BR112020010192A2

BR112020010192A2 - tratamento terapêutico de câncer de mama com base no status de c-maf

Info

Publication number: BR112020010192A2
Application number: BR112020010192-3A
Authority: BR
Inventors: Walter Martin GREGORY; Juan Carlos TERCERO; Robert E. Coleman; Roger Gomis
Original assignee: Inbiomotion S.L.
Priority date: 2017-11-22
Filing date: 2018-11-21
Publication date: 2020-10-13
Also published as: US20240000816A1; WO2019102380A1; AU2018372762A1; US11654153B2; CA3082728A1; US12233077B2; EP3713581A1; JP2021504339A; MX2020005182A; WO2019102380A8; CN111565725A; US20210137952A1; KR20200104298A

Abstract

A presente invenção refere-se ao projeto de uma terapia personalizada para um objeto com câncer de mama com base no nível de expressão de c-MAF e no status menopáusico do objeto. Em algumas modalidades, a terapia personalizada compreende um agente para evitar, tratar ou prevenir a degradação óssea. Em algumas modalidades, o agente para evitar, tratar ou prevenir a degradação óssea é o ácido zoledrônico.

Description

“TRATAMENTO TERAPÊUTICO DE CÂNCER DE MAMA COM BASE NO STATUS DE C-MAF” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório U.S. No.

62/589.630, depositado em 22 de novembro de 2017, que é incorporado aqui por referência na sua totalidade.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] O conteúdo da listagem de sequências submetida eletronicamente ("3190_017PC01_ST25", 58.721 bytes, criada em 8 de novembro de 2018) depositada com o pedido é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo de Invenção

[003] A presente invenção refere-se ao projeto de uma terapia personalizada para um objeto tendo câncer de mama, em que a terapia personalizada é selecionada com base no nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação, ganho ou translocação. Em algumas modalidades, a terapia personalizada compreende um agente para evitar, tratar ou prevenir a remodelação óssea. Em algumas modalidades, o agente para evitar, tratar ou prevenir a remodelação óssea é ácido zoledrônico, denosumabe ou clodronato.

Técnica de Fundamentos

[004] O câncer de mama é o segundo tipo mais comum de câncer no mundo (10,4%; após câncer de pulmão) e a quinta causa mais comum de morte por câncer (após câncer de pulmão, câncer de estômago, câncer de fígado e câncer de cólon).

Entre as mulheres, o câncer de mama é a causa mais comum de morte por câncer.

Em 2005, o câncer de mama causou 502.000 mortes em todo o mundo (7% das mortes por câncer; quase 1% de todas as mortes). O número de casos em todo o mundo aumentou significativamente a partir da década de 1970, um fenômeno que se deve em parte ao estilo de vida moderno no mundo ocidental.

[005] O fato de a maioria dos pacientes com câncer de tumor sólido morrer após metástase significa que é crucial entender os mecanismos moleculares e celulares que permitem a metástase de um tumor. Publicações recentes demonstraram como a metástase é causada por meio de mecanismos complexos, ainda que pouco conhecidos, e também como os diferentes tipos de células metastáticas têm um tropismo em relação a órgãos específicos. Essas células metastáticas específicas de tecido têm uma série de funções adquiridas, permitindo colonizar órgãos específicos.

[006] Todas as células têm receptores em sua superfície, em seu citoplasma e no núcleo celular. Certos mensageiros químicos, como hormônios, se ligam aos referidos receptores e isso causa alterações na célula. Existem células de câncer de mama: receptor de estrogênio (ER), receptor de progesterona (PR) e HER2/neue três receptores significativos que podem afetar. Com o objetivo de nomear as células que possuem um desses receptores, um sinal positivo é colocado quando o receptor está presente e um sinal negativo se ele estiver ausente: ER positivo (ER+), ER negativo (ER-), PR positivo (PR+), PR negativo (PR-), HER2 positivo (HER2+) e HER2 negativo (HER2-). O estado do receptor tornou-se uma avaliação crítica para todos os cânceres de mama, uma vez que determina a adequação do uso de tratamentos específicos, por exemplo, tamoxifeno ou trastuzumabe.

[007] O perfil de matriz de expressão gênica não supervisionada forneceu evidências biológicas para a heterogeneidade do câncer de mama através da identificação de subtipos intrínsecos como luminal A, luminal B, HER2+/ER e o subtipo basal.

[008] Os cânceres triplo-negativos são definidos como tumores que não expressam os genes do receptor de estrogênio (ER), receptor de progesterona (PR) ou HER2. Esse subgrupo é responsável por 15% de todos os tipos de câncer de mama e por uma porcentagem maior de câncer de mama que ocorre em mulheres africanas e afro-americanas na pré-menopausa. Os cânceres de mama triplo- negativos têm um padrão de recaída muito diferente dos cânceres de mama positivos para o receptor de estrogênio: o risco de recaída é muito maior nos primeiros 3-5 anos, mas cai acentuada e substancialmente abaixo do câncer de mama positivo para Receptor de Estrogênio depois disso.

[009] O subtipo basal é caracterizado pela baixa expressão de ambos os grupos de genes ER e HER2, de modo que ele geralmente é ER negativo, PR negativo e HER2 negativo em testes clínicos; por esse motivo, é frequentemente chamado de câncer de mama "triplo-negativo" (Breast Cancer Research 2007, 9 (Suppl 1): S13). Cânceres do tipo basal expressam genes geralmente encontrados em células "basais"/mioepiteliais da mama normal, incluindo citoqueratinas de alto peso molecular (5/6, 14 e 17), P-caderina, caveolinas 1 e 2, nestina, receptor αB de fator de crescimento cristalino e epidérmico (Reis-Fiho J. et al., http://www.uscap.org/site~/98th/pdf/companion03h03.pdf).

[010] Dado que, não existe uma definição internacionalmente aceita para câncer de mama do tipo basal, não é de surpreender que tenha havido muita confusão sobre se os cânceres de mama triplo-negativo e do tipo basal são sinônimos. Embora vários grupos tenham usado esses termos de forma intercambiável, deve-se notar que nem todos os cânceres do tipo basal carecem de ER, PR e HER2 e nem todos os cânceres triplo-negativos exibem um fenótipo do tipo basal. A grande maioria dos cânceres triplo-negativos é de fenótipo basal. Da mesma forma, a grande maioria dos tumores que expressam marcadores 'basais' é triplo-negativos. Deve-se notar, no entanto, que existe um número significativo de cânceres triplo-negativos que não expressam marcadores basais e um subgrupo pequeno, mas ainda significativo, de câncer do tipo basal que expressa receptores hormonais ou HER2. Bertucci et al. (Int J Cancer. 01 de julho de 2008; 123 (1): 236-

40) abordaram essa questão diretamente e confirmaram que nem todos os tumores triplo-negativos, quando analisados por perfis de expressão gênica, foram classificados como câncer do tipo basal (ou seja, apenas 71% eram de fenótipo basal) e nem todos os carcinomas basais classificados por matrizes de expressão exibiam um fenótipo triplo-negativo (77%).

[011] O pilar para o tratamento do câncer de mama é a cirurgia quando o tumor é localizado com uma possível terapia hormonal adjuvante (com tamoxifeno ou um inibidor da aromatase), quimioterapia e/ou radioterapia. Atualmente, as sugestões de tratamento após a cirurgia (terapia adjuvante) seguem um padrão.

Esse padrão está submetido a alterações porque a cada dois anos ocorre uma conferência mundial em St. Gallen, na Suíça, para discutir os resultados reais dos estudos multicêntricos mundiais. Da mesma forma, o referido padrão também é revisado de acordo com o critério de consenso do Instituto Nacional de Saúde (NIH).

Com base nesses critérios, mais de 85-90% dos pacientes que não apresentavam metástase nos linfonodos seriam candidatos a receber terapia sistêmica adjuvante.

[012] Atualmente, ensaios de PCR tal como Oncotype DX ou ensaios de micromatriz como MammaPrint podem prever o risco de recaída do câncer de mama com base na expressão de genes específicos. Em fevereiro de 2007, o ensaio MammaPrint se tornou o primeiro indicador de câncer de mama a obter autorização oficial da Food and Drug Administration.

[013] O Pedido de Patente No. EP1961825-A1 descreve um método para prever a ocorrência de metástase de câncer de mama no osso, pulmão, fígado ou cérebro, que compreende determinar em uma amostra de tecido tumoral o nível de expressão de um ou mais marcadores em relação ao seu nível de expressão correspondente em uma amostra de controle, entre as quais incluem c-MAF. No entanto, este documento requer a determinação de vários genes simultaneamente para permitir determinar a sobrevida de pacientes com câncer de mama, e a correlação entre as capacidades da assinatura do gene para prever a capacidade de sobrevida livre de metástases ósseas não foi estatisticamente significativa.

[014] A Publicação de Patente U.S. No. 2011/0150979 refere-se a um método para prever um prognóstico de um câncer de mama basal semelhante, compreendendo detectar o nível de FOXC1.

[015] A Publicação de Patente U.S. No. 2010/0210738 refere-se a um método para prognóstico de câncer em um indivíduo com câncer de mama triplo- negativo, compreendendo a detecção em uma amostra dos níveis de expressão de uma série de genes que são aleatoriamente regulados para cima ou para baixo.

[016] Publicação de patente U.S. Publ. 2011/0130296 refere-se à identificação de genes marcadores úteis no diagnóstico e prognóstico do câncer de mama triplo-negativo.

[017] É necessário identificar subconjuntos de pacientes com câncer de mama que se beneficiarão de tratamentos específicos e, inversamente, subconjuntos de pacientes com câncer de mama que não se beneficiarão ou serão potencialmente prejudicados por tratamentos específicos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[018] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para tratar um objeto tendo câncer de mama, compreendendo administrar cerca de 1 mg a cerca de 10 mg de ácido zoledrônico ao objeto, em que o objeto foi identificado como tendo um nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho não aumentado em uma amostra de tumor em relação a uma amostra de controle.

[019] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um método para tratar um objeto tendo câncer de mama, compreendendo: (i) quantificar o nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, e (ii) comparar o nível de expressão, número de cópias,

amplificação ou ganho obtido em (i) com um valor de referência, em que se o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado em relação ao referido valor de referência, então o referido objeto é administrado com cerca de 1 mg a cerca de 10 mg de ácido zoledrônico.

[020] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um método para tratar um objeto tendo câncer de mama, compreendendo quantificar o nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, em que se o nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado, então, o referido objeto é administrado com cerca de 1 mg a cerca de 10 mg de ácido zoledrônico. Em outra modalidade, o objeto é administrado com cerca de 4 mg de ácido zoledrônico.

[021] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um método para identificar um objeto tendo câncer de mama que se beneficiará do tratamento com ácido zoledrônico, compreendendo: (i) quantificar o nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, e (ii) comparar o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho obtido em (i) com um valor de referência, em que se o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado em relação ao referido valor de referência, então o referido objeto é administrado com cerca de 1 mg a cerca de 10 mg de ácido zoledrônico. Em outra modalidade, o objeto é administrado com cerca de 4 mg de ácido zoledrônico.

[022] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um método para identificar um objeto tendo câncer de mama que se beneficiará do tratamento com ácido zoledrônico, compreendendo: (i) quantificar o nível de expressão de c- MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, em que se o nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado, então o referido objeto é administrado com cerca de 1 mg a cerca de 10 mg de ácido zoledrônico. Em outra modalidade, o objeto é administrado com cerca de 4 mg de ácido zoledrônico.

[023] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um método in vitro para designar uma terapia personalizada para um objeto tendo câncer de mama que compreende: (i) quantificar o nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, e (ii) comparar o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho obtido em (i) com um valor de referência, em que se o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado em relação ao referido valor de referência, então o referido objeto é suscetível a receber cerca de 1 mg a cerca de 10 mg de ácido zoledrônico. Em outra modalidade, o objeto é administrado com cerca de 4 mg de ácido zoledrônico.

[024] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um método para tratar um objeto tendo câncer de mama, compreendendo administrar clodronato a uma dose de cerca de 1000 mg a cerca de 2000 mg cerca de uma vez por dia, em que o objeto foi identificado como tendo um nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho não aumentado em uma amostra de tumor em relação a uma amostra de controle.

[025] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um método para tratar um objeto tendo câncer de mama, compreendendo: (i) quantificar o nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, e (ii) comparar o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho obtido em (i) com um valor de referência, em que se o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado em relação ao referido valor de referência, então o referido objeto é administrado com clodronato a uma dose de cerca de 1000 mg a cerca de 2000 mg cerca de uma vez por dia.

[026] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um método para tratar um objeto tendo câncer de mama, compreendendo quantificar o nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, em que se o nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado, então, o referido objeto é administrado com clodronato a uma dose de cerca de 1000 mg a cerca de 2000 mg, cerca de uma vez por dia.

[027] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um método para identificar um objeto tendo câncer de mama que se beneficiará do tratamento com clodronato, compreendendo: (i) quantificar o nível de expressão gênica de c- MAF, número de cópias, amplificação, ou ganho em uma amostra do referido objeto, e (ii) comparar o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho obtido em (i) com um valor de referência, em que se o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado em relação ao referido valor de referência, então o referido objeto é administrado com clodronato a uma dose de cerca de 1000 mg a cerca de 2000 mg cerca de uma vez por dia.

[028] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um método para identificar um paciente com câncer de mama que se beneficiará do tratamento com clodronato, compreendendo quantificar o nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, em que se o nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado, então o referido objeto é administrado com clodronato a uma dose de cerca de 1000 a cerca de 2000 mg cerca de uma vez por dia.

[029] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um método in vitro para designar uma terapia personalizada para um objeto tendo câncer de mama, compreendendo: (i) quantificar o nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, e (ii)

comparar o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho obtido em (i) com um valor de referência, em que se o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado em relação ao referido valor de referência, então o objeto é suscetível a receber clodronato a uma dose de cerca de 1000 mg a cerca de 2000 mg cerca de uma vez por dia.

[030] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um método para tratar um objeto tendo câncer de mama, compreendendo administrar denosumabe em uma dose de cerca de 10 mg a cerca de 300 mg, em que o objeto foi identificado como tendo um nível de expressão de MAF, número de cópias, amplificação ou ganho não aumentado em uma amostra de tumor em relação a uma amostra de controle.

[031] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um método para tratar um objeto tendo câncer de mama, compreendendo: (i) quantificar o nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, e (ii) comparar o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho obtido em (i) com um valor de referência, em que se o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado em relação ao referido valor de referência, então o referido objeto é administrado com denosumabe a uma dose de cerca de 10 mg a cerca de 300 mg.

[032] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um método para tratar um objeto tendo câncer de mama, compreendendo quantificar o nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, em que se o nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado, então, o referido objeto é administrado com denosumabe a uma dose de cerca de 10 mg a cerca de 300 mg.

[033] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um método para identificar um objeto tendo câncer de mama que se beneficiará do tratamento com denosumabe, compreendendo: (i) quantificar o nível de expressão gênica de c- MAF, número de cópias, amplificação, ou ganho em uma amostra do referido objeto, e (ii) comparar o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho obtido em (i) com um valor de referência, em que se o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado em relação ao referido valor de referência, então o referido objeto é administrado com denosumabe a uma dose de cerca de 10 mg a cerca de 300 mg.

[034] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um método para identificar um objeto tendo câncer de mama que se beneficiará do tratamento com denosumabe, compreendendo quantificar o nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, em que se o nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado, então o referido objeto é administrado com denosumabe a uma dose de cerca de 10 mg a cerca de 300 mg.

[035] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um método in vitro para designar uma terapia personalizada para um objeto tendo câncer de mama, compreendendo: (i) quantificar o nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, e (ii) comparar o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho obtido em (i) com um valor de referência, em que se o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado em relação ao referido valor de referência, então o referido objeto é suscetível a receber denosumabe a uma dose de cerca de 10 mg a cerca de 300 mg.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[036] Figura 1. Visão geral dos parâmetros do ensaio.

[037] Figura 2. Desenho da triagem AZURE.

[038] Figura 3. Análise de H&E de amostras AZURE. Amostras avaliáveis e não avaliáveis são indicadas.

[039] Figuras 4A-4B. Taxa de positividade de MAF.

[040] Figura 5. Dados FISH otimizados para corte de MAF. Um aumento acentuado no gráfico do corte indica que o valor de MAF FISH é realmente um evento de limite. Além disso, o corte predefinido está próximo do corte otimizado.

[041] Figura 6. Risco de recorrência óssea com base no valor de MAF FISH.

[042] Figura 7. Tempo de recorrência óssea pelo valor de MAF FISH usando um corte ósseo otimizado de 2,3.

[043] Figura 8. Porcentagem de IDFS por FISH. Foi utilizado um corte ideal de 2,2.

[044] Figura 9. Sobrevida geral por FISH. Foi utilizado um corte ideal de 2,2.

[045] Figura 10. Tempo de recorrência óssea por FISH apenas nos pacientes de controle AZURE. Foi utilizado um corte ósseo otimizado de 2,3.

[046] Figura 11. IDFS por FISH apenas nos pacientes de controle AZURE.

Foi utilizado um corte otimizado de 2,2.

[047] Figura 12. Tempo para IDFS (excluindo recorrência óssea) por FISH apenas nos pacientes de controle AZURE. Foi utilizado um corte otimizado de 2,2.

[048] Figuras 13A-13B. Tempo para metástase óssea em pacientes no braço de controle e no braço de tratamento com ácido zoledrônico. Incidência cumulativa de metástases ósseas (A) como primeiro evento e (B) a qualquer momento durante o acompanhamento. As análises foram por intenção de tratar.

Relação de risco de FC.

[049] Figura 14. Avaliação do tempo até a metástase óssea como um primeiro evento em pacientes de controle AZURE e pacientes tratados com ácido zoledrônico. Foi utilizado um corte ósseo otimizado de 2,3.

[050] Figuras 15A-15B. Sobrevida livre de doença (DFS) e doença invasiva (IDFS) entre o braço de controle e o paciente tratado com ácido zoledrônico. Curvas de Kaplan-Meier de (A) sobrevida livre de doença e (B) sobrevida livre de doença invasiva. As análises foram por intenção de tratamento. HR = taxa de risco.

[051] Figura 16. Tempo para recorrência distante entre o braço de controle e os pacientes tratados com ácido zoledrônico.

[052] Figura 17. Tempo para um evento metastático ósseo (a qualquer momento) de acordo com o tratamento. A morte como evento concorrente é usada a tempo de eliminar as metástases (a qualquer momento).

[053] Figura 18. Tempo para um evento metastático ósseo (a qualquer momento), de acordo com o número de cópias de MAF (de acordo com o corte pré- especificado de MAF de 2,5).

[054] Figuras 19A-19B. IDFS pelo status menopáusico da triagem AZURE.

Curva de Kaplan-Meir da sobrevida livre de doença invasiva pelo status de menopausa. (A) pré-menopausa, perimenopausa e menopausa desconhecida e (B) mais de 5 anos desde a menopausa. Teste de heterogeneidade pelo status de menopausa 𝑥12 4,71; p = 0,03.

[055] Figura 20. Tempo para um evento metastático ósseo (a qualquer momento) de acordo com o número de cópias de MAF (dados de acordo com um corte pré-especificado de 2,5) em pacientes pós-menopáusicos.

[056] Figura 21. Tempo para um evento metastático ósseo (a qualquer momento) de acordo com o número de cópias de MAF (dados de acordo com um corte pré-especificado de 2,5) em pacientes não pós-menopáusicas.

[057] Figura 22. IDFS do braço de tratamento com ácido zoledrônico e do braço de controle, excluindo metástases ósseas de mulheres pós-menopáusicas.

[058] Figura 23. IDFS do braço de tratamento com ácido zoledrônico e do braço de controle, excluindo metástases ósseas de mulheres não pós- menopáusicas.

[059] Figura 24. Sobrevida geral (OS) por braço de tratamento. O tratamento de pacientes com MAF FISH positivo com ácido zoledrônico impactou significativamente a OS.

[060] Figura 25. Valor prognóstico de MAF FISH para sobrevida livre de doença (DFS) no braço de controle AZURE.

[061] Figura 26. Valor prognóstico de MAF FISH para a sobrevida geral (OS) no braço de controle AZURE.

[062] Figura 27. Valor preditivo de MAF FISH para o efeito do tratamento com ácido zoledrônico no resultado da sobrevida livre de doença (DFS).

[063] Figura 28. Valor preditivo de MAF FISH para o efeito do tratamento com ácido zoledrônico no resultado da sobrevida livre de doença (DFS) em pacientes pós-menopáusicos.

[064] Figura 29. Valor preditivo de MAF FISH para o efeito do tratamento com ácido zoledrônico no resultado da sobrevida livre de doença (DFS) em pacientes não pós-menopáusicas.

[065] Figura 30. Valor preditivo de MAF FISH para o efeito do tratamento com ácido zoledrônico no resultado da OS.

[066] Figura 31. Valor preditivo de MAF FISH para o efeito do tratamento com ácido zoledrônico no resultado da OS em pacientes pós-menopáusicos.

[067] Figura 32. Valor preditivo de MAF FISH para o efeito do tratamento com ácido zoledrônico no resultado da OS em pacientes não pós-menopáusicas.

[068] Figura 33. O efeito do número de cópias de MAF na sobrevida livre de doença invasiva. HRs e CIs de 95% baseiam-se na análise multivariável de Cox. HR = taxa de risco.

[069] Figura 34. Sobrevida livre de doença invasiva por grupo de tratamento em pacientes com MAF negativo. Resultado do modelo multivariável de Cox ajustado para diferenças nos fatores prognósticos entre os grupos. HR = taxa de risco.

[070] Figura 35. O efeito do status de MAF na associação entre ácido zoledrônico adjuvante e sobrevida livre de doença invasiva, estratificada por status menopáusico e idade. HR = taxa de risco.

[071] Figura 36. O risco cumulativo de primeira recorrência extraesquelética em mulheres não pós-menopáusicas na entrada da triagem, por grupo de tratamento. A Figura 36A mostra pacientes com tumores positivos para MAF. A Figura 36B mostra pacientes com tumores negativos para MAF. É mostrada a incidência cumulativa não ajustada para diferenças nos fatores prognósticos entre os grupos. Os eventos para esse objetivo final foram morte e doença invasiva local ou contralateral. Os primeiros eventos no osso foram um risco competitivo. HR = taxa de risco.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições de termos e expressões gerais

[072] "E/ou", quando usado neste documento, deve ser tomado como divulgação específica de cada um dos dois recursos ou componentes especificados com ou sem o outro. Por exemplo, "A e/ou B" deve ser tomado como divulgação específica de cada um dos itens (i) A, (ii) B e (iii) A e B, como se cada um deles fosse definido individualmente neste documento.

[073] O gene c-MAF (homólogo do oncogene de fibrossarcoma musculoaponeurótico v-maf (aviário) também conhecido como MAF ou MGC71685) é um fator de transcrição que contém um zíper de leucina que age como um homodímero ou um heterodímero. Dependendo do sítio de ligação ao DNA, a proteína codificada pode ser um ativador ou repressor transcricional. A sequência de DNA que codifica c-MAF é descrita no banco de dados NCBI sob o número de acesso NG_016440 (SEQ ID NO: 1) (codificação)). A sequência genômica de c-MAF é apresentada na SEQ ID NO: 13. Os métodos da presente invenção podem utilizar a sequência de codificação ou a sequência de DNA genômico. Dois RNA mensageiros são transcritos a partir da referida sequência de DNA, cada um dos quais dará origem a uma das duas isoformas da proteína c-MAF, a isoforma α e a isoforma β. As sequências complementares de DNA para cada uma das referidas isoformas são descritas, respectivamente, no banco de dados NCBI sob os números de acesso NM_005360.4 (SEQ ID NO: 2) e NM_001031804.2 (SEQ ID NO: 3). O uso do gene c-MAF para prever o prognóstico do câncer de mama ER+ pode ser encontrado no Pedido U.S. No. 13/878.114, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. O uso do gene c-MAF para predizer o prognóstico de câncer de mama triplo-negativo e ER+ é descrito no Pedido No. 14/391,085, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. O uso do gene c-MAF para prever o prognóstico do câncer de tireóide é descrito no Pedido Prov. U.S. No. 61/801.769, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. O uso do gene c-MAF para prever o prognóstico do carcinoma de células renais é descrito no Pedido Prov. U.S.

No. 14/776.390, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. O uso de um gene de interesse, incluindo c-MAF e o locus gênico de c-MAF, e sondas para o locus gênico, para determinar o prognóstico de um indivíduo com câncer de mama é descrito no Pedido U.S. No. 14/776.412, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. O uso do gene c-MAF para predizer o prognóstico do câncer de pulmão é encontrado no Pedido U.S. No. 14/405.724, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. O uso do gene c-MAF para predizer o prognóstico do câncer de próstata é encontrado no Pedido U.S. Nos. 14/050.262 e 14/435.128, que são aqui incorporados por referência na sua totalidade. O uso do gene c-MAF para predizer o prognóstico do câncer de HER2+ é encontrado no Pedido U.S. No.

15/027.946, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. O uso de genes a jusante de c-MAF para prever o prognóstico do câncer é encontrado no Pedido U.S. Nos. 15/014.916 e 14/776.453, que são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

[074] Como aqui utilizado, os termos "tipo basal" "subtipo basal", "câncer de mama do subtipo basal" e similares, como aqui utilizados, referem-se a um subtipo particular de câncer de mama caracterizado pelos dois receptores negativos ER e HER2 e pelo menos um receptor positivo do grupo que consiste em CK5/6, CK14, CK17 e EGFR. Assim, todas as frases no presente pedido que citam e se referem ao câncer de mama triplo-negativo (ER, HER-2, PgR) também podem ser citadas e se referem também ao câncer de mama do tipo basal, em que ER e HER2 são negativos e em que pelo menos um de CK5/6, CK14, CK17 e EGFR é positivo.

Alternativamente, "do tipo basal" também se refere ao câncer de mama caracterizado por um perfil de expressão gênica baseado na regulação positiva e/ou negativa dos dez genes a seguir: (1) Forkhead box CI (FOXC 1); (2) atividade inibidora de melanoma (MIA); (3) homólogo de NDC80, componente complexo cinetócoro (KNTC2); (4) proteína centrossômica 55kDa (CEP55); (5) Anilina, proteína de ligação à actina (ANLN); (6) zíper quinase de leucina embrionária materna (MELK); (7) receptor 160 acoplado à proteína G (GPR160); (8) proteína transmembranar 45B (TMEM45B); (9) receptor 1 de estrogênio (ESR1); (10) forkhead box Al (FOXA1). Como o perfil de expressão gênica usado para classificar os tumores de câncer de mama como subtipo do tipo basal não inclui o receptor de estrogênio, o receptor de progesterona ou Her2, ambos os cânceres de mama triplo- negativos e não triplo-negativos podem ser classificados como subtipo do tipo basal.

