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BR112021011750A2 - Alfa-galactosidase a recombinante e/ou fragmento de alfa-galactosidase a recombinante, composição, sequência de polinucleotídeo recombinante, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos para produzir uma variante de alfa-galactosidase a e para tratar e/ou prevenir os sintomas da doença de fabry, composição farmacêutica, e, uso das composições - Google Patents

Alfa-galactosidase a recombinante e/ou fragmento de alfa-galactosidase a recombinante, composição, sequência de polinucleotídeo recombinante, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos para produzir uma variante de alfa-galactosidase a e para tratar e/ou prevenir os sintomas da doença de fabry, composição farmacêutica, e, uso das composições Download PDF

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BR112021011750A2
BR112021011750A2 BR112021011750-4A BR112021011750A BR112021011750A2 BR 112021011750 A2 BR112021011750 A2 BR 112021011750A2 BR 112021011750 A BR112021011750 A BR 112021011750A BR 112021011750 A2 BR112021011750 A2 BR 112021011750A2
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BR
Brazil
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galactosidase
alpha
seq
sequence
recombinant
Prior art date
Application number
BR112021011750-4A
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English (en)
Inventor
William Casey Hallows
Moulay Hicham Alaoui Ismaili
Kristen Jean Vallieu
Nikki Dellas
Yu Zhu
Judy Viduya
Chinpingc Chng
Antoinette Sero
Gjalt W. Huisman
Rachel Cathleen Botham
Original Assignee
Codexis, Inc.
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Filing date
Publication date
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Abstract

alfa-galactosidase a recombinante e/ou fragmento de alfa-galactosidase a recombinante, composição, sequência de polinucleotídeo recombinante, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos para produzir uma variante de alfa-galactosidase a e para tratar e/ou prevenir os sintomas da doença de fabry, composição farmacêutica, e, uso das composições. a presente invenção provê polipeptídeos de alfa-galactosidase humana engenheirados e composições dos mesmos. os polipeptídeos de alfa-galactosidase humana engenheirados foram otimizados para prover termoestabilidade aprimorada, estabilidade do soro, absorção celular aprimorada, estabilidade sob ambas as condições ácida (ph < 4) e básica (ph > 7), imunogenicidade reduzida e remoção aprimorada de globotriaosilceramida das células. a invenção também refere-se ao uso das composições que compreendem os polipeptídeos de alfa-galactosidase humana engenheirados para fins terapêuticos.

Description

1 / 169 ALFA-GALACTOSIDASE A RECOMBINANTE E/OU FRAGMENTO DE ALFA-GALACTOSIDASE A RECOMBINANTE, COMPOSIÇÃO, SEQUÊNCIA DE POLINUCLEOTÍDEO RECOMBINANTE, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA VARIANTE DE ALFA-GALACTOSIDASE A E PARA TRATAR E/OU PREVENIR OS SINTOMAS DA DOENÇA DE FABRY, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, USO DAS COMPOSIÇÕES
[001] O presente pedido de patente reivindica a prioridade deste ao Pedido de Patente US Provisório No de Série 62/782 553, depositado em 20 de dezembro de 2018, aqui incorporado, em sua totalidade, por referência para todos os efeitos. Campo da invenção
[002] A presente invenção provê polipeptídeos de alfa-galactosidase humana engenheirados e composições dos mesmos. Os polipeptídeos de alfa- galactosidase humana engenheirados foram otimizados par prover termoestabilidade aprimorada, estabilidade do soro, imunogenicidade reduzida, absorção celular aprimorada, estabilidade sob ambas as condições ácida (pH < 4) e básica (pH > 7), e remoção aprimorada de globotriaosilceramida das células. A invenção também se refere ao das composições que compreendem os polipeptídeos de alfa-galactosidase humana engenheirados para fins terapêuticos. Referência à listagem de sequências, tabela ou programa de computador
[003] A cópia oficial da Listagem de Sequências é submetida simultaneamente com o pedido de patente como um arquivo ASCII em formato de texto por meio da EFS-Web, com nome do arquivo de “CX7- 184WO2_ST25.txt”, data de criação de 19 de dezembro de 2019 e tamanho de 1,67 megabytes. A Listagem de Sequências, depositada por meio da EFS- Web, faz parte do pedido de patente e é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
2 / 169 Fundamentos da invenção
[004] A galactosidase alfa humana (“GLA”; EC 3.2.1.22) é uma glicoproteína lisossômica responsável por hidrolisar as porções alfa-galactosil terminais de glicolipídios e glicoproteínas. Ela atua sobre muitos substratos presentes em uma gama de tecidos humanos. A doença de Fabry (também referida como angioqueratoma corpóreo difuso, doença de Anderson-Fabry, lipidose distópica hereditária, deficiência de alfa-galactosidase A, deficiência de e deficiência de ceramida trihexosidase) é um erro de nascença ligado ao X no catabolismo dos glicoesfingolipídios que resulta da atividade deficiente ou ausente da alfa-galactosidase A. Pacientes afetados com a doença de Fabry acumulam globotriaosilceramida (aqui referida como “Gb3” e “Gb3”) e glicoesfingolipídios relacionados no plasma e em lisossomos celulares de vasos sanguíneos tecido e órgãos (Ver, por exemplo, Nance at al., Arch. Neurol., 63:453-457 [2006]). À medida que o paciente envelhece, os vasos sanguíneos tornam-se progressivamente estreitados, devido ao acúmulo desses lipídios, resultando em fluxo sanguíneo e nutrição diminuídos para os tecidos, especialmente na pele, rins, coração, cérebro e sistema nervoso. Assim, a doença cerebrovascular de Fabry é um transtorno sistêmico que se manifesta como insuficiência renal, doença cardíaca, doença cerebrovascular, neuropatia periférica de fibras finas e lesões cutâneas, bem como outros transtornos (Ver, por exemplo, Schiffmann, Pharm. Ther., 122:65-77 [2009]). Os pacientes afetados exibem sintomas como mãos e pés doloridos, pequenos pontos vermelhos escuros aglomerados na pele, diminuição na capacidade de suar, opacidade da córnea, problemas gastrointestinais, zumbido e perda da audição. As complicações que potencialmente colocam a vida em risco incluem lesão renal progressiva, ataques cardíacos e acidente vascular cerebral. Essa doença tem incidência estimada de 1 em 40.000-60.000 indivíduos do sexo masculino, mas também ocorre no sexo feminino. De fato, mulheres heterozigotas com a doença de Fabry apresentam condições
3 / 169 significativas de risco à vida, incluindo anormalidades do sistema nervoso, dor crônica, fadiga, pressão arterial elevada, doença cardíaca, insuficiência renal e acidente vascular cerebral, requerendo, assim, tratamento clínico (Ver, por exemplo, Want at al., Genet. Med., 13:457-484 [2011]). Os sinais da doença de Fabry podem iniciar a qualquer momento a partir da primeira infância, em geral, começando a se manifestar entre as idades de 4 e 8 anos, embora alguns pacientes exibam uma forma mais leve, de início tardio da doença. O tratamento é geralmente de suporte e não existe cura para a doença de Fabry, portanto, há ainda necessidade de um tratamento seguro e eficaz. Sumário da invenção
[005] A presente invenção provê polipeptídeos de alfa-galactosidase humana engenheirados e composições dos mesmos. Os polipeptídeos de alfa- galactosidase humana engenheirados foram otimizados para prover termoestabilidade aprimorada, estabilidade do soro, imunogenicidade reduzida, absorção celular aprimorada, estabilidade sob ambas as condições ácida (pH < 4) e básica (pH > 7) e remoção aprimorada de globotriaosilceramida das células. A invenção também se refere ao uso das composições que compreende os polipeptídeos de alfa-galactosidase humana engenheirados para fins terapêuticos.
[006] A presente invenção provê alfa-galactosidase A recombinante e/ou fragmento de alfa-galactosidase A recombinante biologicamente ativo que compreendem uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 75%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 91%, pelo menos aproximadamente 92%, pelo menos aproximadamente 93%, pelo menos aproximadamente 94%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98% ou pelo menos aproximadamente 99% de
4 / 169 identidade de sequência com SEQ ID NO:8. A presente invenção provê alfa- galactosidase A recombinante e/ou fragmento de alfa-galactosidase A recombinante biologicamente ativo que compreende uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:8.
[007] A presente invenção também provê alfa-galactosidase A recombinante em que a dita compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 44, 44/217, 44/217/316, 44/217/322, 44/217/322/337, 44/247, 44/247/302, 44/247/302/322, 44/247/322, 44/247/337, 44/247/362, 44/302, 44/337, 44/373, 217/322, 217/373, 247/322, 247/362, 302/322/362/373, 302/337, 316, 316/337, 322, 322/337, 362/373 e 373, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 44L, 44L/217F, 44L/217F/316L, 44L/217F/322M, 44L/217F/322M/337A, 44L/247N, 44L/247N/302Q, 44L/247N/302Q/322M, 44L/247N/322M, 44L/247N/337A, 44L/247N/362K,
5 / 169 44L/302Q, 44L/337A, 44L/373R, 217F/322M, 217F/373R, 247N/322M, 247N/362K, 302Q/322M/362K/373R, 302Q/337A, 316L, 316L/337A, 322M, 322M/337A, 362K/373R e 373R, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO:
8. Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre R44L, R44L/R217F, R44L/R217F/D316L, R44L/R217F/I322M, R44L/R217F/I322M/P337A, R44L/D247N, R44L/D247N/K302Q, R44L/D247N/K302Q/I322M, R44L/D247N/I322M, R44L/D247N/P337A, R44L/D247N/Q362K, R44L/K302Q, R44L/P337A, R44L/K373R, R217F/I322M, R217F/K373R, D247N/I322M, D247N/Q362K, K302Q/I322M/Q362K/K373R, K302Q/P337A, D316L, D316L/P337A, I322M, I322M/P337A, Q362K/K373R e K373R, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 8.
[008] A presente invenção também provê alfa-galactosidase A recombinante em que a dita compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 10/39/44/47/92/166/206/217/247/261/271/302/316/322/337/362/368/373/392, 44/217/316, 44/217/322/337, 166/362, 217/373 e 362/373, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como
6 / 169 referência a SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 10T/39M/44L/47S/92Y/166S/206K/217F/247N/261A/271H/302Q/316L/322 M/337A/362K/368W/373R/392M, 44L/217F/316L, 44L/217F/322M/337A, 166A/362K, 217F/373R e 362K/373R, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre P10T/E39M/R44L/T47S/H92Y/P166S/A206K/R217F/D247N/G261A/A271 H/K302Q/D316L/I322M/P337A/Q362K/A368W/K373R/T392M, R44L/R217F/D316L, R44L/R217F/I322M/P337A, P166A/Q362K, R217F/K373R e Q362K/K373R, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO:
8.
[009] A presente invenção também provê alfa-galactosidase A recombinante em que a dita compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 58, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase
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A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 7, 7/48/68, 7/48/68/120/282/299, 7/48/130/282, 7/48/180, 7/68/130/282/365, 7/68/180, 7/88/120/305/365, 7/120, 7/130, 7/282, 7/305, 7/305/365, 7/365, 39, 47, 47/87/95/96/158/162, 47/95, 47/273, 47/343, 48, 48/68, 48/180/282, 48/282, 48/282/305, 67/180, 68, 68/299/300, 71, 87/91/95/96/158/162, 87/91/95/96/206/343, 87/96/155/273/343, 88, 91/95, 91/95/96, 92, 93, 96, 96/273, 96/312/343, 120, 120/299/305, 151, 158, 158/162/273, 162, 162/273, 162/343, 166, 178, 180, 181, 206, 217, 271, 273, 273/343, 282, 282/365, 293/391, 299/300, 299/300/305/365, 300, 301, 305, 305/365, 314, 333, 336, 337, 343, 345, 363, 365, 370, 389, 393, 394, 396/398, 397 e 398, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 58. Em algumas modalidades, a alfa- galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 58, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 7L, 7L/48D/68E, 7L/48D/68E/120H/282N/299R, 7L/48D/130E/282N, 7L/48D/180G, 7L/68E/130E/282N/365V, 7L/68E/180G, 7L/88A/120H/305G/365V, 7L/120H, 7L/130E, 7L/282N, 7L/305G, 7L/305G/365V, 7L/365V, 39V, 47D, 47D/87K/95E/96L/158R/162H, 47D/95E, 47D/273P, 47D/343G, 47V, 48D, 48D/68E, 48D/180G/282N, 48D/282N, 48D/282N/305G, 67T/180G, 68E, 68E/299R/300I, 71P, 87K/91Q/95E/96L/158A/162K, 87K/91Q/95E/96L/206S/343G, 87K/96I/155N/273P/343G, 88A, 91Q/95E, 91Q/95E/96L, 92F, 92T, 93I, 96L, 96L/273P, 96L/312Q/343G, 120H, 120H/299R/305G, 151L, 158A, 158A/162K/273G, 158R, 162H/343D, 162K, 162K/273P, 162S, 166K, 178G, 178S, 180G, 180L, 180T, 180V, 181A,
8 / 169
206K, 206S, 217K, 271R, 273P, 273P/343G, 282N, 282N/365V, 293P/391A, 299R/300I, 299R/300I/305G/365V, 300I, 301M, 305G, 305G/365V, 314A, 333F, 333G, 336V, 337R, 343D, 343G, 345A, 345Q, 363Q, 365A, 365Q, 365V, 370G, 389K, 393V, 394K, 396G/398T, 397A, 398A, 398P, 398S e 398V, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 58. Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 58, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre R7L, R7L/E48D/Q68E, R7L/E48D/Q68E/Y120H/D282N/Q299R, R7L/E48D/D130E/D282N, R7L/E48D/F180G, R7L/Q68E/D130E/D282N/F365V, R7L/Q68E/F180G, R7L/Q88A/Y120H/N305G/F365V, R7L/Y120H, R7L/D130E, R7L/D282N, R7L/N305G, R7L/N305G/F365V, R7L/F365V, E39V, T47D, T47D/R87K/S95E/K96L/L158R/R162H, T47D/S95E, T47D/S273P, T47D/K343G, T47V, E48D, E48D/Q68E, E48D/F180G/D282N, E48D/D282N, E48D/D282N/N305G, P67T/F180G, Q68E, Q68E/Q299R/L300I, S71P, R87K/N91Q/S95E/K96L/L158A/R162K, R87K/N91Q/S95E/K96L/A206S/K343G, R87K/K96I/H155N/S273P/K343G, Q88A, N91Q/S95E, N91Q/S95E/K96L, H92F, H92T, V93I, K96L, K96L/S273P, K96L/P312Q/K343G, Y120H, Y120H/Q299R/N305G, D151L, L158A, L158A/R162K/S273G, L158R, R162H/K343D, R162K, R162K/S273P, R162S, P166K, W178G, W178S, F180G, F180L, F180T, F180V, Q181A, A206K, A206S, R217K, A271R, S273P, S273P/K343G, D282N, D282N/F365V, L293P/Q391A, Q299R/L300I, Q299R/L300I/N305G/F365V, L300I, R301M, N305G, N305G/F365V,
9 / 169 S314A, S333F, S333G, I336V, P337R, K343D, K343G, V345A, V345Q, L363Q, F365A, F365Q, F365V, S370G, T389K, S393V, L394K, D396G/L398T, L397A, L398A, L398P, L398S e L398V, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 58.
[0010] A presente invenção também provê alfa-galactosidase A recombinante em que a dita compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 158, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 24/202, 39/47, 39/47/217, 39/151, 39/282/337/398, 39/337/343/398, 39/393/398, 47/130, 47/151, 47/343/345/393, 48, 48/68, 48/68/217/333/391/393, 48/68/333, 48/217, 48/333, 48/345/393, 48/393, 59/143, 68, 68/345, 130, 130/158, 130/158/393, 130/345/393, 143/271, 143/333, 143/387, 151, 151/158/217/343/345/393, 151/206/282/337/343/345/398, 151/282/393, 151/345/393/398, 151/393, 158, 158/393, 202, 206, 206/217, 217, 217/333, 217/337/345/398, 271, 282/393, 333, 333/345, 337/343/345/398, 343, 343/345/393/398, 393 e 393/398, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO:
158. Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 158, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 24S/202N, 39V/47D, 39V/47V/217K, 39V/151L, 39V/282N/337R/398A, 39V/337R/343G/398A, 39V/393V/398A,
10 / 169
47V/130E, 47V/151L, 47V/343D/345Q/393V, 48D, 48D/68E, 48D/68E/217K/333F/391A/393V, 48D/68E/333F, 48D/217K, 48D/333F, 48D/333G, 48D/345Q/393V, 48D/393V, 59A/143S, 68E, 68E/345Q, 130E, 130E/158R, 130E/158R/393V, 130E/345Q/393V, 143S/271N, 143S/333N, 143S/387N, 151L, 151L/158R/217K/343G/345Q/393V, 151L/206S/282N/337R/343D/345Q/398A, 151L/282N/393V, 151L/345Q/393V/398A, 151L/393V, 158R, 158R/393V, 202N, 206S, 206S/217K, 217K, 217K/333F, 217K/333G, 217K/337R/345Q/398A, 271N, 282N/393V, 333F/345Q, 333G, 333N, 337R/343G/345Q/398A, 343D, 343D/345Q/393V/398A, 393V e 393V/398A, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 158. Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre D24S/D202N, E39V/T47D, E39V/T47V/R217K, E39V/D151L, E39V/D282N/P337R/L398A, E39V/P337R/K343G/L398A, E39V/S393V/L398A, T47V/D130E, T47V/D151L, T47V/K343D/V345Q/S393V, E48D, E48D/Q68E, E48D/Q68E/R217K/S333F/Q391A/S393V, E48D/Q68E/S333F, E48D/R217K, E48D/S333F, E48D/S333G, E48D/V345Q/S393V, E48D/S393V, C59A/C143S, Q68E, Q68E/V345Q, D130E, D130E/L158R, D130E/L158R/S393V, D130E/V345Q/S393V, C143S/A271N, C143S/S333N, C143S/E387N, D151L, D151L/L158R/R217K/K343G/V345Q/S393V, D151L/A206S/D282N/P337R/K343D/V345Q/L398A,
11 / 169 D151L/D282N/S393V, D151L/V345Q/S393V/L398A, D151L/S393V, L158R, L158R/S393V, D202N, A206S, A206S/R217K, R217K, R217K/S333F, R217K/S333G, R217K/P337R/V345Q/L398A, A271N, D282N/S393V, S333F/V345Q, S333G, S333N, P337R/K343G/V345Q/L398A, K343D, K343D/V345Q/S393V/L398A, S393V e S393V/L398A, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO:
158.
[0011] A presente invenção também provê alfa-galactosidase A recombinante em que a dita compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 372, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 10, 10/39/44/322, 10/39/92/206/217/271, 10/39/92/247, 10/39/92/247/271/316, 10/44, 10/44/47/92/247, 10/44/47/261/302/322/368, 10/44/92/316/322, 10/44/261/302/316, 10/44/302/337/368, 10/47/217/247/316/392, 10/47/217/322, 10/47/271, 10/92, 10/92/206/217/247, 10/92/206/247/316/322/392, 10/92/206/247/322/368, 10/92/217/261/302/337, 10/206/217/271, 10/206/247, 10/206/261/271/316, 10/261, 10/271/302, 10/302, 10/302/316, 10/302/322/337, 10/316/322, 10/337/392, 10/368, 39/44/92/162/247/302/316/322, 39/44/92/217/322, 39/44/92/247/271/302, 39/47/92/247/302/316/322, 39/47/217/247/368, 39/47/247, 39/92/247/302/316/337/368, 39/92/316/322, 39/247/271, 39/247/271/316, 39/322, 44/47/92/206/217/316/322, 44/47/92/247/261/271/316/337/368, 44/47/206/217/247/271/322, 44/47/247/322/368, 44/47/302/316/322, 44/92/206/247/368, 44/206/337, 44/247/261/302/316, 44/247/261/302/316/322, 47/92/247/271, 47/217/302, 47/247, 47/247/271,
12 / 169 89/217/247/261/302/316, 92/217/271, 92/247, 92/247/271/322, 92/247/302/322/337, 92/271/337, 92/302, 92/316, 206/217/271/392, 217/247/316/322/337/368, 247, 247/271, 247/302, 271, 271/302/322, 271/316/322, 302/322/368 e 368, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO:
372. Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 372, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 10P, 10P/39E/44R/322I, 10P/39E/92H/206A/217R/271A, 10P/39E/92H/247D, 10P/39E/92H/247D/271A/316D, 10P/44R, 10P/44R/47T/92H/247D, 10P/44R/47T/261G/302K/322I/368A, 10P/44R/92H/316D/322I, 10P/44R/261G/302K/316D, 10P/44R/302K/337P/368A, 10P/47T/217R/247D/316D/392T, 10P/47T/217R/322I, 10P/47T/271A, 10P/92H, 10P/92H/206A/217R/247D, 10P/92H/206A/247D/316D/322I/392T, 10P/92H/206A/247D/322I/368A, 10P/92H/217R/261G/302K/337P, 10P/206A/217R/271A, 10P/206A/247D, 10P/206A/261G/271A/316D, 10P/261G, 10P/271A/302K, 10P/302K, 10P/302K/316D, 10P/302K/322I/337P, 10P/316D/322I, 10P/337P/392T, 10P/368A, 39E/44R/92H/162M/247D/302K/316D/322I, 39E/44R/92H/217R/322I, 39E/44R/92H/247D/271A/302K, 39E/47T/92H/247D/302K/316D/322I, 39E/47T/217R/247D/368A, 39E/47T/247D, 39E/92H/247D/302K/316D/337P/368A, 39E/92H/316D/322I, 39E/247D/271A, 39E/247D/271A/316D, 39E/322I, 44R/47T/92H/206A/217R/316D/322I, 44R/47T/92H/247D/261G/271A/316D/337P/368A,
13 / 169
44R/47T/206A/217R/247D/271A/322I, 44R/47T/247D/322I/368A, 44R/47T/302K/316D/322I, 44R/92H/206A/247D/368A, 44R/206A/337P, 44R/247D/261G/302K/316D, 44R/247D/261G/302K/316D/322I, 47T/92H/247D/271A, 47T/217R/302K, 47T/247D, 47T/247D/271A, 89I/217R/247D/261G/302K/316D, 92H/217R/271A, 92H/247D, 92H/247D/271A/322I, 92H/247D/302K/322I/337P, 92H/271A/337P, 92H/302K, 92H/316D, 206A/217R/271A/392T, 217R/247D/316D/322I/337P/368A, 247D, 247D/271A, 247D/302K, 271A, 271A/302K/322I, 271A/316D/322I, 302K/322I/368A e 368A, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 372. Em algumas modalidades, a alfa- galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 372, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre T10P, T10P/M39E/L44R/M322I, T10P/M39E/Y92H/K206A/F217R/H271A, T10P/M39E/Y92H/N247D, T10P/M39E/Y92H/N247D/H271A/L316D, T10P/L44R, T10P/L44R/S47T/Y92H/N247D, T10P/L44R/S47T/A261G/Q302K/M322I/W368A, T10P/L44R/Y92H/L316D/M322I, T10P/L44R/A261G/Q302K/L316D, T10P/L44R/Q302K/A337P/W368A, T10P/S47T/F217R/N247D/L316D/M392T, T10P/S47T/F217R/M322I, T10P/S47T/H271A, T10P/Y92H, T10P/Y92H/K206A/F217R/N247D, T10P/Y92H/K206A/N247D/L316D/M322I/M392T, T10P/Y92H/K206A/N247D/M322I/W368A, T10P/Y92H/F217R/A261G/Q302K/A337P, T10P/K206A/F217R/H271A, T10P/K206A/N247D, T10P/K206A/A261G/H271A/L316D, T10P/A261G,
14 / 169 T10P/H271A/Q302K, T10P/Q302K, T10P/Q302K/L316D, T10P/Q302K/M322I/A337P, T10P/L316D/M322I, T10P/A337P/M392T, T10P/W368A, M39E/L44R/Y92H/R162M/N247D/Q302K/L316D/M322I, M39E/L44R/Y92H/F217R/M322I, M39E/L44R/Y92H/N247D/H271A/Q302K, M39E/S47T/Y92H/N247D/Q302K/L316D/M322I, M39E/S47T/F217R/N247D/W368A, M39E/S47T/N247D, M39E/Y92H/N247D/Q302K/L316D/A337P/W368A, M39E/Y92H/L316D/M322I, M39E/N247D/H271A, M39E/N247D/H271A/L316D, M39E/M322I, L44R/S47T/Y92H/K206A/F217R/L316D/M322I, L44R/S47T/Y92H/N247D/A261G/H271A/L316D/A337P/W368A, L44R/S47T/K206A/F217R/N247D/H271A/M322I, L44R/S47T/N247D/M322I/W368A, L44R/S47T/Q302K/L316D/M322I, L44R/Y92H/K206A/N247D/W368A, L44R/K206A/A337P, L44R/N247D/A261G/Q302K/L316D, L44R/N247D/A261G/Q302K/L316D/M322I, S47T/Y92H/N247D/H271A, S47T/F217R/Q302K, S47T/N247D, S47T/N247D/H271A, L89I/F217R/N247D/A261G/Q302K/L316D, Y92H/F217R/H271A, Y92H/N247D, Y92H/N247D/H271A/M322I, Y92H/N247D/Q302K/M322I/A337P, Y92H/H271A/A337P, Y92H/Q302K, Y92H/L316D, K206A/F217R/H271A/M392T, F217R/N247D/L316D/M322I/A337P/W368A, N247D, N247D/H271A, N247D/Q302K, H271A, H271A/Q302K/M322I, H271A/L316D/M322I, Q302K/M322I/W368A e W368A, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO:
372.
[0012] A presente invenção também provê alfa-galactosidase A recombinante em que a dita compreende uma sequência polipeptídica tendo
15 / 169 pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 374, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 10/36/92/166/247/261/316/392, 10/39, 10/39/44/47/92/206/217, 10/39/44/47/316, 10/39/44/47/337, 10/39/44/92/166/261/316/322, 10/39/44/92/166/302/322, 10/39/44/92/166/392, 10/39/44/92/217/302/322, 10/39/44/92/302/322, 10/39/44/166/261/271/316/322, 10/39/44/392, 10/39/47/92/337, 10/39/92/131/166/271/316/322, 10/39/92/166/217/247/271, 10/39/92/217/316, 10/44/47/166/261/271, 10/44/47/166/271/322/368, 10/44/47/217/271/316/322, 10/44/92, 10/44/92/217/247/271/302/316/392, 10/44/166/302, 10/44/206/316/322, 10/47/92/166/271/316/337, 10/47/92/271/302, 10/47/92/316/322/392, 10/47/166/271, 10/47/166/316, 10/92/166, 10/92/166/217/247/261/271, 10/92/166/261/271/392, 10/92/166/261/316/322/337, 10/92/166/337/368, 10/92/302/337, 10/92/316/322, 10/206, 10/206/247/261, 10/217/322, 10/261, 10/261/337/392, 10/316/392, 10/368, 39/44/47/92/166/206/392, 39/44/47/92/206/247/261, 39/44/47/92/206/392, 39/44/47/206/337/368/392, 39/44/92/166/247/261/302/337, 39/44/166/271, 39/44/166/271/337/368/392, 39/47/92/316/322, 39/47/92/392, 39/47/166/217/261/392, 39/47/217/247/368, 39/47/247, 39/92/166/217/392, 39/92/261/302, 39/166/217/261/316/368, 39/322, 39/392, 44/47, 44/47/92/217/271, 44/47/92/217/316/322/392, 44/47/92/392, 44/47/166, 44/47/166/271, 44/47/247/271/392, 44/316/322/392, 44/337, 47/166/206/217/247/337, 47/166/217/271/337, 47/206, 47/217/247/261, 47/271, 52/217/302/316, 92/166/206/271/316, 92/166/217/261/271/392, 92/166/217/316/337/392, 92/166/247, 92/166/316, 92/206/322, 92/217, 92/217/271/337, 92/261/271, 92/271, 166/217/316/322/337, 166/247/271/316, 166/316/322/337, 206/217, 217/392,
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247/316, 316/322/368 e 316/337/392, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 374. Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 374, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 10T/36M/92Y/166S/247N/261A/316L/392M, 10T/39M, 10T/39M/44L/47S/92Y/206K/217F, 10T/39M/44L/47S/316L, 10T/39M/44L/47S/337A, 10T/39M/44L/92Y/166S/261A/316L/322M, 10T/39M/44L/92Y/166S/302Q/322M, 10T/39M/44L/92Y/166S/392M, 10T/39M/44L/92Y/217F/302Q/322M, 10T/39M/44L/92Y/302Q/322M, 10T/39M/44L/166S/261A/271H/316L/322M, 10T/39M/44L/392M, 10T/39M/47S/92Y/337A, 10T/39M/92Y/131G/166S/271H/316L/322M, 10T/39M/92Y/166S/217F/247N/271H, 10T/39M/92Y/217F/316L, 10T/44L/47S/166S/261A/271H, 10T/44L/47S/166S/271H/322M/368W, 10T/44L/47S/217F/271H/316L/322M, 10T/44L/92Y, 10T/44L/92Y/217F/247N/271H/302Q/316L/392M, 10T/44L/166S/302Q, 10T/44L/206K/316L/322M, 10T/47S/92Y/166S/271H/316L/337A, 10T/47S/92Y/271H/302Q, 10T/47S/92Y/316L/322M/392M, 10T/47S/166S/271H, 10T/47S/166S/316L, 10T/92Y/166S, 10T/92Y/166S/217F/247N/261A/271H, 10T/92Y/166S/261A/271H/392M, 10T/92Y/166S/261A/316L/322M/337A, 10T/92Y/166S/337A/368W, 10T/92Y/302Q/337A, 10T/92Y/316L/322M, 10T/206K, 10T/206K/247N/261A, 10T/217F/322M, 10T/261A, 10T/261A/337A/392M, 10T/316L/392M, 10T/368W, 39M/44L/47S/92Y/166S/206K/392M, 39M/44L/47S/92Y/206K/247N/261A, 39M/44L/47S/92Y/206K/392M, 39M/44L/47S/206K/337A/368W/392M,
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39M/44L/92Y/166S/247N/261A/302Q/337A, 39M/44L/166S/271H, 39M/44L/166S/271H/337A/368W/392M, 39M/47S/92Y/316L/322M, 39M/47S/92Y/392M, 39M/47S/166S/217F/261A/392M, 39M/47S/217F/247N/368W, 39M/47S/247N, 39M/92Y/166S/217F/392M, 39M/92Y/261A/302Q, 39M/166S/217F/261A/316L/368W, 39M/322M, 39M/392M, 44L/47S, 44L/47S/92Y/217F/271H, 44L/47S/92Y/217F/316L/322M/392M, 44L/47S/92Y/392M, 44L/47S/166S, 44L/47S/166S/271H, 44L/47S/247N/271H/392M, 44L/316L/322M/392M, 44L/337A, 47S/166S/206K/217F/247N/337A, 47S/166S/217F/271H/337A, 47S/206K, 47S/217F/247N/261A, 47S/271H, 52N/217F/302Q/316L, 92Y/166S/206K/271H/316L, 92Y/166S/217F/261A/271H/392M, 92Y/166S/217F/316L/337A/392M, 92Y/166S/247N, 92Y/166S/316L, 92Y/206K/322M, 92Y/217F, 92Y/217F/271H/337A, 92Y/261A/271H, 92Y/271H, 166S/217F/316L/322M/337A, 166S/247N/271H/316L, 166S/316L/322M/337A, 206K/217F, 217F/392M, 247N/316L, 316L/322M/368W e 316L/337A/392M, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 374. Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 374, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre P10T/K36M/H92Y/P166S/D247N/G261A/D316L/T392M, P10T/E39M, P10T/E39M/R44L/T47S/H92Y/A206K/R217F, P10T/E39M/R44L/T47S/D316L, P10T/E39M/R44L/T47S/P337A, P10T/E39M/R44L/H92Y/P166S/G261A/D316L/I322M, P10T/E39M/R44L/H92Y/P166S/K302Q/I322M,
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P10T/E39M/R44L/H92Y/P166S/T392M, P10T/E39M/R44L/H92Y/R217F/K302Q/I322M, P10T/E39M/R44L/H92Y/K302Q/I322M, P10T/E39M/R44L/P166S/G261A/A271H/D316L/I322M, P10T/E39M/R44L/T392M, P10T/E39M/T47S/H92Y/P337A, P10T/E39M/H92Y/W131G/P166S/A271H/D316L/I322M, P10T/E39M/H92Y/P166S/R217F/D247N/A271H, P10T/E39M/H92Y/R217F/D316L, P10T/R44L/T47S/P166S/G261A/A271H, P10T/R44L/T47S/P166S/A271H/I322M/A368W, P10T/R44L/T47S/R217F/A271H/D316L/I322M, P10T/R44L/H92Y, P10T/R44L/H92Y/R217F/D247N/A271H/K302Q/D316L/T392M, P10T/R44L/P166S/K302Q, P10T/R44L/A206K/D316L/I322M, P10T/T47S/H92Y/P166S/A271H/D316L/P337A, P10T/T47S/H92Y/A271H/K302Q, P10T/T47S/H92Y/D316L/I322M/T392M, P10T/T47S/P166S/A271H, P10T/T47S/P166S/D316L, P10T/H92Y/P166S, P10T/H92Y/P166S/R217F/D247N/G261A/A271H, P10T/H92Y/P166S/G261A/A271H/T392M, P10T/H92Y/P166S/G261A/D316L/I322M/P337A, P10T/H92Y/P166S/P337A/A368W, P10T/H92Y/K302Q/P337A, P10T/H92Y/D316L/I322M, P10T/A206K, P10T/A206K/D247N/G261A, P10T/R217F/I322M, P10T/G261A, P10T/G261A/P337A/T392M, P10T/D316L/T392M, P10T/A368W, E39M/R44L/T47S/H92Y/P166S/A206K/T392M, E39M/R44L/T47S/H92Y/A206K/D247N/G261A, E39M/R44L/T47S/H92Y/A206K/T392M, E39M/R44L/T47S/A206K/P337A/A368W/T392M, E39M/R44L/H92Y/P166S/D247N/G261A/K302Q/P337A, E39M/R44L/P166S/A271H, E39M/R44L/P166S/A271H/P337A/A368W/T392M,
19 / 169 E39M/T47S/H92Y/D316L/I322M, E39M/T47S/H92Y/T392M, E39M/T47S/P166S/R217F/G261A/T392M, E39M/T47S/R217F/D247N/A368W, E39M/T47S/D247N, E39M/H92Y/P166S/R217F/T392M, E39M/H92Y/G261A/K302Q, E39M/P166S/R217F/G261A/D316L/A368W, E39M/I322M, E39M/T392M, R44L/T47S, R44L/T47S/H92Y/R217F/A271H, R44L/T47S/H92Y/R217F/D316L/I322M/T392M, R44L/T47S/H92Y/T392M, R44L/T47S/P166S, R44L/T47S/P166S/A271H, R44L/T47S/D247N/A271H/T392M, R44L/D316L/I322M/T392M, R44L/P337A, T47S/P166S/A206K/R217F/D247N/P337A, T47S/P166S/R217F/A271H/P337A, T47S/A206K, T47S/R217F/D247N/G261A, T47S/A271H, D52N/R217F/K302Q/D316L, H92Y/P166S/A206K/A271H/D316L, H92Y/P166S/R217F/G261A/A271H/T392M, H92Y/P166S/R217F/D316L/P337A/T392M, H92Y/P166S/D247N, H92Y/P166S/D316L, H92Y/A206K/I322M, H92Y/R217F, H92Y/R217F/A271H/P337A, H92Y/G261A/A271H, H92Y/A271H, P166S/R217F/D316L/I322M/P337A, P166S/D247N/A271H/D316L, P166S/D316L/I322M/P337A, A206K/R217F, R217F/T392M, D247N/D316L, D316L/I322M/A368W e D316L/P337A/T392M, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 374.
[0013] Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A da presente invenção compreende pelo menos uma mutação em pelo menos uma posição como provida na Tabela 2-1, 5-1, 6-1, 7-1, 8-1 e/ou 9-1, em que as posições são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades adicionais, a alfa-galactosidase A recombinante é derivada de uma alfa-galactosidase A humana. Em mais algumas modalidades adicionais, a alfa-galactosidase A recombinante compreende a sequência polipeptídica de
20 / 169 SEQ ID NO: 8, 58, 158, 372 e/ou 374.
[0014] Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante é mais termoestável que a alfa-galactosidase A de SEQ ID NO: 2, 8, 58, 158, 372 e/ou 374. Em algumas modalidades adicionais, a alfa-galactosidase A recombinante é mais estável em pH 7 que a alfa-galactosidase A de SEQ ID NO: 2, 8, 58, 158, 372 e/ou 374. Em ainda algumas modalidades adicionais, a alfa-galactosidase A recombinante é mais estável em pH 4 que a alfa- galactosidase A de SEQ ID NO: 2, 8, 58, 158, 372 e/ou 374. Em algumas outras modalidades adicionais, a alfa-galactosidase A recombinante é mais estável em pH 7 e mais estável em pH 4 que a alfa-galactosidase A de SEQ ID NO: 2, 8, 58, 158, 372 e/ou 374. Em modalidades ainda adicionais, a alfa- galactosidase A recombinante é mais estável à exposição ao soro que a alfa- galactosidase A de SEQ ID NO: 2, 8, 58, 158, 372 e/ou 374. Em mais algumas modalidades adicionais, a alfa-galactosidase A recombinante é mais estável aos lisossomos que a alfa-galactosidase A de SEQ ID NO:2, 8, 58, 158, 372 e/ou 374. Em ainda algumas modalidades adicionais, a alfa- galactosidase A recombinante é absorvida mais prontamente pelas células que a alfa-galactosidase A de SEQ ID NO: 2, 8, 58, 158, 372 e/ou 374. Em mais algumas modalidades adicionais, a alfa-galactosidase A recombinante provoca mais depleção de globotriaosilceramida das células que a alfa- galactosidase A de SEQ ID NO: 2, 8, 58, 158, 372 e/ou 374. Em ainda algumas modalidades adicionais, a alfa-galactosidase A recombinante exibe absorção aumentada nas células, em comparação a SEQ ID NO: 2, 8, 58, 158, 372 e/ou 374. Em mais algumas modalidades adicionais, a alfa-galactosidase A recombinante é menos imunogênica que a alfa-galactosidase A de SEQ ID NO: 2, 8, 58, 158, 372 e/ou 374. Em mais algumas modalidades adicionais, a alfa-galactosidase A recombinante exibe pelo menos uma propriedade melhorada selecionada dentre: i) atividade catalítica aprimorada; ii) tolerância aumentada a pH 7; iii) tolerância aumentada a pH 4; iv) tolerância aumentada
21 / 169 ao soro; v) absorção aumentada nas células; vi) imunogenicidade reduzida; ou vii) depleção aumentada de globotriaosilceramida das células; ou uma combinação de qualquer um dentre i), ii), iii), iv), v), vi) ou vii), em comparação a uma sequência de referência. Em algumas modalidades, a sequência de referência é SEQ ID NO: 2, 8, 58, 158, 372 e/ou 374. Em mais algumas modalidades adicionais, a alfa-galactosidase A recombinante é purificada.
[0015] A presente invenção também provê sequências de polinucleotídeos recombinantes que codificam pelo menos uma alfa- galactosidase A recombinante como aqui provida (por exemplo, na Tabela 2- 1, 5-1, 6-1, 7-1, 8-1 e/ou 9-1). Em algumas modalidades, uma sequência de polinucleotídeo é selecionada dentre DNA, RNA e mRNA.
[0016] Em algumas modalidades, a sequência de polinucleotídeo recombinante contém códons otimizados.
[0017] A presente invenção também provê vetores de expressão que compreendem uma sequência de polinucleotídeo recombinante que codifica pelo menos uma alfa-galactosidase A recombinante como aqui provida (por exemplo, Tabela 2-1, 5-1, 6-1, 7-1, 8-1 e/ou 9-1). Em algumas modalidades, a sequência de polinucleotídeo recombinante é operacionalmente ligada a uma sequência de controle. Em algumas modalidades adicionais, a sequência controle é um promotor. Em mais algumas modalidades adicionais, o promotor é um promotor heterólogo. Em algumas modalidades, o vetor de expressão compreende adicionalmente uma sequência sinal, como aqui provida.
[0018] A presente invenção também provê células hospedeiras que compreendem pelo menos um vetor de expressão como aqui provido. Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende um vetor de expressão compreendendo a sequência de polinucleotídeo recombinante que codifica pelo menos uma alfa-galactosidase A recombinante como aqui provida (por
22 / 169 exemplo, Tabela 2-1, 5-1, 6-1, 7-1, 8-1 e/ou 9-1). Em algumas modalidades, a célula hospedeira é selecionada dentre eucarióticas e procarióticas. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é eucariótica. Em algumas modalidades adicionais, a célula hospedeira é uma célula de mamífero.
[0019] A presente invenção também provê métodos para produzir uma variante de alfa-galactosidase A, o qual compreende cultivar uma célula hospedeira aqui provida, sob condições em que a alfa-galactosidase A codificada pelo polinucleotídeo recombinante seja produzida. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente a etapa de recuperar a alfa-galactosidase A. Em mais algumas modalidades adicionais, os métodos compreendem adicionalmente a etapa de purificar a alfa-galactosidase A. A presente invenção também provê composições que compreendem pelo menos uma alfa-galactosidase A recombinante como aqui provida (por exemplo, Tabela 2-1, 5-1, 6-1, 7-1, 8-1 e/ou 9-1). Em algumas modalidades, a presente invenção provê composições farmacêuticas. Em algumas modalidades, a presente invenção provê composições farmacêuticas que compreendem pelo menos um polinucleotídeo recombinante aqui provido. Em algumas modalidades adicionais, a presente invenção provê composições farmacêuticas para o tratamento de doença de Fabry, compreendendo uma composição de enzima aqui provida. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem adicionalmente um carreador e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades adicionais, a composição farmacêutica é adequada para injeção ou infusão parenteral em um humano.
[0020] A presente invenção também provê métodos para tratar e/ou prevenir os sintomas da doença de Fabry em um indivíduo, os quais compreendem prover um indivíduo tendo a doença de Fabry, e prover pelo menos uma composição farmacêutica composições compreendendo pelo menos uma alfa-galactosidase A recombinante como aqui provida (por
23 / 169 exemplo, Tabela 2-1, 5-1, 6-1, 7-1, 8-1 e/ou 9-1), e administrar a composição farmacêutica ao indivíduo. Em algumas modalidades, os sintomas da doença de Fabry são aliviados no indivíduo. Em algumas modalidades adicionais, o indivíduo a quem foi administrada a composição farmacêutica da presente invenção pode comer uma dieta que é menos restrita em seu teor de gordura que dietas exigidas por indivíduos que exibem os sintomas da doença de Fabry. Em algumas modalidades, o indivíduo é um lactente ou criança enquanto que, em algumas modalidades alternativas, o indivíduo é um adulto ou jovem adulto.
[0021] A presente invenção também provê o uso das composições aqui provida. Breve descrição dos desenhos
[0022] A Figura 1 fornece um gráfico que mostra a atividade relativa de variantes de GLA depois de incubação por 1 hora a temperaturas de 30-50 ºC.
[0023] A Figura 2 fornece um gráfico que mostra a atividade relativa de variantes de GLA depois do desafio, a 37 ºC por 0-24 horas, com soro humano.
[0024] A Figura 3 fornece um gráfico que mostra a atividade relativa de variantes de GLA depois do desafio, a 37 °C por 0-24 horas, com extrato lisossomal humano.
