteremia da cepa meningocóccica B 8047 pelos antisoros de porquinhos-da-índia. A Figura 12 é uma fotografia de um gel de SDS-PAGE a 15% corado com prata de proteínas expostas à superfície precipitadas pelos antisoros de antígenos anti-CHORI provenientes da cepa meningocóccica B M7 não encapsulada. Faixa 1, proteína total de M7. Faixa 2, proteínas precipitadas pelos antisoros anti-CHORI murinos. Faixa 3, proteínas precipitadas pelos antisoros murinos de controle negativo. Os números à esquerda da figura indicam a massa molecular aparente em kDa. A Figura 13 é uma fotografia de um Western blot de um gel de SDS-PAGE a 15% de proteínas expostas à superfície precipitadas pelos antisoros de antígenos anti-CHORI provenientes da cepa meningocóccica B M7 não encapsulada. Faixas 1 e 4, proteína total de M7. Faixas 2 e 5, pro- teínas precipitadas pelos antisoros anti-CHORI murinos. Faixas 3 e 6, proteínas precipitadas pelos antisoros murinos de controle negativo. Os antisoros de antígenos anti-CHORI foram utilizados como o anticorpo primário de detecção nas faixas 1 até 3 e um mAb antiPorA MN16C13F4 (Rijksinstituut Voor Volksgezondeid en Mileu, Biltoven, Holanda) que é específico para o sorossubtipo P1.2 foi utilizado como o anticorpo primário para a detecção nas faixas 4 até 5. O Quadro 10 (Figura 14) fornece os dados que mostram as proteínas que podem ser acessadas na superfície bacteriana precipitadas pelos antisoros agrupados de camundongos imunizados seqüencialmente com a MV da cepa MenC RM1090, com a MV da cepa MenB BZ198 e com a OMV da cepa MenA Z1092. O Quadro 10A (Figura 14A) fornece exemplos adicionais de dados que mostram as proteínas que pode ser acessadas na superfície bacteriana precipitadas pelos antisoros de camundongos imunizados seqüencialmente com a MV da cepa MenC RM1090, com a MV da cepa MenB BZ198 e com a OMV da cepa MenA Z1092. A Figura 15 é uma fotografia de um Western blot de um gel de SDS-PAGE a 15% de preparações de MV ou de OMV. Os antisoros para detecção primária são os antisoros vacina anti-CHORI/CFA agrupados de camundongos nas faixas 1 até 3, os anti-CH0RI/AI2(0P03)3 agrupados de camundongos nas faixas 4 e 5 e os anti-CH0RI/AI2(0P03)3 agrupados de porquinhos-da-índia nas faixas 6 até 8. Faixas 1 e 6, proteínas das MV preparadas partindo da cepa RM1090. Faixas 2, 4 e 7, proteínas das MV preparadas partindo da cepa BZ198. Faixas 3, 5 e 8, proteínas das OMV preparadas partindo da cepa Z1092. Os números à esquerda da figura indicam a massa molecular aparente em kDa.

O Quadro 11 (Figura 16) fornece os dados que mostram as massas moleculares aparentes de proteínas das preparações de MV ou de OMV indicadas que são reativas com os antisoros de camundongos e de porquinhos-da-índia que foram imunizados seqüencialmente com as MV da cepa MenC RM1090 e da cepa MenB BZ198 e com as OMV da cepa MenA Ζ1092. O Quadro 12 (Figura 17) fornece os dados do ELISA que mostram a absorção de anticorpos antiLOS de antisoros agrupados obtidos de camundongos e porquinhos-da-índia imunizados seqüencialmente com as MV da cepa MenC RM1090 e da cepa MenB BZ198 e com as OMV da cepa MenA Z1092 ou com três injeções de uma mistura das três preparações de vesículas. O Quadro 13 (Figura 18) fornece os dados de um ensaio bacte-ricida mediado pelo complemento que mostram que a absorção de anticorpos antiLOS de antisoros agrupados obtidos de camundongos e de porquinhos-da-índia imunizados seqüencialmente com as MV da cepa MenC RM1090 e da cepa MenB BZ198 e com as OMV da cepa MenA Z1092 ou com três injeções de uma mistura das três preparações de vesículas não altera de forma significativa a atividade bactericida dos antisoros contra as cepas MenB que são homólogas ou heterólogas às cepas vacinais. O Quadro 14 (Figura 19) fornece dados de um ELISA com células inteiras que mostra exemplos de mAbs produzidos por camundongos imunizados seqüencialmente com as MV da cepa MenC RM1090 e da cepa MenB BZ198 e com as OMV da cepa MenA Z1092. Vários mAbs são reativos com todas as cepas meningocóccicas testadas e outros reagem com um subconjunto limitado de cepas. O Quadro 15 (Figura 20) resume a atividade bactericida mediada pelo complemento de mAbs preparados partindo de camundongos imunizados com o antígeno anti-CHORI e testados contra várias cepas MenB. O Quadro 16 (Figura 21) resume o sorotipo e o sorossubtipo meningocóccico que definem os anticorpos monoclonais disponíveis para RIVM. O Quadro 17 (Figura 22) resuma o sorogrupo, o sorotipo e o sorossubtipo que definem os anticorpos monoclonais disponíveis para NIBSC.

Antes da presente invenção e dos exemplos de modalidades específicas serem descritos, deve ser entendido que esta invenção não está limitada às modalidades particulares descritas, de forma que, evidentemente, pode variar. Deve ser também entendido que a terminologia utilizada aqui tem somente a finalidade de descrever as modalidades particulares e não é pretendido que esta seja limitante, uma vez que o âmbito da presente invenção será limitado somente pelas reivindicações em anexo.

Quando é fornecida uma faixa de valores, deve ser entendido que cada valor intermediário, até o décimo da unidade do limite inferior a não ser que o contexto dite claramente de outra maneira, entre os limites superior e inferior de tal faixa e qualquer outro valor citado ou intermediário dentro desta faixa citada é abrangido por esta invenção. Os limites superior e inferior destas faixas menores que podem ser incluídos independentemente nas faixas menores são também abrangidos pela invenção, sujeitos a qualquer limite excluído específicamente na faixa citada. Quando a faixa citada inclui um ou ambos os limites, as faixas que excluem qualquer um dos dois dos limites incluídos são também incluídas na invenção. A não ser que seja citado de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui possuem o mesmo significado que os comumente entendidos por um versado comum na técnica à qual esta invenção pertence. Embora muitos métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui possam ser também utilizados na prática ou no teste da presente invenção, os métodos e os materiais preferidos são descritos agora. Todas as publicações mencionadas aqui são incorporadas aqui como referência para divulgar e descrever os métodos e/ou os materiais em associação com os quais as publicações são citadas.

Deve ser observado que como é utilizado aqui e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "um", "uma", "e", "a" e "o" incluem referentes no plural a não ser que o contexto dite claramente de outra maneira. Assim, por exemplo, a referência a "um antígeno" inclui um grande número de tais antígenos e a referência à "vesícula11 inclui a referência a uma ou mais vesículas e equivalentes das mesmas conhecidas pelos versados na técnica e assim por diante.

As publicações discutidas aqui são fornecidas somente para sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido de patente. Nada aqui deve ser interpretado como um reconhecimento de que a presente invenção não é habilitada para antecipar tal publicação em virtude da invenção anterior. Ainda, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas de publicação atuais que podem necessitar ser confirmadas de forma independente.

Descrição Detalhada da Invenção A imunização de bebês, crianças mais velhas e adultos com vacinas de vesículas de membrana externa (OMV) de meningococos induz anticorpos bactericidas do soro, um correlativo sorológico de proteção contra doenças (Goldschneider e outros, 1969, J. Exp. Med. 129:1307). A eficiência de vacinas de OMV para a prevenção de doença meningocóccica B foi também demonstrada diretamente em crianças mais velhas e adultos em testes clínicos prováveis aleatórios e em estudos para controle de casos retrospectivos. Ver, por exemplo, os resultados resumidos na seção de fundamentos e na quadro 1 (Figura 1). Assim, a eficiência clínica das vacinas de vesículas de membrana externa não está em discussão. Tais vacinas estão próximas da licença para uso na Noruega em crianças mais velhas e em adultos e estão no estágio tardio de desenvolvimento clínico para licença em outros países da Europa. Uma vacina de OMV preparada pelo Finley Institute em Cuba está também disponível comercialmente e foi fornecida a milhões de crianças na América do Sul. A resposta de anticorpos bactericida do soro para as vacinas de OMV tende a ser específica à cepa (Tappero e outros, 1999, JAMA 281:1520; e Rouupe van der Voort ER, 2000, Vaccine, 18:1334-1343). A PorA é imunodominante e a imunidade induzida é predominantemente específica às cepas das quais as vesículas de membrana foram obtidas (Tappero e outros, 1999, JAMA 281:1520, Martin SL e outros, 2000, Vaccine, 18:2476-2481). Esta limitação é particularmente devida à variabilidade anti-gênica da proteína PorA e é particularmente verdadeira em bebês que são imunologicamente "naive" (Tappero e outros) em relação à exposição anterior a antígenos de Neisseria.

Conseqüentemente, a presente invenção envolve a ativação de uma resposta imunológica que é amplamente reativa com diversas cepas de N. meningitidis produtoras de doença. A invenção evita o problema de imunodominância de domínios antigenicamente variáveis da PorA em vacinas baseadas em vesículas ou baseadas em PorA através da concentração da resposta de anticorpos em antígenos comuns nas cepas vacinais. De maneira importante, os métodos da invenção ativam o anticorpo bactericida do soro, o único correlato sorológico provado de proteção em seres humanos (Goldschneider e outros, 1969, supra), contra cepas de Neisseria que expressam os epitopos do sorossubtipo que não foram utilizados nas preparações de vacina. Ainda, o método ativa anticorpo bactericida do soro contra cepas que não são mortas por anticorpo para uma proteína conservada tal como a proteína A de superfície de Neisseria, uma vacina meningocóccica candidata (Martin e outros, 2000. J. Biotechnol. 83:27-31; Moe e outros, 1999 Infect. Immun. 67: 5664; Moe e outros Infect. Immun. 2001 69:3762). Sem estar preso à teoria, a vacina e o regime de imunização da invenção fornece suas vantagens inesperadas em uma imunidade protetora de amplo espectro através da ativação de anticorpos que são específicos tanto para antígenos conservados quanto para não conservados. A. Definições O termo "imunidade protetora" significa que uma vacina ou programa de imunização que é administrado a um mamífero induz uma resposta imunológica que previne, retarda o desenvolvimento de ou reduz a gravidade de uma doença que é causada por Neisseria meningitidis ou diminui ou elimina completamente os sintomas da doença. A frase "uma doença causada por uma cepa do sorogrupo B de Neisseria meningitidis" abrange qualquer sintoma clínico ou combinação de sintomas clínicos que estão presentes em uma infecção com um membro do sorogrupo B de Neisseria meningitidis. Estes sintomas incluem mas não estão limitados: à colonização do trato respiratório superior (por exemplo mu-cosa da nasofaringe ou tonsilas) por uma cepa patogênica do sorogrupo B de Neisseria meningitidis, à penetração das bactérias na mucosa e no leito vascular submucosa, à septicemia, ao choque séptico, à inflamação, à dis-função de órgãos tais como rins, pulmões e parada cardíaca, hemorragia adrenal e infarto muscular, derrame capilar, edema, isquemia de membros periféricos, síndrome de esgotamento respiratório, pericardite e meningite. A frase "imunidade protetora de amplo espectro" significa que uma vacina ou programa de imunização ativa uma "imunidade protetora" contra pelo menos uma ou mais (ou contra pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, contra pelo menos oito ou contra pelo menos mais de oito) cepas de Neisseria meningitidis, em que cada uma das cepas pertence a um sorossubtipo diferente que as cepas utilizadas para preparar a vacina. A invenção considera e abrange especificamente uma vacina ou regime de vacinação que confere proteção contra uma doença causada por um membro do sorogrupo B de Neisseria meningitidis e também contra outros sorogrupos, particularmente os sorogrupos A, C, Y e W-135. A frase "se liga especificamente a um anticorpo" ou "especificamente imunorreativo a", quando se refere a um antígeno tal como um polis-sacarídeo, fosfolipídeo, proteína ou peptídeo, refere-se a uma reação de ligação que é baseada em e/ou é comprovativa da presença do antígeno em uma amostra que pode também incluir uma população heterogênea de outras moléculas. Assim, sob condições planejadas para ensaio imunológico, o anticorpo ou os anticorpos especificados se ligam a um antígeno ou antíge-nos particulares em uma amostra e não se ligam em uma quantidade significativa a outras moléculas presentes na amostra. A ligação específica a um anticorpo sob tais condições pode requere um anticorpo ou um antisoro que é selecionado por sua especificidade em relação a um antígeno ou antíge-nos particulares. A frase "em uma quantidade suficiente para ativar uma resposta imunológica para epitopos presentes na dita preparação" significa que há uma diferença detectável entre um indicador da resposta imunológica medido antes e depois da administração de uma preparação de antígeno particular. Os indicadores da resposta imunológica incluem mas não estão limi- tados: ao título ou à especificidade do anticorpo, que é detectada através de um ensaio tal como um ensaio imunológico ligado à enzima (ELISA), um ensaio bactericida, a citometria de fluxo, a imunoprecipitação, a imunodifu-são de Ouchter-Lowny; os ensaios para detecção de ligação de, por exemplo, ponto, Western blot ou conjuntos de antígenos; ensaios de citotoxicida-de etc.

Um "antígeno de superfície" é um antígeno que está presente em uma estrutura de superfície de Neisseria meningitidis (por exemplo a membrana externa, a membrana interna, o espaço periplasmático, a cápsula, os pili etc.). A frase "geneticamente distinta" como é utilizada no contexto de cepas geneticamente distintas de Neisseria meningitidis, refere-se a cepas que diferem de uma outra na sequência de aminoácidos em pelo menos um e geral mente pelo menos dois, mais geralmente pelo menos três polipeptí-deos, particularmente polipeptídeos antigênicos. A diversidade genética das cepas pode ser realizada através da seleção de cepas que diferem em pelo menos um ou mais, preferencialmente pelo menos dois ou mais, sorogrupo, sorotipo ou sorossubtipo (por exemplo, diz-se que duas cepas que diferem em pelo menos uma das proteínas selecionadas da membrana externa, proteínas PorA e PorB, são geneticamente distintas em relação uma à outra). A diversidade genética pode ser também definida, por exemplo, pela tipagem das seqüências multilocus e/ou pela tipagem das enzimas multilo-cus (ver, por exemplo, Maiden e outros, 1998, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:3140; Pizza e outros 2000 Science 287:1816), pela eletroforese das enzimas multilocus e por outros métodos conhecidos na técnica. "Sorogrupo" como utilizado aqui refere-se à classificação de Neisseria meningitidis em virtude de variações detectáveis imunologica-mente no polissacarídeo capsular. São conhecidos aproximadamente 12 sorogrupos: A, B, C, X, Y, Z, 29-E, W-135, Η, I, K e L. Qualquer um dos so-rogrupos pode abranger vários sorotipos e vários sorossubtipos. "Sorotipo" como utilizado aqui refere-se à classificação de cepas de Neisseria meningitidis baseada nas diferenças antigênicas definidas por anticorpos monoclonais na proteína de membrana externa Porina B. Um único sorotipo pode ser encontrado em vários sorogrupos e vários soros-subtipos. "Sorossubtipo" como utilizado aqui refere-se à classificação de cepas de Neisseria meningitidis baseada nas variações antigênicas definidas por anticorpos na proteína de membrana externa chamada Porina A ou na tipagem de VR das seqüências de aminoácidos deduzidas partindo do seqüenciamento do DNA (Sacchi e outros, 2000, J. Infect. Dis. 182:1169; ver também o site da internet Multi Locus Sequence Typing). A maior variabilidade entre as proteínas PorA ocorre nas duas (voltas I e IV) das supostas oito voltas expostas à superfície. As voltas variáveis I e IV foram denominadas VR1 e VR2, respectivamente. Um único sorossubtipo pode ser encontrado em vários sorogrupos e vários sorotipos. "Enriquecido1' significa que um antígeno em uma composição de antígenos é manipulado por um técnico ou um médico de forma que este esteja presente em uma concentração pelo menos três vezes maior em peso total, preferencialmente pelo menos uma concentração 10 vezes maior, mais preferencialmente uma concentração pelo menos 100 vezes maior e mais preferencialmente uma concentração 1.000 vezes maior que a concentração de tal antígeno na cepa da qual a composição de antígenos foi obtida. Assim, se a concentração de um antígeno particular for de 1 micrograma por grama de preparação bacteriana total (ou de proteína bacteriana total), uma preparação enriquecida conteria pelo menos 3 microgramas por grama de preparação bacteriana total (ou de proteína bacteriana total). O termo "imunologicamente" simples em relação à Neisseria meningitidis" significa um indivíduo (por exemplo, um mamífero tal como um paciente humano) que nunca foi exposto (através de infecção ou administração) à Neisseria meningitidis ou a uma composição de antígenos derivada de Neisseria meningitidis em quantidades suficientes para ativar uma imunidade protetora ou se exposto, falhou em fixar uma resposta imunológica protetora. (Um exemplo do último caso seria um indivíduo exposto sendo muito jovem quando as respostas imunológicas podem não ocorrer. Molages e outros, 1994, Infect. Immun. 62: 4419-4424). É ainda desejável (mas não necessário) que o indivíduo imunologicamente simples" não tenha sido exposto também a uma espécie de Neisseria sem ser Neisseria meningitidis (ou uma composição de antígenos preparada partindo de uma espécie de Neisseria), particularmente não a uma espécie de Neisseria que reaja de forma cruzada (ou composição de antígenos). Os indivíduos que foram expostos (através de infecção ou administração) a uma espécie de Neisseria ou a uma composição de antígenos derivada de tal espécie de Neisseria em quantidades suficientes para ativar uma resposta imunológica para os epi-topos exibidos por tal espécie, são "preparados" para responder imunologi-camente aos epitopos exibidos por tal espécie. B. Preparação de frações de Neisseria meningitidis e detecção de antígenos e de composições antigênicas que conferem imunidade protetora 1. Composições antigênicas As várias composições antigênicas (por exemplo células lisadas, frações subcelulares, MVs e OMVs ou antígenos individuais e combinações de antígenos detectados e isolados como descrito acima e abaixo) que são administradas a um animal (especialmente um paciente humano) para induzir uma resposta imunológica são geralmente obtidas através de métodos conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, as preparações de antígenos utilizadas para ativar uma resposta imunológica são preparadas através do cultivo de Neisseria meningitidis spp. utilizando técnicas de cultivo bacteriano bem-conhecidas e preparando uma fração que contém antígenos que induzem imunidade protetora.