[075] Como usado aqui, "câncer de mama triplo-negativo" refere-se a um câncer de mama que é caracterizado por uma falta de expressão detectável de ER e PR (preferivelmente quando as medidas de expressão de ER e PR são realizadas pelo método divulgado por M. Elizabeth H et al., Journal of Clinical Oncology, 28 (16): 2784-2795, 2010) e as células tumorais não são amplificadas para o receptor do fator de crescimento epidérmico tipo 2 (HER2 ou ErbB2), um receptor normalmente localizado na superfície da célula. As células tumorais são consideradas negativas para expressão de ER e PR se menos de 5 por cento dos núcleos de células tumorais forem corados para expressão de ER e PR usando técnicas padrão imunohistoquímicas. Conforme usado aqui, as células tumorais são consideradas negativas para a superexpressão de HER2 se produzirem uma pontuação de 0 ou 1+ ou 2+ quando testadas com um Kit HercepTest™ (código K5204, Dako North America, Inc., Carpinteria, CA), um ensaio imunohistoquímico semiquantitativo usando um anticorpo policlonal anti-HER2 primário ou se eles forem negativos para HER2 FISH.

[076] Como aqui utilizado, "câncer de mama ER+" é entendido como câncer de mama cujas células tumorais expressam o receptor de estrogênio (ER). Isso torna os referidos tumores sensíveis ao estrogênio, o que significa que o estrogênio faz com que o tumor de mama canceroso cresça. Por outro lado, "câncer de mama ER-" é entendido como câncer de mama cujas células tumorais não expressam o receptor de estrogênio (ER). Entre o câncer de mama ER+ estão incluídos os subtipos A e B luminais.

[077] Como aqui utilizado, "HER2+" refere-se a um câncer de mama que é caracterizado por células tumorais com expressão detectável do receptor do fator de crescimento epidérmico tipo 2 (HER2 ou ErbB2) e/ou amplificação para o gene HER2, um receptor não normalmente localizado na superfície da célula. Conforme usado aqui, as células tumorais são consideradas negativas para a superexpressão de HER2 se produzirem uma pontuação de 0 ou 1+ ou 2+ quando testadas com um Kit HercepTest™ (código K5204, Dako North America, Inc., Carpinteria, CA), um ensaio imunohistoquímico semiquantitativo usando um anticorpo policlonal anti- HER2 primário ou se eles são negativos para HER2 FISH.

[078] O câncer de mama é classificado em estágios de acordo com o sistema TNM. (Vide Comitê Conjunto Americano sobre Câncer. AJCC Cancer Staging Manual. 6a ed. Nova York, NY: Springer, 2002, que é incorporado aqui por referência na íntegra). O prognóstico está intimamente relacionado aos resultados da classificação do estágio, e a classificação do estágio também é usada para atribuir pacientes a tratamentos tanto em ensaios clínicos quanto na prática médica.

As informações para classificação em estágios são as seguintes:

[079] TX: O tumor primário não pode ser avaliado. T0: não há evidência de tumor. Tis: carcinoma in situ, sem invasão. T1: O tumor tem 2 cm ou menos. T2: O tumor tem mais de 2 cm e menos de 5 cm. T3: O tumor tem mais de 5 cm. T4: Tumor de qualquer tamanho que cresce na parede da mama ou pele, ou câncer de mama inflamatório.

[080] NX: Os linfonodos próximos não podem ser avaliados. N0: O câncer não se espalhou para os linfonodos regionais. N1: O câncer se espalhou para 1 a 3 linfonodos axilares ou para um linfonodo mamário interno. N2: O câncer se espalhou para 4 a 9 linfonodos axilares ou para múltiplos linfonodos mamários internos. N3: Um dos seguintes procedimentos se aplica: O câncer se espalhou para 10 ou mais linfonodos axilares, ou se espalhou para os linfonodos infraclaviculares, ou se espalhou para os linfonodos supraclaviculares ou o câncer afeta os linfonodos axilares e se espalhou para os linfonodos mamários internos ou o câncer afeta 4 ou mais linfonodos axilares e quantidades mínimas de câncer estão nos linfonodos mamários internos ou na biópsia do linfonodo sentinela.

[081] MX: A presença de disseminação distante (metástase) não pode ser avaliada. M0: Não há disseminação distante. M1: O espalhamento para órgãos distantes que não incluem o linfonodo supraclavicular foi produzida.

[082] De acordo com a Sociedade Americana de Câncer (American Cancer Society), existem 5 estágios do câncer de mama, e cada um deles é subdividido em vários estágios adicionais (https://www.cancer.org/cancer/breast- cancer/understanding-a-breast-cancer-diagnostic/stage-of-breast-cancer.html, visitado pela última vez em 25 de agosto de 2017).

[083] O câncer de mama de Estágio 0 (Tis, N0, M0) também é conhecido como carcinoma ductal in situ (onde as células cancerosas ainda estão dentro de um ducto) ou carcinoma lobular in situ (LCIS). No estágio 0 do câncer de mama, o câncer não se espalhou para os linfonodos ou sítios distantes.

[084] O câncer de mama em estágio IA (T1, N0, M0) é um câncer em que o tumor tem 2 cm ou menos e onde o tumor não se espalhou para os linfonodos ou sítios distantes.

[085] O câncer de mama em estágio IB (T0 ou T1, N1mi, M0) é um câncer em que o tumor tem 2 cm ou menos e há 1 a 3 micrometástases nos linfonodos das axilas (onde o câncer nos linfonodos é de 0,2-2 mm), mas o câncer não se espalhou para os sítios distantes.

[086] O câncer de mama em estágio IIA (T0 ou T1, N1 (mas não N1mi), M0) é um câncer de mama em que o tumor tem 2 cm ou menos de diâmetro e (1) o câncer se espalhou para 1-3 linfonodos nas axilas e é superior a 2 mm; (2) pequenas quantidades de câncer estão nos linfonodos mamários internos; ou (3) o câncer se espalhou para 1-3 linfonodos nas axilas e para os linfonodos mamários internos. O câncer de mama em estágio IIA (T2, N0, M0) também pode ser câncer de mama, onde o tumor é maior que 2 cm, mas menor do que 5 cm, e não se espalhou para nenhum linfonodo ou sítio distante.

[087] O câncer de mama em estágio IIB (T2, N1, M0) é um câncer de mama em que o tumor é maior que 2 cm, mas menor do que 5 cm, e se espalhou para 1 a 3 linfonodos nas axilas e/ou pequenas quantidades de câncer estão nos linfonodos mamários internos, mas o câncer não se espalhou para sítios distantes. O câncer de mama em estágio IIB (T3, N0, M0) também é um câncer de mama em que o tumor é maior que 5 cm, mas não cresceu na parede torácica ou na pele e não se espalhou para nenhum linfonodo ou sítio distante.

[088] O câncer de mama em estágio IIIA (T0 a T2, N2, M0) é um câncer de mama em que o tumor não tem mais de 5 cm de diâmetro e se espalhou para 4 a 9 linfonodos nas axilas e aumentou os linfonodos mamários, mas não se espalhou para sítios distantes. O câncer de mama em estágio IIIA (T3, N1 ou N2, M0) também é câncer de mama, onde o tumor tem mais de 5 cm de diâmetro, mas não cresceu na parede torácica ou na pele e se espalhou para 1 a 9 nós nas axilas ou para os nós mamários internos, mas não para sítios distantes.

[089] O câncer de mama em estágio IIIB (T4, N0 a N2, M0) é um câncer de mama no qual o tumor cresceu na parede torácica ou na pele, e uma das seguintes situações se aplica: (1) o câncer não se espalhou para o linfonodos; (2) o câncer se espalhou para 1 a 3 linfonodos nas axilas e/ou existem pequenas quantidades de câncer nos linfonodos mamários internos em uma biópsia de linfonodo sentinela; ou (3) o câncer se espalhou para 4 a 9 linfonodos nas axilas ou o câncer aumentou os linfonodos mamários internos. No câncer de estágio IIIB, o câncer não se espalhou para sítios distantes. O câncer de mama inflamatório é pelo menos o estágio IIIB, mas se ele se espalhou, poderia ser o estágio IIIC ou o estágio IV.

[090] No câncer de mama de Estágio IIIC (qualquer T, N3, M0), o tumor pode ser de qualquer tamanho e se aplica a uma das seguintes situações: (1) o câncer se espalhou para 10 ou mais linfonodos nas axilas, (2) o câncer se espalhou para os linfonodos sob a clavícula; (3) o câncer se espalhou para os linfonodos acima da clavícula; (4) o câncer envolve os linfonodos nas axilas e aumentou os linfonodos mamários internos; ou (5) o câncer se espalhou para 4 ou mais linfonodos nas axilas, e há pequenas quantidades de câncer nos linfonodos mamários internos em uma biópsia de linfonodo sentinela. No câncer de mama em estágio IIIC, o câncer não se espalhou para sítios distantes.

[091] No câncer de mama de Estágio IV (qualquer T, qualquer N, M1), o câncer pode ser de qualquer tamanho e o câncer pode ou não ter se espalhado para os linfonodos próximos. O câncer se espalhou para órgãos distantes ou linfonodos distantes da mama.

[092] No contexto da presente invenção, um objeto "pós-menopáusico" é entendido como uma mulher que passou pela menopausa e passou sessenta meses consecutivos sem menstruação. Vide Coleman et al. Lancet Oncol 2014; 15: 997-

1006. Em certas modalidades, uma mulher pode confirmar seu status pós- menopáusico através da medição do hormônio folículo-estimulante (FSH).

[093] No contexto da presente invenção, um objeto "não pós-menopáusico" é qualquer objeto que não tenha passado pela menopausa e não tenha passado sessenta meses consecutivos sem menstruação. Os objetos "não pós- menopáusicos" incluem mulheres no status de pré-menopausa, perimenopausa e menopausa desconhecida.

[094] No contexto da presente invenção, "metástase" é entendida como o espalhamento de um câncer a partir do órgão onde começou para um órgão diferente. Geralmente ocorre através do sangue ou sistema linfático. Quando as células cancerosas se espalham e formam um novo tumor, este último é chamado de tumor secundário ou metastático. As células cancerosas que formam o tumor secundário são semelhantes àquelas do tumor original. Se um câncer de mama, por exemplo, se espalha (sofre metástase) para o osso, o tumor secundário é formado por células malignas de câncer de mama. A doença no osso é câncer de mama metastático e não câncer ósseo. Em uma modalidade particular do método da invenção, a metástase é um câncer da mama que se espalhou (sofre metástase) para o osso.

[095] No contexto da presente invenção, "recorrência" refere-se ao retorno do câncer de mama após um período de tempo em que nenhum câncer foi detectado. O câncer de mama pode reaparecer localmente na mama ou no tecido ao redor da mama. O câncer de mama também pode reaparecer em linfonodos próximos ou não na área circundante. Quando o câncer de mama reaparece ao se espalhar para outros tecidos ou viaja através da corrente sanguínea para se repetir nos ossos ou outros órgãos, também é chamado de metástase. Como aqui utilizado, a recorrência também abrange o risco de recorrência.

[096] No contexto da presente invenção, "recaída" refere-se à situação em que os sintomas diminuíram, mas o objeto não está livre de câncer e, então, o câncer retorna. O câncer de mama pode recair localmente na mama ou no tecido ao redor da mama. O câncer de mama também pode recair nos linfonodos próximos ou não na área circundante. Quando o câncer de mama recai ao se espalhar para outros tecidos ou viaja através da corrente sanguínea para se repetir nos ossos ou em outros órgãos, também é chamado de metástase. Como aqui utilizado, a recaída também abrange o risco de recaída.

[097] Como aqui utilizado, o termo "sobrevida livre de doença" refere-se ao período de tempo após o término do tratamento primário para um câncer, em que o paciente sobrevive sem quaisquer sinais ou sintomas desse câncer. Em algumas modalidades, a sobrevida livre de doença é referida como DFS, sobrevida livre de recaída ou RFS.

[098] Como aqui utilizado, o termo "sobrevida geral" ou "OS" refere-se ao período de tempo a partir da data do diagnóstico ou do início do tratamento de um câncer em que os pacientes diagnosticados com a doença ainda estão vivos.

[099] Como usado aqui, o termo "objeto" ou "paciente" refere-se a todos os animais classificados como mamíferos e inclui, mas não está limitado a, animais domésticos e de fazenda, primatas e humanos, por exemplo, seres humanos, primatas não humanos, vacas, cavalos, porcos, ovelhas, cabras, cães, gatos ou roedores. De preferência, o objeto é um homem ou mulher humana de qualquer idade ou raça.

[0100] Os termos "ruim" ou "bom", como usados aqui para se referir a um resultado clínico, significam que o objeto mostrará um resultado favorável ou desfavorável. Como será entendido por um especialista na técnica, tal avaliação da probabilidade, embora preferida, pode não estar correta para 100% dos objetos a serem diagnosticados. O termo, no entanto, exige que uma parte estatisticamente significativa dos objetos possa ser identificada como tendo uma predisposição para um determinado resultado. Se uma porção é estatisticamente significativa pode ser determinada prontamente pelo especialista na técnica, usando várias ferramentas de avaliação estatística conhecidas, por exemplo, determinação de intervalos de confiança, determinação de valor p, teste t de Student, teste de Mann-Whitney, etc.

Detalhes são encontrados em Dowdy e Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nova York 1983. Intervalos de confiança preferidos são pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos, cerca de 95%. Os valores de p são, preferivelmente, 0,05, 0,01, 0,005 ou 0,0001 ou menos. Mais preferivelmente, pelo menos cerca de 60 por cento, pelo menos cerca de 70 por cento, pelo menos cerca de 80 por cento ou pelo menos cerca de 90 por cento dos objetos de uma população podem ser adequadamente identificados pelo método da presente invenção.

[0101] Na presente invenção, "amostra de tumor" é entendida como uma amostra (por exemplo, tecido tumoral, célula tumoral circulante, DNA tumoral circulante) originária do tumor primário de câncer de mama. A referida amostra pode ser obtida por métodos convencionais, por exemplo, biópsia, usando métodos bem conhecidos pelos especialistas em técnicas médicas relacionadas. Os métodos para obter uma amostra de biópsia incluem dividir um tumor em pedaços grandes, ou microdissecção, ou outros métodos de separação de células conhecidos na técnica.

As células tumorais também podem ser obtidas por citologia por aspiração com uma pequena agulha de calibre. Para simplificar a preservação e o manuseio das amostras, as amostras podem ser fixadas em formalina e embebidas em parafina ou primeiro congeladas e depois embebidas em um meio de congelamento de tecidos,

como o composto OCT, por meio de imersão em um meio altamente criogênico, que permite o congelamento rápido.

[0102] No contexto da presente invenção, "variante funcionalmente equivalente da proteína c-MAF" é entendida como (i) variantes da proteína c-MAF (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5) na qual um ou mais dos resíduos de aminoácidos são substituídos por um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (preferivelmente um resíduo de aminoácido conservado), em que esse resíduo de aminoácido substituído pode ou não ser um codificado pelo código genético, ou (ii ) variantes compreendendo uma inserção ou uma exclusão de um ou mais aminoácidos e tendo a mesma função que a proteína c-MAF, por exemplo, para atuar como um fator de transcrição de ligação ao DNA. As variantes da proteína c- MAF podem ser identificadas usando métodos baseados na capacidade do c-MAF para promover a proliferação celular in vitro, como mostrado no pedido de patente internacional WO2005/046731 (aqui incorporado por referência na sua totalidade), com base na capacidade do assim chamado inibidor para bloquear a capacidade de transcrição de um gene repórter sob o controle do promotor da ciclina D2 ou de um promotor contendo a região responsiva de c-MAF (elemento responsivo de MARE ou c-MAF) nas células que expressam c-MAF, conforme descrito em WO2008098351 (aqui incorporado por referência na sua totalidade) ou com base na capacidade do chamado inibidor para bloquear a expressão gênica repórter sob o controle do promotor de IL-4 em resposta à estimulação com PMA/ionomicina em células que expressam NFATc2 e c-MAF como descrito em US2009048117A (aqui incorporado por referência na sua totalidade).

[0103] As variantes de acordo com a invenção têm preferivelmente similaridade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das isoformas da proteína c-MAF (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5) de pelo menos 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%. O grau de similaridade entre as variantes e as sequências específicas de proteína c- MAF definidas anteriormente é determinado usando algoritmos e processos de computador que são amplamente conhecidos pelos especialistas na técnica. A semelhança entre duas sequências de aminoácidos é preferivelmente determinada usando o algoritmo BLASTP [BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)].

[0104] Como usado aqui, "agente para evitar, tratar ou impedir a remodelação óssea" refere-se a qualquer molécula capaz de prevenir, inibir, tratar, reduzir ou interromper a degradação óssea, estimulando a proliferação de osteoblastos ou inibindo a proliferação de osteoclastos ou fixando a estrutura óssea.

Os agentes para evitar, tratar ou prevenir a remodelação óssea incluem agentes para evitar, tratar ou prevenir a degradação óssea e incluem agentes para evitar, tratar ou impedir a síntese óssea.

[0105] Conforme aqui utilizado, "resultado" ou "resultado clínico" refere-se ao curso resultante da doença e/ou progressão da doença e pode ser caracterizado, por exemplo, por recorrência, período até a recorrência, recaída, metástase, período até metástase, número de metástases, número de sítios de metástase e/ou morte devido à doença. Por exemplo, um bom resultado clínico inclui cura, prevenção de recorrência, prevenção de metástase e/ou sobrevida dentro de um período fixo de tempo (sem recorrência) e um resultado clínico ruim inclui progressão da doença, metástase e/ou morte dentro de um período fixo de tempo.

[0106] Como aqui utilizado, "sobrevida livre de doença invasiva" ou "IDFS" refere-se a, no câncer, o período de tempo após o tratamento primário para um câncer terminar em que o paciente sobrevive sem quaisquer sinais ou sintomas desse câncer invadindo a mesma mama parênquima que o tumor primário original ou outros tecidos. Em algumas modalidades, a IDFS inclui: recorrência de tumor invasivo ipsilateral da mama, recorrência de câncer de mama invasivo local ou regional, recorrência metastática ou distante, morte atribuível a qualquer causa, incluindo câncer de mama, câncer de mama invasivo contralateral e segundo câncer invasivo primário (câncer não mamário, mas excluindo câncer de pele de células basais ou escamosas). Vide Coleman et al. Lancet Oncol 2014; 15: 997-1006.

[0107] Na presente invenção, "diagnóstico de metástase em um objeto com câncer de mama" é entendido como a identificação de uma doença (metástase) por meio do estudo de seus sinais, por exemplo, no contexto da presente invenção por meio de aumento de níveis de expressão gênica de c-MAF (por exemplo, superexpressão) no tecido tumoral de câncer de mama em relação a uma amostra de controle.

[0108] Na presente invenção, "prognóstico da tendência a desenvolver metástases em um objeto com câncer de mama" é entendido como um conhecimento com base nos sinais de se o câncer de mama que o referido objeto teve irá metastizar no futuro. No contexto da presente invenção, o sinal é superexpressão gênica de c-MAF no tecido tumoral.

[0109] No contexto da presente invenção, entende-se que "um objeto tem um diagnóstico positivo para metástase" quando o câncer de mama sofrido por esse objeto é metastizado para outros órgãos do corpo, em uma modalidade específica, no osso. O termo é similarmente usado para recorrência e recaída.

[0110] O especialista na técnica entenderá que a previsão da tendência de um tumor primário metastizar, recair ou ocorrer novamente não se destina a ser correta para todos os objetos a serem identificados (ou seja, para 100% dos objetos). No entanto, o termo requer permitir a identificação de uma parte estatisticamente significativa dos objetos (por exemplo, uma coorte em um estudo de coorte). Se uma parte é estatisticamente significativa pode ser determinada de maneira simples pelo especialista na técnica, usando várias ferramentas de avaliação estatística conhecidas, por exemplo, a determinação de intervalos de confiança, determinação de valores de p, teste T de Student, teste de Mann- Whitney, etc. Os detalhes são fornecidos em Dowdy e Wearden, Statistics for Research, John Wiley and Sons, Nova Iorque 1983. Os intervalos de confiança preferidos são de pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos 98 % ou pelo menos 99%. Os valores de p são preferivelmente 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 ou 0,0001. Mais preferivelmente, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% dos objetos de uma população podem ser adequadamente identificados pelo método da presente invenção.

[0111] Conforme usado neste documento, "prognóstico fraco" indica que se espera que o objeto, por exemplo, predito, não sobreviva e/ou tenha, ou esteja em alto risco de ter metástases recorrentes, recaídas ou distantes dentro de um período de tempo definido. O termo "alto" é um termo relativo e, no contexto deste pedido, refere-se ao risco do grupo de expressão "alto" em relação a um resultado clínico (recorrência, metástases distantes, etc.). Um risco "alto" pode ser considerado como um risco maior que o risco médio para uma população heterogênea de pacientes com câncer. No estudo de Paik et al. (2004), um risco geral "alto" de recorrência foi considerado superior a 15%. O risco também varia em função do período de tempo.

O período de tempo pode ser, por exemplo, cinco anos, dez anos, quinze anos ou mesmo vinte anos do diagnóstico inicial de câncer ou após o prognóstico ser feito.

[0112] "Valor de referência", como aqui utilizado, refere-se a um valor de laboratório usado como referência para valores/dados obtidos por exames laboratoriais de pacientes ou amostras coletadas de pacientes. O valor de referência ou o nível de referência pode ser um valor absoluto; um valor relativo; um valor que tenha um limite superior e/ou inferior; uma faixa de valores; um valor médio; um valor mediano, um valor médio ou um valor em comparação com um controle particular ou valor de linha de base. Um valor de referência pode ser baseado em um valor de amostra individual, como, por exemplo, um valor obtido de uma amostra do objeto que está sendo testado, mas em um ponto de tempo anterior. O valor de referência pode ser baseado em um grande número de amostras, como em uma população de objetos do grupo de idade cronológica correspondente ou em um conjunto de amostras que inclui ou exclui a amostra a ser testada.

[0113] O termo "tratamento", como aqui utilizado, refere-se a qualquer tipo de terapia, que visa a terminar, prevenir, melhorar ou reduzir a suscetibilidade a uma condição clínica, como aqui descrita. Em uma modalidade, o termo tratamento refere-se ao tratamento profilático (por exemplo, uma terapia para reduzir a suscetibilidade a uma condição clínica), a um distúrbio ou condição como aqui definidos. Assim, "tratamento", "tratar" e seus termos equivalentes referem-se à obtenção de um efeito farmacológico ou fisiológico desejado, cobrindo qualquer tratamento de uma condição ou distúrbio patológico em um mamífero, incluindo um humano. O efeito pode ser profilático em termos de prevenção total ou parcial de um distúrbio ou sintoma do mesmo e/ou pode ser terapêutico em termos de cura parcial ou completa de um distúrbio e/ou efeito adverso atribuível ao distúrbio. Ou seja, "tratamento" inclui (1) impedir que o distúrbio ocorra ou se repita em um objeto, (2) inibir o distúrbio, tal como interromper seu desenvolvimento, (3) interromper ou encerrar o distúrbio ou pelo menos os sintomas associados a ele, de modo que o hospedeiro não sofra mais do distúrbio ou de seus sintomas, tal como causando regressão do distúrbio ou de seus sintomas, por exemplo, restaurando ou reparando uma função perdida, ausente ou defectiva, ou estimulando um processo ineficiente, ou (4) amenizando, aliviando ou melhorar o distúrbio ou sintomas associados a ele, em que a melhora é usada em sentido amplo para se referir a pelo menos uma redução na magnitude de um parâmetro, tais como inflamação, dor ou deficiência imunológica.

[0114] Como aqui utilizado, "amostra" ou "amostra biológica" significa material biológico isolado de um objeto. A amostra biológica pode conter qualquer material biológico adequado para determinar o nível de expressão gênica de c-MAF.

A amostra pode ser isolada de qualquer tecido ou fluido biológico adequado, como, por exemplo, tecido tumoral, sangue, plasma sanguíneo, soro, urina ou fluido espinhal cerebral (CSF).

[0115] Como usado aqui, o termo "nível de expressão" de um gene, conforme usado aqui, refere-se à quantidade mensurável de produto genético produzido pelo gene em uma amostra do objeto, em que o produto genético pode ser um produto transcricional ou produto translacional. Por conseguinte, o nível de expressão pode pertencer a um produto de gene de ácido nucleico, como mRNA ou cDNA ou um produto de gene polipeptídico. O nível de expressão é derivado da amostra de um objeto e/ou amostra ou amostras de referência e pode, por exemplo, ser detectado de novo ou corresponder a uma determinação anterior. O nível de expressão pode ser determinado ou medido, por exemplo, usando métodos de micromatriz, métodos de PCR (tal como qPCR) e/ou métodos baseados em anticorpos, como é conhecido por um especialista na técnica.

[0116] "Nível de expressão aumentado" é entendido como o nível de expressão quando se refere aos níveis do gene c-MAF maiores do que uma amostra de referência ou amostra de controle. Esses níveis aumentados podem ser causados sem excluir outros mecanismos por um gene ou amplificação do locus cromossômico 16q23 ou 16q22-24, ganho de cópia ou translocação.

Particularmente, uma amostra pode ser considerada como tendo alto nível de expressão de c-MAF quando o nível de expressão na amostra isolada do paciente é pelo menos cerca de 1,1 vez, 1,2 vez, 1,3 vez, 1,4 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 2,1 vezes,

2,2 vezes, 2,3 vezes, 2,4 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes ou mais em relação à referência ou controle. Nas modalidades, um "nível de expressão aumentado" é um nível de expressão "alto". Um nível de expressão "não aumentado" ou "sem aumento" é qualquer valor que não esteja incluído na definição de nível de expressão "aumentado", incluindo um valor igual ou o nível de referência ou controle ou um nível de expressão diminuído em comparação com um nível de referência ou controle.

[0117] "Nível de expressão diminuído" é entendido como o nível de expressão quando se refere aos níveis do gene c-MAF menores do que aqueles de uma amostra de referência ou amostra de controle. Esse nível reduzido pode ser causado sem excluir outros mecanismos por um gene ou pela exclusão do locus cromossômico 16q23 ou 16q22-24. Particularmente, uma amostra pode ser considerada como tendo níveis reduzidos de expressão de c-MAF quando o nível de expressão na amostra isolada do paciente é de pelo menos cerca de 1,1 vez, 1,2 vez, 1,3 vez, 1,3 vez, 1,4 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 2,1 vezes, 2,2 vezes, 2,3 vezes, 2,4 vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes ou até menos com relação à referência ou controle. Nas modalidades, um "nível de expressão diminuído" é um nível de expressão "baixo" ou um nível de expressão "não aumentado".

[0118] Como aqui utilizado, o termo "número de cópia de gene" refere-se ao número de cópia de uma molécula de ácido nucleico em uma célula. O número da cópia do gene inclui o número da cópia do gene no DNA genômico (cromossômico) de uma célula. Em uma célula normal (célula não tumoral), o número de cópias do gene é normalmente duas cópias (uma cópia em cada membro do par de cromossomos). O número de cópias de genes às vezes inclui metade do número de cópias de genes retirado de amostras de uma população de células.

[0119] Na presente invenção, "número aumentado de cópias de genes" é entendido como quando o número de cópias de genes c-MAF é maior que o número de cópias que uma amostra de referência ou amostra de controle possui. Esse número aumentado de cópias de genes pode ser causado sem excluir outros mecanismos por um gene ou amplificação do locus cromossômico 16q23 ou 16q22- 24, ganho de cópia ou translocação. Em particular, pode-se considerar que uma amostra possui um número de cópias c-MAF aumentado quando o número de cópias é superior a 2 cópias, por exemplo, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2.9, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 cópias e até mais de 10 cópias do gene c-MAF. Nas modalidades, "número aumentado de cópias de genes" é determinado com base em uma média de cópias por células contadas. Nas modalidades, pode-se considerar que uma amostra possui um número de cópias c-MAF aumentado quando o número médio de cópias por célula contada é superior a 2 cópias, por exemplo, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 cópias e até mais de 10 cópias do gene c-MAF.