[0025] A Figura 4 fornece um gráfico que mostra a absorção celular de diferentes variantes purificadas de GLA, expressa como atividade relativa em comparação ao tipo selvagem depois de 4 horas de incubação a 37 ºC com fibroblastos cultivados de pacientes com doença de Fabry.
[0026] A Figura 5 fornece um gráfico que mostra a atividade de variantes de GLA no coração dos camundongos com doença de Fabry, em comparação a SEQ ID NO: 2, em 1, 2, e 4 semanas após a administração.
[0027] A Figura 6 fornece um gráfico que mostra Gb3 residual no
24 / 169 coração de camundongos com doença de Fabry tratados com variantes de GLA em 1 e 2 semanas após a administração. Descrição da invenção
[0028] A presente invenção provê polipeptídeos de alfa-galactosidase humana engenheirados e composições dos mesmos. Os polipeptídeos de alfa- galactosidase humana engenheirados foram otimizados para prover termoestabilidade aprimorada, estabilidade do soro, absorção celular aprimorada, estabilidade sob ambas as condições ácida (pH <4) e básica (pH >7), imunogenicidade reduzida e remoção aprimorada de globotriaosilceramida das células. A invenção também se refere ao uso das composições compreendendo os polipeptídeos de alfa-galactosidase humana engenheirados para fins terapêuticos.
[0029] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de alfa- galactosidase humana engenheirados foram otimizados para prover absorção celular aprimorada enquanto mantendo a estabilidade. A invenção também se refere ao uso das composições que compreendem os polipeptídeos de alfa- galactosidase humana engenheirados para fins terapêuticos.
[0030] Em alguns casos, a terapia de reposição enzimática para o tratamento de doença de Fabry (por exemplo, FABRAZYME® agalsidase beta; Genzyme) é considerada para indivíduos elegíveis. Atualmente, as terapias de reposição enzimática usadas são formas expressas por recombinação da GLA humana do tipo selvagem. É sabido que GLA administrada por via intravenosa circula, é introduzida nas células por endocitose mediada por receptores, primariamente receptores de manose 6- fosfato (M6PR), e desloca-se para os endossomos/lisossomos de órgãos alvo, onde remove Gb3 acumulado. Esses fármacos não aliviam completamente os sintomas dos pacientes, uma vez que dor neuropática e ataques isquêmicos continuam a ocorrer em taxas reduzidas. Além disso, a absorção de GLA pela maioria dos órgãos alvo é pequena em comparação ao fígado altamente
25 / 169 vascularizado e rico em M6PR, e a enzima é instável no pH do sangue e dos lisossomos. Assim, os problemas permanecem com os tratamentos disponíveis. Além disso, os pacientes podem desenvolver uma resposta imune (anticorpos IgG e IgE direcionados contra o fármaco direcionado), e sofrem reações alérgicas graves (anafiláticas), reações graves à infusão e mesmo morte. A presente invenção destina-se a prover enzimas mais estáveis e eficazes, adequadas para o tratamento de doença de Fabry, todavia, com efeitos colaterais reduzidos e resultados melhorados, em comparação aos tratamentos atualmente disponíveis. De fato, a presente invenção destina-se a prover enzimas recombinantes de GLA com estabilidade aumentada no sangue (pH 7,4), com o qual a enzima se depara quando da introdução na corrente sanguínea. Além disso, a enzima tem estabilidade aumentada no pH do lisossomo (pH 4,3), o local onde a enzima é ativa durante a terapia. Assim, a evolução direcionada de GLA humana expressa por recombinação em células HEK293T humanas, empregando o rastreio de alto rendimento de diversas bibliotecas de variantes da enzima, foi utilizada para prover novas variantes de GLA com as propriedades de estabilidade mantidas, remoção aprimorada de globotriaosilceramida e absorção celular. Em algumas modalidades, as variantes de GLA exibem imunogenicidade reduzida. Abreviações e definições:
[0031] A menos que definidos de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm geralmente o mesmo significado que o comumente entendido por qualquer técnico no assunto ao qual pertence esta invenção. Em geral, a nomenclatura aqui usada e os procedimentos laboratoriais de cultura celular, genética molecular, microbiologia, bioquímica, química orgânica, química analítica e de química de ácidos nucleicos descritos abaixo são aqueles que são bem conhecidos e comumente empregados na técnica. Tais técnicas são bem conhecidas e descritas em inúmeros textos e trabalhos de referência bem conhecidos pelos técnicos no
26 / 169 assunto. Técnicas padrão, ou modificações das mesmas, são usadas para sínteses químicas e análises químicas. Todas as patentes, os pedidos de patente, artigos e publicações aqui mencionados, tanto acima como abaixo, pelo presente, são expressamente incorporados por referência.
[0032] Embora quaisquer métodos adequados e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos encontrem utilidade na prática da presente invenção, alguns métodos e materiais são descritos neste documento. Deve ficar entendido que esta invenção não está limitada à metodologia, protocolos e os reagentes específicos descritos, pois esses podem variar, dependendo do contexto em que são usados pelos técnicos no assunto. Deste modo, os termos definidos imediatamente abaixo são descritos mais completamente tendo por referência o pedido de patente como um todo. Todas as patentes, os pedidos de patente, artigos e publicações aqui mencionados, tanto acima como abaixo, pelo presente, são expressamente incorporados por referência.
[0033] Além disso, neste relatório descritivo, o singular “um”, “uma”, “o” e “a” incluem as referências no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário.
[0034] As faixas numéricas incluem os números que definem a faixa. Assim, toda faixa numérica aqui descrita destina-se a abranger toda faixa numérica mais estreita que se enquadre dentro de tal faixa numérica mais larga, como o seria caso tais faixas numéricas mais estreitas tivessem sido expressamente escritas no presente. Também se pretende que toda limitação numérica máxima (ou mínima) aqui descrita inclua toda limitação numérica menor (ou maior), como o seria caso tais limitações numéricas menores (ou maiores) tivessem disso expressamente escritas no presente.
[0035] O termo “aproximadamente” significa um erro aceitável para um determinado valor. Em alguns casos, “aproximadamente” significa dentro de 0,05%, 0,5%, 1,0% ou 2,0% de uma dada faixa de valor. Em alguns casos, “aproximadamente” significa dentro de 1, 2, 3 ou 4 desvios padrão de um
27 / 169 dado valor.
[0036] Além disso, os títulos aqui providos não são limitações dos vários aspectos ou modalidades da invenção que podem ter por referência ao pedido de patente como um todo. Assim, os termos definidos imediatamente abaixo são definidos mais completamente por referência ao pedido de patente como um todo. Não obstante, visando facilitar a compreensão da invenção, vários termos são definidos abaixo.
[0037] A menos que indicado de outra forma, os ácidos nucleicos são escritos da esquerda para direita na orientação 5’ para 3’; as sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para direita na orientação amino para carbóxi, respectivamente.
[0038] Neste relatório descritivo, o termo “compreender” e seus cognatos são usados no sentido de inclusão (ou seja, equivalentes ao termo “incluir” e seus cognatos correspondentes).
[0039] O número “EC” refere-se à Enzyme Nomenclature of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry e Molecular Biology (NC-IUBMB). A classificação bioquímica da IUBMB é um sistema numérico de classificação para enzimas com base nas reações químicas que elas catalisam.
[0040] “ATCC” refere-se à American Type Culture Collection cuja coleção do biorrepositório inclui genes e cepas.
[0041] “NCBI” refere-se ao National Center for Biological Information e os bancos de dados de sequências providos no mesmo.
[0042] “Proteína”, “polipeptídeo” e “peptídeo” são usados de forma intercambiável no presente para indicar um polímero de pelo menos dois aminoácidos ligados covalentemente por uma ligação amida, independentemente do comprimento ou modificação pós-traducional (por exemplo, glicosilação ou fosforilação).
[0043] “Aminoácidos” são referidos no presente por seus símbolos de
28 / 169 três letras comumente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Biochemical Nomenclature Commission do IUPAC-IUB. Nucleotídeos, igualmente, podem ser referidos por seus códigos comumente aceitos de uma única letra.
[0044] O termo “engenheirado”, “recombinante”, “de ocorrência não natural” e “variante”, quando usado com referência a uma célula, um polinucleotídeo ou um polipeptídeo refere-se a um material ou a um material correspondente à forma natural ou nativa do material que foi modificado de uma maneira que do contrário não existira na natureza, ou é idêntico ao mesmo, mas produzido ou derivado de materiais sintéticos e/ou por manipulação empregando técnicas recombinantes.
[0045] Neste relatório descritivo, “UTR” refere-se a regiões não traduzidas de um polinucleotídeo do mRNA. Em algumas modalidades, uma “região não traduzida 5’” ou “5’UTR” é referida como uma “sequência líder” ou “RNA líder”. Essa região do mRNA está diretamente a montante do códon iniciador. Em algumas modalidades, uma “região não traduzida 3’” ou “3’UTR” é uma região do mRNA diretamente a jusante do códon de parada. Em vários organismos (por exemplo, procariotos, eucariotos e vírus), essas duas regiões são importantes para regulação da tradução e tráfego intracelular.
[0046] Neste relatório descritivo, “tipo selvagem” e “ocorrência natural” referem-se à forma encontrada na natureza. Por exemplo, uma sequência de polipeptídeo ou de polinucleotídeo do tipo selvagem é uma sequência presente em um organismo que pode ser isolada de uma fonte na natureza e que não tenha sido intencionalmente modificada por manipulação humana.
[0047] “Sequência de codificação” refere-se àquela parte de um ácido nucleico (por exemplo, um gene) que codifica uma sequência de aminoácidos de uma proteína.
[0048] O termo “percentual (%) de identidade de sequência”, neste
29 / 169 relatório descritivo, refere-se a comparações entre polinucleotídeos e polipeptídeos, e é determinado comparando duas sequências otimamente alinhadas ao longo de uma janela de comparação, em que a porção da sequência do polinucleotídeo ou polipeptídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (ou seja, gaps) em comparação à sequência de referência para alinhamento ótimo das duas sequências.
A porcentagem pode ser calculada determinando o número de posições nas quais ocorre a base de ácido nucleico ou o resíduo de aminoácido idênticos em ambas as sequências para produzir o número de posições matched (correspondentes), dividindo o número de posições matched pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência.
Alternativamente, a porcentagem pode ser calculada determinando o número de posições nas quais ocorre a base de ácido nucleico ou o resíduo de aminoácido idênticos em ambas as sequências ou nas quais uma base de ácido nucleico ou o resíduo de aminoácido está alinhado com um gap (espaço) para produzir o número de posições matched, dividindo o número de posições matched pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência.
Os técnicos no assunto reconhecem que há muitos algoritmos estabelecidos disponíveis para alinhar duas sequências.
O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (Smith e Waterman, Adv.
Appl.
Math., 2:482 [1981]), pelo algoritmo de alinhamento por homologia de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch, J.
Mol.
Biol., 48:443 [1970), pelo método para a busca por similaridade de Pearson e Lipman (Pearson e Lipman, Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 85:2444 [1988]), por implementações computadorizadas desses algoritmos (por exemplo, GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no pacote de softwares GCG Wisconsin) ou por inspeção visual, como conhecido
30 / 169 na técnica.
Os exemplos de algoritmos que são adequados para determinar o percentual de identidade de sequência e similaridade de sequência incluem, entre outros, os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos por Altschul et al. (Ver, Altschul et al., J.
Mol.
Biol., 215: 403-410 [1990]; e Altschul et al., 1977, Nucleic Acids Res., 3389-3402 [1977], respectivamente). O software para execução de análises por BLAST está disponível publicamente no site da internet do National Center for Biotechnology Information.
Esse algoritmo envolve inicialmente identificar pares de sequências de alta pontuação (HSPs) pela identificação de palavras pequenas de comprimento W na sequência de consulta, que podem corresponder ou satisfazer alguma pontuação limite com valor positivo T quando alinhados com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência do banco de dados.
T é referido como o limite para a pontuação da palavra na vizinhança (Ver, Altschul et al., supra). Esses acertos iniciais da palavra na vizinhança atuam como sementes para iniciar as buscas para encontrar HSPs mais longos que as contêm.
Os acertos de palavra são então ampliados em ambas as direções ao longo de cada sequência até onde a pontuação acumulada do alinhamento possa ser aumentada.
As pontuações acumuladas são então calculadas usando, para sequências de nucleotídeos, os parâmetros M (pontos de recompensa para um par de resíduos que se correspondem; sempre >0) e N (pontos por penalidade para resíduos que não correspondem; sempre <0). Para sequências de aminoácidos, uma matriz de pontuação é usada para calcular a pontuação acumulada.
A extensão dos acertos de palavra em cada direção é interrompida quando a pontuação acumulada do alinhamento diminui pela quantidade X desde seu valor máximo alcançado; a pontuação acumulada vai para zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos com pontuação negativa; ou o final de qualquer uma das sequências é atingido.
Os parâmetros W, T e X do algoritmo BLAST determinam a sensibilidade e a velocidade do
31 / 169 alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa como padrões comprimento de palavra (W) igual a 11, expectativa (E) igual a 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as fitas. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrões comprimento de palavra (W) igual 3, expectativa (E) igual a 10 e a matriz de pontuação BLOSUM62 (Ver, Henikoff e Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915
[1989]). A determinação exemplar de alinhamento de sequências e % de identidade de sequência pode empregar os programas BESTFIT ou GAP no pacote de softwares GCG Wisconsin (Accelrys, Madison WI), usando os parâmetros padrão fornecidos.
[0049] “Sequência de referência” refere-se a uma sequência definida usada como base para uma comparação entre sequências. Uma sequência de referência pode ser um subconjunto de uma sequência maior, por exemplo, um segmento da sequência completa do gene ou polipeptídeo. Em geral, uma sequência de referência contém pelo menos 20 resíduos de nucleotídeos ou aminoácidos de comprimento, pelo menos 25 resíduos de comprimento, pelo menos 50 resíduos de comprimento, pelo menos 100 resíduos de comprimento ou o comprimento completo do ácido nucleico ou polipeptídeo. Dado que dois polinucleotídeos ou polipeptídeos podem cada um (1) compreender uma sequência (ou seja, uma porção da sequência completa) que é semelhante entre as duas sequências e (2) podem compreende adicionalmente uma sequência que é divergente entre as duas sequências, as comparações de sequências entre dois (ou mais) polinucleotídeos ou polipeptídeos são tipicamente realizadas comparando sequências dos dois polinucleotídeos ou polipeptídeos ao longo de uma “janela de comparação” para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. Em algumas modalidades, uma “sequência de referência” pode ter como base uma sequência primária de aminoácidos, em que a sequência de referência é uma sequência que pode ter uma ou mais alterações na sequência primária. “Janela
32 / 169 de comparação” refere-se a um segmento conceitual de pelo menos cerca de 20 posições contíguas de resíduos de nucleotídeos ou aminoácidos, em que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência de pelo menos 20 nucleotídeos ou aminoácidos contíguos e em que a porção da sequência na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (ou seja, gaps) de 20 por cento ou menos quando comparada à sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas sequências. A janela de comparação pode ser mais longa que 20 resíduos contíguos e inclui, opcionalmente, 30, 40, 50, 100 janelas ou mais longas.
[0050] “Correspondente a”, “referência a” ou “relativo a”, quando usados no contexto da numeração de uma dada sequência de aminoácidos ou polinucleotídeo refere-se à numeração dos resíduos de uma sequência de referência especificada quando a dada sequência de aminoácidos ou polinucleotídeo é comparada à sequência de referência. Em outras palavras, o número de resíduos ou a posição do resíduo de um dado polímero é designado em relação à sequência de referência em vez pela real posição numérica do resíduo na dada sequência de aminoácidos ou polinucleotídeo. Por exemplo, uma dada sequência de aminoácidos, tal como aquela de uma GLA engenheirada, pode ser alinhada com uma sequência de referência introduzindo-se gaps para otimizar a correspondência de resíduos entre as duas sequências. Nesses casos, embora os gaps estejam presentes, a numeração do resíduo na dada sequência de aminoácidos ou polinucleotídeo é feita com relação à sequência de referência à qual esta foi alinhada.
[0051] “Diferença de aminoácido” ou “diferença de resíduo” refere-se a uma diferença no resíduo de aminoácido a uma posição de uma sequência polipeptídica em relação ao resíduo de aminoácido em uma posição correspondente em uma sequência de referência. As posições das diferenças de aminoácido em geral são aqui referidas como “Xn”, onde n refere-se à
33 / 169 posição correspondente na sequência de referência na qual se baseia a diferença de resíduo.
Por exemplo, uma “diferença de resíduo na posição X44, em comparação a SEQ ID NO: 8”, refere-se a uma diferença do resíduo de aminoácido na posição do polipeptídeo correspondente à posição 44 da SEQ ID NO: 8. Assim, se o polipeptídeo de referência de SEQ ID NO: 8 tiver uma arginina na posição 44, então uma “diferença de resíduo na posição X44, em comparação a SEQ ID NO: 8”, significa uma substituição de aminoácido de qualquer resíduo, que não seja arginina, na posição do polipeptídeo correspondente à posição 44 da SEQ ID NO: 8. Na maioria dos casos no presente, o resíduo específico da diferença de aminoácido em uma posição é indicado como “XnY”, onde “Xn” especificou a posição correspondente, como descrita acima, e “Y” é o identificador de uma única letra do aminoácido verificado no polipeptídeo engenheirado (ou seja, o resíduo diferente daquele no polipeptídeo de referência). Em alguns casos (por exemplo, como mostrados nas Tabelas 2-1,5-1, 6-1, 7-1, 8-1, e 9-1), a presente descrição também provê diferenças específicas de aminoácido indicadas pela notação convencional “AnB”, onde A é o identificador de uma única letra do resíduo na sequência de referência, “n” é o número da posição do resíduo na sequência de referência e B é o identificador de uma única letra do resíduo da substituição na sequência do polipeptídeo engenheirado.
Em alguns casos, um polipeptídeo da presente descrição pode incluir uma ou mais diferenças de resíduos de aminoácido em relação a uma sequência de referência, o que é indicado por uma lista das posições especificadas onde as diferenças do resíduo estão presentes em relação à sequência de referência.
Em algumas modalidades, quando mais de um aminoácido pode ser usado em uma posição específica de resíduo de uma polipeptídeo, os vários resíduos de aminoácidos que podem ser usados são separados por “/” (por exemplo, X247D/X247N ou X247D/N). Em algumas modalidades, as variantes da enzima compreendem mais de uma substituição.
Essas substituições são
34 / 169 separadas por separadas por uma barra para facilitar a leitura (por exemplo, D24S/D202N). O presente pedido de patente inclui sequências de polipeptídeos engenheirados compreendendo uma ou mais diferenças de aminoácido que incluem substituições conservadoras e não conservadoras de aminoácidos, ou ambas.
[0052] “Substituição conservadora de aminoácido” refere-se a uma substituição de um resíduo por um resíduo diferente com uma cadeia lateral semelhante e, assim, tipicamente envolve a substituição do aminoácido no polipeptídeo por aminoácidos dentro da mesma classe definida, ou semelhante, de aminoácidos. A título de exemplo e não de limitação, um aminoácido com uma cadeia lateral alifática pode ser substituído por outro aminoácido alifático (por exemplo, alanina, valina, leucina e isoleucina); um aminoácido com cadeia lateral contendo hidroxila é substituído por outro aminoácido com uma cadeia lateral contendo hidroxila (por exemplo, serina e treonina); um aminoácido com cadeias laterais aromáticas é substituído por outro aminoácido com uma cadeia lateral aromática (por exemplo, fenilalanina, tirosina, triptofano e histidina); um aminoácido com uma cadeia lateral básica é substituído por outro aminoácido com uma cadeia lateral básica (por exemplo, lisina e arginina); um aminoácido com uma cadeia lateral ácida é substituído por outro aminoácido com uma cadeia lateral ácida (por exemplo, ácido aspártico ou ácido glutâmico); e/ou um aminoácido hidrofóbico ou hidrofílico é substituído por outro aminoácido hidrofóbico ou hidrofílico, respectivamente.
[0053] “Substituição não conservadora” refere-se a uma substituição de um aminoácido no polipeptídeo por um aminoácido com propriedades da cadeia lateral significativamente diferentes. As substituições não conservadoras podem usar aminoácidos entre, em vez de dentro, os grupos definidos e afetam (a) a estrutura da cadeia principal peptídica na área da substituição (por exemplo, prolina por glicina) (b) a carga ou hidrofobicidade
35 / 169 ou (c) a maior parte da cadeia lateral. A título de exemplo e não de limitação, uma substituição não conservadora exemplar pode ser um aminoácido ácido substituído por um aminoácido básico ou alifático; um aminoácido aromático substituído por um aminoácido pequeno; e um aminoácido hidrofílico substituído por um aminoácido hidrofóbico.
[0054] “Deleção” refere-se a uma modificação ao polipeptídeo pela remoção de um ou mais aminoácidos do polipeptídeo de referência. As deleções podem compreender a remoção de 1 ou mais aminoácidos, 2 ou mais aminoácidos, 5 ou mais aminoácidos, 10 ou mais aminoácidos, 15 ou mais aminoácidos ou 20 ou mais aminoácidos, até 10% do número total de aminoácidos ou até 20% do número total de aminoácidos que formam a enzima de referência enquanto a atividade enzimática e/ou retendo as propriedades melhoradas de uma enzima engenheirada. As deleções podem ser direcionadas às porções internas e/ou porções terminais do polipeptídeo. Em várias modalidades, a deleção pode compreender um segmento contínuo ou pode ser descontínua.
[0055] “Inserção” refere-se a uma modificação ao polipeptídeo pela adição de um ou mais aminoácidos ao polipeptídeo de referência. As inserções podem ser nas porções internas do polipeptídeo, ou ao terminal carbóxi ou amino. Inserções, neste relatório descritivo, incluem proteínas de fusão como é conhecido na técnica. A inserção pode ser um segmento contínuo de aminoácidos ou separada por um ou mais dos aminoácidos no polipeptídeo de ocorrência natural.
[0056] Um “fragmento funcional” ou um “fragmento biologicamente ativo”, usados de forma intercambiável no presente, refere-se a um polipeptídeo com deleção (ões) no terminal amino e/ou terminal carbóxi e/ou deleções internas, mas em que a sequência de aminoácidos restantes é idêntica às posições correspondentes na sequência à qual está sendo comparado (por exemplo, uma GLA engenheirada completa da presente invenção) e que retém
36 / 169 substancialmente toda a atividade do polipeptídeo completo.
[0057] “Polipeptídeo isolado” refere-se a um polipeptídeo que está substancialmente separado de outros contaminantes que naturalmente o acompanham (por exemplo, proteína, lipídios e polinucleotídeos). O termo abrange polipeptídeos que foram removidos ou purificados do seu ambiente natural ou sistema de expressão (por exemplo, célula hospedeira ou síntese in vitro). Os polipeptídeos de GLA recombinantes podem estar presentes dentro de uma célula, presentes no meio celular, ou preparados em várias formas, como lisados ou preparados isolados. Assim, em algumas modalidades, os polipeptídeos de GLA recombinantes podem ser um polipeptídeo isolado.
[0058] “Polipeptídeo substancialmente puro” refere-se a uma composição na qual a espécie de polipeptídeo é a espécie predominante presente (ou seja, em base molar ou de peso, é mais abundante do que qualquer outra espécie macromolecular individual na composição), e é geralmente uma composição substancialmente purificada quando a espécie em questão compreende pelo menos cerca de 50 por cento da espécie macromolecular presente em % mol ou % em peso. Geralmente, uma composição de GLA substancialmente pura compreende cerca de 60% ou mais, cerca de 70% ou mais, cerca de 80% ou mais, cerca de 90% ou mais, cerca de 95% ou mais e cerca de 98% ou mais de todas as espécies macromoleculares, em % mol ou em peso, presentes na composição. Em algumas modalidades, a espécie em questão é purificada até a homogeneidade essencial (ou seja, não se consegue detectar espécies contaminantes na composição por métodos convencionais de detecção), em que a composição consiste essencialmente em uma única espécie macromolecular. Espécies de solvente, moléculas pequenas (<500 Daltons) e espécies iônicas dos elementos não são consideradas espécies macromoleculares. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de GLA recombinantes isolados são composições substancialmente puras do polipeptídeo.
37 / 169
[0059] “Propriedade melhorada da enzima” refere-se a um polipeptídeo de GLA engenheirado que exibe uma melhoria em qualquer propriedade da enzima, quando comparado a um polipeptídeo de GLA de referência e/ou um polipeptídeo de GLA do tipo selvagem ou outro polipeptídeo de GLA engenheirado. As propriedades melhoradas incluem, entre outras, propriedades tais como expressão gênica aumentada, produção proteica aumentada, termoatividade aumentada, termoestabilidade aumentada, atividade aumentada em vários níveis de pH, estabilidade aumentada, atividade enzimática aumentada, especificidade ou afinidade aumentada pelo substrato, atividade específica aumentada, resistência aumentada à inibição do substrato e/ou produto, estabilidade química aumentada, quimosseletividade melhorada, estabilidade no solvente melhorada, tolerância aumentada a pH ácido, neutro ou básico, tolerância aumentada à atividade proteolítica (ou seja, sensibilidade reduzida à proteólise), agregação reduzida, solubilidade aumentada, imunogenicidade reduzida, modificação pós-traducional melhorada (por exemplo, glicosilação), perfil de temperatura alterado, absorção celular aumentada, estabilidade lisossômica aumentada, capacidade de depleção aumentada de Gb3 nas células, secreção aumentada por células produtoras de GLA etc.
[0060] “Atividade enzimática aumentada” ou “atividade catalítica aprimorada” refere-se a uma propriedade melhorada dos polipeptídeos de GLA engenheirados, a qual pode ser representada por um aumento na atividade específica (por exemplo, produto gerado/tempo/peso de proteína) ou um aumento no percentual de conversão do substrato no produto (por exemplo, percentual de conversão da quantidade inicial do substrato em produto em um período de tempo especificado usando uma quantidade especificada de GLA) em comparação à enzima GLA de referência. Métodos exemplares para determinar a atividade da enzima são fornecidos nos Exemplos. Qualquer propriedade relacionada à atividade da enzima pode ser
38 / 169 afetada, incluindo as propriedades clássicas das enzimas de Km, Vmax ou kcat, cujas alterações podem levar à atividade enzimática aumentada. As melhorias na atividade da enzima podem ser de aproximadamente 1,1 vez a atividade enzimática da enzima do tipo selvagem correspondente, até tanto quanto 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 75 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes ou mais a atividade enzimática da GLA natural ou de outra GLA engenheira a partir das quais os polipeptídeos de GLA foram derivados.
[0061] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de GLA engenheirados exibem kcat igual a pelo menos 0,1/segundo, pelo menos 0,5/segundo, pelo menos 1,0/segundo, pelo menos 5,0/segundo, pelo menos 10,0/segundo e, em algumas modalidades preferidas, superior a 10,0/segundo. Em algumas modalidades, a Km está na faixa entre aproximadamente 1µM e 5mM; na faixa entre aproximadamente 5µM e 2mM; na faixa entre aproximadamente µM e 2mM; ou na faixa entre aproximadamente 10µM e 1mM. Em algumas modalidades específicas, a enzima GLA engenheirada exibe atividade enzimática melhorada, após exposição a certas condições, na faixa de 1,5 a 10 vezes, 1,5 a 25 vezes, 1,5 a 50 vezes, 1,5 a 100 vezes ou superior àquela de uma enzima GLA de referência (por exemplo, uma GLA do tipo selvagem ou qualquer outra GLA de referência, como SEQ ID NO: 8). A atividade de GLA pode ser medida por qualquer método adequado conhecido na técnica (por exemplo, ensaios padrão, como o monitoramento de alterações em propriedades espectrofotométricas de reagentes ou produtos). Em algumas modalidades, a quantidade de produto gerado pode ser medida usando separação por Cromatografia Líquida de Alta Eficácia (HPLC) combinada com absorbância de UV ou detecção fluorescente ou após derivação com o-ftaldialdeído (OPA). Em algumas modalidades, a quantidade de produto gerado pode ser medida monitorando a fluorescência (Ex. 355 nm, Em. 460 nm) depois da hidrólise de uma molécula de 4-metilumbeliferil-alfa-
39 / 169 D-galactopiranosídeo (4-MUGal). As comparações de atividades de enzimas são feitas usando um preparado definido de enzima, um ensaio definido sob uma condição estabelecida e um ou mais substratos definidos, como descrito adicionalmente em detalhes adiante. Geralmente, quando lisados são comparados, os números de células e a quantidade de proteína analisada são determinados, bem como o uso de sistemas de expressão idênticos e células hospedeiras idênticas para minimizar as variações na quantidade de enzima produzida pelas células hospedeiras e presentes nos lisados.
[0062] O termo “tolerância melhorada a pH ácido” significa que uma GLA recombinante de acordo com a invenção terá estabilidade aumentada (maior atividade retida em pH próximo de 4,8 após exposição a pH ácido por um período especificado de tempo (1 hora, até 24 horas)) em comparação a uma GLA de referência ou outra enzima.
[0063] O termo “absorção celular aprimorada” significa que uma GLA recombinante aqui provida exibe endocitose aumentada nas células, em comparação a uma GLA de referência (incluindo GLA do tipo selvagem) ou outra enzima. Em algumas modalidades, as células são de fibroblastos de pacientes com a doença de Fabry (maior atividade intracelular retida depois de incubação com células cultivadas ao longo de um período especificado de tempo, em comparação a uma GLA de referência ou outra enzima). Em algumas modalidades adicionais, a GLA recombinante aqui provida exibe maior atividade intracelular retida com células cultivadas ao longo de um período especificado de tempo, em comparação a uma GLA de referência (incluindo GLA do tipo selvagem) ou outra enzima. Em algumas modalidades adicionais, o período de tempo é de aproximadamente 4 horas, embora em algumas modalidades, o período de tempo é inferior a 4 horas (por exemplo, 1, 2 ou 3 horas) e, em algumas modalidades alternativas, o período de tempo é superior a 4 horas (por exemplo, 5, 6, 7, 8 ou mais horas).
[0064] “pH fisiológico”, neste relatório descritivo, significa a faixa de
40 / 169 pH geralmente verificada no sangue de um indivíduo (por exemplo, humano).
[0065] O termo “pH básico” (por exemplo, usado com referência à estabilidade melhorada a condições de pH básico ou tolerância aumentada a pH básico) significa uma faixa de pH entre aproximadamente 7 e 11.
[0066] O termo “pH ácido” (por exemplo, usado com referência a estabilidade melhorada a condições de pH ácido ou tolerância aumentada a pH ácido) significa uma faixa de pH entre aproximadamente.1,5 e 4,5.
[0067] “Conversão” refere-se à conversão enzimática (ou biotransformação) de um substrato(s) no(s) produto(s) correspondente(s). “Percentual de conversão” refere-se ao percentual do substrato que é convertido no produto dentro de um período de tempo sob condições específicas. Assim, a “atividade enzimática” ou “atividade” de um polipeptídeo de GLA pode ser expressa como “percentual de conversão” do substrato no produto em um período de tempo específico.
[0068] “Rigor da hibridização” refere-se às condições de hibridização, tais como condições de lavagem, na hibridização de ácidos nucleicos. Geralmente, as reações de hibridização são realizadas sob condições de menor rigor, seguidas por lavagens de rigor variável, mas maior. O termo “hibridização moderadamente rigorosa” refere-se a condições que permitem que o DNA alvo se ligue a um ácido nucleico complementar que tenha aproximadamente 60% de identidade, de preferência aproximadamente 75% de identidade, aproximadamente 85% de identidade com o DNA alvo, tendo identidade superior a aproximadamente 90% de identidade com o polinucleotídeo alvo. Condições exemplares moderadamente rigorosas são condições equivalentes à hibridização em formamida 50%, 5× solução de Denhart, 5×SSPE, SDS 0,2% a 42 ºC, seguido por lavagem em 0,2×SSPE, SDS 0,2% a 42 ºC. “Hibridização de alto rigor” refere-se geralmente a condições que são aproximadamente 10 ºC ou menos da temperatura de fusão térmica Tm como determinada sob a condição de solução para uma sequência
41 / 169 de polinucleotídeo definida. Em algumas modalidades, uma condição de alto rigor refere-se a condições que permitem a hibridização de somente aquelas sequências de ácido nucleico que formam híbridos estáveis em NaCl 0,018M a 65 ºC (ou seja, se um híbrido não for estável em NaCl 0,018M a 65 ºC, ele não será estável sob condições de alto rigor, como aqui contempladas). Condições de alto rigor podem ser providas, por exemplo, pela hibridização em condições equivalentes a formamida 50%, 5× solução de Denhart, 5×SSPE, SDS 0,2% a 42 ºC, seguido por lavagem em 0,1×SSPE e SDS 0,1% a 65 ºC. Outra condição de alto rigor é a hibridização em condições equivalentes à hibridização em 5X SSC contendo SDS 0,1% (p/v) a 65 ºC e lavagem em 0,1x SSC contendo SDS 0,1% a 65 ºC. Outras condições para hibridização de alto rigor, bem como condições moderadamente rigorosas são descritas nas referências citadas acima.
[0069] “Códon otimizado” refere-se a mudanças nos códons do polinucleotídeo que codifica uma proteína de modo que a proteína codificada seja expressa mais eficientemente no organismo e/ou células de interesse. Embora o código genético seja degenerado no sentido de que a maioria dos aminoácidos seja representado por vários códons, denominados “sinônimos” ou códons “sinônimos, é bem sabido que o uso dos códons pelos organismos específicos não é aleatório e tende a favor de determinados tripletos de códons. Esse viés no uso dos códons pode ser maior em referência a um dado gene, genes de função ou origem ancestral comum, proteínas altamente expressas versus proteínas com número baixo de cópias e as regiões de codificação em conjunto de proteínas do genoma de um organismo. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos que codificam as enzimas GLA podem ter códons otimizados para produção ótima pelo(s) organismo(s) hospedeiro(s) e/ou tipo(s) de células selecionado(s) para expressão, que são responsáveis pelo teor de GC, sítios crípticos de splicing, sinais de terminação da transcrição, motivos que podem afetar a estabilidade do RNA e estruturas
42 / 169 secundárias do ácido nucleico, bem como por quaisquer outros fatores de interesse.
[0070] “Sequência de controle”, neste relatório descritivo, refere-se a e inclui todos os componentes que são necessários ou vantajosos para a expressão de um polinucleotídeo e/ou polipeptídeo do presente pedido de patente. Cada sequência de controle pode ser nativa ou estranha à sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo. Essas sequências de controle incluem, entre outros, uma sequência líder de poliadenilação, sequência pró- peptidíca, sequência promotora, sequência de peptídeo sinal, sequência iniciadora e terminadora da transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor e sinais de parada de transcrição e tradução. As sequências de controle podem ser providas com ligantes com o objetivo de introduzir sítios de restrição específicos que facilitam a ligação das sequências de controle com a região de codificação da sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo.
[0071] “Operacionalmente ligada” é definido no presente como uma configuração na qual uma sequência de controle encontra-se devidamente colocada (ou seja, em uma relação funcional) em uma posição relativamente a um polinucleotídeo de interesse de modo que a sequência de controle direcione ou regule a expressão do polinucleotídeo e/ou polipeptídeo de interesse.
[0072] “Sequência promotora” refere-se a uma sequência de ácido nucleico que é reconhecida por uma célula hospedeira para expressão de um polinucleotídeo de interesse, tal como uma sequência de codificação. A sequência promotora contém sequências de controle da transcrição, as quais medeiam a expressão de um polinucleotídeo de interesse. O promotor pode ser qualquer sequência de ácido nucleico que mostre atividade transcricional na célula hospedeira de escolha, incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos, e podem ser obtidos a partir de genes que codificam polipeptídeos
43 / 169 extracelulares ou intracelulares quer homólogos ou heterólogos para a célula hospedeira.
[0073] “Condições de reação adequadas” referem-se àquelas condições na solução da reação de conversão enzimática (por exemplo, faixas de carregamento de enzima, temperatura, pH, tampões, co-solventes etc.) sob as quais um polipeptídeo de GLA do presente pedido de patente é capaz de converter um substrato no composto do produto desejado. As “condições de reação adequadas” exemplares são providas no presente pedido de patente e ilustradas pelos Exemplos. “Carregamento de enzima” refere-se à concentração ou quantidade de um componente em uma mistura de reação no início da reação. “Substrato”, no contexto de um processo de reação de conversão enzimática, refere-se ao composto ou molécula que sofre a ação do polipeptídeo de GLA. “Produto”, no contexto de um processo de reação de conversão enzimática, refere-se ao composto ou molécula resultante da ação do polipeptídeo de GLA sobre um substrato.
[0074] Neste relatório descritivo, o termo “cultivar” refere-se ao crescimento de uma população de células microbianas, de mamíferos ou outras adequadas sob quaisquer condições adequadas (por exemplo, usando um meio líquido, gel ou sólido).
[0075] Polipeptídeos recombinantes podem ser produzidos por quaisquer métodos adequados conhecidos na técnica. Genes que codificam o polipeptídeo do tipo selvagem de interesse pode ser clonado em vetores, como plasmídeos, e expressos nos hospedeiros desejados, como E. coli, S. cerevisiae ou linhagens de células de mamíferos (por exemplo, células HEK ou CHO), etc. Variantes de polipeptídeos recombinantes podem ser geradas por vários métodos conhecidos na técnica. De fato, há uma grande variedade de diferentes técnicas de mutagênese bem conhecidas pelos versados no assunto. Além disso, existem também kits de mutagênese disponibilizados por muitos fornecedores comerciais de biologia molecular. Há disponíveis
44 / 169 métodos para fazer substituições específicas em aminoácidos definidos (sítio- dirigida), mutações específicas ou aleatórias em uma região localizada do gene (régio-específica), ou mutagênese aleatória ao longo do gene inteiro (por exemplo, mutagênese por saturação). Inúmeros métodos adequados são conhecidos pelos técnicos no assunto para gerar variantes de enzimas, incluindo, entre outros, mutagênese sítio-dirigida de DNA de fita simples ou DNA de fita dupla usando PCR, mutagênese em cassete, síntese de genes, PCR propensa a erro, mutagênese por embaralhamento e saturação química ou qualquer outro método adequado conhecido na técnica. Exemplos não limitantes de métodos usados para engenharia de DNA e proteínas são fornecidos nas seguintes patentes: Patente US No 6 117 679; Patente US No 6 420 175; Patente US No 6 376 246; Patente US No 6 586 182; Patente US No 7 747 391; Patente US No 7 747 393; Patente US No 7 783 428; e Patente US No 8 383 346. Depois de produzidas, as variantes podem ser rastreadas quanto a qualquer propriedade desejada (por exemplo, atividade elevada ou aumentada ou atividade baixa ou reduzida, atividade térmica aumentada, estabilidade térmica aumentada e/ou estabilidade em pH ácido etc.). Em algumas modalidades, “polipeptídeos de GLA recombinantes” (também aqui referidos como “polipeptídeos GLA engenheirados”, “enzimas GLA variantes” e “variantes de GLA”) encontram utilidade.
[0076] Neste relatório descritivo, um “vetor” é uma construção de DNA para introduzir uma sequência de DNA em uma célula. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de expressão que é operacionalmente ligado a uma sequência de controle adequada capaz de efetuar a expressão em um hospedeiro adequado do polipeptídeo codificado na sequência de DNA. Em algumas modalidades, um “vetor de expressão” contém uma sequência promotora operacionalmente ligada à sequência de DNA (por exemplo, transgene) para dirigir a expressão em uma célula hospedeira e, em algumas modalidades, também compreende uma sequência terminadora da transcrição.
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[0077] Neste relatório descritivo, o termo “vetor de terapia gênica” refere-se a veículos ou carreadores adequados para entrega de sequências de polinucleotídeos a células. Em algumas modalidades, os vetores encapsulam genes (por exemplo, genes terapêuticos) ou sequências de polinucleotídeos para entrega a células ou tecidos, incluindo, entre outros, adenovírus (AV), vírus adenoassociado (AAV), lentivírus (LV) e vetores não virais, como lipossomos. Não se pretende que a presente invenção seja limitada a qualquer vetor específico de terapia gênica, pois qualquer veículo adequado para um dado contexto encontra utilidade. O vetor de terapia gênica pode ser designado para entrega de genes a uma espécie ou hospedeiro específico, ou pode encontrar aplicabilidade mais generalizada.
[0078] Neste relatório descritivo, o termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo incluindo, entre outras, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução e modificação pós- traducional. Em algumas modalidades, o termo também abrange a secreção do polipeptídeo por uma célula.
[0079] Neste relatório descritivo, o termo “produzir” refere-se à produção de proteínas e/ou outros compostos por células. Pretende-se que o termo abranja qualquer etapa envolvida na produção de polipeptídeos incluindo, entre outras, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução e modificação pós-traducional. Em algumas modalidades, o termo também abrange a secreção do polipeptídeo por uma célula.
[0080] Neste relatório descritivo, uma sequência de aminoácidos ou nucleotídeos (por exemplo, uma sequência promotora, de peptídeo sinal, sequência terminadora etc.) é “ recombinante “ ou “heteróloga” em relação a outra sequência com a qual está operacionalmente ligada se as duas sequências não estão associadas na natureza.
[0081] Neste relatório descritivo, os termos “célula hospedeira” e “cepa hospedeira” referem-se a hospedeiros adequados para vetores de
46 / 169 expressão que compreendem o DNA aqui provido (por exemplo, os polinucleotídeos que codificam as variantes de GLA). Em algumas modalidades, as células hospedeiras são células procarióticas ou eucarióticas que foram transformadas ou transfectadas com vetores construídos usando as técnicas do DNA recombinante como conhecidas na técnica.
[0082] O termo “análogo” significa um polipeptídeo com mais de 70% de identidade de sequência, mas menos de 100% de identidade de sequência (por exemplo, mais de 75%, 78%, 80%, 83%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência) com um polipeptídeo de referência. Em algumas modalidades, “análogo” significa polipeptídeos que contêm um ou mais resíduos de aminoácidos não naturais, incluindo, entre outros, homoarginina, ornitina e norvalina, bem como aminoácidos naturais. Em algumas modalidades, os análogos também incluem um ou mais resíduos de D-aminoácidos e ligações não peptídicas entre dois ou mais resíduos de aminoácidos.
[0083] O termo “terapêutico” refere-se a um composto administrado a um indivíduo que mostra sinais ou sintomas de patologia e tem efeitos médicos benéficos ou desejáveis.
[0084] O termo “composição farmacêutica” refere-se a uma composição adequada para uso farmacêutico em um mamífero (por exemplo, humano) que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo de GLA engenheirado abrangido pela invenção e um carreador aceitável.
[0085] O termo “terapia gênica” refere-se à entrega de um gene, sequência de polidesoxirribonucleotídeos ou de polinucleotídeo(s) com um vetor de terapia gênica a células ou tecidos para a modificação daquelas células ou tecidos no tratamento ou prevenção de uma doença. A terapia gênica pode incluir a substituição de um gene com mutação e causa a doença por uma cópia sadia do gene, ou inativar, ou “knocking out”, um gene com
47 / 169 mutação que funciona inadequadamente. Em algumas modalidades, a terapia gênica é usada no tratamento de doença em pacientes.
[0086] O termo “terapia com mRNA” refere-se à entrega de uma sequência de polirribonucleotídeo do mRNA a células ou tecidos para a modificação daquelas células ou tecidos no tratamento ou prevenção de uma doença. Em algumas modalidades, as sequências de polinucleotídeos do mRNA, para entrega a células ou tecido, são formuladas, por exemplo, entre outros, em lipossomos. Em algumas modalidades, a terapia com mRNA é usada no tratamento de doença em pacientes.