Uma fração preferida compreende microvesículas (MV) ou vesículas que são liberadas durante o cultivo da dita Neisseria meningitidis spp. As MVs podem ser obtidas através do cultivo de uma cepa de Neisseria meningitidis em meio de cultura, separando as células inteiras do meio de cultura (por exemplo através de filtração ou por uma centrifugação em baixa velocidade que forma péletes somente das células e não das vesículas menores ou similares) e então coletando as MVs que estão presentes no meio de cultura sem células (por exemplo através de filtração, filtração diferencial ou agregação de MVs ou através de uma centrifugação a alta velocidade que forma péletes somente das vesículas ou similares). As cepas para uso na produção de MVs podem ser geralmente selecionadas com base na quantidade de vesículas produzidas na cultura (por exemplo, as bactérias podem ser cultivadas em um número razoável para fornecer a produção de vesículas adequadas para isolamento e administração nos métodos descritos aqui). Um exemplo de cepa que produz altos níveis de vesículas é descrito na Publicação PCT Ns WO 01/34642. Em adição à produção de vesículas, as cepas para uso na produção de MV podem ser também selecionadas com base na produção de NspA, onde as cepas que produzem níveis mais altos de NspA podem ser preferíveis (para exemplos de cepas de Neisseria meningitidis que possuem níveis de produção de NspA diferentes, ver, por exemplo, Moe e outros (1999 Infect. Immun. 67: 5664).

Uma segunda fração preferida compreende as vesículas de membrana externa (OMV) preparadas partindo da membrana externa de uma cepa cultivada de Neisseria meningitidis spp. As OMVs podem ser obtidas partindo de uma Neisseria meningitidis cultivada em cultura em caldo ou meio sólido, preferencialmente através da separação das células bacteria-nas do meio de cultura (por exemplo através de filtração ou de uma centrifugação em velocidade baixa que forma péletes de células ou similares), lisando as células (por exemplo através da adição de detergente, choque osmótico, ultra-som, cavitação, homogeneização ou similares) e separando uma fração da membrana externa das moléculas citoplasmáticas (por exemplo através de filtração; ou através de precipitação diferencial ou agregação de membranas externas e/ou de vesículas de membrana externa ou através de métodos de separação por afinidade utilizando ligantes que reconhecem especificamente moléculas de membrana externa; ou através de uma centrifugação em velocidade alta que forma péletes de membranas externas e/ou de vesículas de membrana externa ou similares); as frações de membrana externa podem ser utilizadas para produzir as OMVs.

Na produção de MVs ou de OMVs, pode ser preferível utilizar cepas que são produtoras de relativamente pouca endotoxina (lipopolissa-carídeo, LPS) de forma a diminuir a necessidade de remover a endotoxina da preparação final antes do uso em seres humanos. Por exemplo, as OMV e/ou as MV podem ser preparadas partindo de mutantes destas cepas de Neisseria nas quais o lipooligossacarídeo ou outros antígenos que podem ser indesejáveis em uma vacina (por exemplo Rmp) são reduzidos ou eliminados.

Quando desejado (por exemplo, quando as cepas utilizadas para produzir MVs ou OMVs estão associadas com endotoxina ou altos níveis particulares de endotoxina), as MVs ou as OMVs são opcionalmente tratadas para reduzir a endotoxina, por exemplo, para reduzir a toxicidade após a administração. A redução da endotoxina pode ser realizada através da extração com um detergente adequado (por exemplo, BRIJ-96, desoxi-colato de sódio, lauoilsarcosinato de sódio, Empigen BB, Triton X-100, TWEEN 20 (monolaurato polioxietileno de sorbitano), TWEEN 80, a uma concentração de 0,1-10%, preferencialmente 0,5-2%). A extração de preparações de OMV e de MV com desoxicolato resultou na remoção de alguns antígenos protéicos não-capsulares (ver a Figura 2). A vacinação de animais com preparações de OMV ou de MV submetidas à extração com desoxicolato ativou uma resposta imunológica que estava associada com títulos mais baixos de anticorpos bactericidas comparada com a vacinação com material que não sofreu extração com desoxicolato.

Em adição às MVs e às OMVs, os antígenos isolados ou as combinações particulares de antígenos podem ser utilizadas para induzir uma resposta imunológica protetora. A identidade dos antígenos isolados ou das combinações de antígenos é descrita abaixo.

As composições imunogênicas utilizadas como vacinas compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz de antígeno, assim como quaisquer outros componentes compatíveis, quando necessário. Por "quantidade imunologicamente eficaz" entende-se que a administração de tal quantidade a um indivíduo, em uma dose única ou como parte de uma série, é eficaz para o tratamento ou para a prevenção. Esta quantidade varia de- pendendo da saúde e da condição física do indivíduo que será tratado, da idade, do grupo taxonômico do indivíduo que será tratado (por exemplo, primata não-humano, primata etc.) da capacidade do sistema imunológico do indivíduo de sintetizar anticorpos, do grau de proteção desejado, da formulação da vacina, da avaliação do médico responsável pelo tratamento da situação médica e de outros fatores relevantes. É esperado que a quantidade estará dentro de uma faixa relativamente ampla que pode ser determinada através de testes de rotina. O tratamento em dosagens pode ser um programa de dose única ou um programa de várias doses (por exemplo, incluindo doses de reforço). A vacina pode ser administrada em associação com outros agentes imunorreguladores.

As composições de antígenos ou os antígenos individuais que serão administrados são fornecidos em uma solução farmaceuticamente aceitável tal como uma solução aquosa, freqüentemente uma solução salina ou podem ser fornecidos na forma de pó. As composições podem incluir ainda um adjuvante. Os exemplos de adjuvantes adequados conhecidos que podem ser utilizados em seres humanos incluem, mas não estão necessariamente limitados a, alúmen, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, MF59 (esqualeno 4,3% p/v, Tween 80 0,5% p/v, Span 85 0,5% p/v), ácido nucléico contendo CpG (quando a citosina não está metilada), QS21, MPL, 3DMPL, extratos de Alquilla, ISCOMS, mutantes LT/CT, micropartículas de poli(D,L-lactídeo-co-glicolídeo) (PLG), Quil A, interleucinas e similares. Para animais experimentais, pode-se utilizar Freund, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, referido como nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-ala-nina-2-(1 ’-2'-dipalmitoil-sn-gricero-3-hidroxifosforilóxi)-etilarnina (CGP 19835A, referido como MTP-PE) e RIBI, que contém três componentes extraídos de bactérias, monofosforil lipídeo A, dimicolato trealose e esqueleto de parede celular (MPL+TDM+CWS) em uma emulsão de esqualeno 2%/Tween 80. A eficiência de um adjuvante pode ser determinada através da medida da quantidade de anticorpos direcionados contra o antígeno imunogênico.

Os exemplos adicionais de adjuvantes para aumentar a eficiên- cia da composição incluem, mas não estão limitados a: (1) formulações de emulsões óleo-em-água (com ou sem outros agentes imunoestimulantes específicos tais como peptídeos muramil (ver abaixo) ou componentes de parede celular bacteriana), tais como por exemplo (a) MF59® (WO90/14837; Capítulo 10 em Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995), que contém Esqualeno 5%, Tween 80 0,5% e Span 85 0,5% (contendo opcionalmente MTP-PE) formulado em partículas submicroscópicas utilizando um microfluidizador, (b) SAF, que contém Esqualeno 10%, Tween 80 0,4%, polímero L121 bloqueado com plurônico 5% e thr-MDP microfluidizado em uma emulsão submicroscópica ou misturado em vórtex para gerar uma emulsão com tamanho de partícula maior e (c) os sistema de adjuvante Ribi® (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contém Esqualeno 2%, Tween 80 0,2% e um ou mais componentes de parede celular bacteriana tais como o monofosforilipídeo A (MPL), a dimicolato trealose (TDM) e o esqueleto de parede celular (CWS), preferencialmente MPL + CWS (Detox®); (2) adjuvantes de saponina, tal como QS21 ou Stimulon® (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) podem ser utilizados ou partículas geradas partindo dos mesmos tais como os ISCOMs (complexos imunoestimulantes), cujos ISCOMS podem ser desprovidos de detergente adicional por exemplo WO00/07621; (3) Adjuvante Completo de Freund (CFA) e Adjuvante Incompleto de Freund (IFA); (4) citocinas, tais como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (W099/44636) etc.), interferons (por exemplo interferon gama), fator estimulante de colônias de macrófagos (M-CSF), fator de necrose de tumor (TNF) etc.; (5) monofosforil lipídeo A (MPL) ou MPL 3-O-desacilado (3dMPL) por exemplo GB-2220221, EP-A-0689454, opcionalmente na ausência substancial de alúmen quando utilizado com sacarídeos de pneumo-cocos por exemplo WOOO/56358; (6) combinações de 3dMPL com, por exemplo, QS21 e/ou emulsões de óleo-em-água por exemplo EP-A-0835318, EP-A-0735898, EP-A-0761231; (7) oligonucleotídeos que compreendem motivos CpG [Krieg Vaccine 2000, 19, 618-622; Krieg Curr Opin Mol Ther 2001 3:15-24; Roman e outros, Nat. Med., 1997, 3, 849-854; Wei- ner e outros, PNAS USA, 1997, 94, 10833-10837; Davis e outros, J. Im-munol., 1998, 160, 870-876; Chu e outros, J. Exp. Med; 1997-, 186, 1623-1631; Lipford e outros, Ear. J. Immunol., 1997, 27, 2340-2344; Moldoveami e outros, Vaccine, 1988, 16, 1216-1224, Krieg e outros, Nature, 1995, 374, 546-549; Klinman e outros, PNAS USA, 1996, 93, 2879-2883; Bailas e outros; J. Immunol., 1996, 157, 1840-1845; Cowdery e outros, J. Immunol, 1996, 156, 4570-4575; Halpern e outros, Cell Immunol, 1996, 167, 72-78; Yamamoto e outros, Jpn. J. Câncer Res., 1988, 79, 866-873; Stacey e outros, J. Immunol., 1996, 157, 2116-2122; Messina e outros, J. Immunol. 1991, 147, 1759-1764; Yi e outros, J. Immunol., 1996, 157, 4918-4925; Yi e outros, J. Immunol., 1996, 157, 5394-5402; Yi e outros, J. Immunol. 1998, 160, 4755-4761; e Yi e outros, J. Immunol., 1998, 160, 5898-5906; pedidos de patente Internacionais WO96/02555, W098/16247, WO98/18810, W098/40100, W098/55495, W098/37919 e W098/52581] isto é contendo pelo menos um dinucleotídeo CG, onde a citosina não está metilada; (8) um polioxietileno éter ou um polioxietileno éster por exemplo W099/52549; (9) um tensoativo de éster de polioxietileno sorbitano em combinação com um octoxinol (W001/21207) ou um alquil éter de polioxietileno ou um tensoativo de éter em combinação com pelo menos um tensoativo não-iônico adicional tal como um octoxinol (WO01/21152); (10) uma saponina e um oligonucleo-tídeo imunoestimulante (por exemplo um oligonucleotídeo CpG) (WO00/62800); (11) um imunoestimulante e uma partícula de sal metálico por exemplo WO00/23105; (12) uma saponina e uma emulsão de óleo-em-água por exemplo W099/11241; (13) uma saponina (por exemplo QS21) + 3dMPL + IM2 (opcionalmente + um esterol) por exemplo W098/57659; (14) outras substâncias que atuam como agentes imunoestimulantes para aumentar a eficiência da composição. Os peptídeos muramil incluem N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-25 acetil-normuramil-L-alanil-D-isogluta-mina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1 '-2'-dipalmitoil-s/?-glicero-3-hidroxifosforilóxi)-etilamina MTP-PE) etc.

Os antígenos podem ser combinados com excipientes convencionais, tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glicose, sacarose, magnésio, carbonato e similares. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis quando necessárias para aproximar às condições fisiológicas tais como agentes de ajuste de pH e tamponantes, agentes de ajuste de toxicidade e similares, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio e similares. A concentração de antígenos nestas formulações pode variar amplamente e será selecionada primariamente com base nos volumes, nas viscosidades do fluido, no peso corporal e similares de acordo com o modo particular de administração selecionado e com as necessidades do paciente. As composições resultantes podem estar na forma de uma solução, suspensão, comprimido, pílula, cápsula, pó, gel, creme, loção, ungüento, aerossol ou similares. A concentração de antígenos imunogênicos da invenção nas formulações farmacêuticas pode variar amplamente, isto é de menos que aproximadamente 0,1%, geralmente em ou em pelo menos aproximadamente 2% até tanto quanto 20% até 50% ou mais em peso e será selecionada primariamente em volumes, viscosidades do fluido etc., de acordo com o modo particular de administração selecionado. 2. Imunização As MVs, as OMVs, os antígenos isolados ou as combinações de antígenos da presente invenção são administradas oralmente, nasalmente, nasofaringealmente, parenteralmente, entericamente, gastricamente, topi-camente, transdermalmente, subcutaneamente, intramuscularmente, na forma de comprimidos, sólida, de pó, líquida, de aerossol, localmente ou sistematicamente, com ou sem excipientes adicionados. Os métodos precisos para a preparação de composições que podem ser administradas parente-ralmente serão conhecidos ou evidentes pelos versados na técnica e são descritos em maiores detalhes em tais publicações tal como Remington's Pharmaceutical Science, 15§ ed., Mack Publishing Company, Easton, Pen-nsylvania (1980). A administração das MVs, das OMVs, dos antígenos isolados ou das combinações de antígenos pode ser realizada em série ou na forma de uma mistura, como é descrito em maiores detalhes abaixo. É reconhecido que os polipeptídeos e os compostos relacionados descitos anteriormente, quando administrados oralmente, têm que ser protegidos da digestão. Isto é tipicamente realizado através da complexação da proteína com uma composição que a torna resistente à hidrólise ácida e enzimática ou através do empacotamento da proteína em um veículo resistente de maneira apropriada tal como um lipossomo. Os meios para proteger as proteínas da digestão são bem-conhecidos na técnica.

