BR112019025105A2

BR112019025105A2 - fabs quiméricos estabilizados

Info

Publication number: BR112019025105A2
Application number: BR112019025105-7A
Authority: BR
Inventors: Dunja UROSEV; Yang-Chieh Chou
Original assignee: Zymeworks Inc.
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2020-10-20
Also published as: KR102611853B1; AU2018292438A1; RU2019142330A3; US11965019B2; RU2019142330A; WO2019000105A1; KR20200024828A; EP3645575A1; CN110831978A; AU2018292438B2; MX2019015293A; US20200308270A1; JP7245793B2; JP2020530265A; EP3645575A4; CA3064966A1

Abstract

São fornecidos no presente documento Fabs quiméricos estabilizados derivados de um Fab quimérico original que tem uma cadeia leve lambda. Os Fabs quiméricos estabilizados compreendem um construto de polipeptídeo de cadeia pesada de imunoglobulina do Fab quimérico original, que tem uma sequência de CH1 e uma sequência de VH, assim como um construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa. A sequência de Vlambda do construto de cadeia leve quimérico corresponde àquela do Fab quimérico original e compreende uma ou mais modificações de aminoácido estabilizantes que aumentam a estabilidade térmica do Fab quimérico estabilizado em comparação com o Fab quimérico original. Os Fabs estabilizados são úteis como polipeptídeos terapêuticos ou podem ser usados para preparar construtos de anticorpo em outros formatos. Os Fabs quiméricos estabilizados podem ser também úteis, de modo geral, para aumentar a estabilidade de anticorpos que têm cadeias leve lambda.

Description

“FABS QUIMÉRICOS ESTABILIZADOS” REFERÊNCIA A UMA “LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS”, UMA TABELA OU UM ANEXO DE LISTAGEM DE PROGRAMAS DE COMPUTADOR SUBMETIDO EM UM DISCO COMPACTO

[001] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida por meio de EFS-Web e está incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade. A dita cópia ASCII, criada em 27 de junho de 2018, é nomeada 2018-06-27 (097993-1092280 (001610WO)) Sequence Listing.txt e tem 45 bytes de tamanho.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Os anticorpos encontram uso em muitas aplicações, incluindo como ferramentas de pesquisa, como diagnósticos e, obviamente, como produtos terapêuticos, todos os quais exigem a fabricação de anticorpos em grandes quantidades. As propriedades físicas dos anticorpos, tais como estabilidade térmica, podem afetar a fabricabilidade dos anticorpos. Por exemplo, anticorpos com baixa estabilidade térmica ou aqueles que agregam são difíceis de fabricar ou armazenar.

[003] Os anticorpos de ocorrência natural e aqueles que foram artificialmente gerados (por exemplo, por apresentação em fago ou modificação genética recombinante) exibem uma faixa de estabilidades térmicas, com anticorpos artificialmente gerados frequentemente tendo um nível de estabilidade térmica que os torna difíceis de fabricar (McConnell et al. (2014) mAbs: 6:1274- 1282). Além disso, foi sugerido que, em anticorpos identificados a partir de uma biblioteca de Fab sintética, a temperatura de fusão média de anticorpos contendo domínios variáveis de cadeias leves lambda era menor do que esta dos anticorpos contendo domínios variáveis de cadeias leves kappa (Tiller et al. (2013) Mabs 5:3, 445-470).

[004] Os Fabs quiméricos que compreendem cadeias leves quiméricas podem ser construídos para diversos propósitos. Por exemplo, os Fabs quiméricos podem ser gerados mediante a conversão de scFvs gerados por apresentação em fago em formato de Fab para se obter um anticorpo num formato de ocorrência natural. Adicionalmente, os anticorpos quiméricos de camundongo-ser humano podem ser construídos para reduzir a imunogenicidade de anticorpos de camundongo em seres humanos. Os Fabs quiméricos podem compreender um domínio lambda variável e domínio kappa constante (Vlambda-Ckappa) ou um domínio kappa variável e um domínio lambda constante (Vkappa-Clambda). Fabs quiméricos que têm uma cadeia leve quimérica frequentemente exibem uma diminuição na estabilidade térmica em relação a um Fab que compreende a cadeia leve lambda original.

[005] Assim, há uma necessidade de aumentar a estabilidade térmica de Fabs quiméricos, assim como esta de anticorpos que têm cadeias leves lambda, a fim de melhorar sua fabricabilidade.