[0120] Na presente invenção, "número reduzido de cópias de genes" é entendido como quando o número de cópias de genes c-MAF é menor do que o número de cópias que uma amostra de referência ou amostra de controle possui. O número reduzido de cópias de genes pode ser causado sem excluir outros mecanismos por um gene ou por exclusões de locus cromossômicos 16q23 ou 16q22-24. Em algumas modalidades, pode ser considerado que uma amostra tem um número de cópias c-MAF reduzido quando o número de cópias é 2 ou menor do que 2 cópias do gene c-MAF.

[0121] Na presente invenção, um "número de cópias de genes não aumentado" é entendido como quando o número de cópias de genes c-MAF ou o número médio de cópias de genes c-MAF é menor do que o número de cópias que uma amostra de referência ou positivo para amostra aumentada possui. O número de cópias de genes não aumentado pode ser causado sem excluir outros mecanismos, sem aumento no gene ou na amplificação do locus cromossômico 16q23 ou 16q22-24, ganho de cópia ou translocação. Em particular, pode-se considerar que uma amostra não possui um número de cópias c-MAF aumentado ou número médio de cópias de c-MAF quando o número de cópias é menor do que 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 cópias do gene c-MAF.

[0122] O termo "amplificação de um gene", como aqui entendido, refere-se a um processo através do qual várias cópias de um gene ou de um fragmento de gene são formadas em uma célula individual ou em uma linhagem de célula. As cópias do gene não estão necessariamente localizadas no mesmo cromossomo. A região duplicada é frequentemente chamada de "amplicon". Normalmente, a quantidade de mRNA produzido, por exemplo, o nível de expressão gênica também aumenta em proporção ao número de cópias de um gene em particular.

[0123] O termo "ganho" refere-se a qualquer aumento do número de cópias cromossômicas da norma, por exemplo, em um organismo diplóide, 3 cópias de um gene em uma célula seriam um ganho. Em algumas modalidades, "ganho" inclui o termo "ganho de cópia" e é usado como sinônimo de "número de cópia".

[0124] "Sonda", como aqui utilizado, refere-se a uma sequência de oligonucleotídeos que é complementar a uma sequência específica de ácido nucleico de interesse. Em algumas modalidades, as sondas podem ser específicas para regiões de cromossomos que são conhecidas por sofrer translocações. Em algumas modalidades, as sondas têm uma etiqueta ou rótulo específicos. Em algumas modalidades, a etiqueta é um fluoróforo. Em algumas modalidades, a sonda é uma sonda de hibridação de DNA in situ cuja marcação é baseada na ligação coordenada estável da platina a ácidos nucleicos e proteínas. Em algumas modalidades, a sonda é descrita nas Patentes U.S. Nos. 9.127.302 e 9.134.237, que são incorporadas por referência na sua totalidade, ou como descrito em Swennenhuis et al. "Construction of repeat-free fluorescence in situ hybridization probes" Nucleic Acids Research 40(3):e20 (2012).

[0125] "Etiqueta" ou "rótulo", como usado aqui, refere-se a qualquer molécula física que está direta ou indiretamente associada a uma sonda, permitindo que a sonda ou o local da sonda seja visualizado, marcado ou capturado de outra forma.

[0126] "Translocação", como aqui utilizado, refere-se à troca de material cromossômico em quantidades desiguais ou iguais entre os cromossomos. Em alguns casos, a translocação é no mesmo cromossomo. Em alguns casos, a translocação ocorre entre diferentes cromossomos. As translocações ocorrem com alta frequência em muitos tipos de câncer, incluindo câncer de mama e leucemia. As translocações podem ser translocações recíprocas primárias ou translocações secundárias mais complexas. Existem várias translocações primárias que envolvem o locus da cadeia pesada de imunoglobina (IgH), que acredita-se constituir o evento inicial em muitos cânceres. (Eychène, A., Rocques, N. e Puoponnot, C., A new MAFia in cancer. 2008. Nature Reviews: Cancer. 8: 683-693.)

[0127] "Poliploide" ou "poliploidia", como aqui utilizado, indica que a célula contém mais de duas cópias de um gene de interesse. Em alguns casos, o gene de interesse é MAF. Em algumas modalidades, a poliploidia está associada a um acúmulo de expressão gênica de interesse. Em algumas modalidades, a poliploidia está associada à instabilidade genômica. Em algumas modalidades, a instabilidade genômica pode levar a translocações cromossômicas.

[0128] "Sequenciamento completo do genoma", como aqui utilizado, é um processo pelo qual todo o genoma de um organismo é sequenciado ao mesmo tempo. Vide, por exemplo, Ng., P.C. and Kirkness, E.F., Whole Genome Sequencing. 2010. Methods in Molecular Biology. 628: 215-226.

[0129] "Sequenciamento de exoma", como aqui utilizado, é um processo pelo qual toda a região codificante do DNA de um organismo é sequenciada. No sequenciamento do exoma, o mRNA é sequenciado. As regiões não traduzidas do genoma não estão incluídas no sequenciamento do exoma. Vide, por exemplo, Choi, M. et al., Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing. 2009. PNAS. 106(45): 19096–19101.

[0130] Como aqui utilizado, "membro de ligação" descreve um membro de um par de moléculas que se ligam. Os membros de um par de ligação podem ser derivados naturalmente ou produzidos total ou parcialmente de forma sintética. Um membro do par de moléculas tem uma área em sua superfície, ou uma cavidade, que se liga a e é, portanto, complementar a uma organização espacial e polar particular do outro membro do par de moléculas. Exemplos de tipos de pares de ligação são antígeno-anticorpo, receptor-ligante e enzima-substrato. Em algumas modalidades, o membro de ligação é um anticorpo. Em algumas modalidades, o membro de ligação é um anticorpo que liga um antígeno c-MAF. Em certas modalidades, o membro de ligação é qualquer anticorpo c-MAF aqui divulgado.

[0131] Como aqui utilizado, "região CDR" ou "CDR" pretende indicar as regiões hipervariáveis das cadeias pesada e leve da imunoglobulina, conforme definido por Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Edição. Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, Serviço Público, NIH, Washington. Um anticorpo contém tipicamente 3 CDRs de cadeia pesada, denominadas HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e 3 CDRs de cadeia leve, denominadas LCDR1, LCDR2 e LCDR3. O termo CDR ou CDRs é usado aqui para indicar uma dessas regiões ou várias, ou mesmo a totalidade, dessas regiões que contêm a maioria dos resíduos de aminoácidos responsáveis pela ligação por afinidade do anticorpo para o antígeno ou ao epítopo que ele reconhece. Entre as seis sequências de CDR, a terceira CDR da cadeia pesada (HCDR3) tem uma maior variabilidade de tamanho, por exemplo, maior diversidade, essencialmente devido ao mecanismo conhecido na técnica como rearranjo V(D)J dos segmentos gênicos V, D e J do locus gênico da cadeia pesada da imunoglobulina da linhagem germinativa. A HCDR3 pode ser tão curta quanto dois aminoácidos ou até 26 aminoácidos, ou pode ter qualquer comprimento entre esses dois extremos. O comprimento da CDR também pode variar de acordo com o comprimento que pode ser acomodado pela estrutura subjacente particular. Funcionalmente, a HCDR3 pode desempenhar um papel importante na determinação da especificidade do anticorpo (Segal et al., (1974) Proc Natl Acad Sci USA. 71(11): 4298-302; Amit et al., (1986) Science 233(4765): 747-53; Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196(4): 901-17; Chothia et al., (1989) Nature 342(6252): 877-83; Caton et al., (1990) J. Immunol.

144(5): 1965-8; Sharon (1990a) PNAS USA. 87(12): 4814-7, Sharon (1990b) J.

Immunol. 144: 4863-4869, Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5tº Edição. Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, Serviço Público, NIH, Washington).

[0132] Como aqui utilizado, "anticorpo", "molécula de anticorpo" ou "anticorpos" descrevem uma imunoglobulina produzida de maneira natural, parcial ou totalmente sintética. O termo também abrange qualquer polipeptídeo ou proteína compreendendo um sítio de ligação a antígeno do anticorpo. Deve ser entendido aqui que a invenção não se relaciona com os anticorpos na forma natural, ou seja, diz-se que eles não estão em seu ambiente natural, mas que foram capazes de serem isolados ou obtidos por purificação de fontes naturais, ou então obtidos por recombinação genética, ou por síntese química, e que eles podem conter aminoácidos não naturais. Os fragmentos de anticorpo que compreendem um sítio de ligação a antígeno do anticorpo incluem, mas não estão limitados a, moléculas como Fab, Fab’, F(ab’)2, Fab’- SH, scFv, Fv, dAb e Fd. Várias outras moléculas de anticorpo, incluindo um ou mais sítios de ligação a antígeno do anticorpo, foram manipuladas geneticamente, incluindo, por exemplo, Fab2, Fab3, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, camelcorpos, nanocorpos e minicorpos. Moléculas de anticorpo e métodos para sua construção e uso são descritos em Hollinger & Hudson (2005) Nature Biot. 23 (9): 1126-1136.

[0133] Como aqui utilizado, "molécula de anticorpo" deve ser interpretada como cobrindo qualquer membro ou substância de ligação que possua um sítio de ligação a antígeno do anticorpo com a especificidade necessária e/ou a ligação a antígeno. Assim, este termo abrange fragmentos e derivados funcionais de anticorpos, incluindo qualquer polipeptídeo compreendendo um sítio de ligação a antígeno do anticorpo, seja natural ou totalmente, ou parcialmente sintético.

Moléculas quiméricas compreendendo um sítio de ligação a antígeno de anticorpo, ou equivalente, fundido com outro polipeptídeo (por exemplo, derivado de outra espécie ou pertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpo) são, portanto, incluídas. A clonagem e expressão de anticorpos quiméricos são descritas, por exemplo, em EP0120694A (Boss et al) e EP0125023A (Cabilly et al), que são aqui incorporados na sua totalidade.

[0134] Como aqui utilizado, "fragmento ou variante funcional" de, por exemplo, um membro de ligação da presente invenção significa um fragmento ou variante de um membro de ligação que retém pelo menos alguma função de um membro de ligação completo (por exemplo, a capacidade para se ligar especificamente a um antígeno, como Maf).

[0135] "Amostra de tecido tumoral" é entendida como a amostra de tecido originária do tumor de câncer de mama, incluindo, mas não se limitando a, células tumorais circulantes e DNA tumoral circulante. A referida amostra pode ser obtida por métodos convencionais, por exemplo, biópsia, usando métodos bem conhecidos pelos especialistas em técnicas médicas relacionadas.

[0136] "Metástase óssea osteolítica" refere-se a um tipo de metástase em que a reabsorção óssea (perda progressiva da densidade óssea) é produzida na proximidade da metástase resultante da estimulação da atividade dos osteoclastos pelas células tumorais e é caracterizada por dor intensa, fraturas patológicas, hipercalcemia, compressão da medula espinhal e outras síndromes resultantes da compressão do nervo.

[0137] O tratamento no cenário "adjuvante" refere-se ao tratamento administrado após um tratamento primário, como cirurgia ou radioterapia.

[0138] O tratamento no cenário "neoadjuvante" refere-se ao tratamento administrado antes do tratamento primário.

Método para projetar terapia personalizada da invenção em pacientes com tumores de mama

[0139] A presente invenção é direcionada à identificação de objetos que sofrem de câncer de mama que se beneficiarão do tratamento com agentes e/ou terapias particulares. Em outras modalidades, a invenção é direcionada ao tratamento de pacientes que são identificados como beneficiados pelo tratamento com agentes e terapias particulares. Em algumas modalidades, os objetos têm um nível de expressão, número de cópias, amplificação, ganho e/ou translocação não aumentado ou baixo de c-MAF. Em modalidades particulares, o câncer é um câncer de mama triplo-negativo. Em outras modalidades, o câncer é câncer de mama ER+.

Em outras modalidades, o câncer é um câncer de mama ER-. Em ainda outras modalidades, o câncer é o câncer de mama HER2+. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer de mama do tipo basal. Em uma modalidade, os objetos são pós-menopausa. Em uma modalidade, os objetos são não pós-menopáusicos. Como descrito no Pedido Pedido U.S. No. 14/391,085, Pedido Provisório U.S.

No.61/801.769, Pedido Provisório U.S. No.14/776.390, Pedido U.S. No. 14/776.412, Pedido U.S. No. 14/405.724, Pedido U.S. No. 14/050.262, Pedido U.S. No.

14/435,128, Pedido U.S. No. 15/027.946 Pedido U.S. No. 15/014.916, Pedido U.S.

No. 15/534,893, Pedido U.S. No. 14/776.453 e Pedido Inter. No.

PCT/IB2017/053094, cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade, os níveis de c-MAF podem ser usados para diagnosticar metástases, recaídas ou recorrências ou para prever a tendência de um tumor sofrer metástase, recaída ou recorrência. Portanto, conforme descrito na presente invenção, considerando que a superexpressão gênica de c-MAF, amplificação, número de cópias ou ganho está relacionado à presença de metástase, recaída ou recorrência, informações relacionadas a níveis de expressão gênica de c-MAF, amplificação, número de cópias ou ganho permitem a tomada de decisões sobre a terapia mais adequada para o objeto que sofre do referido câncer. Em uma modalidade, a invenção compreende quantificar apenas o nível de expressão gênica de c-MAF, amplificação, número de cópias ou ganho como um único marcador, por exemplo, o método não envolve a determinação do nível de expressão de qualquer marcador adicional. Assim, em uma modalidade, a invenção se refere a um método para tratar um objeto com câncer de mama, compreendendo administrar um agente que evita, trata e/ou previne a remodelação óssea, em que o objeto foi identificado como tendo um nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho não aumentado em uma amostra de tumor em relação a uma amostra de controle. Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método para tratar um objeto tendo câncer de mama, compreendendo: (i) quantificar o nível de expressão gênica de c- MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, e (ii) comparar o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho obtido em (i) com um valor de referência, em que se o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado em relação ao referido valor de referência; então, o referido objeto recebe um agente que evita, trata e/ou previne a remodelação óssea. Nas modalidades, a invenção refere-se a um método para tratar um objeto tendo câncer de mama, compreendendo quantificar o nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, em que se o nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado, então, o objeto é administrado com um agente que evite, trate e/ou previna a remodelação óssea.

Em certas modalidades, a invenção se refere ao método para identificar um objeto tendo câncer de mama que se beneficiará do tratamento com um agente que evita, trata e/ou previne a remodelação óssea, compreendendo (i) quantificar o nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópia, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto,

e (ii) comparar o nível de expressão, número de cópia, amplificação ou ganho obtido em (i) com um valor de referência, em que se o nível de expressão, número de cópias, amplificação, ou o ganho não for aumentado em relação ao referido valor de referência, então o referido objeto recebe um agente que evita, trata e/ou previne a remodelação óssea.

Nas modalidades, a invenção se refere a um método para identificar um objeto tendo câncer de mama que se beneficiará do tratamento com um agente que evita, trata e/ou previne a remodelação óssea, compreendendo quantificar o nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação, ou ganho em uma amostra do referido objeto, em que se o nível de expressão de c-

MAF, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado, então o referido objeto será administrado com um agente que evita, trata e/ou previne a remodelação óssea.

Em certas modalidades, a invenção é direcionada ao método in vitro para designar uma terapia personalizada para um objeto tendo câncer de mama que compreende: (i) quantificar o nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto e ii) comparar o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho obtido em (i) com um valor de referência, em que se o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado em relação ao referido valor de referência, então o referido objeto é suscetível a receber um agente que evita, trata e/ou previne a remodelação óssea. Em algumas modalidades, o tratamento ou terapia melhora a sobrevida geral. Em outras modalidades, o tratamento ou terapia melhora a sobrevida livre de doença invasiva. Em outras modalidades, o tratamento ou terapia melhora a sobrevida livre de doença. Em algumas modalidades, o objeto tem perda óssea induzida por tratamento de câncer (CTIBL). Em certas modalidades, o tratamento ou terapia trata ou melhora a CTIBL. Em outras modalidades, o tratamento ou terapia evita ou previne CTIBL.

[0140] Em algumas modalidades, o objeto tem um alto nível de expressão gênica de c-MAF. Em outras modalidades, o objeto tem um nível baixo de expressão gênica de c-MAF. Em certas modalidades, é administrado ao objeto um agente que evita e/ou previne a remodelação óssea, incluindo agentes que evitam, tratam ou previnem a degradação óssea. Nas modalidades, o objeto recebe adicionalmente um agente que trata o câncer. Em modalidades particulares, o agente que evita e/ou evita a remodelação óssea ou o agente inibidor de c-MAF é qualquer agente divulgado no Pedido U.S. 14/391,085, Pedido Provisório U.S. No.61/801.769, Pedido Provisório U.S. No.14/776.390, Pedido U.S. No. 14/776.412, Pedido U.S. No.

14/405.724, Pedido U.S. No. 14/050.262, Pedido U.S. No. 14/435,128, Pedido U.S.

No. 15/027.946 Pedido U.S. No. 15/014.916, Pedido U.S. No. 15/534,893, Pedido U.S. No. 14/776.453 e Pedido Inter. No. PCT/IB2017/053094, que são incorporados aqui por referência em sua totalidade.

[0141] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método para tratar metástases ósseas em um objeto com câncer de mama e com níveis reduzidos de c- MAF em uma amostra de tumor em relação a uma amostra de controle que compreende a administração de um agente capaz de prevenir ou inibir a remodelação óssea e ou melhorar a sobrevida livre de doença ou sobrevida geral, em que o agente capaz de evitar, tratar ou prevenir a remodelação óssea ou melhorar a sobrevida livre de doença ou sobrevida geral é selecionado a partir do grupo que consiste em: um bisfosfonato, um inibidor de RANKL, PTH, Inibidor de PTHLH (incluindo anticorpos e peptídeos neutralizantes), um análogo de PRG, ranelato de estrôncio, um inibidor de DKK-1, um inibidor duplo de MET e VEGFR2, um modulador de receptor de estrogênio, um inibidor de EGFR, calcitonina, Radium- 223, um antagonista de CCR5, um Inibidor de Src quinase, um inibidor de COX-2, um inibidor de mTor e um inibidor de catepsina K. Em algumas modalidades, o objeto é não pós-menopáusico. Em outras modalidades, o objeto é pós- menopáusico.

[0142] Nas modalidades, o tratamento com bifosfonatos é iniciado no início da terapia adjuvante. Em certas modalidades, o tratamento com bifosfonato é continuado por cerca de 3-5 anos e é continuado somente após 5 anos se o risco de fratura for indicado.

[0143] Em certas modalidades, o objeto é administrado com um agente que evita, trata e/ou previne a remodelação óssea, incluindo agentes que evitam, tratam ou previnem a degradação óssea. Nas modalidades, é administrado ao objeto um agente que evita, trata e/ou previne a degradação óssea. Nas modalidades, o agente que evita, trata e/ou previne a degradação óssea é selecionado a partir do grupo que consiste em: denosumabe, ácido zoledrônico, clodronato, alendronato, risedronato e ibandronato.

[0144] Depois que o nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho na amostra foram medidos e comparados com a amostra de controle, o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho do referido gene indica se o objeto é suscetível receber uma terapia ou agente destinado a evitar, tratar ou prevenir a remodelação óssea.

[0145] Em algumas modalidades, um número de cópias de MAF ou número médio de cópias de MAF por célula, medido usando FISH ≥ 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 ou 3,0, é considerado um valor alto. Nas modalidades, o valor de

MAF FISH é ≥ 2,2. Em certas modalidades, o valor de MAF FISH é ≥ 2,3. Em outras modalidades, o valor de MAF FISH é ≥ 2,4. Em outras modalidades, o valor de MAF FISH é ≥ 2,5. Em outras modalidades, o número de cópias de c-MAF, medido usando FISH, é < 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 cópias do gene c-MAF é considerado um valor baixo. Nas modalidades, o número de cópias do c-MAF conforme medido usando c-MAF é < 2,1. Em modalidades particulares, o número de cópias do c-MAF é ≤ 2,0, 1,9. 1,8 1,7 1,6 ou 1,5. Em uma modalidade, o número de cópias do c-MAF é ≤ 2,0.

[0146] Em uma modalidade específica, o objeto tem metástase ou um prognóstico para sofrer metástase. Em algumas modalidades, a metástase é uma metástase óssea. Em uma modalidade adicional, a metástase óssea é metástase osteolítica.

[0147] Em algumas modalidades, o método compreende em uma primeira etapa quantificar o nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, ganho ou amplificação em uma amostra de tumor em um objeto que sofre de câncer de mama.

[0148] Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra primária de tecido tumoral do objeto. Em outras modalidades, a amostra é uma amostra de tumor metastático do objeto. Em uma segunda etapa, o nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho obtido na amostra de tumor do objeto é comparado com o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho do referido gene em uma amostra de controle. A determinação dos níveis de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho deve estar relacionada aos valores de uma amostra de controle ou amostra de referência.

Dependendo do tipo de tumor a ser analisado, a natureza exata da amostra de controle pode variar. Assim, em algumas modalidades, a amostra de referência é uma amostra de tecido tumoral de um objeto com câncer de mama que não metastizou, recidivou ou recuperou ou que corresponde ao valor médio dos níveis de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho medido em uma coleção de tecido tumoral em amostras de biópsia de objetos com câncer de mama que não tenham metastizado, recaído ou recuperado.

[0149] Em uma modalidade, os métodos da invenção compreendem, em uma segunda etapa, comparar o nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho obtido na amostra de tumor (incluindo, entre outros, uma biópsia de tumor primário, células tumorais circulantes e DNA tumoral circulante) do objeto com o nível de expressão do referido gene em uma amostra de controle.

[0150] A determinação do nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho deve ser correlacionada com os valores de uma amostra de controle ou amostra de referência. Dependendo do tipo de tumor a ser analisado, a natureza exata da amostra de controle pode variar. Assim, no caso de um diagnóstico ser avaliado, a amostra de referência é uma amostra de tecido tumoral de um paciente com câncer de mama que não foi metastizado ou que corresponde ao valor médio dos níveis de expressão gênica de c-MAF medidos em uma coleta de tecido tumoral em amostras de biópsia de objetos com câncer de mama que não foram metastizados.

[0151] A referida amostra de referência é tipicamente obtida combinando quantidades iguais de amostras de uma população em questão. Geralmente, as amostras de referência típicas serão obtidas de objetos clinicamente bem documentados e nos quais a ausência de metástase é bem caracterizada. Nessas amostras, as concentrações normais (concentração de referência) do biomarcador (gene c MAF) podem ser determinadas, por exemplo, fornecendo a concentração média sobre a população de referência. Várias considerações são levadas em consideração ao determinar a concentração de referência do marcador. Entre essas considerações estão a idade, peso, sexo, condição física geral do paciente e similares. Por exemplo, quantidades iguais de um grupo de pelo menos cerca de 2, pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 75, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 250, pelo menos pelo menos 500, a mais de 1000 objetos, classificados de acordo com as considerações anteriores, por exemplo, de acordo com várias categorias de idade, são tomados como grupo de referência. A coleta de amostras da qual o nível de referência é derivado será preferivelmente formada por objetos que sofrem do mesmo tipo de câncer que o objeto paciente do estudo (por exemplo, câncer de mama). Da mesma forma, o valor de referência em uma coorte de pacientes pode ser estabelecido usando uma curva de operação de recebimento (ROC) e medindo a área sob a curva para todos os pares de sensibilidade e especificidade para determinar qual par fornece os melhores valores e qual é o valor de referência correspondente. ROC é um conceito estatístico padrão. Uma descrição pode ser encontrada nas curvas de Stuart G. Baker "The Central Role of Receiver Operating Characteristic (ROC) curves in Evaluating Tests for the Early Detection of Cancer" Journal of The National Cancer Institute (2003) Vol 95, No. 7, 511-515

[0152] Uma vez estabelecido esse valor mediano ou de referência, o nível desse marcador expresso em tecidos tumorais de pacientes com esse valor mediano pode ser comparado e, assim, ser atribuído, por exemplo, o nível de expressão "aumentado" ou "não aumentado". Devido à variabilidade entre os objetos (por exemplo, aspectos referentes à idade, raça, etc.), é muito difícil (se não praticamente impossível) estabelecer valores de referência absolutos da expressão de c-MAF. Assim, em modalidades particulares, os valores de referência para a expressão "aumentada" ou "reduzida" ou expressão "não aumentada" de c-MAF são determinados calculando os percentis por meios convencionais, que envolvem a realização de ensaios em uma ou várias amostras isoladas de objetos cuja doença está bem documentada por qualquer um dos métodos mencionados acima dos níveis de expressão de c-MAF. Os níveis "reduzidos" ou "não aumentados" de c- MAF podem então ser preferivelmente atribuídos a amostras em que os níveis de expressão de c-MAF são iguais ou menores do que o percentil 50 na população normal, incluindo, por exemplo, níveis de expressão iguais a ou menor do que o percentil 60 na população normal, iguais ou menores do que o percentil 70 na população normal, iguais ou menores do que o percentil 80 na população normal, iguais ou menores do que o percentil 90 na população normal, e igual ou inferior ao percentil 95 na população normal. Os níveis "aumentados" de expressão gênica de c-MAF podem então ser preferivelmente atribuídos a amostras em que os níveis de expressão gênica de c-MAF são iguais ou maiores que o percentil 50 na população normal, incluindo, por exemplo, níveis de expressão iguais ou maiores que o percentil 60 na população normal, igual ou maior que o percentil 70 na população normal, igual ou maior que o percentil 80 na população normal, igual ou maior que o percentil 90 na população normal e igual a ou maior que o percentil 95 na população normal.

[0153] Em uma modalidade específica, o grau de amplificação ou ganho do gene c-MAF pode ser determinado por meio da determinação da amplificação ou ganho de uma região cromossômica contendo o referido gene. De preferência, a região cromossômica cuja amplificação ou ganho é indicativa da existência de amplificação ou ganho do gene c-MAF é o locus 16q22-q24 que inclui o gene c- MAF. O locus 16q22-q24 está localizado no cromossomo 16, no braço longo do referido cromossomo e em uma faixa entre a banda 22 e a banda 24. Essa região corresponde no banco de dados NCBI com os contigs NT_010498.15 e NT_010542.15. Em outra modalidade preferida, o grau de amplificação ou ganho do gene c-MAF pode ser determinado por meio de uma sonda específica para o referido gene.

[0154] Em algumas modalidades, a amplificação ou ganho está na região no locus 16q23. Em algumas modalidades, a amplificação ou ganho está em qualquer parte da região cromossômica entre Crom. 16 - 79.392.959 pb a 79.663.806 pb (do centrômero ao telômero). Em algumas modalidades, a amplificação ou ganho está na região genômica entre Crom. 16 - 79.392.959 pb a 79.663.806 pb, mas excluindo elementos de repetição de DNA. Em algumas modalidades, a amplificação ou ganho é medido usando uma sonda específica para essa região.