Com a finalidade de aumentar a meia-vida, as preparações anti-gênicas que são injetadas podem ser também encapsuladas, introduzidas no lúmen de lipossomas, preparadas na forma de um colóide ou podem ser empregadas outras técnicas convencionais que fornecem uma meia-vida dos peptídeos extendida no soro. Está disponível uma variedade de métodos para a preparação de lipossomos, como é descrito, por exemplo, em Szoka e outros, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), Patentes U.S. N03 4.235.871, 4.501.728 e 4.837.028. As preparações podem ser também fornecidas em formas de liberação controlada ou de liberação lenta para a liberação e a administração das preparações de antígenos como uma mistura ou em série.

As composições são administradas a um animal que está em risco de adquirir uma doença causada por Neisseria para prevenir ou pelo menos interromper parcialmente o desenvolvimento da doença e suas complicações. Uma quantidade adequada para realizar isto é definida como uma "dose terapeuticamente eficaz". As quantidades eficazes para uso terapêutico dependerão, por exemplo, da composição de antígenos, da forma de administração, do peso e do estado geral de saúde do paciente e do julgamento do médico que prescreve. As dose únicas ou múltiplas das composições de antígenos podem ser administradas dependendo da dosagem e da freqüência necessária e tolerada pelo paciente e da rota de administração.

Em modalidades particulares, as composições de antígenos descritas aqui são administradas em série. Primeiro, uma dose terapeuticamente eficaz de uma primeira composição de antígenos (por exemplo MV, OMV, antígeno isolado ou combinações de antígenos, com ou sem excipi-entes) preparada partindo de uma primeira cepa de Neisseria é administrada a um indivíduo. A primeira composição antigênica é geralmente administrada em uma quantidade eficaz para ativar uma resposta imunológica (por exemplo, ativação de células B e/ou T). As quantidades para a imunização inicial geralmente variam de aproximadamente 0,001 mg até aproximadamente 1,0 mg por 70 quilogramas de paciente, mais comumente de aproximadamente 0,001 mg até aproximadamente 0,2 mg por 70 quilograma de paciente. Podem ser utilizadas dosagens de 0,001 até aproximadamente 10 mg por paciente ao dia, particularmente quando o antígeno é administrado em um local isolado e não na corrente sangüínea, tal como em uma cavidade corporal ou em um lúmen de um órgão. Dosagens substancialmente mais altas (por exemplo 10 até 100 mg ou mais) são possíveis na administração oral, nasal ou tópica.

Após a administração da primeira composição de antígenos, uma dose terapeuticamente eficaz de uma segunda composição de antígenos (por exemplo MV, OMV, antígenos isolados ou combinações de antígenos, com ou sem excipientes) preparada partindo de uma segunda cepa de Neisseria é administrada a um indivíduo após o indivíduo ter sido imunologi-camente preparado pela exposição à primeira composição de antígenos. O reforço pode ser administrado dias, semanas ou meses após a imunização inicial, dependendo da resposta e do estado de saúde do paciente. A existência de uma resposta imunológica para a primeira composição de antígenos pode ser determinada por métodos conhecidos (por exemplo através da obtenção do soro do indivíduo antes e depois da imunização inicial demonstrando uma alteração na condição imunológica do indivíduo, por exemplo um ensaio de imunoprecipitação ou um ELISA ou um ensaio bacte-ricida ou um Western blot ou um ensaio de citometria de fluxo ou similares) e/ou demonstrando que a magnitude da resposta imunológica à segunda injeção é maior do que a dos animais de controle imunizados pela primeira vez com a composição de objetivo utilizada para a segunda injeção (por exemplo preparação imunológica). A preparação imunológica e/ou a exis- tência de uma resposta imunológica para a primeira composição de antíge-nos pode ser assumida aguardando durante um período de tempo após a primeira imunização que, com base na experiência anterior, é um tempo suficiente para que uma resposta imunológica e/ou preparação ocorra - por exemplo 2, 4, 6, 10 ou 14 semanas. As dosagens de reforço da segunda composição de antígenos são tipicamente de aproximadamente 0,001 mg até aproximadamente 1,0 mg de antígeno, dependendo da natureza do imunógeno e da rota de imunização.

Em certas modalidades preferidas, uma dose terapeuticamente eficaz de uma terceira composição de antígenos preparada partindo de uma cepa de Neissería é administrada a um indivíduo após o indivíduo ter sido preparado e/ou ter sido produzida uma resposta imunológica à segunda composição de antígenos. O terceiro reforço pode ser administrado dias, semanas ou meses após a segunda imunização, dependendo da resposta e do estado de saúde do paciente. A existência da preparação e/ou da resposta imunológica à segunda composição de antígenos pode ser determinada através dos mesmos métodos utilizados para detectar uma resposta imunológica para a segunda composição de antígenos. A existência da preparação e/ou de um resposta imunológica à segunda composição de antígenos pode ser também assumida aguardando durante um período de tempo após a segunda imunização que, com base na experiência anterior, é um tempo suficiente para que uma resposta imunológica ocorra - por exemplo 2, 4, 6, 10 ou 14 semanas. As dosagens de reforço da segunda composição de antígenos são tipicamente de aproximadamente 0,001 mg até aproximadamente 1,0 mg de antígeno, dependendo da natureza do imunógeno e da rota de imunização. A presente invenção considera ainda o uso de uma quarta, quinta, sexta ou mais imunizações de reforço, utilizando uma quarta, quinta ou sexta cepa de Neissería meningitidis ou qualquer uma das primeira, segunda ou terceira cepas ou outra cepa que seja geneticamente distinta em relação a pelo menos uma das primeira, segunda e terceira cepas.

Quando a administração de composições antigênicas preparadas partindo das primeira, segunda e terceira (opcionalmente, mas prefe- rencialmente) cepas é feita em série, a ordem de administração das composições pode ser variada. Por exemplo, a ordem de administração de OMV e/ou de MV dentro destas etapas de administração em série pode ser variada. Por exemplo, as ordens a seguir de administração estão dentro do escopo da invenção (da esquerda para direita, com a terceira administração sendo opcional): OMV-OMV-OMV; OMV-OMV-MV; OMV-MV-MV; MV-MV-MV; MV-MV-OMV; MV-OMV-OMV; OMV-MV-OMV; e MV-OMV-MV. Preferencialmente, a ordem de administração é MV-MV-OMV.

Em outras modalidades a primeira, a segunda e a terceira (opci-onalmente) composições de antígenos são administradas na forma de uma mistura. Em modalidades relacionadas, a primeira e a segunda composições de antígenos são administradas na forma de uma mistura e a terceira composição de antígenos é administrada subsequentemente.

As misturas são administradas em uma quantidade eficaz para ativar uma resposta imunológica, particularmente uma resposta imunológica humoral, no hospedeiro. As quantidades para a imunização da mistura geralmente variam de aproximadamente 0,001 mg até aproximadamente 1,0 mg por 70 quilogramas do paciente, mais comumente de aproximadamente 0,001 mg até aproximadamente 0,2 mg por 70 quilogramas do paciente. Podem ser utilizadas dosagens de 0,001 até aproximadamente 10 mg por paciente ao dia, particularmente quando o antígeno é administrado em um local isolado e não na corrente sangüínea, tal como em uma cavidade corporal ou em um lúmen de um órgão. Dosagens substancialmente mais altas (por exemplo 10 até 100 mg ou mais) são possíveis na administração oral, nasal ou tópica. A administração inicial da mistura pode ser seguida pela imunização de reforço da mesma mistura ou de uma diferente, com pelo menos um reforço, mais geralmente dois reforços, sendo preferidos.

Em certas modalidades preferidas, a primeira e a segunda cepas de Neisseria são distintas geneticamente uma da outra, por exemplo, as cepas pertencem a sorotipos de PorB e/ou a sorossubtipos de PorA diferentes; e podem também opcionalmente pertencer a sorogrupos capsulares diferentes. Além disso, a segunda e a terceira cepas de Neisseria são gene- ticamente distintas uma da outra, por exemplo, as cepas pertencem a soro-tipos e/ou sorossubtipos diferentes; podem também opcionalmente pertencer a sorogrupos diferentes. A terceira cepa de Neissería é preferencialmente geneticamente distinta em relação à primeira e à segunda cepas, mas pode, em algumas modalidades, não ser geneticamente distinta em relação à primeira cepa. Por exemplo, o sorotipo e/ou o sorossubtipo da terceira cepa de Neissería deve ser preferencialmente diferente da primeira e da segunda cepas mas pode ser o mesmo que o da primeira cepa. A presente invenção considera ainda especificamente que as composições de antígenos de outros membros do gênero Neissería podem ser administradas como é descrito aqui para gerar imunidade protetora contra Neissería meningitidis. Por exemplo, Neissería lactamica, um membro comensal não-encapsulado não-patogênico do gênero Neissería que é co-mumente encontrado na nasofaringe humana, ambrange cepas que possuem muitos antígenos presentes na N. meningitidis e, portanto, pode ser também utilizada para preparar um dos imunógenos imaginados nesta invenção. Assim, as MVs e as OMVs provenientes da Neissería lactamica podem ser utilizadas para preparar ou ativar uma resposta imunológica protetora contra Neissería meningitidis (ou contra outras Neissería patogênicas tal como Neissería gonorrhea). Isto pode ser realizado através da administração inicial de uma composição de antígenos (por exemplo, MV ou OMV) provenientes de Neissería lactamica, seguida pela administração de uma segunda e opcionalmente uma terceira composição de antígenos de Neissería meningitidis (ou Neissería gonorrhea). A invenção considera especificamente também que as composições de antígenos provenientes de cepas de Neissería lactamica podem ser utilizadas as administrações inicial, segunda e qualquer uma subseqüente, em que cada cepa de Neissería lactamica possui um sorotipo e/ou um sorossubitpo diferente das outras. A invenção considera ainda que as composições de antígenos utilizadas em qualquer etapa no protocolo de imunização podem ser obtidas partindo de uma ou mais cepas de bactérias (especialmente de Neissería lactamica ou de Neissería meningitidis) que são engenheiradas genetica- mente através de métodos conhecidos (ver, por exemplo a Patente U.S. Ng 6.013.267) para expressar um ou mais ácidos nucléicos que codificam uma ou mais moléculas de interesse, particularmente moléculas que ativam ou aumentam uma resposta imunológica protetora. Os ácidos nucléicos pode, por exemplo, codificar a Porina A, a Porina B, a NspA, a pilina ou outras proteínas de Neisseria. Outros exemplos de ácidos nucléicos incluem aqueles que codificam proteínas de Neisseria imunoprecipitadas com antiso-ros produzidos após a vacinação com a vacina CHORI, particularmente as proteínas que possuem massas moleculares aparentes de aproximadamente 53 kDa-57 kDa; aproximadamente 46-47 kDa, aproximadamente 33 kDa, aproximadamente 20 kDa até 21 kDa; e aproximadamente 18 kDa. Os ácidos nucléicos podem codificar qualquer uma das proteínas anteriores que esteja truncada ou alterada para incluir ou deletar um sítio de glicosila-ção ou para incluir ou deletar qualquer epitopo ou para aumentar a expressão de qualquer uma das proteínas anteriores. São de interesse particular os fragmentos antigênicos de tais proteínas. Em adição, as composições de antígenos da invenção podem compreender antígenos adicionais de N. me-ningitidis tais como os exemplificados na Publicação PCT Nos WO 99/24578, WO 99/36544, WO 99/57280, WO 00/22430 e WO 00/66791, assim como fragmentos antigênicos tais como proteínas.

Um aspecto importante da presente invenção é que as composições de antígenos utilizadas para preparar e reforçar uma ampla imunidade protetora contra Neisseria meningitidis são preparadas partindo de cepas de Neisseria que possuem antígenos imunodominantes variantes (os antígenos principais que são detectados rotineiramente pelos antisoros provenientes de animais hospedeiros diferentes que foram infectados com Neisseria; os exemplos representativos incluem a Porina A, a Porina B, a pilina, a NspA etc.). Nos exemplos descritos na seção de Exemplos abaixo, as cepas variam em relação à Por A ou à PorB, que é evidenciado por seu sorotipo ou sorossubtipo. As cepas também podem variar em relação à molécula da cápsula, que é refletido por seu sorogrupo. A classificação de sorotipo e de sorossubtipo é determinada atualmente através da detecção de qual de uma lista de monoclonais conhecidos, que são conhecidos por reconhecerem moléculas de Porina específicas, se liga a uma cepa desconhecida (Sacchi e outros, 1998, Clin. Diag. Lab. Immunol. 5:348, ver as Tabelas 8 e 9 para as listas parciais de monoclonais). É provável que outros tais monoclonais venham a ser identificados. O uso de quaisquer sorotipos e sorossubtipos novos pode ser definido por qualquer um dos novos monoclonais novos que são especificamente considerados pela invenção. Em adição, os sorotipos e sorossubtipos podem ser definidos, não somente pela interação com anticorpos monoclonais, mas também estruturalmente através da ausência e/ou da presença dos resíduos peptídicos e dos epitopos peptídicos definidos (Sacchi e outros, 2000, J. Infect. Dis. 182:1169). Os esquemas de classificação de sorotipo e de sorossubtipo que são baseados nas características estruturais das Pori-nas (conhecidas ou que podem ser descobertas mais tarde) são especificamente abrangidos pela invenção.

Uma finalidade e um efeito da administração em série de composições de antígenos de cepas diferentes são potencializar uma resposta imunológica a antígenos e epitopos que são tipicamente não imunodomi-nantes, particularmente epitopos não imunodominantes que exibem menor variabilidade genética do que os epitopos /munodominantes conhecidos. A invenção abrange especificamente a administração em série de composições de antígenos de cepas de Neisseria que diferem em relação a antígenos imunodominantes exceto a Porins (por exemplo, fosfolipídeos, polissa-carídeos, lipopolissacarídeos, pilins, OmpA, Opa, Opc, etc.).

As composições de antígenos são tipicamente administradas a um mamífero que é imunologicamente simples em relação a Neisseria me-ningitidis. Em uma realização particular, o mamífero é uma criança humana de cerca de cinco anos ou mais jovem e preferencialmente cerca de dois anos ou mais jovem, e as composições de antígeno são administradas em qualquer uma ou mais que as seguintes vezes: duas semanas, um mês, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 meses, ou 1 ano ou 15, 18, ou 21 meses após o nascimento, ou em 2, 3, 4 ou 5 anos de idade.

Onde peptídeos imunogênicos partculares que dão aumento à imunidade protetora, são identificados como descrito acima e abaixo, estes antígenos podem ser diretamente administrados ao invés de MVs ou OMVs. Onde os antígenos identificados são peptídeos, a codificação do DNA de um ou mais dos peptídeos da invenção, também podem ser administrados ao paciente. Essa aproximação é descrita, por exemplo, em Wolft et al., Science 247: 1465-1468 (1990), bem como na patentes US 5,580,859 e 5.589.466. 3. Detecção de antígenos imunogênicos Frações subcelulares tais como MVs e OMVs contém muitos antígenos que podem dar aumento à uma resposta imune (veja, por exemplo, Figura 2, que descreve um gel eletroforético de muitas das frações). No entanto, nem todo antígeno em uma preparação, pode obter também, uma resposta humorada ou imunidade protetora contra uma doença causada por uma Neisseria meningitidis spp. Assim, a presente invenção também revela antígenos individuais e/ou combinações de antígenos que induzem imunidade protetora. Outro objetivo é usar os antígenos identificados para formular composições de antígeno que podem ser usadas para obter imunidade protetora contra uma doença Neisseríal.

Anti-soro ou mAbs são obtidos ou produzidos de mamíferos que são induzidos por métodos da presente invenção a manifestar imunidade protetora contra uma doença causada por antígenos Neisseria meningitidis spp.. O anti-soro ou mAbs são usados para detectar seus antígenos Neisse-riais correspondentes e esses antígenos são identificados e isolados, baseados nas suas propriedades fisicoquímicas (classe de molécula: peptídeo, ácido nucléico etc.; massa molecular, carga, composição química etc.) ou seqüência de aminoácidos. Os antígenos isolados (ou partes imunologica-mente eficazes dos mesmos) podem ser então administrados a mamíferos, sozinhos e/ou em combinação, como é descrito anteriormente ou na forma de proteínas recombinantes (ou fragmentos imunologicamente eficazes das mesmas) para avaliar a extensão até a qual induzem a imunidade protetora. A presente invenção considera especificamente a administração em série de antígenos isolados de uma cepa ou de cepas diferentes de Neisseria ou a administração de tais antígenos em uma mistura que compreende um ou mais, geralmente dois ou mais, mais geralmente três ou mais, ainda mais geralmente quatro até seis ou mais antígenos.