BREVE SUMÁRIO

[006] A presente divulgação fornece Fabs quiméricos estabilizados. Num aspecto, é fornecido um Fab quimérico ou heterodímero quimérico estabilizado que compreende: um primeiro construto de polipeptídeo de cadeia pesada de imunoglobulina (H1) que compreende uma sequência de domínio constante de cadeia pesada 1 (CH1) e uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (VH), e um primeiro construto de polipeptídeo de cadeia leve de imunoglobulina quimérico (L1) que compreende uma sequência de domínio constante de cadeia leve kappa (Ckappa) e uma sequência de domínio variável de cadeia leve lambda (Vlambda), em que a sequência de Vlambda compreende uma ou mais modificações de aminoácido estabilizantes que aumentam a estabilidade térmica do heterodímero quimérico em comparação com um heterodímero quimérico do tipo selvagem correspondente sem as substituições de aminoácido estabilizantes, em que H1 e L1 formam uma primeira região Fab que se liga a um primeiro epítopo.

[007] Em outro aspecto, é fornecido um construto de anticorpo que compreende: um primeiro heterodímero, em que o primeiro heterodímero é o Fab quimérico ou heterodímero quimérico estabilizado descrito no presente documento, e um arcabouço, em que pelo menos um dentre H1 e L1 do dito primeiro heterodímero está ligado com ou sem um ligante ao arcabouço.

[008] Em outro aspecto, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende o Fab quimérico ou heterodímero quimérico estabilizado, ou o construto de anticorpo descrito no presente documento, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[009] Em outro aspecto, é fornecido um polinucleotídeo ou conjunto de polinucleotídeos que codifica o Fab quimérico ou heterodímero quimérico estabilizado, ou o construto de anticorpo descrito no presente documento.

[010] Em outro aspecto, é fornecido um vetor ou conjunto de vetores que compreende um ou mais polinucleotídeos ou conjuntos de polinucleotídeos descritos no presente documento.

[011] Em outro aspecto, é fornecida uma célula isolada que compreende o polinucleotídeo, o conjunto de polinucleotídeos, o vetor ou o conjunto de vetores descrito no presente documento.

[012] Em outro aspecto, é fornecido um método para preparar o Fab quimérico ou heterodímero quimérico estabilizado, ou o construto de anticorpo descrito no presente documento, que compreende as etapas de: obter uma célula hospedeira que compreende um polinucleotídeo ou conjunto de polinucleotídeos que codifica o heterodímero quimérico ou construto de anticorpo; cultivar a célula hospedeira numa cultura de células hospedeiras sob condições que permitem a expressão do heterodímero quimérico ou construto de anticorpo, e coletar o heterodímero quimérico ou construto de anticorpo da cultura de células hospedeiras.

[013] Em outro aspecto, é fornecido um construto de polipeptídeo de cadeia leve quimérico que compreende uma sequência de domínio constante de cadeia leve kappa (Ckappa) e uma sequência de domínio variável de cadeia leve lambda (Vlambda), em que a sequência de Vlambda compreende uma ou mais substituições de aminoácido estabilizantes que aumentam a estabilidade térmica de um heterodímero quimérico que compreende a cadeia leve quimérica.

[014] Em outro aspecto, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende o construto de polipeptídeo de cadeia leve quimérico descrito no presente documento e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[015] Em outro aspecto, é fornecido um polinucleotídeo que codifica o construto de polipeptídeo de cadeia leve quimérico descrito no presente documento.

[016] Em outro aspecto, é fornecido um método para aumentar a estabilidade térmica de um anticorpo que compreende uma cadeia leve de imunoglobulina lambda e uma cadeia pesada de imunoglobulina, em que o método compreende: preparar uma cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa que compreende a sequência de Vlambda do anticorpo, e uma sequência de Ckappa de um anticorpo que tem uma cadeia leve kappa, em que a sequência de Vlambda compreende uma ou mais modificações de aminoácido estabilizantes, e expressar a cadeia leve quimérica Vlambda-Ckappa com a cadeia pesada de imunoglobulina para obter um anticorpo com estabilidade térmica aumentada.