[0155] Em uma modalidade, o gene c-MAF é amplificado em relação a um número de cópia do gene de referência quando o número de cópia do gene c-MAF é maior que o número da cópia que uma amostra de referência ou amostra de controle possui. Em um exemplo, diz-se que o gene c-MAF é "amplificado" se o número de cópia genômica ou o número médio de cópias genômicas do gene c-MAF for aumentado em pelo menos cerca de 2 (por exemplo, 6 cópias), 3 (por exemplo, 8 cópias), 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 vezes em uma amostra de teste em relação a uma amostra de controle. Em outro exemplo, é referido que um gene c-MAF é "amplificado" se o número de cópias genômicas ou o número médio de cópias genômicas do gene c-MAF por célula for de pelo menos cerca de 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 25, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 e similares. Em um exemplo, o gene c-MAF não é amplificado se o número de cópias genômicas ou o número médio de cópias genômicas do gene c-MAF por célula for menor do que cerca de 2 cópias por célula.

[0156] Em algumas modalidades, quando o número de cópias é medido, a amostra de controle se refere a uma amostra de tumor de um objeto tendo câncer de mama que não sofreu metástase ou que corresponde ao valor médio do número de cópias do gene c-MAF medido em coleta de tecido tumoral em amostras de biópsia de objetos com câncer de mama que não sofreram metástase. A referida amostra de referência é tipicamente obtida combinando quantidades iguais de amostras de uma população em questão. Se o número de cópias do gene c-MAF for aumentado em relação ao número de cópias do referido gene na amostra de controle, o objeto tem um diagnóstico positivo para metástase ou uma maior tendência a desenvolver metástase. Em outra modalidade, o número de cópia do gene de referência é o número de cópia do gene em uma amostra de câncer de mama de um objeto que não sofreu metástase óssea.

[0157] Em outra modalidade, a amplificação ou ganho é determinado por meio de hibridização in situ ou PCR.

[0158] Em outra modalidade e como descrito na presente invenção, dado que o chr16q22-24, incluindo o gene c-MAF, é amplificado em células de câncer de mama está relacionado à presença de metástase, recaída ou recorrência do chr16q22-24, incluindo o gene c-MAF, amplificação ou ganho permitem tomar decisões em termos da terapia mais adequada para o objeto que sofre o referido câncer.

[0159] A determinação da amplificação do gene c-MAF precisa ser correlacionada com valores de uma amostra de controle ou amostra de referência que correspondem ao nível de amplificação do gene c-MAF medido em uma amostra de tecido tumoral de um objeto tendo câncer de mama que não sofreu metástase ou que corresponde ao valor médio da amplificação do gene c-MAF medido em uma coleção de tecido tumoral em amostras de biópsia de objetos com câncer de mama que não sofreram metástase. A referida amostra de referência é tipicamente obtida combinando quantidades iguais de amostras de uma população em questão.

[0160] Em geral, as amostras de referência típicas serão obtidas de objetos clinicamente bem documentados e nos quais a ausência de metástase é bem caracterizada. A coleta de amostras da qual o nível de referência é derivado será preferivelmente composta por objetos que sofrem o mesmo tipo de câncer que o paciente objeto do estudo. Uma vez estabelecido esse valor mediano, o nível de amplificação da c-MAF nos tecidos tumorais dos pacientes pode ser comparado com esse valor mediano e, portanto, se houver amplificação, o objeto tem um diagnóstico positivo para metástase ou uma maior tendência a desenvolver metástases.

[0161] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método in vitro para designar uma terapia personalizada para um paciente que sofre de câncer de mama, que compreende determinar se o gene c-MAF é translocado em uma amostra do referido objeto.

[0162] Em algumas modalidades, o gene translocado é da região no locus 16q23. Em algumas modalidades, o gene translocado é de qualquer parte da região cromossômica entre Crom. 16 - 79.392.959 pb a 79.663.806 pb (do centrômero ao telômero). Em algumas modalidades, o gene translocado é da região genômica entre Crom. 16 - 79.392.959 pb a 79.663.806 pb, mas excluindo elementos de repetição de DNA. Em algumas modalidades, a translocação é medida usando uma sonda específica para essa região.

[0163] Em uma modalidade específica, a translocação do gene c-MAF pode ser determinada por meio da determinação da translocação de uma região cromossômica contendo o referido gene. Em uma modalidade, a translocação é a translocação t(14,16). Em outra modalidade, a região cromossômica que é translocada é do locus 16q22-q24. O locus 16q22-q24 está localizado no cromossomo 16, no braço longo do referido cromossomo e em uma faixa entre a banda 22 e a banda 24. Essa região corresponde no banco de dados NCBI com os contigs NT_010498.15 e NT_010542.15. Em uma, o gene c-MAF se transloca para o cromossomo 14 no locus 14q32, resultando na translocação t(14,16) (q32, q23).

Essa translocação coloca o gene da MAF próximo aos fortes intensificadores no locus da IgH, o que, em alguns casos, leva à superexpressão de MAF. (Eychène, A.,

Rocques, N., e Puoponnot, C., A new MAFia in cancer. 2008. Nature Reviews: Cancer. 8: 683-693.)

[0164] Em uma modalidade, a translocação do gene c-MAF pode ser determinada por meio do uso de uma sonda específica para a referida translocação.

[0165] Uma modalidade da invenção compreende um método no qual, em uma primeira etapa, é determinado se o gene c-MAF é translocado em uma amostra de um objeto. Em uma modalidade, a amostra é uma amostra de tecido tumoral.

[0166] Em algumas modalidades, a amplificação, ganho e número de cópia do gene c-MAF é determinado após a translocação do gene c-MAF ser determinada.

Em algumas modalidades, uma sonda é usada para determinar se a célula é poliploide para o gene c-MAF. Em algumas modalidades, uma determinação da poliploidia é feita determinando se existem mais de 2 sinais do gene de interesse.

Em algumas modalidades, a poliploidia é determinada medindo o sinal da sonda específica para o gene de interesse e comparando-a com uma sonda centromérica ou outra sonda.

Método de previsão de sobrevida, incluindo IDFS, usando c-MAF

[0167] A presente invenção é direcionada à previsão da IDFS de um objeto que sofre de câncer de mama. Em certas modalidades, os objetos têm um alto nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho de c-MAF. Em outras modalidades, os objetos têm um baixo nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho de c-MAF. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de mama triplo-negativo. Em outras modalidades, o câncer é câncer de mama ER+. Em outras modalidades, o câncer é um câncer de mama ER-. Em certas modalidades, o câncer é um câncer de mama do tipo basal. Em ainda outras modalidades, o câncer é o câncer de mama HER2+. Em algumas modalidades, os objetos são pós- menopáusicos. Em outras modalidades, os objetos são não pós-menopáusicos.

[0168] Em algumas modalidades, a invenção é direcionada a um método in vitro para prever a IDFS de um paciente com câncer de mama que compreende i) quantificar o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho do gene c-MAF em uma amostra do referido objeto e ii) comparar o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho obtido na etapa i) com um valor de referência, em que nível de expressão aumentado, número de cópias, amplificação ou ganho do referido gene em relação ao referido valor de referência é indicativo de um mau prognóstico de IDFS.

[0169] Em uma modalidade, a invenção é direcionada a um método in vitro para prever a IDFS de um paciente com câncer de mama que compreende determinar o nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto em relação a uma referência em que um aumento do nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação à referida referência é indicativo de um mau prognóstico de IDFS.

[0170] Em uma modalidade adicional, a invenção é direcionada a um método in vitro para prever a IDFS, excluindo a recorrência óssea, de um paciente com câncer de mama que compreende determinar o nível de expressão gênica de c- MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto em relação a uma referência em que um aumento do nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação à referida referência é indicativo de um mau prognóstico de IDFS, excluindo a recorrência óssea.

[0171] Em algumas modalidades, o número de cópias de MAF ou o número médio de cópias de MAF por célula, medido usando FISH ≥ 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 ou 3,0, é considerado um valor alto. Em certas modalidades, o valor de MAF FISH é ≥ 2,2. Em outras modalidades, o valor de MAF FISH é ≥ 2,3. Em outras modalidades, o valor de MAF FISH é ≥ 2,4. Em ainda outras modalidades, o valor de MAF FISH é ≥ 2,5.

[0172] Em algumas modalidades, o status de c-MAF do objeto prediz a sobrevida geral ou a duração da sobrevida livre de doença do objeto. Em certas modalidades, o status de c-MAF em qualquer uma das modalidades aqui inclui amplificação do locus cromossômico 16q23 ou 16q22-24, ganho ou translocação de cópia ou falta do mesmo, ou deleções do locus cromossômico 16q23 ou 16q22-24.

Em modalidades particulares, um objeto com um aumento no nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência tem uma sobrevida livre de doença mais curta do que um objeto sem aumento do nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópia, amplificação ou ganho em relação a uma referência. Nas modalidades, a sobrevida livre de doença de um objeto com um aumento no nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência é de pelo menos cerca de 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 1 ano, dezoito meses, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 6 anos, 7 anos, 8 anos, 9 anos, 10 anos ou mais de 10 anos menos que a sobrevida livre de doença de um objeto sem aumento do nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho com relação para uma referência. Em certas modalidades, um objeto com um aumento no nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência tem uma sobrevida geral mais curta do que um objeto sem um aumento no nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópia, amplificação ou ganho em relação a uma referência. Nas modalidades, a sobrevida geral de um objeto com um aumento no nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência é de pelo menos cerca de 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 1 ano, dezoito meses, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 5 anos, 6 anos, 7 anos, 8 anos, 9 anos, 10 anos ou mais de 10 anos menos que a sobrevida livre de doença de um objeto sem um aumento do nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência. Nas modalidades, o objeto é pós-menopáusico. Em outras modalidades, o objeto é não pós-menopáusico. Em algumas modalidades, o objeto é pré- menopáusico.

[0173] Em modalidades, a sobrevida livre de doença de um objeto sem um aumento do nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência é mais longa após o tratamento com um agente modificador ósseo e/ou um agente que evite ou previna a degradação óssea, por exemplo, ácido zoledrônico, do que a sobrevida livre de doença de um objeto com um aumento no nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência. Em modalidades, a sobrevida livre de doença de um objeto sem um aumento no nível de expressão gênica de c- MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência é de pelo menos cerca de 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 1 ano, dezoito meses, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 6 anos, 7 anos, 8 anos, 9 anos, 10 anos ou mais após o tratamento com ácido zoledrônico do que a sobrevida livre de doença de um objeto com um aumento do nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência após o tratamento com um agente modificador ósseo e/ou um agente que evite ou previna a degradação óssea, por exemplo, ácido zoledrônico. Em modalidades, a sobrevida geral de um objeto sem um aumento do nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência é mais longa após o tratamento, um agente modificador ósseo e/ou um agente que evite ou previna degradação óssea, por exemplo, ácido zoledrônico, do que a sobrevida geral de um objeto com um aumento no nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias,

amplificação ou ganho em relação a uma referência. Nas modalidades, a sobrevida geral de um objeto sem um aumento no nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência é de pelo menos cerca de 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 1 ano, dezoito meses, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 5 anos, 6 anos, 7 anos, 8 anos, 9 anos, 10 anos ou mais após o tratamento com ácido zoledrônico do que a sobrevida geral de um objeto com um aumento do nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência após o tratamento com ácido zoledrônico.

Nas modalidades, o objeto é pós-menopáusico. Em outras modalidades, o objeto é não pós-menopáusico. Em algumas modalidades, o objeto é pré-menopáusico.

[0174] Nas modalidades, a sobrevida livre de doença de um objeto com um aumento do nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência é mais curta após o tratamento de um agente modificador ósseo e/ou um agente que evite ou previna a degradação óssea, por exemplo, ácido zoledrônico, do que a sobrevida livre de doença de um objeto sem um aumento no nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência. Nas modalidades, a sobrevida livre de doença de um objeto com um aumento no nível de expressão gênica de c- MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência é de pelo menos cerca de 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 1 ano, dezoito meses, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 6 anos, 7 anos, 8 anos, 9 anos, 10 anos ou mais de 10 anos menos após o tratamento, um agente modificador ósseo e/ou um agente que evite ou previna a degradação óssea, por exemplo, ácido zoledrônico, do que a sobrevida livre de doença de um objeto sem um aumento do nível de expressão gênica de c- MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência após o tratamento, um agente modificador ósseo e/ou um agente que evite ou previna a degradação óssea, por exemplo, ácido zoledrônico. Nas modalidades, a sobrevida geral de um objeto com um aumento do nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência é mais curta após o tratamento, um agente modificador ósseo e/ou um agente que evite ou previna a degradação óssea, por exemplo, ácido zoledrônico, do que a sobrevida geral de um objeto sem aumento no nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência. Nas modalidades, a sobrevida geral de um objeto com um aumento no nível de expressão gênica de c- MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência é de pelo menos cerca de 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 1 ano, dezoito meses, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 5 anos, 6 anos, 7 anos, 8 anos, 9 anos, 10 anos ou mais de 10 anos menos após o tratamento, um agente modificador ósseo e/ou um agente que evite ou previna a degradação óssea, por exemplo, ácido zoledrônico, do que a sobrevida geral de um objeto sem um aumento do nível de expressão gênica de c- MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência após tratamento a um agente modificador ósseo e/ou a um agente que evite ou previna a degradação óssea, por exemplo, ácido zoledrônico. Nas modalidades, o objeto é pós-menopáusico. Em outras modalidades, o objeto é não pós-menopáusico. Em algumas modalidades, o objeto é pré-menopáusico.

[0175] Em modalidades, a sobrevida livre de doença de objetos não menopáusicos com um aumento do nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência é mais curta após o tratamento, um agente modificador ósseo e/ou um agente que evite ou previna a degradação óssea, por exemplo, ácido zoledrônico, do que a sobrevida livre de doença de um objeto sem um aumento no nível de expressão gênica de c-MAF,

número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência. Em modalidades, a sobrevida livre de doença de um objeto não pós-menopáusico com um aumento no nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência é de pelo menos cerca de 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 1 ano, dezoito meses, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 6 anos, 7 anos, 8 anos, 9 anos, 10 anos ou mais de 10 anos menos após o tratamento, um agente modificador ósseo e/ou um agente que evite ou previna a degradação óssea, por exemplo, ácido zoledrônico, do que a sobrevida livre de doença de um objeto sem um aumento do nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência após tratamento a um agente modificador ósseo e/ou a um agente que evite ou previna a degradação óssea, por exemplo, ácido zoledrônico.

[0176] Nas modalidades, a sobrevida geral de um objeto com um aumento do nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência é mais curta após o tratamento de um agente modificador ósseo e/ou de um agente que evite ou previna a degradação óssea, por exemplo, ácido zoledrônico, do que a sobrevida livre de doença de um objeto sem um aumento no nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência. Nas modalidades, a sobrevida geral de um objeto com um aumento no nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência é de pelo menos cerca de 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 1 ano, dezoito meses, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 5 anos, 6 anos, 7 anos, 8 anos, 9 anos, 10 anos ou menos após o tratamento, um agente de modificação óssea e/ou um agente que evite ou previna a degradação óssea, por exemplo, ácido zoledrônico, do que a sobrevida geral de um objeto sem um aumento do nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência após tratamento a um agente modificador ósseo e/ou a um agente que evite ou previna a degradação óssea, por exemplo, ácido zoledrônico. Nas modalidades, o objeto é pós-menopáusico. Em outras modalidades, o objeto é não pós-menopáusico. Em algumas modalidades, o objeto é pré-menopáusico.

[0177] Nas modalidades, o poder preditivo de MAF para a OS ou a DFS de um objeto é baseado no status menopáusico do objeto. Em algumas modalidades, o MAF é preditivo em objetos pós-menopáusicos, desconhecidos e na perimenopausa com risco de uma DFS mais curta ou OS pior. Em outras modalidades, em objetos pré-menopáusicos, os objetos com MAF positivo são aqueles com menos risco e são mais propensos a ter uma DFS mais longa e OS melhor.

[0178] Nas modalidades, o status de MAF do objeto é preditivo dos tratamentos que devem ser recebidos pelo objeto. Em modalidades, o status de c- MAF em qualquer uma das modalidades aqui inclui amplificação do locus cromossômico 16q23 ou 16q22-24, ganho de cópia ou translocação ou falta dos mesmos, ou deleções do locus cromossômico 16q23 ou 16q22-24. Nas modalidades, pacientes pós-menopáusicos com um aumento do nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência (e, portanto, correm um alto risco de um resultado ruim de DFS ou OS) podem ser administrados com qualquer tratamento aqui divulgado. Em algumas modalidades, pacientes pós-menopáusicos com um aumento do nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho com relação a uma referência (e, portanto, correm um alto risco de um resultado ruim de DFS ou OS) podem ser tratados estendendo seu tratamento hormonal para além dos cinco anos prescritos pelo uso de tratamentos hormonais como padrão de atendimento. Em certas modalidades, o tratamento hormonal é o Tamoxifeno e/ou inibidores de aromatase. Pacientes sem aumento do nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em relação a uma referência não devem receber um tratamento aqui divulgado.

[0179] Em uma modalidade particular, o objeto tem metástase ou um prognóstico para sofrer metástase. Em algumas modalidades, a metástase é uma metástase óssea. Em uma modalidade adicional, a metástase óssea é metástase osteolítica.

[0180] Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra primária de tecido tumoral do objeto. Em uma segunda etapa, o nível de expressão gênica de c- MAF, número de cópias, amplificação ou ganho obtido na amostra de tumor do objeto é comparado com o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho do referido gene em uma amostra de controle. A determinação dos níveis de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho deve estar relacionada aos valores de uma amostra de controle ou amostra de referência.

[0181] Em uma modalidade, os métodos da invenção compreendem, em uma segunda etapa, comparar o nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho obtido na amostra de tumor (incluindo, mas não se limitando a, uma biópsia de tumor primário, tumor em circulação células e DNA tumoral circulante) do objeto com o nível de expressão do referido gene em uma amostra de controle.

[0182] Depois que o nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra de tecido tumoral, uma célula tumoral circulante ou DNA tumoral circulante de um objeto com câncer de mama foi medido e comparado com a amostra de controle, se o nível de expressão do referido gene é aumentado em relação ao seu nível de expressão na amostra de controle, então pode-se concluir que o objeto tem um diagnóstico positivo para metástase ou uma maior tendência a desenvolver metástase.

[0183] A determinação do nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho deve ser correlacionada com os valores de uma amostra de controle ou amostra de referência. Dependendo do tipo de tumor a ser analisado, a natureza exata da amostra de controle pode variar. Assim, no caso de um diagnóstico ser avaliado, a amostra de referência é uma amostra de tecido tumoral de um paciente com câncer de mama que não foi metastizado ou que corresponde ao valor médio dos níveis de expressão gênica de c-MAF medidos em uma coleta de tecido tumoral em amostras de biópsia de objetos com câncer de mama que não foram metastizados.

[0184] A referida amostra de referência é tipicamente obtida combinando quantidades iguais de amostras de uma população em questão. Geralmente, as amostras de referência típicas serão obtidas de objetos clinicamente bem documentados e nos quais a ausência de metástase é bem caracterizada. Nessas amostras, as concentrações normais (concentração de referência) do biomarcador (gene c MAF) podem ser determinadas, por exemplo, fornecendo a concentração média na população de referência. Várias considerações são levadas em conta ao determinar a concentração de referência do marcador. Entre essas considerações estão a idade, peso, sexo, condição física geral do paciente e similares. Por exemplo, quantidades iguais de um grupo de pelo menos cerca de 2, pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de

50, pelo menos cerca de 75, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 250, pelo menos pelo menos 500, a mais de 1000 objetos, classificados de acordo com as considerações anteriores, por exemplo, de acordo com várias categorias de idade, são tomados como grupo de referência. A coleta de amostras da qual o nível de referência é derivado será preferivelmente formada por objetos que sofrem do mesmo tipo de câncer que o paciente objeto do estudo (por exemplo, câncer de mama). Da mesma forma, o valor de referência em uma coorte de pacientes pode ser estabelecido usando uma curva de operação de recepção (ROC) e medindo a área sob a curva para todos os pares de sensibilidade e especificidade para determinar qual par fornece os melhores valores e qual é o valor de referência correspondente. ROC é um conceito estatístico padrão. Uma descrição pode ser encontrada em Stuart G. Baker “The Central Role of Receiver Operating Characteristic (ROC) curves in Evaluating Tests for the Early Detection of Cancer” Journal of The National Cancer Institute (2003) Vol 95, No. 7, 511-515.

[0185] Uma vez estabelecido esse valor mediano ou de referência, o nível desse marcador expresso em tecidos tumorais de pacientes com esse valor mediano pode ser comparado e, assim, ser atribuído, por exemplo, ao nível de expressão "aumentado". Devido à variabilidade entre os objetos (por exemplo, aspectos referentes à idade, raça, etc.), é muito difícil (se não praticamente impossível) estabelecer valores de referência absolutos da expressão de c-MAF.

Assim, em modalidades particulares, os valores de referência para expressão "aumentada" ou "reduzida" da expressão de c-MAF são determinados calculando os percentis por meios convencionais, que envolvem a realização de ensaios em uma ou várias amostras isoladas de objetos cuja doença está bem documentada por qualquer um dos métodos mencionados acima dos níveis de expressão de c-MAF.

Os níveis "reduzidos" de c-MAF podem então ser preferivelmente atribuídos a amostras em que os níveis de expressão de c-MAF são iguais ou menores do que o percentil 50 na população normal, incluindo, por exemplo, níveis de expressão iguais ou menores do que o percentil 60 na população normal, iguais ou menores do que o percentil 70 na população normal, iguais ou menores do que o percentil 80 na população normal, iguais ou menores do que o percentil 90 na população normal e iguais ou menores do que o percentil 95 na população normal. Os níveis "aumentados" de expressão gênica de c-MAF podem então ser preferivelmente atribuídos a amostras em que os níveis de expressão gênica de c-MAF são iguais ou maiores que o percentil 50 na população normal, incluindo, por exemplo, níveis de expressão iguais ou maiores que o percentil 60 na população normal, igual ou maior que o percentil 70 na população normal, igual ou maior que o percentil 80 na população normal, igual ou maior que o percentil 90 na população normal e igual a ou maior que o percentil 95 na população normal.

[0186] Em uma modalidade particular, o grau de amplificação ou ganho do gene c-MAF pode ser determinado por meio da determinação da amplificação ou ganho de uma região cromossômica contendo o referido gene. De preferência, a região cromossômica cuja amplificação ou ganho é indicativa da existência de amplificação ou ganho do gene c-MAF é o locus 16q22-q24 que inclui o gene c- MAF. O locus 16q22-q24 está localizado no cromossomo 16, no braço longo do referido cromossomo e em um intervalo entre a banda 22 e a banda 24. Essa região corresponde no banco de dados NCBI com os contigs NT_010498.15 e NT_010542.15. Em uma modalidade, o grau de amplificação ou ganho do gene c- MAF pode ser determinado por meio de uma sonda específica para o referido gene.

[0187] Quando o número de cópias é medido, a amostra de controle se refere a uma amostra de tumor de um paciente com câncer de mama que não sofreu metástase ou que corresponde ao valor mediano do número de cópias do gene c- MAF medido em uma coleção de tecidos tumorais em amostras de biópsia de objetos com câncer de mama que não sofreram metástase. A referida amostra de referência é tipicamente obtida combinando quantidades iguais de amostras de uma população em questão. Se o número de cópias do gene c-MAF for aumentado em relação ao número de cópias do referido gene na amostra de controle, o objeto tem um diagnóstico positivo para metástase ou uma maior tendência a desenvolver metástase. Nas modalidades, o número de cópias é determinado como o número médio de cópias por célula.

[0188] Em algumas modalidades, a amplificação ou ganho está na região no locus 16q23. Em algumas modalidades, a amplificação ou ganho está em qualquer parte da região cromossômica entre Crom. 16 - 79.392.959 pb a 79.663.806 pb (do centrômero ao telômero). Em algumas modalidades, a amplificação ou ganho está na região genômica entre Crom. 16 - 79.392.959 pb a 79.663.806 pb, mas excluindo elementos de repetição de DNA. Em algumas modalidades, a amplificação ou ganho é medido usando uma sonda específica para essa região.

[0189] Em uma modalidade, o gene c-MAF é amplificado em relação a um número de cópia do gene de referência quando o número de cópia do gene c-MAF é maior que o número da cópia que uma amostra de referência ou amostra de controle possui. Em um exemplo, é dito que o gene c-MAF é "amplificado" se o número de cópias genômicas ou o número médio de cópias genômicas do gene c-MAF for aumentado em pelo menos cerca de 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 15-, 20-, 25-, 30-, 35-, 40-, 45- ou 50 vezes em uma amostra de teste em relação a uma amostra de controle. Em outro exemplo, diz-se que um gene c-MAF é "amplificado" se o número de cópias genômicas ou o número médio de cópias genômicas do gene c-MAF por célula for de pelo menos cerca de 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, e similar.

[0190] Em outra modalidade, o número de cópia do gene de referência é o número de cópia do gene em uma amostra de câncer de mama de um objeto que não sofreu metástase óssea.

[0191] Em outra modalidade, a amplificação ou ganho é determinado por meio de hibridação in situ ou PCR.

[0192] Em outra modalidade e como descrito na presente invenção, dado que o chr16q22-24, incluindo o gene c-MAF, é amplificado em células de câncer de mama está relacionado à presença de metástase, recaída ou recorrência do chr16q22-24, incluindo o gene c-MAF, amplificação ou ganho permitem tomar decisões em termos da terapia mais adequada para o objeto que sofre o referido câncer.

[0193] A determinação da amplificação do gene c-MAF precisa ser correlacionada com valores de uma amostra de controle ou amostra de referência que correspondem ao nível de amplificação do gene c-MAF medido em uma amostra de tecido tumoral de um objeto tendo câncer de mama que não sofreu metástase ou que corresponde ao valor médio da amplificação do gene c-MAF medido em uma coleção de tecido tumoral em amostras de biópsia de objetos com câncer de mama que não sofreram metástase. A referida amostra de referência é tipicamente obtida combinando quantidades iguais de amostras de uma população em questão.

[0194] Em geral, as amostras de referência típicas serão obtidas de objetos clinicamente bem documentados e nos quais a ausência de metástase é bem caracterizada. A coleta de amostras da qual o nível de referência é derivado será preferivelmente composta por objetos que sofrem o mesmo tipo de câncer que o paciente objeto do estudo. Uma vez estabelecido esse valor mediano, o nível de amplificação da c-MAF nos tecidos tumorais dos pacientes pode ser comparado com esse valor mediano e, portanto, se houver amplificação, o objeto tem um diagnóstico positivo para metástase ou uma maior tendência a desenvolver metástases.

[0195] Em outro aspecto, a invenção refere-se à determinação de se o gene c-MAF é translocado em uma amostra do referido objeto.

[0196] Em algumas modalidades, o gene translocado é da região no locus 16q23. Em algumas modalidades, o gene translocado é de qualquer parte da região cromossômica entre Crom. 16 - 79.392.959 pb a 79.663.806 pb (do centrômero ao telômero). Em algumas modalidades, o gene translocado é da região genômica entre Crom. 16 - 79.392.959 pb a 79.663.806 pb, mas excluindo elementos de repetição de DNA. Em algumas modalidades, a translocação é medida usando uma sonda específica para essa região.