[0087] O termo “terapia celular” refere-se à entrega de células vivas que sofreram modificação exógena a pacientes para prover um gene ausente no tratamento ou prevenção de uma doença. As células modificadas são então reintroduzidas no corpo.
[0088] O termo “quantidade eficaz” significa uma quantidade suficiente para produzir o resultado desejado. Qualquer técnico no assunto pode determinar qual é a quantidade eficaz utilizando experimentação rotineira.
[0089] Os termos “isolado” e “purificado” são usados para referir-se a uma molécula (por exemplo, um ácido nucleico, polipeptídeo isolado etc.) ou outro componente que seja removido de pelo menos um outro componente com o qual está naturalmente associado. O termo “purificado” não requer pureza absoluta, mas, em vez disso, pretende ser uma definição relativa.
[0090] O termo “indivíduo” abrange mamíferos, como humanos, primatas não humanos, gado, animais de estimação e animais de laboratório (por exemplo, roedores e lagomorfos). O termo destina-se a abranger indivíduos do sexo feminino, bem como do masculino.
[0091] Neste relatório descritivo, o termo “paciente” significa qualquer indivíduo que esteja sendo avaliado para, tratado para ou está apresentando doença.
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[0092] O termo “lactente” refere-se a uma criança no período do primeiro mês depois do nascimento até aproximadamente um (1) ano de idade. Neste relatório descritivo, o termo “recém-nascido” refere-se a uma criança no período desde o nascimento até o 28o dia de vida. O termo “lactente prematuro” refere-se a um lactente nascido depois de concluída a vigésima semana de gestação, não obstante antes de a termo, em geral pesando ~500 a ~2499 gramas no nascimento. Um “lactente de peso muito baixo ao nascer” é um lactente pesando menos de 1500 g no nascimento.
[0093] Neste relatório descritivo, o termo “criança” refere-se a uma pessoa que não atingiu a idade legal para dar consentimento a procedimentos do tratamento ou de pesquisa. Em algumas modalidades, o termo refere-se a uma pessoa entre o momento do nascimento e a adolescência.
[0094] Neste relatório descritivo, o termo “adulto” refere-se a uma pessoa que atingiu a idade legal para a jurisdição relevante (por exemplo, 18 anos de idade nos Estados Unidos). Em algumas modalidades, o termo refere- se a qualquer organismo amadurecido, totalmente crescido. Em algumas modalidades, o termo “adulto jovem” refere-se a uma pessoa com menos de 18 anos de idade, mas que atingiu a maturidade sexual.
[0095] Neste relatório descritivo, “composição” e “formulação” abrangem produtos que compreendem pelo menos uma GLA engenheirada da presente invenção, destinadas a qualquer uso adequado (por exemplo, composições farmacêuticas, suplementos dietéticos/nutricionais, rações etc.).
[0096] Os termos “administração” e “administrar” uma composição significam fornecer uma composição da presente invenção a um indivíduo (por exemplo, a uma pessoa que sofre dos efeitos da doença de Fabry).
[0097] O termo “carreador”, quando usado em referência a uma composição farmacêutica, significa qualquer um dos carreadores farmacêuticos padrão, tampões e excipientes, como estabilizantes, conservantes e adjuvantes.
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[0098] O termo “farmaceuticamente aceitável” significa um material que pode ser administrado a um indivíduo sem causar quaisquer efeitos biológicos indesejáveis ou interagir de maneira prejudicial com qualquer um dos componentes nos quais esteja contido e que possui a atividade biológica desejada.
[0099] Neste relatório descritivo, o termo “excipiente” refere-se a qualquer aditivo, carreador, diluente, adjuvante ou outro ingrediente farmaceuticamente aceitável, que não seja o ingrediente farmacêutico ativo (IFA; por exemplo, os polipeptídeos de GLA engenheirados da presente invenção). Os excipientes são tipicamente incluídos para fins na formulação e/ou administração.
[00100] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz”, quando usado em referência a sintomas de doença/condição, refere-se à quantidade e/ou concentração de um composto (por exemplo, polipeptídeos de GLA engenheirados) que alivia, atenua ou elimina um ou mais sintomas de uma doença/condição ou que evita ou retarda o início de sintoma(s).
[00101] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz”, quando usado em referência a uma doença/condição, refere-se à quantidade e/ou concentração de uma composição (por exemplo, polipeptídeos de GLA engenheirados) que alivia, atenua ou elimina a doença/condição. Em algumas modalidades, o termo é usado em referência à quantidade de uma composição que suscita a resposta biológica (por exemplo, médica) por um tecido, sistema ou animal que é buscada pelo pesquisador, médico, veterinário ou outro clínico.
[00102] A intenção é que os termos “tratar”, “tratando” e “tratamento” abranjam tratamento preventivo (por exemplo, profilático), bem como paliativo. Expressão e atividade de GLA engenheiradas:
[00103] A expressão de uma GLA humana madura com códons
50 / 169 otimizados por secreção de uma levedura foi alcançada utilizando um peptídeo sinal sintético de IG de camundongo. Os clones foram expressos a partir de um vetor pCDNA3.1(+) em células HEK293T. Essa abordagem forneceu sobrenadantes com atividade mensurável no substrato fluorogênico 4-metilumbeliferil α-D-galactopiranosídeo (4-MuGal).
[00104] Em algumas modalidades, para identificar diversidade mutacional com estabilidade similar e absorção celular aprimorada em comparação a SEQ ID NO: 8, construiu-se uma biblioteca combinatória e foram geradas variantes de GLA derivadas da SEQ ID NO:8. Volumes equivalentes do sobrenadante foram rastreados em uma condição sem desafio (sem incubação, pH 4,6) ou após uma hora de incubação em um ambiente com pH baixo (3,9-4,2), pH neutro (7,0-7,6) ou do soro humano (pH fisiológico 7,1-8,2). As variantes de GLA com atividade devido à expressão aumentada de GLA ou atividade específica de GLA foram identificadas com base no número de vezes em que melhoradas em relação à GLA original. As variantes de GLA com estabilidade aumentada foram identificadas dividindo o incremento de melhoria observada sob condições de desafio pelo incremento de melhoria observada sob condições sem desafio. Essa abordagem reduz o viés para selecionar variantes com base em expressão aumentada, mas sem alterações na atividade específica em pH extremos. Pontuações compostas por atividade (o produto de incrementos de melhoria para todas as três condições) e estabilidade (o produto de pontuações de estabilidade) foram usadas para ordenar as mutações em variantes melhoradas para inclusão em bibliotecas subsequentes de GLA. Em modalidades adicionais, foram utilizados os métodos e sequências adicionais descritos nos Exemplos. GLA engenheirada:
[00105] Em algumas modalidades, a GLA engenheirada que exibe uma propriedade melhorada tem pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos
51 / 169 aproximadamente 88%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 91%, pelo menos aproximadamente 92%, pelo menos aproximadamente 93%, pelo menos aproximadamente 94%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99% ou aproximadamente 100% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 2, 8, 48, 158, 372 e/ou 374, e uma diferença de resíduo de aminoácido em comparação a SEQ ID NO: 2, 8, 48, 158, 372 e/ou 374, em uma ou mais posições de aminoácidos (tal como em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 20 ou mais posições de aminoácidos quando comparada a SEQ ID NO: 2, 8, 48, 158, 372 e/ou 374, ou uma sequência tendo pelo menos 85%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou identidade de sequência de aminoácidos maior com a SEQ ID NO: 2, 8, 48, 158, 372 e/ou 374). Em algumas modalidades, a diferença de resíduo em comparação a SEQ ID NO:5, em uma ou mais posições, inclui pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais substituições conservadoras de aminoácido. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de GLA engenheirado é um polipeptídeo listado na Tabela 2-1, 5-1, 6-1, 7-1, 8-1 e/ou 9-1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de GLA engenheirado compreende a SEQ ID NO: 2, 8, 48, 158, 372 e/ou 374.
[00106] A presente invenção também provê alfa-galactosidase A recombinante em que a dita compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 44, 44/217,
52 / 169 44/217/316, 44/217/322, 44/217/322/337, 44/247, 44/247/302, 44/247/302/322, 44/247/322, 44/247/337, 44/247/362, 44/302, 44/337, 44/373, 217/322, 217/373, 247/322, 247/362, 302/322/362/373, 302/337, 316, 316/337, 322, 322/337, 362/373 e 373, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 44L, 44L/217F, 44L/217F/316L, 44L/217F/322M, 44L/217F/322M/337A, 44L/247N, 44L/247N/302Q, 44L/247N/302Q/322M, 44L/247N/322M, 44L/247N/337A, 44L/247N/362K, 44L/302Q, 44L/337A, 44L/373R, 217F/322M, 217F/373R, 247N/322M, 247N/362K, 302Q/322M/362K/373R, 302Q/337A, 316L, 316L/337A, 322M, 322M/337A, 362K/373R e 373R, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO:
8. Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre R44L, R44L/R217F, R44L/R217F/D316L, R44L/R217F/I322M, R44L/R217F/I322M/P337A, R44L/D247N, R44L/D247N/K302Q, R44L/D247N/K302Q/I322M, R44L/D247N/I322M, R44L/D247N/P337A, R44L/D247N/Q362K, R44L/K302Q, R44L/P337A, R44L/K373R, R217F/I322M, R217F/K373R, D247N/I322M,
53 / 169 D247N/Q362K, K302Q/I322M/Q362K/K373R, K302Q/P337A, D316L, D316L/P337A, I322M, I322M/P337A, Q362K/K373R e K373R, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 8.
[00107] A presente invenção também provê alfa-galactosidase A recombinante em que a dita compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 10/39/44/47/92/166/206/217/247/261/271/302/316/322/337/362/368/373/392, 44/217/316, 44/217/322/337, 166/362, 217/373 e 362/373, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 10T/39M/44L/47S/92Y/166S/206K/217F/247N/261A/271H/302Q/316L/322 M/337A/362K/368W/373R/392M, 44L/217F/316L, 44L/217F/322M/337A, 166A/362K, 217F/373R e 362K/373R, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8, ou um fragmento funcional
54 / 169 da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre P10T/E39M/R44L/T47S/H92Y/P166S/A206K/R217F/D247N/G261A/A271 H/K302Q/D316L/I322M/P337A/Q362K/A368W/K373R/T392M, R44L/R217F/D316L, R44L/R217F/I322M/P337A, P166A/Q362K, R217F/K373R e Q362K/K373R, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO:
8.
[00108] A presente invenção também provê alfa-galactosidase A recombinante em que a dita compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 58, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 7, 7/48/68, 7/48/68/120/282/299, 7/48/130/282, 7/48/180, 7/68/130/282/365, 7/68/180, 7/88/120/305/365, 7/120, 7/130, 7/282, 7/305, 7/305/365, 7/365, 39, 47, 47/87/95/96/158/162, 47/95, 47/273, 47/343, 48, 48/68, 48/180/282, 48/282, 48/282/305, 67/180, 68, 68/299/300, 71, 87/91/95/96/158/162, 87/91/95/96/206/343, 87/96/155/273/343, 88, 91/95, 91/95/96, 92, 93, 96, 96/273, 96/312/343, 120, 120/299/305, 151, 158, 158/162/273, 162, 162/273, 162/343, 166, 178, 180, 181, 206, 217, 271, 273, 273/343, 282, 282/365, 293/391, 299/300, 299/300/305/365, 300, 301, 305, 305/365, 314, 333, 336, 337, 343, 345, 363, 365, 370, 389, 393, 394, 396/398, 397 e 398, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 58. Em algumas modalidades, a alfa- galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,
55 / 169 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 58, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 7L, 7L/48D/68E, 7L/48D/68E/120H/282N/299R, 7L/48D/130E/282N, 7L/48D/180G, 7L/68E/130E/282N/365V, 7L/68E/180G, 7L/88A/120H/305G/365V, 7L/120H, 7L/130E, 7L/282N, 7L/305G, 7L/305G/365V, 7L/365V, 39V, 47D, 47D/87K/95E/96L/158R/162H, 47D/95E, 47D/273P, 47D/343G, 47V, 48D, 48D/68E, 48D/180G/282N, 48D/282N, 48D/282N/305G, 67T/180G, 68E, 68E/299R/300I, 71P, 87K/91Q/95E/96L/158A/162K, 87K/91Q/95E/96L/206S/343G, 87K/96I/155N/273P/343G, 88A, 91Q/95E, 91Q/95E/96L, 92F, 92T, 93I, 96L, 96L/273P, 96L/312Q/343G, 120H, 120H/299R/305G, 151L, 158A, 158A/162K/273G, 158R, 162H/343D, 162K, 162K/273P, 162S, 166K, 178G, 178S, 180G, 180L, 180T, 180V, 181A, 206K, 206S, 217K, 271R, 273P, 273P/343G, 282N, 282N/365V, 293P/391A, 299R/300I, 299R/300I/305G/365V, 300I, 301M, 305G, 305G/365V, 314A, 333F, 333G, 336V, 337R, 343D, 343G, 345A, 345Q, 363Q, 365A, 365Q, 365V, 370G, 389K, 393V, 394K, 396G/398T, 397A, 398A, 398P, 398S e 398V, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 58.
[00109] Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 58, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre R7L, R7L/E48D/Q68E, R7L/E48D/Q68E/Y120H/D282N/Q299R, R7L/E48D/D130E/D282N, R7L/E48D/F180G, R7L/Q68E/D130E/D282N/F365V, R7L/Q68E/F180G,
56 / 169 R7L/Q88A/Y120H/N305G/F365V, R7L/Y120H, R7L/D130E, R7L/D282N, R7L/N305G, R7L/N305G/F365V, R7L/F365V, E39V, T47D, T47D/R87K/S95E/K96L/L158R/R162H, T47D/S95E, T47D/S273P, T47D/K343G, T47V, E48D, E48D/Q68E, E48D/F180G/D282N, E48D/D282N, E48D/D282N/N305G, P67T/F180G, Q68E, Q68E/Q299R/L300I, S71P, R87K/N91Q/S95E/K96L/L158A/R162K, R87K/N91Q/S95E/K96L/A206S/K343G, R87K/K96I/H155N/S273P/K343G, Q88A, N91Q/S95E, N91Q/S95E/K96L, H92F, H92T, V93I, K96L, K96L/S273P, K96L/P312Q/K343G, Y120H, Y120H/Q299R/N305G, D151L, L158A, L158A/R162K/S273G, L158R, R162H/K343D, R162K, R162K/S273P, R162S, P166K, W178G, W178S, F180G, F180L, F180T, F180V, Q181A, A206K, A206S, R217K, A271R, S273P, S273P/K343G, D282N, D282N/F365V, L293P/Q391A, Q299R/L300I, Q299R/L300I/N305G/F365V, L300I, R301M, N305G, N305G/F365V, S314A, S333F, S333G, I336V, P337R, K343D, K343G, V345A, V345Q, L363Q, F365A, F365Q, F365V, S370G, T389K, S393V, L394K, D396G/L398T, L397A, L398A, L398P, L398S e L398V, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 58.
[00110] A presente invenção também provê alfa-galactosidase A recombinante em que a dita compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 158, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 24/202, 39/47, 39/47/217, 39/151, 39/282/337/398, 39/337/343/398, 39/393/398, 47/130, 47/151, 47/343/345/393, 48, 48/68, 48/68/217/333/391/393, 48/68/333, 48/217, 48/333, 48/345/393, 48/393, 59/143, 68, 68/345, 130, 130/158,
57 / 169 130/158/393, 130/345/393, 143/271, 143/333, 143/387, 151, 151/158/217/343/345/393, 151/206/282/337/343/345/398, 151/282/393, 151/345/393/398, 151/393, 158, 158/393, 202, 206, 206/217, 217, 217/333, 217/337/345/398, 271, 282/393, 333, 333/345, 337/343/345/398, 343, 343/345/393/398, 393 e 393/398, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO:
158. Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 158, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 24S/202N, 39V/47D, 39V/47V/217K, 39V/151L, 39V/282N/337R/398A, 39V/337R/343G/398A, 39V/393V/398A, 47V/130E, 47V/151L, 47V/343D/345Q/393V, 48D, 48D/68E, 48D/68E/217K/333F/391A/393V, 48D/68E/333F, 48D/217K, 48D/333F, 48D/333G, 48D/345Q/393V, 48D/393V, 59A/143S, 68E, 68E/345Q, 130E, 130E/158R, 130E/158R/393V, 130E/345Q/393V, 143S/271N, 143S/333N, 143S/387N, 151L, 151L/158R/217K/343G/345Q/393V, 151L/206S/282N/337R/343D/345Q/398A, 151L/282N/393V, 151L/345Q/393V/398A, 151L/393V, 158R, 158R/393V, 202N, 206S, 206S/217K, 217K, 217K/333F, 217K/333G, 217K/337R/345Q/398A, 271N, 282N/393V, 333F/345Q, 333G, 333N, 337R/343G/345Q/398A, 343D, 343D/345Q/393V/398A, 393V e 393V/398A, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 158. Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8, ou um
58 / 169 fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre D24S/D202N, E39V/T47D, E39V/T47V/R217K, E39V/D151L, E39V/D282N/P337R/L398A, E39V/P337R/K343G/L398A, E39V/S393V/L398A, T47V/D130E, T47V/D151L, T47V/K343D/V345Q/S393V, E48D, E48D/Q68E, E48D/Q68E/R217K/S333F/Q391A/S393V, E48D/Q68E/S333F, E48D/R217K, E48D/S333F, E48D/S333G, E48D/V345Q/S393V, E48D/S393V, C59A/C143S, Q68E, Q68E/V345Q, D130E, D130E/L158R, D130E/L158R/S393V, D130E/V345Q/S393V, C143S/A271N, C143S/S333N, C143S/E387N, D151L, D151L/L158R/R217K/K343G/V345Q/S393V, D151L/A206S/D282N/P337R/K343D/V345Q/L398A, D151L/D282N/S393V, D151L/V345Q/S393V/L398A, D151L/S393V, L158R, L158R/S393V, D202N, A206S, A206S/R217K, R217K, R217K/S333F, R217K/S333G, R217K/P337R/V345Q/L398A, A271N, D282N/S393V, S333F/V345Q, S333G, S333N, P337R/K343G/V345Q/L398A, K343D, K343D/V345Q/S393V/L398A, S393V e S393V/L398A, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO:
158.
[00111] A presente invenção também provê alfa-galactosidase A recombinante em que a dita compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 372, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 10, 10/39/44/322,
59 / 169 10/39/92/206/217/271, 10/39/92/247, 10/39/92/247/271/316, 10/44, 10/44/47/92/247, 10/44/47/261/302/322/368, 10/44/92/316/322, 10/44/261/302/316, 10/44/302/337/368, 10/47/217/247/316/392, 10/47/217/322, 10/47/271, 10/92, 10/92/206/217/247, 10/92/206/247/316/322/392, 10/92/206/247/322/368, 10/92/217/261/302/337, 10/206/217/271, 10/206/247, 10/206/261/271/316, 10/261, 10/271/302, 10/302, 10/302/316, 10/302/322/337, 10/316/322, 10/337/392, 10/368, 39/44/92/162/247/302/316/322, 39/44/92/217/322, 39/44/92/247/271/302, 39/47/92/247/302/316/322, 39/47/217/247/368, 39/47/247, 39/92/247/302/316/337/368, 39/92/316/322, 39/247/271, 39/247/271/316, 39/322, 44/47/92/206/217/316/322, 44/47/92/247/261/271/316/337/368, 44/47/206/217/247/271/322, 44/47/247/322/368, 44/47/302/316/322, 44/92/206/247/368, 44/206/337, 44/247/261/302/316, 44/247/261/302/316/322, 47/92/247/271, 47/217/302, 47/247, 47/247/271, 89/217/247/261/302/316, 92/217/271, 92/247, 92/247/271/322, 92/247/302/322/337, 92/271/337, 92/302, 92/316, 206/217/271/392, 217/247/316/322/337/368, 247, 247/271, 247/302, 271, 271/302/322, 271/316/322, 302/322/368 e 368, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO:
372. Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 372, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 10P, 10P/39E/44R/322I, 10P/39E/92H/206A/217R/271A, 10P/39E/92H/247D, 10P/39E/92H/247D/271A/316D, 10P/44R, 10P/44R/47T/92H/247D, 10P/44R/47T/261G/302K/322I/368A, 10P/44R/92H/316D/322I,
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10P/44R/261G/302K/316D, 10P/44R/302K/337P/368A, 10P/47T/217R/247D/316D/392T, 10P/47T/217R/322I, 10P/47T/271A, 10P/92H, 10P/92H/206A/217R/247D, 10P/92H/206A/247D/316D/322I/392T, 10P/92H/206A/247D/322I/368A, 10P/92H/217R/261G/302K/337P, 10P/206A/217R/271A, 10P/206A/247D, 10P/206A/261G/271A/316D, 10P/261G, 10P/271A/302K, 10P/302K, 10P/302K/316D, 10P/302K/322I/337P, 10P/316D/322I, 10P/337P/392T, 10P/368A, 39E/44R/92H/162M/247D/302K/316D/322I, 39E/44R/92H/217R/322I, 39E/44R/92H/247D/271A/302K, 39E/47T/92H/247D/302K/316D/322I, 39E/47T/217R/247D/368A, 39E/47T/247D, 39E/92H/247D/302K/316D/337P/368A, 39E/92H/316D/322I, 39E/247D/271A, 39E/247D/271A/316D, 39E/322I, 44R/47T/92H/206A/217R/316D/322I, 44R/47T/92H/247D/261G/271A/316D/337P/368A, 44R/47T/206A/217R/247D/271A/322I, 44R/47T/247D/322I/368A, 44R/47T/302K/316D/322I, 44R/92H/206A/247D/368A, 44R/206A/337P, 44R/247D/261G/302K/316D, 44R/247D/261G/302K/316D/322I, 47T/92H/247D/271A, 47T/217R/302K, 47T/247D, 47T/247D/271A, 89I/217R/247D/261G/302K/316D, 92H/217R/271A, 92H/247D, 92H/247D/271A/322I, 92H/247D/302K/322I/337P, 92H/271A/337P, 92H/302K, 92H/316D, 206A/217R/271A/392T, 217R/247D/316D/322I/337P/368A, 247D, 247D/271A, 247D/302K, 271A, 271A/302K/322I, 271A/316D/322I, 302K/322I/368A e 368A, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 372. Em algumas modalidades, a alfa- galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 372, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase
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A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre T10P, T10P/M39E/L44R/M322I, T10P/M39E/Y92H/K206A/F217R/H271A, T10P/M39E/Y92H/N247D, T10P/M39E/Y92H/N247D/H271A/L316D, T10P/L44R, T10P/L44R/S47T/Y92H/N247D, T10P/L44R/S47T/A261G/Q302K/M322I/W368A, T10P/L44R/Y92H/L316D/M322I, T10P/L44R/A261G/Q302K/L316D, T10P/L44R/Q302K/A337P/W368A, T10P/S47T/F217R/N247D/L316D/M392T, T10P/S47T/F217R/M322I, T10P/S47T/H271A, T10P/Y92H, T10P/Y92H/K206A/F217R/N247D, T10P/Y92H/K206A/N247D/L316D/M322I/M392T, T10P/Y92H/K206A/N247D/M322I/W368A, T10P/Y92H/F217R/A261G/Q302K/A337P, T10P/K206A/F217R/H271A, T10P/K206A/N247D, T10P/K206A/A261G/H271A/L316D, T10P/A261G, T10P/H271A/Q302K, T10P/Q302K, T10P/Q302K/L316D, T10P/Q302K/M322I/A337P, T10P/L316D/M322I, T10P/A337P/M392T, T10P/W368A, M39E/L44R/Y92H/R162M/N247D/Q302K/L316D/M322I, M39E/L44R/Y92H/F217R/M322I, M39E/L44R/Y92H/N247D/H271A/Q302K, M39E/S47T/Y92H/N247D/Q302K/L316D/M322I, M39E/S47T/F217R/N247D/W368A, M39E/S47T/N247D, M39E/Y92H/N247D/Q302K/L316D/A337P/W368A, M39E/Y92H/L316D/M322I, M39E/N247D/H271A, M39E/N247D/H271A/L316D, M39E/M322I, L44R/S47T/Y92H/K206A/F217R/L316D/M322I, L44R/S47T/Y92H/N247D/A261G/H271A/L316D/A337P/W368A, L44R/S47T/K206A/F217R/N247D/H271A/M322I, L44R/S47T/N247D/M322I/W368A, L44R/S47T/Q302K/L316D/M322I, L44R/Y92H/K206A/N247D/W368A, L44R/K206A/A337P,
62 / 169 L44R/N247D/A261G/Q302K/L316D, L44R/N247D/A261G/Q302K/L316D/M322I, S47T/Y92H/N247D/H271A, S47T/F217R/Q302K, S47T/N247D, S47T/N247D/H271A, L89I/F217R/N247D/A261G/Q302K/L316D, Y92H/F217R/H271A, Y92H/N247D, Y92H/N247D/H271A/M322I, Y92H/N247D/Q302K/M322I/A337P, Y92H/H271A/A337P, Y92H/Q302K, Y92H/L316D, K206A/F217R/H271A/M392T, F217R/N247D/L316D/M322I/A337P/W368A, N247D, N247D/H271A, N247D/Q302K, H271A, H271A/Q302K/M322I, H271A/L316D/M322I, Q302K/M322I/W368A e W368A, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO:
372.
[00112] A presente invenção também provê alfa-galactosidase A recombinante em que a dita compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 374, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 10/36/92/166/247/261/316/392, 10/39, 10/39/44/47/92/206/217, 10/39/44/47/316, 10/39/44/47/337, 10/39/44/92/166/261/316/322, 10/39/44/92/166/302/322, 10/39/44/92/166/392, 10/39/44/92/217/302/322, 10/39/44/92/302/322, 10/39/44/166/261/271/316/322, 10/39/44/392, 10/39/47/92/337, 10/39/92/131/166/271/316/322, 10/39/92/166/217/247/271, 10/39/92/217/316, 10/44/47/166/261/271, 10/44/47/166/271/322/368, 10/44/47/217/271/316/322, 10/44/92, 10/44/92/217/247/271/302/316/392, 10/44/166/302, 10/44/206/316/322, 10/47/92/166/271/316/337, 10/47/92/271/302, 10/47/92/316/322/392, 10/47/166/271, 10/47/166/316, 10/92/166, 10/92/166/217/247/261/271, 10/92/166/261/271/392,
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10/92/166/261/316/322/337, 10/92/166/337/368, 10/92/302/337, 10/92/316/322, 10/206, 10/206/247/261, 10/217/322, 10/261, 10/261/337/392, 10/316/392, 10/368, 39/44/47/92/166/206/392, 39/44/47/92/206/247/261, 39/44/47/92/206/392, 39/44/47/206/337/368/392, 39/44/92/166/247/261/302/337, 39/44/166/271, 39/44/166/271/337/368/392, 39/47/92/316/322, 39/47/92/392, 39/47/166/217/261/392, 39/47/217/247/368, 39/47/247, 39/92/166/217/392, 39/92/261/302, 39/166/217/261/316/368, 39/322, 39/392, 44/47, 44/47/92/217/271, 44/47/92/217/316/322/392, 44/47/92/392, 44/47/166, 44/47/166/271, 44/47/247/271/392, 44/316/322/392, 44/337, 47/166/206/217/247/337, 47/166/217/271/337, 47/206, 47/217/247/261, 47/271, 52/217/302/316, 92/166/206/271/316, 92/166/217/261/271/392, 92/166/217/316/337/392, 92/166/247, 92/166/316, 92/206/322, 92/217, 92/217/271/337, 92/261/271, 92/271, 166/217/316/322/337, 166/247/271/316, 166/316/322/337, 206/217, 217/392, 247/316, 316/322/368 e 316/337/392, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 374. Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 374, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 10T/36M/92Y/166S/247N/261A/316L/392M, 10T/39M, 10T/39M/44L/47S/92Y/206K/217F, 10T/39M/44L/47S/316L, 10T/39M/44L/47S/337A, 10T/39M/44L/92Y/166S/261A/316L/322M, 10T/39M/44L/92Y/166S/302Q/322M, 10T/39M/44L/92Y/166S/392M, 10T/39M/44L/92Y/217F/302Q/322M, 10T/39M/44L/92Y/302Q/322M, 10T/39M/44L/166S/261A/271H/316L/322M, 10T/39M/44L/392M, 10T/39M/47S/92Y/337A, 10T/39M/92Y/131G/166S/271H/316L/322M,
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10T/39M/92Y/166S/217F/247N/271H, 10T/39M/92Y/217F/316L, 10T/44L/47S/166S/261A/271H, 10T/44L/47S/166S/271H/322M/368W, 10T/44L/47S/217F/271H/316L/322M, 10T/44L/92Y, 10T/44L/92Y/217F/247N/271H/302Q/316L/392M, 10T/44L/166S/302Q, 10T/44L/206K/316L/322M, 10T/47S/92Y/166S/271H/316L/337A, 10T/47S/92Y/271H/302Q, 10T/47S/92Y/316L/322M/392M, 10T/47S/166S/271H, 10T/47S/166S/316L, 10T/92Y/166S, 10T/92Y/166S/217F/247N/261A/271H, 10T/92Y/166S/261A/271H/392M, 10T/92Y/166S/261A/316L/322M/337A, 10T/92Y/166S/337A/368W, 10T/92Y/302Q/337A, 10T/92Y/316L/322M, 10T/206K, 10T/206K/247N/261A, 10T/217F/322M, 10T/261A, 10T/261A/337A/392M, 10T/316L/392M, 10T/368W, 39M/44L/47S/92Y/166S/206K/392M, 39M/44L/47S/92Y/206K/247N/261A, 39M/44L/47S/92Y/206K/392M, 39M/44L/47S/206K/337A/368W/392M, 39M/44L/92Y/166S/247N/261A/302Q/337A, 39M/44L/166S/271H, 39M/44L/166S/271H/337A/368W/392M, 39M/47S/92Y/316L/322M, 39M/47S/92Y/392M, 39M/47S/166S/217F/261A/392M, 39M/47S/217F/247N/368W, 39M/47S/247N, 39M/92Y/166S/217F/392M, 39M/92Y/261A/302Q, 39M/166S/217F/261A/316L/368W, 39M/322M, 39M/392M, 44L/47S, 44L/47S/92Y/217F/271H, 44L/47S/92Y/217F/316L/322M/392M, 44L/47S/92Y/392M, 44L/47S/166S, 44L/47S/166S/271H, 44L/47S/247N/271H/392M, 44L/316L/322M/392M, 44L/337A, 47S/166S/206K/217F/247N/337A, 47S/166S/217F/271H/337A, 47S/206K, 47S/217F/247N/261A, 47S/271H, 52N/217F/302Q/316L, 92Y/166S/206K/271H/316L, 92Y/166S/217F/261A/271H/392M, 92Y/166S/217F/316L/337A/392M, 92Y/166S/247N, 92Y/166S/316L, 92Y/206K/322M, 92Y/217F, 92Y/217F/271H/337A, 92Y/261A/271H, 92Y/271H, 166S/217F/316L/322M/337A, 166S/247N/271H/316L, 166S/316L/322M/337A, 206K/217F, 217F/392M, 247N/316L,
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316L/322M/368W e 316L/337A/392M, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 374. Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 374, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre P10T/K36M/H92Y/P166S/D247N/G261A/D316L/T392M, P10T/E39M, P10T/E39M/R44L/T47S/H92Y/A206K/R217F, P10T/E39M/R44L/T47S/D316L, P10T/E39M/R44L/T47S/P337A, P10T/E39M/R44L/H92Y/P166S/G261A/D316L/I322M, P10T/E39M/R44L/H92Y/P166S/K302Q/I322M, P10T/E39M/R44L/H92Y/P166S/T392M, P10T/E39M/R44L/H92Y/R217F/K302Q/I322M, P10T/E39M/R44L/H92Y/K302Q/I322M, P10T/E39M/R44L/P166S/G261A/A271H/D316L/I322M, P10T/E39M/R44L/T392M, P10T/E39M/T47S/H92Y/P337A, P10T/E39M/H92Y/W131G/P166S/A271H/D316L/I322M, P10T/E39M/H92Y/P166S/R217F/D247N/A271H, P10T/E39M/H92Y/R217F/D316L, P10T/R44L/T47S/P166S/G261A/A271H, P10T/R44L/T47S/P166S/A271H/I322M/A368W, P10T/R44L/T47S/R217F/A271H/D316L/I322M, P10T/R44L/H92Y, P10T/R44L/H92Y/R217F/D247N/A271H/K302Q/D316L/T392M, P10T/R44L/P166S/K302Q, P10T/R44L/A206K/D316L/I322M, P10T/T47S/H92Y/P166S/A271H/D316L/P337A, P10T/T47S/H92Y/A271H/K302Q, P10T/T47S/H92Y/D316L/I322M/T392M, P10T/T47S/P166S/A271H, P10T/T47S/P166S/D316L, P10T/H92Y/P166S,
66 / 169
P10T/H92Y/P166S/R217F/D247N/G261A/A271H, P10T/H92Y/P166S/G261A/A271H/T392M, P10T/H92Y/P166S/G261A/D316L/I322M/P337A, P10T/H92Y/P166S/P337A/A368W, P10T/H92Y/K302Q/P337A, P10T/H92Y/D316L/I322M, P10T/A206K, P10T/A206K/D247N/G261A, P10T/R217F/I322M, P10T/G261A, P10T/G261A/P337A/T392M, P10T/D316L/T392M, P10T/A368W, E39M/R44L/T47S/H92Y/P166S/A206K/T392M, E39M/R44L/T47S/H92Y/A206K/D247N/G261A, E39M/R44L/T47S/H92Y/A206K/T392M, E39M/R44L/T47S/A206K/P337A/A368W/T392M, E39M/R44L/H92Y/P166S/D247N/G261A/K302Q/P337A, E39M/R44L/P166S/A271H, E39M/R44L/P166S/A271H/P337A/A368W/T392M, E39M/T47S/H92Y/D316L/I322M, E39M/T47S/H92Y/T392M, E39M/T47S/P166S/R217F/G261A/T392M, E39M/T47S/R217F/D247N/A368W, E39M/T47S/D247N, E39M/H92Y/P166S/R217F/T392M, E39M/H92Y/G261A/K302Q, E39M/P166S/R217F/G261A/D316L/A368W, E39M/I322M, E39M/T392M, R44L/T47S, R44L/T47S/H92Y/R217F/A271H, R44L/T47S/H92Y/R217F/D316L/I322M/T392M, R44L/T47S/H92Y/T392M, R44L/T47S/P166S, R44L/T47S/P166S/A271H, R44L/T47S/D247N/A271H/T392M, R44L/D316L/I322M/T392M, R44L/P337A, T47S/P166S/A206K/R217F/D247N/P337A, T47S/P166S/R217F/A271H/P337A, T47S/A206K, T47S/R217F/D247N/G261A, T47S/A271H, D52N/R217F/K302Q/D316L, H92Y/P166S/A206K/A271H/D316L, H92Y/P166S/R217F/G261A/A271H/T392M, H92Y/P166S/R217F/D316L/P337A/T392M, H92Y/P166S/D247N,
67 / 169 H92Y/P166S/D316L, H92Y/A206K/I322M, H92Y/R217F, H92Y/R217F/A271H/P337A, H92Y/G261A/A271H, H92Y/A271H, P166S/R217F/D316L/I322M/P337A, P166S/D247N/A271H/D316L, P166S/D316L/I322M/P337A, A206K/R217F, R217F/T392M, D247N/D316L, D316L/I322M/A368W e D316L/P337A/T392M, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 374.
[00113] Em algumas modalidades, a sequência do polipeptídeo de alfa- galactosidase A recombinante tem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com as sequências de números pares dentre SEQ ID NOS: 4-702.
[00114] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de GLA engenheirado compreende um fragmento funcional de um polipeptídeo de GLA engenheirado abrangido pela invenção. Os fragmentos funcionais apresentam pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da atividade do polipeptídeo de GLA engenheirado do qual foi derivado (ou seja, o GLA engenheirado original). Um fragmento funcional compreende pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e mesmo 99% da sequência original da GLA engenheirada. Em algumas modalidades, o fragmento funcional é truncado com menos de 5, menos de 10, menos de 15, menos de 10, menos de 25, menos de 30, menos de 35, menos de 40, menos de 45 e menos de 50 aminoácidos.
[00115] Polinucleotídeos que codificam polipeptídeos engenheirados, vetores de expressão e células hospedeiras:
[00116] A presente invenção provê polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos de GLA engenheirados aqui descritos. Em algumas
68 / 169 modalidades, os polinucleotídeos são ligados operativamente a uma ou mais sequências reguladoras heterólogas ou homólogas que controlam a expressão do gene para criar um polinucleotídeo recombinante capaz de expressar o polipeptídeo. Construções para expressão contendo um polinucleotídeo heterólogo que codifica os polipeptídeos de GLA engenheirados podem ser introduzidas em células hospedeiras adequadas para expressar o polipeptídeo de GLA correspondente.
[00117] Como será evidente para o técnico no assunto, a disponibilidade de uma sequência proteica e o conhecimento dos códons correspondentes aos vários aminoácidos provêm uma descrição de todos os polinucleotídeos capazes de codificar os polipeptídeos em questão. A degenerescência do código genético, em que os mesmos aminoácidos são codificados por códons alternativos ou sinônimos permite que seja produzido um número extremamente grande de ácidos nucleicos, os quais, todos codificam o polipeptídeo de GLA engenheirado. Assim, tendo conhecimento de uma determinada sequência de aminoácidos, os técnicos no assunto poderiam produzir qualquer número de diferentes ácidos nucleicos simplesmente modificando a sequência de um ou mais códons de uma maneira que não altere a sequência de aminoácidos da proteína. A esse respeito, a presente invenção especificamente contempla toda e cada possível variação de polinucleotídeos que possam ser efetuadas, codificando os polipeptídeos aqui descritos pela seleção de combinações com base nas possíveis escolhas de códons, e todas as tais variações deverão ser consideradas especificamente descritas para qualquer polipeptídeo aqui descrito, incluindo as variantes fornecidas nas Tabelas 2-1, 5-1, 6-1, 7-1, 8-1 e/ou 9-1.
[00118] Em várias modalidades, os códons são preferivelmente selecionados para se encaixarem na célula hospedeira na qual a proteína está sendo produzida. Por exemplo, códons preferidos usados em bactérias são
69 / 169 usados para expressão em bactérias. Consequentemente, os polinucleotídeos com códons otimizados que codificam os polipeptídeos de GLA engenheirados contêm códons preferidos em cerca de 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou mais de 90% das posições de códons da região de codificação completa. Em algumas modalidades, a presente invenção provê sequências de polinucleotídeos recombinantes nas quais os códons são otimizados para expressão em células ou tecidos humanos.
[00119] Em algumas modalidades, a presente invenção provê uma sequência de polinucleotídeo recombinante tendo pelo menos aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a presente invenção provê uma sequência de polinucleotídeo recombinante tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a sequência de polinucleotídeo recombinante tem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com as sequências de números ímpares dentre SEQ ID NOS: 3-701.
[00120] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica uma alfa- galactosidase A recombinante que compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa- galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou
70 / 169 conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 44, 44/217, 44/217/316, 44/217/322, 44/217/322/337, 44/247, 44/247/302, 44/247/302/322, 44/247/322, 44/247/337, 44/247/362, 44/302, 44/337, 44/373, 217/322, 217/373, 247/322, 247/362, 302/322/362/373, 302/337, 316, 316/337, 322, 322/337, 362/373 e 373, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica uma alfa- galactosidase A recombinante que compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa- galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 44L, 44L/217F, 44L/217F/316L, 44L/217F/322M, 44L/217F/322M/337A, 44L/247N, 44L/247N/302Q, 44L/247N/302Q/322M, 44L/247N/322M, 44L/247N/337A, 44L/247N/362K, 44L/302Q, 44L/337A, 44L/373R, 217F/322M, 217F/373R, 247N/322M, 247N/362K, 302Q/322M/362K/373R, 302Q/337A, 316L, 316L/337A, 322M, 322M/337A, 362K/373R e 373R, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica uma alfa-galactosidase A recombinante compreendendo uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8, ou um fragmento funcional da mesma, em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre R44L, R44L/R217F, R44L/R217F/D316L, R44L/R217F/I322M, R44L/R217F/I322M/P337A, R44L/D247N, R44L/D247N/K302Q,
71 / 169 R44L/D247N/K302Q/I322M, R44L/D247N/I322M, R44L/D247N/P337A, R44L/D247N/Q362K, R44L/K302Q, R44L/P337A, R44L/K373R, R217F/I322M, R217F/K373R, D247N/I322M, D247N/Q362K, K302Q/I322M/Q362K/K373R, K302Q/P337A, D316L, D316L/P337A, I322M, I322M/P337A, Q362K/K373R e K373R, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 8.
[00121] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica uma alfa- galactosidase A recombinante compreendendo uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa- galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 10/39/44/47/92/166/206/217/247/261/271/302/316/322/337/362/368/373/392, 44/217/316, 44/217/322/337, 166/362, 217/373 e 362/373, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica uma alfa-galactosidase A recombinante compreendendo uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8, ou um fragmento funcional da mesma, em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 10T/39M/44L/47S/92Y/166S/206K/217F/247N/261A/271H/302Q/316L/322 M/337A/362K/368W/373R/392M, 44L/217F/316L, 44L/217F/322M/337A, 166A/362K, 217F/373R e 362K/373R, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID
72 / 169 NO: 8. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica uma alfa- galactosidase A recombinante compreendendo uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8, ou um fragmento funcional da mesma, em que a dita alfa- galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre P10T/E39M/R44L/T47S/H92Y/P166S/A206K/R217F/D247N/G261A/A271 H/K302Q/D316L/I322M/P337A/Q362K/A368W/K373R/T392M, R44L/R217F/D316L, R44L/R217F/I322M/P337A, P166A/Q362K, R217F/K373R e Q362K/K373R, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO:
8.