[017] Em outro aspecto, é fornecido um método para tratar câncer, doença autoimune, um distúrbio inflamatório ou uma doença infecciosa num indivíduo que compreende administrar uma quantidade eficaz de um heterodímero quimérico ou construto de anticorpo descrito no presente documento a um indivíduo ou paciente.

[018] Em outro aspecto, o uso de uma quantidade eficaz de um heterodímero quimérico ou um construto de anticorpo descrito no presente documento no tratamento de câncer, doença autoimune, um distúrbio inflamatório ou uma doença infecciosa num indivíduo é fornecido. Numa modalidade, o uso de um heterodímero quimérico ou um construto de anticorpo descrito no presente documento na preparação de um medicamento para o tratamento de câncer, doença autoimune, um distúrbio inflamatório ou uma doença infecciosa é fornecido. Em outro aspecto, um heterodímero quimérico ou um construto de anticorpo descrito no presente documento para uso no tratamento de câncer, doença autoimune, um distúrbio inflamatório ou uma doença infecciosa num indivíduo é fornecido.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[019] A Figura 1 retrata uma representação esquemática de um Fab quimérico Vlambda-Ckappa e a abordagem de modificação genética tomada para melhorar a estabilidade térmica do Fab quimérico Vlambda-Ckappa. Um Fab lambda WT (do tipo selvagem) (também denominado Fab lambda original) é mostrado, tendo uma sequência de Fab de cadeia pesada (domínios VH e CH1, preenchimento cinza) e uma cadeia leve lambda do tipo selvagem (preenchimento branco). Este Fab lambda original pode ser geneticamente modificado num Fab quimérico original (Fab quimérico Vlambda-Ckappa) trocando-se a sequência

Clambda da cadeia leve lambda original por uma sequência de Ckappa para formar um construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa. Assim, o construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa compreende uma sequência de Vlambda do Fab lambda original (preenchimento branco) fundida a uma sequência de Ckappa (preenchimento hachurado). A estabilidade térmica do Fab quimérico original pode ser aumentada introduzindo-se mutações na sequência de Vlambda para imitar a interface observada entre domínios kappa variáveis e domínios kappa constantes (Vkappa-Ckappa), resultando na compatibilidade melhorada da interface Vlambda-Ckappa. Este Fab quimérico estabilizado é retratado na Figura 1 como “Fab quimérico Vlambda-Ckappa projetado”, em que os símbolos de estrela representam as modificações de aminoácido estabilizantes (também denominadas projeto de otimização de estabilidade). Os Fabs quiméricos originais são também denominados no presente documento “heterodímeros quiméricos do tipo selvagem”.

[020] A Figura 2 mostra a sequência de um construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa exemplificativo, para o anticorpo CAT-2200. A sequência de cadeia leve lambda WT que corresponde a CAT-2200 (do PDB entrada 2VXS, cadeia L) é alinhada com o construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa com base no anticorpo CAT-2200 para destacar as diferenças entre os dois construtos. O construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa é composto da sequência de domínio variável lambda de CAT-2200 terminando no resíduo L106A e sequência de domínio constante kappa que corresponde a IGKC*01 começando na posição R108. Um asterisco (*) indica as posições que têm um único resíduo conservado; dois pontos (:) indicam a conservação entre os grupos de propriedades fortemente similares; um ponto (.) indica a conservação entre o grupo de propriedades fracamente similares; e nenhum símbolo de consenso indica resíduos muito diferentes, como referido no site da web do EMBL- EBI.

[021] As Figuras 3A a 3D retratam diagramas de fita da interface de domínio variável-domínio constante na cadeia leve. A Figura 3A retrata uma representação esquemática de um Fab. A região correspondente à área delimitada foi ampliada nas Figuras 3B a 3D. A Figura 3B destaca os resíduos de ponto de interesse 83, 85 e 105 na interface Vkappa-Ckappa (anticorpo D3H44, PDB:1jpt). A Figura 3C retrata a interface Vlambda-Clambda (anticorpo CAT-2200, PDB:2vxs), também destacando os resíduos 83, 85 e 105. A Figura 3D retrata uma interface Vlambda-Ckappa não otimizada (anticorpo S4, PDB: 3nps), novamente destacando os resíduos 83, 85 e 105.