[0197] Em uma modalidade particular, a translocação do gene c-MAF pode ser determinada por meio da determinação da translocação de uma região cromossômica contendo o referido gene. Em uma modalidade, a translocação é a translocação t(14,16). Em outra modalidade, a região cromossômica que é translocada é do locus 16q22-q24. O locus 16q22-q24 está localizado no cromossomo 16, no braço longo do referido cromossomo e em um intervalo entre a banda 22 e a banda 24. Essa região corresponde no banco de dados NCBI com os contigs NT_010498.15 e NT_010542.15. Em uma modalidade, o gene c-MAF se transloca para o cromossomo 14 no locus 14q32, resultando na translocação t(14,16) (q32, q23). Essa translocação coloca o gene da MAF próximo aos potenciadores fortes no locus da IgH, o que, em alguns casos, leva à superexpressão da MAF. (Eychène, A., Rocques, N., and Puoponnot, C., A new MAFia in cancer. 2008. Nature Reviews: Cancer. 8: 683-693.)

[0198] Em uma modalidade, a translocação do gene c-MAF pode ser determinada por meio do uso de uma sonda específica para a referida translocação.

[0199] Uma modalidade da invenção compreende um método no qual, em uma primeira etapa, é determinado se o gene c-MAF é translocado em uma amostra de um objeto. Em uma modalidade, a amostra é uma amostra de tecido tumoral.

[0200] Em uma modalidade particular, um método da invenção para o prognóstico da tendência a desenvolver metástase óssea em um objeto com câncer de mama compreende determinar o número de cópias do gene c-MAF em uma amostra do referido objeto em que o gene c-MAF é translocado e comparando o referido número de cópias com o número de cópias de uma amostra de controle ou de referência, em que se o número de cópias do c-MAF for maior em relação ao número de cópias do c-MAF de uma amostra de controle, o objeto terá uma tendência maior a desenvolver metástase óssea.

[0201] Métodos para determinar se o gene c-MAF ou a região cromossômica 16q22-q24 são translocados são amplamente conhecidos no estado da técnica e incluem aqueles descritos anteriormente para a amplificação de c-MAF. Os referidos métodos incluem, sem limitação, hibridização in situ (ISH) (como hibridização por fluorescência in situ (FISH), hibridização cromogênica in situ (CISH) ou hibridização in situ de prata (SISH)), hibridação comparativa genômica ou reação em cadeia da polimerase (como PCR quantitativa em tempo real). Para qualquer método ISH, a amplificação, o ganho, o número de cópias ou a translocação podem ser determinados contando o número de pontos fluorescentes, pontos coloridos ou pontos com prata nos cromossomos ou no núcleo. Em outras modalidades, a detecção de alterações no número de cópias e translocações pode ser detectada através do uso de sequenciamento de genoma completo, sequenciamento de exoma ou pelo uso de qualquer tecnologia derivada de PCR. Por exemplo, a PCR pode ser realizada em amostras de DNA genômico para detectar a translocação. Em uma modalidade, a PCR quantitativa é usada. Em uma modalidade, a PCR é realizada com um iniciador específico para o gene c-MAF e um iniciador específico para a região promotora de IGH; se um produto é produzido, ocorreu a translocação.

[0202] Em algumas modalidades, o número de amplificação, ganho e cópia do gene c-MAF são determinados após a translocação do gene c-MAF ser determinada. Em algumas modalidades, uma sonda é usada para determinar se a célula é poliploide para o gene c-MAF. Em algumas modalidades, uma determinação da poliploidia é feita determinando se existem mais de 2 sinais do gene de interesse.

Em algumas modalidades, a poliploidia é determinada medindo o sinal da sonda específica para o gene de interesse e comparando-o com uma sonda centromérica ou outra sonda.

Métodos de medição da expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação, ganho e translocação

[0203] Em algumas modalidades, o nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação, ganho ou translocação é medido usando qualquer método conhecido na técnica ou aqui descrito.

[0204] O nível de expressão da proteína c-MAF pode ser quantificado por qualquer método convencional que permita detectar e quantificar a referida proteína em uma amostra de um objeto. A título de ilustração não limitativa, os referidos níveis de proteína podem ser quantificados, por exemplo, utilizando anticorpos com capacidade de ligação a c-MAF (ou um seu fragmento contendo um determinante antigênico) e a subsequente quantificação dos complexos formados. Os anticorpos utilizados nestes ensaios podem ou não serem marcados. Exemplos ilustrativos de marcadores que podem ser utilizados incluem isótopos radioativos, enzimas, fluoróforos, reagentes de quimioluminescência, substratos ou cofatores de enzimas, inibidores de enzimas, partículas, corantes, etc. Há uma ampla gama de ensaios conhecidos que podem ser utilizados na presente invenção, os quais use anticorpos não marcados (anticorpo primário) e anticorpos marcados (anticorpo secundário); essas técnicas incluem transferência Western-blot ou Western, ELISA (ensaio imunossorvente ligado a enzima), RIA (radioimunoensaio), EIA competitiva (imunoensaio enzimático competitivo), DAS-ELISA (ELISA sanduíche de anticorpo duplo), técnicas imunocitoquímicas e imunohistoquímicas, técnicas baseadas no uso de micromatrizes de proteínas ou biochips, incluindo anticorpos ou ensaios específicos com base na precipitação coloidal em formatos como varetas. Outras maneiras de detectar e quantificar a referida proteína c-MAF incluem técnicas de cromatografia de afinidade, ensaios de ligação a ligandos, etc. Quando um método imunológico é usado, qualquer anticorpo ou reagente que se sabe se ligar à proteína c-MAF com alta afinidade pode ser utilizado para detectar a sua quantidade. Isso inclui, entre outros, o uso de um anticorpo, por exemplo, soros policlonais, sobrenadantes de hibridomas ou anticorpos monoclonais, fragmentos de anticorpos, Fv, Fab, Fab’e F(ab’)2, scFv, diabéticos humanizados, triacorpos, tetrocorpos, anticorpos, nanocorpos, alfabetos, peptídeos grampeados e ciclopeptídeos. Existem anticorpos comerciais da proteína anti-c-MAF no mercado que podem ser utilizados no contexto da presente invenção, como por exemplo os anticorpos ab427, ab55502, ab55502, ab72584, ab76817, ab77071 (Abcam plc, 330 Science Park, Cambridge CB4 0FL, Reino Unido), o anticorpo monoclonal O75444 (anticorpo monoclonal livre de AzF anti-MAF humano, não acoplado, clone 6b8) de AbD Serotec, etc. Existem muitas empresas comerciais que oferecem anticorpos anti-c- MAF, como a Abnova Corporation, Bethyl Laboratories, Bioworld Technology, GeneTex, etc.

[0205] Em algumas modalidades, os níveis de proteína c-MAF são detectados por um membro de ligação a antígeno ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, o membro de ligação é uma molécula de ligação a antígeno ou fragmento do mesmo que se liga ao c-MAF humano, em que a molécula de ligação a anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma CDR1 de cadeia pesada pelo menos cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e/ou uma CDR2 de cadeia pesada pelo menos cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 99% ou cerca de 100% são idênticos à sequência de aminoácidos de

SEQ ID NO: 22 e/ou uma CDR3 de cadeia pesada pelo menos cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; e/ou compreendendo uma CDR1 de cadeia leve pelo menos cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e/ou uma CDR2 de cadeia leve pelo menos cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e/ou uma CDR3 de cadeia leve pelo menos cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 99% ou cerca de 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20.

[0206] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende um domínio VH com uma sequência que é pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.

[0207] Em algumas modalidades, a molécula de ligação a antígeno ou fragmento do mesmo compreende um domínio VL com uma sequência que é pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.

[0208] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma sequência de cadeia pesada que é pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, em pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99%

ou pelo menos cerca de 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

14.

[0209] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma sequência de cadeia leve que é pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, em pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

[0210] Em algumas modalidades, a molécula de ligação a antígeno ou fragmento do mesmo é um anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo de coelho, um anticorpo de camundongo, um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado. Em um aspecto, a presente invenção é direcionada a um membro de ligação, fragmento funcional, anticorpo ou variante do mesmo que se liga especificamente ao epítopo codificado por SEQ ID NO: 24. Em algumas modalidades, o anticorpo é qualquer anticorpo descrito em Pedido Inter. No.

PCT/IB2015/059562, que é incorporado aqui por referência na sua totalidade.

[0211] Em uma modalidade particular, os níveis de proteína c-MAF são meios quantificados de western blot, imunoistoquímica, ELISA ou uma matriz de proteínas.

[0212] Como entendido pelo especialista na técnica, os níveis de expressão gênica podem ser quantificados medindo os níveis de RNA mensageiro do referido gene ou da proteína codificada pelo referido gene. Em alguma modalidade, o nível de expressão gênica pode ser quantificado por qualquer meio conhecido na técnica.

[0213] Para esse fim, a amostra biológica pode ser tratada para quebrar física ou mecanicamente a estrutura do tecido ou da célula, liberando os componentes intracelulares em uma solução aquosa ou orgânica para a preparação de ácidos nucléicos. Os ácidos nucleicos são extraídos por meio de métodos disponíveis comercialmente, conhecidos pelo especialista na técnica (Sambroock, J.,

et al., "Molecular cloning: a Laboratory Manual", 3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1-3.)

[0214] Assim, o nível de expressão gênica de c-MAF pode ser quantificado a partir do RNA resultante da transcrição do referido gene (RNA mensageiro ou mRNA) ou, alternativamente, do DNA complementar (cDNA) do referido gene.

Portanto, em uma modalidade particular da invenção, a quantificação dos níveis de expressão gênica de c-MAF compreende quantificar o RNA mensageiro do gene c- MAF ou de um fragmento do referido mRNA, DNA complementar do gene c-MAF ou um fragmento do referido cDNA ou a sua mistura.

[0215] Praticamente qualquer método convencional pode ser utilizado dentro do escopo da invenção para detectar e quantificar os níveis de mRNA codificados pelo gene c-MAF ou pelo cDNA correspondente. A título de ilustração não limitativa, os níveis de mRNA codificado pelo referido gene podem ser quantificados usando métodos convencionais, por exemplo, métodos compreendendo a amplificação de mRNA e a quantificação do referido produto de amplificação de mRNA, como eletroforese e coloração, ou alternativamente, por Southern blot e usando sondas adequadas, Northern blot e usando sondas específicas do mRNA do gene de interesse (c-MAF) ou do cDNA correspondente do mesmo, mapeando com nuclease S1, RT-PCR, hibridação, micromatrizes, etc., de preferência por meios de PCR quantitativa em tempo real usando um marcador adequado. Da mesma forma, os níveis de cDNA correspondentes ao mRNA codificado pelo gene c-MAF também podem ser quantificados por meio de técnicas convencionais; neste caso, o método da invenção inclui uma etapa para sintetizar o cDNA correspondente por meios de transcrição reversa (RT) do mRNA correspondente seguido pela amplificação e quantificação do referido produto de amplificação de cDNA. Métodos convencionais para quantificação dos níveis de expressão podem ser encontrados, por exemplo, em Sambrook et al., 2001. (citado ad supra). Estes métodos são conhecidos na técnica e um especialista na técnica estaria familiarizado com as normalizações necessárias para cada técnica. Por exemplo, as medições de expressão geradas usando a PCR multiplex devem ser normalizadas comparando a expressão dos genes que estão sendo medidos com os chamados genes de "tarefas domésticas", cuja expressão deve ser constante em todas as amostras, fornecendo, assim, uma expressão de linha de base para comparar ou outros genes de controle cuja expressão é conhecida por ser modulada com câncer.

[0216] Em uma modalidade particular, os níveis de expressão gênica de c- MAF são quantificados por meio de reação em cadeia da polimerase (PCR) quantitativa ou por uma técnica de hibridação de DNA, RNA ou matriz de nucleotídeos.

[0217] Além disso, o nível de expressão gênica de c-MAF também pode ser quantificado por meio da quantificação dos níveis de expressão da proteína codificada pelo referido gene, por exemplo, a proteína c-MAF (c-MAF) [NCBI, número de acesso O75444 ] ou qualquer variante funcionalmente equivalente da proteína c-MAF. Existem duas isoformas da proteína c-MAF, a isoforma α (NCBI, NP_005351.2) composta de 403 aminoácidos (SEQ ID NO: 4) e a isoforma β (NP_001026974.1) composta de 373 aminoácidos (SEQ ID NO: 5). O nível de expressão gênica de c-MAF pode ser quantificado por meio da quantificação dos níveis de expressão de qualquer uma das isoformas da proteína c-MAF. Assim, em uma modalidade particular, a quantificação dos níveis da proteína codificada pelo gene c-MAF compreende a quantificação da proteína c-MAF.

[0218] Métodos para determinar se o gene c-MAF ou a região cromossômica 16q22-q24 são amplificados são amplamente conhecidos no estado da técnica. Os referidos métodos incluem, sem limitação, hibridação in situ (ISH) (como hibridação por fluorescência in situ (FISH), hibridação cromogênica in situ (CISH) ou hibridização in situ de prata (SISH)), hibridização comparativa genômica ou reação em cadeia da polimerase (tal como PCR quantitativa em tempo real). Para qualquer método ISH, a amplificação, o ganho ou o número de cópias podem ser determinados contando o número de pontos fluorescentes, pontos coloridos ou pontos com prata nos cromossomos ou no núcleo.

[0219] A hibridação por fluorescência in situ (FISH) é uma técnica citogenética usada para detectar e localizar a presença ou ausência de sequências específicas de DNA nos cromossomos. FISH usa sondas de fluorescência que se ligam apenas a algumas partes do cromossomo com as quais mostram um alto grau de similaridade de sequência. Em um método típico de FISH, a sonda de DNA é marcada com uma molécula fluorescente ou um hapteno, normalmente na forma de fluor-dUTP, digoxigenina-dUTP, biotina-dUTP ou hapten-dUTP, que é incorporada no DNA usando reações enzimáticas, tal como tradução de Nick ou PCR. A amostra que contém o material genético (os cromossomos) é colocada em lâminas de vidro e é desnaturada por um tratamento com formamida. A sonda marcada é então hibridizada com a amostra que contém o material genético sob condições adequadas que serão determinadas pelo especialista na técnica. Após a hibridação, a amostra é visualizada diretamente (no caso de uma sonda marcada com flúor) ou indiretamente (usando anticorpos marcados com fluorescência para detectar o hapteno).

[0220] No caso de CISH, a sonda é marcada com digoxigenina, biotina ou fluoresceína e é hibridizada com a amostra que contém o material genético em condições adequadas.

[0221] Os métodos para determinar se o gene c-MAF ou a região cromossômica 16q22-q24 são translocados são amplamente conhecidos no estado da técnica e incluem aqueles descritos anteriormente para a amplificação de c-MAF.

Os referidos métodos incluem, sem limitação, hibridação in situ (ISH) (como hibridação por fluorescência in situ (FISH), hibridação cromogênica in situ (CISH) ou hibridização in situ de prata (SISH)), hibridização comparativa genômica ou reação em cadeia da polimerase (tal como PCR quantitativa em tempo real). Para qualquer método ISH, a amplificação, o ganho, o número de cópias ou a translocação pode ser determinado contando o número de pontos fluorescentes, pontos coloridos ou pontos com prata nos cromossomos ou no núcleo. Em outras modalidades, a detecção de alterações no número de cópias e translocações pode ser detectada através do uso de sequenciamento de genoma completo, sequenciamento de exoma ou pelo uso de qualquer tecnologia derivada de PCR. Por exemplo, a PCR pode ser realizada em amostras de DNA genômico para detectar a translocação. Em uma modalidade, a PCR quantitativa é usada. Em uma modalidade, a PCR é realizada com um iniciador específico para o gene c-MAF e um iniciador específico para a região promotora de IGH; se um produto é produzido, ocorreu a translocação.

[0222] Qualquer molécula de marcação ou rotulagem que pode se ligar a um DNA pode ser usada para marcar as sondas utilizadas nos métodos da invenção, permitindo assim a detecção de moléculas de ácido nucleico. Exemplos de marcadores para a marcação incluem, embora não limitados a, isótopos radioativos, substratos enzimáticos, cofatores, ligandos, agentes de quimioluminescência, fluoróforos, haptenos, enzimas e combinações dos mesmos. Métodos para rotulagem e diretrizes para seleção de rótulos adequados para diferentes finalidades podem ser encontrados, por exemplo, em Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989) e Ausubel et al. (Em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley e Sons, Nova Iorque, 1998).

[0223] Em algumas modalidades, uma sonda da invenção é uma sonda de duas cores. Em algumas modalidades, uma sonda da invenção é uma sonda de fusão dupla. Em algumas modalidades, uma sonda da invenção é uma sonda de fusão dupla de cor dupla. Em algumas modalidades, duas sondas separadas são usadas.

[0224] Em outra modalidade, uma das seguintes sondas é usada para medir o gene c-MAF (incluindo a tradução do gene c-MAF): a sonda de fusão dupla e cor dupla Vysis LSI IGH/MAF (http://www.abbottmolecular.com/us/products/analyte-

specific-reagent/fish/vysis-lsi-igh-maf-dual-color-dual-fusion-probe.html; último acesso em 05/11/2012), que compreende uma sonda contra 14q32 e 16q23; uma sonda de fusão MAF/IGH gt(14;16) de Kreatech diagnostics

(https://www.leicabiosystems.com/fileadmin/img_uploads/kreatech/ifu/PI-KI-

10610_D2.1.pdf; último acesso em 05/18/2017), uma sonda MAF FISH da Abnova

(http://www.abnova.com/products/products_detail.asp?Catalog_id=FA0375; último acesso em 05/11/2012), uma sonda de translocação de Duas cores, duas fusões

IGH/MAF de Cancer Genetics Italia (http://www.cancergeneticsitalia.com/dna-fish-

probe/ighmaf/; último acesso em 05/11/2012), um sonda FISH IGH/MAF-

t(14;16)(q32;q23) de Creative Bioarray (http://www.creative-

bioarray.com/products.asp?cid=35&page=10; último acesso em 05/11/2012), um quadro de mieloma múltiplo de Arup Laboratories por FISH

(http://www.aruplab.com/files/technical-

bulletins/Multiple%20Myeloma%20%28MM%29%20by%20FISH.pdf; último acesso em 05/11/2012), uma sonda Agilent específica para 16q23 ou 14q32

(http://www.genomics.agilent.com/ProductSearch.aspx?chr=16&start=79483700&en d=79754340; último acesso em 05/11/2012;

http://www.genomics.agilent.com/ProductSearch.aspx?Pageid=3000&ProductID=63;

último acesso em 05/11/2012), uma sonda Dako específica para 16q23 ou 14q32

(http://www.dako.com/us/ar42/psg42806000/baseproducts_surefish.htm?setCountry

=true&purl=ar42/psg42806000/baseproducts_surefish.htm?undefined&submit=Accep t%20country; último acesso em 05/11/2012), uma sonda de fusão dupla de translocação IGH/MAF da Cytocell

(http://www.zentech.be/uploads/docs/products_info/prenatalogy/cytocell%202012-

2013%20catalogue%5B3%5D.pdf; último acesso em 05/11/2012), uma Sonda de fusão dupla – translocação da IGH/MAF da Metasystems XL (http://www.metasystems- international.com/index.php?option=com_joodb&view=article&joobase=5&id=12%3A d-5029-100-og&Itemid=272; último acesso em 05/11/2012), uma Sonda XL de Zeiss FISH, 100µl, IGH/MAFB (https://www.micro- shop.zeiss.com/?s=440675675dedc6&l=en&p=uk&f=r&i=5000&o=&h=25&n=1&sd=0 00000-0528-231-uk; último acesso em 05/11/2012) ou uma sonda de fusão dupla IGH/MAF da Genycell Biotech (http://www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=& esrc=s&source=web&cd=1&ved=0CCQQFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.genycell.e s%2Fimages%2Fproductos%2Fbrochures%2Flphmie6__86.ppt&ei=MhGYUOi3GKW H0QGlt4DoDw&usg=AFQjCNEqQMbT8vQGjJbi9riEf3lVgoFTFQ&sig2=V5IS8juEMV HB18Mv2Xx_Ww; último acesso em 05/11/2012).

[0225] Em algumas modalidades, o rótulo na sonda é um fluoróforo. Em algumas modalidades, o fluoróforo na sonda é laranja. Em algumas modalidades, o fluoróforo na sonda é verde. Em algumas modalidades, o fluoróforo na sonda é vermelho. Em alguns casos, o fluoróforo na sonda é amarelo. Em algumas modalidades, uma sonda é marcada com um fluoróforo vermelho e outra com um fluoróforo verde. Em algumas modalidades, uma sonda é marcada com um fluoróforo verde e outra com um fluoróforo laranja. Em alguns casos, o fluoróforo na sonda é amarelo. Por exemplo, se a sonda específica de MAF estiver marcada com um fluoróforo vermelho e a sonda específica do IGH estiver marcada com um fluoróforo verde, se branco for visto, isso indica que os sinais se sobrepõem e translocação ocorreu.

[0226] Em algumas modalidades, o fluoróforo é SpectrumOrange. Em algumas modalidades, o fluoróforo é SpectrumGreen. Em algumas modalidades, o fluoróforo é DAPI. Em algumas modalidades, o fluoróforo é PlatinumBright405 Em algumas modalidades, o fluoróforo é PlatinumBright415. Em algumas modalidades, o fluoróforo é PlatinumBright495. Em algumas modalidades, o fluoróforo é PlatinumBright505. Em algumas modalidades, o fluoróforo é PlatinumBright550. Em algumas modalidades, o fluoróforo é PlatinumBright547. Em algumas modalidades, o fluoróforo é PlatinumBright570. Em algumas modalidades, o fluoróforo é PlatinumBright590. Em algumas modalidades, o fluoróforo é PlatinumBrig ht647. Em algumas modalidades, o fluoróforo é PlatinumBright495/550. Em algumas modalidades, o fluoróforo é PlatinumBright415/495/550. Em algumas modalidades, o fluoróforo é DAPI/PlatinumBright495/550. Em algumas modalidades, o fluoróforo é FITC. Em algumas modalidades, o fluoróforo é o Texas Red. Em algumas modalidades, o fluoróforo é DEAC. Em algumas modalidades, o fluoróforo é R6G.

Em algumas modalidades, o fluoróforo é Cy5. Em algumas modalidades, o fluoróforo é FITC, Texas Red e DAPI. Em algumas modalidades, um contracorante DAPI é usado para visualizar a translocação, amplificação, ganho ou alteração no número de cópias.

Agentes e terapias para uso em métodos de tratamento ou prevenção de câncer de mama

[0227] Em algumas modalidades, os métodos da invenção aqui incluem tratamento de objetos com agentes para evitar, tratar ou prevenir a remodelação óssea. Como usado aqui, um "agente para evitar, tratar ou impedir a remodelação óssea" refere-se a qualquer molécula capaz de tratar ou interromper a degradação óssea, quer estimulando a proliferação de osteoblastos ou inibindo a proliferação de osteoclastos, incluindo agentes para evitar, tratar ou impedir a degradação óssea.

Nas modalidades, o agente para evitar ou impedir a remodelação óssea é um agente modificador ósseo e/ou um agente que evita, trata ou previne a degradação óssea. Nas modalidades, os agentes para evitar, tratar ou prevenir a remodelação óssea são usados como terapias adjuvantes. Em outras modalidades, os agentes para evitar, tratar ou prevenir a remodelação óssea são usados como terapias neoadjuvantes. Exemplos ilustrativos de agentes utilizados para evitar, tratar e/ou prevenir a degradação óssea incluem os agentes divulgados na Pedido U.S. No.

14/391,085, Pedido Provisório U.S. No.61/801.769, Pedido Provisório U.S.

No.14/776.390, Pedido U.S. No. 14/776.412, Pedido U.S. No. 14/405.724, Pedido U.S. No. 14/050.262, Pedido U.S. No. 14/435,128, Pedido U.S. No. 15/027.946 Pedido U.S. No. 15/014.916, Pedido U.S. No. 15/534.893 e Pedido U.S. No.

14/776.453 e Pedido Inter. No. PCT/IB2017/053094, incluindo os seguintes agentes: - Bisfosfonatos: são um grupo de medicamentos utilizados para a prevenção e o tratamento de doenças com nova absorção e reabsorção óssea, tais como osteoporose e câncer com metástase óssea, sendo este último com ou sem hipercalcemia, associado ao câncer de mama. Exemplos de bifosfonatos que podem ser utilizados na terapia projetada por meio de qualquer método da invenção incluem, embora não se limitem a, bifosfonatos nitrogenados (como pamidronato, neridronato, olpadronato, alendronato, ibandronato, risedronato, incadronato, zoledronato ou ácido zoledrônico, etc.) e bifosfonatos não nitrogenados (como etidronato, clodronato, tiludronato, etc.). Em uma modalidade particular, o bisfosfonato é ácido zoledrônico. Em uma modalidade diferente, o bisfosfonato é clodronato. Em uma modalidade, o bisfosfonato é alendronato, risedronato ou ibandronato. O uso de bisfosfonatos, ácido zoledrônico, clodronato, alendronato, risedronato ou ibandronato como tratamentos adjuvantes no câncer de mama precoce, incluindo dados de ensaios clínicos, pode ser encontrado em Hadji et al., Annals of Oncology, 27: 379-390 (2016); Paterson et al., J. Clin. Med. 2 (4): 263-301 (2013). Nas modalidades, vários aspectos do clodronato são cobertos por, por exemplo, Pat. U.S. Nos 4859472 e Pedido Inter. WO1995013054 (todo o conteúdo de cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade). Nas modalidades, o clodronato é representado pela seguinte fórmula:

[0228] As diretrizes para o uso adjuvante de bisfosfonatos podem ser encontradas DHESY-THIND, S., et al., J Clin Oncol 35, Sociedade Americana de Oncologia Clínica, Estados Unidos, 22 páginas (publicadas on-line antes da impressão em 6 de março de 2017) (todo o conteúdo deste documento é aqui incorporado por referência). Um ensaio clínico descrevendo o uso de clodronato como tratamento adjuvante é descrito em PATERSON, AHG, et al., The Lancet Oncology 13 (7): 734-742, (2012) (todo o conteúdo deste documento é aqui incorporado por referência). Um ensaio clínico que descreve o uso de ácido zoledrônico é descrito no Protocolo da triagem AZURE para: COLEMAN, RE, et al., The New England Journal of Medicine 365 (15): 1396-1405, (2011) e COLEMAN, RE, et al., The New England Journal of Medicine 365 (15): 1396-1405, (2011) (todo o conteúdo deste documento é aqui incorporado por referência). Nas modalidades, o bisfosfonato é administrado por via intravenosa. Em outras modalidades, o bisfosfonato é administrado por via oral.

- "Inibidores de RANKL", tal como aqui utilizado, refere-se a qualquer composto que seja capaz de reduzir a atividade de RANK.

[0229] Em uma modalidade, o inibidor de RANKL é um anticorpo específico para RANKL. Em uma modalidade particular, o anticorpo anti-RANKL é um anticorpo monoclonal. Em uma modalidade ainda mais específica, o anticorpo anti-RANKL é o Denosumabe (Pageau, Steven C. (2009). MAbs 1 (3): 210-215, número CAS 615258-40-7) (todo o conteúdo deste documento é aqui incorporado por referência).