[00122] Em algumas modalidades, a presente invenção provê uma sequência de polinucleotídeo recombinante tendo pelo menos aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 57. Em algumas modalidades, a presente invenção provê uma sequência de polinucleotídeo recombinante tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 57. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica uma alfa-galactosidase A recombinante, em que a dita alfa- galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO:
73 / 169
58, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 7, 7/48/68, 7/48/68/120/282/299, 7/48/130/282, 7/48/180, 7/68/130/282/365, 7/68/180, 7/88/120/305/365, 7/120, 7/130, 7/282, 7/305, 7/305/365, 7/365, 39, 47, 47/87/95/96/158/162, 47/95, 47/273, 47/343, 48, 48/68, 48/180/282, 48/282, 48/282/305, 67/180, 68, 68/299/300, 71, 87/91/95/96/158/162, 87/91/95/96/206/343, 87/96/155/273/343, 88, 91/95, 91/95/96, 92, 93, 96, 96/273, 96/312/343, 120, 120/299/305, 151, 158, 158/162/273, 162, 162/273, 162/343, 166, 178, 180, 181, 206, 217, 271, 273, 273/343, 282, 282/365, 293/391, 299/300, 299/300/305/365, 300, 301, 305, 305/365, 314, 333, 336, 337, 343, 345, 363, 365, 370, 389, 393, 394, 396/398, 397 e 398, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 58. Em algumas modalidades, a alfa- galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 58, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 7L, 7L/48D/68E, 7L/48D/68E/120H/282N/299R, 7L/48D/130E/282N, 7L/48D/180G, 7L/68E/130E/282N/365V, 7L/68E/180G, 7L/88A/120H/305G/365V, 7L/120H, 7L/130E, 7L/282N, 7L/305G, 7L/305G/365V, 7L/365V, 39V, 47D, 47D/87K/95E/96L/158R/162H, 47D/95E, 47D/273P, 47D/343G, 47V, 48D, 48D/68E, 48D/180G/282N, 48D/282N, 48D/282N/305G, 67T/180G, 68E, 68E/299R/300I, 71P, 87K/91Q/95E/96L/158A/162K, 87K/91Q/95E/96L/206S/343G, 87K/96I/155N/273P/343G, 88A, 91Q/95E, 91Q/95E/96L, 92F, 92T, 93I, 96L, 96L/273P, 96L/312Q/343G, 120H, 120H/299R/305G, 151L, 158A, 158A/162K/273G, 158R, 162H/343D, 162K,
74 / 169
162K/273P, 162S, 166K, 178G, 178S, 180G, 180L, 180T, 180V, 181A, 206K, 206S, 217K, 271R, 273P, 273P/343G, 282N, 282N/365V, 293P/391A, 299R/300I, 299R/300I/305G/365V, 300I, 301M, 305G, 305G/365V, 314A, 333F, 333G, 336V, 337R, 343D, 343G, 345A, 345Q, 363Q, 365A, 365Q, 365V, 370G, 389K, 393V, 394K, 396G/398T, 397A, 398A, 398P, 398S e 398V, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 58. Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 58, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre R7L, R7L/E48D/Q68E, R7L/E48D/Q68E/Y120H/D282N/Q299R, R7L/E48D/D130E/D282N, R7L/E48D/F180G, R7L/Q68E/D130E/D282N/F365V, R7L/Q68E/F180G, R7L/Q88A/Y120H/N305G/F365V, R7L/Y120H, R7L/D130E, R7L/D282N, R7L/N305G, R7L/N305G/F365V, R7L/F365V, E39V, T47D, T47D/R87K/S95E/K96L/L158R/R162H, T47D/S95E, T47D/S273P, T47D/K343G, T47V, E48D, E48D/Q68E, E48D/F180G/D282N, E48D/D282N, E48D/D282N/N305G, P67T/F180G, Q68E, Q68E/Q299R/L300I, S71P, R87K/N91Q/S95E/K96L/L158A/R162K, R87K/N91Q/S95E/K96L/A206S/K343G, R87K/K96I/H155N/S273P/K343G, Q88A, N91Q/S95E, N91Q/S95E/K96L, H92F, H92T, V93I, K96L, K96L/S273P, K96L/P312Q/K343G, Y120H, Y120H/Q299R/N305G, D151L, L158A, L158A/R162K/S273G, L158R, R162H/K343D, R162K, R162K/S273P, R162S, P166K, W178G, W178S, F180G, F180L, F180T, F180V, Q181A, A206K, A206S, R217K, A271R, S273P, S273P/K343G, D282N, D282N/F365V, L293P/Q391A, Q299R/L300I,
75 / 169 Q299R/L300I/N305G/F365V, L300I, R301M, N305G, N305G/F365V, S314A, S333F, S333G, I336V, P337R, K343D, K343G, V345A, V345Q, L363Q, F365A, F365Q, F365V, S370G, T389K, S393V, L394K, D396G/L398T, L397A, L398A, L398P, L398S e L398V, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 58.
[00123] Em algumas modalidades, a presente invenção provê uma sequência de polinucleotídeo recombinante tendo pelo menos aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 157. Em algumas modalidades, a presente invenção provê uma sequência de polinucleotídeo recombinante tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 157. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica uma alfa-galactosidase A recombinante, em que a dita alfa- galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 158, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 24/202, 39/47, 39/47/217, 39/151, 39/282/337/398, 39/337/343/398, 39/393/398, 47/130, 47/151, 47/343/345/393, 48, 48/68, 48/68/217/333/391/393, 48/68/333, 48/217, 48/333, 48/345/393, 48/393, 59/143, 68, 68/345, 130, 130/158, 130/158/393, 130/345/393, 143/271, 143/333, 143/387, 151,
76 / 169 151/158/217/343/345/393, 151/206/282/337/343/345/398, 151/282/393, 151/345/393/398, 151/393, 158, 158/393, 202, 206, 206/217, 217, 217/333, 217/337/345/398, 271, 282/393, 333, 333/345, 337/343/345/398, 343, 343/345/393/398, 393 e 393/398, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO:
158. Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 158, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 24S/202N, 39V/47D, 39V/47V/217K, 39V/151L, 39V/282N/337R/398A, 39V/337R/343G/398A, 39V/393V/398A, 47V/130E, 47V/151L, 47V/343D/345Q/393V, 48D, 48D/68E, 48D/68E/217K/333F/391A/393V, 48D/68E/333F, 48D/217K, 48D/333F, 48D/333G, 48D/345Q/393V, 48D/393V, 59A/143S, 68E, 68E/345Q, 130E, 130E/158R, 130E/158R/393V, 130E/345Q/393V, 143S/271N, 143S/333N, 143S/387N, 151L, 151L/158R/217K/343G/345Q/393V, 151L/206S/282N/337R/343D/345Q/398A, 151L/282N/393V, 151L/345Q/393V/398A, 151L/393V, 158R, 158R/393V, 202N, 206S, 206S/217K, 217K, 217K/333F, 217K/333G, 217K/337R/345Q/398A, 271N, 282N/393V, 333F/345Q, 333G, 333N, 337R/343G/345Q/398A, 343D, 343D/345Q/393V/398A, 393V e 393V/398A, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 158. Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A
77 / 169 recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre D24S/D202N, E39V/T47D, E39V/T47V/R217K, E39V/D151L, E39V/D282N/P337R/L398A, E39V/P337R/K343G/L398A, E39V/S393V/L398A, T47V/D130E, T47V/D151L, T47V/K343D/V345Q/S393V, E48D, E48D/Q68E, E48D/Q68E/R217K/S333F/Q391A/S393V, E48D/Q68E/S333F, E48D/R217K, E48D/S333F, E48D/S333G, E48D/V345Q/S393V, E48D/S393V, C59A/C143S, Q68E, Q68E/V345Q, D130E, D130E/L158R, D130E/L158R/S393V, D130E/V345Q/S393V, C143S/A271N, C143S/S333N, C143S/E387N, D151L, D151L/L158R/R217K/K343G/V345Q/S393V, D151L/A206S/D282N/P337R/K343D/V345Q/L398A, D151L/D282N/S393V, D151L/V345Q/S393V/L398A, D151L/S393V, L158R, L158R/S393V, D202N, A206S, A206S/R217K, R217K, R217K/S333F, R217K/S333G, R217K/P337R/V345Q/L398A, A271N, D282N/S393V, S333F/V345Q, S333G, S333N, P337R/K343G/V345Q/L398A, K343D, K343D/V345Q/S393V/L398A, S393V e S393V/L398A, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO:
158.
[00124] Em algumas modalidades, a presente invenção provê uma sequência de polinucleotídeo recombinante tendo pelo menos aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 371. Em algumas
78 / 169 modalidades, a presente invenção provê uma sequência de polinucleotídeo recombinante tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 371. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica uma alfa-galactosidase A recombinante, em que a dita alfa- galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 372, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 10, 10/39/44/322, 10/39/92/206/217/271, 10/39/92/247, 10/39/92/247/271/316, 10/44, 10/44/47/92/247, 10/44/47/261/302/322/368, 10/44/92/316/322, 10/44/261/302/316, 10/44/302/337/368, 10/47/217/247/316/392, 10/47/217/322, 10/47/271, 10/92, 10/92/206/217/247, 10/92/206/247/316/322/392, 10/92/206/247/322/368, 10/92/217/261/302/337, 10/206/217/271, 10/206/247, 10/206/261/271/316, 10/261, 10/271/302, 10/302, 10/302/316, 10/302/322/337, 10/316/322, 10/337/392, 10/368, 39/44/92/162/247/302/316/322, 39/44/92/217/322, 39/44/92/247/271/302, 39/47/92/247/302/316/322, 39/47/217/247/368, 39/47/247, 39/92/247/302/316/337/368, 39/92/316/322, 39/247/271, 39/247/271/316, 39/322, 44/47/92/206/217/316/322, 44/47/92/247/261/271/316/337/368, 44/47/206/217/247/271/322, 44/47/247/322/368, 44/47/302/316/322, 44/92/206/247/368, 44/206/337, 44/247/261/302/316, 44/247/261/302/316/322, 47/92/247/271, 47/217/302, 47/247, 47/247/271, 89/217/247/261/302/316, 92/217/271, 92/247, 92/247/271/322, 92/247/302/322/337, 92/271/337, 92/302, 92/316, 206/217/271/392, 217/247/316/322/337/368, 247, 247/271, 247/302, 271, 271/302/322, 271/316/322, 302/322/368 e 368, em que as posições de aminoácidos da dita
79 / 169 sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO:
372. Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 372, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 10P, 10P/39E/44R/322I, 10P/39E/92H/206A/217R/271A, 10P/39E/92H/247D, 10P/39E/92H/247D/271A/316D, 10P/44R, 10P/44R/47T/92H/247D, 10P/44R/47T/261G/302K/322I/368A, 10P/44R/92H/316D/322I, 10P/44R/261G/302K/316D, 10P/44R/302K/337P/368A, 10P/47T/217R/247D/316D/392T, 10P/47T/217R/322I, 10P/47T/271A, 10P/92H, 10P/92H/206A/217R/247D, 10P/92H/206A/247D/316D/322I/392T, 10P/92H/206A/247D/322I/368A, 10P/92H/217R/261G/302K/337P, 10P/206A/217R/271A, 10P/206A/247D, 10P/206A/261G/271A/316D, 10P/261G, 10P/271A/302K, 10P/302K, 10P/302K/316D, 10P/302K/322I/337P, 10P/316D/322I, 10P/337P/392T, 10P/368A, 39E/44R/92H/162M/247D/302K/316D/322I, 39E/44R/92H/217R/322I, 39E/44R/92H/247D/271A/302K, 39E/47T/92H/247D/302K/316D/322I, 39E/47T/217R/247D/368A, 39E/47T/247D, 39E/92H/247D/302K/316D/337P/368A, 39E/92H/316D/322I, 39E/247D/271A, 39E/247D/271A/316D, 39E/322I, 44R/47T/92H/206A/217R/316D/322I, 44R/47T/92H/247D/261G/271A/316D/337P/368A, 44R/47T/206A/217R/247D/271A/322I, 44R/47T/247D/322I/368A, 44R/47T/302K/316D/322I, 44R/92H/206A/247D/368A, 44R/206A/337P, 44R/247D/261G/302K/316D, 44R/247D/261G/302K/316D/322I, 47T/92H/247D/271A, 47T/217R/302K, 47T/247D, 47T/247D/271A,
80 / 169
89I/217R/247D/261G/302K/316D, 92H/217R/271A, 92H/247D, 92H/247D/271A/322I, 92H/247D/302K/322I/337P, 92H/271A/337P, 92H/302K, 92H/316D, 206A/217R/271A/392T, 217R/247D/316D/322I/337P/368A, 247D, 247D/271A, 247D/302K, 271A, 271A/302K/322I, 271A/316D/322I, 302K/322I/368A e 368A, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 372. Em algumas modalidades, a alfa- galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 372, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre T10P, T10P/M39E/L44R/M322I, T10P/M39E/Y92H/K206A/F217R/H271A, T10P/M39E/Y92H/N247D, T10P/M39E/Y92H/N247D/H271A/L316D, T10P/L44R, T10P/L44R/S47T/Y92H/N247D, T10P/L44R/S47T/A261G/Q302K/M322I/W368A, T10P/L44R/Y92H/L316D/M322I, T10P/L44R/A261G/Q302K/L316D, T10P/L44R/Q302K/A337P/W368A, T10P/S47T/F217R/N247D/L316D/M392T, T10P/S47T/F217R/M322I, T10P/S47T/H271A, T10P/Y92H, T10P/Y92H/K206A/F217R/N247D, T10P/Y92H/K206A/N247D/L316D/M322I/M392T, T10P/Y92H/K206A/N247D/M322I/W368A, T10P/Y92H/F217R/A261G/Q302K/A337P, T10P/K206A/F217R/H271A, T10P/K206A/N247D, T10P/K206A/A261G/H271A/L316D, T10P/A261G, T10P/H271A/Q302K, T10P/Q302K, T10P/Q302K/L316D, T10P/Q302K/M322I/A337P, T10P/L316D/M322I, T10P/A337P/M392T, T10P/W368A, M39E/L44R/Y92H/R162M/N247D/Q302K/L316D/M322I, M39E/L44R/Y92H/F217R/M322I,
81 / 169 M39E/L44R/Y92H/N247D/H271A/Q302K, M39E/S47T/Y92H/N247D/Q302K/L316D/M322I, M39E/S47T/F217R/N247D/W368A, M39E/S47T/N247D, M39E/Y92H/N247D/Q302K/L316D/A337P/W368A, M39E/Y92H/L316D/M322I, M39E/N247D/H271A, M39E/N247D/H271A/L316D, M39E/M322I, L44R/S47T/Y92H/K206A/F217R/L316D/M322I, L44R/S47T/Y92H/N247D/A261G/H271A/L316D/A337P/W368A, L44R/S47T/K206A/F217R/N247D/H271A/M322I, L44R/S47T/N247D/M322I/W368A, L44R/S47T/Q302K/L316D/M322I, L44R/Y92H/K206A/N247D/W368A, L44R/K206A/A337P, L44R/N247D/A261G/Q302K/L316D, L44R/N247D/A261G/Q302K/L316D/M322I, S47T/Y92H/N247D/H271A, S47T/F217R/Q302K, S47T/N247D, S47T/N247D/H271A, L89I/F217R/N247D/A261G/Q302K/L316D, Y92H/F217R/H271A, Y92H/N247D, Y92H/N247D/H271A/M322I, Y92H/N247D/Q302K/M322I/A337P, Y92H/H271A/A337P, Y92H/Q302K, Y92H/L316D, K206A/F217R/H271A/M392T, F217R/N247D/L316D/M322I/A337P/W368A, N247D, N247D/H271A, N247D/Q302K, H271A, H271A/Q302K/M322I, H271A/L316D/M322I, Q302K/M322I/W368A e W368A, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO:
372.
[00125] Em algumas modalidades, a presente invenção provê uma sequência de polinucleotídeo recombinante tendo pelo menos aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%,
82 / 169 aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 373. Em algumas modalidades, a presente invenção provê uma sequência de polinucleotídeo recombinante tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 373. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica uma alfa-galactosidase A recombinante, em que a dita alfa- galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 374, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 10/36/92/166/247/261/316/392, 10/39, 10/39/44/47/92/206/217, 10/39/44/47/316, 10/39/44/47/337, 10/39/44/92/166/261/316/322, 10/39/44/92/166/302/322, 10/39/44/92/166/392, 10/39/44/92/217/302/322, 10/39/44/92/302/322, 10/39/44/166/261/271/316/322, 10/39/44/392, 10/39/47/92/337, 10/39/92/131/166/271/316/322, 10/39/92/166/217/247/271, 10/39/92/217/316, 10/44/47/166/261/271, 10/44/47/166/271/322/368, 10/44/47/217/271/316/322, 10/44/92, 10/44/92/217/247/271/302/316/392, 10/44/166/302, 10/44/206/316/322, 10/47/92/166/271/316/337, 10/47/92/271/302, 10/47/92/316/322/392, 10/47/166/271, 10/47/166/316, 10/92/166, 10/92/166/217/247/261/271, 10/92/166/261/271/392, 10/92/166/261/316/322/337, 10/92/166/337/368, 10/92/302/337, 10/92/316/322, 10/206, 10/206/247/261, 10/217/322, 10/261, 10/261/337/392, 10/316/392, 10/368, 39/44/47/92/166/206/392, 39/44/47/92/206/247/261, 39/44/47/92/206/392, 39/44/47/206/337/368/392, 39/44/92/166/247/261/302/337, 39/44/166/271, 39/44/166/271/337/368/392, 39/47/92/316/322, 39/47/92/392, 39/47/166/217/261/392, 39/47/217/247/368,
83 / 169
39/47/247, 39/92/166/217/392, 39/92/261/302, 39/166/217/261/316/368, 39/322, 39/392, 44/47, 44/47/92/217/271, 44/47/92/217/316/322/392, 44/47/92/392, 44/47/166, 44/47/166/271, 44/47/247/271/392, 44/316/322/392, 44/337, 47/166/206/217/247/337, 47/166/217/271/337, 47/206, 47/217/247/261, 47/271, 52/217/302/316, 92/166/206/271/316, 92/166/217/261/271/392, 92/166/217/316/337/392, 92/166/247, 92/166/316, 92/206/322, 92/217, 92/217/271/337, 92/261/271, 92/271, 166/217/316/322/337, 166/247/271/316, 166/316/322/337, 206/217, 217/392, 247/316, 316/322/368 e 316/337/392, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 374. Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 374, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 10T/36M/92Y/166S/247N/261A/316L/392M, 10T/39M, 10T/39M/44L/47S/92Y/206K/217F, 10T/39M/44L/47S/316L, 10T/39M/44L/47S/337A, 10T/39M/44L/92Y/166S/261A/316L/322M, 10T/39M/44L/92Y/166S/302Q/322M, 10T/39M/44L/92Y/166S/392M, 10T/39M/44L/92Y/217F/302Q/322M, 10T/39M/44L/92Y/302Q/322M, 10T/39M/44L/166S/261A/271H/316L/322M, 10T/39M/44L/392M, 10T/39M/47S/92Y/337A, 10T/39M/92Y/131G/166S/271H/316L/322M, 10T/39M/92Y/166S/217F/247N/271H, 10T/39M/92Y/217F/316L, 10T/44L/47S/166S/261A/271H, 10T/44L/47S/166S/271H/322M/368W, 10T/44L/47S/217F/271H/316L/322M, 10T/44L/92Y, 10T/44L/92Y/217F/247N/271H/302Q/316L/392M, 10T/44L/166S/302Q, 10T/44L/206K/316L/322M, 10T/47S/92Y/166S/271H/316L/337A, 10T/47S/92Y/271H/302Q, 10T/47S/92Y/316L/322M/392M,
84 / 169
10T/47S/166S/271H, 10T/47S/166S/316L, 10T/92Y/166S, 10T/92Y/166S/217F/247N/261A/271H, 10T/92Y/166S/261A/271H/392M, 10T/92Y/166S/261A/316L/322M/337A, 10T/92Y/166S/337A/368W, 10T/92Y/302Q/337A, 10T/92Y/316L/322M, 10T/206K, 10T/206K/247N/261A, 10T/217F/322M, 10T/261A, 10T/261A/337A/392M, 10T/316L/392M, 10T/368W, 39M/44L/47S/92Y/166S/206K/392M, 39M/44L/47S/92Y/206K/247N/261A, 39M/44L/47S/92Y/206K/392M, 39M/44L/47S/206K/337A/368W/392M, 39M/44L/92Y/166S/247N/261A/302Q/337A, 39M/44L/166S/271H, 39M/44L/166S/271H/337A/368W/392M, 39M/47S/92Y/316L/322M, 39M/47S/92Y/392M, 39M/47S/166S/217F/261A/392M, 39M/47S/217F/247N/368W, 39M/47S/247N, 39M/92Y/166S/217F/392M, 39M/92Y/261A/302Q, 39M/166S/217F/261A/316L/368W, 39M/322M, 39M/392M, 44L/47S, 44L/47S/92Y/217F/271H, 44L/47S/92Y/217F/316L/322M/392M, 44L/47S/92Y/392M, 44L/47S/166S, 44L/47S/166S/271H, 44L/47S/247N/271H/392M, 44L/316L/322M/392M, 44L/337A, 47S/166S/206K/217F/247N/337A, 47S/166S/217F/271H/337A, 47S/206K, 47S/217F/247N/261A, 47S/271H, 52N/217F/302Q/316L, 92Y/166S/206K/271H/316L, 92Y/166S/217F/261A/271H/392M, 92Y/166S/217F/316L/337A/392M, 92Y/166S/247N, 92Y/166S/316L, 92Y/206K/322M, 92Y/217F, 92Y/217F/271H/337A, 92Y/261A/271H, 92Y/271H, 166S/217F/316L/322M/337A, 166S/247N/271H/316L, 166S/316L/322M/337A, 206K/217F, 217F/392M, 247N/316L, 316L/322M/368W e 316L/337A/392M, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência a SEQ ID NO: 374. Em algumas modalidades, a alfa-galactosidase A recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 374, ou um fragmento funcional
85 / 169 da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre P10T/K36M/H92Y/P166S/D247N/G261A/D316L/T392M, P10T/E39M, P10T/E39M/R44L/T47S/H92Y/A206K/R217F, P10T/E39M/R44L/T47S/D316L, P10T/E39M/R44L/T47S/P337A, P10T/E39M/R44L/H92Y/P166S/G261A/D316L/I322M, P10T/E39M/R44L/H92Y/P166S/K302Q/I322M, P10T/E39M/R44L/H92Y/P166S/T392M, P10T/E39M/R44L/H92Y/R217F/K302Q/I322M, P10T/E39M/R44L/H92Y/K302Q/I322M, P10T/E39M/R44L/P166S/G261A/A271H/D316L/I322M, P10T/E39M/R44L/T392M, P10T/E39M/T47S/H92Y/P337A, P10T/E39M/H92Y/W131G/P166S/A271H/D316L/I322M, P10T/E39M/H92Y/P166S/R217F/D247N/A271H, P10T/E39M/H92Y/R217F/D316L, P10T/R44L/T47S/P166S/G261A/A271H, P10T/R44L/T47S/P166S/A271H/I322M/A368W, P10T/R44L/T47S/R217F/A271H/D316L/I322M, P10T/R44L/H92Y, P10T/R44L/H92Y/R217F/D247N/A271H/K302Q/D316L/T392M, P10T/R44L/P166S/K302Q, P10T/R44L/A206K/D316L/I322M, P10T/T47S/H92Y/P166S/A271H/D316L/P337A, P10T/T47S/H92Y/A271H/K302Q, P10T/T47S/H92Y/D316L/I322M/T392M, P10T/T47S/P166S/A271H, P10T/T47S/P166S/D316L, P10T/H92Y/P166S, P10T/H92Y/P166S/R217F/D247N/G261A/A271H, P10T/H92Y/P166S/G261A/A271H/T392M, P10T/H92Y/P166S/G261A/D316L/I322M/P337A, P10T/H92Y/P166S/P337A/A368W, P10T/H92Y/K302Q/P337A, P10T/H92Y/D316L/I322M, P10T/A206K, P10T/A206K/D247N/G261A, P10T/R217F/I322M, P10T/G261A, P10T/G261A/P337A/T392M,
86 / 169
P10T/D316L/T392M, P10T/A368W, E39M/R44L/T47S/H92Y/P166S/A206K/T392M, E39M/R44L/T47S/H92Y/A206K/D247N/G261A, E39M/R44L/T47S/H92Y/A206K/T392M, E39M/R44L/T47S/A206K/P337A/A368W/T392M, E39M/R44L/H92Y/P166S/D247N/G261A/K302Q/P337A, E39M/R44L/P166S/A271H, E39M/R44L/P166S/A271H/P337A/A368W/T392M, E39M/T47S/H92Y/D316L/I322M, E39M/T47S/H92Y/T392M, E39M/T47S/P166S/R217F/G261A/T392M, E39M/T47S/R217F/D247N/A368W, E39M/T47S/D247N, E39M/H92Y/P166S/R217F/T392M, E39M/H92Y/G261A/K302Q, E39M/P166S/R217F/G261A/D316L/A368W, E39M/I322M, E39M/T392M, R44L/T47S, R44L/T47S/H92Y/R217F/A271H, R44L/T47S/H92Y/R217F/D316L/I322M/T392M, R44L/T47S/H92Y/T392M, R44L/T47S/P166S, R44L/T47S/P166S/A271H, R44L/T47S/D247N/A271H/T392M, R44L/D316L/I322M/T392M, R44L/P337A, T47S/P166S/A206K/R217F/D247N/P337A, T47S/P166S/R217F/A271H/P337A, T47S/A206K, T47S/R217F/D247N/G261A, T47S/A271H, D52N/R217F/K302Q/D316L, H92Y/P166S/A206K/A271H/D316L, H92Y/P166S/R217F/G261A/A271H/T392M, H92Y/P166S/R217F/D316L/P337A/T392M, H92Y/P166S/D247N, H92Y/P166S/D316L, H92Y/A206K/I322M, H92Y/R217F, H92Y/R217F/A271H/P337A, H92Y/G261A/A271H, H92Y/A271H, P166S/R217F/D316L/I322M/P337A, P166S/D247N/A271H/D316L, P166S/D316L/I322M/P337A, A206K/R217F, R217F/T392M, D247N/D316L, D316L/I322M/A368W e D316L/P337A/T392M, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo
87 / 169 como referência a SEQ ID NO: 374.
[00126] Em algumas modalidades, como descrito acima, o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo engenheirado tendo atividade de GLA com as propriedades aqui descritas, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade com uma sequência de referência (por exemplo, SEQ ID NO: 2, 8, 58, 158, 372 e/ou 374), ou a sequência de aminoácidos de qualquer variante como descrita na Tabela 2.1 e/ou 5.1, e uma ou mais diferenças de resíduo em comparação ao polipeptídeo de referência de SEQ ID NO: 8, ou a sequência de aminoácidos de qualquer variante como descrita na Tabela 2-1, 5-1, 6-1, 7-1, 8-1 e/ou 9-1 (por exemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais posições de resíduos de aminoácido). Em algumas modalidades, o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo engenheirado tendo atividade de GLA com as propriedades aqui descritas, em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com a sequência de referência SEQ ID NO: 2, 8, 58, 158, 372 e/ou 374, e uma ou mais diferenças de resíduo em comparação a SEQ ID NO: 2, 8, 58, 158, 372 e/ou 374, nas posições de resíduos selecionadas dentre aquelas providas na Tabela 2-1, 5-1, 6-1, 7-1, 8-1 e/ou 9-1, quando em alinhamento ótimo com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 8, 58, 158, 372 e/ou 374.
[00127] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica os polipeptídeos de GLA engenheirados compreende a sequência de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 8, 58, 158, 372 e/ou 374. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos são capazes de hibridizar sob condições altamente rigorosas com uma sequência de polinucleotídeo de referência. Em algumas modalidades, a sequência de referência é selecionada dentre SEQ ID
88 / 169 NOS: 1, 7, 57, 157, 371 e/ou 373, ou um complemento das mesmas, ou uma sequência de polinucleotídeo que codifica qualquer um dos polipeptídeos variantes de GLA aqui providos. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo capaz de hibridizar sob condições altamente rigorosas codifica um polipeptídeo de GLA que compreende uma sequência de aminoácidos contendo uma ou mais diferenças de resíduo em comparação a SEQ ID NO: 2, 8, 58, 158, 372 e/ou 374, nas posições de resíduo selecionadas dentre qualquer uma das posições como providas na Tabela 2-1, 5-1, 6-1, 7-1, 8-1 e/ou 9-1.
[00128] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo isolado que codifica qualquer um dos polipeptídeos de GLA engenheirados aqui providos é manipulado de várias maneiras para prover a expressão do polipeptídeo. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos são providos como vetores de expressão onde uma ou mais sequências de controle estão presentes para regular a expressão dos polinucleotídeos e/ou polipeptídeos. A manipulação do polinucleotídeo isolado antes de sua inserção em um vector pode ser desejável ou necessária, dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar sequências de polinucleotídeos e ácidos nucleicos, utilizando métodos do DNA recombinante, são bem conhecidas no campo.
[00129] Em algumas modalidades, as sequências de controle incluem entre outras sequências, promotores, sequência de Kozak, sequências líderes, sequências de poliadenilação, sequências de pró-peptídeo, sequências de peptídeo sinal, elementos reguladores com base no DNA para retenção da terapia gênica e terminadores da transcrição. Como conhecido na técnica, os promotores adequados podem ser selecionados com base nas células hospedeiras utilizadas. Promotores exemplares para células hospedeiras de fungos filamentosos incluem os promotores obtidos dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, aspártico proteinase de Rhizomucor miehei,
89 / 169 alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase ácido-estável de Aspergillus niger, glicoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, lipase de Rhizomucor miehei, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, acetamidase de Aspergillus nidulans e protease semelhante à tripsina de Fusarium oxysporum (Ver, por exemplo, WO 96/00787), bem como o promotor NA2-tpi (um híbrido dos promotores dos genes para alfa-amilase neutra de Aspergillus niger e triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae), e promotores mutantes, truncados e híbridos dos mesmos. Promotores exemplares de células de levedura podem ser dos genes para enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactoquinase (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae e 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para células hospedeiras de levedura são conhecidos na técnica (Ver, por exemplo, Romanos et al., Yeast 8:423-488 [1992]). Promotores exemplares para uso em células de mamíferos incluem, entre outros, aqueles do citomegalovírus (CMV), promotor de β-actina de galinha fundido com o intensificador do CMV, vírus vacuolante símio 40 (SV40), fosfoglicerato quinase de Homo sapiens, beta actina, fator-1a de alongamento ou gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase ou β-actina de Gallus gallus.
[00130] Em algumas modalidades, a sequência de controle é uma sequência terminadora da transcrição adequada, uma sequência reconhecida por uma célula hospedeira para encerrar a transcrição. A sequência terminadora é operacionalmente ligada ao terminal 3’ da sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo. Qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira de escolha encontra utilidade na presente invenção. Por exemplo, terminadores exemplares da transcrição para células hospedeiras de fungos filamentosos podem ser obtidos dos genes para TAKA amilase de
90 / 169 Aspergillus oryzae, glicoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, alfa-glicosidase de Aspergillus niger e protease semelhante à tripsina de Fusarium oxysporum. Os terminadores exemplares para células hospedeiras de leveduras podem ser obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores úteis para células hospedeiras de leveduras são conhecidos na técnica (Ver, por exemplo, Romanos et al., supra). Os terminadores exemplares para células de mamíferos incluem, entre outros, aqueles do citomegalovírus (CMV), vírus vacuolante símio 40 (SV40), do hormônio de crescimento gGH de Homo sapiens, do hormônio de crescimento bovino BGH e de beta-globulina humana ou de coelho.
[00131] Em algumas modalidades, a sequência de controle uma sequência líder adequada, modificação 5′-cap, 5′ UTR etc. Em algumas modalidades, esses elementos de sequências reguladoras medeiam a ligação a moléculas envolvidas no tráfego e tradução do mRNA, inibem a degradação 5′-exonucleolítlica e conferem resistência à decapagem. A sequência líder é operacionalmente ligada ao terminal 5’ da sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo. Qualquer sequência líder que seja funcional na célula hospedeira de escolha pode ser utilizada. As líderes exemplares para células hospedeiras de fungos filamentosos são obtidas dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans. As líderes adequadas para células hospedeiras de leveduras incluem, entre outras, aquelas obtidas dos genes para enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae, fator-alfa de Saccharomyces cerevisiae e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de (ADH2/GAP) Saccharomyces cerevisiae. As líderes adequadas para células hospedeiras de mamíferos incluem, entre outras, o elemento 5ʹ-UTR presente no mRNA do
91 / 169 ortopoxivírus.
[00132] Em algumas modalidades, a sequência de controle compreende uma região 3’ não traduzida do ácido nucleico e sequência de ácido nucleico com cauda de poliadenilação, sequências operacionalmente ligadas ao terminal 3’ da sequência de ácido nucleico codificadora de proteína que medeiam a ligação a proteínas envolvidas no tráfego e tradução do mRNA e meia-vida do mRNA. Qualquer sequência de poliadenilação e 3’ UTR que seja funcional na célula hospedeira de escolha pode ser utilizada na presente invenção. Sequências de poliadenilação exemplares para células hospedeiras de fungos filamentosos incluem, entre outras, aquelas dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, glicoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, protease semelhante à tripsina de Fusarium oxysporum e alfa-glicosidase de Aspergillus niger. Sequências de poliadenilação úteis para células hospedeiras de levedura são também conhecidas na técnica (Ver, por exemplo, Guo e Sherman, Mol. Cell. Biol., 15:5983-5990 [1995]). Sequências de poliadenilação e 3’ UTR úteis para células hospedeiras de mamíferos incluem, entre outras, as 3ʹ-UTRs de mRNAs de α- e β-globina que abrigam diversos elementos da sequência que aumentam a estabilidade e tradução do mRNA.
[00133] Em algumas modalidades, a sequência de controle é uma região de codificação de peptídeo sinal que codifica para uma sequência de aminoácidos ligada ao amino terminal de um polipeptídeo e que direciona o polipeptídeo codificado para a via secretora da célula. A terminação 5’ da sequência de codificação da sequência de ácido nucleico pode conter inerentemente uma região de codificação de peptídeo sinal ligada naturalmente, na fase de leitura de tradução, ao segmento da região de codificação que codifica o polipeptídeo secretado. Alternativamente, a extremidade 5’ da sequência de codificação pode conter uma região de codificação de peptídeo sinal que é estranha à sequência de codificação.
92 / 169 Qualquer região de codificação de peptídeo sinal que direcione o polipeptídeo expresso para a via secretora de uma célula hospedeira de escolha encontra utilidade para expressão dos polipeptídeos de GLA engenheirados aqui providos. As regiões de codificação de peptídeo sinal, eficazes para células hospedeiras de fungos filamentosos, incluem, entre outras, as regiões de codificação de peptídeo sinal obtidas dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, amilase neutra de Aspergillus niger, glicoamilase de Aspergillus niger, aspártico proteinase de Rhizomucor miehei, celulase de Humicola insolens e lipase de Humicola lanuginosa. Os peptídeos sinal para células hospedeiras de leveduras incluem, entre outros, aqueles obtidos dos genes para fator-alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Os peptídeos sinal úteis para células hospedeiras de mamíferos incluem, entre outros, aqueles obtidos dos genes para imunoglobulina gama (IgG).
[00134] Em algumas modalidades, a sequência de controle é uma região de codificação de pró-peptídeo que codifica para uma sequência de aminoácidos posicionada no terminal amino de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é referido como uma “pró-enzima”, “pró- polipeptídeo” ou “zimógeno”, em alguns casos). Um pró-polipeptídeo pode ser convertido em um polipeptídeo maduro ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo a partir do pró-polipeptídeo.
[00135] Em outro aspecto, a presente invenção também provê um vetor de expressão recombinante que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de GLA engenheirado, e uma ou mais regiões reguladoras da expressão como um promotor e um terminador, uma origem de replicação etc., dependendo do tipo de hospedeiros nos quais deverão ser introduzidos. Em algumas modalidades, as várias sequências de ácidos nucleicos e de controle descritas acima são unidas para produzir um vetor de expressão recombinante que inclui um ou mais sítios de restrição convenientes para
93 / 169 permitir a inserção ou substituição da sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de GLA variante em tais sítios. Alternativamente, a(s) sequência(s) de polinucleotídeo da presente invenção é/são expressa(s) inserindo a sequência de polinucleotídeo ou uma construção de ácido nucleico compreendendo a sequência de polinucleotídeo em um vetor adequado para expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência de codificação está localizada no vetor de modo que a sequência de codificação seja operacionalmente ligada às sequências de controle adequadas para expressão.
[00136] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus incluindo, entre outros, adenovírus (AV), vírus adenoassociado (AAV), lentivírus (LV), e vetores não virais, tais como lipossomos), que possa ser convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinantes e possa resultar na expressão da sequência de polinucleotídeo da GLA variante. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor deverá ser introduzido. Os vetores podem ser plasmídeos lineares ou circulares fechados.
[00137] Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um vetor capaz de replicação autônoma (ou seja, a vector que existe como uma entidade extra-cromossômica, cuja replicação independe da replicação cromossômica, tal como um plasmídeo, um elemento extra-cromossômico, um minicromossomo ou um cromossomo artificial). O vetor pode conter qualquer meio para assegurar a auto-replicação. Em algumas modalidades alternativas, o vetor pode ser aquele que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado junto com o(s) cromossomo(s) no(s) qual/quais foi integrado. Além disso, podem ser utilizados um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que, em conjunto, contenham o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon.
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[00138] Em algumas modalidades, o vetor de expressão preferivelmente contém um ou mais marcadores selecionáveis, os quais permitem a seleção fácil de células transformadas. Um “marcador selecionável” é um gene cujo produto provê resistência a biocidas ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia para auxotróficos e semelhantes. Os marcadores adequados para células hospedeiras de leveduras incluem, entre outros, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 e URA3. Os marcadores selecionáveis para uso em uma célula hospedeira de fungo filamentoso incluem, entre outros, amdS (acetamidase), argB (ornitina carbamoiltransferases), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidina-5’-fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase) e trpC (antranilato sintase), bem como equivalentes dos mesmos. Em outro aspecto, a presente invenção provê uma célula hospedeira que compreende um polinucleotídeo que codifica pelo menos um polipeptídeo de GLA engenheirado do presente pedido de patente, o polinucleotídeo sendo operativamente ligado a uma ou mais sequências de controle para expressão da(s) enzima(s) GLA engenheirada(s) na célula hospedeira. Células hospedeiras para uso em expressar os polipeptídeos codificados pelos vetores de expressão da presente invenção são bem conhecidas na técnica e incluem, entre outras, células de fungos, como células de leveduras (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris [por exemplo, No de acesso ATCC 201178]); células de inseto (por exemplo, células S2 de Drosophila e Sf9 de Spodoptera), células de plantas, células de animais (por exemplo, CHO, CHO-K1, COS e BHK) e células humanas (por exemplo, HEK293T, fibroblasto humano, THP-1, linhagens de células Jurkat e Bowes de melanoma).
[00139] Deste modo, em outro aspecto, a presente invenção provê métodos para produzir os polipeptídeos de GLA engenheirados, em que os métodos compreendem cultivar uma célula hospedeira capaz de expressar um
95 / 169 polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de GLA engenheirado, sob condições adequadas para expressão do polipeptídeo. Em algumas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente as etapas de isolar e/ou purificar os polipeptídeos de GLA, como aqui descritos.
[00140] Meios de cultura adequados e condições de crescimento para as células hospedeiras descritas acima são bem conhecidos na técnica. Os polinucleotídeos para expressão dos polipeptídeos de GLA podem ser introduzidos em células por vários métodos conhecidos na técnica. As técnicas incluem, entre outras, eletroporação, bombardeamento de partículas ou biobalística, transfecção mediada por lipossomos, transfecção com cloreto de cálcio e fusão de protoplastos.
[00141] A GLA engenheirada com as propriedades aqui descritas pode ser obtida submetendo o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de GLA natural ou engenheirado a métodos de mutagênese e/ou evolução direcionada conhecidos na técnica e como aqui descritos. Uma técnica exemplar de evolução direcionada é mutagênese e/ou embaralhamento do DNA (Ver, por exemplo, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751 [1994]; WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651; WO 01/75767 e a Patente U.S. 6 537 746). Outros procedimentos de evolução direcionada que podem ser utilizados incluem, entre outros, o processo de extensão escalonada (StEP), recombinação in vitro (Ver, por exemplo, Zhao et al., Nat. Biotechnol., 16:258–261 [1998]), PCR mutagênica (Ver, por exemplo, Caldwell et al., PCR Methods Appl., 3:S136-S140 [1994]) e mutagênese por cassete (Ver, por exemplo, Black et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3525-3529 [1996]).
[00142] Por exemplo, métodos de mutagênese e evolução direcionada podem ser prontamente aplicados a polinucleotídeos para gerar bibliotecas de variantes que podem ser expressas, rastreadas e analisadas, e métodos de evolução direcionada são bem conhecidos na técnica (Ver, por exemplo, as
96 / 169 Patentes US Nos 5 605 793, 5 811 238, 5 830 721. 5 834 252. 5 837 458, 5 928 905, 6 096 548, 6 117 679, 6 132 970, 6 165 793, 6 180 406, 6 251 674, 6 277 638, 6 287 861, 6 287 862, 6 291 242, 6 297 053, 6 303 344, 6 309 883, 6 319 713, 6 319 714, 6 323 030, 6 326 204, 6 335 160, 6 335 198, 6 344 356, 6 352 859, 6 355 484, 6 358 740, 6 358 742, 6 365 377, 6 365 408, 6 368 861, 6 372 497, 6 376 246, 6 379 964, 6 387 702, 6 391 552, 6 391 640, 6 395 547, 6 406 855, 6 406 910, 6 413 745, 6 413 774, 6 420 175, 6 423 542, 6 426 224, 6 436 675, 6 444 468, 6 455 253, 6 479 652, 6 482 647, 6 489 146, 6 506 602, 6 506 603, 6 519 065, 6 521 453, 6 528 311, 6 537 746, 6 573 098, 6 576 467, 6 579 678, 6 586 182, 6 602 986, 6 613 514, 6 653 072, 6 716 631, 6 946 296, 6 961 664, 6 995 017, 7 024 312, 7 058 515, 7 105 297, 7 148 054, 7 288 375, 7 421 347, 7 430 477, 7 534 564, 7 620 500, 7 620 502, 7 629 170, 7 702 464, 7 747 391, 7 747 393, 7 751 986, 7 776 598, 7 783 428, 7 795 030, 7 853 410, 7 868 138, 7 873 499, 7 904 249, 7 957 912, 8 383 346, 8 504 498, 8 849 575, 8 876 066, 8 768 871, 9 593 326, e todas as correspondentes relacionadas não dos Estados Unidos; Ling et al., Anal. Biochem., 254(2):157-78 [1997]; Dale et al., Meth. Mol. Biol., 57:369-74 [1996]; Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423- 462 [1985]; Botstein et al., Science, 229:1193-1201 [1985]; Carter, Biochem. J., 237:1-7 [1986]; Kramer et al., Cell, 38:879-887 [1984]; Wells et al., Gene, 34:315-323 [1985]; Minshull et al., Curr. Op. Chem. Biol., 3:284-290 [1999]; Christians et al., Nat. Biotechnol., 17:259-264 [1999]; Crameri et al., Nature, 391:288-291 [1998]; Crameri, et al., Nat. Biotechnol., 15:436-438 [1997]; Zhang et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 94:4504-4509 [1997]; Crameri et al., Nat. Biotechnol., 14:315-319 [1996]; Stemmer, Nature, 370:389-391
[1994]; Stemmer, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751 [1994]; Publicação de Pedido de Patente US Nos 2008/0220990, US 2009/0312196, US2014/0005057, US2014/0214391, US2014/0221216; US2015/0050658, US2015/0133307, US2015/0134315 e todas as correspondentes relacionadas não dos Estados Unidos; WO 95/22625, WO 97/0078, WO 97/35966, WO
97 / 169 98/27230, WO 00/42651, WO 01/75767, e WO 2009/152336; todos os aqui incorporados por referência).
[00143] Em algumas modalidades, as variantes da enzima obtidas após o tratamento de mutagênese são rastreadas, submetendo as variantes da enzima a uma temperatura definida (ou outras condições de ensaio) e medindo a quantidade de atividade da enzima após tratamentos térmicos ou outras condições de ensaio. O DNA contendo o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de GLA é então isolado da célula hospedeira, sequenciado para identificar as alterações na sequência de nucleotídeos (se houver) e usado para expressar a enzima em uma célula hospedeira diferente ou na mesma. A atividade de enzimas provenientes das bibliotecas de expressão pode ser medida usando qualquer método conhecido adequado na técnica (por exemplo, técnicas padrão de bioquímica, como análise por HPLC).