[022] A Figura 4 representa um esquema análogo a este na Figura 1, aplicado ao formato de Mab, retratando um Mab lambda WT, um Mab quimérico Vlambda-Ckappa e um Mab quimérico Vlambda-Ckappa projetado (também denominado Mab estabilizado), em que os símbolos de estrela denotam a presença de um projeto de otimização de estabilidade.

[023] A Figura 5 fornece a comparação de titulações de proteína A para Fab quiméricos designados selecionados (a região variável da cadeia pesada de anticorpo CAT-2200 pertence ao subgrupo de linhagem germinativa VH3 e tem a capacidade para se ligar à proteína A), Mabs e os respectivos formatos do tipo selvagem no sistema CAT-2200. As titulações de proteína A médias (mg/l) de três transfecções de 50 ml independentes são plotadas.

[024] As Figuras 6A e 6B retratam o efeito das modificações de aminoácido estabilizantes dentro e através dos temas de projeto 83X, em que X= F, V, I, A, com base em diferentes Fabs quiméricos originais. A Figura 6A mostra a estabilidade térmica de Fabs quiméricos estabilizados com base no anticorpo lambda CAT- 2200; e a Figura 6B mostra a estabilidade térmica de Fabs quiméricos estabilizados com base no anticorpo lambda H3. A alteração na Tm (medida por DSF) do Fab quimérico estabilizado em comparação a esta do respectivo Fab quimérico original é plotada para o número de projetos de tema.

[025] A Figura 7 retrata a extensão do aumento numa estabilidade térmica através de diferentes sistemas de Fab. A alteração na Tm (medida por DSC) do Fab quimérico projetado em comparação a este do respectivo Fab quimérico original é plotada para sete projetos selecionados (cobrindo todos os temas) em três sistemas de teste H3, CAT-2200 e EP6b_B01.

[026] A Figura 8 demonstra a transferabilidade do aumento na estabilidade do formato de Fab para Mab. A alteração na Tm (medida por DSC) de sete Fab e Mabs quiméricos projetados selecionados em comparação a esta do respectivo Fab ou Mab quimérico é plotada para dois sistemas de teste H3 e CAT-2200.

[027] As Figura 9A e 9B retratam perfis de DSC típicos dos Fab (Figura 9A) e Mabs (Figura 9B) quiméricos projetados num subconjunto de dois projetos (projetos 18 e 39) no sistema de anticorpo H3. Os perfis de DSC para os respectivos Fab e Mabs do tipo selvagem e quiméricos são incluídos para referência.

[028] As Figuras 10A a 10F retratam perfis de UPLC-SEC monodispersos típicos de Mabs quiméricos projetados com base no sistema H3, em diferentes pontos de tempo do estudo de estabilidade de bancada. Este estudo foi executado a 37 °C e a uma concentração de 5 mg/ml no tampão de PBS pH 7,4. As Figuras 10A, 10C e 10E mostram os perfis de UPLC-SEC para o Mab lambda do tipo selvagem nos dias 0, 20 e 30, respectivamente. As Figuras 10B, 10D e 10F mostram os perfis de UPLC-SEC para um Mab estabilizado que tem modificações de aminoácido estabilizantes que correspondem ao projeto 37 nos dias 0, 20, 30, respectivamente.

[029] A Figura 11 retrata os produtos associados à cadeia pesada potenciais que podem ser esperados quando duas cadeias leves diferentes são coexpressas com duas cadeias pesadas diferentes numa célula. O pareamento preferencial é avaliado com o uso de um SMCA (ensaio de competição de anticorpo monoclonal).

[030] A Figura 12 retrata uma representação esquemática de um anticorpo quimérico biespecífico projetado exemplificativo composto do Fab original 1 (Fab kappa) e Fab original 2 (Fab quimérico Vlambda-Ckappa projetado), em que os símbolos de estrela denotam projetos de otimização de estabilidade, e os símbolos retangulares denotam projetos de pareamento de cadeia leve ou projetos de pareamento de cadeia pesada.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[031] Fabs quiméricos são Fabs que compreendem uma cadeia leve quimérica. No contexto da presente divulgação, Fabs quiméricos podem compreendem um construto de cadeia leve quimérico que tem uma sequência de domínio variável de cadeia leve de uma cadeia leve lambda (sequência de Vlambda) e uma sequência de domínio constante de cadeia leve de uma cadeia leve kappa (sequência de Ckappa). Tais cadeias leves quiméricas são denominadas no presente documento como cadeias leves quiméricas Vlambda- Ckappa (cadeias leves quiméricas Vlambda-Ckappa). Em muitos casos, os Fabs quiméricos com uma cadeia leve quimérica Vlambda-Ckappa podem exibir uma diminuição na estabilidade térmica em comparação a um Fab original que compreende uma cadeia leve lambda do tipo selvagem. Ademais, muitos anticorpos que têm cadeias leves lambda exibem estabilidade térmica que é diminuída em comparação a anticorpos que têm cadeias leves kappa. Uma diminuição na estabilidade térmica pode levar a dificuldades na fabricação de anticorpos contendo tais Fabs quiméricos na quantidade necessária e com a quantidade necessária exigida para o desenvolvimento do anticorpo terapêutico.