O Denosumabe é um anticorpo monoclonal totalmente humano que se liga ao RANKL e previne sua ativação (não se liga ao receptor RANK). Em modalidades, vários aspectos de Denosumabe são cobertos pela Patente U.S. 6.740.522;

7.411.050; 7.097.834; 7.364.736; 7.411.050; 7.744.886; 7.923.008; 8.058.418;

8.333.963; 8.377.690; e 8.409.578 (todo o conteúdo de cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade). As diretrizes canadenses para o uso de Denosumabe podem ser encontradas em Paterson et al., J. Clin. Med. 2 (4): 263- 301 (2013) (todo o conteúdo deste documento é aqui incorporado por referência).

Um ensaio clínico que descreve o uso de denosumabe pode ser encontrado em https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01077154 (última visita a 25 de agosto de 2017) (todo o conteúdo deste documento é aqui incorporado por referência). Em outra modalidade, o inibidor de RANKL é um anticorpo, fragmento de anticorpo ou construto de fusão que se liga ao mesmo epítopo que o Denosumabe. Nas modalidades, o Denosumabe é administrado por subcutaneamente.

[0230] Em uma modalidade, o agente que previne a degradação óssea é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido zoledrônico, clodronato e denosumabe.

[0231] Alternativamente, um tratamento combinado pode ser realizado no qual mais de um agente daqueles mencionados acima ou um ou mais agentes divulgados neste documento ou divulgados no Pedido U.S. No. 14/391,085, Pedido Provisório U.S. No.61/801.769, Pedido Provisório U.S. No.14/776.390, Pedido U.S.

No. 14/776.412, Pedido U.S. No. 14/405.724, Pedido U.S. No. 14/050.262, Pedido U.S. No. 14/435,128, Pedido U.S. No. 15/027.946 Pedido U.S. No. 15/014.916, Pedido U.S. No. 15/534,893, Pedido U.S. No. 14/776.453 e Pedido Inter. No.

PCT/IB2017/053094, cada um dos quais é incorporado aqui por referência na sua totalidade, são combinados para tratar e/ou prevenir as metástases, recaídas ou recorrências ou os referidos agentes podem ser combinados com outros suplementos, como cálcio ou vitamina D ou combinado com um tratamento hormonal.

[0232] Nas modalidades, os pacientes são tratados no cenário adjuvante com qualquer terapia para melhorar o resultado dos pacientes. Estas terapias incluem qualquer terapia aqui divulgada ou um ou mais agentes aqui divulgados ou divulgados na Pedido U.S. No. 14/391,085, Pedido Provisório U.S. No.61/801.769, Pedido Provisório U.S. No.14/776.390, Pedido U.S. No. 14/776.412, Pedido U.S. No.

14/405.724, Pedido U.S. No. 14/050.262, Pedido U.S. No. 14/435,128, Pedido U.S.

No. 15/027.946 Pedido U.S. No. 15/014.916, Pedido U.S. No. 15/534.893 e Pedido U.S. No. 14/776.453 e Pedido Inter. No. PCT/IB2017/053094, cada um dos quais é incorporado aqui por referência na sua totalidade, incluindo agentes para evitar, tratar ou prevenir a remodelação óssea, agentes para melhorar a sobrevida livre de doença ou sobrevida geral, agentes inibidores da c-MAF, quimioterapia, hormônio terapia, inibidores de m-Tor, inibidores de CDK4/6, Radium-223, um antagonista de CCR5, um inibidor de Src quinase ou um inibidor de COX-2 e suas combinações.

[0233] Quando o câncer é metastizado, são utilizados tratamentos sistêmicos, incluindo, entre outros, quimioterapia, tratamento hormonal, imunoterapia ou uma combinação dos mesmos. Além disso, radioterapia e/ou cirurgia podem ser usadas. A escolha do tratamento geralmente depende do tipo de câncer primário, do tamanho, da localização das metástases, da idade, da saúde geral do paciente e dos tipos de tratamentos usados anteriormente.

[0234] Os tratamentos sistêmicos são aqueles que atingem todo o corpo: - Quimioterapia é o uso de medicamentos para destruir células cancerosas.

Os medicamentos são geralmente administrados por via oral ou intravenosa. Em outras modalidades, o tratamento é quimioterapia. Em algumas modalidades, a quimioterapia é qualquer quimioterapia que é conhecida na técnica. Em modalidades particulares, a quimioterapia é quimioterapia adjuvante. Em certas modalidades, a quimioterapia é um taxano. Em outras modalidades, o taxano é Paclitaxel (Taxol), docetaxel (Taxotere) ou Cabazitaxel. Os medicamentos são geralmente administrados por via oral ou intravenosa. Às vezes, a quimioterapia é usada juntamente com o tratamento com radiação. A terapia hormonal é baseada no fato de que alguns hormônios promovem o crescimento do câncer. Por exemplo, o estrogênio em mulheres produzido pelos ovários às vezes promove o crescimento do câncer de mama. Existem várias maneiras de interromper a produção desses hormônios. Uma maneira é remover os órgãos que os produzem: os ovários, no caso das mulheres, os testículos, no caso dos homens. Mais frequentemente, podem ser utilizados medicamentos para impedir que esses órgãos produzam os hormônios ou para impedir que os hormônios atuem nas células cancerosas. Nas modalidades, o tratamento é terapia hormonal. Em certas modalidades, a terapia hormonal é o Tamoxifeno e/ou um inibidor da aromatase.

- Imunoterapia é um tratamento que auxilia o próprio sistema imunológico do paciente no combate ao câncer. Existem vários tipos de imunoterapia que são usados para tratar metástases em pacientes. Estes incluem, entre outros, citocinas, anticorpos monoclonais e vacinas antitumorais.

[0235] Os agentes para evitar, tratar ou prevenir a remodelação óssea são tipicamente administrados em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0236] O termo "veículo" refere-se a um diluente ou excipiente pelo qual o ingrediente ativo é administrado. Esses veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, como água e óleo, incluindo aqueles de origem petrolífera, animal, vegetal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. Soluções salinas aquosas ou aquosas e soluções aquosas de dextrose e glicerol, particularmente para soluções injetáveis, são preferivelmente usadas como veículos. Os veículos farmacêuticos adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por EW Martin, 1995. De preferência, os veículos da invenção são aprovados pela agência reguladora do governo estadual ou federal ou estão listados na Farmacopeia dos Estados Unidos ou em outra farmacopeia geralmente reconhecida pelo dos mesmos em animais e mais particularmente em seres humanos.

[0237] Os veículos e substâncias auxiliares necessários para fabricar a forma de dosagem farmacêutica desejada da composição farmacêutica da invenção dependerão, entre outros fatores, da forma de dosagem farmacêutica escolhida. As referidas formas de dosagem farmacêutica da composição farmacêutica serão fabricadas de acordo com os métodos convencionais conhecidos pelo especialista na técnica. Uma revisão dos diferentes métodos para administrar ingredientes ativos, excipientes a serem utilizados e processos para produzi-los pode ser encontrada em "Tratado de Farmacia Galénica", C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A.

Edição de 1993. Exemplos de composições farmacêuticas incluem qualquer composição sólida (comprimidos, pílulas, cápsulas, grânulos, etc.) ou composição líquida (soluções, suspensões ou emulsões) para administração oral, tópica ou parentérica. Além disso, a composição farmacêutica pode conter, conforme necessário, estabilizadores, suspensões, conservantes, surfactantes e similares.

[0238] Para uso em medicina, os agentes de remodelação óssea podem ser encontrados na forma de pró-droga, sal, solvato ou clatrato, isolados ou em combinação com agentes ativos adicionais e podem ser formulados em conjunto com um excipiente farmaceuticamente aceitável. Os excipientes preferidos para uso dos mesmos na presente invenção incluem açúcares, amidos, celuloses, borrachas e proteínas. Em uma modalidade particular, a composição farmacêutica da invenção será formulada em uma forma de dosagem farmacêutica sólida (por exemplo, comprimidos, cápsulas, pílulas, grânulos, supositórios, cristais estéreis ou sólidos amorfos que podem ser reconstituídos para fornecer formas líquidas etc.), forma de dosagem farmacêutica líquida (por exemplo, soluções, suspensões, emulsões, elixires, loções, unguentos, etc.) ou forma de dosagem farmacêutica semissólida (géis, unguentos, cremes e similares). As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas por qualquer via, incluindo mas não se limitando à via oral, via intravenosa, via intramuscular, via intra-arterial, via intramedular, via intratecal, via intraventricular, via transdérmica, via subcutânea, via intraperitoneal, intranasal rota, rota entérica, rota tópica, rota sublingual ou rota retal. Uma revisão das diferentes maneiras de administrar ingredientes ativos, dos excipientes a serem utilizados e de seus processos de fabricação pode ser encontrada no Tratado de Farmacia Galénica, C. Faulí e Trillo, Luzán 5, SA, edição de 1993 e em Remington's Pharmaceutical Sciences (AR Gennaro, Ed.), 20ª edição, Williams & Wilkins PA, EUA (2000). Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos no estado da técnica e incluem soluções salinas tamponadas com fosfato, água, emulsões como emulsões óleo/água, diferentes tipos de agentes umectantes, soluções estéreis, etc. As composições compreendendo os referidos veículos podem ser formuladas por processos convencionais conhecidos no estado da técnica.

[0239] Os agentes de prevenção e remodelação óssea ou as composições farmacêuticas que os contêm podem ser administrados a uma dose inferior a 10 mg por quilograma de peso corporal, de preferência inferior a pelo menos 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 ou 0,00001 mg por kg de peso corporal. A dose unitária pode ser administrada por injeção, inalação ou administração tópica. Em modalidades particulares, o agente é administrado na sua dose aprovada.

[0240] A dose depende da gravidade e da resposta da condição a ser tratada e pode variar entre vários dias e meses ou até que a condição desapareça. A dosagem ideal pode ser determinada medindo periodicamente as concentrações do agente no corpo do paciente. A dose ideal pode ser determinada a partir dos valores de EC50 obtidos por meio de ensaios anteriores in vitro ou in vivo em modelos de animal. A dose unitária pode ser administrada uma vez ao dia ou menos de uma vez ao dia, de preferência menos de uma vez a cada 2, 4, 8 ou 30 dias.

Alternativamente, é possível administrar uma dose inicial seguida por uma ou várias doses de manutenção, geralmente de uma quantidade menor do que a dose inicial.

O regime de manutenção pode envolver o tratamento do paciente com uma dose variando entre 0,01 µg e 1,4 mg/kg de peso corporal por dia, por exemplo 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 ou 0,00001 mg por kg de peso corporal por dia. As doses de manutenção são preferivelmente administradas no máximo uma vez a cada 5, 10 ou 30 dias. O tratamento deve ser continuado por um tempo que varia de acordo com o tipo de distúrbio que o paciente sofre, a gravidade do mesmo e a condição do paciente. Após o tratamento, o progresso do paciente deve ser monitorado para determinar se a dose deve ser aumentada no caso de a doença não responder ao tratamento, ou a dose é reduzida, se for observada uma melhora da doença ou se efeitos colaterais indesejados observados.

[0241] Nas modalidades, os termos "tratamento" e "terapia" são usados de forma intercambiável.

[0242] Em certas modalidades, o tratamento é ácido zoledrônico. Em modalidades, o ácido zoledrônico é administrado de acordo com qualquer esquema de dosagem no AZURE Trial Protocol para: COLEMAN, R.E., et al., The New England Journal of Medicine 365 (15): 1396-1405, (2011); COLEMAN, R.E., et al., The New England Journal of Medicine 365 (15): 1396-1405, (2011); Hadji et al., Annals of Oncology, 27: 379-390 (2016); ou Paterson et al., J. Clin. Med. 2 (4): 263- 301 (2013) (todo o conteúdo deste documento é aqui incorporado por referência).

[0243] Em modalidades, o ácido zoledrônico é administrado em uma dose de cerca de 1 mg a cerca de 10 mg de ácido zoledrônico, cerca de 2 mg a cerca de 9 mg de ácido zoledrônico, cerca de 2 mg a cerca de 8 mg de ácido zoledrônico, cerca de 2 mg a cerca de 7 mg de ácido zoledrônico, cerca de 2 mg a cerca de 6 mg de ácido zoledrônico, cerca de 2 mg a cerca de 5 mg de ácido zoledrônico ou cerca de 3 mg a cerca de 5 mg de ácido zoledrônico. O objeto é administrado com cerca de 1 mg, cerca de 2 mg, cerca de 3 mg, cerca de 4 mg, cerca de 5 mg, cerca de 6 mg, cerca de 7 mg, cerca de 8 mg, cerca de 9 mg, cerca de 10 mg, cerca de 12 mg, cerca de 14 mg, ou cerca de 16 mg de ácido zoledrônico. Nas modalidades, o objeto é administrado com cerca de 4 mg de ácido zoledrônico.

[0244] Nas modalidades, o ácido zoledrônico é administrado uma vez a cada 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas, 12 semanas, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses ou 1 ano.

Em certas modalidades, o ácido zoledrônico é administrado uma vez a cada 3 semanas. Em outras modalidades, o ácido zoledrônico é administrado uma vez a cada 4 semanas.

[0245] Em algumas modalidades, o ácido zoledrônico é administrado uma vez a cada 3 semanas por pelo menos seis doses iniciais. Em outras modalidades, o ácido zoledrônico é administrado uma vez a cada 4 semanas por pelo menos seis doses iniciais. Em certas modalidades, a dose inicial de ácido zoledrônico é de 4 mg.

[0246] Nas modalidades, o ácido zoledrônico é administrado uma vez a cada 3 meses por pelo menos oito doses de manutenção após as doses iniciais. Em outras modalidades, o ácido zoledrônico é administrado uma vez a cada 6 meses para até cinco doses de manutenção após as doses iniciais de manutenção. Em certas modalidades, as doses de manutenção são de cerca de 4 mg de ácido zoledrônico.

[0247] Em algumas modalidades, o ácido zoledrônico é administrado na dose de 4 mg uma vez a cada 3 semanas por pelo menos seis doses iniciais, seguido por 4 mg uma vez a cada 3 meses por pelo menos oito doses de manutenção, seguidas por 4 mg a cada 6 meses para até cinco doses de manutenção. Em outras modalidades, o ácido zoledrônico é administrado na dose de 4 mg uma vez a cada 3 semanas por pelo menos seis doses iniciais, seguido por 4 mg uma vez a cada 3 meses por pelo menos oito doses de manutenção, seguido por 4 mg a cada 6 meses para até cinco doses de manutenção.

[0248] Em certas modalidades, o ácido zoledrônico é administrado como uma terapia adjuvante. Em outras modalidades, o ácido zoledrônico é administrado como uma terapia neoadjuvante. Em certas modalidades, o ácido zoledrônico é administrado com uma terapia adicional. Nas modalidades, a terapia adicional é qualquer terapia divulgada ou referenciada aqui. Em outras modalidades, o ácido zoledrônico é administrado antes, simultaneamente com ou após a terapia adicional.

Nas modalidades, os pacientes tratados com injeção de ácido zoledrônico têm a creatinina sérica avaliada antes de cada tratamento. Em certas modalidades, os pacientes administrados com ácido zoledrônico também recebem cálcio e/ou vitamina D.

[0249] Em modalidades, o tratamento é alendronato administrado em uma dose de cerca de 50 mg a cerca de 100 mg. Em certas modalidades, o alendronato é administrado em uma dose de cerca de 50 mg, cerca de 60 mg, cerca de 70 mg, cerca de 80 mg, cerca de 90 mg ou cerca de 100 mg por semana. Em certas modalidades, o alendronato é administrado a uma dose de cerca de 70 mg por semana. Em modalidades particulares, o alendronato é administrado por via oral.

Em certas modalidades, o alendronato é administrado como uma terapia adjuvante.

Em outras modalidades, o alendronato é administrado como uma terapia neoadjuvante. Em certas modalidades, o alendronato é administrado com uma terapia adicional. Nas modalidades, a terapia adicional é qualquer terapia divulgada ou referenciada aqui. Em outras modalidades, o alendronato é administrado antes, simultaneamente com ou após a terapia adicional. Em certas modalidades, os pacientes administrados com alendronato também recebem cálcio e/ou vitamina D.

[0250] Em modalidades, o tratamento é risedronato administrado em uma dose de cerca de 20 mg a cerca de 50 mg. Em certas modalidades, o risedronato é administrado em uma dose de cerca de 20 mg, cerca de 25 mg, cerca de 30 mg,

cerca de 35 mg, cerca de 40 mg, cerca de 45 mg ou cerca de 50 mg semanalmente.

Em certas modalidades, o risedronato é administrado a uma dose de cerca de 35 mg por semana. Em modalidades particulares, o risedronato é administrado por via oral.

Em certas modalidades, o risedronato é administrado como uma terapia adjuvante.

Em outras modalidades, o risedronato é administrado como uma terapia neoadjuvante. Em certas modalidades, o risedronato é administrado com uma terapia adicional. Nas modalidades, a terapia adicional é qualquer terapia divulgada ou referenciada aqui. Em outras modalidades, o risedronato é administrado antes, simultaneamente com ou após a terapia adicional. Em certas modalidades, os pacientes administrados com risedronato também recebem cálcio e/ou vitamina D.

[0251] Em modalidades, o tratamento é ibandronato administrado em uma dose de cerca de 100 mg a cerca de 200 mg. Em certas modalidades, o ibandronato é administrado em uma dose de cerca de 100 mg, cerca de 110 mg, cerca de 120 mg, cerca de 130 mg, cerca de 140 mg, cerca de 150 mg, cerca de 150 mg, cerca de 160 mg, cerca de 170 mg, cerca de 180 mg, cerca de 190 mg, ou cerca de 200 mg por mês. Em certas modalidades, o ibandronato é administrado em uma dose de cerca de 150 mg por mês. Em modalidades particulares, o ibandronato é administrado por via oral. Em certas modalidades, o ibandronato é administrado como uma terapia adjuvante. Em outras modalidades, o ibandronato é administrado como uma terapia neoadjuvante. Em certas modalidades, o ibandronato é administrado com uma terapia adicional. Nas modalidades, a terapia adicional é qualquer terapia divulgada ou referenciada aqui. Em outras modalidades, o ibandronato é administrado antes, simultaneamente com ou após a terapia adicional.

Em certas modalidades, os pacientes administrados com ibandronato também recebem cálcio e/ou vitamina D.

[0252] Nas modalidades, o tratamento é clodronato. Em certas modalidades, o clodronato é administrado em qualquer esquema de dosagem descrito em Hadji et al., Annals of Oncology, 27: 379-390 (2016); Paterson et al., J. Clin. Med. 2 (4): 263- 301 (2013) ou PATERSON, A.H.G., et al., The Lancet Oncology 13 (7) (todo o conteúdo deste documento é aqui incorporado por referência).

[0253] Nas modalidades, o clodronato é administrado em uma dose de cerca de 1000 mg a cerca de 2000 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 2000 mg, cerca de 1200 mg a cerca de 1800 mg, cerca de 1300 mg a cerca de 1800 mg ou cerca de 1400 mg para cerca de 1800 mg. Em modalidades particulares, o clodronato é administrado em uma dose de cerca de 1000 mg, cerca de 1100 mg, cerca de 1200 mg, cerca de 1250 mg, cerca de 1300 mg, cerca de 1400 mg, cerca de 1500 mg, cerca de 1600 mg, cerca de 1700 mg, cerca de 1750 mg, cerca de 1800 mg, cerca de 1900 mg ou cerca de 2000 mg. Em certas modalidades, o clodronato é administrado a uma dose de cerca de 1600 mg.

[0254] Em certas modalidades, o clodronato é administrado com cerca de uma vez por dia, cerca de duas vezes por dia, cerca de uma vez por semana, cerca de uma vez a cada duas semanas ou cerca de uma vez por mês. Em modalidades particulares, o clodronato é administrado aproximadamente uma vez por dia. Em modalidades particulares, o clodronato é administrado por via oral a uma dose de cerca de 1600 mg, cerca de uma vez por dia.

[0255] Em certas modalidades, o clodronato é administrado por via oral. Em certas modalidades, o clodronato administrado como uma terapia adjuvante. Em outras modalidades, o clodronato é administrado como uma terapia neoadjuvante.

Em certas modalidades, o clodronato é administrado com uma terapia adicional. Nas modalidades, a terapia adicional é qualquer terapia divulgada ou referenciada aqui.

Em outras modalidades, o clodronato é administrado antes, simultaneamente com ou após a terapia adicional. Em certas modalidades, os pacientes administrados com clodronato também recebem cálcio e/ou vitamina D.

[0256] Em certas modalidades, o tratamento é denosumabe. Em certas modalidades, o denosumabe é administrado em qualquer esquema de dosagem divulgado em Paterson et al., J. Clin. Med. 2 (4): 263-301 (2013), Pageau, Steven C.

(2009). mAbs 1 (3): 210-215, número CAS 615258-40-7 ou https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01077154 (última visita em 25 de agosto de 2017) (todo o conteúdo deste documento é aqui incorporado por referência).

[0257] Nas modalidades, o denosumabe é administrado em uma dose de cerca de 10 mg a cerca de 300 mg, cerca de 20 mg a cerca de 300 mg, cerca de 50 mg a cerca de 300 mg, cerca de 50 mg a cerca de 250 mg, cerca de 75 mg a cerca de 250 mg, cerca de 100 mg a cerca de 250 mg, cerca de 100 mg a cerca de 200 mg ou cerca de 100 mg a cerca de 150 mg. Em modalidades particulares, o denosumabe é administrado em uma dose de cerca de 20 mg, cerca de 30 mg, cerca de 50 mg, cerca de 75 mg, cerca de 100 mg, cerca de 110 mg, cerca de 120 mg, cerca de 130 mg, cerca de 130 mg, cerca de 150 mg, cerca de 175 mg, cerca de 200 mg, cerca de 225 mg, cerca de 250 mg, cerca de 275 mg ou cerca de 300 mg. Em modalidades, o denosumabe é administrado em uma dose do denosumabe é administrado em uma dose de cerca de 120 mg. Nas modalidades, o denosumabe é administrado em uma dose de cerca de 30 mg. Nas modalidades, o denosumabe é administrado em uma dose de cerca de 60 mg. Nas modalidades, o denosumabe é administrado em uma dose de cerca de 180 mg.

[0258] Em certas modalidades, o denosumabe é administrado uma vez pelo menos a cada 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 12 semanas, 4 meses, 6 meses ou 1 ano. Em uma modalidade, o denosumabe é administrado a uma dose de uma vez a cada mês, durante pelo menos 6 meses. Em uma modalidade, o denosumabe é administrado a uma dose de 120 mg uma vez a cada mês, durante pelo menos 6 meses. Em uma modalidade adicional, o denosumabe é administrado a uma dose de 120 mg uma vez a cada mês, durante pelo menos 6 meses, seguido por uma dose de 120 mg uma vez a cada 3 meses, durante pelo menos cerca de 1 ano, 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos ou mais. Nas modalidades, o denosumabe é administrado a uma dose de cerca de 30 mg, cerca de uma vez a cada 4 semanas. Em outras modalidades, o denosumabe é administrado a uma dose de 120 mg aproximadamente uma vez a cada 4 semanas. Em ainda outras modalidades, o denosumabe é administrado a uma dose de 180 mg aproximadamente uma vez a cada 4 semanas. Em outras modalidades, o denosumabe é administrado a uma dose de cerca de 60 mg cerca de uma vez a cada 12 semanas. Em outras modalidades, o denosumabe é administrado a uma dose de 180 mg aproximadamente uma vez a cada 12 semanas. Nas modalidades, o denosumabe é administrado por subcutaneamente.

Em certas modalidades, os pacientes administrados com denosumabe também recebem cálcio e/ou vitamina D.

[0259] Em certas modalidades, o objeto é adicionalmente administrado com cálcio. Nas modalidades, o cálcio é administrado uma vez por dia. Nas modalidades, o cálcio é administrado por via oral. Em certas modalidades, o cálcio é administrado em uma dose de cerca de 100 mg, cerca de 200 mg, cerca de 300 mg, cerca de 400 mg, cerca de 500 mg, cerca de 600 mg, cerca de 700 mg, cerca de 800 mg, cerca de 900 mg ou cerca de 1000 mg. Em modalidades particulares, o cálcio é administrado em uma dose de pelo menos cerca de 500 mg. Em algumas modalidades, o objeto é adicionalmente administrado com vitamina D. Em modalidades particulares, a vitamina D é administrada uma vez por dia. Em modalidades, a vitamina D é administrada em uma dose de cerca de 100 UI, cerca de 200 UI, cerca de 300 UI, cerca de 400 UI e 500 UI, cerca de 600 UI, cerca de 700 UI ou cerca de 800 IT. Em modalidades particulares, a vitamina D é administrada a uma dose de pelo menos cerca de 400 UI. Nas modalidades, o paciente que recebe a vitamina D e/ou cálcio está na pós-menopausa.

[0260] Em algumas modalidades, o tratamento é de uma sacola plástica ou de uma sacola intravenosa. Nas modalidades, o medicamento já está diluído e corresponde a cada dose. Em outras modalidades, o tratamento deve ser diluído.

Por exemplo, vide Ministry of Health, Social Services and Equality, Folha de dados de "Zoledronic acid Kern Pharma 4 mg/100 mL Solution for Infusion EFG," Texto Revisado em Julho de 2016, tradução automática em 6 de Julho de 2017, 38 páginas (Ministerio de Sanidad, Servicios Sociales e Igualdad, Ficha Técnica de "Acido Zoledronico Kern Pharma 4 mg/100 ml Solucion Para Perfusion EFG"). Cada embalagem plástica com 100 ml de solução contém 4 mg de ácido zoledrônico, equivalente a 4.264 mg de ácido zoledrônico monohidratado. Cada ml da solução contém 0,04 mg de ácido zoledrônico, equivalente a 0,042 mg de ácido zoledrônico monohidratado. Cada embalagem plástica de 100 ml de solução contém 342,9 mg (14,9 mmol) de sódio.

[0261] Nas modalidades, os tratamentos a partir das embalagens plásticas são administrados aos pacientes via IV. Em algumas modalidades, o tratamento é administrado via perfusão intravenosa. Em certas modalidades, a perfusão ocorre durante um período de cerca de 10 minutos a cerca de 45 minutos. Em outras modalidades, a perfusão ocorre durante um período de cerca de 10 minutos, cerca de 15 minutos, cerca de 20 minutos, cerca de 25 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 40 minutos, cerca de 45 minutos ou mais. Em algumas modalidades, a perfusão ocorre durante um período de cerca de 15 a 20 minutos.

[0262] Nas modalidades, as soluções nos sacos de plástico incluem excipientes. Em certas modalidades, esses excipientes incluem: Manitol (E421), Citrato de sódio (E331) ou citrato de sódio di-hidratado, cloreto de sódio e/ou água para preparações injetáveis.

[0263] Em algumas modalidades, os tratamentos são em seringas pré- cheias. Em outras modalidades, os tratamentos são em frascos pré-cheios. Em certas modalidades, os frascos pré-cheios devem ser adicionalmente diluídos para administração. Em algumas modalidades, um frasco pré-cheio é diluído adicionando uma solução estéril de cloreto de sódio ou dextrose (por exemplo, 100 ml de cloreto de sódio a 0,9%, USP ou Injeção de Dextrose a 5%, USP).