[00144] Para polipeptídeos engenheirados de sequência conhecida, os polinucleotídeos que codificam a enzima podem ser preparados por métodos padrão em fase sólida, de acordo com métodos sintéticos conhecidos. Em algumas modalidades, pode-se sintetizar individualmente fragmentos com até cerca de 100 bases, depois uni-los (por exemplo, por métodos de ligação enzimática ou química ou métodos mediados por polimerase) para formar qualquer sequência contínua desejada. Por exemplo, polinucleotídeos e oligonucleotídeos aqui descritos podem ser preparados por síntese química usando o método clássico com fosforamidita (Ver, por exemplo, Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859-69 [1981]; e Matthes et al., EMBO J., 3:801-05
[1984]), como este é tipicamente praticado em métodos sintéticos automáticos. De acordo com o método de fosforamidita, oligonucleotídeos são sintetizados (por exemplo, em um sintetizador automático de DNA), purificados, anelados, ligados e clonados em vetores adequados.
[00145] Deste modo, em algumas modalidades, um método para preparar o polipeptídeo de GLA engenheirado pode compreender: (a)
98 / 169 sintetizar um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as sequências de aminoácidos de qualquer variante fornecida na Tabela 2-1, 5-1, 6-1, 7-1, 8-1 e/ou 9-1, bem como SEQ ID NOS: 8, 58, 158, 372 e/ou 374, e (b) expressar o polipeptídeo de GLA codificado pelo polinucleotídeo. Em algumas modalidades do método, a sequência de aminoácidos codificada pelo polinucleotídeo por ter opcionalmente uma ou várias (por exemplo, até 3, 4, 5 ou até 10) deleções, inserções e/ou substituições de resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos tem opcionalmente 1- 2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 1-15, 1-20, 1-21, 1-22, 1-23, 1-24, 1- 25, 1-30, 1-35, 1-40, 1-45 ou 1-50 deleções, inserções e/ou substituições de resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos tem opcionalmente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 30, 35, 40, 45 ou 50 deleções, inserções e/ou substituições de resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos tem opcionalmente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 deleções, inserções e/ou substituições de resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, as substituições podem ser substituições conservadoras ou não conservadoras.
[00146] O polipeptídeo de GLA engenheirado expresso pode ser avaliado quanto a qualquer propriedade melhorada desejada (por exemplo, atividade, seletividade, estabilidade, tolerância a ácido, sensibilidade a proteases etc.), utilizando qualquer ensaio adequado conhecido na técnica, incluindo, entre outros, os ensaios e condições aqui descritos.
[00147] Em algumas modalidades, qualquer um dos polipeptídeos de GLA engenheirados expressos em uma célula hospedeira é recuperado das células e/ou do meio de cultura utilizando qualquer uma ou mais das técnicas bem conhecidas para purificação de proteínas, incluindo, entre outras,
99 / 169 tratamento com lisozimas, sonicação, filtração, precipitação em solução por altas concentrações de sal, ultracentrifugação e cromatografia.
[00148] As técnicas cromatográficas para isolamento dos polipeptídeos de GLA incluem, entre outras, cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica, eletroforese em gel e cromatografia de afinidade. As condições para purificar uma enzima em particular dependem, em parte, de fatores como carga final, hidrofobicidade, hidrofilicidade, peso molecular, forma molecular etc., e serão evidentes para os técnicos no assunto. Em algumas modalidades, técnicas de afinidade podem ser utilizadas para isolar as enzimas GLA variantes melhoradas. Em algumas modalidades que utilizam purificação por cromatografia de afinidade, qualquer anticorpo que se liga especificamente ao polipeptídeo de GLA variante encontra utilidade. Em algumas modalidades que utilizam purificação por cromatografia de afinidade, proteínas que se ligam aos glicano covalentemente ligados a GLA encontram utilidade. Em ainda outras modalidades que utilizam purificações por cromatografia de afinidade, qualquer molécula pequena que se ligue ao sítio ativo de GLA encontra utilidade. Para a produção de anticorpos, vários animais hospedeiros, incluindo, entre outros, coelhos, camundongos, ratos etc. são imunizados por injeção com um polipeptídeo de GLA (por exemplo, uma variante de GLA), ou um fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de GLA ou fragmento é anexado a um carreador adequado, como BSA, por meio de um grupo funcional da cadeia lateral ou ligantes anexados a um grupo funcional da cadeia lateral.
[00149] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de GLA engenheirado é produzido em uma célula hospedeira por um método que compreende cultivar uma célula hospedeira (por exemplo, S. cerevisiae, Daucus carota, Nicotiana tabacum, H. sapiens (por exemplo, HEK293T) ou Cricetulus griseus (por exemplo, CHO)) compreendendo uma sequência de
100 / 169 polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de GLA engenheirado como aqui descrito, sob condições que conduzem à produção do polipeptídeo de GLA engenheirado, e recuperar o polipeptídeo de GLA engenheirado das células e/ou do meio de cultura.
[00150] Em algumas modalidades, a invenção abrange um método para produzir um polipeptídeo de GLA engenheirado, o qual compreende cultivar uma célula eucariótica recombinante compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de GLA engenheirado tendo pelo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com uma sequência de referência (por exemplo, SEQ ID NO: 8, 58, 158, 372 e/ou 374), e uma ou mais diferenças de resíduo de aminoácido, em comparação a SEQ ID NO: 8, selecionada dentre aquelas fornecidas nas Tabelas 2-1, 5-1, 6-1, 7- 1, 8-1, 9-1, e/ou combinações das mesmas, quando em alinhamento ótimo com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8, 58, 158, 372 e/ou 374, sob condições de cultura adequadas para permitir a produção do polipeptídeo de GLA engenheirado e, opcionalmente, recuperar o polipeptídeo de GLA engenheirado da cultura e/ou das células cultivadas.
[00151] Em algumas modalidades, uma vez recuperados das células hospedeiras recombinantes ou do meio de cultura celular, os polipeptídeos de GLA engenheirados são adicionalmente purificados por qualquer/quaisquer método(s) adequado(s) conhecido(s) na técnica. Em algumas modalidades adicionais, os polipeptídeos de GLA purificados são combinados com outros ingredientes e compostos para fornecer composições e formulações que compreendem o polipeptídeo de GLA engenheirado, conforme adequado para diferentes aplicações e usos (por exemplo, composições farmacêuticas). Em algumas modalidades adicionais, os polipeptídeos de GLA engenheirados purificados, ou os polipeptídeos de GLA engenheirados formulados são liofilizados. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de GLA
101 / 169 engenheirados são produzidos diretamente dentro de um corpo (ou seja, células dentro de um corpo, tal como um humano ou outro animal) e não são purificados. No entanto, em algumas modalidades alternativas, os polipeptídeos de GLA engenheirados são produzidos dentro de um corpo (ou seja, células dentro de um corpo, tal como um humano ou outro animal) e são coletados do corpo utilizando métodos conhecidos na técnica. Em algumas modalidades adicionais, esses polipeptídeos de GLA engenheirados coletados são purificados. Em ainda algumas modalidades adicionais, esses polipeptídeos engenheirados coletados e/ou purificados são introduzidos em outro animal (por exemplo, humano ou outro animal) ou reintroduzidos no corpo que originalmente produziu os polipeptídeos de GLA engenheirados coletados e/ou purificados. Composições:
[00152] A presente invenção provê várias composições e formatos, incluindo, entre outros, aqueles descritos abaixo. Em algumas modalidades, a presente invenção provê polipeptídeos de GLA engenheirados adequados para uso em composições farmacêuticas e outras, como suplementos dietéticos/nutricionais.
[00153] Dependendo do modo de administração, essas composições compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma GLA engenheirada de acordo com a invenção estão na forma de um solido, semissólido ou líquido. Em algumas modalidades, as composições incluem outros componentes farmaceuticamente aceitáveis como diluentes, tampões, excipientes, sais, emulsificantes, conservantes, estabilizantes, materiais de preenchimento e outros ingredientes. Detalhes sobre técnicas para formulação e administração são bem conhecidos no campo e descritos na literatura. Em algumas modalidades, essas composições são produzidas diretamente no corpo humano após a introdução como terapia gênica.
[00154] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de GLA
102 / 169 engenheirados são formulados para uso em composições farmacêuticas. Qualquer formato adequado para uso em entregar os polipeptídeos de GLA engenheirados encontram utilidade na presente invenção, incluindo, entre outros, pílulas, comprimidos, comprimentos de gel, cápsula, pastilhas, drágeas, pós, géis moles, sol-géis, géis, emulsões, implantes, adesivos, sprays, pomadas, unguentos, cremes, pastas, gelatinas, tintas, aerossóis, gomas de mascar, emolientes, bastões, soluções, suspensões (incluindo, entre outros, suspensões à base de óleo, emulsões óleo em água etc.), pastas fluidas, xaropes, formulações de liberação controlada, supositórios etc. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de GLA engenheirados são providos em um formato adequado para injeção ou infusão (ou seja, em uma formulação injetável). Em algumas modalidades, as sequências de polinucleotídeos para o polipeptídeo de GLA engenheirado são providas em um formato adequado para injeção. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de GLA engenheirados são providos em matrizes biocompatíveis, como sol-géis, incluindo sol-géis à base de sílica (por exemplo, oxisilano). Em algumas modalidades, os polipeptídeos de GLA engenheirados são encapsulados. Em algumas modalidades alternativas, os polipeptídeos de GLA engenheirados são encapsulados em nanoestruturas (por exemplo, nanotubos, nanotúbulos, nanocápsulas ou microcápsulas, microesferas, lipossomos etc.). De fato, não se pretende que a presente invenção seja limitada a qualquer formulação para entrega e/ou meios de entrega em particular. Pretende-se que os polipeptídeos de GLA engenheirados sejam administrados por qualquer meio adequado conhecido na técnica, incluindo, entre outros, parenteral, oral, topical, transdérmico, intranasal, intraocular, intratecal, através de implantes etc.
[00155] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de GLA engenheirados são modificados quimicamente por glicosilação, reagentes de reticulação química, peguilação (ou seja, modificados com polietilenoglicol [PEG] ou PEG ativado etc.) ou outros compostos (Ver, por exemplo, Ikeda,
103 / 169 Amino Acids 29:283-287 [2005]; Patente US Nos 7 531 341, 7 534 595, 7 560 263 e 7 53 653; Publicação de Pedido de Patente US Nos 2013/0039898, 2012/0177722 etc.). De fato, não se pretende que a presente invenção seja limitada a qualquer método e/ou mecanismo de entrega em particular.
[00156] Em algumas modalidades adicionais, os polipeptídeos de GLA engenheirados são providos para entrega a células ou tecidos por intermédio de terapia gênica, incluindo vetores virais de entrega, incluindo, entre outros, adenovírus (AV), vírus adenoassociado (AAV), lentivírus (LV), ou vetores não virais (por exemplo, lipossomos). Em algumas modalidades, os polipeptídeos de GLA engenheirados são providos para entrega a células ou tecidos por intermédio de terapia com mRNA após formulação de sequências de polirribonucleotídeos em uma entrega encapsulada, como lipossomos. Em algumas modalidades adicionais, os polipeptídeos de GLA engenheirados são providos para entrega a células ou tecidos por intermédio de terapia celular, onde a sequência de polinucleotídeo que codifica os polipeptídeos de GLA engenheirados é introduzida em uma célula exógena e aquela célula (ou células) é introduzida em um receptor (por exemplo, um paciente exibindo ou em risco de desenvolver doença de Fabry).
[00157] Em algumas modalidades adicionais, os polipeptídeos de GLA engenheirados são providos em formulações que compreendem cristais da enzima imobilizados em matriz. Em algumas modalidades, a formulação compreende uma enzima GLA engenheirada reticulada cristalina e um polímero com uma porção reativa que se adere aos cristais da enzima. A presente invenção também provê polipeptídeos de GLA engenheirados em polímeros.
[00158] Em algumas modalidades, as composições que compreendem os polipeptídeos de GLA engenheirados da presente invenção incluem um ou mais compostos comumente usados como transportadores, incluindo, entre outros, açúcares (por exemplo, lactose, sacarose, manitol e/ou sorbitol),
104 / 169 amidos (por exemplo, amido de milho, trigo, arroz, batata ou outra planta), celulose (por exemplo, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose sódica), gomas (por exemplo, arábica, tragacanta, guar etc.) e/ou proteínas (por exemplo, gelatina, colágeno etc.).
[00159] Em algumas modalidades, a presente invenção provê polipeptídeos de GLA engenheirados adequados para uso em diminuir a concentração de glicolipídios em líquidos, tais como sangue, líquido cefalorraquidiano etc. A dose dos polipeptídeo(s) de GLA engenheirado(s) administrado(s) depende da condição ou doença, a condição geral do indivíduo e de outros fatores conhecidos pelos técnicos no assunto. Em algumas modalidades, as composições destinam-se a administrações únicas ou múltiplas. Em algumas modalidades, contempla-se que a concentração do(s) polipeptídeo(s) de GLA engenheirado(s) na(s) composição(ões) administrada(s) a um humano com doença de Fabry seja suficiente para efetivamente tratar e/ou aliviar a doença (por exemplo, doença de Fabry). Em algumas modalidades, os polipeptídeos de GLA engenheirados são administrados em combinação com outras composições farmacêuticas e/ou dietéticas. Experimental
[00160] Os Exemplos a seguir, incluindo experimentos e resultados alcançados, são fornecidos para fins ilustrativos somente e não deverão ser interpretados como limitações à presente invenção.
[00161] Na descrição experimental abaixo, aplicam-se as seguintes abreviações: ppm (partes por milhão); M (molar); mM (milimolar), uM e µM (micromolar); nM (nanomolar); mol (moles); g (grama); mg (miligramas); ug e µg (microgramas); L e l (litro); ml e mL (mililitro); cm (centímetros); mm (milímetros); um e µm (micrômetros); s (segundos); min.(s) (minuto(s)); h(s) (hora(s)); U (unidades); MW (peso molecular); rpm (rotações per minuto); ºC (graus centígrados); CDS (sequência de codificação); DNA (ácido
105 / 169 desoxirribonucleico); RNA (ácido ribonucleico); E. coli W3110 (cepa de E. coli comumente usada em laboratório, disponível no Coli Genetic Stock Center [CGSC], New Haven, CT); HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência); MWCO (corte para peso molecular); SDS-PAGE (eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida); PBS (solução salina com tampão fosfato); DPBS (solução salina com tampão fosfato de Dulbecco); PES (poli-éter sulfona); CFSE (succinimidil éster de carboxifluoresceína); IPTG (isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo); PMBS (sulfato de polimixina B); NADPH (nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato); GIDH (glutamato desidrogenase); FIOPC (incrementos de melhoria em relação ao controle positivo); PBMC (células mononucleares do sangue periférico); LB (caldo de Luria); MeOH (metanol); Athens Research (Athens Research Technology, Athens, GA); ProSpec (ProSpec Tany Technogene, East Brunswick, NJ); Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St.
Louis, MO); Ram Scientific (Ram Scientific, Inc., Yonkers, NY); Pall Corp. (Pall, Corp., Pt.
Washington, NY); Millipore (Millipore, Corp., Billerica MA); Difco (Difco Laboratories, BD Diagnostic Systems, Detroit, MI); Molecular Devices (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA); Kuhner (Adolf Kuhner, AG, Basileia, Suíça); Axygen (Axygen, Inc., Union City, CA); Toronto Research Chemicals (Toronto Research Chemicals Inc., Toronto, Ontário, Canadá); Cambridge Isotope Laboratories, (Cambridge Isotope Laboratories, Inc., Tewksbury, MA); Applied Biosystems (Applied Biosystems, part of Life Technologies, Corp., Grand Island, NY), Agilent (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA); Thermo Scientific (parte da ThermoFisher Scientific, Waltham, MA); Gibco (ThermoFisher Scientific); Pierce (Pierce Biotechnology (atualmente parte da Thermo Fisher Scientific), Rockford, IL); ThermoFisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA); Corning (Corning, Inc., Palo Alto, CA); XenoTech (Sekisui XenoTech, LLC, Kansas City, KS); Coriell Institute for Medical Research (Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ);
106 / 169 VWR (VWR International, Radnor, PA); Jackson (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME); Megazyme (Megazyme International, Wicklow, Irlanda); Enzo (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY); GE Healthcare (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ); LI-COR (LI-COR Biotechnology, Lincoln, NE); Amicus (Amicus Terapeutics, Cranbury, NJ); Phenomenex (Phenomenex, Inc., Torrance, CA); Optimal (Optimal Biotech Group, Belmont, CA); e Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
[00162] As sequências de polinucleotídeos e polipeptídeos a seguir encontram utilidade na presente invenção. Em alguns casos (como mostrados abaixo), a sequência de polinucleotídeo é seguida pelo polipeptídeo codificado.
[00163] Sequência de polinucleotídeo do cDNA completo de GLA humana (SEQ ID NO.1):
[00164] ATGCAGCTGAGGAACCCAGAACTACATCTGGGCTGC
GCGCTTGCGCTTCGCTTCCTGGCCCTCGTTTCCTGGGACATCCCTG GGGCTAGAGCACTGGACAATGGATTGGCAAGGACGCCTACCATGG GCTGGCTGCACTGGGAGCGCTTCATGTGCAACCTTGACTGCCAGG AAGAGCCAGATTCCTGCATCAGTGAGAAGCTCTTCATGGAGATGG CAGAGCTCATGGTCTCAGAAGGCTGGAAGGATGCAGGTTATGAGT ACCTCTGCATTGATGACTGTTGGATGGCTCCCCAAAGAGATTCAGA AGGCAGACTTCAGGCAGACCCTCAGCGCTTTCCTCATGGGATTCGC CAGCTAGCTAATTATGTTCACAGCAAAGGACTGAAGCTAGGGATT TATGCAGATGTTGGAAATAAAACCTGCGCAGGCTTCCCTGGGAGT TTTGGATACTACGACATTGATGCCCAGACCTTTGCTGACTGGGGAG TAGATCTGCTAAAATTTGATGGTTGTTACTGTGACAGTTTGGAAAA TTTGGCAGATGGTTATAAGCACATGTCCTTGGCCCTGAATAGGACT GGCAGAAGCATTGTGTACTCCTGTGAGTGGCCTCTTTATATGTGGC CCTTTCAAAAGCCCAATTATACAGAAATCCGACAGTACTGCAATC ACTGGCGAAATTTTGCTGACATTGATGATTCCTGGAAAAGTATAAA
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GAGTATCTTGGACTGGACATCTTTTAACCAGGAGAGAATTGTTGAT GTTGCTGGACCAGGGGGTTGGAATGACCCAGATATGTTAGTGATT GGCAACTTTGGCCTCAGCTGGAATCAGCAAGTAACTCAGATGGCC CTCTGGGCTATCATGGCTGCTCCTTTATTCATGTCTAATGACCTCCG ACACATCAGCCCTCAAGCCAAAGCTCTCCTTCAGGATAAGGACGT AATTGCCATCAATCAGGACCCCTTGGGCAAGCAAGGGTACCAGCT TAGACAGGGAGACAACTTTGAAGTGTGGGAACGACCTCTCTCAGG CTTAGCCTGGGCTGTAGCTATGATAAACCGGCAGGAGATTGGTGG ACCTCGCTCTTATACCATCGCAGTTGCTTCCCTGGGTAAAGGAGTG GCCTGTAATCCTGCCTGCTTCATCACACAGCTCCTCCCTGTGAAAA GGAAGCTAGGGTTCTATGAATGGACTTCAAGGTTAAGAAGTCACA
TAAATCCCACAGGCACTGTTTTGCTTCAGCTAGAAAATACAATGCA GATGTCATTAAAAGACTTACTTTAG (SEQ ID NO:1) Sequência polipeptídica de GLA humana completa:
[00165] MQLRNPELHLGCALALRFLALVSWDIPGARALDNGLA
RTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKLFMEMAELMVSEGWK DAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFPHGIRQLANYVHSKG LKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFADWGVDLLKFDGCYC DSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPLYMWPFQKPNYTEIRQ YCNHWRNFADIDDSWKSIKSILDWTSFNQERIVDVAGPGGWNDPDM LVIGNFGLSWNQQVTQMALWAIMAAPLFMSNDLRHISPQAKALLQD KDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLSGLAWAVAMINRQEI
GGPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRKLGFYEWTSRLRSHI NPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL (SEQ ID NO:2) Sequência polinucleotídica de GLA humana com códons otimizados para levedura madura (yCDS):
[00166] TTGGATAACGGGTTAGCCCGTACACCTACTATGGGTT
GGCTTCACTGGGAAAGATTCATGTGTAACTTAGATTGCCAAGAAG AGCCTGACAGCTGTATCTCAGAGAAACTATTCATGGAGATGGCTG
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AACTAATGGTAAGTGAAGGATGGAAGGATGCTGGTTATGAATACC TATGTATTGATGATTGCTGGATGGCTCCACAGCGTGATTCAGAAGG TAGGTTACAAGCTGACCCCCAGAGATTCCCACATGGCATACGTCA GCTTGCAAACTACGTACACAGCAAGGGTCTAAAGTTAGGCATCTA CGCTGATGTCGGAAACAAGACATGTGCTGGTTTCCCAGGTTCATTC GGTTACTATGACATAGATGCGCAGACGTTTGCTGATTGGGGTGTTG ATTTGTTGAAGTTTGATGGATGCTACTGCGATTCCCTGGAGAACCT AGCCGATGGGTACAAACACATGAGTTTGGCTCTAAACAGGACTGG TAGGAGCATCGTCTATAGTTGTGAATGGCCCTTGTACATGTGGCCG TTTCAGAAGCCAAACTACACTGAGATAAGACAATACTGTAACCAT TGGCGTAACTTTGCTGACATAGATGATTCATGGAAGTCAATCAAAT CTATCTTGGATTGGACTTCTTTCAACCAGGAAAGAATTGTTGATGT TGCAGGTCCAGGTGGATGGAATGACCCTGATATGCTTGTCATAGG GAACTTTGGGCTATCATGGAATCAACAAGTTACACAAATGGCTTTG TGGGCGATCATGGCCGCACCCCTATTCATGTCTAATGATCTACGTC ACATATCACCCCAAGCAAAGGCTTTACTTCAAGATAAGGATGTCA TAGCGATCAACCAAGATCCTCTTGGTAAACAAGGTTATCAATTGA GACAAGGTGACAACTTTGAAGTGTGGGAAAGACCATTGTCTGGAC TTGCGTGGGCTGTTGCTATGATCAACCGTCAAGAGATCGGAGGGC CAAGATCTTACACTATCGCGGTAGCCTCTTTGGGTAAGGGTGTTGC GTGCAATCCTGCCTGCTTCATTACACAATTGCTTCCAGTTAAGAGA AAGTTGGGTTTCTATGAGTGGACATCTAGGCTAAGAAGTCACATC
AATCCTACTGGTACGGTATTGTTGCAATTGGAGAACACAATGCAA ATGTCTTTGAAAGATTTGTTA (SEQ ID NO:3) Sequência polinucleotídica de GLA humana madura (hCDS nativa):
[00167] CTGGACAATGGATTGGCAAGGACGCCTACCATGGGC
TGGCTGCACTGGGAGCGCTTCATGTGCAACCTTGACTGCCAGGAA GAGCCAGATTCCTGCATCAGTGAGAAGCTCTTCATGGAGATGGCA GAGCTCATGGTCTCAGAAGGCTGGAAGGATGCAGGTTATGAGTAC
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CTCTGCATTGATGACTGTTGGATGGCTCCCCAAAGAGATTCAGAAG GCAGACTTCAGGCAGACCCTCAGCGCTTTCCTCATGGGATTCGCCA GCTAGCTAATTATGTTCACAGCAAAGGACTGAAGCTAGGGATTTA TGCAGATGTTGGAAATAAAACCTGCGCAGGCTTCCCTGGGAGTTTT GGATACTACGACATTGATGCCCAGACCTTTGCTGACTGGGGAGTA GATCTGCTAAAATTTGATGGTTGTTACTGTGACAGTTTGGAAAATT TGGCAGATGGTTATAAGCACATGTCCTTGGCCCTGAATAGGACTG GCAGAAGCATTGTGTACTCCTGTGAGTGGCCTCTTTATATGTGGCC CTTTCAAAAGCCCAATTATACAGAAATCCGACAGTACTGCAATCA CTGGCGAAATTTTGCTGACATTGATGATTCCTGGAAAAGTATAAAG AGTATCTTGGACTGGACATCTTTTAACCAGGAGAGAATTGTTGATG TTGCTGGACCAGGGGGTTGGAATGACCCAGATATGTTAGTGATTG GCAACTTTGGCCTCAGCTGGAATCAGCAAGTAACTCAGATGGCCC TCTGGGCTATCATGGCTGCTCCTTTATTCATGTCTAATGACCTCCGA CACATCAGCCCTCAAGCCAAAGCTCTCCTTCAGGATAAGGACGTA ATTGCCATCAATCAGGACCCCTTGGGCAAGCAAGGGTACCAGCTT AGACAGGGAGACAACTTTGAAGTGTGGGAACGACCTCTCTCAGGC TTAGCCTGGGCTGTAGCTATGATAAACCGGCAGGAGATTGGTGGA CCTCGCTCTTATACCATCGCAGTTGCTTCCCTGGGTAAAGGAGTGG CCTGTAATCCTGCCTGCTTCATCACACAGCTCCTCCCTGTGAAAAG GAAGCTAGGGTTCTATGAATGGACTTCAAGGTTAAGAAGTCACAT
AAATCCCACAGGCACTGTTTTGCTTCAGCTAGAAAATACAATGCA GATGTCATTAAAAGACTTACTT (SEQ ID NO:4) Sequência polipeptídica de GLA humana madura:
[00168] LDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKL
FMEMAELMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRF PHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFA DWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPL YMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWKSIKSILDWTSFNQERI
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VDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWNQQVTQMALWAIMAAPLFMSN DLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLS
GLAWAVAMINRQEIGGPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKR KLGFYEWTSRLRSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL (SEQ ID NO:5) Sequência polinucleotídica do vetor de expressão pCK110900i E. coli:
[00169] TCGAGTTAATTAAGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAA
TGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATG CTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTC ACACAGGAAACGGCTATGACCATGATTACGGATTCACTGGCCGTC GTTTTACAATCTAGAGGCCAGCCTGGCCATAAGGAGATATACATA TGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTCTGCGGCA TTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAA AAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAAC TGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAG AGCGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGC GGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCG CATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACA GAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGT GCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGA CAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGTTTTTTTGCACACCA TGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGA ATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTACAG CAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTA CTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATA AAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTT TATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATC ATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTA TCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGTAATAGAC AGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGGGCCAAA
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CTGGCCACCATCACCATCACCATTAGGGAAGAGCAGATGGGCAAG CTTGACCTGTGAAGTGAAAAATGGCGCACATTGTGCGACATTTTTT TTTGAATTCTACGTAAAAAGCCGCCGATACATCGGCTGCTTTTTTT TTGATAGAGGTTCAAACTTGTGGTATAATGAAATAAGATCACTCCG GGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCT AAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCC CAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTC AATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTT AAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTAT TCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAGTTCCGTATG GCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCT TGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCT GGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTC GCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAA GGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGA GTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTT CGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAA GGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTCTGTGAT GGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCG ATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAACTGCAGGAGCTCAAACAGCAG CCTGTATTCAGGCTGCTTTTTTCGTTTTGGTCTGCGCGTAATCTCTT GCTCTGAAAACGAAAAAACCGCCTTGCAGGGCGGTTTTTCGAAGG TTCTCTGAGCTACCAACTCTTTGAACCGAGGTAACTGGCTTGGAGG AGCGCAGTCACCAAAACTTGTCCTTTCAGTTTAGCCTTAACCGGCG CATGACTTCAAGACTAACTCCTCTAAATCAATTACCAGTGGCTGCT GCCAGTGGTGCTTTTGCATGTCTTTCCGGGTTGGACTCAAGACGAT AGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGACTGAACGGGGGGTTCGT GCATACAGTCCAGCTTGGAGCGAACTGCCTACCCGGAACTGAGTG TCAGGCGTGGAATGAGACAAACGCGGCCATAACAGCGGAATGAC
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ACCGGTAAACCGAAAGGCAGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGC CGCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCG CCACCACTGATTTGAGCGTCAGATTTCGTGATGCTTGTCAGGGGGG CGGAGCCTATGGAAAAACGGCTTTGCCGCGGCCCTCTCACTTCCCT GTTAAGTATCTTCCTGGCATCTTCCAGGAAATCTCCGCCCCGTTCG TAAGCCATTTCCGCTCGCCGCAGTCGAACGACCGAGCGTAGCGAG TCAGTGAGCGAGGAAGCGGAATATATCCTGTATCACATATTCTGCT GACGCACCGGTGCAGCCTTTTTTCTCCTGCCACATGAAGCACTTCA CTGACACCCTCATCAGTGAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTT AGGCCTATGGCCTTTTTTTTTTGTGGGAAACCTTTCGCGGTATGGTA TTAAAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAATGTGAAA CCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATC AGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGA AAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTAC ATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTG CTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGC AAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCA GCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTA AAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGA TCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGC TGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAG ACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGAC TGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGC TGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGC TGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCG GAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACC ATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTTCCACTGCGATGCTGGTTG CCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGT CCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGACATCTCGGTAGTGGGATACGACG
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ATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAA ACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCT GCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTTAAGGGCAATCAGCTGTTGCC CGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCA AACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCA
CGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGGTACCCGAT AAAAGCGGCTTCCTGACAGGAGGCCGTTTTGTTTC (SEQ ID NO:6) Sequência polinucleotídica do vetor de expressão pYT-72Bgl secretado de levedura:
[00170] TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTGTACAAATATCATAAAAAAAGAGAATCTTTTTAAGC AAGGATTTTCTTAACTTCTTCGGCGACAGCATCACCGACTTCGGTG GTACTGTTGGAACCACCTAAATCACCAGTTCTGATACCTGCATCCA AAACCTTTTTAACTGCATCTTCAATGGCTTTACCTTCTTCAGGCAA GTTCAATGACAATTTCAACATCATTGCAGCAGACAAGATAGTGGC GATAGGGTTGACCTTATTCTTTGGCAAATCTGGAGCGGAACCATGG CATGGTTCGTACAAACCAAATGCGGTGTTCTTGTCTGGCAAAGAG GCCAAGGACGCAGATGGCAACAAACCCAAGGAGCCTGGGATAAC GGAGGCTTCATCGGAGATGATATCACCAAACATGTTGCTGGTGATT ATAATACCATTTAGGTGGGTTGGGTTCTTAACTAGGATCATGGCGG CAGAATCAATCAATTGATGTTGAACTTTCAATGTAGGGAATTCGTT CTTGATGGTTTCCTCCACAGTTTTTCTCCATAATCTTGAAGAGGCC AAAACATTAGCTTTATCCAAGGACCAAATAGGCAATGGTGGCTCA TGTTGTAGGGCCATGAAAGCGGCCATTCTTGTGATTCTTTGCACTT CTGGAACGGTGTATTGTTCACTATCCCAAGCGACACCATCACCATC GTCTTCCTTTCTCTTACCAAAGTAAATACCTCCCACTAATTCTCTAA CAACAACGAAGTCAGTACCTTTAGCAAATTGTGGCTTGATTGGAG ATAAGTCTAAAAGAGAGTCGGATGCAAAGTTACATGGTCTTAAGT TGGCGTACAATTGAAGTTCTTTACGGATTTTTAGTAAACCTTGTTC
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AGGTCTAACACTACCGGTACCCCATTTAGGACCACCCACAGCACCT AACAAAACGGCATCAGCCTTTTTGGAGGCTTCCAGCGCCTCATTTG GAAGTGGAACACCTGTAGCATCGATAGCAGCCCCCCCAATTAAAT GATTTTCGAAATCGAACTTGACATTGGAACGAACATCAGAAATAG CTTTAAGAACCTTAATGGCTTCGGCTGTGATTTCTTGACCAACGTG GTCACCTGGCAAAACGACGATTTTTTTAGGGGCAGACATTACAAT GGTATATCCTTGAAATATATATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAATGCAGCTTCTCAATGATATTCGAATACGCTTTGAGGA GATACAGCCTAATATCCGACAAACTGTTTTACAGATTTACGATCGT ACTTGTTACCCATCATTGAATTTTGAACATCCGAACCTGGGAGTTT TCCCTGAAACAGATAGTATATTTGAACCTGTATAATAATATATAGT CTAGCGCTTTACGGAAGACAATGTATGTATTTCGGTTCCTGGAGAA ACTATTGCATCTATTGCATAGGTAATCTTGCACGTCGCATCCCCGG TTCATTTTCTGCGTTTCCATCTTGCACTTCAATAGCATATCTTTGTT AACGAAGCATCTGTGCTTCATTTTGTAGAACAAAAATGCAACGCG AGAGCGCTAATTTTTCAAACAAAGAATCTGAGCTGCATTTTTACAG AACAGAAATGCAACGCGAAAGCGCTATTTTACCAACGAAGAATCT GTGCTTCATTTTTGTAAAACAAAAATGCAACGCGAGAGCGCTAATT TTTCAAACAAAGAATCTGAGCTGCATTTTTACAGAACAGAAATGC AACGCGAGAGCGCTATTTTACCAACAAAGAATCTATACTTCTTTTT TGTTCTACAAAAATGCATCCCGAGAGCGCTATTTTTCTAACAAAGC ATCTTAGATTACTTTTTTTCTCCTTTGTGCGCTCTATAATGCAGTCT CTTGATAACTTTTTGCACTGTAGGTCCGTTAAGGTTAGAAGAAGGC TACTTTGGTGTCTATTTTCTCTTCCATAAAAAAAGCCTGACTCCACT TCCCGCGTTTACTGATTACTAGCGAAGCTGCGGGTGCATTTTTTCA AGATAAAGGCATCCCCGATTATATTCTATACCGATGTGGATTGCGC ATACTTTGTGAACAGAAAGTGATAGCGTTGATGATTCTTCATTGGT CAGAAAATTATGAACGGTTTCTTCTATTTTGTCTCTATATACTACGT ATAGGAAATGTTTACATTTTCGTATTGTTTTCGATTCACTCTATGAA
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TAGTTCTTACTACAATTTTTTTGTCTAAAGAGTAATACTAGAGATA AACATAAAAAATGTAGAGGTCGAGTTTAGATGCAAGTTCAAGGAG CGAAAGGTGGATGGGTAGGTTATATAGGGATATAGCACAGAGATA TATAGCAAAGAGATACTTTTGAGCAATGTTTGTGGAAGCGGTATTC GCAATATTTTAGTAGCTCGTTACAGTCCGGTGCGTTTTTGGTTTTTT GAAAGTGCGTCTTCAGAGCGCTTTTGGTTTTCAAAAGCGCTCTGAA GTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCA AAGCGTTTCCGAAAACGAGCGCTTCCGAAAATGCAACGCGAGCTG CGCACATACAGCTCACTGTTCACGTCGCACCTATATCTGCGTGTTG CCTGTATATATATATACATGAGAAGAACGGCATAGTGCGTGTTTAT GCTTAAATGCGTACTTATATGCGTCTATTTATGTAGGATGAAAGGT AGTCTAGTACCTCCTGTGATATTATCCCATTCCATGCGGGGTATCG TATGCTTCCTTCAGCACTACCCTTTAGCTGTTCTATATGCTGCCACT CCTCAATTGGATTAGTCTCATCCTTCAATGCTATCATTTCCTTTGAT ATTGGATCATATGCATAGTACCGAGAAACTAGTGCGAAGTAGTGA TCAGGTATTGCTGTTATCTGATGAGTATACGTTGTCCTGGCCACGG CAGAAGCACGCTTATCGCTCCAATTTCCCACAACATTAGTCAACTC CGTTAGGCCCTTCATTGAAAGAAATGAGGTCATCAAATGTCTTCCA ATGTGAGATTTTGGGCCATTTTTTATAGCAAAGATTGAATAAGGCG CATTTTTCTTCAAAGCTTTATTGTACGATCTGACTAAGTTATCTTTT AATAATTGGTATTCCTGTTTATTGCTTGAAGAATTGCCGGTCCTATT TACTCGTTTTAGGACTGGTTCAGAATTCCTCAAAAATTCATCCAAA TATACAAGTGGATCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTCTTG AAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTC ATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAA ATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAAT ATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAAT ATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCT TATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAG
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AAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCAC GAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTG AGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAA AGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAA GAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTG AGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAG TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTG CGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAA CCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCG TTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGA CACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATT AACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGAC TGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCC CTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGC GTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGC CCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTAT GGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGAT TAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAG ATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGA TCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCG TTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTT GAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAA ACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCA ACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAA ATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAA CTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCA GTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACT CAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGG GGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCG
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AACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTC CCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTC GGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTG GTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTC GATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACG CCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTT GCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCG TATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACG ACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCT GATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGC ATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAA GCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCG CCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGT CTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGA GCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGA GGCAGCTGCGGTAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGAAGCGATTCAC AGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGTCCAGCTCGTTGAGTTTCTCCAG AAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAAGCGGGCCATGTTAAGGGC GGTTTTTTCCTGTTTGGTCACTGATGCCTCCGTGTAAGGGGGATTTC TGTTCATGGGGGTAATGATACCGATGAAACGAGAGAGGATGCTCA CGATACGGGTTACTGATGATGAACATGCCCGGTTACTGGAACGTT GTGAGGGTAAACAACTGGCGGTATGGATGCGGCGGGACCAGAGA AAAATCACTCAGGGTCAATGCCAGCGCTTCGTTAATACAGATGTA GGTGTTCCACAGGGTAGCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGATCCGG AACATAATGGTGCAGGGCGCTGACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACG AAACACGGAAACCGAAGACCATTCATGTTGTTGCTCAGGTCGCAG ACGTTTTGCAGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCGGTGA TTCATTCTGCTAACCAGTAAGGCAACCCCGCCAGCCTAGCCGGGTC CTCAACGACAGGAGCACGATCATGCGCACCCGTGGCCAGGACCCA
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ACGCTGCCCGAGATGCGCCGCGTGCGGCTGCTGGAGATGGCGGAC GCGATGGATATGTTCTGCCAAGGGTTGGTTTGCGCATTCACAGTTC TCCGCAAGAATTGATTGGCTCCAATTCTTGGAGTGGTGAATCCGTT AGCGAGGTGCCGCCGGCTTCCATTCAGGTCGAGGTGGCCCGGCTC CATGCACCGCGACGCAACGCGGGGAGGCAGACAAGGTATAGGGC GGCGCCTACAATCCATGCCAACCCGTTCCATGTGCTCGCCGAGGCG GCATAAATCGCCGTGACGATCAGCGGTCCAATGATCGAAGTTAGG CTGGTAAGAGCCGCGAGCGATCCTTGAAGCTGTCCCTGATGGTCGT CATCTACCTGCCTGGACAGCATGGCCTGCAACGCGGGCATCCCGA TGCCGCCGGAAGCGAGAAGAATCATAATGGGGAAGGCCATCCAGC CTCGCGTCGCGAACGCCAGCAAGACGTAGCCCAGCGCGTCGGCCG CCATGCCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGC GGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGAA TACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCG GTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTAC GAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGATAGT CATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCT CAAGGGCATCGGTCGAGGATCTGGGCAAAACGTAGGGGCAAACA AACGGAAAAATCGTTTCTCAAATTTTCTGATGCCAAGAACTCTAAC CAGTCTTATCTAAAAATTGCCTTATGATCCGTCTCTCCGGTTACAG CCTGTGTAACTGATTAATCCTGCCTTTCTAATCACCATTCTAATGTT TTAATTAAGGGATTTTGTCTTCATTAACGGCTTTCGCTCATAAAAA TGTTATGACGTTTTGCCCGCAGGCGGGAAACCATCCACTTCACGAG ACTGATCTCCTCTGCCGGAACACCGGGCATCTCCAACTTATAAGTT GGAGAAATAAGAGAATTTCAGATTGAGAGAATGAAAAAAAAAAA AAAAAAAAGGCAGAGGAGAGCATAGAAATGGGGTTCACTTTTTGG TAAAGCTATAGCATGCCTATCACATATAAATAGAGTGCCAGTAGC GACTTTTTTCACACTCGAAATACTCTTACTACTGCTCTCTTGTTGTT TTTATCACTTCTTGTTTCTTCTTGGTAAATAGAATATCAAGCTACAA
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AAAGCATACAATCAACTATCAACTATTAACTATATCGTAATACACA GGATCCACCATGAAGGCTGCTGCGCTTTCCTGCCTCTTCGGCAGTA CCCTTGCCGTTGCAGGCGCCATTGAATCGAGAAAGGTTCACCAGA AGCCCCTCGCGAGATCTGAACCTTTTTACCCGTCGCCATGGATGAA TCCCAACGCCATCGGCTGGGCGGAGGCCTATGCCCAGGCCAAGTC CTTTGTCTCCCAAATGACTCTGCTAGAGAAGGTCAACTTGACCACG GGAGTCGGCTGGGGGGAGGAGCAGTGCGTCGGCAACGTGGGCGC GATCCCTCGCCTTGGACTTCGCAGTCTGTGCATGCATGACTCCCCT CTCGGCGTGCGAGGAACCGACTACAACTCAGCGTTCCCCTCTGGCC AGACCGTTGCTGCTACCTGGGATCGCGGTCTGATGTACCGTCGCGG CTACGCAATGGGCCAGGAGGCCAAAGGCAAGGGCATCAATGTCCT TCTCGGACCAGTCGCCGGCCCCCTTGGCCGCATGCCCGAGGGCGG TCGTAACTGGGAAGGCTTCGCTCCGGATCCCGTCCTTACCGGCATC GGCATGTCCGAGACGATCAAGGGCATTCAGGATGCTGGCGTCATC GCTTGTGCGAAGCACTTTATTGGAAACGAGCAGGAGCACTTCAGA CAGGTGCCAGAAGCCCAGGGATACGGTTACAACATCAGCGAAACC CTCTCCTCCAACATTGACGACAAGACCATGCACGAGCTCTACCTTT GGCCGTTTGCCGATGCCGTCCGGGCCGGCGTCGGCTCTGTCATGTG CTCGTACAACCAGGGCAACAACTCGTACGCCTGCCAGAACTCGAA GCTGCTGAACGACCTCCTCAAGAACGAGCTTGGGTTTCAGGGCTTC GTCATGAGCGACTGGTGGGCACAGCACACTGGCGCAGCAAGCGCC GTGGCTGGTCTCGATATGTCCATGCCGGGCGACACCATGGTCAAC ACTGGCGTCAGTTTCTGGGGCGCCAATCTCACCCTCGCCGTCCTCA ACGGCACAGTCCCTGCCTACCGTCTCGACGACATGTGCATGCGCAT CATGGCCGCCCTCTTCAAGGTCACCAAGACCACCGACCTGGAACC GATCAACTTCTCCTTCTGGACCCGCGACACTTATGGCCCGATCCAC TGGGCCGCCAAGCAGGGCTACCAGGAGATTAATTCCCACGTTGAC GTCCGCGCCGACCACGGCAACCTCATCCGGAACATTGCCGCCAAG GGTACGGTGCTGCTGAAGAATACCGGCTCTCTACCCCTGAACAAG
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CCAAAGTTCGTGGCCGTCATCGGCGAGGATGCTGGGCCGAGCCCC AACGGGCCCAACGGCTGCAGCGACCGCGGCTGTAACGAAGGCACG CTCGCCATGGGCTGGGGATCCGGCACAGCCAACTATCCGTACCTC GTTTCCCCCGACGCCGCGCTCCAGGCGCGGGCCATCCAGGACGGC ACGAGGTACGAGAGCGTCCTGTCCAACTACGCCGAGGAAAATACA AAGGCTCTGGTCTCGCAGGCCAATGCAACCGCCATCGTCTTCGTCA ATGCCGACTCAGGCGAGGGCTACATCAACGTGGACGGTAACGAGG GCGACCGTAAGAACCTGACTCTCTGGAACAACGGTGATACTCTGG TCAAGAACGTCTCGAGCTGGTGCAGCAACACCATCGTCGTCATCC ACTCGGTCGGCCCGGTCCTCCTGACCGATTGGTACGACAACCCCAA CATCACGGCCATTCTCTGGGCTGGTCTTCCGGGCCAGGAGTCGGGC AACTCCATCACCGACGTGCTTTACGGCAAGGTCAACCCCGCCGCCC GCTCGCCCTTCACTTGGGGCAAGACCCGCGAAAGCTATGGCGCGG ACGTCCTGTACAAGCCGAATAATGGCAATTGGGCGCCCCAACAGG ACTTCACCGAGGGCGTCTTCATCGACTACCGCTACTTCGACAAGGT TGACGATGACTCGGTCATCTACGAGTTCGGCCACGGCCTGAGCTAC ACCACCTTCGAGTACAGCAACATCCGCGTCGTCAAGTCCAACGTC AGCGAGTACCGGCCCACGACGGGCACCACGATTCAGGCCCCGACG TTTGGCAACTTCTCCACCGACCTCGAGGACTATCTCTTCCCCAAGG ACGAGTTCCCCTACATCCCGCAGTACATCTACCCGTACCTCAACAC GACCGACCCCCGGAGGGCCTCGGGCGATCCCCACTACGGCCAGAC CGCCGAGGAGTTCCTCCCGCCCCACGCCACCGATGACGACCCCCA GCCGCTCCTCCGGTCCTCGGGCGGAAACTCCCCCGGCGGCAACCG CCAGCTGTACGACATTGTCTACACAATCACGGCCGACATCACGAA TACGGGCTCCGTTGTAGGCGAGGAGGTACCGCAGCTCTACGTCTC GCTGGGCGGTCCCGAGGATCCCAAGGTGCAGCTGCGCGACTTTGA CAGGATGCGGATCGAACCCGGCGAGACGAGGCAGTTCACCGGCCG CCTGACGCGCAGAGATCTGAGCAACTGGGACGTCACGGTGCAGGA CTGGGTCATCAGCAGGTATCCCAAGACGGCATATGTTGGGAGGAG
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CAGCCGGAAGTTGGATCTCAAGATTGAGCTTCCTTGATAAGTCGAC CTCGACTTTGTTCCCACTGTACTTTTAGCTCGTACAAAATACAATA TACTTTTCATTTCTCCGTAAACAACATGTTTTCCCATGTAATATCCT TTTCTATTTTTCGTTCCGTTACCAACTTTACACATACTTTATATAGC TATTCACTTCTATACACTAAAAAACTAAGACAATTTTAATTTTGCT GCCTGCCATATTTCAATTTGTTATAAATTCCTATAATTTATCCTATT AGTAGCTAAAAAAAGATGAATGTGAATCGAATCCTAAGAGAATTG GATCTGATCCACAGGACGGGTGTGGTCGCCATGATCGCGTAGTCG ATAGTGGCTCCAAGTAGCGAAGCGAGCAGGACTGGGCGGCGGCCA AAGCGGTCGGACAGTGCTCCGAGAACGGGTGCGCATAGAAATTGC ATCAACGCATATAGCGCTAGCAGCACGCCATAGTGACTGGCGATG CTGTCGGAATGGACGATATCCCGCAAGAGGCCCGGCAGTACCGGC ATAACCAAGCCTATGCCTACAGCATCCAGGGTGACGGTGCCGAGG ATGACGATGAGCGCATTGTTAGATTTCATACACGGTGCCTGACTGC GTTAGCAATTTAACTGTGATAAACTACCGCATTAAAGCTTTTTCTTT CCAATTTTTTTTTTTTCGTCATTATAAAAATCATTACGACCGAGATT CCCGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAAGCTCTAATTTGTGAG TTTAGTATACATGCATTTACTTATAATACAGTTTTTTAGTTTTGCTG GCCGCATCTTCTCAAATATGCTTCCCAGCCTGCTTTTCTGTAACGTT CACCCTCTACCTTAGCATCCCTTCCCTTTGCAAATAGTCCTCTTCCA ACAATAATAATGTCAGATCCTGTAGAGACCACATCATCCACGGTTC TATACTGTTGACCCAATGCGTCTCCCTTGTCATCTAAACCCACACC GGGTGTCATAATCAACCAATCGTAACCTTCATCTCTTCCACCCATG TCTCTTTGAGCAATAAAGCCGATAACAAAATCTTTGTCGCTCTTCG CAATGTCAACAGTACCCTTAGTATATTCTCCAGTAGATAGGGAGCC CTTGCATGACAATTCTGCTAACATCAAAAGGCCTCTAGGTTCCTTT GTTACTTCTTCTGCCGCCTGCTTCAAACCGCTAACAATACCTGGGC CCACCACACCGTGTGCATTCGTAATGTCTGCCCATTCTGCTATTCT GTATACACCCGCAGAGTACTGCAATTTGACTGTATTACCAATGTCA
122 / 169
GCAAATTTTCTGTCTTCGAAGAGTAAAAAATTGTACTTGGCGGATA ATGCCTTTAGCGGCTTAACTGTGCCCTCCATGGAAAAATCAGTCAA GATATCCACATGTGTTTTTAGTAAACAAATTTTGGGACCTAATGCT TCAACTAACTCCAGTAATTCCTTGGTGGTACGAACATCCAATGAAG CACACAAGTTTGTTTGCTTTTCGTGCATGATATTAAATAGCTTGGC AGCAACAGGACTAGGATGAGTAGCAGCACGTTCCTTATATGTAGC TTTCGACATGATTTATCTTCGTTTCCTGCAGGTTTTTGTTCTGTGCA GTTGGGTTAAGAATACTGGGCAATTTCATGTTTCTTCAACACTACA TATGCGTATATATACCAATCTAAGTCTGTGCTCCTTCCTTCGTTCTT CCTTCTGTTCGGAGATTACCGAATCAAAAAAATTTCAAGGAAACC GAAATCAAAAAAAAGAATAAAAAAAAAATGATGAATTGAAAAGC TTATCGATCCTACCCCTTGCGCTAAAGAAGTATATGTGCCTACTAA CGCTTGTCTTTGTCTCTGTCACTAAACACTGGATTATTACTCCCAGA TACTTATTTTGGACTAATTTAAATGATTTCGGATCAACGTTCTTAAT ATCGCTGAATCTTCCACAATTGATGAAAGTAGCTAGGAAGAGGAA TTGGTATAAAGTTTTTGTTTTTGTAAATCTCGAAGTATACTCAAAC GAATTTAGTATTTTCTCAGTGATCTCCCAGATGCTTTCACCCTCACT TAGAAGTGCTTTAAGCATTTTTTTACTGTGGCTATTTCCCTTATCTG CTTCTTCCGATGATTCGAACTGTAATTGCAAACTACTTACAATATC AGTGATATCAGATTGATGTTTTTGTCCATAGTAAGGAATAATTGTA AATTCCCAAGCAGGAATCAATTTCTTTAATGAGGCTTCCAGAATTG TTGCTTTTTGCGTCTTGTATTTAAACTGGAGTGATTTATTGACAATA TCGAAACTCAGCGAATTGCTTATGATAGTATTATAGCTCATGAATG TGGCTCTCTTGATTGCTGTTCCGTTATGTGTAATCATCCAACATAA ATAGGTTAGTTCAGCAGCACATAATGCTATTTTCTCACCTGAAGGT CTTTCAAACCTTTCCACAAACTGACGAACAAGCACCTTAGGTGGTG TTTTACATAATATATCAAATTGTGGCATGCTTAGCGCCGATCTTGT GTGCAATTGATATCTAGTTTCAACTACTCTATTTATCTTGTATCTTG CAGTATTCAAACACGCTAACTCGAAAAACTAACTTTAATTGTCCTG
123 / 169
TTTGTCTCGCGTTCTTTCGAAAAATGCACCGGCCGCGCATTATTTG TACTGCGAAAATAATTGGTACTGCGGTATCTTCATTTCATATTTTA AAAATGCACCTTTGCTGCTTTTCCTTAATTTTTAGACGGCCCGCAG GTTCGTTTTGCGGTACTATCTTGTGATAAAAAGTTGTTTTGACATGT GATCTGCACAGATTTTATAATGTAATAAGCAAGAATACATTATCAA ACGAACAATACTGGTAAAAGAAAACCAAAATGGACGACATTGAA ACAGCCAAGAATCTGACGGTAAAAGCACGTACAGCTTATAGCGTC TGGGATGTATGTCGGCTGTTTATTGAAATGATTGCTCCTGATGTAG ATATTGATATAGAGAGTAAACGTAAGTCTGATGAGCTACTCTTTCC AGGATATGTCATAAGGCCCATGGAATCTCTCACAACCGGTAGGCC GTATGGTCTTGATTCTAGCGCAGAAGATTCCAGCGTATCTTCTGAC TCCAGTGCTGAGGTAATTTTGCCTGCTGCGAAGATGGTTAAGGAA AGGTTTGATTCGATTGGAAATGGTATGCTCTCTTCACAAGAAGCAA GTCAGGCTGCCATAGATTTGATGCTACAGAATAACAAGCTGTTAG ACAATAGAAAGCAACTATACAAATCTATTGCTATAATAATAGGAA GATTGCCCGAGAAAGACAAGAAGAGAGCTACCGAAATGCTCATGA GAAAAATGGATTGTACACAGTTATTAGTCCCACCAGCTCCAACGG AAGAAGATGTTATGAAGCTCGTAAGCGTCGTTACCCAATTGCTTAC TTTAGTTCCACCAGATCGTCAAGCTGCTTTAATAGGTGATTTATTC ATCCCGGAATCTCTAAAGGATATATTCAATAGTTTCAATGAACTGG CGGCAGAGAATCGTTTACAGCAAAAAAAGAGTGAGTTGGAAGGA AGGACTGAAGTGAACCATGCTAATACAAATGAAGAAGTTCCCTCC AGGCGAACAAGAAGTAGAGACACAAATGCAAGAGGAGCATATAA ATTACAAAACACCATCACTGAGGGCCCTAAAGCGGTTCCCACGAA AAAAAGGAGAGTAGCAACGAGGGTAAGGGGCAGAAAATCACGTA ATACTTCTAGGGTATGATCCAATATCAAAGGAAATGATAGCATTG AAGGATGAGACTAATCCAATTGAGGAGTGGCAGCATATAGAACAG CTAAAGGGTAGTGCTGAAGGAAGCATACGATACCCCGCATGGAAT GGGATAATATCACAGGAGGTACTAGACTACCTTTCATCCTACATAA
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ATAGACGCATATAAGTACGCATTTAAGCATAAACACGCACTATGC CGTTCTTCTCATGTATATATATATACAGGCAACACGCAGATATAGG TGCGACGTGAACAGTGAGCTGTATGTGCGCAGCTCGCGTTGCATTT TCGGAAGCGCTCGTTTTCGGAAACGCTTTGAAGTTCCTATTCCGAA GTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCAGAGCGCTTTTGAAA ACCAAAAGCGCTCTGAAGACGCACTTTCAAAAAACCAAAAACGCA CCGGACTGTAACGAGCTACTAAAATATTGCGAATACCGCTTCCAC AAACATTGCTCAAAAGTATCTCTTTGCTATATATCTCTGTGCTATAT CCCTATATAACCTACCCATCCACCTTTCGCTCCTTGAACTTGCATCT AAACTCGACCTCTACATCAACAGGCTTCCAATGCTCTTCAAATTTT ACTGTCAAGTAGACCCATACGGCTGTAATATGCTGCTCTTCATAAT GTAAGCTTATCTTTATCGAATCGTGTGAAAAACTACTACCGCGATA AACCTTTACGGTTCCCTGAGATTGAATTAGTTCCTTTAGTATATGAT ACAAGACACTTTTGAACTTTGTACGACGAATTTTGAGGTTCGCCAT CCTCTGGCTATTTCCAATTATCCTGTCGGCTATTATCTCCGCCTCAG TTTGATCTTCCGCTTCAGACTGCCATTTTTCACATAATGAATCTATT TCACCCCACAATCCTTCATCCGCCTCCGCATCTTGTTCCGTTAAACT ATTGACTTCATGTTGTACATTGTTTAGTTCACGAGAAGGGTCCTCTT CAGGCGGTAGCTCCTGATCTCCTATATGACCTTTATCCTGTTCTCTT TCCACAAACTTAGAAATGTATTCATGAATTATGGAGCACCTAATAA CATTCTTCAAGGCGGAGAAGTTTGGGCCAGATGCCCAATATGCTTG ACATGAAAACGTGAGAATGAATTTAGTATTATTGTGATATTCTGAG GCAATTTTATTATAATCTCGAAGATAAGAGAAGAATGCAGTGACC TTTGTATTGACAAATGGAGATTCCATGTATCTAAAAAATACGCCTT TAGGCCTTCTGATACCCTTTCCCCTGCGGTTTAGCGTGCCTTTTACA TTAATATCTAAACCCTCTCCGATGGTGGCCTTTAACTGACTAATAA ATGCAACCGATATAAACTGTGATAATTCTGGGTGATTTATGATTCG ATCGACAATTGTATTGTACACTAGTGCAGGATCAGGCCAATCCAGT TCTTTTTCAATTACCGGTGTGTCGTCTGTATTCAGTACATGTCCAAC
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AAATGCAAATGCTAACGTTTTGTATTTCTTATAATTGTCAGGAACT GGAAAAGTCCCCCTTGTCGTCTCGATTACACACCTACTTTCATCGT ACACCATAGGTTGGAAGTGCTGCATAATACATTGCTTAATACAAG CAAGCAGTCTCTCGCCATTCATATTTCAGTTATTTTCCATTACAGCT GATGTCATTGTATATCAGCGCTGTAAAAATCTATCTGTTACAGAAG GTTTTCGCGGTTTTTATAAACAAAACTTTCGTTACGAAATCGAGCA ATCACCCCAGCTGCGTATTTGGAAATTCGGGAAAAAGTAGAGCAA CGCGAGTTGCATTTTTTACACCATAATGCATGATTAACTTCGAGAA GGGATTAAGGCTAATTTCACTAGTATGTTTCAAAAACCTCAATCTG TCCATTGAATGCCTTATAAAACAGCTATAGATTGCATAGAAGAGTT AGCTACTCAATGCTTTTTGTCAAAGCTTACTGATGATGATGTGTCT ACTTTCAGGCGGGTCTGTAGTAAGGAGAATGACATTATAAAGCTG GCACTTAGAATTCCACGGACTATAGACTATACTAGTATACTCCGTC TACTGTACGATACACTTCCGCTCAGGTCCTTGTCCTTTAACGAGGC CTTACCACTCTTTTGTTACTCTATTGATCCAGCTCAGCAAAGGCAG TGTGATCTAAGATTCTATCTTCGCGATGTAGTAAAACTAGCTAGAC
CGAGAAAGAGACTAGAAATGCAAAAGGCACTTCTACAATGGCTGC CATCATTATTATCCGATGTGACGCTGCA (SEQ ID NO:7) Sequência polinucleotídica de yCDS da variante no 73:
[00171] TTGGATAACGGGTTAGCCCGTACACCTACTATGGGTT
GGCTTCACTGGGAAAGATTCATGTGTAACTTAGATTGCCAAGAAG AGCCTGACAGCTGTATCTCAGAGAAACTATTCATGGAGATGGCTG AACTAATGGTAAGTGAAGGATGGAAGGATGCTGGTTATGAATACC TATGTATTGATGATTGCTGGATGGCTCCACAGCGTGATTCAGAAGG TAGGTTACAAGCTGACCCCCAGAGATTCCCACATGGCATACGTCA GCTTGCAAACTACGTACACAGCAAGGGTCTAAAGTTAGGCATCTA CGCTGATGTCGGAAACAAGACATGTGCTGGTTTCCCAGGTTCATTC GGTTACTATGACATAGATGCGCAGACGTTTGCTGATTGGGGTGTTG ATTTGTTGAAGTTTGATGGATGCTACTGCGATTCCCTGGAGAACCT
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AGCCGATGGGTACAAACACATGAGTTTGGCTCTAAACAGGACTGG TAGGAGCATCGTCTATAGTTGTGAATGGCCCTTGTACATGTGGCCG TTTCAGAAGCCAAACTACACTGAGATAAGACAATACTGTAACCAT TGGCGTAACTTTGCTGACATAGATGATTCATGGGCTTCAATCAAAT CTATCTTGGATTGGACTTCTTTCAACCAGGAAAGAATTGTTGATGT TGCAGGTCCAGGTGGATGGAATGACCCTGATATGCTTGTCATAGG GAACTTTGGGCTATCATGGAATCAACAAGTTACACAAATGGCTTTG TGGGCGATCATGGCCGCACCCCTATTCATGTCTAATGATCTACGTC ACATATCACCCCAAGCAAAGGCTTTACTTCAAGATAAGGATGTCA TAGCGATCAACCAAGATCCTCTTGGTAAACAAGGTTATCAATTGA GACAAGGTGACAACTTTGAAGTGTGGGAAAGACCATTGTCTGGAC TTGCGTGGGCTGTTGCTATGATCAACCGTCAAGAGATCGGAGGGC CAAGATCTTACACTATCGCGGTAGCCTCTTTGGGTAAGGGTGTTGC GTGCAATCCTGCCTGCTTCATTACACAATTGCTTCCAGTTAAGAGA AAGTTGGGTTTCTATGAGTGGACATCTAGGCTAAGAAGTCACATC
AATCCTACTGGTACGGTATTGTTGCAATTGGAGAACACAATGCAA ATGTCTTTGAAAGATTTGTTA (SEQ ID NO:8) Sequência polinucleotídica da variante no 73:
[00172] CTGGACAATGGATTGGCAAGGACGCCTACCATGGGC
TGGCTGCACTGGGAGCGCTTCATGTGCAACCTTGACTGCCAGGAA GAGCCAGATTCCTGCATCAGTGAGAAGCTCTTCATGGAGATGGCA GAGCTCATGGTCTCAGAAGGCTGGAAGGATGCAGGTTATGAGTAC CTCTGCATTGATGACTGTTGGATGGCTCCCCAAAGAGATTCAGAAG GCAGACTTCAGGCAGACCCTCAGCGCTTTCCTCATGGGATTCGCCA GCTAGCTAATTATGTTCACAGCAAAGGACTGAAGCTAGGGATTTA TGCAGATGTTGGAAATAAAACCTGCGCAGGCTTCCCTGGGAGTTTT GGATACTACGACATTGATGCCCAGACCTTTGCTGACTGGGGAGTA GATCTGCTAAAATTTGATGGTTGTTACTGTGACAGTTTGGAAAATT TGGCAGATGGTTATAAGCACATGTCCTTGGCCCTGAATAGGACTG
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GCAGAAGCATTGTGTACTCCTGTGAGTGGCCTCTTTATATGTGGCC CTTTCAAAAGCCCAATTATACAGAAATCCGACAGTACTGCAATCA CTGGCGAAATTTTGCTGACATTGATGATTCCTGGGCGAGTATAAAG AGTATCTTGGACTGGACATCTTTTAACCAGGAGAGAATTGTTGATG TTGCTGGACCAGGGGGTTGGAATGACCCAGATATGTTAGTGATTG GCAACTTTGGCCTCAGCTGGAATCAGCAAGTAACTCAGATGGCCC TCTGGGCTATCATGGCTGCTCCTTTATTCATGTCTAATGACCTCCGA CACATCAGCCCTCAAGCCAAAGCTCTCCTTCAGGATAAGGACGTA ATTGCCATCAATCAGGACCCCTTGGGCAAGCAAGGGTACCAGCTT AGACAGGGAGACAACTTTGAAGTGTGGGAACGACCTCTCTCAGGC TTAGCCTGGGCTGTAGCTATGATAAACCGGCAGGAGATTGGTGGA CCTCGCTCTTATACCATCGCAGTTGCTTCCCTGGGTAAAGGAGTGG CCTGTAATCCTGCCTGCTTCATCACACAGCTCCTCCCTGTGAAAAG GAAGCTAGGGTTCTATGAATGGACTTCAAGGTTAAGAAGTCACAT
AAATCCCACAGGCACTGTTTTGCTTCAGCTAGAAAATACAATGCA GATGTCATTAAAAGACTTACTT (SEQ ID NO:9) Sequência polipeptídica da variante no 73:
[00173] LDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKL
FMEMAELMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRF PHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFA DWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPL YMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWASIKSILDWTSFNQERI VDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWNQQVTQMALWAIMAAPLFMSN DLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLS
GLAWAVAMINRQEIGGPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKR KLGFYEWTSRLRSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL (SEQ ID NO:10) Sequência polinucleotídica de yCDS da variante no 218:
[00174] TTGGATAACGGGTTAGCCCGTACACCTACTATGGGTT
128 / 169
GGCTTCACTGGGAAAGATTCATGTGTAACTTAGATTGCCAAGAAG AGCCTGACAGCTGTATCTCAGAGAAACTATTCATGGAGATGGCTG AACTAATGGTAAGTGAAGGATGGAAGGATGCTGGTTATGAATACC TATGTATTGATGATTGCTGGATGGCTCCACAGCGTGATTCAGAAGG TAGGTTACAAGCTGACCCCCAGAGATTCCCACATGGCATACGTCA GCTTGCAAACTACGTACACAGCAAGGGTCTAAAGTTAGGCATCTA CGCTGATGTCGGAAACAAGACATGTGCTGGTTTCCCAGGTTCATTC GGTTACTATGACATAGATGCGCAGACGTTTGCTGATTGGGGTGTTG ATTTGTTGAAGTTTGATGGATGCTACTGCGATTCCCTGGAGAACCT AGCCGATGGGTACAAACACATGAGTTTGGCTCTAAACAGGACTGG TAGGAGCATCGTCTATAGTTGTGAATGGCCCTTGTACATGTGGCCG TTTCAGAAGCCAAACTACACTGAGATAAGACAATACTGTAACCAT TGGCGTAACTTTGCTGACATAGATGATTCATGGGCTTCAATCAAAT CTATCTTGGATTGGACTTCTTTCAACCAGGAAAGAATTGTTGATGT TGCAGGTCCAGGTGGATGGAATGACCCTGATATGCTTGTCATAGG GAACTTTGGGCTATCATGGAATCAACAAGTTACACAAATGGCTTTG TGGGCGATCATGGCCGCACCCCTATTCATGTCTAATGATCTACGTC ACATATCACCCCAAGCAAAGGCTTTACTTCAAGATAAGGATGTCA TAGCGATCAACCAAGATCCTCTTGGTAAACAAGGTTATCAATTGA GACAAGGTGACAACTTTGAAGTGTGGGAAAGACCATTGTCTGGAC TTGCGTGGGCTGTTGCTATTATCAACCGTCAAGAGATCGGAGGGCC AAGATCTTACACTATCGCGGTAGCCTCTTTGGGTAAGGGTGTTGCG TGCAATCCTGCCTGCTTCATTACACAATTGCTTCCAGTTAAGAGAA AGTTGGGTTTCTATAACTGGACATCTAGGCTAAAAAGTCACATTAA
TCCTACTGGTACGGTATTGTTGCAATTGGAGAACACAATGCAAATG TCTTTGAAAGATTTGTTA (SEQ ID NO:11) Sequência polinucleotídica de hCDS da variante no 218:
[00175] CTGGACAATGGATTGGCAAGGACGCCTACCATGGGC
TGGCTGCACTGGGAGCGCTTCATGTGCAACCTTGACTGCCAGGAA
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GAGCCAGATTCCTGCATCAGTGAGAAGCTCTTCATGGAGATGGCA GAGCTCATGGTCTCAGAAGGCTGGAAGGATGCAGGTTATGAGTAC CTCTGCATTGATGACTGTTGGATGGCTCCCCAAAGAGATTCAGAAG GCAGACTTCAGGCAGACCCTCAGCGCTTTCCTCATGGGATTCGCCA GCTAGCTAATTATGTTCACAGCAAAGGACTGAAGCTAGGGATTTA TGCAGATGTTGGAAATAAAACCTGCGCAGGCTTCCCTGGGAGTTTT GGATACTACGACATTGATGCCCAGACCTTTGCTGACTGGGGAGTA GATCTGCTAAAATTTGATGGTTGTTACTGTGACAGTTTGGAAAATT TGGCAGATGGTTATAAGCACATGTCCTTGGCCCTGAATAGGACTG GCAGAAGCATTGTGTACTCCTGTGAGTGGCCTCTTTATATGTGGCC CTTTCAAAAGCCCAATTATACAGAAATCCGACAGTACTGCAATCA CTGGCGAAATTTTGCTGACATTGATGATTCCTGGGCGAGTATAAAG AGTATCTTGGACTGGACATCTTTTAACCAGGAGAGAATTGTTGATG TTGCTGGACCAGGGGGTTGGAATGACCCAGATATGTTAGTGATTG GCAACTTTGGCCTCAGCTGGAATCAGCAAGTAACTCAGATGGCCC TCTGGGCTATCATGGCTGCTCCTTTATTCATGTCTAATGACCTCCGA CACATCAGCCCTCAAGCCAAAGCTCTCCTTCAGGATAAGGACGTA ATTGCCATCAATCAGGACCCCTTGGGCAAGCAAGGGTACCAGCTT AGACAGGGAGACAACTTTGAAGTGTGGGAACGACCTCTCTCAGGC TTAGCCTGGGCTGTAGCTATTATAAACCGGCAGGAGATTGGTGGA CCTCGCTCTTATACCATCGCAGTTGCTTCCCTGGGTAAAGGAGTGG CCTGTAATCCTGCCTGCTTCATCACACAGCTCCTCCCTGTGAAAAG GAAGCTAGGGTTCTATAACTGGACTTCAAGGTTAAAAAGTCACAT
AAATCCCACAGGCACTGTTTTGCTTCAGCTAGAAAATACAATGCA GATGTCATTAAAAGACTTACTT (SEQ ID NO:12) Sequência polipeptídica da variante no 218:
[00176] LDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKL
FMEMAELMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRF PHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFA
130 / 169
DWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPL YMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWASIKSILDWTSFNQERI VDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWNQQVTQMALWAIMAAPLFMSN DLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLS
GLAWAVAIINRQEIGGPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRK LGFYNWTSRLKSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL (SEQ ID NO:13) Sequência polinucleotídica de yCDS da variante no 326 yCDS:
[00177] TTGGATAACGGGTTAGCCCGTACACCTACTATGGGTT
GGCTTCACTGGGAAAGATTCATGTGTAACTTAGATTGCCAAGAAG AGCCTGACAGCTGTATCTCAGAGAAACTATTCATGGAGATGGCTG AACGGATGGTAAGTGAAGGATGGAAGGATGCTGGTTATGAATACC TATGTATTGATGATTGCTGGATGGCTCCACAGCGTGATTCAGAAGG TAGGTTACAAGCTGACCCCCAGAGATTCCCACATGGCATACGTCA GCTTGCAAACTACGTACACAGCAAAGGTCTAAAGTTAGGCATCTA CGCTGATGTCGGAAACAAGACATGTGCTGGTTTCCCAGGTTCATTC GGTTACTATGACATAGATGCGCAGACGTTTGCTGATTGGGGTGTTG ATTTGTTGAAGTTTGATGGATGCTACTGCGATTCCCTGGAGAACCT AGCCGATGGGTACAAACACATGAGTTTGGCTCTAAACAGGACTGG TAGGAGCATCGTCTATAGTTGTGAATGGCCCTTGTACATGTGGCCG TTTCAGAAGCCAAACTACACTGAGATAAGACAATACTGTAACCAT TGGCGTAACTTTGCTGACATAGATGATTCATGGGCTTCAATCAAAT CTATCTTGGATTGGACTTCTCGTAACCAGGAAAGAATTGTTGATGT TGCAGGTCCAGGTGGATGGAATGACCCTGATATGCTTGTCATAGG GAACTTTGGGCTATCATGGGACCAACAAGTTACACAAATGGCTTT GTGGGCGATCATGGCCGCACCCCTATTCATGTCTAATGATCTACGT CACATATCACCCCAAGCAAAGGCTTTACTTCAAGATAAGGATGTC ATAGCGATCAACCAAGATCCTCTTGGTAAACAAGGTTATCAATTG AGAAAAGGTGACAACTTTGAAGTGTGGGAAAGACCATTGTCTGGA GATGCGTGGGCTGTTGCTATTATCAACCGTCAAGAGATCGGAGGG
131 / 169
CCAAGATCTTACACTATCCCGGTAGCCTCTTTGGGTAAGGGTGTTG CGTGCAATCCTGCCTGCTTCATTACACAATTGCTTCCAGTTAAGAG ACAATTGGGTTTCTATAACTGGACCTCTAGGCTAAAAAGTCACATT
AATCCTACTGGTACGGTATTGTTGCAATTGGAGAACACAATGCAA ATGTCTTTGAAAGATTTGTTA (SEQ ID NO:14) Sequência polipeptídica da variante no 326:
[00178] LDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKL
FMEMAERMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRF PHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFA DWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPL YMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWASIKSILDWTSRNQERI VDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWDQQVTQMALWAIMAAPLFMSN DLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRKGDNFEVWERPLS
GDAWAVAIINRQEIGGPRSYTIPVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRQ LGFYNWTSRLKSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL (SEQ ID NO:15) Sequência polinucleotídica de yCDS da variante no 206:
[00179] TTGGATAACGGGTTAGCCCGTACACCTACTATGGGTT
GGCTTCACTGGGAAAGATTCATGTGTAACTTAGATTGCCAAGAAG AGCCTGACAGCTGTATCTCAGAGAAACTATTCATGGAGATGGCTG AACTAATGGTAAGTGAAGGATGGAAGGATGCTGGTTATGAATACC TATGTATTGATGATTGCTGGATGGCTCCACAGCGTGATTCAGAAGG TAGGTTACAAGCTGACCCCCAGAGATTCCCACATGGCATACGTCA GCTTGCAAACTACGTACACAGCAAGGGTCTAAAGTTAGGCATCTA CGCTGATGTCGGAAACAAGACATGTGCTGGTTTCCCAGGTTCATTC GGTTACTATGACATAGATGCGCAGACGTTTGCTGATTGGGGTGTTG ATTTGTTGAAGTTTGATGGATGCTACTGCGATTCCCTGGAGAACCT AGCCGATGGGTACAAACACATGAGTTTGGCTCTAAACAGGACTGG TAGGAGCATCGTCTATAGTTGTGAATGGCCCTTGTACATGTGGCCG TTTCAGAAGCCAAACTACACTGAGATAAGACAATACTGTAACCAT
132 / 169
TGGCGTAACTTTGCTGACATAGATGATTCATGGGCTTCAATCAAAT CTATCTTGGATTGGACTTCTTTCAACCAGGAAAGAATTGTTGATGT TGCAGGTCCAGGTGGATGGAATGACCCTGATATGCTTGTCATAGG GAACTTTGGGCTATCATGGAATCAACAAGTTACACAAATGGCTTTG TGGGCGATCATGGCCGCACCCCTATTCATGTCTAATGATCTACGTC ACATATCACCCCAAGCAAAGGCTTTACTTCAAGATAAGGATGTCA TAGCGATCAACCAAGATCCTCTTGGTAAACAAGGTTATCAATTGA GACAAGGTGACAACTTTGAAGTGTGGGAAAGACCATTGTCTGGAC TTGCGTGGGCTGTTGCTATGATCAACCGTCAAGAGATCGGAGGGC CAAGATCTTACACTATCGCGGTAGCCTCTTTGGGTAAGGGTGTTGC GTGCAATCCTGCCTGCTTCATTACACAATTGCTTCCAGTTAAGAGA AAGTTGGGTTTCTATAATTGGACCTCTAGGCTAAGAAGTCACATCA
ATCCTACTGGTACGGTATTGTTGCAATTGGAGAACACAATGCAAAT GTCTTTGAAAGATTTGTTA (SEQ ID NO:16) Sequência polinucleotídica de hCDS da variante no 206:
[00180] CTGGACAATGGATTGGCAAGGACGCCTACCATGGGC
TGGCTGCACTGGGAGCGCTTCATGTGCAACCTTGACTGCCAGGAA GAGCCAGATTCCTGCATCAGTGAGAAGCTCTTCATGGAGATGGCA GAGCTCATGGTCTCAGAAGGCTGGAAGGATGCAGGTTATGAGTAC CTCTGCATTGATGACTGTTGGATGGCTCCCCAAAGAGATTCAGAAG GCAGACTTCAGGCAGACCCTCAGCGCTTTCCTCATGGGATTCGCCA GCTAGCTAATTATGTTCACAGCAAAGGACTGAAGCTAGGGATTTA TGCAGATGTTGGAAATAAAACCTGCGCAGGCTTCCCTGGGAGTTTT GGATACTACGACATTGATGCCCAGACCTTTGCTGACTGGGGAGTA GATCTGCTAAAATTTGATGGTTGTTACTGTGACAGTTTGGAAAATT TGGCAGATGGTTATAAGCACATGTCCTTGGCCCTGAATAGGACTG GCAGAAGCATTGTGTACTCCTGTGAGTGGCCTCTTTATATGTGGCC CTTTCAAAAGCCCAATTATACAGAAATCCGACAGTACTGCAATCA CTGGCGAAATTTTGCTGACATTGATGATTCCTGGGCGAGTATAAAG
133 / 169
AGTATCTTGGACTGGACATCTTTTAACCAGGAGAGAATTGTTGATG TTGCTGGACCAGGGGGTTGGAATGACCCAGATATGTTAGTGATTG GCAACTTTGGCCTCAGCTGGAATCAGCAAGTAACTCAGATGGCCC TCTGGGCTATCATGGCTGCTCCTTTATTCATGTCTAATGACCTCCGA CACATCAGCCCTCAAGCCAAAGCTCTCCTTCAGGATAAGGACGTA ATTGCCATCAATCAGGACCCCTTGGGCAAGCAAGGGTACCAGCTT AGACAGGGAGACAACTTTGAAGTGTGGGAACGACCTCTCTCAGGC TTAGCCTGGGCTGTAGCTATGATAAACCGGCAGGAGATTGGTGGA CCTCGCTCTTATACCATCGCAGTTGCTTCCCTGGGTAAAGGAGTGG CCTGTAATCCTGCCTGCTTCATCACACAGCTCCTCCCTGTGAAAAG GAAGCTAGGGTTCTATAACTGGACTTCAAGGTTAAGAAGTCACAT
AAATCCCACAGGCACTGTTTTGCTTCAGCTAGAAAATACAATGCA GATGTCATTAAAAGACTTACTT (SEQ ID NO:17) Sequência polipeptídica da variante no 206:
[00181] LDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKL
FMEMAELMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRF PHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFA DWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPL YMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWASIKSILDWTSFNQERI VDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWNQQVTQMALWAIMAAPLFMSN DLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLS
GLAWAVAMINRQEIGGPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKR KLGFYNWTSRLRSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL (SEQ ID NO:18) Sequência polinucleotídica de yCDS da variante no 205:
[00182] TTGGATAACGGGTTAGCCCGTACACCTACTATGGGTT
GGCTTCACTGGGAAAGATTCATGTGTAACTTAGATTGCCAAGAAG AGCCTGACAGCTGTATCTCAGAGAAACTATTCATGGAGATGGCTG AACTAATGGTAAGTGAAGGATGGAAGGATGCTGGTTATGAATACC
134 / 169
TATGTATTGATGATTGCTGGATGGCTCCACAGCGTGATTCAGAAGG TAGGTTACAAGCTGACCCCCAGAGATTCCCACATGGCATACGTCA GCTTGCAAACTACGTACACAGCAAGGGTCTAAAGTTAGGCATCTA CGCTGATGTCGGAAACAAGACATGTGCTGGTTTCCCAGGTTCATTC GGTTACTATGACATAGATGCGCAGACGTTTGCTGATTGGGGTGTTG ATTTGTTGAAGTTTGATGGATGCTACTGCGATTCCCTGGAGAACCT AGCCGATGGGTACAAACACATGAGTTTGGCTCTAAACAGGACTGG TAGGAGCATCGTCTATAGTTGTGAATGGCCCTTGTACATGTGGCCG TTTCAGAAGCCAAACTACACTGAGATAAGACAATACTGTAACCAT TGGCGTAACTTTGCTGACATAGATGATTCATGGGCTTCAATCAAAT CTATCTTGGATTGGACTTCTTTCAACCAGGAAAGAATTGTTGATGT TGCAGGTCCAGGTGGATGGAATGACCCTGATATGCTTGTCATAGG GAACTTTGGGCTATCATGGAATCAACAAGTTACACAAATGGCTTTG TGGGCGATCATGGCCGCACCCCTATTCATGTCTAATGATCTACGTC ACATATCACCCCAAGCAAAGGCTTTACTTCAAGATAAGGATGTCA TAGCGATCAACCAAGATCCTCTTGGTAAACAAGGTTATCAATTGA GACAAGGTGACAACTTTGAAGTGTGGGAAAGACCATTGTCTGGAC TTGCGTGGGCTGTTGCTATGATCAACCGTCAAGAGATCGGAGGGC CAAGATCTTACACTATCGCGGTAGCCTCTTTGGGTAAGGGTGTTGC GTGCAATCCTGCCTGCTTCATTACACAATTGCTTCCAGTTAAGAGA AAGTTGGGTTTCTATGATTGGGACTCTAGGCTAAGAAGTCACATCA
ATCCTACTGGTACGGTATTGTTGCAATTGGAGAACACAATGCAAAT GTCTTTGAAAGATTTGTTA (SEQ ID NO:19) Sequência polinucleotídica de hCDS da variante no 205:
[00183] CTGGACAATGGATTGGCAAGGACGCCTACCATGGGC
TGGCTGCACTGGGAGCGCTTCATGTGCAACCTTGACTGCCAGGAA GAGCCAGATTCCTGCATCAGTGAGAAGCTCTTCATGGAGATGGCA GAGCTCATGGTCTCAGAAGGCTGGAAGGATGCAGGTTATGAGTAC CTCTGCATTGATGACTGTTGGATGGCTCCCCAAAGAGATTCAGAAG
135 / 169
GCAGACTTCAGGCAGACCCTCAGCGCTTTCCTCATGGGATTCGCCA GCTAGCTAATTATGTTCACAGCAAAGGACTGAAGCTAGGGATTTA TGCAGATGTTGGAAATAAAACCTGCGCAGGCTTCCCTGGGAGTTTT GGATACTACGACATTGATGCCCAGACCTTTGCTGACTGGGGAGTA GATCTGCTAAAATTTGATGGTTGTTACTGTGACAGTTTGGAAAATT TGGCAGATGGTTATAAGCACATGTCCTTGGCCCTGAATAGGACTG GCAGAAGCATTGTGTACTCCTGTGAGTGGCCTCTTTATATGTGGCC CTTTCAAAAGCCCAATTATACAGAAATCCGACAGTACTGCAATCA CTGGCGAAATTTTGCTGACATTGATGATTCCTGGGCGAGTATAAAG AGTATCTTGGACTGGACATCTTTTAACCAGGAGAGAATTGTTGATG TTGCTGGACCAGGGGGTTGGAATGACCCAGATATGTTAGTGATTG GCAACTTTGGCCTCAGCTGGAATCAGCAAGTAACTCAGATGGCCC TCTGGGCTATCATGGCTGCTCCTTTATTCATGTCTAATGACCTCCGA CACATCAGCCCTCAAGCCAAAGCTCTCCTTCAGGATAAGGACGTA ATTGCCATCAATCAGGACCCCTTGGGCAAGCAAGGGTACCAGCTT AGACAGGGAGACAACTTTGAAGTGTGGGAACGACCTCTCTCAGGC TTAGCCTGGGCTGTAGCTATGATAAACCGGCAGGAGATTGGTGGA CCTCGCTCTTATACCATCGCAGTTGCTTCCCTGGGTAAAGGAGTGG CCTGTAATCCTGCCTGCTTCATCACACAGCTCCTCCCTGTGAAAAG GAAGCTAGGGTTCTATGATTGGGATTCAAGGTTAAGAAGTCACAT
AAATCCCACAGGCACTGTTTTGCTTCAGCTAGAAAATACAATGCA GATGTCATTAAAAGACTTACTT (SEQ ID NO:20) Sequência polipeptídica da variante no 205:
[00184] LDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKL
FMEMAELMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRF PHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFA DWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPL YMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWASIKSILDWTSFNQERI VDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWNQQVTQMALWAIMAAPLFMSN
136 / 169
DLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLS
GLAWAVAMINRQEIGGPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKR KLGFYDWDSRLRSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL (SEQ ID NO:21) Sequência polinucleotídica de yCDS da variante no 76:
[00185] TTGGATAACGGGTTAGCCCGTACACCTACTATGGGTT
GGCTTCACTGGGAAAGATTCATGTGTAACTTAGATTGCCAAGAAG AGCCTGACAGCTGTATCTCAGAGAAACTATTCATGGAGATGGCTG AACTAATGGTAAGTGAAGGATGGAAGGATGCTGGTTATGAATACC TATGTATTGATGATTGCTGGATGGCTCCACAGCGTGATTCAGAAGG TAGGTTACAAGCTGACCCCCAGAGATTCCCACATGGCATACGTCA GCTTGCAAACTACGTACACAGCAAGGGTCTAAAGTTAGGCATCTA CGCTGATGTCGGAAACAAGACATGTGCTGGTTTCCCAGGTTCATTC GGTTACTATGACATAGATGCGCAGACGTTTGCTGATTGGGGTGTTG ATTTGTTGAAGTTTGATGGATGCTACTGCGATTCCCTGGAGAACCT AGCCGATGGGTACAAACACATGAGTTTGGCTCTAAACAGGACTGG TAGGAGCATCGTCTATAGTTGTGAATGGCCCTTGTACATGTGGCCG TTTCAGAAGCCAAACTACACTGAGATAAGACAATACTGTAACCAT TGGCGTAACTTTGCTGACATAGATGATTCATGGAGGTCAATCAAAT CTATCTTGGATTGGACTTCTTTCAACCAGGAAAGAATTGTTGATGT TGCAGGTCCAGGTGGATGGAATGACCCTGATATGCTTGTCATAGG GAACTTTGGGCTATCATGGAATCAACAAGTTACACAAATGGCTTTG TGGGCGATCATGGCCGCACCCCTATTCATGTCTAATGATCTACGTC ACATATCACCCCAAGCAAAGGCTTTACTTCAAGATAAGGATGTCA TAGCGATCAACCAAGATCCTCTTGGTAAACAAGGTTATCAATTGA GACAAGGTGACAACTTTGAAGTGTGGGAAAGACCATTGTCTGGAC TTGCGTGGGCTGTTGCTATGATCAACCGTCAAGAGATCGGAGGGC CAAGATCTTACACTATCGCGGTAGCCTCTTTGGGTAAGGGTGTTGC GTGCAATCCTGCCTGCTTCATTACACAATTGCTTCCAGTTAAGAGA
137 / 169
AAGTTGGGTTTCTATGAGTGGACATCTAGGCTAAGAAGTCACATC
AATCCTACTGGTACGGTATTGTTGCAATTGGAGAACACAATGCAA ATGTCTTTGAAAGATTTGTTA (SEQ ID NO:22) Sequência polinucleotídica de hCDS da variante no 76:
[00186] CTGGACAATGGATTGGCAAGGACGCCTACCATGGGC
TGGCTGCACTGGGAGCGCTTCATGTGCAACCTTGACTGCCAGGAA GAGCCAGATTCCTGCATCAGTGAGAAGCTCTTCATGGAGATGGCA GAGCTCATGGTCTCAGAAGGCTGGAAGGATGCAGGTTATGAGTAC CTCTGCATTGATGACTGTTGGATGGCTCCCCAAAGAGATTCAGAAG GCAGACTTCAGGCAGACCCTCAGCGCTTTCCTCATGGGATTCGCCA GCTAGCTAATTATGTTCACAGCAAAGGACTGAAGCTAGGGATTTA TGCAGATGTTGGAAATAAAACCTGCGCAGGCTTCCCTGGGAGTTTT GGATACTACGACATTGATGCCCAGACCTTTGCTGACTGGGGAGTA GATCTGCTAAAATTTGATGGTTGTTACTGTGACAGTTTGGAAAATT TGGCAGATGGTTATAAGCACATGTCCTTGGCCCTGAATAGGACTG GCAGAAGCATTGTGTACTCCTGTGAGTGGCCTCTTTATATGTGGCC CTTTCAAAAGCCCAATTATACAGAAATCCGACAGTACTGCAATCA CTGGCGAAATTTTGCTGACATTGATGATTCCTGGCGTAGTATAAAG AGTATCTTGGACTGGACATCTTTTAACCAGGAGAGAATTGTTGATG TTGCTGGACCAGGGGGTTGGAATGACCCAGATATGTTAGTGATTG GCAACTTTGGCCTCAGCTGGAATCAGCAAGTAACTCAGATGGCCC TCTGGGCTATCATGGCTGCTCCTTTATTCATGTCTAATGACCTCCGA CACATCAGCCCTCAAGCCAAAGCTCTCCTTCAGGATAAGGACGTA ATTGCCATCAATCAGGACCCCTTGGGCAAGCAAGGGTACCAGCTT AGACAGGGAGACAACTTTGAAGTGTGGGAACGACCTCTCTCAGGC TTAGCCTGGGCTGTAGCTATGATAAACCGGCAGGAGATTGGTGGA CCTCGCTCTTATACCATCGCAGTTGCTTCCCTGGGTAAAGGAGTGG CCTGTAATCCTGCCTGCTTCATCACACAGCTCCTCCCTGTGAAAAG GAAGCTAGGGTTCTATGAATGGACTTCAAGGTTAAGAAGTCACAT