Os exemplos de antígenos de Neisseria adequados para a administração como descrito podem incluir, mas não estão necessariamente limitados às proteínas imunoprecipitadas com os antisoros produzidos após a vacinação com a vacina CHORI, particularmente as proteínas que possuem massas moleculares aparentes de aproximadamente 80 kDa, aproximadamente 59,5 kDa, aproximadamente 40,7 kDa, aproximadamente 39,6 kDa, aproximadamente 33 kDa, aproximadamente 27,9 kDa e 14,5 kDa ou fragmentos antigênicos das mesmas. Os antígenos administrados podem incluir pelo menos um destes antígenos ou podem incluir uma combinação destes antígenos (por exemplo, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro ou mais).

Os exemplos antígenos de Neisseria adicionais adequados para a administração como descrito podem incluir, mas não estão necessariamente limitados às proteínas detectadas por Western blot com os antisoros produzidos após a vacinação com a vacina CHORI, particularmente as proteína que possuem massas moleculares aparentes de aproximadamente 53 kDa-57 kDa; aproximadamente 46-47 kDa, aproximadamente 33 kDa, aproximadamente 20 kDa até 21 kDa; e aproximadamente 18 kDa ou fragmentos antigênicos das mesmas. Os antígenos administrados podem incluir pelo menos um destes antígenos ou podem incluir uma combinação destes antígenos (por exemplo, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro ou mais).

Deve ser observado que as referências feitas para as massas moleculares de proteínas referem-se à massa molecular aparente que é determinada utilizando SDS-PAGE sob as condições descritas. Deverá ser rapidamente evidente para o versado na técnica após a leitura do presente relatório descritivo que estas massas moleculares aparentes podem variar para a mesma proteína entre dois experimentos diferentes (por exemplo, utilizando géis diferentes ou preparações diferentes, quando isoladas de duas cepas diferentes (por exemplo, devido aos polimorfismos entre as cepas por causa das substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos, modificações pós-tradução e similares)) e também que proteínas diferentes podem parecer ter a mesma massa molecular aparente.

Os antígenos que ativam uma imunidade protetora são detectados através de métodos conhecidos: por exemplo, ensaio imunológico, imunoprecipitação, cromatografia por afinidade, Western blots etc. Os exemplos de tais métodos são descritos abaixo. (a) Detecção de Antígenos por Imunoensaio Uma variedade de imunoensaios é utilizada para caracterizar os antisoros e os anticorpos especificamente imunorreativos com um antígeno particular ou com uma composição antigênica e também para medir a força de uma resposta imunológica para um antígeno particular ou para uma composição antigênica. A primeira etapa é geralmente a produção de anti-soro ou de uma preparação de anticorpo que se liga ao antígeno ou à composição antigênica. (1) Produção de Anti-soros Imunológicos e de Anticorpos Policlonais ou Monoclonais Específicos Os métodos para a produção de anticorpos policlonais e monoclonais utilizados nestes ensaios são conhecidos pelos versados na técnica. Ver, por exemplo, Coligan (1991), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNO-LOGY, Wiley/Greene, NY; e Harlow e Lane (1989), ANTIBODIES: A LABO-RATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press, NY; Stites e outros (eds.) 1997 MEDICAL IMMUNOLOGY 9§ ed. McGraw-HilI Professional Publishing, Nova York, NY e referências citadas no mesmo; Goding (1986), MONO-CLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (25 ed.) Academic Press, Nova York, NY; e Kohler e Milstein (1975), Nature, 256: 495-497. Por exemplo, com a finalidade de produzir antisoros para uso em um ensaio imunológico, uma composição que contém antígenos provenientes da Neis-seria meningitidis spp. é fornecida sozinha ou é misturada com um adjuvante e injetada em um animal de escolha (por exemplo um camundongo, um rato, um coelho, um porco, uma cabra, uma vaca, um cavalo, uma galinha etc.) de acordo com qualquer um dos protocolos descritos aqui. A resposta imunológica do animal para a preparação do imunó-geno é monitorada retirando amostras de sangue para teste e determinando o título de reatividade de alíquotas diluídas em série do soro em relação a alíquotas diluídas em série da composição antigênica. Os antisoros policlo-nais com um título de 104 ou maior são selecionados e testados em relação à sua reatividade cruzada contra controles não-imunogênicos, utilizando um ensaio imunológico de ligação competitiva. Os anticorpos monoclonais e policlonais específicos e os antisoros geralmente se ligarão com uma constante de dissociação (KD) de pelo menos aproximadamente 0,1 mM, mais geralmente de pelo menos aproximadamente 1 μΜ, preferencialmente pelo menos aproximadamente 0,1 μΜ ou melhor e mais preferencialmente, 0,01 μΜ ou melhor. (2) Anticorpos Monoclonais Em alguns exemplos, é desejável preparar anticorpos monoclonais provenientes de vários hospedeiros mamíferos, tais como camundon-gos, roedores, primatas, seres humanos etc. A descrição de técnicas para a preparação de tais anticorpos monoclonais é encontrada, por exemplo, em Stites e outros, Supra e referência citadas no mesmo; Harlow e Lane, Supra; Goding Supra\ e Kohler e Milstein, Supra. Resumido sucintamente, este método procede com a injeção de um animal com uma preparação imuno-gênica. O animal é então sacrificado e as células são retiradas de seu baço, as quais são fundidas com células de mieloma. O resultado é uma célula híbrida ou "hibridoma" que é capaz de se reproduzir in vitro. A população de hibridomas é então selecionada para isolar clones individuais, dos quais cada um secreta uma espécie única de anticorpo para o imunógeno. Desta maneira, as espécies individuais de anticorpos obtidas são os produtos de células B isoladas imortalizadas e clonadas provenientes do animal geradas em resposta a uma substância imunogênica em um sítio específico reconhecido.

Os métodos alternativos de imortalização incluem a transforma- ção com o Vírus de Epstein Barr, com oncogenes ou com retrovírus ou outros métodos conhecidos na técnica. As colônias que surgem das células imortalizadas isoladas são selecionadas para a produção de anticorpos da especificidade e da afinidade desejadas ao antígeno e o rendimento dos anticorpos monoclonais produzidos por tais células é aumentado por várias técnicas, incluindo a injeção na cavidade peritoneal de um hospedeiro vertebrado (preferencialmente mamífero).

Outras técnicas adequadas envolvem a seleção de bibliotecas de anticorpos recombinantes em fagos ou vetores similares (ver, por exemplo, Huse e outros (1989) Sdence 246: 1275-1281; Ward e outros (1989) Nature 341: 544-546; e Vaughan e outros (1996) Nature Biotechnology 14: 309-314). (3) Imunoensaios Uma vez que um soro imunológico ou um anticorpo monoclonal que reconhece um ou mais antígenos de Neisseria é obtido, este pode ser obtido para realizar imunoensaios. Para uma revisão de procedimentos imunológicos e de imunoensaios em geral, ver D. Stites e A. Terr, (eds.), Supra. Além disso, os imunoensaios da presente invenção podem ser realizados em qualquer uma das várias configurações, que são revisadas extensivamente em ΕΝΖΥΜΕ IMMUNOASSAY, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Flórida (1980); "Practice and Theory of Enzyme Immunoas-says," P. Tijssen, em LABO RATO RY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier Science Publishers B. V. Amsterdam (1985); e Harlow e Lane, supra, dos quais cada um é incorporado aqui como referência.

Por exemplo, os imunoensaios de ELISA em fase sólida são utilizados rotineiramente para selecionar anticorpos monoclonais especificamente imunorreativos com um antígeno. Ver Harlow e Lane, Supra.

Os antisoros imunoabsorvidos e/ou agrupados (ou anticorpos monoclonais) são também utilizados em um ensaio imunológico de ligação direta ou competitiva. O último compara a ligação de uma segunda composição de antígenos (por exemplo MVs, OMVs, antígenos isolados ou com- posições de antígenos provenientes de uma cepa de Neisseria diferente desconhecida ou conhecida) com a da composição de antígenos de referência utilizada para ativar a imunidade protetora. Com a finalidade de fazer esta comparação no ensaio competitivo, as duas preparações de antígenos são cada uma analisadas em uma faixa ampla de concentrações e é determinada a quantidade de cada molécula necessária para inibir 50% da ligação do antisoro com a preparação de antígenos de referência imortalizada. Se a quantidade da segunda proteína necessária for menor que 10 vezes a quantidade do peptídeo de referência utilizado para produzir o anticorpo, então diz-se que a segunda proteína se liga especificamente a um anticorpo gerado para a preparação de antígenos de referência. (b) Western Blots A análise de Western blot compreende geralmente a separação dos produtos da amostra por eletroforese em gel com base no peso molecular, transferindo as proteínas separadas para um suporte sólido adequado (tal como um filtro de nitrocelulose, um filtro de náilon ou filtro derivado de náilon) e incubando a amostra com anticorpos de marcação que se ligam especificamente com a proteína de análise. Os anticorpos de marcação se ligam especificamente ao analito no suporte sólido. Estes anticorpos são marcados diretamente ou alternativamente são detectados utilizando agentes de marcação tais como anticorpos (por exemplo anticorpos anticamun-dongo de ovelha quando o anticorpo para um analito é um anticorpo murino) que se ligam especificamente ao anticorpo de marcação. 4. Purificação de Antígenos Imunogênicos Os antígenos podem ser isolados (separados de uma ou mais moléculas com as quais o antígeno está associado in vivo) e purificados (um antígeno purificado, por exemplo uma proteína, preferencialmente exibe essencialmente uma banda única em um gel eletroforético para cada subuni-dade dissociável do antígeno) e utilizados para ativar uma imunidade protetora.

Os antígenos individuais, especialmente proteínas e fragmentos peptídicos das mesmas, podem ser purificados através de qualquer uma de uma variedade de técnicas conhecidas, incluindo, por exemplo, a cromato-grafia Iíquida de alto desempenho (HPLC) de fase inversa, a cromatografia de troca iônica ou por imunoafinidade, separação por tamanho ou eletrofo-rese (ver, geralmente, Scopes, R. Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982)). Por exemplo, os antígenos provenientes da Neisseria meningitidis spp. que são reconhecidos por antisoros de amplo espectro obtidos após injeções em série de OMVs e/ou de MVs obtidas de Neisseria meningitidis spp. diferentes são obtidos utilizando antisoros de amplo espectro para gerar preparações de antígenos enriquecidas. Os antígenos isolados podem ser também preparados através da imunoprecipitação de uma fração obtida da Neisseria meningitidis spp. Os antígenos podem ser também isolados através da conjugação dos antisoros imunológicos ou dos anticorpos mono-clonais a uma coluna e realizando uma cromatografia por afinidade. A fonte dos antígenos pode ser um lisado de células inteiras obtido por métodos conhecidos, por exemplo através de ultra-som ou alternativamente através da exposição a um detergente iônico ou não-iônico ou a fonte pode ser MVs ou OMVs de uma cepa de Neisseria. 5. Antígenos Peptídicos Além disso, uma vez que a identidade dos antígenos protéicos e/ou dos epitopos peptídicos específicos é estabelecida, as preparações de antígenos de Neisseria meningitidis spp. adequadas para a indução da imunidade protetora na presente invenção podem ser geradas através da síntese dos peptídeos por técnicas convencionais e da injeção das preparações dos peptídeos sintéticos em um mamífero. As técnicas para a síntese de peptídeos são bem-conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Stewart e Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Rockford, III. Pierce), 2- Ed. (1984) e Kent, 1988, Annu. Rev. Biochem. 57:957.

Alternativamente, as seqüências de ácido nucléico que codificam o polipeptídeo particular pode ser clonado e expressado para prover o peptídeo. Técnicas padrão podem ser usadas para obter e classificar bibliotecas de ácido nucléico para identificar seqüências codificando as seqüências desejadas (ver Sambrook etal., Molecular Cloning - A Laboratory Ma- nual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989), ou ácidos nucléicos que codificam peptídeos desejados podem ser sintetizados por métodos conhecidos. Proteínas de fusão (consistem em todas ou parte das sequências de aminoácidos de duas ou mais proteínas) podem ser recombinantemente produzidas. Além disso, usando técnicas de muta-gênese in vitro, proteínas não relacionadas podem ser modificadas para compreender as seqüências apropriadas.

Será entendido que os antígenos imunogênicos da presente invenção podem ser modificados para prover uma variedade de atributos desejados, por exemplo, características farmacêuticas melhoradas, enquanto aumenta-se ou pelo menos, retém-se substancialmente toda a atividade biológica do peptídeo não-modificado. Por exemplo, os peptídeos podem ser modificados extendendo, diminuindo a seqüência de aminoácido do peptídeo. Substituições com diferentes aminoácidos ou aminoácidos miméticos podem também, ser feitas.

Os peptídeos empregados na matéria da invenção não precisam ser idênticos ao revelado nos exemplos da seção abaixo (por exemplo, em relação ao peso molecular), contanto que os peptídeos da matéria sejam capaz de induzir uma resposta imune contra a molécula de antígeno desejado. Assim, um versado na técnica reconhecerá que um número de substituições conservadoras (descrita em mais detalhes abaixo) pode ser feito sem afetar substancialmente a atividade do peptídeo.

Substituições de aminoácidos simples, deleções ou inserções podem ser usadas para determinar quais resíduos são relativamente insensíveis a modificação. Substituições são preferencialmente feitas com pequenas partes relativamente neutras tais como Ala, Gly, Pro ou resíduos similares. O efeito das substituições de aminoácidos simples pode também ser sondado usando D-aminoácidos. Os números e tipos de resíduos que são substituídos ou adicionados dependendo do espaço necessário entre pontos de contato essenciais e atributos funcionais certos, os quais são procurados (por exemplo, hidrofobicidade versus hidrofilicidade). Imunoge-nicidade aumentada pode ser alcançada por tais substituições, comparadas com o peptídeo parental. Em qualquer evento, tais substituições devem empregar resíduos de aminoácidos ou outros fragmentos moleculares escolhidos para evitar, por exemplo, interferência estérica e de carga que poderia interromper a ligação.

Os aminoácidos para substituição, entretanto, não precisam estar limitados aos que ocorrem naturalmente nas proteínas, tais como os aminoácidos L-α ou seus isômeros D. Os peptídeos podem ser substituídos por uma variedade de porções tais como miméticos de aminoácidos bem-conhecidos pelos versados na técnica. (Ver, por exemplo, a Patente U.S. N5 6.030.619).

Os resíduos individuais dos polipeptídeos antigênicos imunogê-nicos podem ser incorporados no peptídeo através de uma ligação peptídica ou de um mimético de ligação peptídica. Um mimético de ligação peptídica da invenção inclui modificações na estrutura principal do peptídeo bem-conhecidas pelos versados na técnica. Tais modificações incluem modificações do nitrogênio da amida, do carbono a, da carbonil amida, a substituição completa da ligação amida, extensões, deleções ou ligações cruzadas na estrutura principal. Ver, geralmente, Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. VII (Weinstein ed., 1983). São conhecidas várias modificações da estrutura principal do peptídeo. Estas incluem \|/[CH2S], ψ[ΟΗ2ΝΗ], \|/[CSNH2], ψ[ΝΗΟΟ], ψ[ΟΟΟΗ2] e ψ[(Ε) ou (Z) CH=CH], A nomenclatura utilizada acima segue a sugerida por Spatola, acima. Neste contexto, ψ indica a ausência de uma ligação amida. A estrutura que substitui o grupo amida está especificada entre parênteses.

Os miméticos de aminoácidos podem ser também incorporados nos peptídeos. Um "mimético de aminoácido" como é utilizado aqui é uma porção sem ser um aminoácido que ocorre naturalmente que serve confor-macionalmente e funcional mente como um substituto para um aminoácido em um polipeptídeo da presente invenção. Tal porção serve como um substituto para um resíduo de aminoácido se este não interferir com a capacidade do peptídeo de ativar uma resposta imunológica contra o antígeno apropriado. Os miméticos de aminoácidos podem incluir aminoácidos não- protéicos, tais como β-γ-δ-aminoácidos, β-γ-δ-iminoácidos (tal como o ácido piperidina-4-carboxílico), assim como muitos derivados de L-a-aminoácidos. Um número de miméticos de aminoácidos adequados é conhecido pelo versado na técnica; estes incluem a ciclohexilalanina, o ácido 3-ciclohexil-propiônico, a L-adamantil alanina, o ácido adamantilacético e similares. Os miméticos de peptídeos adequados para os peptídeos da presente invenção são discutidos por Morgan e Gainor, (1989) Ann. Repts. Med. Chem. 24:243-2526.