[0264] Os exemplos seguintes ilustram a invenção e não limitam o seu âmbito.

EXEMPLOS Exemplo 1: Validação de c-MAF como marcador de metástase

[0265] Os ensaios IHC e FISH utilizados para testar c-MAF nas amostras AZURE foram validados analiticamente. Uma visão geral dos parâmetros de validação do ensaio pode ser vista na Figura 1.

[0266] O ensaio MAF FISH foi produzido pela Kreatech para Inbiomotion com base na tecnologia FISH proprietária da Kreatech. O conjunto de sondas contém duas sondas: uma sonda MAF 16q23 mais uma sonda D16Z3 como controle da região centromérica do cromossomo 16. O ensaio foi validado utilizando uma sonda 16q23/D16Z3 (Inbiomotion) e um kit de Digestão de Tecido Poseidon da Kreatech. Os critérios de pontuação foram definidos em uma ficha técnica e da seguinte forma: dois resultados avaliáveis de FISH por paciente e o valor mais alto foi selecionado. O algoritmo de pontuação foi o seguinte: 20 células contadas para amplificação de alvo e centrômero, se a contagem de genes for > 2 e ≤ 3, em seguida, 50 células foram contadas.

[0267] O ensaio MAF IHC foi baseado em um anticorpo monoclonal recombinante (descrito no número de aplicação internacional PCT/IB2015/059562, que é incorporado aqui por referência na sua totalidade). O anticorpo foi selecionado com base em IHC. O ensaio foi validado usando o MAF RecMab (Inbiomotion) com plataforma DAKO AS LINK e protocolo em amostras de controle fornecidas por Inbiomotion. O critério de pontuação foi definido antecipadamente em uma ficha informativa, e havia um único IHC Hscore por paciente. O algoritmo de pontuação foi o H-score.

[0268] Uma visão geral do projeto de estudo de triagem clínica AZURE (Coleman et al., N Eng J Med 2011; 365: 1396-1405 e número de Triagens Atuais controladas por AZURE, ISRCTN79831382 e identificador ClinicalTrials.gov NCT00072020), cujos pacientes foram usados para validar MAF, é fornecida na Figura 2. O MAF foi validado em uma análise retrospectiva da triagem AZURE usando amostra de tumor de paciente coletada prospectivamente sob condições reguladoras. Dos 3.360 pacientes recrutados, 1.769 doaram tecido tumoral (52,4%).

Havia 13 TMAs (micromatrizes de tecidos) (150 amostras de pacientes cada) (1.769 pacientes). Havia 4 réplicas de cada TMA usando diferentes núcleos de tecido (6.326 (4x paciente)). Uma TMA tinha apenas 1 réplica e duas TMAs tiveram três réplicas. Com base na análise de H&E (hematoxilina e eosina) (Figura 3) (6.326):

3.978 núcleos foram avaliados (63%) e 2.348 não foram avaliados.

[0269] Para o ensaio FISH, havia 2.067 núcleos avaliáveis de FISH (56%).

Havia 865 pacientes (49%) com dois núcleos avaliáveis de FISH (26% dos pacientes AZURE) e 1.202 pacientes tiveram uma única pontuação FISH (68%). 567 pacientes não foram avaliados pelo FISH em nenhuma das quatro réplicas (32%).

[0270] Para o ensaio IHC, foram realizadas uma avaliação patológica e uma avaliação assistida por computador VisoPharm. Para a avaliação do patologista,

2.232 núcleos foram avaliados (59% avaliáveis para HScore). Havia 1.390 pacientes com um HScore IHC (74%), representando 39% do total de pacientes AZURE. Havia 460 pacientes que não eram avaliáveis por IHC em nenhuma das quatro réplicas. Na avaliação da coloração por IHC assistida por computador VisioPharm, 1299 pacientes com IHC foram avaliados em 1.309 pontuados por patologistas para HScore e coloração média por núcleo. A taxa de positividade de MAF pode ser vista nas Figuras 4A e 4B.

[0271] Os dados FISH otimizados para corte podem ser vistos na Figura 5 e foram calculados conforme descrito em Vipery et al. JCO 2014 DOI:

10.1200/JCO.2013.53.3604.

[0272] Em relação às variáveis moleculares, para análise de FISH: número de cópias do MAF: variável numérica e categórica (+/- corte >= 2,5); % de MAF nucleico amplificado (MAF CN> 2): numérico + categórico (TBD de corte). Para a análise IHC: IHC H-Score: numérico + categórico (corte >= 200), IHC OD: numérico + categórico (corte tBD). As seguintes variáveis clínicas foram analisadas: sobrevida livre de doença (DFS), sobrevida livre de doença invasiva (IDFS), sobrevida geral (OS), primeira recorrência óssea, recorrência óssea a qualquer momento, tempo até o primeiro evento de DFS óssea, tempo ao primeiro evento DFS não óssea, resposta ao tratamento com ácido zoledrônico.

[0273] Na análise do valor prognóstico de MAF FISH, os pacientes dos braços de controle e tratamento foram reunidos para a análise inicial. Pontos de corte otimizados para cada variável a ser analisada foram utilizados quando indicado. A morte como evento competidor foi usada a tempo de metástase óssea, a qualquer momento. Foram analisadas as seguintes variáveis clínicas: tempo para metástase óssea (a qualquer momento), tempo para metástase óssea (como primeiro evento), IDFS (incluindo recorrência de tumor de mama invasivo ipsilateral, recorrência regional de câncer de mama invasivo, doença metastática-câncer de mama, morte atribuível a qualquer causa, incluindo câncer de mama, câncer de mama invasivo contralateral, segundo câncer primário não invasivo de mama) e sobrevida geral.

[0274] A Figura 6 mostra que o risco de metástase óssea foi 40% maior em pacientes com MAF FISH positivo (>= 2,3) (p = 0,007) quando todos os pacientes são analisados (a morte como um evento concorrente é usada a tempo da metástase óssea (a qualquer momento)). A Figura 7 mostra que havia um risco 42% maior para osso como o primeiro sítio de metástase em pacientes com MAF FISH positivo (>= 2,3) (p = 0,02, análise multivariada). Como visto na Figura 8, o risco de IDFS foi 38% maior em pacientes com MAF FISH positivo (>= 2,2) (p = 0,0002, análise multivariada) (há uma separação muito precoce por dois anos e as curvas são paralelas). A Figura 9 mostra que a sobrevida geral foi 33% menor em pacientes positivos para o MAF FISH (>= 2,2) (p = 0,02, análise multivariada) (há uma separação precoce por três anos para a sobrevida geral).

[0275] Como visto na Figura 10, houve um tempo mais curto para osso como a primeira recorrência em pacientes com MAF FISH positivo (>= 2,3) do braço de controle, com uma diferença significativa na análise multivariada (HR = 0,47, p = 0,013).

[0276] Como visto na Figura 11, houve uma tendência a um tempo mais curto para recorrência em pacientes com MAF positivo não tratados (>= 2,2) (HR = 0,72, p = 0,08, análise multivariada) em comparação com pacientes com MAF não positivo não tratados. A Figura 12 mostra o tempo para IDFS (excluindo a recorrência óssea) por FISH apenas nos pacientes de controle AZURE. Foi utilizado um corte otimizado de 2,2.

[0277] Em resumo, o corte predefinido para estratificar os pacientes de acordo com o seu nível de MAF FISH foi muito próximo dos cortes definidos baseados em computador otimizados. O efeito limite permite o delineamento de grupos limpos para tratamento apropriado (relacionado) (ou para evitar o tratamento). Com base no prognóstico dos pacientes com MAF FISH positivo do braço de controle, observamos um tempo mais curto para osso como a primeira metástase (HR = 0,53, multivariada p = 0,03) e uma tendência para um tempo mais curto de recorrência (doença invasiva) (HR = 0,72, p = 0,08).

Exemplo 2: Avaliação do efeito do tratamento com ácido zoledrônico de acordo com a estratificação de MAF FISH

[0278] Os braços de controle e tratamento com ácido zoledrônico da triagem

AZURE descrito no Exemplo 1 foram avaliados para determinar o efeito do tratamento com ácido zoledrônico em pacientes estratificados por MAF.

[0279] As Figuras 13A-13B (Coleman et al., Lancet Oncol 2014; 15: 997- 1006, Figura 3) mostram o tempo até a metástase óssea em pacientes no braço de controle e no braço de tratamento com ácido zoledrônico da triagem AZURE. A Figura 14 mostra uma avaliação do tempo até a metástase óssea como um primeiro evento. Como pode ser visto na Figura 14, houve um tempo mais curto para osso como primeira recorrência em pacientes com MAF FISH (>= 2,3) do braço de controle, com uma diferença significativa na análise multivariada (HR = 0,47, p = 0,013, análise multivariada). O tratamento com ácido zoledrônico reduziu as diferenças na incidência de osso como primeiro sítio de recorrência entre pacientes com MAF positivo e não positivo, e não houve diferença significativa no risco de metástase óssea a qualquer momento em MAF positivo em comparação com pacientes não positivos com MAF tratados com ácido zoledrônico.

[0280] A Figura 15 (Coleman et al. Lancet Oncol 2014; 15: 997-1006, Figura 2) mostra uma análise da sobrevida livre de doença (DFS) e doença invasiva (IDFS) entre o braço de controle e os pacientes tratados com ácido zoledrônico na triagem AZURE.

[0281] A Figura 16 mostra o tempo até a recorrência distante entre o braço de controle e os pacientes tratados com ácido zoledrônico. Houve uma tendência a um tempo mais curto de recorrência à distância em pacientes com MAF positivo não tratados (>= 2,2) (HR = 0,72, p = 0,08, análise multivariada). Houve um tempo significativamente mais curto de recorrência (doença invasiva) em pacientes com MAF positivo no grupo de tratamento com ácido zoledrônico (HR = 0,52, p < 0,001, análise multivariada). O tratamento com ácido zoledrônico piorou a IDFS em comparação com pacientes com MAF positivo não tratados .

[0282] A Figura 17 mostra o tempo para um evento metastático ósseo (a qualquer momento) de acordo com o tratamento. A morte como evento concorrente é usada a tempo de eliminar as metástases (a qualquer momento). Houve um aumento não significativo do risco de metástase óssea em pacientes com MAF FISH positivo (>= 2,3) do braço de controle (HR = 0,72, p = 0,18). O tratamento com ácido zoledrônico reduziu significativamente o risco de metástase óssea a qualquer momento em pacientes com MAF FISH não positivo (<2,3) (HR = 0,52, p = 0,01) em comparação com pacientes com MAF FISH positivo.

[0283] A Figura 18 mostra o tempo para um evento metastático ósseo (a qualquer momento) de acordo com o número de cópias de MAF (de acordo com o corte de MAF pré-especificado de 2,5). A morte como evento concorrente é usada a tempo de eliminar as metástases (a qualquer momento). O tratamento com ácido zoledrônico reduziu significativamente o risco de metástase óssea em pacientes com MAF FISH não positivo (HR = 0,65, p = 0,03). O tratamento com ácido zoledrônico mostrou uma tendência a um risco aumentado de metástase óssea em pacientes com MAF positivo. A diferença não foi significativa (HR = 1,54, p = 0,22).

[0284] A Figura 19 mostra a IDFS pelo status menopáusico da triagem AZURE quando os pacientes não são estratificados de acordo com MAF (Coleman et al. Lancet Oncol 2014; 15: 997-1006, Figura 5).

[0285] A Figura 20 mostra o tempo até um evento metastático ósseo (a qualquer momento) usando a morte como um evento competitivo de acordo com o número de cópias de MAF (dados de acordo com um corte pré-especificado de 2,5) em pacientes pós-menopáusicos. O resultado do tratamento em pacientes pós- menopáusicos com MAF positivo (> 2,5) mostrou uma tendência para reduzir o número de eventos de metástases ósseas (HR = 0,46, p = 0,26, com um número limitado de eventos). O resultado do tratamento em pacientes pós-menopáusicos com MAF não positivo tratados com ácido zoledrônico foi menos eficaz do que em pacientes pós-menopáusicos com MAF positivo (HR = 0,63 vs HR = 0,46, com um número limitado de eventos), sugerindo um benefício claro do tratamento com ácido zoledrônico para prevenir metástase óssea nos pacientes pós-menopáusicos com MAF positivo.

[0286] A Figura 21 mostra o tempo para um evento metastático ósseo (a qualquer momento) de acordo com o número de cópias de MAF (dados de acordo com um corte pré-especificado de 2,5) em pacientes não pós-menopáusicos. Houve um resultado significativamente pior no tratamento com ácido zoledrônico em pacientes não pós-menopáusicos com MAF positivo, causando um aumento nos eventos metastáticos ósseos (HR = 2,44, p = 0,045). Houve uma tendência a um melhor resultado com o tratamento com ácido zoledrônico em pacientes pós- menopáusicos com MAF não positivo (HR = 0,66, p = 0,08).

[0287] A Figura 22 mostra a IDFS do braço de tratamento com ácido zoledrônico e do braço de controle, excluindo as metástases ósseas de mulheres pós-menopáusicas. Como visto na Figura 22, o tratamento de pacientes pós- menopáusicos com ácido zoledrônico melhorou significativamente a IDFS (excluindo osso) de pacientes com MAF FISH positivo (>= 2,2), reduzindo o número de eventos invasivos da doença e não houve diferença na IDFS (excluindo osso) de pacientes com MAF não positivo.

[0288] A Figura 23 mostra a IDFS do braço de tratamento com ácido zoledrônico e do braço de controle, excluindo metástases ósseas de mulheres não pós-menopáusicas. Como visto na Figura 23, o tratamento de mulheres pós- menopáusicas com ácido zoledrônico piora significativamente a IDFS (excluindo osso) de pacientes com MAF FISH positivo (>= 2,2), e nenhuma diferença foi observada na IDFS (excluindo osso) da pacientes com MAF FISH não positivo.

[0289] A Figura 24 mostra a sobrevida geral (OS) pelo braço de tratamento.

O tratamento de pacientes com MAF FISH positivo com ácido zoledrônico impactou significativamente a OS.

[0290] A Figura 25 mostra o prognóstico de sobrevida livre de doença (DFS) no braço de controle AZURE. Como pode ser visto na Figura 25, há uma sobrevida livre de doença significativamente menor em pacientes pós-menopáusicos com MAF positivo não tratados. No que diz respeito à sobrevida livre de doença: a significância da interação do status FISH e status menopáusico covaria na análise multivariada (em pacientes de controle); Chi2 = 6,23, valor de p = 0,013. A Figura 26 mostra o prognóstico da sobrevida geral em pacientes do braço de controle AZURE. Há uma tendência a uma OS mais curta em pacientes pós-menopáusicos com MAF positivo não tratados. No que diz respeito à OS: a significância da interação do status de FISH e e status não menopáusico covaria na análise multivariada (em pacientes de controle); Chi2 = 3,62, valor de p = 0,057. A Figura 27 mostra o impacto do tratamento com ácido zoledrônico na DFS de acordo com o valor de MAF FISH.

Como pode ser visto na Figura 27, o tratamento com ácido zoledrônico produz um resultado diferencial de DFS entre pacientes com MAF FISH positivo e negativo, e essas diferenças ocorrem em mulheres pós-menopáusicas e não pós- menopáusicas.

[0291] A Figura 28 mostra o impacto do tratamento com ácido zoledrônico na DFS de acordo com o valor de MAF FISH em pacientes pós-menopáusicos. Como pode ser visto na Figura 28, o tratamento com ácido zoledrônico produz um melhor resultado de DFS em pacientes pós-menopáusicos com MAF negativo (HR = 0,56, (CI de 95%. 0,33-0,95). A Figura 29 mostra o impacto do tratamento com ácido zoledrônico na DFS de mulheres não pós-menopáusicas. Como pode ser visto na Figura 29, o tratamento com ácido zoledrônico produz o pior resultado de DFS em pacientes não pós-menopáusicas positivas para MAF. A Figura 30 mostra o impacto do tratamento com ácido zoledrônico na sobrevida geral, de acordo com o valor MAF FISH. Como pode ser visto na Figura 30, o tratamento com ácido zoledrônico produz uma sobrevida geral significativamente menor em pacientes com MAF positivo.

Essas diferenças ocorrem em mulheres pós-menopáusicas e não pós- menopáusicas. A Figura 31 mostra o impacto do tratamento com ácido zoledrônico na sobrevida geral de acordo com os níveis de MAF FISH em pacientes pós- menopáusicos. Como pode ser visto na Figura 31, o tratamento com ácido zoledrônico mostra uma tendência a um melhor resultado geral de sobrevida em pacientes pós-menopáusicos com MAF negativo. HR = 0,56, (95 % de CI., 0,31- 1,01), mas um efeito maior em pacientes positivos para FISH zoledrônico. A Figura 32 mostra o impacto do tratamento com ácido zoledrônico na sobrevida geral de mulheres não menopáusicas de acordo com o valor de MAF FISH. Como pode ser visto na Figura 32, o tratamento com ácido zoledrônico produz o pior resultado geral de sobrevida em pacientes não póss-menopáusicos com MAF positivo.

[0292] Um resumo do valor preditivo do MAF do gene de interesse (GOI) sobre o risco dos pacientes para DFS e OS quebrada de acordo com o status menopáusico é visto na Tabela 1.

Tabela 1. Razão de risco para poder preditivo de MAF com base no status menopáusico Razão de Limite Limite risco (HR) inferior de superior de 95% CI para 95% CI parra

HR HR Status GOI: negativo v. positivo 3.134 0.913 10.760 para pacientes pré-menopáusicos Status GOI: negativo v. positivo 0.667 0.202 2.200 para menos do que ou igual a 5 anos uma vez que pacientes menopáusicos Status GOI: negativo v. positivo 0.552 0.280 1.089 para mais do que 5 anos uma vez que pacientes menopáusicos Status GO: negativo v. positivo 0.656 0.121 3.559 para pacientes com status menstrual desconhecido

[0293] Como pode ser visto, MAF é preditivo em pacientes pós- menopáusicos, desconhecidos e na perimenopausa com risco de uma DFS mais curta ou pior OS. No entanto, em mulheres pré-menopáusicas, os pacientes com MAF positivo são aqueles com menos risco e são mais propensos a ter uma DFS mais longa e melhor OS.

[0294] Em resumo, há um aumento significativo do risco de metástase óssea como primeiro sítio de recorrência em pacientes com MAF FISH positivo ou não positivo do braço de controle. (HR = 0,47, p = 0,013 com um corte = 2,3) e essa diferença é reduzida após o tratamento com ácido zoledrônico. Além disso, o tratamento com ácido zoledrônico reduziu significativamente o risco de metástase óssea a qualquer momento em pacientes com MAF FISH não positivo (HR = 0,65, p = 0,03, corte = 2,5). O tratamento com ácido zoledrônico mostra um risco aumentado de metástase óssea a qualquer momento em pacientes com MAF positivo. A diferença não é significativa (HR = 1,54, p = 0,22, corte = 2,5). Esse efeito é causado pelo status menopáusico e mostra o maior efeito no grupo não pós-menopáusico. O ácido zoledrônico melhora significativamente o resultado de pacientes pós- menopáusicos com MAF FISH positivo. No entanto, o ácido zoledrônico piora o resultado de pacientes não pós-menopáusicos com MAF FISH positivo. O efeito depende de um aumento da doença invasiva (IDFS reduzida) após o tratamento com ácido zoledrônico (sugerindo que a prevenção de metástases no osso pode facilitar metástases em outros lugares em pacientes não pós-menopáusicos e eventualmente levar à metástase no osso como um evento secundário).

[0295] Pacientes positivos para MAF FISH que não são tratados com ácido zoledrônico têm um risco maior de metástase óssea e doença invasiva (IDFS reduzida, incluindo e excluindo eventos ósseos). Nos pacientes tratados com ácido zoledrônico, os pacientes com MAF positivo têm um resultado pior em comparação aos pacientes não tratados em termos de metástase óssea a qualquer momento, IDFS (incluindo eventos ósseos excludentes) e sobrevida geral. Pacientes com MAF negativo tratados com ácido zoledrônico têm um resultado melhor em comparação com pacientes não tratados em relação a metástases ósseas a qualquer momento.

Em relação às mulheres pós-menopáusicas, há um melhor resultado em relação ao IDFS (excluindo osso) em pacientes com MAF positivo tratadas com ácido zoledrônico. Em mulheres não pós-menopáusicas, há um resultado pior em relação à IDFS (excluindo osso) em pacientes com MAF positiva tratadas com ácido zoledrônico.

Exemplo 3: Efeito de amplificação de MAF nos resultados de tratamento com ácido zoledrônico adjuvante em câncer inicial

[0296] A amplificação de MAF foi investigada como um preditor da probabilidade de benefício do ácido zoledrônico adjuvante em tumores primários.

Métodos Projeto de estudo e pacientes

[0297] 3.360 pacientes de 174 centros em todo o mundo foram recrutados para a triagem AZURE entre 4 de setembro de 2003 e 16 de fevereiro de 2006.

Pacientes elegíveis tinham câncer de mama invasivo histologicamente confirmado em estágio II ou III de qualquer subtipo, quer com metástase de linfonodo axilar patologicamente envolvida ou um tumor primário T3 ou T4 tratado com intenção curativa e ressecção completa do tumor primário (ou ressecção planejada se os pacientes estivessem sendo tratados com quimioterapia neoadjuvante). Outros critérios de inclusão foram idade igual ou superior a 18 anos, índice de desempenho de Karnofsky igual ou superior a 80 e não estar grávida ou amamentando. Os pacientes foram excluídos se tivessem evidências clínicas ou de imagem de metástases distantes, uso atual ou recente (<1 ano) de bifosfonatos, ou doença óssea preexistente que provavelmente exigisse tratamento direcionado aos ossos.

Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento informado. No Reino Unido, os pacientes também forneceram consentimento específico voluntário para uso de materiais biológicos (tumor primário e amostras de sangue). Antes da randomização, os pacientes foram submetidos a testes de imagem de função hematológica, renal, hepática e estadiamento, de acordo com protocolos institucionais. Aqueles que foram confirmados como elegíveis foram aleatoriamente designados (1:1) para tratamento sistêmico adjuvante padrão isoladamente ou com ácido zoledrônico a partir de uma programação central gerada por computador realizada na Unidade de Pesquisa de Ensaios Clínicos da Universidade de Leeds, Leeds, Reino Unido. Um processo de minimização que levou em consideração o número de axilares envolvidos linfonodos, estágio clínico do tumor, status do receptor de estrogênio, tipo e época da terapia sistêmica, status menopáusico, uso de estatina e centro de tratamento que foi usado.

Procedimentos Tratamento com Drogas

[0298] Os pacientes receberam terapia sistêmica padrão com quimioterapia (neo-) adjuvante, terapia endócrina ou ambas, isoladamente (grupo de controle) ou com 4 mg de ácido zoledrônico administrados por via intravenosa a cada 3-4 semanas nas primeiras seis doses, a cada 3 meses em oito doses e a cada 6 meses em cinco doses para completar 5 anos de tratamento (grupo ácido zoledrônico).

Suplementos orais de cálcio e vitamina D foram recomendados para todos os pacientes nos primeiros 6 meses de tratamento, e continuaram depois, a critério do médico assistente. Tratamentos sistêmicos adjuvantes e radioterapia locorregional foram utilizados de acordo com os protocolos padrão de cada instituição participante.

[0299] O cronograma de acompanhamento foi semelhante nos dois grupos de estudo e incluiu avaliações clínicas, monitoramento de eventos adversos e testes de função hematológica, renal e hepática. A imagem de rotina de acompanhamento não era obrigatória, mas investigações foram feitas sobre a recorrência clinicamente suspeita, se considerado apropriado pelo médico assistente. A recorrência foi definida pela data em que foi suspeitada pela primeira vez, para reduzir o risco de viés de apuração. 91% das recorrências foram validadas independentemente quer pelo monitoramento no local ou por telefone. Após o término do tratamento com ácido zoledrônico, os pacientes foram acompanhados anualmente quanto aos parâmetros de segurança e doença.

Medição da amplificação de MAF

[0300] Tiras de 5 μm de espessura foram cortadas de cada bloco de TMA e orientadas para coincidir com o mapa de TMA para permitir a identificação de cada núcleo de tecido. As tiras foram montadas em lâminas de vidro Superfrost plus (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) e coradas com hematoxilina e eosina para confirmar a presença de tumor avaliável. A amplificação de MAF foi avaliada com a hibridização in situ validada por MAFTEST (FISH) com a sonda MAF/D16Z3 (Inbiomotion, Barcelona, Espanha). Um laboratório central (Targos Molecular Pathology, Kassel, Alemanha) validou o desempenho analítico e diagnóstico do ensaio, estabeleceu critérios de aceitação, incluiu controles de qualidade apropriados para cada ensaio e realizou as análises mascaradas na atribuição do tratamento. Resumidamente, as seções de TMA foram reidratadas em séries de etanol, lavadas com água e pré-tratadas a 98 ºC por 15 min. As amostras foram digeridas com pepsina em um kit de Digestão de Tecido Poseidon (Kreatech, Amsterdã, Holanda) por 30 minutos, desidratadas em séries de etanol e secas. Após adição de 10 μL de sonda MAF/D16Z3, as lâminas foram desnaturadas a 80 ºC e colocadas durante a noite em um hibridizador a 37 ºC. Após a hibridação, as lâminas FISH foram lavadas em Tampão de Lavagem I do kit de Digestão de Tecido Poseidon a 72 ºC por 2 minutos e depois o Tampão de Lavagem II por 1 min à temperatura ambiente. Após desidratação e secagem ao ar, as lâminas foram incubadas com 15 μL de solução de 4,6-diamidino-2-fenilindol (0,03 mg/mL) e armazenadas a 4 ºC no escuro até a pontuação.

[0301] O número médio de cópias de MAF por núcleo foi pontuado em 20 núcleos da região de tumor com maior amplificação, por funcionários do laboratório que foram mascarados no grupo de tratamento. Se o número médio de cópias estivesse entre 2 e 0, mais 30 núcleos seriam pontuados. Para manter ao mínimo o efeito da heterogeneidade do tumor em fragmentos tão pequenos, foram exigidos resultados duplicados para cada paciente. Assim, os núcleos das réplicas foram pontuados até dois valores de amplificação de FISH para cada tumor serem obtidos, dos quais o mais alto por paciente foi utilizado na análise estatística. As TMAs foram analisadas por FISH sem otimização ou repetição, conforme estipulado no protocolo do estudo. Os pacientes para os quais o número médio de cópias de MAF foi 2,5 ou superior em pelo menos uma réplica foram considerados positivos para MAF. Esse limite foi baseado em estudos em uma coorte retrospectiva e considerado improvável que seja artificialmente afetado pela rápida proliferação de células tumorais.

Resultados

[0302] 1.739 (64%) dos 2.710 pacientes inscritos em locais elegíveis do Reino Unido deram consentimento e receberam amostras de tumor primário enviadas para análise central. As amostras foram processadas entre setembro de 2003 e março de 2006, e as TMAs foram preparadas em 2007 e 2008. 3.978 (63%) dos 6.326 núcleos de TMA apresentaram tumor invasivo suficiente para a análise de FISH. O ensaio MAFTEST FISH pode ser avaliado com segurança em 2.067 (56%) desses 3.978 núcleos de tecidos. 865 (50%) dos 1.739 pacientes tiveram dois resultados de FISH avaliáveis (445 no grupo de controle e 420 no grupo ácido zoledrônico) e destes, 184 (21%) apresentaram tumores positivos para MAF (85 no grupo de controle e 99 no grupo ácido zoledrônico).