[032] São fornecidos no presente documento Fabs quiméricos estabilizados que compreendem um construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa modificado e uma cadeia pesada que compreende um domínio VH e CH1. O construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa modificado compreende uma sequência de Vlambda que compreende uma ou uma ou mais modificações de aminoácido estabilizantes que aumentam a estabilidade térmica do Fab quimérico. Em algumas modalidades, as modificações de aminoácido estabilizantes estão num ou mais resíduos de aminoácido na interface entre os domínios Vlambda e Ckappa. Em algumas modalidades, o Fab quimérico estabilizado pode exibir uma estabilidade térmica que é ainda maior do que esta de um Fab do tipo selvagem correspondente que tem uma cadeia leve lambda do tipo selvagem (Fab lambda do tipo selvagem). As modificações de aminoácido estabilizantes são transferíveis através de diferentes sistemas de anticorpo e têm pouco a nenhum impacto na capacidade do Fab quimérico estabilizado para se ligar ao antígeno. Quando os construtos de cadeia leve quiméricos Vlambda-Ckappa que têm as modificações de aminoácido estabilizantes estão presentes no contexto de um anticorpo num formato de Mab, as modificações de aminoácido estabilizantes não afetam a capacidade do anticorpo para se ligar a receptores Fc gama ou FcRn.

[033] Os Fabs quiméricos estabilizados são úteis como polipeptídeos terapêuticos ou podem ser usados para preparar construtos de anticorpo em outros formatos, incluindo o formato de Mab ou outros formatos de anticorpo em que uma cadeia leve quimérica Vlambda-Ckappa está presente. Os Fabs quiméricos estabilizados podem ser também úteis, de modo geral, para aumentar a estabilidade de anticorpos que têm cadeias leve lambda. Neste contexto, o anticorpo lambda original pode ser preparado com construtos de cadeia leve quiméricos Vlambda-Ckappa incluindo as modificações de aminoácido estabilizantes para aumentar a estabilidade térmica.

DEFINIÇÕES

[034] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado comumente compreendido pelo versado na técnica a qual a matéria reivindicada pertence. No caso em que houver uma pluralidade de definições para termos no presente documento, aqueles nessa seção prevalecem. Embora seja feita referência a uma URL ou outro tal identificador ou endereço, é entendido que tais identificadores podem mudar e informações particulares na internet podem surgir e desaparecer, mas informações equivalentes podem ser encontradas por pesquisa na internet. A referência às mesmas evidencia a disponibilidade e a disseminação pública de tais informações.

[035] Deve-se entender que a descrição geral anterior e a descrição detalhada a seguir são apenas exemplificativas e explicativas e não são restritivas a qualquer matéria reivindicada. Neste pedido, o uso do singular inclui o plural a não ser que especificamente determinado de outro modo.

[036] Na presente descrição, qualquer faixa de concentração, faixa de porcentagem, faixa de razão ou faixa de número inteiro não deve ser compreendida para incluir o valor de qualquer número inteiro dentro da faixa citada e, quando adequado, frações da mesma (como um décimo e um centésimo de um número inteiro), a menos que seja indicado o contrário. Conforme usado no presente documento, “cerca de” significa ± 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% da faixa, valor, sequência ou estrutura indicada, a não ser que indicado de outro modo. Deve-se compreender que os termos “um” e “uma”, conforme usado no presente documento, referem-se a “um ou mais” dos componentes enumerados a não ser que indicado ou ditado de outro modo por seu contexto. O uso da alternativa (por exemplo, “ou”) deve ser entendido significando um, ambos ou qualquer combinação dos mesmos das alternativas. Conforme usado no presente documento, os termos “incluir” e “compreender” são usados como sinônimos. Adicionalmente, deve-se entender que os polipeptídeos de cadeia única individuais ou construtos de imunoglobulina derivados de várias combinações das estruturas e substituintes descritos no presente documento são divulgados pelo presente pedido ao mesmo ponto como se cada polipeptídeo de cadeia única ou Fab quimérico estabilizado tivesse sido apresentado individualmente. Assim, a seleção de componentes particulares para formar polipeptídeos de cadeia única individuais ou Fabs quiméricos estabilizados é abrangida pelo escopo da presente divulgação.