Como observado anteriormente, os peptídeos empregados na presente invenção não precisam ser idênticos, mas podem ser substancialmente idênticos, à seqüência correspondente do antígeno alvo. Portanto, os peptídeos podem ser submetidos a várias alterações, tais como inserções, deleções e substituições, conservativas ou não consevativas, onde tais alterações poderiam fornecer certas vantagens em seu uso. Os polipeptídeos da invenção podem ser modificados em um número de maneiras contanto que compreendam uma seqüência substancialmente idêntica (que é definida abaixo) a uma seqüência na região alvo do antígeno. O alinhamento e a comparação de seqüências de aminoácidos relativamente curtas (menores que aproximadamente 30 resíduos) é tipicamente fácil. A comparação de seqüências mais longas pode requerer métodos mais sofisticados para se conseguir o alinhamento ótimo das duas seqüências. O alinhamento ótimo das seqüências para o alinhamento de uma janela de comparação pode ser conduzido através do algoritmo de homolo-gia local de Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, através do algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, através do método de busca de similaridade de Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 85:2444, através de implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wísconsin Genetics Software Package Versão 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl) ou pela inspeção e é selecionado o melhor alinhamento (isto é que resulta na porcentagem mais alta de similaridade de seqüência ao longo da janela de comparação) gerado pelos vários métodos.

Os termos "idêntico" ou "identidade" por cento, no contexto de dois ou mais ácidos nucléicos ou seqüências polipeptídicas, referem-se a duas ou mais seqüências ou subseqüências que são a mesma ou que possuem uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou de nucleotídeos que é a mesma, quando comparadas e alinhadas para a correspondência máxima, que é medida utilizando um dos algoritmos para comparação de seqüências a seguir ou através de inspeção visual. A frase "substancialmente idêntica", no contexto de dois ácidos nucléicos ou polipeptídeos, refere-se a duas ou mais seqüências ou subseqüências que possuem pelo menos 60%, preferencialmente 80%, mais preferencialmente 90-95% de identidade de resíduos de nucleotídeos ou de aminoácidos, quando comparadas e alinhadas para a correspondência máxima, que é medida utilizando um dos algoritmos para comparação de seqüências a seguir ou através de inspeção visual. Preferencialmente, a identidade substancial existe ao longo de uma região das seqüências que possui pelo menos aproximadamente 50 resíduos de comprimento, mais preferencialmente ao longo de uma região com pelo menos aproximadamente 100 resíduos e mais preferencialmente as seqüências são substancialmente idênticas ao longo de pelo menos aproximadamente 150 resíduos. Em uma modalidade mais preferida, as seqüências são substancialmente idênticas ao longo do comprimento total das regiões codificadoras.

Para a comparação de seqüências, tipicamente uma seqüência atua como uma seqüência de referência, a qual as seqüências para teste são comparadas. Quando se utiliza um algoritmo para comparação de seqüência, as seqüências para teste e de referência são introduzidas em um computador, as coordenadas da subseqüência são determinadas, se necessário e são determinados os parâmetros do programa de algoritmo de seqüência. O algoritmo para comparação de seqüência então calcula a identidade percentual de seqüência para a(s) seqüência(s) para teste em relação à seqüência de referência, com base nos parâmetros determinados do programa. O alinhamento ótimo de seqüências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, através do algoritmo de homologia local de Smith & Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), através do algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970), através do método de busca de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:2444 (1988), através de implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wiscon-sin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl) ou pela inspeção visual (ver geralmente, Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel e outros, eds., Current Protocols, um "joint venture" entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (1995 Suplemento) (Ausubel)).

Os exemplos de algoritmos que são adequados para a determinação da identidade de seqüência e da similaridade de seqüência percentuais são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul e outros (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 e Altschuel e outros (1977) Nu-cleic Acids Res. 25: 3389-3402, respectivamente. O software para realizar as análises de BLAST está disponível ao público através do National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve uma primeira identificação de pares de seqüências com escore alto (HSPs) através da identificação de palavras curtas de comprimento W na seqüência de indagação, que combinam ou satisfazem algum escore T de entrada de valor positivo quando alinhados com uma palavra do mesmo comprimento em uma seqüência do banco de dados. T é referido como o escore de entrada da palavra de vizinhança (Altschul e outros, supra).

Estes encontros iniciais com a palavra de vizinhança atuam como sementes para o começo das buscas para encontrar HSPs mais longos que os contêm. Os encontros com as palavras são então extendidos em ambas as direções ao longo de cada seqüência durante e tão longe quanto o escore do alinhamento cumulativo puder ser aumentado. Os escores cumulativos são calculados utilizando, para as seqüências de nucleotídeos, os parâmetros M (escore de recompensa para um par de resíduos que combi- na; sempre > 0) e N (escore de penalidade para resíduos mal pareados; sempre < 0). Para as seqüências de aminoácidos, é utilizada uma matriz para escore para calcular o escorecumulativo. A extensão dos encontros da palavra em cada direção é interrompida quando: o escore do alinhamento cumulativo diminui para a quantidade X de seu valor máximo alcançado; o escore cumulativo vai para zero ou menos, por causa do acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos de escore negativo; ou o final de qualquer uma das seqüências é atingido. Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para seqüências nucleotídicas) utiliza como parâmetros predeterminados um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambos os filamentos. Para as seqüências de aminoácidos, o programa BLASTP utiliza como parâmetros predeterminados um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10 e a matriz para escore BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915 (1989)).

Em adição ao cálculo da identidade de seqüência percentual, o algoritmo BLAST realiza ainda uma análise estatística da similaridade entre duas seqüências (ver, por exemplo, Karlin & Altschul, Proc. Natl Acad. Sei. USA 90:5873-5787 (1993)). Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo de BLAST é a probabilidade da menor soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade através da qual uma combinação entre duas seqüências de nucleotídeos ou de aminoácidos ocorrería ao acaso. Por exemplo, um ácido nucléico é considerado similar a uma seqüência de referência se a probabilidade da menor soma em uma comparação do ácido nucléico de teste ao ácido nucléico de referência for menor que aproximadamente 0,1, mais preferencialmente menor que aproximadamente 0,01 e mais preferencialmente menor que aproximadamente 0,001.

Uma indicação adicional de que duas seqüências de ácido nucléico ou de polipeptídeos são substancialmente idênticas é que o poli-peptídeo codificado pelo primeiro ácido nucléico reage imunologicamente de forma cruzada com o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucléico, como é descrito abaixo. Assim, um polipeptídeo é tipicamente substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, quando os dois peptídeos diferem somente em substituições conservativas. Uma outra indicação de que duas seqüências de ácido nucléico são substancialmente idênticas é que as duas moléculas se hibridizam uma com a outra sob condições rigorosas, como é descrito abaixo.

Preferencialmente, as posições dos resíduos que não são idênticos diferem em substituições de aminoácidos conservativas. As substituições de aminoácidos conservativas referem-se à capacidade de intercâmbio de resíduos que possuem cadeias laterais similares. Por exemplo, um grupo de aminoácidos que possui cadeias laterais alifáticas é constituído pela gli-cina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos que possui cadeias laterais hidroxil alifáticas é constituída pela serina e treoni-na; um grupo de aminoácidos que possui cadeias laterais contendo amida é constituído pela asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos que possui cadeias laterais aromáticas é constituído pela fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos que possui cadeias laterais básicas é constituído pela lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos que possui cadeias laterais contendo enxofre é constituído pela cisteína e meti-onina. Os grupos de substituições de aminoácidos conservativos preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina e asparagina-glutamina.

Os polipeptídeos abrangidos pela invenção compreendem tipicamente pelo menos aproximadamente 10 resíduos e mais preferencialmente pelo menos aproximadamente 15 resíduos, preferencialmente de um domínio do antígeno que fica exposto ao sistema imunológico. Em certas modalidades os peptídeos não excederão aproximadamente 50 resíduos e tipicamente não excederão aproximadamente 30 resíduos.

Os peptídeos imunogênicos estão confinados conformacional-mente. Os meios para conseguir isto são bem-conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Hruby e Bonner em Methods in Molecular Biology, Volume 35: Peptide Synthesis Protocols, Pennington e Dunn eds (Humana Press, To- towa, NJ, 1994)). Um meio preferido para preparar peptídeos confinados estruturalmente é através da ciclização. Qualquer método comumente utilizado para produzir oligopeptídeos ciclizados pode ser utilizado para produzir os peptídeos da invenção. Por exemplo, em certas modalidades os peptídeos incluirão resíduos de cisteína em ambos os terminais, o que permite a produção de peptídeos cíclicos através de ligações dissulfeto. O tratamento de tal peptídeo com um agente oxidante tal como oxigênio, iodo ou um agente similar produzirá um peptídeo cíclico que pode ser purificado adicionalmente utilizando métodos cromatográficos ou outros de purificação química. A construção de peptídeos cíclicos pode ser também realizada através de ligações tioéter. Por exemplo, os peptídeos derivados de N-bromoacetila podem ser reagidos com resíduos contendo sulfidrila, tal como a cisteína. A ciclização ocorre através da reação da sulfidrila livre da cisteína no peptídeo com o grupo bromo acetila para formar uma ligação tioéter (Robey e outros, Anal. Biochem. 177: 373-7 (1989) e Patente U.S. N9 5.066.716).

Outros métodos de construção de peptídeos cíclicos são conhecidos pelos versados na técnica. Estes incluem ciclizações cadeia lateral-cadeia lateral, cadeia lateral-cadeia principal e cadeia principal-cadeia principal. Em adição, podem ser utilizados ligantes para unir os terminais amino e carboxila de um peptídeo. O ligante é capaz de formar ligações covalentes com ambos os terminais amino e carboxila. Os ligantes adequados são bem-conhecidos pelos versados na técnica e incluem, mas não estão limitados aos ligantes de carbono de cadeia reta ou ramificada, aos ligantes de carbono heterocíclico ou aos ligantes peptídicos. Os ligantes podem estar unidos aos aminoácidos dos terminais carboxila e amino através de seus grupos laterais (por exemplo através de uma ligação dissulfeto à cisteína) ou através dos grupos amino e carboxila do carbono alfa dos aminoácidos terminais.

Para uma discussão geral de métodos adequados para ciclização, ver Hruby e Bonner em Methods in Molecular Biology, Volume 35: Peptide Synthesis Protocols, Pennington e Dunn eds (Humana Press, To- tawa, NJ, 1994). Por exemplo, as ciclizações podem incluir a formação de análogos de carba e tioéteres (Lebl e outros em Peptides 1986 Proceedings of the 19th European Peptide Symposium pp. 341-344; Robey e outros, Anal. Biochem. 177: 373-7 (1989) e Patente U.S. N9 5.066.716), bis-tioéteres (Mosberg e outros, JACS 107: 2986-2987 (1985)), azopeptídeos (Siemion e outros Mol. Cell. Biochem. 34:(1991)) e outras estruturas cíclicas, tais como estruturas formadoras de pontes (Charpentier, M. e outros, J. Med. Chem. 32(6): 1184-1190 (1989), Thaisrivongs, S. e outros, J. Med. Chem. 34(4): 127 (1991) e Ozeki, E. e outros, Int. J. Peptide Protein Res. 34:111 (1989)). Pode ser também utilizada a ciclização de posições da estrutura principal-para-estrutura principal. A formação de pontes é um tipo especial de ciclização em que sítios distantes em um peptídeo são unidos utilizando moléculas ou fragmentos separados que formam pontes. As moléculas formadoras de pontes podem incluir, por exemplo, moléculas do anidrido succínico (Charpentier, B. e outros, supra) e fragmentos de carboximetileno (Thaisrivongs, S. e outros, supra). A formação de pontes por metais pode ser também utilizada (Ozeki, E. e outros, supra).

Em algumas modalidades, os peptídeos incluem dois ou mais resíduos de cisteína. As cisteínas podem ser substituídas ou adicionadas dentro do peptídeo ou em qualquer um dos terminais. A posição das cisteínas não é crítica contanto que possam se formar ligações dissulfito entre elas o que permite a produção de peptídeos cíclicos. Por exemplo, o tratamento de tal peptídeo com um agente oxidante tal como oxigênio, iodo ou agente similar produzirá um peptídeo cíclico que pode ser adicionalmente purificado utilizando métodos cromatográficos ou outros de purificação química.

As modalidades adicionais incluem peptídeos que contêm se-qüências antigênicas de sequências de proteínas que foram incorporadas nos peptídeos que se dobram independentemente (Regan & DeGrado, 1988, Science 241:976; Mutter, 1988, TIBS 13:260; Kamtekar e outros, 1993, Science 262:1680; Sieber & Moe, 1996, Biochemistry 35:181; Butcher & Moe, 1996, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:1135; FitzGerald e outros, 1998, Biochemistry 273:9951). Os peptídeos que se dobram independentemente podem ser os que ocorrem naturalmente ou os de planejamento de novo.

Os peptídeos capazes de ativar uma imunidade protetora similar à da vacina CHORI poderíam ser também obtidos através da utilização de anticorpos monoclonais produzidos através da imunização com o antígeno de CHORI ou similar para selecionar miméticos moleculares de bibliotecas de peptídeos exibidos por fagos ou de outras bibliotecas combinatórias tais como moléculas ou ácidos nucléicos pequenos.

Em adição ao uso de peptídeos, os anticorpos produzidos contra os peptídeos da invenção podem ser utilizados para inibir respostas in-flamatórias. Os anticorpos podem ser produzidos para os peptídeos da presente invenção utilizando técnicas bem-conhecidas pelos versados na técnica. Podem ser também gerados anticorpos antiidiotípicos. A discussão a seguir é apresentada como um panorama geral das técnicas disponíveis; entretanto, um versado na técnica reconhecerá que são conhecidas muitas variações sobre os métodos a seguir.

Freqüentemente, os peptídeos e os anticorpos da invenção serão marcados através da ligação, covalentemente ou não covalentemente, de uma substância que fornece um sinal que pode ser detectado. É conhecida uma ampla variedade de marcações e técnicas de conjugação e são reportadas extensivamente tanto na literatura científica quanto de patentes. As marcações adequadas incluem radionucleotídeos, enzimas, substratos, co-fatores, inibidores, porções fluorescentes, porções quimioluminescentes, partículas magnéticas e similares. As patentes que ensinam o uso de tais marcações incluem as Patentes U.S. N055 3,817,837, 3,850,752, 3,939,350, 3,996,345, 4,277,437, 4,275,149 e 4,366,241. Podem ser também produzidas imunoglobulinas recombinantes. Ver Cabilly, Patente U.S. N9 4.816.567; e Queen e outros (1989) Proc. Nat‘l Acad. Sei. USA 86: 10029-10033. 6. Imunidade Passiva Os anticorpos imunoprotetores que reconhecem epitopos de Neisseríal podem ser também administrados a um organismo (por exemplo um paciente humano) para induzir uma imunidade passiva contra uma doença causada por Neisserial para prevenir que a infecção ou que a doença ocorra ou como uma terapia para melhorar o resultado clínico em pacientes com a doença estabelecida (por exemplo taxa de complicação diminuída tal como choque, taxa de mortalidade diminuída ou morbidade diminuída, tal como surdez).

Os anticorpos administrados a um organismo sem ser a espécie em que estes foram produzidos são freqüentemente imunogênicos. Assim, por exemplo, os anticorpos murinos ou suínos administrados a um ser humano induzem uma resposta imunológica contra o anticorpo. As propriedades imunogênicas do anticorpo são reduzidas através da alteração de partes ou de todo o anticorpo em seqüências caracteristicamente humanas produzindo desta maneira anticorpos quiméricos ou humanos, respectivamente.

Os anticorpos quiméricos são moléculas de imunoglobulina que compreendem uma parte humana e uma não-humana. Mais especificamente, a região de combinação do antígeno (ou região variável) de um anticorpo quimérico humanizado é derivada de uma fonte não-humana (por exemplo murino) e a região constante do anticorpo quimérico (que confere a função efetora biológica à imunoglobulina) é derivada de uma fonte humana. O anticorpo quimérico deve possuir a especificidade de ligação ao antígeno da molécula de anticorpo não-humana e a função efetora conferida pela molécula de anticorpo humana. Um grande número de métodos para produção de anticorpos quiméricos é bem-conhecido pelos versados na técnica (ver, por exemplo, as Patentes U.S. N08 5,502,167, 5,500,362, 5,491,088, 5,482,856, 5,472,693, 5,354,847, 5,292,867, 5,231,026, 5,204,244, 5,202,238, 5,169,939, 5,081,235, 5,075,431 e 4,975,369). Uma abordagem alternativa é a produção de anticorpos humanizados através da ligação das regiões CDR de anticorpos não-humanos a regiões constantes humanas através de técnicas do DNA recombinante. Ver Queen e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 10029-10033 (1989) e WO 90/07861.