[0303] O acompanhamento médio foi de 84 • 6 meses (IQR 72 • 0–95 • 8).

282 (33%) de 865 pacientes tiveram um evento de sobrevida livre de doença invasiva (147 no grupo de controle e 135 no grupo ácido zoledrônico), 60 tiveram um primeiro evento no osso (39 e 21) e 193 morreram (102 e 91). A sobrevida livre de doença invasiva em cinco anos foi de 74 • 1% (CI de 95% 69 • 8–78 • 3) no grupo de ácido zoledrônico e 73 • 7% (69 • 6–77 • 8) no grupo de controle; os valores foram semelhantes aos da população geral da triagem AZURE.

[0304] Entre os pacientes do grupo de controle, 118 (33%) dos 360 com tumores negativos para MAF e 29 (34%) dos 85 com tumores positivos para MAF tiveram um evento de sobrevida livre de doença invasiva, sugerindo que o status de MAF era não prognóstico para este parâmetro (Figura 33). Esse resultado, no entanto, não é totalmente representativo dos dados, porque o efeito do status de MAF no resultado da doença dependia do status menopáusico no início do tratamento (𝜒² = 7 • 34, grau de liberdade [df] 1, Pinteração (pinteraction)= 0 • 009).

Entre os pacientes pós-menopáusicos no grupo de controle, o status negativo para MAF foi associado a uma menor sobrevida livre de doença invasiva do que o positivo para MAF, enquanto que nos pacientes não pós-menopáusicos, a sobrevida livre de doença invasiva foi maior para os pacientes com tumores negativos para MAF do que aqueles com tumores positivos para MAF (Figura 33). No grupo ácido zoledrônico, a sobrevida livre de doença invasiva foi menor em pacientes com tumores positivos para MAF do que naqueles com tumores negativos para MAF, o que significa que o status de MAF forneceu informações prognósticas (Figura 33).

Um efeito semelhante foi observado para a sobrevida geral. O status menopáusico não alterou substancialmente o efeito do status de MAF no resultado da doença no grupo ácido zoledrônico (Figura 33).

[0305] Em pacientes com tumores negativos para MAF, o tratamento com ácido zoledrônico foi associado a uma sobrevida livre de doença invasiva mais longa do que o tratamento padrão isolado (Figura 34). Os benefícios do tratamento com ácido zoledrônico foram semelhantes, independentemente do status menopáusico ou da idade (Figura 35). Por outro lado, em pacientes com tumores positivos para MAF, embora o ácido zoledrônico não tenha sido associado a maior sobrevida livre de doença invasiva, houve heterogeneidade significativa no efeito do tratamento por status menopáusico e idade (Figura 35). Não estar na pós-menopausa no início do tratamento ou idade inferior a 50 anos teve efeitos adversos nítidos na sobrevida livre de doença invasiva em pacientes tratados com ácido zoledrônico (Figura 35).

Em mulheres pós-menopáusicas, o número de eventos naqueles com tumores positivos para MAF foi insuficiente para estabelecer uma associação definitiva entre o status de MAF e o efeito do tratamento, embora HR tenha sido semelhante (apensar de intervalos de confiança mais amplos) àquela observada em mulheres negativas para MAF (Figura 35).

[0306] Para sobrevida geral, foi observada uma associação semelhante entre tratamento, menopausa e status de MAF. Menos pacientes com tumores negativos para MAF tratados com ácido zoledrônico morreram do que aqueles do grupo de controle (57 [18%] de 321 vs 76 [21%] de 360; HR 0 • 78, CI de 95% 0 • 55- 1 • 10) Entre os pacientes com tumores positivos para MAF, não foi observado efeito do ácido zoledrônico na sobrevida geral (34 [34%] de 99 morreram versus 26 [31%] de 85; HR 1 • 11, CI de 95% 0 • 66-1) 86). Em mulheres com tumores positivos para MAF que não estavam na pós-menopausa no início do tratamento, houve um claro efeito adverso do ácido zoledrônico na sobrevida geral (24 [36%] dos 66 pacientes no grupo com ácido zoledrônico morreram versus nove [16%] dos 55 pacientes do grupo de controle; HR 2 • 27, CI de 95% 1 • 04–4 • 93), que contrasta com o efeito do tratamento do ácido zoledrônico na sobrevida geral em mulheres pós- menopáusicas com tumores positivos para MAF (dez [30%] dos 33 pacientes no grupo com ácido zoledrônico morreram contra 17 [57%] dos 30 no grupo de controle; 0 • 62; 0 · 27–1 • 48).

[0307] 190 pacientes tiveram um evento de sobrevida livre de doença invasiva extraesquelética (92 no grupo de controle e 98 no grupo ácido zoledrônico).

Quando comparado com o grupo de controle, o tratamento com ácido zoledrônico em mulheres não pós-menopáusicas com tumores positivos para MAF foi associado a um aumento acentuado da recaída em sítios extraesqueléticos (Figura 36). A sobrevida livre de doença invasiva extraesquelética estimada em 60 meses para pacientes com tumores positivos para MAF foi de 5 • 7% (CI de 95% 1 • 5–14 • 2) no grupo de controle e 38 • 8% (27 • 1–50 • 3) no grupo ácido zoledrônico (Figura 36).

Não foi observado efeito do tratamento com ácido zoledrônico na recorrência extraesquelética em pacientes com tumores negativos para MAF que não estavam na pós-menopausa no início do tratamento (a sobrevida livre de doença invasiva extraesquelética aos 60 meses foi de 18 • 0%, CI de 95% 13 • 5– 23 • 1 no grupo de controle e 19 • 8%, 14 • 8–25 • 5 no grupo ácido zoledrônico; Figura 36).

[0308] As análises do subgrupo da menopausa indicaram que o status menopáusico no início do tratamento teve um papel na associação entre o status de MAF e a sobrevida livre de doença invasiva (teste de razão de verossimilhança para o termo de interação de três vias entre status de MAF, status menopáusico e tratamento: 𝜒2 = 5 • 71, df 1; p = 0 • 017). Heterogeneidade no efeito do tratamento pelo status menopáusico foi encontrada para tumores positivos para MAF (𝜒2 = 6 • 98, df 1; p = 0 • 008), mas não tumores negativos para MAF (𝜒2 = 0 • 38, df 1; p = 0 • 539).

[0309] Em comparação com pacientes de controle não pós-menopáusicos com tumores negativos para MAF, HRs individuais foram consistentes com a análise primária de que a sobrevida livre de doença invasiva é independente do status menopáusico quando os pacientes são tratados com ácido zoledrônico (Tabela 2).

Tabela 2. Sobrevida livre de doença invasiva por status de MAF, status menopáusico e tratamento.

Número de Razão de risco Pacientes (CI de 95%) (Número de eventos) MAF negativo Grupo de controle não pós- 253 (83) 1 menopáusico Grupo de controle pós-menopáusico 107 (35) 1• 25 (0 • 80-1 • 95) Grupo de ácido zoledrônico não pós- 216 (61) 0• 83 (0 • 59-1 • menopáusico 15) Grupo de ácido zoledrônico pós- 105 (29) 1• 85 (0 • 53-1 • menopáusico 36) MAF positivo Grupo de controle não pós- 55 (11) 0• 63 (0 • 33-1 • menopáusico 20) Grupo de controle pós-menopáusico 30 (18) 2• 68 (1 • 53-4 • 68) Grupo de ácido zoledrônico não pós- 66 (33) 1• 61 (1 • 06-2 • menopáusico 44) Grupo de ácido zoledrônico pós- 33 (12) 1• 72 (0 • 90-3 • menopáusico 29)

[0310] Heterogeneidade nos resultados do status menopáusico, além do status de MAF, foi observada em pacientes nos grupos controle, pois aqueles com tumores positivos para MAF que não estavam na pós-menopausa no início do tratamento tiveram uma sobrevida livre de doença invasiva significativamente melhor do que aqueles que estavam na pós-menopausa (HR 0 • 26, CI de 95% 0 • 12–0 • 56). Pacientes não pós-menopáusicos no grupo de controle com tumores positivos para MAF tiveram uma sobrevida livre de doença invasiva mais longa do que pacientes no grupo de controle com tumores negativos para MAF (Tabela 2).

[0311] Nenhuma diferença na sobrevida livre de doença invasiva foi encontrada quando a idade foi usada como um marcador substituto para a menopausa (Tabela 3), com efeitos benéficos semelhantes em ambos os grupos etários observados com ácido zoledrônico em pacientes com tumores negativos para MAF (Figura 35 ) Tabela 3. Efeito do status de MAF na sobrevida livre de doença invasiva, por idade Número de Pacientes Razão de risco (Número de eventos) (CI de 95%) Grupo de ácido zoledrônico < 50 anos 142 (41) vs 44 (23) 0 • 473 (0 • 281-0 • 797) ≥ 50 anos 179 (49) vs 55 (22) 0 • 533 (0 • 719-0 • 890) Grupo de controle < 50 anos 167 (55) vs 33 (8) 1 • 410 (0 • 666-2 • 985) ≥ 50 anos 193 (63) vs 52 (21) 0 • 673 (0 • 407-1 • 114) *tumores positivos negativos para MAF vs positivos para MAF Conclusões

[0312] O número aumentado de cópias de tumores de MAF, quando medido por FISH em TMAs de tumores de mama primários, previu o benefício do tratamento e os danos associados ao ácido zoledrônico adjuvante. Além disso, o ácido zoledrônico adjuvante melhorou os resultados da doença em 79% dos pacientes com

[0313] Tumores negativos para MAF (número médio de cópias <2 • 5). Este efeito benéfico do tratamento foi independente do status menopáusico na entrada do estudo, o que sugere que o uso de bisfosfonatos adjuvantes poderia ser estendido a 80% das mulheres pré-menopáusicas que apresentam tumores negativos para MAF.

[0314] Embora o presente pedido tenha sido ilustrado pela descrição de modalidades e exemplos dos mesmos, e embora as modalidades e exemplos tenham sido descritos em detalhes, não é intenção dos requerentes restringir ou de alguma forma limitar o escopo das reivindicações a esse detalhe. Vantagens e modificações adicionais aparecerão prontamente para os especialistas na técnica, tendo o benefício do presente pedido. Portanto, a aplicação, em seus aspectos mais amplos, não se limita aos detalhes específicos, exemplos ilustrativos mostrados ou qualquer aparelho referido. Partidas podem ser feitas a partir de tais detalhes, exemplos e aparelhos sem se afastar do espírito ou do escopo do conceito inventivo geral.

[0315] Todas as publicações, patentes, pedidos de patentes, sites da Internet e números de acesso/sequências de bancos de dados, incluindo as sequências polinucleotídica e polipeptídica citadas neste documento, são incorporadas por referência aqui na íntegra para todos os fins, na mesma medida em que cada publicação de patente individual, pedido de patente, site na Internet ou número de acesso/sequência do banco de dados foram indicados específica e individualmente para serem incorporados por referência.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para tratar um objeto tendo câncer de mama, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar cerca de 1 mg a cerca de 10 mg de ácido zoledrônico ao objeto, em que o objeto foi identificado como tendo um nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho não aumentado em uma amostra de tumor em relação a uma amostra de controle.

2. Método para tratar um objeto tendo câncer de mama, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (i) quantificar o nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, e (ii) comparar o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho obtido em (i) com um valor de referência, em que se o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado em relação ao referido valor de referência, o referido objeto é administrado com de cerca de 1 mg a cerca de 10 mg de ácido zoledrônico.

3. Método para tratar um objeto tendo câncer de mama, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende quantificar o nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, em que se o nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação, ou o ganho não for aumentado, o referido objeto é administrado com cerca de 1 mg a cerca de 10 mg de ácido zoledrônico.

4. Método para identificar um objeto tendo câncer de mama que se beneficiará do tratamento com ácido zoledrônico, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (i) quantificar o nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, e (ii) comparar o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho obtido em (i) com um valor de referência, em que se o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado em relação ao referido valor de referência, o referido objeto é administrado com de cerca de 1 mg a cerca de 10 mg de ácido zoledrônico.

5. Método para identificar um objeto com câncer de mama que se beneficiará do tratamento com ácido zoledrônico, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende quantificar o nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, em que se o nível de expressão de c-MAF, o número de cópias, a amplificação ou o ganho não for aumentado; então, o referido objeto é administrado com cerca de 1 mg a cerca de 10 mg de ácido zoledrônico.

6. Método in vitro para designar uma terapia personalizada para um objeto tendo câncer de mama que CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (i) quantificar o nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, e (ii) comparar o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho obtido em (i) com um valor de referência, em que se o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado em relação ao referido valor de referência, então o objeto é suscetível a receber cerca de 1 mg a cerca de 10 mg de ácido zoledrônico.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o objeto é administrado com cerca de 2 mg a cerca de 9 mg de ácido zoledrônico, de cerca de 2 mg a cerca de 8 mg de ácido zoledrônico, de cerca de 2 mg a cerca de 7 mg. de ácido zoledrônico, de cerca de 2 mg a cerca de 6 mg de ácido zoledrônico, de cerca de 2 mg a cerca de 5 mg de ácido zoledrônico, ou de cerca de 3 mg a cerca de 5 mg de ácido zoledrônico.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6,

CARACTERIZADO pelo fato de que o objeto é administrado com cerca de 1 mg, cerca de 2 mg, cerca de 3 mg, cerca de 4 mg, cerca de 5 mg, cerca de 6 mg, cerca de 7 mg, cerca de 8 mg, cerca de 9 mg, cerca de 10 mg, cerca de 12 mg, cerca de 14 mg, cerca de 15 mg ou cerca de 16 mg de ácido zoledrônico.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o objeto é administrado com cerca de 4 mg de ácido zoledrônico.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido zoledrônico é administrado uma vez a cada 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas, 12 semanas, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses ou 1 ano.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido zoledrônico é administrado uma vez a cada 3 semanas.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido zoledrônico é administrado uma vez a cada 4 semanas.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido zoledrônico é administrado uma vez a cada 3 semanas por pelo menos seis doses iniciais.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido zoledrônico é administrado uma vez a cada 4 semanas por pelo menos seis doses iniciais.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido zoledrônico é administrado uma vez a cada 3 meses por pelo menos oito doses de manutenção após as doses iniciais.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9,

CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido zoledrônico é administrado uma vez a cada 6 meses por até cinco doses de manutenção após as doses iniciais de manutenção.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido zoledrônico é administrado como uma terapia adjuvante.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido zoledrônico é administrado como uma terapia neoadjuvante.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido zoledrônico é administrado com uma terapia adicional.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido zoledrônico é administrado antes, simultaneamente ou após a terapia adicional.

21. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que a terapia adicional é qualquer droga quimioterápica citotóxica aprovada localmente, qualquer terapia hormonal, cirurgia, radioterapia aprovada localmente, ou uma combinação dos mesmos.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o objeto é adicionalmente administrado com cálcio uma vez por dia.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o objeto recebe adicionalmente vitamina D uma vez por dia.

24. Método para tratar um objeto tendo câncer de mama, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a administração de clodronato a uma dose de cerca de 1000 mg a cerca de 2000 mg cerca de uma vez por dia, em que o objeto foi identificado como tendo um nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho não aumentado em uma amostra de tumor em relação a uma amostra de controle.

25. Método para tratar um objeto tendo câncer de mama, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (i) quantificar o nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, e (ii) comparar o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho obtido em (i) com um valor de referência, em que se o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado em relação ao referido valor de referência, então o objeto é administrado com clodronato a uma dose de cerca de 1000 a cerca de 2000 mg cerca de uma vez por dia.

26. Método para tratar um objeto tendo câncer de mama, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende quantificar o nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, em que se o nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação, ou o ganho não for aumentado, então, o referido objeto é administrado com clodronato a uma dose de cerca de 1000 a cerca de 2000 mg, cerca de uma vez por dia.

27. Método para identificar um objeto tendo câncer de mama que se beneficiará do tratamento com clodronato, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (i) quantificar o nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, e (ii) comparar o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho obtido em (i) com um valor de referência, em que se o nível de expressão, número de cópias, amplificação, ou o ganho não é aumentado em relação ao referido valor de referência, então o referido objeto é administrado com clodronato a uma dose de cerca de 1000 a cerca de 2000 mg cerca de uma vez por dia.

28. Método para identificar um objeto com câncer de mama que se beneficiará do tratamento com clodronato, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende quantificar o nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, em que se o nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado, então o referido objeto é administrado com clodronato a uma dose de cerca de 1000 a cerca de 2000 mg cerca de uma vez por dia.

29. Método in vitro para designar uma terapia personalizada para um objeto tendo câncer de mama, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (i) quantificar o nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, e (ii) comparar o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho obtido em (i) com um valor de referência, em que se o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado em relação ao referido valor de referência, então o objeto é suscetível a receber clodronato a uma dose de cerca de 1000 a cerca de 2000 mg cerca de uma vez por dia.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 29, CARACTERIZADO pelo fato de que o clodronato é administrado a uma dose de cerca de 1200 a cerca de 2000 mg, de cerca de 1200 a cerca de 1800 mg, de cerca de 1300 a cerca de 1800 mg ou de cerca de 1400 mg a cerca de 1800 mg.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 29,

CARACTERIZADO pelo fato de que o clodronato é administrado a uma dose de cerca de 1000 mg, cerca de 1100 mg, cerca de 1200 mg, cerca de 1250 mg, cerca de 1300 mg, cerca de 1400 mg, cerca de 1500 mg, cerca de 1600 mg, cerca de 1700 mg, cerca de 1750 mg, cerca de 1800 mg, cerca de 1900 mg ou cerca de 2000 mg.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 29, CARACTERIZADO pelo fato de que o clodronato é administrado a uma dose de cerca de 1600 mg.

33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o clodronato é administrado com cerca de uma vez ao dia por pelo menos 1 mês, cerca de 2 meses, cerca de 3 meses, cerca de 4 meses, cerca de 6 meses, cerca de 6 meses, cerca de 9 meses, cerca de 1 ano, cerca de 2 anos, cerca de 3 anos, cerca de 4 anos, cerca de 5 anos ou mais.

34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o clodronato é administrado como uma terapia adjuvante.

35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o clodronato é administrado como uma terapia neoadjuvante.

36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o clodronato é administrado com uma terapia adicional.

37. Método, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato de que o clodronato é administrado antes, simultaneamente com ou após a terapia adicional.

38. Método, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato de que a terapia adicional é qualquer droga quimioterápica citotóxica aprovada localmente, qualquer terapia hormonal, cirurgia, radioterapia localmente aprovada ou uma combinação dos mesmos.

39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 38, CARACTERIZADO pelo fato de que o objeto é adicionalmente administrado com cálcio uma vez por dia.

40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 39, CARACTERIZADO pelo fato de que o objeto recebe adicionalmente vitamina D uma vez por dia.

41. Método para tratar um objeto tendo câncer de mama, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a administração de denosumabe em uma dose de cerca de 10 mg a cerca de 300 mg, em que o objeto foi identificado como tendo um nível de expressão de c-MAF, número de cópia, amplificação não aumentado ou ganho em uma amostra de tumor em relação a uma amostra de controle.

42. Método para tratar um objeto tendo câncer de mama, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (i) quantificar o nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, e (ii) comparar o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho obtido em (i) com um valor de referência, em que se o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado em relação ao referido valor de referência, então o referido objeto é administrado com denosumabe a uma dose de cerca de 10 mg a cerca de 300 mg.

43. Método para tratar um objeto tendo câncer de mama, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende quantificar o nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, em que se o nível de expressão de c-MAF, número de cópias, amplificação, ou o ganho não for aumentado, então o referido objeto é administrado com denosumabe a uma dose de cerca de 10 mg a cerca de 300 mg.

44. Método para identificar um objeto tendo câncer de mama que se beneficiará do tratamento com denosumabe, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (i) quantificar o nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, e (ii) comparar o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho obtido em (i) com um valor de referência, em que se o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado em relação ao referido valor de referência, então o referido objeto é administrado com denosumabe a uma dose de cerca de 10 mg a cerca de 300 mg.

45. Um método para identificar um paciente com câncer de mama que se beneficiará do tratamento com denosumabe, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende quantificar o nível de expressão da c-MAF, número de cópias e amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, em que se o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho de c-MAF não for aumentado, então o referido objeto é administrado com denosumabe a uma dose de cerca de 10 mg a cerca de 300 mg.

46. Método in vitro para designar uma terapia personalizada para um objeto tendo câncer de mama, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (i) quantificar o nível de expressão gênica de c-MAF, número de cópias, amplificação ou ganho em uma amostra do referido objeto, e (ii) comparar o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho obtido em (i) com um valor de referência,

em que se o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho não for aumentado em relação ao referido valor de referência, então o objeto é suscetível a receber denosumabe a uma dose de cerca de 10 mg a cerca de 300 mg.

47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o denosumabe é administrado a uma dose de cerca de 20 mg a cerca de 300 mg, de cerca de 50 mg a cerca de 300 mg, de cerca de 50 mg a cerca de 250 mg, de cerca de 75 mg a cerca de 250 mg, de cerca de 100 mg a cerca de 250 mg, de cerca de 100 mg a cerca de 200 mg ou de cerca de 100 mg a cerca de 150 mg.

48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o denosumabe é administrado a uma dose de cerca de 20 mg, cerca de 30 mg, cerca de 50 mg, cerca de 75 mg, cerca de 75 mg, cerca de 100 mg, cerca de 110 mg, cerca de 110 mg, cerca de 130 mg, cerca de 150 mg, cerca de 175 mg, cerca de 200 mg, cerca de 225 mg, cerca de 250 mg, cerca de 275 mg ou cerca de 300 mg.

49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o denosumabe é administrado a uma dose de cerca de 120 mg.

50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o denosumabe é administrado a uma dose de cerca de 30 mg.

51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o denosumabe é administrado a uma dose de cerca de 60 mg.

52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o denosumabe é administrado a uma dose de cerca de 180 mg.

53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 52, CARACTERIZADO pelo fato de que o denosumabe é administrado uma vez pelo menos a cada 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 12 semanas, 4 meses, 6 meses ou 1 ano.

54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 52, CARACTERIZADO pelo fato de que o denosumabe é administrado a uma dose de 120 mg uma vez a cada mês, durante pelo menos 6 meses.

55. Método, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de que, após as 6 doses mensais, o denosumabe é administrado a uma dose de 120 mg uma vez a cada 3 meses por pelo menos cerca de 1 ano, cerca de 2 anos, cerca de 3 anos, cerca de 4 anos, cerca de 5 anos ou mais.

56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 55, CARACTERIZADO pelo fato de que o objeto é adicionalmente administrado com cálcio uma vez por dia.

57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 56, CARACTERIZADO pelo fato de que o objeto recebe adicionalmente vitamina D uma vez por dia.

58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 57, CARACTERIZADO pelo fato de que o denosumabe é administrado por subcutaneamente.

59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 58, CARACTERIZADO pelo fato de que o denosumabe é administrado como uma terapia adjuvante.

60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 58, CARACTERIZADO pelo fato de que o denosumabe é administrado como uma terapia neoadjuvante.

61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 58, CARACTERIZADO pelo fato de que o denosumabe é administrado com uma terapia adicional.

62. Método, de acordo com a reivindicação 61, CARACTERIZADO pelo fato de que o denosumabe é administrado antes, simultaneamente com ou após a terapia adicional.

63. Método, de acordo com a reivindicação 61, CARACTERIZADO pelo fato de que a terapia adicional é qualquer droga quimioterápica citotóxica aprovada localmente, qualquer terapia hormonal, cirurgia, radioterapia localmente aprovada ou uma combinação dos mesmos.

64. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 63, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer de mama é o câncer de mama de Estágio 0.

65. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 63, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer de mama é câncer de mama de Estágio I.

66. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 63, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer de mama é câncer de mama de Estágio II.

67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 63, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer de mama é câncer de mama de Estágio III.

68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 63, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer de mama é um câncer de mama de Estágio IV.

69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 68, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer de mama é um câncer de mama metastático.

70. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 68, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer de mama é um câncer de mama que não foi metastizado.

71. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 70, CARACTERIZADO pelo fato de que a quantificação compreende quantificar o RNA mensageiro (mRNA) do referido gene, ou um fragmento do referido mRNA, o DNA complementar (cDNA) do referido gene, ou um fragmento do referido cDNA ou quantificar o nível de proteína codificada pelo referido gene.

72. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 71, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho é quantificado por meio de uma técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) quantitativa ou uma matriz de DNA ou RNA, FISH ou hibridação nucleotídica.

73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 72, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de proteína é quantificado por meio de western blot, ELISA, imunohistoquímica ou matriz de proteínas.

74. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 72, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de proteína é quantificado usando um anticorpo compreendendo uma CDR1 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 21 e/ou uma CDR2 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 22 e/ou uma CDR3 de cadeia pesada de SEQ ID NO: 23 e/ou uma CDR1 de cadeia leve de SEQ ID NO: 18 e/ou uma CDR2 de cadeia leve de SEQ ID NO: 19 e/ou uma CDR3 de cadeia leve de SEQ ID NO: 20.

75. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 74, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho do gene c-MAF é determinado por meio da determinação do nível de expressão, número de cópias, amplificação ou ganho do locus 16q23 ou 16q22-q24.

76. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 75, CARACTERIZADO pelo fato de que a amplificação ou ganho do gene c-MAF é determinada por meio do uso de uma sonda específica ao gene c-MAF.

77. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 76, CARACTERIZADO pelo fato de que o valor de referência é o de uma amostra de tecido tumoral de câncer de mama de um objeto que não sofreu metástase.

78. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 77, CARACTERIZADO pelo fato de que a amplificação ou ganho é determinado por meio de hibridização in situ ou PCR.

79. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 78, CARACTERIZADO pelo fato de que o número de cópias do c-MAF medido usando FISH é < 2,0 ou 2,1.

80. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 79, CARACTERIZADO pelo fato de que o número de cópias é determinado como o número médio de cópias por célula.

81. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 80, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer de mama é câncer de mama ER+.

82. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 80, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer de mama é um câncer de mama ER-.

83. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 80, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer de mama é um câncer de mama triplo- negativo.

84. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 83, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer de mama é do subtipo basal.

85. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-84, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer de mama é HER2+.

86. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 85, CARACTERIZADO pelo fato de que o objeto é não pós-menopáusico.

87. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 85, CARACTERIZADO pelo fato de que o objeto é pré-menopáusico.

88. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 85, CARACTERIZADO pelo fato de que o objeto é pós-menopáusico.

89. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 88, CARACTERIZADO pelo fato de que o tratamento ou terapia melhora a sobrevida livre de doença invasiva.

90. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 89, CARACTERIZADO pelo fato de que o tratamento ou terapia melhora a sobrevida geral.

91. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 90, CARACTERIZADO pelo fato de que o tratamento ou terapia melhora a sobrevida livre de doença.

92. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 91, CARACTERIZADO pelo fato de que o objeto tem perda óssea induzida por tratamento de câncer.