[037] Os cabeçalhos de seção usados no presente documento servem apenas a propósitos organizacionais e não devem ser interpretados como limitando a matéria descrita. Todos os documentos, ou partes de documentos, mencionados no pedido, incluindo, porém sem limitação, patentes, pedidos de patente, artigos, livros, manuais e dissertações, estão incorporados expressamente ao presente documento a título de referência em sua totalidade para qualquer propósito.

[038] Deve-se entender que os métodos e composições descritos no presente documento não são limitados à metodologia, aos protocolos, às linhagens celulares, aos construtos e aos reagentes particulares descritos no presente documento e, como tais, podem variar. Deve-se entender também que a terminologia usada no presente documento é para o propósito de descrever modalidades particulares apenas e não se destina a limitar o escopo dos métodos e composições descritos no presente documento, que será apenas limitado apenas pelas reivindicações anexas.

[039] Todas as publicações e patentes mencionadas no presente documento são incorporadas no presente documento a título de referência em sua totalidade para o propósito de descrever e revelar, por exemplo, os conceitos e metodologias que são descritos nas publicações que podem ser usados em conexão com os métodos, as composições e os compostos descritos no presente documento. As publicações discutidas neste documento são fornecidas apenas para sua revelação anterior à data de deposito do presente pedido. Nada no presente documento deve ser interpretado como uma suposição de que os inventores descritos no presente documento não são autorizados a antedatar tal revelação em virtude da invenção antecedente ou por qualquer outra razão.

[040] No presente pedido, os nomes de aminoácido e nomes de átomo (por exemplo N, O, C, etc.) são usados conforme definido pelo Banco de Dados de Proteína (PDB) (www.pdb.org), que é baseado na nomenclatura IUPAC (IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (nomes de resíduo, nomes de átomo etc.), Eur. J. Biochem., 138, 9-37 (1984) juntamente com suas correções em Eur. J. Biochem., 152 1 (1985)) O termo “resíduo de aminoácido” é primariamente destinado a indicar um resíduo de aminoácido contido no grupo que consiste nos 20 aminoácidos de ocorrência natural, isto é, os resíduos alanina (Ala ou A), cisteína (Cys ou C), ácido aspártico (Asp ou D), ácido glutâmico (Glu ou E), fenilalanina (Phe ou F), glicina (Gly ou G), histidina (His ou H), isoleucina (Ile ou I), lisina (Lys ou K), leucina (Leu ou L), metionina (Met ou M), asparagina (Asn ou N), prolina (Pro ou P), glutamina (Gln ou Q), arginina (Arg ou R), serina (Ser ou S), treonina (Thr ou T), valina (Val ou V), triptofano (Trp ou W) e tirosina (Tyr ou Y).

[041] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são usados de forma intercambiável no presente documento para referência a um polímero de resíduos de aminoácidos. Isto é, uma descrição direcionada a um polipeptídeo aplica-se igualmente a uma descrição de um peptídeo e uma descrição de uma proteína a e vice-versa. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácido de ocorrência natural assim como a polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduos de aminoácido são um aminoácido codificado de ocorrência não natural. Conforme usado no presente documento, os termos abrangem cadeias de aminoácido de qualquer comprimento, incluindo proteínas de comprimento total, em que os resíduos de aminoácido são ligados por ligações de peptídeo covalentes.

[042] O termo “sequência de nucleotídeos” ou “sequência de ácidos nucleicos” destina-se a indicar uma extensão consecutiva de duas ou mais moléculas de nucleotídeo. A sequência de nucleotídeos pode ser de origem genômica, cDNA, RNA, semissintética ou sintética, ou qualquer combinação dos mesmos.