Em uma modalidade preferida, o vetor de DNA recombinante é utilizado para transfectar uma linhagem de células que produz um anticorpo contra um peptídeo da invenção. O novo vetor de DNA recombinante contém um "gene de substituição" para substituir todo ou uma parte do gene que codifica a região constante da imunoglobulina na linhagem de células (por exemplo um gene de substituição pode codificar toda ou uma parte de uma região constante de uma imunoglobulina humana ou de uma classe de imunoglobulina específica) e uma "seqüência alvo" que permite a recombi-nação homóloga direcionada com as seqüências de imunoglobulina dentro da célula produtora de anticorpos.

Em uma outra modalidade, um vetor de DNA recombinante é utilizado para transfectar uma linhagem de células que produz um anticorpo que possui uma função efetora desejada (por exemplo uma região constante de uma imunoglobulina humana), em cujo caso, o gene de substituição contido no vetor recombinante pode codificar toda ou uma parte de uma região de um anticorpo e a seqüência alvo contida no vetor recombinante permite a recombinação homóloga e a modificação do gene direcionado dentro da célula produtora de anticorpos. Em uma outra modalidade, quando apenas uma parte da região variável ou constante é substituída, o anticorpo quimé-rico resultante pode definir o mesmo antígeno e/ou possuir a mesma função efetora também alterada ou melhorada de forma que o anticorpo quimérico possa demonstrar uma maior especificidade ao antígeno, uma maior constante de afinidade de ligação, uma função efetora aumentada ou uma secreção e produção aumentadas pela linhagem de células produtoras de anticorpos transfectadas etc.

Em uma outra modalidade, esta invenção fornece anticorpos totalmente humanos. Os anticorpos humanos consistem inteiramente de seqüências polipeptídicas caracteristicamente humanas. Os anticorpos desta invenção podem ser produzidos através de uma ampla variedade de métodos (ver, por exemplo, Larrick e outros, Patente U.S. N5 5.001.065). Em uma modalidade, os anticorpos humanos da presente invenção são produzidos inicialmente em células de trioma (descendentes de três células, duas humanas e uma de camundongo). Os genes que codificam os anticorpos são então clonados e expressos em outras células, particularmente células de mamíferos não-humanos. A abordagem geral para a produção de anticorpos humanos através da tecnologia de triomas foi descrita por Ostberg e outros (1983), Hybridoma 2:361-367, Ostberg, Patente U.S. N5 4.634.664 e Engel-man e outros, Patente U.S. NQ 4.634.666. Foi descoberto que os triomas produzem anticorpos de forma mais estável do que os hibridomas comuns produzidos partindo de células humanas.

Os métodos para produzir e formular os anticorpos adequados para a administração a um indivíduo (por exemplo, um indivíduo humano) são bem-conhecidos na técnica. Por exemplo, os anticorpos podem ser fornecidos em uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de um anticorpo e excipientes farmacêuticos (por exemplo, solução salina). A composição farmacêutica pode incluir opcionalmente outros aditivos (por exemplo, tampões, agentes estabilizantes, preservantes e similares). Uma quantidade eficaz de anticorpo é geralmente uma quantidade eficaz para fornecer proteção contra uma doença ou sintomas causados por Neisseria durante um período desejado, por exemplo, um perído de pelo menos aproximadamente 2 dias até 10 dias ou 1 mês até 2 meses). 7. Ensaios para Diagnóstico Os antígenos ou os anticorpos da invenção podem ser também utilizados com a finalidade de diagnósticos. Por exemplo, os peptídeos podem ser utilizados para selecionar soros pré-imunológicos e imunológicos para garantir que a vacinação foi eficaz. Os anticorpos podem ser também utilizados em imunoensaios para detectar a presença de moléculas de antígenos particulares associadas com a doença causada por Neisserial. EXEMPLOS É entendido que os exemplos e as modalidades descritas aqui têm somente a finalidade de ilustração e que serão sugeridas várias modificações ou alterações à luz dos mesmos pelos versados na técnica e devem ser incluídos dentro do espírito e do limite deste pedido de patente e do âmbito das reivindicações em anexo. Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes citados aqui são incorporados aqui como referência em sua totalidade para todas as finalidades. A. Preparações de membrana As cepas para a preparação de OMVS e MVs foram selecionadas com base no sorogrupo, no sorotipo e no sorossubtipo. As cepas que foram utilizadas na preparação de MVs foram selecionadas em relação a níveis relativamente altos de formação de vesículas e de expressão de NspA (ver Moe e outros (1999 Infect. Immun. 67: 5664)). Os exemplos de cepas utilizadas na preparação de OMVs e de MVs foram depositadas na American Type Culture Collection (ATCC; ver abaixo). As cepas que produzem altos níveis de vesículas, cujas cepas são particularmente úteis na produção de MV, podem ser selecionadas ou são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, WO 01/34642). A cepa meningocóccica congelada a -80°C em leite desnatado aquoso a 2% (p/v) foi subcultivada em uma placa de ágar de chocolate comercial (Remei, Laztakas, KS). Após o crescimento durante a noite a 37°C em CO2 4%, foram selecionadas várias colônias para inocular ~7 mL de caldo Mueller-Hinton estéril a uma DO620nm de 0,1. A cultura foi incubada a 37°C, C02 a 4% com agitação até a DC>62onm atingir 0,6-0,8 (duas a três horas). Duas a três culturas de partida de 7 mL foram então utilizadas para inocular 500 mL de caldo Mueller-Hinton. A cultura maior foi cultivada até uma DO620nm de 0,9-1,0 a 37°C com agitação vigorosa. O fenol é adicionado à cultura até uma concentração final de 0,5% (p/v) e a mistura é mantida a 4°C durante a noite para inativar as bactérias. As células foram então pele-tizadas através de centrifugação (11.000 x g) durante 30 min a 4°C. Os pé-letes de células foram congeladas a -20°C até serem utilizadas para a preparação de vesículas de proteínas de membrana externa (OMV).

As microvesículas (MV) foram coletadas do sobrenadante de cultura de células tratadas com fenol através da adição de sulfato de amô-nio sólido (concentração final de 390 g/L) lentamente com agitação. Após o sulfato de amônio ter sido adicionado e completamente dissolvido, a mistura foi mantida a 4°C durante a noite. As MVs precipitadas foram então coletadas através de centrifugação a 11.000 x g durante 30 min. O pélete de MV precipitado foi ressuspenso em 0,04 volume de PBS e centrifugado novamente a 16.000 x g durante 15 min a 4°C. O pélete foi descartada e as MVs, que permaneceram no sobrenadante, foram coletadas através de centrifu-gação a 100.000 x g durante 2 hs a 4°C. O pélete final foi ressuspensao em 0,01 volume (isto é 5 mL por 500 mL de cultura) de água (preparação de vacina de "MV"). Alternativamente, o pélete foi ressuspenso em Tris.HCI 0,1 M, pH 8,6, contendo EDTA 10 mM e desoxicolato de sódio 0,5% (p/v) (~3 ml_/500 mL de cultura de células). Após a agitação (30 min), a mistura foi centrifugada (125.000 x g, 2 hs, 4°C). O sobrenadante foi descartado e o pélete ressuspenso em 1 mL de sacarose 3% (preparação de vacina de "DOC MV"). A concentração de proteína das preparações de MV e de DOC MV foi determinada através do ensaio de BCA (Pierce Chemical Co., Ro-ckford, IL). As suspensões de MV e de DOC MV foram então congeladas em gelo seco e armazenadas a -20°C até serem utilizadas para imunização.

As vesículas de membrana externa (OMV) foram preparadas através do método de Zollinger e outros (1979 J. Clin. Invest. 63: 836-848). O pélete de células congeladas foi ressuspensa em 10 mL de tampão Tris.HCI 0,05 M, pH 7,4 contendo NaCI 0,15 M e EDTA 0,01 M e então aquecida até 56°C durante 30 min seguidos por resfriamento em gelo. A suspensão de células foi então submetida a ultra-som em gelo com várias explosões de 15 segundos utilizando um sonificador em microssonda (Bran-son, Danbury, CT). Os restos celulares foram removidos através de centri-fugação a 16.000 x g durante 15 min e as vesículas de membrana externa (OMVs) no sobrenadante foram obtidas através da ultracentrifugação a 100.000 x g durante 2 hs a 4°C. O pélete de OMV foi ressuspensa em 2 mL de água (preparação de vacina de "OMV"). Alternativamente, a pélete de células congeladas foi ressuspenso em Tris.HCI 0,1 M, pH 8,6, contendo EDTA 10 mM e desoxicolato de sódio 0,5% (p/v). Após a agitação durante 30 min à temperatura ambiente, a mistura foi centrifugada (20.000 x g, 30 min, 4°C). O sobrenadante foi mantido e o pélete foi reextraído e centrifugado novamente com um terço do volume do mesmo tampão. Os sobrena-dantes de ambas as extrações foram combinados e centrifugados (125.000 x g, 2 hs, 4°C). 0 sobrenadante foi descartado e o pélete foi ressuspenso em 5 ml_ de sacarose 3% (preparação de vacina de "DOC OMVM). As preparações de vacina de OMV e de DOC OMV foram congeladas em gelo seco e armazenadas a -20°C até serem utilizadas para imunização. A concentração das proteínas das preparações de OMV e de DOC OMV foi determinada por BCA (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). B. Programa de imunização As preparações de MV ou de OMV foram diluídas em PBS e misturadas com um volume equivalente de adjuvante completo de Freund (CFA; Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) ou hidróxido de alumínio (Alhydrogel 1,3% da Superfos Biosector, Frederikssund, Dinamarca) ou fosfato de alumínio (Alhydrogel que foi incubado com tampão PBS durante pelo menos 3 hs). Em algumas preparações de vacina, os nucleotídeos CpG ^'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-S' (SEQ ID Ng: 1) Chiron Corp., Emeryvi-lle, CA) foram adicionados à mistura fosfato de alumínio/antígeno a uma concentração final de 100 μg/mL como um adjuvante secundário. Os ca-mundongos foram imunizados pelas rotas IP (CFA) ou SC (fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio) com 100 μΙ_ contendo entre 5 até 25 microgra-mas de proteína total da MV preparada partindo da cepa meningocóccica RM1090. Em intervalos de 3 a 4 semanas foram fornecidas duas doses de reforço subseqüentes (5-25 microgramas/camundongo) com o adjuvante incompleto de Freund (IFA) ou com hidróxido de alumínio ou com fosfato de alumínio (preparado como descrito acima) através das rotas IP ou SC, res-pectivamente, das primeiras MVs preparadas partindo da cepa menigocóc-cica BZ198 e então das OMVs preparadas partindo da cepa meningocóccica Z1092. A imunização seqüencial com três cepas meningocóccicas diferentes, que eram geneticamente diferentes em relação ao seu sorogrupo, sorotipo e sorossubtipo e outros antígenos constitui o que é chamado posteriormente aqui de "vacina CHORI". Em um segundo experimento, um outro grupo de camundongos foi imunizado com a vacina CHORI como descrito acima exceto pelo fato de que os oligonucleotídeos CpG não foram utilizados como um segundo adjuvante e o experimento incluiu camundongos que receberam a vacina CHORI combinada com o adjuvante hidróxido de alumínio e os camundongos que receberam três injeções de uma mistura de MV/OMV descrita anteriormente junto com fosfato de alumínio. Em um terceiro experimento, os grupos de porquinhos-da-índia receberam imunizações seqüenciais com os antígenos da vacina CHORI ou três injeções de uma mistura de antígenos da vacina CHORI combinada com fosfato de alumínio. C. SDS-PAGE e Western blots As preparações de proteína foram analisadas utilizando SDS-PAGE a 15% como é descrito por Laemmli (1970 Nature 227: 680-685) empregando um aparelho para eletroforese Mini-Protean II (BioRad, Richmond, CA). As amostras foram suspensas em tampão de amostra contendo SDS (Tris.HCI 0,06 M, pH 6,8, glicerol 10% (v/v), SDS 2% (p/v), 2-mercaptoetanol 5% (v/v), 10 microgramas/mL de azul de bromofenol) e opcionalmente aquecidas a 100°C durante 1 min antes de carregar diretamente no gel.

A Figura 2 mostra um gel de SDS-PAGE a 15% corado com Co-omassie das proteínas presentes na MV da cepa Z1092 (faixa 2) ou nas preparações de OMV da cepa Z1092 (faixa 4) ou das respectivas preparações após terem sido extraídas com desoxicolato de sódio 0,5% (p/v) (isto é DOV MV [faixa 3] e DOC OMV [faixa 5]) como descrito por Fredricksen e outros (1991, NIPH Ann. 14: 67-79). As quatro preparações correspondentes produzidas partindo das cepas meningocóccicas BZ198 e RM1090 (são mostradas nas faixas 6 até 13, respectivamente). É sabido que as cinco proteínas, PorA, PorB, Rmp, Opa e Opc, constituem as proteínas de membrana externa principais de Neisseria meningitidis. Todas as preparações parecem conter as proteínas principais de membrana externa PorA e PorB (-39-42 kDa) e as proteínas de opacidade, Opa e Opc (-28-31 kDa), embora a massa aparente das proteínas particulares e as quantidades relativas fossem diferentes em cada preparação. A proteína menos distinta que possui uma massa aparente de -31-34 kDa nas preparações de DOC OMV pode ser a proteína modificável de redução (Rmp). Em adição a estas proteínas principais de membrana externa, cada preparação de MV e de OMV contém várias outras proteínas em quantidades menores. Em geral, as proteínas em menores quantidades são mais variáveis entre as cepas e entre as preparações de MV comparadas com as de OMV. D. Ligação do anticorpo à superfície celular A ligação dos anticorpos à superfície de bactérias vivas foi determinada através de citometria de fluxo de fluorescência indireta (Granoff e outros, 1998, J. Immunol. 160: 5028-5036). As células bacterianas foram cultivadas até a fase míd-log em caldo Mueller-Hinton, coletadas por centri-fugação e ressuspensas em tampão de bloqueio (PBS contendo albumina de soro bovino (BSA) 1% (p/v) e azida sódica 0,4% (p/v)) a uma densidade de ~108 células por mL. As diluições do antisoro para teste ou de controle (tipicamente 1:20, 1:200, 1:2000) foram então adicionadas e foi permitido que houvesse ligação às células e foram mantidas em gelo durante 2 hs. Após duas lavagens com tampão de bloqueio, as células foram incubadas com o fragmento F(ab')2 de IgG (H+L) anticamundongo de cabra conjugado com FITC (Jackson Immune Research, West Grove, PA) durante 1 h. As células foram lavadas duas vezes com o tampão de bloqueio e reagidas com formaldeído 0,25% em tampão PBS antes de analisar as células bacterianas por citometria de fluxo.

Os anticorpos para controle positivo incluíam anticorpos mono-clonais para sorotipagem ou para sorossubtipagem específicos para menin-gococos (MN2C3B, MN16C13F4, Rijksinstituut Voor Volksgezondheid en Mileu, Bilthoven, Holanda) e SEAM 12, um anticorpo monoclonal antipolis-sacarídeo que é específico para cepas do sorogrupo B encapsuladas (Granoff e outros, 1998, J. Immunol. 160:5028). O controle negativo consistia de um anticorpo monoclonal de IgG de camundongo (VIG10) de especificidade irrelevante e soros policlonais provenientes de camundongos imunizados com proteínas de membrana de E. coli. Os anticorpos utilizados para definir o sorogrupo, o sorotipo e o sorossubtipo são fornecidos nas Figuras 20 e 21. A Figura 3 mostra os resultados de um experimento típico que examina a ligação do anticorpo a duas cepas de teste: MC58 e S3446. Am- bas as cepas expressam as proteínas PorA e PorB que são heterólogas às respectivas proteínas porinas das três cepas utilizadas para preparar a vacina CHORI. Os antisoros dos camundongos imunizados com o antígeno de CHORI mostram um aumento na intensidade da fluorescência com ambas as cepas quando os antisoros foram testados nas diluições de 1:20 até 1:200. Em contraste, os antisoros policlonais preparados para as proteínas precipitadas do sobrenadante de cultura da E. coli mostram somente baixa intensidade de fluorescência residual (diluição de 1:20) e foram considerados negativos. Os antisoros provenientes de porquinhos-da-índia imunizados com a vacina Norueguesa, preparada partindo da OMV da cepa H44/76 (P1.7,16), eram positivos contra a cepa MC58 com um sorossubtipo da PorA homólogo (P1.7,16) mas negativos quando testados na diluição de 1:20 contra a cepa S3446 com um sorossubtipo heterólogo (P1.22,14).