138 / 169
AAATCCCACAGGCACTGTTTTGCTTCAGCTAGAAAATACAATGCA GATGTCATTAAAAGACTTACTT (SEQ ID NO:23) Sequência polipeptídica da variante no 76:
[00187] LDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKL
FMEMAELMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRF PHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFA DWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPL YMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWRSIKSILDWTSFNQERI VDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWNQQVTQMALWAIMAAPLFMSN DLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLS
GLAWAVAMINRQEIGGPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKR KLGFYEWTSRLRSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL (SEQ ID NO:24) Sequência polinucleotídica do peptídeo sinal Mfalpha:
[00188] ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGC AGCATCCTCCGCATTAGCT (SEQ ID NO:25) Sequência polipeptídica do peptídeo sinal Mfalpha:
[00189] MRFPSIFTAVLFAASSALA (SEQ ID NO:26) Sequência polinucleotídica de MMO435:
[00190] ttaactatatcgtaatacacaggatccaccATGAGATTTCCTTCAATTT TTACTG (SEQ ID NO:27) Sequência polinucleotídica de MMO439:
[00191] AGTAGGTGTACGGGCTAACCCGTTATCCAAAGCTAAT GCGGAGGATGC (SEQ ID NO:28) Sequência polinucleotídica de MMO514:
[00192] TTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAG CTTTGGATAACGGGTTAGCCCG (SEQ ID NO:29) Sequência polinucleotídica de MMO481:
[00193] GAGCTAAAAGTACAGTGGGAACAAAGTCGAGGTCGA
139 / 169 CTTATAACAAATCTTTCAAAGACA (SEQ ID NO:30) Sequência polinucleotídica do peptídeo sinal mamífero sintético:
[00194] ATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAG TAACGACTGGTGTCCACTCC (SEQ ID NO:31) Sequência polinucleotídica de LAKE Fw:
[00195] CGATCGAAGCTTCGCCACCA (SEQ ID NO.32) Sequência polinucleotídica de Br reverse:
[00196] CTTGCCAATCCATTGTCCAGGGAGTGGACACCAGTCG TTA (SEQ ID NO:33) Sequência polinucleotídica de Br Fw:
[00197] TAACGACTGGTGTCCACTCCCTGGACAATGGATTGGC AAG (SEQ ID NO:34) Sequência polinucleotídica de hGLA Rv:
[00198] CGATCGGCGGCCGCTCAAAGTAAGTCTTTTAATGACA (SEQ ID NO:35) Sequência polinucleotídica de SP-GLA (yCDS):
[00199] ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGC
AGCATCCTCCGCATTAGCTTTGGATAACGGGTTAGCCCGTACACCT ACTATGGGTTGGCTTCACTGGGAAAGATTCATGTGTAACTTAGATT GCCAAGAAGAGCCTGACAGCTGTATCTCAGAGAAACTATTCATGG AGATGGCTGAACTAATGGTAAGTGAAGGATGGAAGGATGCTGGTT ATGAATACCTATGTATTGATGATTGCTGGATGGCTCCACAGCGTGA TTCAGAAGGTAGGTTACAAGCTGACCCCCAGAGATTCCCACATGG CATACGTCAGCTTGCAAACTACGTACACAGCAAGGGTCTAAAGTT AGGCATCTACGCTGATGTCGGAAACAAGACATGTGCTGGTTTCCC AGGTTCATTCGGTTACTATGACATAGATGCGCAGACGTTTGCTGAT TGGGGTGTTGATTTGTTGAAGTTTGATGGATGCTACTGCGATTCCC TGGAGAACCTAGCCGATGGGTACAAACACATGAGTTTGGCTCTAA ACAGGACTGGTAGGAGCATCGTCTATAGTTGTGAATGGCCCTTGTA
140 / 169
CATGTGGCCGTTTCAGAAGCCAAACTACACTGAGATAAGACAATA CTGTAACCATTGGCGTAACTTTGCTGACATAGATGATTCATGGAAG TCAATCAAATCTATCTTGGATTGGACTTCTTTCAACCAGGAAAGAA TTGTTGATGTTGCAGGTCCAGGTGGATGGAATGACCCTGATATGCT TGTCATAGGGAACTTTGGGCTATCATGGAATCAACAAGTTACACA AATGGCTTTGTGGGCGATCATGGCCGCACCCCTATTCATGTCTAAT GATCTACGTCACATATCACCCCAAGCAAAGGCTTTACTTCAAGATA AGGATGTCATAGCGATCAACCAAGATCCTCTTGGTAAACAAGGTT ATCAATTGAGACAAGGTGACAACTTTGAAGTGTGGGAAAGACCAT TGTCTGGACTTGCGTGGGCTGTTGCTATGATCAACCGTCAAGAGAT CGGAGGGCCAAGATCTTACACTATCGCGGTAGCCTCTTTGGGTAA GGGTGTTGCGTGCAATCCTGCCTGCTTCATTACACAATTGCTTCCA GTTAAGAGAAAGTTGGGTTTCTATGAGTGGACATCTAGGCTAAGA
AGTCACATCAATCCTACTGGTACGGTATTGTTGCAATTGGAGAACA CAATGCAAATGTCTTTGAAAGATTTGTTA (SEQ ID NO:36) Sequência polinucleotídica de MFleader-GLA (yCDS):
[00200] ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGC
AGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGA TGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTTAGAT TTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCA CAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGC TGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTTTGGATAAAAGATTGGATAACGG GTTAGCCCGTACACCTACTATGGGTTGGCTTCACTGGGAAAGATTC ATGTGTAACTTAGATTGCCAAGAAGAGCCTGACAGCTGTATCTCA GAGAAACTATTCATGGAGATGGCTGAACTAATGGTAAGTGAAGGA TGGAAGGATGCTGGTTATGAATACCTATGTATTGATGATTGCTGGA TGGCTCCACAGCGTGATTCAGAAGGTAGGTTACAAGCTGACCCCC AGAGATTCCCACATGGCATACGTCAGCTTGCAAACTACGTACACA GCAAGGGTCTAAAGTTAGGCATCTACGCTGATGTCGGAAACAAGA
141 / 169
CATGTGCTGGTTTCCCAGGTTCATTCGGTTACTATGACATAGATGC GCAGACGTTTGCTGATTGGGGTGTTGATTTGTTGAAGTTTGATGGA TGCTACTGCGATTCCCTGGAGAACCTAGCCGATGGGTACAAACAC ATGAGTTTGGCTCTAAACAGGACTGGTAGGAGCATCGTCTATAGTT GTGAATGGCCCTTGTACATGTGGCCGTTTCAGAAGCCAAACTACAC TGAGATAAGACAATACTGTAACCATTGGCGTAACTTTGCTGACATA GATGATTCATGGAAGTCAATCAAATCTATCTTGGATTGGACTTCTT TCAACCAGGAAAGAATTGTTGATGTTGCAGGTCCAGGTGGATGGA ATGACCCTGATATGCTTGTCATAGGGAACTTTGGGCTATCATGGAA TCAACAAGTTACACAAATGGCTTTGTGGGCGATCATGGCCGCACC CCTATTCATGTCTAATGATCTACGTCACATATCACCCCAAGCAAAG GCTTTACTTCAAGATAAGGATGTCATAGCGATCAACCAAGATCCTC TTGGTAAACAAGGTTATCAATTGAGACAAGGTGACAACTTTGAAG TGTGGGAAAGACCATTGTCTGGACTTGCGTGGGCTGTTGCTATGAT CAACCGTCAAGAGATCGGAGGGCCAAGATCTTACACTATCGCGGT AGCCTCTTTGGGTAAGGGTGTTGCGTGCAATCCTGCCTGCTTCATT ACACAATTGCTTCCAGTTAAGAGAAAGTTGGGTTTCTATGAGTGGA CATCTAGGCTAAGAAGTCACATCAATCCTACTGGTACGGTATTGTT
GCAATTGGAGAACACAATGCAAATGTCTTTGAAAGATTTGTTA (SEQ ID NO:37) Sequência polipeptídica de MFleader:
[00201] MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIG YLDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLDKR (SEQ ID NO:38) Sequência polinucleotídica de yCDS da variante no 395:
[00202] TTGGATAACGGGTTAGCCCGTACACCTACTATGGGTT
GGCTTCACTGGGAAAGATTCATGTGTAACTTAGATTGCCAAGAAG AGCCTGACAGCTGTATCTCAGAGAAACTATTCATGGAGATGGCTG AACGGATGGTAAGTGAAGGATGGAAGGATGCTGGTTATGAATACC
142 / 169
TATGTATTGATGATTGCTGGATGGCTCCACAGCGTGATTCAGAAGG TAGGTTACAAGCTGACCCCCAGAGATTCCCACATGGCATACGTCA GCTTGCAAACCATGTACACAGCAAAGGTCTAAAGTTAGGCATCTA CGCTGATGTCGGAAACAAGACATGTGCTGGTTTCCCAGGTTCATTC GGTTACTATGACATAGATGCGCAGACGTTTGCTGATTGGGGTGTTG ATTTGTTGAAGTTTGATGGATGCTACTGCGATTCCCTGGAGAACCT AGCCGATGGGTACAAACACATGAGTTTGGCTCTAAACAGGACTGG TAGGAGCATCGTCTATAGTTGTGAATGGCCCTTGTACATGTGGCCG TTTCAGAAGCCAAACTACACTGAGATAAGACAATACTGTAACCAT TGGCGTAACTTTGCTGACATAGATGATTCATGGGCTTCAATCAAAT CTATCTTGGATTGGACTTCTCGTAACCAGGAAAGAATTGTTGATGT TGCAGGTCCAGGTGGATGGAATGACCCTGATATGCTTGTCATAGG GAACTTTGGGCTATCATGGGACCAACAAGTTACACAAATGGCTTT GTGGGCGATCATGGCCGCACCCCTATTCATGTCTAATGATCTACGT CACATATCACCCCAAGCAAAGGCTTTACTTCAAGATAAGGATGTC ATAGCGATCAACCAAGATCCTCTTGGTAAACAAGGTTATCAATTG AGAAAAGGTGACAACTTTGAAGTGTGGGAAAGACCATTGTCTGGA GATGCGTGGGCTGTTGCTATTATCAACCGTCAAGAGATCGGAGGG CCAAGATCTTACACTATCCCGGTAGCCTCTTTGGGTAAGGGTGTTG CGTGCAATCCTGCCTGCTTCATTACACAATTGCTTCCAGTTAAGAG ACAATTGGGTTTCTATAACTGGACCTCTAGGCTAAAAAGTCACATT
AATCCTACTGGTACGGTATTGTTGCAATTGGAGAACACAATGCAA ATGTCTTTGAAAGATTTGTTA (SEQ ID NO:39) Sequência polipeptídica da variante no 395:
[00203] LDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKL
FMEMAERMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRF PHGIRQLANHVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFA DWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPL YMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWASIKSILDWTSRNQERI
143 / 169
VDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWDQQVTQMALWAIMAAPLFMSN DLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRKGDNFEVWERPLS
GDAWAVAIINRQEIGGPRSYTIPVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRQ LGFYNWTSRLKSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL (SEQ ID NO:40) Sequência polinucleotídica de yCDS da variante no 402:
[00204] TTGGATAACGGGTTAGCCCGTACACCTACTATGGGTT
GGCTTCACTGGGAAAGATTCATGTGTAACTTAGATTGCCAAGAAG AGCCTGACAGCTGTATCTCAGAGAAACTATTCATGGAGATGGCTG AACGGATGGTAAGTGAAGGATGGAAGGATGCTGGTTATGAATACC TATGTATTGATGATTGCTGGATGGCTCCACAGCGTGATTCAGAAGG TAGGTTACAAGCTGACCCCCAGAGATTCCCACATGGCATACGTCA GCTTGCAAACTACGTACACAGCAAAGGTCTAAAGTTAGGCATCTA CGCTGATGTCGGAAACAAGACATGTGCTGGTTTCCCAGGTTCATTC GGTTACTATGACATAGATGCGCAGACGTTTGCTGATTGGGGTGTTG ATTTGTTGAAGTTTGATGGATGCTACTGCGATTCCCTGGAGAACCT AGCCGATGGGTACAAACACATGAGTTTGGCTCTAAACAGGACTGG TAGGCCGATCGTCTATAGTTGTGAATGGCCCTTGTACATGTGGCCG TTTCAGAAGCCAAACTACACTGAGATAAGACAATACTGTAACCAT TGGCGTAACTTTGCTGACATAGATGATTCATGGGCTTCAATCAAAT CTATCTTGGATTGGACTTCTCGTAACCAGGAAAGAATTGTTGATGT TGCAGGTCCAGGTGGATGGAATGACCCTGATATGCTTGTCATAGG GAACTTTGGGCTATCATGGGACCAACAAGTTACACAAATGGCTTT GTGGGCGATCATGGCCGCACCCCTATTCATGTCTAATGATCTACGT CACATATCACCCCAAGCAAAGGCTTTACTTCAAGATAAGGATGTC ATAGCGATCAACCAAGATCCTCTTGGTAAACAAGGTTATCAATTG AGAAAAGGTGACAACTTTGAAGTGTGGGAAAGACCATTGTCTGGA GATGCGTGGGCTGTTGCTATTATCAACCGTCAAGAGATCGGAGGG CCAAGATCTTACACTATCCCGGTAGCCTCTTTGGGTAAGGGTGTTG CGTGCAATCCTGCCTGCTTCATTACACAATTGCTTCCAGTTAAGAG
144 / 169
ACAATTGGGTTTCTATAACTGGACCTCTAGGCTAAAAAGTCACATT
AATCCTACTGGTACGGTATTGTTGCAATTGGAGAACACAATGCAA ATGTCTTTGAAAGATTTGTTA (SEQ ID NO:41) Sequência polipeptídica da variante no 402:
[00205] LDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKL
FMEMAERMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRF PHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFA DWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRPIVYSCEWPL YMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWASIKSILDWTSRNQERI VDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWDQQVTQMALWAIMAAPLFMSN DLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRKGDNFEVWERPLS
GDAWAVAIINRQEIGGPRSYTIPVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRQ LGFYNWTSRLKSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL (SEQ ID NO:42) Sequência polinucleotídica de yCDS da variante no 625:
[00206] TTGGATAACGGGTTAGCCCGTACACCTACTATGGGTT
GGCTTCACTGGGAAAGATTCATGTGTAACTTAGATTGCCAAGAAG AGCCTGACAGCTGTATCTCAGAGAAACTATTCATGGAGATGGCTG AACGGATGGTAACCGAAGGATGGAAGGATGCTGGTTATGAATACC TATGTATTGATGATTGCTGGATGGCTCCACAGCGTGATTCAGAAGG TAGGTTACAAGCTGACCCCCAGAGATTCCCACATGGCATACGTCA GCTTGCAAACCATGTACACAGCAAAGGTCTAAAGTTAGGCATCTA CGCTGATGTCGGAAACAAGACATGTGCTGGTTTCCCAGGTTCATTC GGTTACTATGACATAGATGCGCAGACGTTTGCTGATTGGGGTGTTG ATTTGTTGAAGTTTGATGGATGCTACTGCGATTCCCTGGAGAACCT AGCCGATGGGTACAAACACATGAGTTTGGCTCTAAACAGGACTGG TAGGCCGATCGTCTATAGTTGTGAATGGCCCTTGTACATGTGGCCG TTTCAGAAGCCAAACTACACTGAGATAAGACAATACTGTAACCAT TGGCGTAACTTTGCTGACATAGATGATTCATGGGCTTCAATCAAAT CTATCTTGGATTGGACTTCTCGTAACCAGGAAAGAATTGTTGATGT
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TGCAGGTCCAGGTGGATGGAATGACCCTGATATGCTTGTCATAGG GAACTTTGGGCTATCATGGGACCAACAAGTTACACAAATGGCTTT GTGGGCGATCATGGCCGCACCCCTATTCATGTCTAATGATCTACGT GCGATATCACCCCAAGCAAAGGCTTTACTTCAAGATAAGGATGTC ATAGCGATCAACCAAGATCCTCTTGGTAAACAAGGTTATCAATTG AGAAAAGGTGACAACTTTGAAGTGTGGGAAAGACCATTGTCTGGA GATGCGTGGGCTGTTGCTATTATCAACCGTCAAGAGATCGGAGGG CCAAGATCTTACACTATCCCGGTAGCCTCTTTGGGTAAGGGTGTTG CGTGCAATCCTGCCTGCTTCATTACACAATTGCTTCCAGTTAAGAG ACAATTGGGTTTCTATAACTGGACCTCTAGGCTAAAAAGTCACATT
AATCCTACTGGTACGGTATTGTTGCAATTGGAGAACACAATGCAA ACCTCTTTGAAAGATTTGTTA (SEQ ID NO:43) Sequência polipeptídica da variante no 625:
[00207] LDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKL
FMEMAERMVTEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRF PHGIRQLANHVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFA DWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRPIVYSCEWPL YMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWASIKSILDWTSRNQERI VDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWDQQVTQMALWAIMAAPLFMSN DLRAISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRKGDNFEVWERPLS
GDAWAVAIINRQEIGGPRSYTIPVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRQ LGFYNWTSRLKSHINPTGTVLLQLENTMQTSLKDLL (SEQ ID NO:44) Sequência polinucleotídica de yCDS da variante no 648:
[00208] TTGGATAACGGGTTAGCCCGTACACCTCCGATGGGTT
GGCTTCACTGGGAAAGATTCATGTGTAACTTAGATTGCCAAGAAG AGCCTGACAGCTGTATCTCAGAGAAACTATTCGAAGAGATGGCTG AACGGATGGTAACCGAAGGATGGAAGGATGCTGGTTATGAATACC TATGTATTGATGATTGCTGGATGGCTCCACAGCGTGATTCAGAAGG TAGGTTACAAGCTGACCCCCAGAGATTCCCACATGGCATACGTCA
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GCTTGCAAACCATGTACACAGCAAAGGTCTAAAGTTAGGCATCTA CGCTGATGTCGGAAACAAGACATGTGCTGGTTTCCCAGGTTCATTC GGTTACTATGACATAGATGCGCAGACGTTTGCTGATTGGGGTGTTG ATTTGTTGAAGTTTGATGGATGCTACTGCGATTCCCTGGAGAACCT AGCCGATGGGTACAAACACATGAGTTTGGCTCTAAACAGGACTGG TAGGCCGATCGTCTATAGTTGTGAATGGCCCTTGTACATGTGGCCG TTTCAGAAGCCAAACTACACTGAGATAAGACAATACTGTAACCAT TGGCGTAACTTTGCTGACATAGATGATTCATGGGCTTCAATCAAAT CTATCTTGGATTGGACTTCTCGTAACCAGGAAAGAATTGTTGATGT TGCAGGTCCAGGTGGATGGAATGACCCTGATATGCTTGTCATAGG GAACTTTGGGCTATCATGGGACCAACAAGTTACACAAATGGCTTT GTGGGCGATCATGGCCGGCCCCCTATTCATGTCTAATGATCTACGT GCGATATCACCCCAAGCAAAGGCTTTACTTCAAGATAAGGATGTC ATAGCGATCAACCAAGATCCTCTTGGTAAACAAGGTTATCAATTG AGAAAAGGTGACAACTTTGAAGTGTGGGAAAGACCATTGTCTGGA GATGCGTGGGCTGTTGCTATTATCAACCGTCAAGAGATCGGAGGG CCAAGATCTTACACTATCCCGGTAGCCTCTTTGGGTAAGGGTGTTG CGTGCAATCCTGCCTGCTTCATTACACAATTGCTTCCAGTTAAGAG ACAATTGGGTTTCTATAACGCAACCTCTAGGCTAAAAAGTCACATT
AATCCTACTGGTACGGTATTGTTGCAATTGGAGAACACAATGCAA ACCTCTTTGAAAGATTTGTTA (SEQ ID NO:45) Sequência polipeptídica da variante no 648:
[00209] LDNGLARTPPMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKLF
EEMAERMVTEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFP HGIRQLANHVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFAD WGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRPIVYSCEWPLY MWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWASIKSILDWTSRNQERIV DVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWDQQVTQMALWAIMAGPLFMSND LRAISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRKGDNFEVWERPLSG
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DAWAVAIINRQEIGGPRSYTIPVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRQL GFYNATSRLKSHINPTGTVLLQLENTMQTSLKDLL (SEQ ID NO:46) Exemplo 1 Aquisição do gene de GLA e construção de vetores de expressão
[00210] Genes sintéticos (SEQ ID NO: 1) que codificam para a sequência de GLA humana WT (SEQ ID NO: 2) e variantes derivadas (SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6) foram construídos como descrito anteriormente (Ver, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente US No 2017/0360900 A1). Para expressão secretada e transfecção transitória em células de mamíferos, uma construção de expressão de GLA quimérica, compreendendo um polinucleotídeo que codifica um peptídeo sinal sintético de IG de camundongo fundido a um gene sintético que codifica para as diferentes variantes de GLA, foi gerada como segue. Os oligonucleotídeos BamHI- pcDNA-GLA-F (SEQ ID NO: 63) e XhoI-pcDNA-GLA-R (SEQ ID NO: 64) foram usados para amplificar um fragmento que codifica um peptídeo sinal e a sequência de codificação para a forma madura de variantes de GLA. O produto da PCR foi ligado no vetor de expressão pcDNA3.1(+) (Invitrogen) de mamíferos, linearizado com BamHI/XhoI. Técnicas de evolução direcionada, geralmente conhecidas pelos técnicos no assunto, foram empregadas para gerar variantes do gene derivadas da SEQ ID NO: 8 dentro dessa construção de plasmídeo (Ver, por exemplo, Patente US No 8 383 346 e WO2010/144103). Exemplo 2 Crescimento de alto rendimento e ensaios Crescimento de alto rendimento (HTP) de GLA e variantes de GLA
[00211] Células HEK 293T foram transfectadas com vetores pcDNA
3.1(+) que codificam um peptídeo sinal sintético de IG de camundongo fundido à GLA do tipo selvagem ou a variantes de GLA usando o método de lipofecção com o reagente LIPOFECTAMINE® 3000 (ThermoFisher
148 / 169 Scientific). As células HEK 293T foram cultivadas em meio de crescimento (DMEM com soro fetal bovino 10% [ambos da Corning]). 24 horas antes da transfecção, as células foram semeadas em uma placa NUNC® Edge 2.0 de 96 poços (ThermoFisher Scientific) nas densidades de 105 células/poço/250 µL em meio de crescimento, e incubadas a 37 ºC, CO2 5% em uma incubadora. As células foram incubadas por 24-72 horas a 37 ºC, CO2 5% para permitir a expressão e secreção de variantes de GLA. Meios condicionados (50-100 µL) das transfecções de HEK293T foram transferidos para placas pretas sólidas Corning de 96 poços (Corning) para análise de atividade e/ou estabilidade. HTP – Análise de sobrenadantes
[00212] A atividade de variantes de GLA foi determinada medindo-se a hidrólise de 4-metilumbeliferil α-D-galactopiranosídeo (MUGal). Para um ensaio sem desafio, 50 µL de meio condicionado para HEK 293T, produzido como descrito acima, foram misturados com 50 µL de MUGal 1 mM em Tampão McIlvaine (McIlvaine, J. Biol. Chem., 49:183-186 [1921]), pH 4,8, em uma placa de microtitulação de fundo preto opaco e 96 poços. As reações foram misturadas brevemente e incubadas a 37 ºC por 30-180 minutos, antes do arrefecimento rápido com 100 μL de carbonato de sódio 0,5 M, pH 10,2. A hidrólise foi analisada pela fluorescência monitorada usando um leitor de microplaca SPECTRAMAX® M2 (Ex. 355 nm, Em. 460 nm). Os resultados desse ensaio são apresentados na Tabela 2-1. Análise HTP de sobrenadantes pré-tratados com ácido
[00213] Variantes de GLA foram submetidas ao desafio com tampão ácido para simular o pH extremo pH que as variantes podem encontrar dentro dos lisossomos. Primeiramente, 50 µL de meio condicionado HEK 293T e 50 uL de tampão McIlvaine (pH 3,3-4,3) foram adicionados aos poços de uma placa de microtitulação com fundo redondo e 96 poços. As placas foram vedadas com selador térmico de microplacas PlateLoc® (Agilent), e
149 / 169 incubadas a 37 ºC por 1-2 h. Para o ensaio de desafio com pH 4, 50 µL de amostra submetida ao desafio com pH ácido foram misturados com 50 uL de MUGal 1 mM em tampão McIlvaine, pH 4,4. As reações foram misturadas brevemente e incubadas a 37 ºC por 30-180 minutos, antes do arrefecimento rápido com 100 μL de carbonato de sódio 0,5 M, pH 10,2. A hidrólise foi analisada pela fluorescência monitorada usando um leitor de microplaca SPECTRAMAX® M2 (Ex. 355 nm, Em. 460 nm). Os resultados desse ensaio são apresentados na Tabela 2-1. Análise HTP de sobrenadantes pré-tratados com base
[00214] Variantes de GLA foram submetidas ao desafio com tampão básico (neutro) para simular os pHs que as variantes encontram no sangue após a administração a um paciente. Primeiramente, 50 µL de meios condicionados HEK 293T para variantes GLA e 50 μL de tampão McIlvaine (pH 7,0-8,2) foram adicionados aos poços de uma placa de microtitulação com fundo redondo e 96 poços. As placas foram vedadas e incubadas a 37 ºC por 1-18 h. Para o ensaio de desafio com pH 7, 50 µL de amostra desafiada com pH básico foram misturados com 50 μL de MUGal 1 mM em tampão McIlvaine, pH 4,4. As reações foram misturadas brevemente e incubadas a 37 ºC por 30-180 minutos, antes do arrefecimento rápido com 100 μL de carbonato de sódio 0,5 M pH 10,2. A hidrólise foi analisada pela fluorescência monitorada usando um leitor de microplaca SPECTRAMAX® M2 (Ex. 355 nm, Em. 460 nm). Os resultados desse ensaio são apresentados na Tabela 2-1. Tabela 2-1. Atividade de variantes de GLA em relação a SEQ ID NO: 8 depois de Sem Desafio (Não desafiada) ou Desafio no pH indicado1 FIOPC de FIOPC de SEQ ID Diferenças de aminoácidos (Em FIOPC sem desafio com pH desafio com pH NO: (nt/aa) relação a SEQ ID NO: 8) Desafio 4 7 7/8 ++ ++ ++ 9/10 R44L/D247N/P337A ++ ++++ 11/12 R44L/K302Q ++ ++++ + 13/14 R44L/D247N/K302Q ++ ++++ 15/16 R217F/K373R ++++ + 17/18 I322M/P337A ++++ ++++ ++
150 / 169 FIOPC de FIOPC de SEQ ID Diferenças de aminoácidos (Em FIOPC sem desafio com pH desafio com pH NO: (nt/aa) relação a SEQ ID NO: 8) Desafio 4 7 19/20 R44L/D247N/K302Q/I322M ++ ++++ 21/22 K302Q/I322M/Q362K/K373R +++ ++++ + 23/24 I322M +++ +++ ++ 25/26 K302Q/P337A ++ +++ + 27/28 R44L/R217F/I322M +++ +++ ++ 29/30 R44L/D247N/I322M ++ +++ 31/32 R44L/P337A ++ +++ + 33/34 R44L/K373R ++ +++ + 35/36 R44L/D247N +++ +++ ++ 37/38 R217F/I322M +++ +++ + 39/40 R44L/R217F/D316L ++ +++ + 41/42 D247N/Q362K ++ +++ 43/44 R44L/R217F +++ +++ ++ 45/46 K373R ++ ++ + 47/48 D247N/I322M ++ ++ 49/50 R44L ++ ++ + 51/52 D316L ++ ++ + 53/54 R44L/D247N/Q362K ++ ++ 55/56 D316L/P337A ++ ++ 57/58 Q362K/K373R ++ + 59/60 R44L/R217F/I322M/P337A + 1Os níveis de atividade aumentada foram determinados em relação ao polipeptídeo de referência de SEQ ID NO: 8, e definidos como segue: “+” > 0,75; “++” > 0,9; “+++” > 1,1; e “++++” > 1,2.
Exemplo 3 Produção de variantes de GLA Produção de GLA em células HEK293T
[00215] A expressão secretada de variantes de GLA em células de mamíferos foi realizada por transfecção transitória de células HEK293 ou HEK293T. as células foram transfectadas com variantes de GLA (SEQ ID NOS: 3, 4, 9, 12, 17, 20, 23, e 41) fundidas a um peptídeo sinal sintético de mamífero N-terminal e subclonadas no vetor de expressão pLEV113 de mamíferos, como descrito no Exemplo 1. As células HEK293 foram transfectadas com DNA plasmidial e cultivadas em suspensão por 4 dias usando técnicas padrão conhecidas pelos versados no assunto. Os sobrenadantes foram coletados e armazenados a 4 ºC até que analisados. Exemplo 4 Purificação de variantes de GLA Purificação de variantes de GLA dos sobrenadantes de células de mamíferos
[00216] GLA WT (SEQ ID NO: 2) foi purificada do sobrenadante da
151 / 169 cultura de mamífero como descrito na literatura (Yasuda et al., Prot. Exp. Pur. 37:499-506 [2004]). Todas as outras variantes de GLA foram purificadas como segue. As variantes de GLA foram purificadas do sobrenadante da cultura de mamífero essencialmente como conhecido na técnica (Ver, Yasuda et al., Prot. Exp. Pur. 37:499-506 [2004]). Resina de concanavalina A (Sigma Aldrich) foi equilibrada com acetato de sódio 0,1 M, NaCl 0,1 M, MgCl2 1 mM, CaCl2 e MnCl2, pH 6,0 (Tampão de ligação à concanavalina A). O sobrenadante foi filtrado estéril com filtro na parte superior do frasco de 0,2 μm antes de ser carregado na coluna. Depois do carregamento, a coluna foi lavada com 10 volumes da coluna de tampão de ligação à Concanavalina A, e a proteína ligada foi eluída com tampão de ligação à Concanavalina A, suplementado com metil-α-D-manopiranosídeo 0,9 M e metil-α-D- glicopiranosídeo 0,9 M. A proteína eluída foi concentrada e o tampão trocado para o tampão de armazenamento (fosfato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 150 mM, detergente não iônico TWEEN®-20 185 μM, pH 6,0) usando uma unidade de filtração Amicon® Ultra 15mL contendo uma membrana com corte para peso molecular de 30 kDa (Millipore). A GLA no tampão de armazenamento foi filtrada estéril através de filtros de seringa de 0,2 μm ANOTOP® 0 (Whatman), e armazenada a -80 ºC. A purificação forneceu 2,4-50 μg de proteína purificada/ml de sobrenadante de cultura com base na quantificação com BCA. Quantificação da proteína pelo ensaio de proteína com BCA
[00217] Usou-se um ensaio de proteína com ácido bicinconínico (BCA) (Sigma Aldrich) para quantificar GLA purificada. Em uma placa de microtitulação, 25 uL de padrões de proteína e GLA purificada com diluição apropriada foram misturados com 200 uL do reagente de trabalho contendo 50 partes do reagente A BCA e 1 parte do reagente B BCA. A placa foi misturada bastante em um agitador de placa por 30 segundos e incubada a 37 ºC por 30 minutos. Depois que as placas resfriaram até a temperatura
152 / 169 ambiente, a absorbância das amostras foi medida a 562 nm usando um leitor de placas. Exemplo 5 Caracterização in vitro de variantes de GLA Termoestabilidade de variantes de GLA expressas em células HEK 293T
[00218] Variantes de GLA foram expostas a vários desafios com temperatura para avaliar a estabilidade global da enzima. Primeiramente, 50 µL de GLA e variantes de GLA purificadas e expressas em HEK 293T em 1X PBS, pH 6,2, foram adicionados aos poços de uma placa PCR de 96 poços (Biorad, HSP-9601). As placas foram vedadas e incubadas a 30-50 ºC por 1 hora usando o programa de gradiente de um termociclador. Para o ensaio, 25 µL do sobrenadante desafiado foram misturados com 25 μL de MUGal 1 mM em tampão McIlvaine, pH 4,4. As reações foram misturadas brevemente e incubadas a 37 ºC por 60 minutos, antes do arrefecimento rápido com 100 μL de carbonato de sódio 0,5 M, pH 10,2. A hidrólise foi analisada pela fluorescência monitorada usando um leitor de microplaca SPECTRAMAX® M2 (Ex. 355 nm, Em. 460 nm). O percentual de atividade residual foi calculado para incubações de 1 hora a temperaturas variando de 30 ºC a 50 ºC, dividindo a atividade de amostras desafiadas pela atividade de amostras não desafiadas, em que “não desafiada” é a hidrólise medida no tempo 0, e “desafiada” é a hidrólise medida em 1 hora na temperatura especificada para cada variante. Os resultados desse ensaio são mostrados na Tabela 5-1. A Figura 1 fornece um gráfico que mostra a atividade residual de variantes de GLA depois de incubação por 1 hora em várias temperaturas. Estabilidade do soro de variantes de GLA expressas em células HEK 293T
[00219] Para avaliar a estabilidade relativa de variantes na presença de sangue, amostras foram expostas a soro. Primeiramente, 100 µL de variantes de GLA purificadas 7,5 ug/mL em 1X PBS, pH 6,2, e 90 uL de soro humano foram adicionados aos poços de uma placa de fundo redondo COSTAR® com
153 / 169 96 poços (Corning). As placas foram vedadas e incubadas a 37 ºC por 0-24h. Para o ensaio, 50 µL de sobrenadante desafiado foram misturados com 50 μL de MUGal 1 mM em tampão McIlvaine, pH 4,4. As reações foram misturadas brevemente e incubadas a 37 ºC por 90 minutos, antes do arrefecimento rápido com 100 μL de carbonato de sódio 0,5 M, pH 10,2. A hidrólise foi analisada pela fluorescência monitorada usando um leitor de microplaca SPECTRAMAX® M2 (Ex. 355 nm, Em. 460 nm). O percentual da atividade residual no soro depois de 24 horas foi calculado dividindo a atividade de amostras desafiadas pela atividade de amostras não desafiadas, em que “não desafiada” é a hidrólise medida no tempo 0 e “desafiada” é a hidrólise medida nos momentos especificados para cada variante. Os resultados são mostrados na Tabela 5.1. A Figura 2 fornece um gráfico que mostra a atividade residual de variantes de GLA depois de um desafio com soro humano por 0-24 horas. Estabilidade lisossomal de variantes de GLA expressas em células HEK 293T
[00220] Para avaliar a estabilidade relativa de variantes na presença de proteases lisossomais e outros componentes lisossômicos, variantes de GLA foram expostas ao lisado lisossomal humano (XenoTech, no H0610.L), seguindo as instruções do fabricante com algumas modificações, como aqui descritas. Resumidamente, as variantes de GLA foram diluídas até uma faixa de concentração apropriada (0,0625-0,0078125 mM), e 10 μL das diluições foram combinados com 10 μL de uma diluição 1:20 de lisado lisossomal humano em 2x tampão catabólico (XenoTech, no K5200) em uma placa de fundo redondo COSTAR® de 96 poços (no 3798, Corning). As placas foram vedadas e incubadas a 37 ºC por 0-24h. Para o ensaio, 50 µL de sobrenadante desafiado foram misturados com 50 μL de MUGal 1 mM em tampão McIlvaine, pH 4,4. As reações foram misturadas brevemente e incubadas a 37 ºC por 90 minutos, antes do arrefecimento rápido com 100 μL de carbonato de sódio 0,5 M pH 10,2. A hidrólise foi analisada pela fluorescência monitorada usando um leitor de microplaca SPECTRAMAX® M2 (Ex. 355
154 / 169 nm, Em. 460 nm). O percentual da atividade residual no extrato lisossomal depois de 24 horas foi calculado dividindo a atividade de amostras desafiadas pela atividade de amostras não desafiadas, em que “não desafiada” é a hidrólise medida no tempo 0 e “desafiada” é a hidrólise medida em 4 e 24 horas para cada variante. Os resultados são fornecidos na Tabela 5.1. A Figura 3 fornece um gráfico que mostra a atividade residual de variantes de GLA depois do desafio com extrato lisossomal humano por 0 a 24 horas. Absorção celular em fibroblastos de Fabry de variantes de GLA purificadas, expressas em células HEK293T
[00221] A absorção celular de variantes de GLA, em comparação a uma enzima de referência (GLA WT [SEQ ID NO: 2]), foi determinada para avaliar a capacidade global das variantes de serem absorvidas pelas células cultivadas por endocitose. Fibroblastos de Fabry (GMO2775, Coriell Institute for Medical Research) foram semeados em placa de cultura com 12 poços (VWR, no 10861-698), contendo Meio Essencial Mínimo (MEM; Gibco no 11095-080, suplementado com aminoácidos não essenciais 1% (NEAA; Gibco no 11140-050) e soro fetal bovino 15% (Corning no 35-016-CV)), e deixadas crescer até a confluência (2-3 dias a 37 ºC, CO2 5%). Depois de atingida a confluência, MEM suplementado foi removido por vácuo estéril e substituído por MEM sem soro + NEAA 1% a 1 mL/poço. Enzimas purificadas, como descrito no Exemplo 4, foram adicionadas às células a 10 ug GLA/mL e deixadas incubar por 4 horas a 37 ºC, CO2 5%. O meio sem soro foi aspirado por vácuo estéril, as células foram lavadas brevemente com 1 mL 1x PBS/poço e o PBS aspirado por vácuo estéril. As células foram então tratadas com tripsina 0,25%-EDTA a 200 μL/poço (VWR no 02-0154-0100) e incubadas por ~5 minutos à temperatura ambiente para desalojar células aderentes à placa e degradar a GLA extracelular restante. Depois, 500 μL de MEM sem soro foram adicionados a cada poço, e as amostras transferidas para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. As amostras foram centrifugadas a
155 / 169
8000 RPM por 5 minutos até as células se aglomerarem em pellets.
O meio foi gentilmente aspirado com uma pipeta de 1000 μL.
Os pellets celulares foram ressuspensos em 500 μL de 1xPBS, voltaram a se aglomerar a 8000 RPM por 5 minutos, e o PBS foi gentilmente removido.
Depois, 100 μL de Tampão de Lise (tensoativo não iônico TRITON X-100™ 0,2% (Sigma no 93443) diluído em 1xPBS) foram adicionados a cada amostra, seguido por sonicação por 1-2 minutos, e centrifugação a 12.000-14.000 RPM por 10 minutos a 4 ºC.
O sobrenadante foi transferido para um tubo PCR estéril para ensaio de proteína e atividade.
Para o ensaio de atividade, 10 µL da amostra de lise celular foram misturados com 50 μL de MUGal 2,5 mM em tampão McIlvaine, pH 4,6. As placas de reação foram vedadas e incubadas a 37 ºC por 60 minutos, antes de arrefecer rapidamente a reação com 140 μL de carbonato de sódio 0,5 M, pH 10,2, por poço.
A hidrólise de MUGal foi determinada pela fluorescência monitorada usando um leitor de microplacas SPECTRAMAX® M2 (Ex. 355 nm, Em. 460 nm). Para quantificação da proteína, o ensaio de BCA foi realizado seguindo as instruções do fabricante (Pierce, no 23225) com as seguintes modificações: 10 μL de amostra de lise celular foram misturados com 190 μL de Reagente de Trabalho BCA, e as placas foram vedadas e incubadas a 37 ºC por 60 minutos.
As amostras foram analisadas usando um leitor de microplacas SPECTRAMAX® M2 que monitorava a absorbância (562 nm). As concentrações da proteína foram calculadas a partir da curva padrão de BSA.
A absorção celular de cada variante de GLA foi calculada primeiramente subtraindo a fluorescência não enzimática de fundo das células não tratadas de amostras tratadas com a enzima e, então, normalizando a concentração de proteína em cada poço.
FIPC da absorção celular foi calculado dividindo a atividade intracelular normalizada da variante de GLA pela atividade correspondente do controle (WT). A Figura 4 fornece um gráfico da absorção celular de variantes de GLA purificadas em fibroblastos cultivados de pacientes com doença de
156 / 169 Fabry, expressa como atividade relativa em comparação ao tipo selvagem (SEQ ID NO: 2), depois de 4 horas de incubação a 37 ºC. Tabela 5-1. Atividade relativa e absorção celular de variantes de GLA produzidas em células HEK293T1 Estabilidade Estabilidade do SEQ ID Diferenças de aminoácidos % atividade % atividade lisossomal % soro NO: (Em relação a SEQ ID NO: residual a 37 residual a 50 atividade % atividade (nt/aa) 8) ºC (1h) ºC (1h) residual em 24h residual em 24h 1/2 P10T/E39M/R44L/T47S/H9 + + 2Y/P166S/A206K/R217F/D2 47N/G261A/A271H/K302Q/ D316L/I322M/P337A/Q362 K/A368W/K373R/T392M 7/8 +++ ++++ +++ +++ 15/16 R217F/K373R +++ ++++ ++++ 57/58 Q362K/K373R +++ ++++ ++++ + 59/60 R44L/R217F/I322M/P337A +++ ++++ ++++ 39/40 R44L/R217F/D316L +++ ++++ ++++ 61/62 P166A/Q362K +++ ++++ ++++ +++ 1O percentual (%) de atividade residual a 35 ºC e 50 ºC, bem como o percentual (%) de estabilidade lisossomal e no soro foram determinados em relação a cada variante individual e definidos como segue: “+” > 50%; “++” >60%; “+++” > 80%; e “++++” >95%. A atividade residual para cada variante em 1 hora foi determinada, em relação à sua atividade no tempo 0.