Como é resumido na Quadro 2 (Figura 4), das 12 cepas do so-rogrupo B de N. meningitidis testadas pela citometria de fluxo, 11 (92%), incluindo 6 cepas com sorossubtipos da PorA heterólogos e 3 cepas possuindo tanto sorotipos quanto sorossubtipos heterólogos, eram positivas para a ligação à superfície celular pelos antisoros antiantígenos de CHORI. A única cepa negativa não expressa PorA, o que sugere que alguns dos anticorpos vacina anti-CHORI se ligam à PorA ou às proteínas cuja expressão pode ser regulada em associação com a expressão de PorA. Em adição às 11 cepas meningocóccicas B, os antisoros vacina anti-CHORI eram também positivos neste ensaio quando testados com as cepas menigocóccicas heterólogas dos sorogrupos A (Z1073) e C (60E) (Quadro 3 (Figura 5)). E. Atividade bactericida do anticorpo dependente do complemento O ensaio bactericida foi adaptado do método descrito anteriormente por Mandrell e outros (1995 J. Infect. Dis. 172: 1279-1289). A descoberta de que uma vacina produz anticorpos bactericidas contra Neisseria meningitidis é aceita no campo como um prognóstico do efeito protetor da vacina em seres humanos (Goldschneider e outros, 1969, J. Exp. Med. 129:1307; Borrow e outros 2001 Infect. Immunol. 69:1568). Após o cultivo durante a noite em ágar de chocolate, várias colônias foram inoculadas em caldo Mueller-Hinton (partindo de A620nm de ~0,1) e o organismo de teste foi crescido durante aproximadamente 2 hs até uma A620nm de ~0,6. Após a lavagem das bactérias duas vezes em tampão de Gey contendo BSA 1% (p/v), aproximadamente 300 até 400 unidades formadoras de colônias (UFCs) foram adicionadas na mistura de reação. A mistura de reação final de 60 microlitros continha complemento 20% (v/v) e diluições em série de 2 vezes dos soros para teste ou de anticorpos monoclonais de controle em tampão de Gey. A fonte do complemento era o soro humano de um adulto saudável sem anticorpo anticápsula detectável para o polissacarídeo do sorogrupo B quando testado por ELISA (Granoff e outros, 1998, J. Immunol. 160: 5028-5036) e sem atividade bactericida intrínseca contra a cepa de teste a uma concentração final de 20 ou 40%. Em experimentos preliminares com um conjunto de soros para teste, esta fonte do complemento forneceu títulos bactericidas comparáveis aos obtidos com o soro agamaglobulinêmi-co como a fonte do complemento. Os títulos de soro bactericida foram definidos como a diluição do soro (ou a concentração de anticorpo) que resulta-va em um decréscimo de 50% nas UFCs por mL uma incubação de 60 min das bactérias na mistura de reação, comparadas com as UFCs de controle por mL no tempo 0. Tipicamente, as bactérias incubadas com o anticorpo de controle negativo e com o complemento exibiam um aumento de 150 até 200% nas UFCs/mL após durante os 60 min de incubação. O Quadro 7 (Figura 6) mostra os dados de um experimento típico com a cepa de meningo-cocos B 2996 testada com um mAb anticápsula de meningococos B (SEAM 12, Granoff e outros, 1998, J. Immunol. 160: 5028-5036), antisoros de controle de camundongo e de porquinho-da-índia, antisoros antiNspA recombi-nante e antiantígeno de CHORI de camundongos e antisoros anti vacina Norueguesa de porquinhos-da-índia. O Quadro 5 (Figura 7) resume os resultados da medida da atividade bactericida mediada pelo complemento dos antisoros antiantígeno de CHORI para cada uma das cepas meningocóccicas B testadas. Todas as 12 cepas foram mortas pelo complemento junto com concentrações similares de um mAb anticapsular de controle positivo (SEAM 12; subtipo lgG2a (Granoff e outros, 1998, J. Immunol. 160: 5028-5036). Similarmente, todas as 11 cepas que eram positivas para a ligação pelos antisoros antiCHORI pelo ensaio de fluxo eram suscetíveis à bacteriólise mediada pelo complemento induzida pelo anticorpo (a uma diluição de 1:10 ou maior, cada uma exibiu mais de 50% de morte, comparada com as CFUs/mL presente no tempo 0). Ainda, as cepas meningocócicas heterólogas A e C que eram positivas quando testadas no ensaio de fluxo eram positivas no ensaio bacteri-cida (Quadro 3(Figura 5)). Novamente, somente a cepa M136, que não expressa a PorA e era negativa para a ligação de anticorpo no ensaio de fluxo, era resistente à morte no ensaio bactericida. Em contraste, os anticorpos ativados pela vacina Norueguesa ou pela rNspA, das quais ambas são candidatas à vacina para meningococos B que estão sendo atualmente testadas em seres humanos, eram capazes de ativar a bacteriólise mediada pelo complemento apenas com um número limitado do conjunto de cepas geneticamente distinto. Como com o ensaio de fluxo, os antisoros anti vacina com NspA e os antisoros anti vacina Norueguesa eram bactericidas somente contra um número limitado das cepas. O Quadro 6 (Figura 8) resume os resultados do teste da atividade bactericida mediada pelo complemento de antisoros anti-CHORI preparados em um segundo experimento em camundongos. Os dados são mostrados para os antisoros preparados com a vacina CHORI fornecida com CFA ou fosfato de alumínio (sem CpG). Os resultados são mostrados para as 14 cepas de meningococos B testadas neste experimento (8 com soros-subtipos heterólogos aos das cepas vacinais). São mostrados também os resultados para uma cepa MenB adicional na qual o gene que codifica a NspA foi inativado (BZ198ANspA). Todas as 15 cepas foram mortas pelos antisoros anti-CHORI (14/15 com a vacina CHORI fornecida com CFA; e 13/15 com a vacina fornecida com fosfato de alumínio; para as cepas heterólogas, 6/7 e 5/7, respectivamente). Em contraste, somente 1 das 15 cepas foi morta pelos antisoros provenientes de animais de controle que receberam 3 injeções de MV de E. coli. Estes resultados de um segundo experimento em camundongos confirmam os resultados anteriores obtidos com a vacina CHORI no experimento 1. Em adição, os dados indicam que o segundo adjuvante, oligonucleotídeos CpG, que não foi utilizado no segundo experimento, não é necessário para que a vacina CHORI ative anticorpo amplamente reativo.

Um grupo de camundongos no segundo experimento recebeu três injeções, cada uma consistindo em uma mistura das mesmas MV, MV e OMV utilizadas na imunização seqüencial. Os antisoros resultantes eram bactericidas contra 12 das 15 cepas (4 de 7 das cepas heterólogas). A imunização com a mistura de antígenos ativou uma atividade bactericida mais ampla que a esperada mas os títulos medidos contra as mesmas cepas tendiam a ser muito mais baixos do que os obtidos nos animais que receberam a imunização seqüencial com a vacina CHORI (por exemplo, cepas CU385 e 1000, títulos de 1:128 e 1:128 após vacina CHORI/fosfato de alumínio vs. os títulos de <1:4 e 1:6 nos antisoros preparados contra três injeções dos antígenos misturados/fosfato de alumínio).

Em um terceiro experimento, os grupos de porquinhos-da-índia foram imunizados com a vacina CHORI fornecida com fosfato de alumínio (sem CpG) ou hidróxido de alumínio (sem CpG). Os resultados são mostrados na Quadro 7 (Figura 9) para 9 cepas de meningococos B testadas (5 com sorossubtipos heterólogos aos das cepas vacinais) e para uma cepa MenB adicional na qual o gene que codifica a NspA foi inativado (BZ198ANspA). 9 das 10 cepas foram mortas pelos antisoros anti-CHORI vs. 0 das 10 cepas mortas pelos antisoros provenientes dos animais de controle que receberam 3 injeções de MV de E. coli. Assim a vacina CHORI ativa respostas de anticorpos bactericidas de base ampla em porquinhos-da-índia, um segundo modelo de animal que pode ser melhor prognóstico de respostas de anticorpos protetores em seres humanos do que camundongos. F. Proteção animal passiva Uma crítica aos ensaios bactericidas é que estes testam a atividade dos anticorpos contra as bactérias crescidas em caldo e que as bactérias crescidas in vivo podem possuir propriedades diferentes. Portanto, a capacidade do antisoro anti-CHORI de camundongo de conferir proteção passiva contra a bacteremia do grupo B de N. meningitidis foi testada em ratos bebês desafiados IP, utilizando um modelo aceito na técnica e um método adaptado de Saukkonen e outros (J. Infect. Dis., 1988, 158: 209-212), que é referido no campo como sendo um prognóstico de resultados em seres humanos. A cepa meningocóccica B 8047, que era positiva pelo ensaio de citometria de fluxo para os epitopos acessíveis de superfície ao antígeno de CHORI e susceptível à atividade bactericida antiantígeno de CHORI, foi selecionada para este estudo. Os filhotes bebês (com 6 a 7 semanas de idade) de seis ninhadas de ratos da raça Wintar (Charles River, Hollister, CA) foram redistribuídos aleatoriamente para as mães em período de aleitamento. Os grupops de cinco a seis animais foram desafiados IP com 100 μΐ_ de aproximadamente 5 x 103 CFU da cepa do grupo B 8047. A cepa utilizada foi passada três vezes em ratos bebês. As bactérias isoladas das culturas de sangue após a terceira passagem foram cultivadas em ágar chocolate durante a noite e armazenadas a -70°C em pequenos frascos contendo leite desnatado estéril. No dia do experimento, as bactérias foram crescidas, lavadas e ressuspensas em tampão PBS contendo BSA 1%, como descrito anteriormente para o ensaio bactericida.

Os animais receberam antisoros ou anticorpos diluídos em PBS contendo BSA 1% através de injeção IP 2 hs antes do desafio bacteriano. Dezoito horas após o desafio bacteriano, os espécimes de sangue foram obtidos através de punctura do coração com uma seringa e agulha contendo uma até duas gotas de 25 Unidades/mL de heparina sem conservante (Fuji-sawa USA, Deerfiel, IL). Alíquotas de 1, 10 e 100 microlitros de sangue foram plaqueadas em ágar chocolate. A UFC por mL de sangue foi determinada após incubação durante a noite das placas a 37°C em CO2 5%. O Quadro 8 (Figura 10) resume os resultados de culturas bacte-rianas quantitativas realizadas em espécimes de sangue obtidos 18 horas após o desafio. Uma dose de 10 microgramas por rato do anticorpo anticap-sular de controle positivo, SEAM 3, era completamente protetora contra a cepa assim como eram os antisoros anti-CHORI de camundongo a uma di- luição de 1:20. Em contraste, os antisoros anti vacina Norueguesa de por-quinhos-da-índia (1:20) e os dois soros de controle (antisoros de camun-dongos preparados para proteínas de E. coli ou antisoros de porquinhos-da-índia provenientes de animais imunizados somente com alúmen) não eram capazes de proteger contra a bacteremia causada pela cepa 8047.

Em um segundo experimento de proteção passiva utilizando o protocolo descrito acima, foi também mostrado que os antisoros vacina anti-CHORI preparados em porquinhos-da-índia protegiam os ratos bebês da bacteremia meningocóccica B após o desafio IP(Quadro 9 (Figura 11)). A proteção foi observada em animais tratados com os antisoros preparados para a vacina administrada com fosfato de alumínio ou com hidróxido de alumínio e era superior à proteção observada em animais de controle tratados com 20 pg de um anticorpo monoclonal anticapsular murino (SEAM 3).

G. Imunoprecipitação de antígenos de superfície reconhecidos pelos anticorpos antígeno anti-CHORI O método utilizado para a imunoprecipitação de antígenos acessíveis na superfície era baseado nos descritos por Hansen e outros (1981 Infect. Immun. 33: 950-953) e Gulig e outros (1982 Infect. Immun. 37: 82-88). Nestes estudos, o método foi utilizado com células não marcadas ou com células em que as proteínas de superfície tinham sofrido reação com iodo radioativo. As células foram cultivadas em caldo Mueller-Hinton (~7 ml_) até uma OD de 0,6 e coletadas por centrifugação a 5000 x g a 4°C. O pélete de células foi lavado duas vezes em PBS gelado contendo BSA 1% ou, para o ensaio de imunoprecipitação radioativo, PBS apenas.

As células que seriam iodadas foram transferidas para um tubo de vidro. Um nanomol de Kl e 1 mCi de Na12Sl (Amersham) foram adicionados à suspensão de células. A reação com iodo radioativo foi iniciado através da adição de H202 0,03% (50 μΙ_) e lactoperoxidase (Sigma, St. Louis, MO) em água (50 μΙ_ de uma solução de 1 mg/mL). As mesmas quantidades de H202 e lactoperoxidase foram adicionadas em intervalos de 4 min durante 12 min. A reação foi interrompida após 16 min através da adição da mistura de reação em PBI gelado (20 mL) (isto é, o NaCI substituído é pelo Nal no PBS). As células foram coletadas por centrifugação (5.000 x g, 10 min, 4°C), lavadas 2 vezes com PBS e então utilizadas imediatamente.

As células foram ressuspensas em PBS (2 ml_) contendo BSA 1%. Os antisoros foram adicionados em alíquotas de 0,5 mL de suspensão celular. A mistura foi incubada com agitação durante 90 min a 4°C. As células foram então coletadas por centrifugação (1 min de centrifugação rápida em microcentrífuga), lavadas duas vezes com PBS/BSA 1% e ressuspensas em 1 mL de tampão de solubilização (tampão Tris 50 mM, pH 7,8, contedo NaCI 150 mM, EDTA 1 mM, Triton X-100 1%, desoxicolato de sódio 0,2% e dodecil sulfato de sódio 0,1%. Após incubação durante 60 min a 37°C, o material insolúvel foi removido por centrifugação (45.000 x g durante 60 min a 20°C). Os sobrenadantes foram então transferidos para tubos contendo 3-4 miligramas de esferas de Sepharose de proteína A (Sigma) pré-equilibradas com 50 pL de PBS. As amostras foram incubadas durante 4°C com agitação. As esferas foram lavadas cinco vezes com tampão de solubi-lização. As proteínas ligadas foram liberadas das esferas através da adição de 75 pL de tampão de amostra com SDS e aquecidas a 100°C durante 1 min. Após a remoção do sobrenadante, 1 pL de 2-mercaptoetanol foi adicionado a cada amostra e foram então aquecidas novamente a 100°C durante 1 min. As amostras foram então corridas em um gel de SDS-PAGE a 15% e coradas utilizando coloração à prata (Pierce Chemical Co., Rockford, IL).

Para Western blots, o gel foi equilibrado com tampão (Tris.HCI 48 mM, glicina 39 mM, pH 9,0, metanol 20% (v/v)) e as proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Bio-Rad) utilizando uma célula de transferência eletroforética semi-seca Trans-Blot® (Bio-Rad). As membranas de nitrocelulose foram bloqueadas com leite desnatado 2% (p/v) em PBS contendo azida sódica 0,2% (p/v). Os antisoros foram diluídos no mesmo tampão de bloqueio contendo Tween-20 0,1%. O anticorpo ligado foi detectado utilizando anticorpo policlonal conjugado com fosfatase alcalina lgG,A,M anticamundongo de coelho (Zymed, Sul de São Francisco, CA) diluído em PBS contendo BSA 1% (p/v), Tween-20 1% (p/v) e azida sódica 0,2% (p/v) e o substrato Sigma Fast® BCIP/NBT (Sigma). A Figura 12 é um gel de SDS corado com prata que demonstra as proteínas de superfície celular precipitadas com os antisoros anti-CHORI (Faixa 2) de M7, um mutante não encapsulado da cepa do sorogrupo B, NMB (Stephens e outros 1991, Infect. Immun. 59: 4097-4107). Seis proteínas que possuem as massas aparentes de 59,5, 40,7, 39,6, 33, 27,9 e 14,5 kDa foram precipitadas pelos antisoros preparados para o antígeno CHORl (Faixa 2) mas não pelos antisoros de controle anti proteína de E. coli (Faixa 3). Os mesmos resultados foram obtidos quando os antisoros antiantígeno de CHORl foram utilizados para precipitar proteínas de superfície da cepa parental encapsulada, NMB (dados não-mostrados). Exceto para as proteínas de Ig de cadeia pesada e leve de 59,5 e 27,9 kDa (ver abaixo), as mesmas proteínas de superfície detectadas pela coloração com a prata foram observadas também em células marcadas com 125l (dados não-mostrados).

Para observação, não havia lipooligossacarídeo (LOS), que pudesse ser detectado pela coloração com a prata, que tivesse sido precipitado pelos antisoros antiantígeno de CHORl. Experimentos adicionais, descritos abaixo, foram planejados para determinar se a ligação à superfície e a atividade biológica protetora observadas dos antisoros vacina anti-CHORI eram causadas por anticorpos anti LOS. A Figura 13 mostra um Western blot das mesmas amostras que as resolvidas no gel de SDS da Figura 12. As amostras nas faixas 1 até 3 foram detectadas pelos antisoros vacina anti-CHORI. As amostras nas faixas 4 até 6 foram detectadas por um mAB antiPorA específico a P1.2. As proteínas que possuem massas aparentes de 59,5 e 27,9 kDa na Figura 13, (Faixas 2, 3, 5 e 6) correspondem às cadeias pesadas e leves dos anticorpos, respectivamente, uma vez que foram detectadas com o anticorpo secundário conjugado com fosfatase alcalina Ig anticamundongo de coelho. A proteína de 40,7 kDa precipitada pelos antisoros antiantígeno de CHORl (Figura 12, Faixa 2) era reativa com o anticorpo antiPorA específico a P1.2 no Western (Figura 13, Faixa 5) e é, portanto, PorA P1.2. Como é esperado, a PorA P1.2 foi também detectada na proteína total de M7 (Figura 13, Faixa 4). Os antisoros vacina anti-CHORI detectaram somente a proteína de 33 kDa (Faixa 2) e não a PorA. Assim, os antisoros preparados para o antígeno CHORI reage tanto com a proteína de 33 kDa nativa quanto desnaturada mas somente com as formas nativas das proteínas de 40,7, 39,6 e 14,5 kDa presentes na superfície celular da cepa M7 (Figura 12, faixa 2).

Experimentos de imunoprecipitação similares foram realizados com preparações de MV e de OMV utilizadas para a imunização e com sete cepas do sorogrupo B encapsuladas geneticamente distintas. Os resultados estão resumidos no Quadro 10 (Figura 14). Quando os resultados são comparados, é evidente que a imunização seqüencial com vesículas de membrana provenientes de três cepas meningocóccicas geneticamente distintas ativa anticorpos que reconhecem uma variedade de antígenos. Alguns dos antígenos que são reconhecidos são os mesmos em todas as cepas; outros são específicos às cepas ou comuns a subconjuntos de cepas. Por exemplo, as proteínas que possuem massas aparentes de 37-41 kDa eram precipitadas das cepas BZ 198 e NMB mas não de qualquer uma das outras cepas. Similarmente, as proteínas que possuem uma massa aparente de 25,7 kDa eram precipitadas das cepas NG3/88 e S3446 mas não de qualquer uma das outras cepas. Entretanto, há uma proteína de superfície que possui uma massa aparente de 32 até 33 kDa que é reconhecida pelos antisoros em todos os exemplos exceto para a cepa M136, que era negativa em ambos os ensaios de fluxo e bactericida. A proteína de 32 até 33 kDa pode ser um antígeno conservado.

Foram realizados experimentos adicionais em cepas do sorogrupo B encapsuladas. CU385, BZ198 e 1000 utilizando células nas quais as proteínas de superfície sofreram reação com iodo radioativo (Quadro 10A (Fig. 14A) e foram precipitadas com antisoros imunológicos de grupos diferentes de camundongos que receberam a vacina CHORI. Em adição às proteínas descritas anteriormente, neste segundo conjunto de experimentos, as proteínas com massas moleculares aparentes entre 10 e 14,5 kDa e 80 kDa foram precipitadas das cepas CU385 e BZ198. As três proteínas com kDa aparente de 26, 41 e 45 foram precipitadas da cepa 1000. É importante observar que nem todos os antígenos reconhecidos pelos antisoros provenientes de camundongos imunizados com o antí-geno de CHORI eram imunoprecipitados das células bacterianas. Havia também anticorpos nos antisoros para alguns antígenos (por exemplo a proteína NspA) que mostraram estar presentes através de um ELISA ou de um Western blot, mas que não foram imunoprecipitados neste experimento. A falha em detectar estes outros antígenos pode resultar do fato de que o complexo anticorpo/antígeno tem que ser estável na presença de detergentes (Triton X-100, desoxicolato e sulfato de laurila) para ser detectado. H. Detecção de proteínas reativas em preparações de MV e de OMV da vacina CHORI com anticorpos vacina anti-CHORI ativados em camundongos e porquinhos-da-índia. A Figura 15 mostra um Western blot de MVs das cepas RM1090 (C:2a:P1.5,2:L3,7) e BZ198 (B:NT:P1.4) e de OMV da cepa Z1092 (A:4:P1.10). Os antisoros de camundongos imunizados com a vacina CHO-Rl combinada com CFA ou fornecida com o adjuvante fosfato de alumínio, foram utilizados como o anticorpo de detecção primário. O blot mostra que a vacina CHORI ativa anticorpos que são reativos com várias proteínas que possuem massa molecular aparente similar em cada uma das preparações de MV ou de OMV independente da espécie animal ou do adjuvante utilizado na vacina. As massas moléculas aparentes de todas as proteínas nas preparações de MV ou de OMV que são reativas com os anticorpos produzidos pela imunização com a vacina CHORI estão resumidas na Quadro 11 (Figura 16).

I. Detecção da atividade dos anticorpos antiLOS

Um dos determinantes antigênicos na superfície dos meningo-cocos observado que ativava os anticorpos bactericidas é o lipooligossaca-rídeo (LOS). A fim de determinar se os anticorpos antiLOS eram ativados pela vacina CHORI, foi preparada uma coluna de afinidade de LOS e foi utilizada para absorver os anticorpos antiLOS nos antisoros vacina anti-CHORI utilizando os métodos descritos por Shenep e outros (1982, J. Infect. Dis. 145: 181-190) com as modificações a seguir. LOS foi preparado partin- do de cada cepa vacinai através do método de Appicella e outros (Bacterial Pathogenesis (1997) V. L. Clark e P. M. Bavoil eds. Academic Press, San Diego, CA) e foi conjugado com BSA como a seguir. LOS (1 mg) foi combinado com BSA (2 mg) em tampão MES 100 mM, pH 5,0. EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida HCI; 100 pL de uma solução 10 mg/mL em água) foi adicionado com agitação após a incubação à temperatura ambiente durante 2 hs. Uma mistura equivalente dos três conjugados de LOS-BSA (1 mg de conjugado de LOS-BSA por mL de gel hidratado) foi acoplada às esferas de agarose ativadas com CNBr (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) em tampão carbonato de sódio (0,1 M, pH 8,0) durante a noite à temperatura ambiente.

Após a remoção dos anticorpos antiLOS através da passagem dos antisoros vacina anti-CHORI e antiantígenos de CHORI misturados através da coluna de afinidade de LOS, os antisoros foram concentrados até seus volumes originais através de ultrafiltração e testados em relação à presença de anticorpo antiLOS por ELISA e à atividade bactericida mediada pelo complemento contra duas cepas MenB (BZ198 e S3032). Como é resumido na Quadro 12 (Figura 17), a presença de anticorpo antiLOS foi enormemente reduzida ou eliminada através da absorção na coluna de afinidade pelo conjugado LOS-BSA. Como é mostrado na Quadro 13 (Figura 18), havia pouca ou nenhuma diferença nos títulos bactericidas entre os soros absorvidos e não absorvidos provenientes de camundongos ou porqui-nhos-da-índia imunizados com a vacina CHORI indicando que o anticorpo antiLOS não contribui de forma significativa para a atividade bactericida contra uma cepa vacinai (BZ198) ou contra a cepa S3032, que possui PorA e PorB que são heterólogas às cepas utilizadas para preparar a vacina. Havia um efeito maior sobre os títulos bactericidas de antisoros preparados de camundongos e porquinhos-da-índia imunizados com a vacina CHORI misturada indicando uma contribuição mais significativa de anticorpos antiLOS para o título bactericida neste antisoro. J. Preparação de anticorpos monoclonais Fêmeas de camundongos CD1 (Charles River, Hollister, Calif.) foram vacinadas seqüencialmente com MV preparada das cepas meningo-cóccicas RM1090 (C:2a:P1.5,2), BZ198 (B:NT:7,4) e com OMV da cepa Z1092 (A:4,21:P1.10). Os camundongos receberam três injeções de 100 microlitros, cada uma separada por três semanas, contendo 5 microgramas de proteína. As duas primeiras doses foram fornecidas subcutaneamente junto com fosfato de alumínio (0,5% p/v) e a dose final foi fornecida sem adjuvante e foi administrada intraperitonealmente (i.p.). Três dias depois, os animais foram sacrificados e suas células do baço foram fundidas com células de mieloma (P3X63-AG8.653) a uma proporção de 1 célula de baço para 1,7 célula de mieloma. Após duas semanas de incubação em meio seletivo HAT, os sobrenadantes dos hibridomas foram selecionados em relação à atividade de ligação ao anticorpo por ELISA com células inteiras utilizando as cepas de MenB encapsuladas 1000 e CU385 como o antígeno alvo. O método descrito por Abdillahi e Poolman, (Microb Pathog, 1988 4:27-32) foi utilizado para o ensaio de ELISA com células inteiras. Os hibridomas que secretavam anticorpo que era reativo com ambas as cepas 1000 e CU385 em um ELISA de célula inteira e que eram positivos para ligação por citometria de fluxo foram clonados através de diluição limitante e então expandidos e congelados para uso subseqüente em cultura de tecido.

Os anticorpos provenientes de oito linhagens de células foram caracterizados em detalhes. As subclasses dos anticorpos monoclonais foram determinadas utilizando um ELISA de captura de anticorpos e anticorpo policlonal conjugado com fosfatase alcalina específico para cada uma das subclasses de IgG de camundongos, IgM, IgA e para as cadeias leves κ e λ (Southern Biotechnology Associates, Inc. Birmingham, Ala.). Os anticorpos monoclonais produzidos pelos clones de hibridomas foram coletados dos meios de cultura de tecidos através da precipitação com sulfato de amônio (55% p/v). A concentração do mAb purificado foi determinada por ELISA de captura utilizando padrões de Ig como recomendado pelo fabricante (Southern Biotechnology Associates, Inc. Birmingham, Ala.). K. Reatividade de mAbs para antígenos anti-CHORI com diversas cepas de MenB. A capacidade dos mAbs preparados partindo de camundongos imunizados com o antígeno anti-CHORI (administrado com CFA ou fosfato de alumínio) de se ligar a diversas cepas de MenB foi determinada por ELISA de células inteiras (Abdillahi e Poolman, Microb Pathog. 1988 4:27-32). Os resultados estão resumidos na Quadro 14 (Figura 19). Nenhum dos anticorpos monoclonais reage com o LOS preparado partindo das cepas imuni-zantes. Os mAbs 1D9 e 14C7 são reativos com os antígenos em todas ou quase todas as cepas meningocóccicas testadas mas não com qualquer cepa que não seja de Neisseria. O mAb 14C7 é específico para a proteína de superfície altamente conservada de Neisseria NspA uma vez que este é reativo com rNspA expressa em E. coli. Este mAb é também reativo com as cepas 8047 e BZ198 mas não é reativo com as cepas correspondentes nas quais o gene NspA foi inativado. Em contraste aos anticorpos amplamente reativos, os antígenos reconhecidos pelos mAbs 4B11 e 9B6 são limitados a certas cepas. Observe que o MAb 4B11 é reativo com a cepa 8047 mas não com o mutante correspondente de 8047 no qual o gene NspA foi inativado. Entretanto, o mAb 4B11 não se liga à rNspA expressa em vesículas de E. coli e também não se liga à cepa BZ198, que é conhecida por superexpres-sar naturalmente (ver Moe e outros (1999 Infect. Immun. 67: 5664; Moe e outros Infect. Immun. 2001 69:3762). Portanto, o mAb 4B11 pode reconhecer um epitopo de NspA que é específico para a cepa 8047 ou um epitopo em uma outra proteína de membrana que não está presente na cepa BZ198 mas que está presente e associado com a expressão de NspA na cepa 8047. Tomados juntos, os resultados com os mAbs diferentes mostram que a vacina antiantígeno de CHORI ativa anticorpos contra proteínas tanto altamente conservadas quanto não conservadas. L. Atividade bactericida de mAbs para antígenos anti-CHORI com diversas cepas de MenB. A atividade bactericida mediada pelo complemento de mAbs preparados partindo de camundongos imunizados com antiantígeno de CHORI e testados contra várias cepas de MenB é resumida na Figura 20. O anticorpo monoclonal 1D9, que reage por ELISA com todas as cepas de N. meningitidis testadas, não era bactericida. O anticorpo monoclonal 14C7, que parece reconhecer NspA, era bactericida ou bacterioestático contra todas as cepas testadas exceto a BZ198ANspA (um nocaute da NspA). A atividade do anticorpo monoclonal 14C7 era superior à do anticorpo monoclonal de controle AL12 (produzido em camundongos imunizados com NspA recombinante (ver Moe e outros Infect. Immun. 2001 69:3762). Esta observação sugere que a imunização com a vacina CHORI fornece um meio superior para ativar anticorpos antiNspA bactericidas quando comparada com a imunização com uma vacina baseada na NspA recombinante. O anticorpo monoclonal 4B11 (um anticorpo IgM) era bactericida contra as cepas 1000 e CU385. Observe que o anticorpo monoclonal 4B11 não reage com estas mesmas cepas por ELISA com células inteiras na concentração mais alta testada (ver o quadro 14 (Figura 19)). Os ensaios bactericidas medem a atividade do anticorpo funcional utilizando bactérias vivas enquanto que o ELISA com células bacterianas mede a ligação de anticorpos a bactérias mortas por tratamento térmico, que nestas cepas pode ter desnaturado o alvo antigênico do mAb 4B11.

DEPÓSITOS

Foi feito um depósito de culturas biologicamente puras dos materiais na tabela abaixo na American Type Culture Collection, 10801 Univer-sity Blvd., Manasas, VA 20110-2209, sob as cláusulas do Tratado de Budapeste, na ou antes da data de depósito do presente pedido de patente. O número de acesso indicado é atribuído após o teste de viabilidade bem sucedido e as taxas necessárias terem sido pagas. O acesso às ditas culturas será disponível durante a pendência do pedido de patente para uma pessoa determinada pelo Membro de uma Comissão que será autorizada por este sob 37 C.F.R. §1.14 e 35 U.S.C. §122. Toda restrição sobre a disponibilidade das ditas culturas ao público será irrevogavelmente removida após a concessão de uma patente baseada no pedido de patente. Além disso, os depósitos designados serão mantidos durante um período de trinta (30) anos a partir da data do depósito ou durante cinco (5) anos após a última requisição do depósito; ou durante a existência vigente da Patente U.S., qualquer que seja a sua duração. Se uma cultura se tornar inviável ou for destruída inadvertidamente ou, no caso de cepas que contêm plasmídeos, estas perderem seus plasmídeos, estas serão substituídas por uma (ou mais) cultura(s) da mesma descrição taxonômica. 5 Estes depósitos são fornecidos meramente como uma conveni- ência para os versados na técnica e não são um reconhecimento de que é necessário um depósito. Pode ser necessária uma licença para produzir, utilizar ou vender os materiais depositados e esta licença não é concedida aqui. O depósito abaixo foi recebido pela ATCC na ou antes da data de de-10 pósito do presente pedido de patente.

REIVINDICAÇÕES

Claims (1)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende: a) uma primeira preparação compreendendo microvisículas (MV) obtidas da cepa RM1090 de Neisseria meningitidis (Número de depósito ATCC: PTA-3557); b) uma segunda preparação compreendendo MV obtidas da cepa BZ198 de Neisseria meningitidis (Número de depósito ATCC: PTA-3555); e c) uma terceira preparação compreendendo vesículas de membrana externa (OMV), ou ambas OMVs e MVs, obtidas da cepa Z1092 de Neisseria meningitidis (Número de depósito ATCC: PTA-3556).