Análise HTP da atividade de GLA em lisados de fibroblastos de Fabry
[00222] Variantes de GLA produzidas em HTP foram submetidas ao desafio de serem absorvidas por células e reterem a atividade durante 24 a 96 horas. Fibroblastos de Fabry (GMO2775, Coriell Institute for Medical Research) foram semeados e deixados crescer até a confluência ao longo de 24-72 horas. Depois de atingida a confluência, o meio foi removido usando um robô BioMek i5 para manuseio automático de líquidos. O meio condicionado de células HEK293T, transfectadas transitoriamente como descrito acima, foi adicionado aos fibroblastos de Fabry e as células deixadas incubar com as variantes de GLA por 2-4 horas a 37 ºC, CO2 5%. O meio condicionado contendo GLA foi removido com um robô BioMek i5 para manuseio automático de líquidos. Depois, as células foram lavadas brevemente com 150 μL de 1xDPBS /poço, e o DPBS foi removido com um robô BioMek i5 para manuseio automático de líquidos. Em seguida, 200 μL do meio de crescimento completo foram adicionados a cada poço, e as placas foram devolvidas à incubadora por 24-72 horas. Ao ser concluída a
157 / 169 incubação, o meio de crescimento completo foi removido com um robô BioMek i5 para manuseio automático de líquidos. As células foram lavadas com 150 μL de 1xDPBS /poço, e the DPBS foi removido com um robô BioMek i5 para manuseio automático de líquidos. As células foram lisadas pela adição de 50 μL de tampão McIlvaine, pH 4,4, suplementado com o tensoativo não iônico TRITON X-100™ 0,2% (Sigma no 93443)) e agitação à temperatura ambiente por 30 minutos. A atividade foi avaliada pela adição de 50 µL de MuGal 1,5 mM em tampão McIlvaine, pH 4,4. As placas foram vedadas e incubadas a 37 ºC por 360 minutos com agitação a 400 rpm, antes do arrefecimento rápido com 100 μL de carbonato de sódio 0,5 M, pH 10,2. A hidrólise foi analisada pela fluorescência monitorada usando um leitor de microplaca SPECTRAMAX® M2 (Ex. 355 nm, Em. 460 nm). O FIOPC da absorção celular foi calculado dividindo a atividade intracelular normalizada da variante de GLA pela atividade correspondente da sequência de referência. Análise HTP da depleção de globotriaosilceramida induzida por GLA em fibroblastos de Fabry
[00223] Variantes de GLA produzidas em HTP foram submetidas ao desafio de serem absorvidas por células e reduzirem a carga celular de globotriaosilceramida. Fibroblastos de Fabry (GMO2775, Coriell Institute for Medical Research) foram semeados e deixados crescer até a confluência ao longo de 24-72 horas. Depois de atingida a confluência, o meio foi removido usando um robô BioMek i5 para manuseio automático de líquidos. O meio condicionado produzido por células HEK293T, transfectadas transitoriamente como descrito acima, foi adicionado aos fibroblastos e deixado incubar por 2- 4 horas a 37 ºC, CO2 5%. O meio condicionado contendo GLA foi removido com um robô BioMek i5 para manuseio automático de líquidos. Depois, as células foram lavadas brevemente com 150 μL de 1xDPBS /poço, e o DPBS foi removido com um robô BioMek i5 para manuseio automático de líquidos. Em seguida, 200 μL do meio de crescimento completo foram adicionados a
158 / 169 cada poço, e as placas foram devolvidas à incubadora por 24-72 horas. Ao ser concluída a incubação, o meio de crescimento completo foi removido com um robô BioMek i5 para manuseio automático de líquidos. Depois, as células foram lavadas com 150 μL 1xDPBS /poço, e o DPBS foi removido com um robô BioMek i5 para manuseio automático de líquidos. Globotriaosilceramida foi extraída para 200 uL de metanol, suplementado com N-heptadecanoil- ceramida trihexosídeo 10 ng/mL por 30 minutos à temperatura ambiente com leve agitação. As extrações com metanol foram filtradas através de uma pilha de filtro hidrofóbico Millipore para placas de fundo redondo com 96 poços. A globotriaosilceramida celular foi quantificada essencialmente como conhecido na técnica (Ver, Provencal et al., Bioanal., 8:1793-1807 [2016]) por LC- MS/MS. A soma das integrações máximas para amostra de célula foi determinada e o FIOPC da globotriaosilceramida foi calculado dividindo a alteração em níveis de globotriaosilceramida das variantes de GLA normalizadas pela sequência de referência. Exemplo 6 Variantes de GLA derivadas da SEQ ID NO: 58
[00224] Nesse exemplo, são descritos experimentos conduzidos para avaliar a atividade de e a depuração de Gb3 por variantes de GLA em fibroblastos de Fabry. Nesse exemplo, usou-se a SEQ ID NO: 58 como a sequência de referência (ou seja, as diferenças de aminoácidos nas variantes são indicadas em relação a SEQ ID NO: 58, e os resultados do ensaio são relatados em relação aos resultados obtidos para SEQ ID NO: 58). Nesses experimentos, as variantes de GLA foram testadas quanto à atividade de MU- Gal sem pré-incubação, como descrito no Exemplo 5. As variantes foram também testadas quanto à depleção de Gb3 em fibroblastos de Fabry como descrito no Exemplo 5. Tabela 6-1. Desempenho relativo de variantes de GLA em condições de não desafio e na depleção de Gb2 em fibroblastos de Fabry (em relação a SEQ ID
159 / 169
NO:58)1 SEQ ID Diferenças de aminoácidos Não desafiada Depleção de Gb3 em NO: (nt/aa) (Em relação a SEQ ID NO: 58) FIOPC fibroblastos de Fabry 67/68 R7L/Y120H + + 69/70 R7L/F365V + 71/72 R7L/Q88A/Y120H/N305G/F365V ++ 73/74 R7L/N305G ++ + 75/76 Q88A ++ 77/78 D282N ++ + 79/80 Q299R/L300I ++ 81/82 Y120H ++ 83/84 R7L +++ + 85/86 R7L/N305G/F365V +++ 87/88 Y120H/Q299R/N305G +++ 89/90 R7L/E48D/Q68E/Y120H/D282N/Q299R +++ ++ 91/92 E48D +++ ++ 93/94 Q68E +++ ++ 95/96 R7L/D130E +++ ++ 97/98 P67T/F180G +++ 99/100 R7L/E48D/F180G +++ 101/102 F365V +++ 103/104 L300I +++ ++ 105/106 R7L/E48D/Q68E +++ ++ 107/108 E48D/F180G/D282N +++ 109/110 F180G +++ 111/112 Q299R/L300I/N305G/F365V +++ 113/114 D282N/F365V ++++ 115/116 E48D/D282N/N305G ++++ + 117/118 R7L/Q68E/F180G ++++ 119/120 N305G ++++ ++ 121/122 Q68E/Q299R/L300I ++++ ++ 123/124 R7L/E48D/D130E/D282N ++++ ++ 125/126 E48D/Q68E ++++ +++ 127/128 N305G/F365V ++++ 129/130 R7L/D282N ++++ + 131/132 R7L/Q68E/D130E/D282N/F365V ++++ ++ 133/134 E48D/D282N ++++ ++ 135/136 A206S ++ 137/138 K343D +++ 139/140 K343G ++ ++ 141/142 K96L ++ +++ 143/144 K96L/P312Q/K343G ++ 145/146 K96L/S273P + +++ 147/148 L158A/R162K/S273G ++ 149/150 L158R + 151/152 N91Q/S95E +++ 153/154 N91Q/S95E/K96L +++ 155/156 R162H/K343D + 157/158 R162K ++ +++ 159/160 R162K/S273P + +++ 161/162 R162S ++ +++ 163/164 R87K/K96I/H155N/S273P/K343G ++ 165/166 R87K/N91Q/S95E/K96L/A206S/K343G + 167/168 R87K/N91Q/S95E/K96L/L158A/R162K +++ 169/170 S273P +++ 171/172 S273P/K343G ++ 173/174 T47D ++ ++ 175/176 T47D/K343G + ++
160 / 169 SEQ ID Diferenças de aminoácidos Não desafiada Depleção de Gb3 em NO: (nt/aa) (Em relação a SEQ ID NO: 58) FIOPC fibroblastos de Fabry 177/178 T47D/R87K/S95E/K96L/L158R/R162H ++ 179/180 T47D/S273P ++ +++ 181/182 T47D/S95E +++ 183/184 W178G + 185/186 T389K + 187/188 F180T +++ 189/190 F365A ++++ 191/192 F180V ++++ 193/194 L158A + 195/196 F180L + 197/198 S370G ++ 199/200 L398S +++ 201/202 L397A ++ 203/204 A206K ++++ 205/206 P166K +++ 207/208 A271R + 209/210 D396G/L398T ++ 211/212 W178S + + 213/214 S314A + + 215/216 S71P ++ + 217/218 L394K + 219/220 Q181A + + 221/222 V345A ++ + 223/224 V93I + 225/226 F365Q ++ + 227/228 I336V ++ + 229/230 H92F + + 231/232 L398V +++ + 233/234 L398P +++ ++ 235/236 R301M ++++ ++ 237/238 P337R ++ ++ 239/240 S333G +++ ++ 241/242 L363Q ++++ ++ 243/244 T47V ++ 245/246 H92T ++++ ++ 247/248 S393V + ++ 249/250 D151L ++ 251/252 S333F ++++ ++ 253/254 L293P/Q391A ++ ++ 255/256 V345Q + ++ 257/258 E39V ++ 259/260 R217K ++ ++ 261/262 L398A +++ 1Todas as atividades foram determinadas em relação ao polipeptídeo de referência de SEQ ID NO:
58. Os níveis de atividade aumentada são definidos como segue: “+” = 0,9 a 1,1; “++” > 1,1; “+++” > 1,5; e “++++” > 2.
Exemplo 7 Variantes de GLA derivadas de SEQ ID NO: 158
[00225] Nesse exemplo, são descritos experimentos conduzidos para avaliar a atividade, estabilidade em pH 7,4 e atividade intracelular em fibroblastos de Fabry de variantes de GLA. Nesse exemplo, a sequência de
161 / 169 referência foi SEQ ID NO: 158 (ou seja, as diferenças de aminoácidos nas variantes são indicadas em relação a SEQ ID NO: 158, e os resultados do ensaio são relatados em relação aos resultados para SEQ ID NO: 158). As variantes de GLA foram testadas quanto à atividade de MU-Gal sem pré- incubação (não desafiada) e depois de pré-incubação em pH 7,4 como descrito no Exemplo 5. As variantes foram também testadas quanto à atividade de MU-Gal após a lise dos fibroblastos de Fabry incubados com variantes de GLA como descrito no Exemplo 5. Tabela 7-1. Desempenho relativo de variantes de GLA (em relação a SEQ ID NO: 158) Estabilidade Não SEQ ID Diferenças de aminoácidos Lisado depois de pré- desafiada NO: (nt/aa) (Em relação a SEQ ID NO: 158) FIOPC incubação em pH
FIOPC 7,4 FIOPC 263/264 E48D ++ + ++++ 265/266 E48D/Q68E + ++++ 267/268 E48D/Q68E/R217K/S333F/Q391A/S393V + ++++ 269/270 E48D/Q68E/S333F + ++++ 271/272 E48D/R217K + + ++++ 273/274 E48D/S333F ++++ 275/276 E48D/S333G + + ++++ 277/278 E48D/S393V + + +++ 279/280 E48D/V345Q/S393V +++ 281/282 Q68E + +++ 283/284 Q68E/V345Q ++ ++ ++++ 285/286 R217K/S333F + + +++ 287/288 R217K/S333G + + ++++ 289/290 S333F/V345Q + ++ ++ 291/292 S333G ++ ++ ++++ 293/294 D130E + D151L/A206S/D282N/P337R/K343D/V345Q/ 295/296 L398A ++ + 297/298 D130E/V345Q/S393V + 299/300 E39V/P337R/K343G/L398A + 301/302 T47V/D151L + + 303/304 T47V/D130E + + 305/306 T47V/K343D/V345Q/S393V + + 307/308 A206S/R217K + 309/310 P337R/K343G/V345Q/L398A + 311/312 D282N/S393V + 313/314 K343D + + 315/316 K343D/V345Q/S393V/L398A + 317/318 E39V/T47V/R217K + 319/320 A206S + 321/322 S393V/L398A + 323/324 E39V/D282N/P337R/L398A + + 325/326 D151L + 327/328 S393V + + 329/330 R217K/P337R/V345Q/L398A + +
162 / 169 Estabilidade Não SEQ ID Diferenças de aminoácidos Lisado depois de pré- desafiada NO: (nt/aa) (Em relação a SEQ ID NO: 158) FIOPC incubação em pH
FIOPC 7,4 FIOPC 331/332 D151L/D282N/S393V + + 333/334 E39V/S393V/L398A + + 335/336 L158R + 337/338 D151L/L158R/R217K/K343G/V345Q/S393V + ++ + 339/340 D130E/L158R + + 341/342 D151L/S393V + + 343/344 R217K + + + 345/346 D130E/L158R/S393V + ++ +++ 347/348 E39V/D151L + +++ 349/350 D151L/V345Q/S393V/L398A + ++ +++ 351/352 E39V/T47D ++ + ++++ 353/354 L158R/S393V ++ + ++++ 355/356 C59A/C143S + 357/358 A271N ++ 359/360 D202N ++++ 361/362 D24S/D202N + 363/364 S333N + 365/366 C143S/S333N + 367/368 C143S/A271N ++ +++ 369/370 C143S/E387N ++ ++ 1Todas as atividades foram determinadas em relação ao polipeptídeo de referência de SEQ ID NO:
158. Os níveis de atividade aumentada são definidos como segue: “+” = 0,9 a 1,1; “++” > 1,1; “+++” > 1,5; e “++++” > 2.5.
Exemplo 8 Variantes de GLA derivadas de SEQ ID NO: 372
[00226] Nesse exemplo, são descritos experimentos conduzidos para avaliar a atividade, estabilidade em pH 7,4, depuração de Gb3 e atividade intracelular em fibroblastos de Fabry de variantes de GLA. Nesse exemplo, a sequência de referência foi SEQ ID NO: 372 (ou seja, as diferenças de aminoácidos nas variantes são indicadas em relação a SEQ ID NO: 372 e os resultados do ensaio são relatados em relação aos resultados for SEQ ID NO: 372). Essas variantes foram testadas quanto à atividade de MU-Gal sem pré- incubação (“não desafiada”) e depois de pré-incubação em pH 7,4 como descrito no Exemplo 5. As variantes foram também testadas quanto à atividade de MU-Gal atividade em fibroblastos de Fabry incubados com variantes de GLA como descrito no Exemplo 5 (“Lisado FIOPC”). As variantes foram também testadas quanto à depleção de Gb3 em fibroblastos de Fabry depois de incubação com variantes de GLA como descrito no Exemplo 5 (“Gb3 FIOPC”).
163 / 169 Tabela 8-1. Desempenho relativo de variantes de GLA (Em relação a SEQ ID NO: 372) Estabilidade Não depois de pré- SEQ ID Diferenças de aminoácidos (Em Lisado Gb3 desafiada incubação em pH NO: (nt/aa) relação a SEQ ID NO: 372) FIOPC FIOPC FIOPC 7,4
FIOPC F217R/N247D/L316D/M322I/A33 375/376 7P/W368A + ++++ 377/378 H271A + + 379/380 H271A/L316D/M322I +++ ++ 381/382 H271A/Q302K/M322I +++ ++++ ++ 383/384 K206A/F217R/H271A/M392T ++ ++++ +++ + 385/386 L44R/K206A/A337P +++ +++ ++++ ++ L44R/N247D/A261G/Q302K/L31 387/388 6D ++ ++ L44R/N247D/A261G/Q302K/L31 389/390 6D/M322I ++ + + L44R/S47T/K206A/F217R/N247D 391/392 /H271A/M322I + ++++ ++++ L44R/S47T/N247D/M322I/W368 393/394 A +++ ++++ ++ 395/396 L44R/S47T/Q302K/L316D/M322I +++ ++++ +++ L44R/S47T/Y92H/K206A/F217R/ 397/398 L316D/M322I ++++ ++++ ++++ L44R/S47T/Y92H/N247D/A261G/ 399/400 H271A/L316D/A337P/W368A ++ + + L44R/Y92H/K206A/N247D/W368 401/402 A ++ + +++ ++ L89I/F217R/N247D/A261G/Q302 403/404 K/L316D ++ + 405/406 M39E/L44R/Y92H/F217R/M322I +++ + +++ M39E/L44R/Y92H/N247D/H271A 407/408 /Q302K ++ ++ + M39E/L44R/Y92H/R162M/N247 409/410 D/Q302K/L316D/M322I ++ + ++ 411/412 M39E/M322I +++ + ++ 413/414 M39E/N247D/H271A + + + + 415/416 M39E/N247D/H271A/L316D +++ +++ M39E/S47T/F217R/N247D/W368 417/418 A ++++ ++++ 419/420 M39E/S47T/N247D +++ + + M39E/S47T/Y92H/N247D/Q302K 421/422 /L316D/M322I + +++ + 423/424 M39E/Y92H/L316D/M322I + + ++ + M39E/Y92H/N247D/Q302K/L316 425/426 D/A337P/W368A ++++ ++++ + 427/428 N247D + ++++ + 433/434 N247D/H271A +++ ++ + 435/436 N247D/Q302K ++ ++++ ++ + 437/438 Q302K/M322I/W368A ++ + + 439/440 S47T/F217R/Q302K +++ +++ +++ 441/442 S47T/N247D ++ ++++ + 443/444 S47T/N247D/H271A +++ ++++ ++ 445/446 S47T/Y92H/N247D/H271A ++ ++ + + 447/448 T10P ++ ++ ++ ++ 449/450 T10P/A261G + + ++ 451/452 T10P/A337P/M392T ++ ++ + ++
164 / 169 Estabilidade Não depois de pré- SEQ ID Diferenças de aminoácidos (Em Lisado Gb3 desafiada incubação em pH NO: (nt/aa) relação a SEQ ID NO: 372) FIOPC FIOPC FIOPC 7,4
FIOPC 453/454 T10P/H271A/Q302K +++ ++++ ++ + T10P/K206A/A261G/H271A/L316 455/456 D + + ++ 457/458 T10P/K206A/F217R/H271A ++ ++++ ++++ 459/460 T10P/K206A/N247D ++++ ++++ ++++ 461/462 T10P/L316D/M322I +++ ++++ ++ + 463/464 T10P/L44R +++ + +++ ++ T10P/L44R/A261G/Q302K/L316 465/466 D ++ ++ + T10P/L44R/Q302K/A337P/W368 467/468 A ++++ ++++ ++++ T10P/L44R/S47T/A261G/Q302K/ 469/470 M322I/W368A +++ + +++ 471/472 T10P/L44R/S47T/Y92H/N247D + +++ +++ 473/474 T10P/L44R/Y92H/L316D/M322I ++++ +++ +++ 475/476 T10P/M39E/L44R/M322I +++ +++ + T10P/M39E/Y92H/K206A/F217R/ 477/478 H271A ++ +++ +++ 479/480 T10P/M39E/Y92H/N247D +++ +++ + T10P/M39E/Y92H/N247D/H271A 481/482 /L316D + +++ 483/484 T10P/Q302K ++ + +++ +++ 485/486 T10P/Q302K/L316D ++ +++ ++ + 487/488 T10P/Q302K/M322I/A337P +++ ++++ +++ ++ 489/490 T10P/S47T/F217R/M322I + +++ ++ + T10P/S47T/F217R/N247D/L316D/ 491/492 M392T +++ ++++ + 493/494 T10P/S47T/H271A +++ ++ ++ 495/496 T10P/W368A +++ ++ + 497/498 T10P/Y92H + + ++ T10P/Y92H/F217R/A261G/Q302 499/500 K/A337P ++ + ++ T10P/Y92H/K206A/F217R/N247 501/502 D + ++++ +++ + T10P/Y92H/K206A/N247D/L316 503/504 D/M322I/M392T + ++++ ++ T10P/Y92H/K206A/N247D/M322 505/506 I/W368A + ++++ +++ ++ 507/508 W368A + + 509/510 Y92H/F217R/H271A ++ + + 511/512 Y92H/H271A/A337P ++ + + 513/514 Y92H/L316D +++ + + 515/516 Y92H/N247D +++ ++ ++ 517/518 Y92H/N247D/H271A/M322I ++ ++ + + Y92H/N247D/Q302K/M322I/A33 519/520 7P + +++ + 521/522 Y92H/Q302K ++ ++ + 1Todas as atividades foram determinadas em relação ao polipeptídeo de referência de SEQ ID NO:
372. Os níveis de atividade aumentada são definidos como segue: “+” = 0,9 a 1,1; “++” > 1,1; “+++” > 1,5; e “++++” > 2.
Exemplo 9 Variantes de GLA derivadas de SEQ ID NO: 374
165 / 169
[00227] Nesse exemplo, são descritos experimentos conduzidos para determinar a atividade da variante de GLA pela análise da atividade enzimática depois de uma série ou de desafios independentes. Essas variantes de GLA foram testadas quanto à atividade MU-Gal sem pré-incubação e depois de pré-incubação em pH 7,4, como descrito no Exemplo 5. As variantes foram também testadas quanto à atividade de MU-Gal depois da lise de fibroblastos de Fabry incubados com variantes como descrito no Exemplo
5. As variantes foram também testadas quanto à depleção de Gb3 em fibroblastos de Fabry depois de incubação, como descrito no Exemplo 5. Tabela 9-1. Desempenho relativo de variantes de GLA (Em relação a SEQ ID NO: 374)1 Diferenças de aminoácidos Não SEQ ID NO: Estabilidade Lisado Depleção de (Em relação a SEQ ID NO: desafiada (nt/aa) FIOPC FIOPC Gb3 FIOPC 374) FIOPC P10T/E39M/R44L/T47S/P337 523/524 A + 525/526 P10T/R44L/H92Y ++ 527/528 R44L/T47S/P166S + 529/530 A206K/R217F ++ 531/532 E39M/T47S/H92Y/T392M + P10T/E39M/H92Y/W131G/P 533/534 166S/A271H/D316L/I322M + + E39M/T47S/R217F/D247N/A 535/536 368W + 537/538 H92Y/P166S/D247N + 539/540 H92Y/R217F + 541/542 P10T/A206K ++ 543/544 P10T/D316L/T392M ++ P10T/E39M/R44L/H92Y/P16 545/546 6S/G261A/D316L/I322M + P10T/E39M/R44L/H92Y/P16 547/548 6S/K302Q/I322M + P10T/E39M/R44L/H92Y/R21 549/550 7F/K302Q/I322M + P10T/E39M/R44L/T47S/D31 551/552 6L + P10T/E39M/R44L/T47S/H92 553/554 Y/A206K/R217F ++ 555/556 P10T/H92Y/K302Q/P337A + P10T/R44L/H92Y/R217F/D2 47N/A271H/K302Q/D316L/T 557/558 392M + P10T/R44L/T47S/P166S/A27 559/560 1H/I322M/A368W ++ P10T/R44L/T47S/R217F/A27 561/562 1H/D316L/I322M + 563/564 R44L/T47S/H92Y/T392M + 565/566 T47S/A271H ++
166 / 169 Diferenças de aminoácidos Não SEQ ID NO: Estabilidade Lisado Depleção de (Em relação a SEQ ID NO: desafiada (nt/aa) FIOPC FIOPC Gb3 FIOPC 374) FIOPC T47S/P166S/A206K/R217F/D 567/568 247N/P337A + E39M/R44L/P166S/A271H/P 569/570 337A/A368W/T392M + E39M/R44L/T47S/H92Y/P16 571/572 6S/A206K/T392M + 573/574 H92Y/A206K/I322M + P10T/E39M/R44L/H92Y/K30 575/576 2Q/I322M + 577/578 P10T/E39M/R44L/T392M + 579/580 R44L/T47S + 581/582 D247N/D316L + 583/584 D316L/P337A/T392M + 585/586 D52N/R217F/K302Q/D316L + H92Y/P166S/A206K/A271H/ 587/588 D316L + 589/590 P10T/G261A/P337A/T392M + P10T/K36M/H92Y/P166S/D2 591/592 47N/G261A/D316L/T392M ++ 593/594 H92Y/R217F/A271H/P337A ++ 595/596 P10T/A368W + P10T/E39M/H92Y/P166S/R2 597/598 17F/D247N/A271H + P10T/R44L/T47S/P166S/G26 599/600 1A/A271H + 601/602 R44L/D316L/I322M/T392M ++ E39M/R44L/T47S/A206K/P3 603/604 37A/A368W/T392M + ++ P10T/R44L/A206K/D316L/I3 605/606 22M + + 607/608 E39M/R44L/P166S/A271H ++ ++ 609/610 E39M/T47S/D247N ++ + 611/612 P10T/A206K/D247N/G261A +++ ++ P10T/E39M/R44L/H92Y/P16 613/614 6S/T392M + ++ 615/616 P10T/R44L/P166S/K302Q +++ ++ P10T/T47S/H92Y/A271H/K3 617/618 02Q + + 619/620 R44L/T47S/P166S/A271H ++ ++ E39M/R44L/T47S/H92Y/A20 621/622 6K/D247N/G261A +++ +++ ++ E39M/R44L/T47S/H92Y/A20 623/624 6K/T392M +++ ++++ +++ P10T/E39M/T47S/H92Y/P33 625/626 7A ++ +++ + P10T/H92Y/P166S/R217F/D2 627/628 47N/G261A/A271H ++ + 629/630 P10T/T47S/P166S/D316L + ++ P10T/T47S/H92Y/D316L/I32 631/632 2M/T392M ++ ++ 633/634 R217F/T392M ++ + E39M/P166S/R217F/G261A/ 635/636 D316L/A368W +++ +++ E39M/T47S/P166S/R217F/G2 637/638 61A/T392M ++ ++ P10T/E39M/H92Y/R217F/D3 639/640 16L +++ ++
167 / 169 Diferenças de aminoácidos Não SEQ ID NO: Estabilidade Lisado Depleção de (Em relação a SEQ ID NO: desafiada (nt/aa) FIOPC FIOPC Gb3 FIOPC 374) FIOPC 641/642 D316L/I322M/A368W + +++ ++ 643/644 H92Y/P166S/D316L + +++ +++ H92Y/P166S/R217F/D316L/P 645/646 337A/T392M + +++ +++ H92Y/P166S/R217F/G261A/ 647/648 A271H/T392M +++ +++ +++ 649/650 P10T/H92Y/D316L/I322M +++ ++++ +++ 651/652 P10T/H92Y/P166S + ++ +++ P10T/H92Y/P166S/P337A/A3 653/654 68W + ++ ++ 655/656 P10T/R217F/I322M + +++ +++ P10T/T47S/H92Y/P166S/A27 657/658 1H/D316L/P337A + +++ ++ 659/660 P10T/T47S/P166S/A271H ++ ++ ++ 661/662 P166S/D247N/A271H/D316L + ++ + 663/664 P166S/D316L/I322M/P337A + + + P166S/R217F/D316L/I322M/ 665/666 P337A + +++ ++ R44L/T47S/D247N/A271H/T 667/668 392M +++ +++ ++ 669/670 T47S/A206K +++ + +++ T47S/P166S/R217F/A271H/P 671/672 337A + + +++ R44L/T47S/H92Y/R217F/A2 673/674 71H ++ +++ +++ 675/676 H92Y/G261A/A271H +++ ++ ++ P10T/E39M/R44L/P166S/G2 677/678 61A/A271H/D316L/I322M + ++ +++ P10T/H92Y/P166S/G261A/A 679/680 271H/T392M +++ + +++ 681/682 T47S/R217F/D247N/G261A + +++ + 683/684 E39M/H92Y/G261A/K302Q +++ ++++ + + E39M/H92Y/P166S/R217F/T 685/686 392M +++ +++ +++ ++ 687/688 E39M/I322M +++ +++ ++ ++ E39M/R44L/H92Y/P166S/D2 689/690 47N/G261A/K302Q/P337A +++ ++++ + + 691/692 E39M/T392M + +++ ++ + E39M/T47S/H92Y/D316L/I3 693/694 22M + +++ + + 695/696 H92Y/A271H +++ ++++ ++++ +++ 697/698 P10T/E39M +++ +++ ++++ +++ 699/700 P10T/G261A ++ ++++ +++ ++ P10T/H92Y/P166S/G261A/D 701/702 316L/I322M/P337A ++ +++ +++ +++ 429/430 R44L/P337A + + + +++ R44L/T47S/H92Y/R217F/D3 431/432 16L/I322M/T392M +++ ++ +++ +++ 1Todas as atividades foram determinadas em relação ao polipeptídeo de referência de SEQ ID NO: 374. Os níveis de atividade aumentada são definidos como segue: “+” = 0,75-0,9; “++” > 0,9; “+++” > 1,1; e “++++” > 2.
Exemplo 10 Caracterização in vivo de variantes de GLA
[00228] As variantes de GLA foram caracterizadas in vivo quanto às
168 / 169 suas atividades frente à Gb3 acumulada.
Camundongos Fabry (fêmeas com 5 meses de idade; Jackson, estoque no 3535) e camundongos do tipo selvagem de idade/sexo correspondentes com background genético idêntico foram utilizados.
Os camundongos receberam uma única injeção IV através da veia da cauda com variantes da enzima Codexis (1,0 mg/kg). Os animais foram sacrificados usando anestesia de CO2 em momentos programados (1 e 2 semanas após a injeção), e tecidos relevantes para a doença (por exemplo, coração e rim) foram dissecados em duas porções (uma para o ensaio de atividade da enzima, a outra para quantificação de Gb3), congeladas em gelo seco e armazenadas a -80 ºC até a análise.
Para o ensaio da enzima, os tecidos dos camundongos foram homogeneizados em 20x volume (p/v) em Tampão de Lise (tensoativo não iônico TRITON X-100™ 0,2% (Sigma no 93443) diluído em 1xPBS), usando um pilão revestido de TEFLON® acionado por motor, em um homogeneizador de vidro.
Os lisados foram sonicados, centrifugados a 14.000 rpm por 15 minutos a 4 ºC, e os sobrenadantes usados para o ensaio da enzima.
A atividade de α-Gal A foi medida pelo ensaio fluorimétrico padrão que usa 4-metilumbeliferil-α-D-galactopiranosídeo em pH 4,4, na presença de N-acetilgalactosamina 0,1M (ou seja, um inibidor específico de α-galactosidase B). As concentrações proteicas foram medidas com o kit para ensaio de proteína com BCA (Pierce, no 23225). A atividade foi normalizada para a concentração de proteína e expressa em nmol/mg de proteína/hora.
As concentrações de Gb3 foram medidas por espectrometria de massa como descrita anteriormente (Ver, Durant et al., J.
Lipid Res., 52:1742- 6 [2011]). Resumidamente, os tecidos dos camundongos foram homogeneizados em 20x volume de água ultrapura gelada em um homogeneizador de vidro, e os lisados, correspondendo a 200 μg de proteína total, foram submetidos à extração de glicoesfingolipídios, saponificação e análise subsequente de Gb3 por espectrometria de massa.
A concentração de Gb3 foi expressa em ng/mg de proteína.
A Figura 5 fornece um gráfico que
169 / 169 mostra a atividade da enzima in vivo no coração, no modelo de camundongos Fabry, 1, 2 e 4 semanas após o tratamento.
A Figura 6 fornece um gráfico da degradação de Gb3 no tecido cardíaco em modelos de camundongo Fabry, 1 e 2 semanas após o tratamento em comparação a animais não tratados.

Claims (38)

1 / 10 REIVINDICAÇÕES
1. Alfa-galactosidase A recombinante e/ou fragmento de alfa- galactosidase A recombinante biologicamente ativo, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:8, 58, 158, 372 e/ou
374.
2. Alfa-galactosidase A recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita alfa-galactosidase recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 44, 44/217, 44/217/316, 44/217/322, 44/217/322/337, 44/247, 44/247/302, 44/247/302/322, 44/247/322, 44/247/337, 44/247/362, 44/302, 44/337, 44/373, 217/322, 217/373, 247/322, 247/362, 302/322/362/373, 302/337, 316, 316/337, 322, 322/337, 362/373 e 373, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência SEQ ID NO: 8.
3. Alfa-galactosidase A recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita alfa-galactosidase recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 8, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A
2 / 10 recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 10/39/44/47/92/166/206/217/247/261/271/302/316/322/337/362/368/373/392, 44/217/316, 44/217/322/337, 166/362, 217/373 e 362/373, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência SEQ ID NO: 8.
4. Alfa-galactosidase A recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita alfa-galactosidase recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO:58, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 7, 7/48/68, 7/48/68/120/282/299, 7/48/130/282, 7/48/180, 7/68/130/282/365, 7/68/180, 7/88/120/305/365, 7/120, 7/130, 7/282, 7/305, 7/305/365, 7/365, 39, 47, 47/87/95/96/158/162, 47/95, 47/273, 47/343, 48, 48/68, 48/180/282, 48/282, 48/282/305, 67/180, 68, 68/299/300, 71, 87/91/95/96/158/162, 87/91/95/96/206/343, 87/96/155/273/343, 88, 91/95, 91/95/96, 92, 93, 96, 96/273, 96/312/343, 120, 120/299/305, 151, 158, 158/162/273, 162, 162/273, 162/343, 166, 178, 180, 181, 206, 217, 271, 273, 273/343, 282, 282/365, 293/391, 299/300, 299/300/305/365, 300, 301, 305, 305/365, 314, 333, 336, 337, 343, 345, 363, 365, 370, 389, 393, 394, 396/398, 397 e 398, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência SEQ ID NO: 58.
5. Alfa-galactosidase A recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita alfa-galactosidase recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,
3 / 10 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 158, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 24/202, 39/47, 39/47/217, 39/151, 39/282/337/398, 39/337/343/398, 39/393/398, 47/130, 47/151, 47/343/345/393, 48, 48/68, 48/68/217/333/391/393, 48/68/333, 48/217, 48/333, 48/345/393, 48/393, 59/143, 68, 68/345, 130, 130/158, 130/158/393, 130/345/393, 143/271, 143/333, 143/387, 151, 151/158/217/343/345/393, 151/206/282/337/343/345/398, 151/282/393, 151/345/393/398, 151/393, 158, 158/393, 202, 206, 206/217, 217, 217/333, 217/337/345/398, 271, 282/393, 333, 333/345, 337/343/345/398, 343, 343/345/393/398, 393 e 393/398, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência SEQ ID NO:
158.
6. Alfa-galactosidase A recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita alfa-galactosidase recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO: 372, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 10, 10/39/44/322, 10/39/92/206/217/271, 10/39/92/247, 10/39/92/247/271/316, 10/44, 10/44/47/92/247, 10/44/47/261/302/322/368, 10/44/92/316/322, 10/44/261/302/316, 10/44/302/337/368, 10/47/217/247/316/392, 10/47/217/322, 10/47/271, 10/92, 10/92/206/217/247, 10/92/206/247/316/322/392, 10/92/206/247/322/368, 10/92/217/261/302/337, 10/206/217/271, 10/206/247, 10/206/261/271/316, 10/261, 10/271/302, 10/302, 10/302/316, 10/302/322/337, 10/316/322, 10/337/392, 10/368,
4 / 10 39/44/92/162/247/302/316/322, 39/44/92/217/322, 39/44/92/247/271/302, 39/47/92/247/302/316/322, 39/47/217/247/368, 39/47/247, 39/92/247/302/316/337/368, 39/92/316/322, 39/247/271, 39/247/271/316, 39/322, 44/47/92/206/217/316/322, 44/47/92/247/261/271/316/337/368, 44/47/206/217/247/271/322, 44/47/247/322/368, 44/47/302/316/322, 44/92/206/247/368, 44/206/337, 44/247/261/302/316, 44/247/261/302/316/322, 47/92/247/271, 47/217/302, 47/247, 47/247/271, 89/217/247/261/302/316, 92/217/271, 92/247, 92/247/271/322, 92/247/302/322/337, 92/271/337, 92/302, 92/316, 206/217/271/392, 217/247/316/322/337/368, 247, 247/271, 247/302, 271, 271/302/322, 271/316/322, 302/322/368 e 368, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência SEQ ID NO:
372.
7. Alfa-galactosidase A recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita alfa-galactosidase recombinante compreende uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com SEQ ID NO:374, ou um fragmento funcional da mesma, e em que a dita alfa-galactosidase A recombinante compreende pelo menos uma substituição ou conjunto de substituições em uma ou mais posições selecionadas dentre 10/36/92/166/247/261/316/392, 10/39, 10/39/44/47/92/206/217, 10/39/44/47/316, 10/39/44/47/337, 10/39/44/92/166/261/316/322, 10/39/44/92/166/302/322, 10/39/44/92/166/392, 10/39/44/92/217/302/322, 10/39/44/92/302/322, 10/39/44/166/261/271/316/322, 10/39/44/392, 10/39/47/92/337, 10/39/92/131/166/271/316/322, 10/39/92/166/217/247/271, 10/39/92/217/316, 10/44/47/166/261/271, 10/44/47/166/271/322/368, 10/44/47/217/271/316/322, 10/44/92, 10/44/92/217/247/271/302/316/392, 10/44/166/302, 10/44/206/316/322, 10/47/92/166/271/316/337,
5 / 10 10/47/92/271/302, 10/47/92/316/322/392, 10/47/166/271, 10/47/166/316, 10/92/166, 10/92/166/217/247/261/271, 10/92/166/261/271/392, 10/92/166/261/316/322/337, 10/92/166/337/368, 10/92/302/337, 10/92/316/322, 10/206, 10/206/247/261, 10/217/322, 10/261, 10/261/337/392, 10/316/392, 10/368, 39/44/47/92/166/206/392, 39/44/47/92/206/247/261, 39/44/47/92/206/392, 39/44/47/206/337/368/392, 39/44/92/166/247/261/302/337, 39/44/166/271, 39/44/166/271/337/368/392, 39/47/92/316/322, 39/47/92/392, 39/47/166/217/261/392, 39/47/217/247/368, 39/47/247, 39/92/166/217/392, 39/92/261/302, 39/166/217/261/316/368, 39/322, 39/392, 44/47, 44/47/92/217/271, 44/47/92/217/316/322/392, 44/47/92/392, 44/47/166, 44/47/166/271, 44/47/247/271/392, 44/316/322/392, 44/337, 47/166/206/217/247/337, 47/166/217/271/337, 47/206, 47/217/247/261, 47/271, 52/217/302/316, 92/166/206/271/316, 92/166/217/261/271/392, 92/166/217/316/337/392, 92/166/247, 92/166/316, 92/206/322, 92/217, 92/217/271/337, 92/261/271, 92/271, 166/217/316/322/337, 166/247/271/316, 166/316/322/337, 206/217, 217/392, 247/316, 316/322/368 e 316/337/392, em que as posições de aminoácidos da dita sequência polipeptídica são numeradas tendo como referência SEQ ID NO: 374.
8. Alfa-galactosidase A recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita alfa-galactosidase A compreende pelo menos uma mutação em pelo menos uma posição como provido nas Tabelas 2.1, 5.1, 6.1, 7.1, 8.1 e/ou 9.1.
9. Alfa-galactosidase A recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a dita alfa- galactosidase A recombinante é derivada de alfa-galactosidase A humana.
10. Alfa-galactosidase A recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência polipeptídica de SEQ ID NO:8, 58, 158, 372 e/ou 374.
6 / 10
11. Alfa-galactosidase A recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a dita alfa-galactosidase A recombinante é mais termoestável que a alfa- galactosidase A de SEQ ID NO:2.
12. Alfa-galactosidase A recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a dita alfa-galactosidase A recombinante é mais estável em pH 7 que a alfa- galactosidase A de SEQ ID NO:2.
13. Alfa-galactosidase A recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que a dita alfa-galactosidase A recombinante é mais estável em pH 4 que a alfa- galactosidase A de SEQ ID NO:2.
14. Alfa-galactosidase A recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que a dita alfa-galactosidase A recombinante é mais estável à exposição ao soro que a alfa-galactosidase A de SEQ ID NO:2.
15. Alfa-galactosidase A recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que a dita alfa-galactosidase A recombinante é mais estável aos lisossomos que a alfa- galactosidase A de SEQ ID NO:2.
16. Alfa-galactosidase A recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que a dita alfa-galactosidase A recombinante é absorvida mais prontamente pelas células que a alfa-galactosidase A de SEQ ID NO: 2.
17. Alfa-galactosidase A recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que a dita alfa-galactosidase A recombinante provoca mais depleção de globotriaosilceramida das células que a alfa-galactosidase A de SEQ ID NO:
2.
7 / 10
18. Alfa-galactosidase A recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que a dita alfa-galactosidase A recombinante é purificada.
19. Alfa-galactosidase A recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que a dita alfa-galactosidase A recombinante exibe pelo menos uma propriedade melhorada selecionada dentre: i) atividade catalítica aprimorada; ii) tolerância aumentada a pH 7; iii) tolerância aumentada a pH 4; iv) tolerância aumentada ao soro; v) absorção aumentada nas células; vi) depleção aumentada de globotriaosilceramida das células; vii) imunogenicidade reduzida; ou uma combinação de qualquer um dentre i), ii), iii), iv), v), vi), e/ou vii), em comparação a uma sequência de referência.
20. Alfa-galactosidase A recombinante de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que a dita sequência de referência é selecionada dentre SEQ ID NO: 2, 8, 58, 158, 372 e 374.
21. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma alfa-galactosidase A recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 20.
22. Sequência de polinucleotídeo recombinante, caracterizada pelo fato de que codifica pelo menos uma alfa-galactosidase A recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 21.
23. Sequência de polinucleotídeo recombinante de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a dita sequência de polinucleotídeo é selecionada dentre DNA, RNA e mRNA.
24. Sequência de polinucleotídeo recombinante de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a dita sequência de polinucleotídeo é uma sequência com códons otimizados.
8 / 10
25. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de polinucleotídeo recombinante como definida na reivindicação 22 ou 24.
26. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a dita sequência de polinucleotídeo recombinante é operacionalmente ligada a uma ou mais sequências de controle.
27. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a dita sequência de controle é um promotor.
28. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o dito promotor é um promotor heterólogo.
29. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor de expressão como definido em qualquer uma das reivindicações 25 a 28.
30. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que a dita célula hospedeira é selecionada dentre eucarióticas e procarióticas.
31. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizada pelo fato de que a dita célula hospedeira é uma célula de mamífero.
32. Método para produzir uma variante de alfa-galactosidase A, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a dita célula hospedeira como definida em qualquer uma das reivindicações 29 a 31, sob condições em que a dita alfa-galactosidase A codificada pelo dito polinucleotídeo recombinante seja produzida.
33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de recuperar a dita alfa- galactosidase A.
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34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de purificar a dita alfa- galactosidase A.
35. Composição farmacêutica para o tratamento de doença de Fabry, caracterizada pelo fato de que compreende a composição como definida na reivindicação 21.
36. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um carreador e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
37. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 35 ou 36, caracterizada pelo fato de que a dita composição é adequada para injeção ou infusão parenteral em um humano.
38. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 22 a 24.
39. Método para tratar e/ou prevenir os sintomas da doença de Fabry em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende prover um indivíduo tendo a doença de Fabry e prover a composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 35 a 38 ao dito indivíduo.
40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que os ditos sintomas da doença de Fabry são aliviados.
41. Método de acordo com a reivindicação 39 ou 40, caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo pode comer uma dieta que é menos restrita em seu teor de gordura que as dietas exigidas por indivíduos que exibem os sintomas da doença de Fabry.
42. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 41, caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo é um lactente ou criança.
10 / 10
43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 41, caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo é um adulto ou jovem adulto.
44. Uso das composições, caracterizado pelo fato de que as composições são como definidas em qualquer uma das reivindicações 21, 35 a
38.
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