[043] “Célula”, “célula hospedeira”, “linhagem de células” e “cultura celular” são usados de forma intercambiável no presente documento e todos tais termos devem ser entendidos como incluindo a progênie resultante do crescimento ou cultivo de uma célula. “Transformação” e “transfecção” são usados de forma intercambiável para se referir ao processo de introduzir uma sequência de ácidos nucleicos numa célula.

[044] O termo “aminoácido” refere-se a aminoácidos de ocorrência natural e aminoácidos de ocorrência não natural, assim como análogos de aminoácido e miméticos de aminoácido que funcionam de uma maneira similar aos aminoácidos de ocorrência natural. Os aminoácidos naturalmente codificados são os 20 aminoácidos comuns (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina) e pirrolisina e selenocisteína. Análogos de aminoácido referem-se a compostos que têm a mesma estrutura química básica como um aminoácido de ocorrência natural, isto é, um carbono que está ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino e um grupo R, tal como, homosserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfônio. Tais análogos têm grupos R modificados (tal como, norleucina) ou cadeias principais peptídicas modificadas, mas mantêm a mesma estrutura química básica como um aminoácido de ocorrência natural. A referência a um aminoácido inclui, por exemplo, L-aminoácidos proteogênicos de ocorrência natural; D- aminoácidos, aminoácidos quimicamente modificados, tais como variantes e derivados de aminoácido; aminoácidos não proteogênicos de ocorrência natural, tais como alanina, ornitina, etc.; e compostos quimicamente sintetizados que têm as propriedades conhecidas na técnica para serem características de aminoácidos. Os exemplos de aminoácidos de ocorrência não natural incluem, porém sem limitação, aminoácidos de N-metila (por exemplo, metil alanina), D-aminoácidos, aminoácidos do tipo histidina (por exemplo, 2-amino-histidina, hidroxi-histidina, homo-histidina), aminoácidos que têm um metileno extra na cadeia lateral (aminoácidos “homo”) e aminoácidos em que um grupo funcional ácido carboxílico na cadeia lateral é substituído por um grupo ácido sulfônico (por exemplo, ácido cisteico). A incorporação de aminoácidos não naturais, incluindo aminoácidos não nativos sintéticos, aminoácidos substituídos ou um ou mais D-aminoácidos nas proteínas dos Fabs quiméricos estabilizados descritos no presente documento pode ser vantajosa de vários modos diferentes. Peptídeos contendo D-aminoácido etc. exibem estabilidade aumentada in vitro ou in vivo em comparação a contrapartes contendo L-aminoácido. Assim, a construção de peptídeos etc. incorporando D-aminoácidos pode ser particularmente útil quando estabilidade intracelular maior é desejada ou exigida. Mais especificamente, D-peptídeos etc. são resistentes a peptidases e proteases endógenas, fornecendo, assim, biodisponibilidade melhorada da molécula e vidas úteis prolongadas in vivo quando tais propriedades são desejáveis. Adicionalmente, D-peptídeos etc. não podem ser processados eficientemente para apresentação restrita a complexo de histocompatibilidade principal classe II a células T auxiliares e têm, portanto, menos probabilidade de induzir respostas imunológicas humorais no organismo inteiro.

[045] Os aminoácidos são referidos no presente documento por seus símbolos de três letras comumente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Os nucleotídeos, similarmente, podem ser referidos por seus códigos de letra única comumente aceitos.

[046] O termo “variantes conservativamente modificadas” aplica-se a sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos. Em relação a sequências de ácidos nucleicos particulares, “variantes conservativamente modificadas” referem-se àqueles ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas ou em que o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácidos a sequências essencialmente idênticas. Devido à degenerescência do código genético, um número grande de ácidos nucleicos funcionalmente idênticas codifica qualquer dada proteína. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU todos codificam o aminoácido alanina. Desse modo, em cada posição em que uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado a qualquer um dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácido nucleico são “variações silenciosas”, que são uma espécie de variações conservativamente modificadas. Cada sequência de ácidos nucleicos no presente documento que codifica um polipeptídeo também descreve cada variação silenciosa possível do ácido nucleico. Uma pessoa de habilidade comum na técnica reconhecerá que cada códon num ácido nucleico (exceto AUG, que é normalmente o único códon para metionina, e TGG, que é normalmente o único códon para triptofano) pode ser modificado para render uma molécula funcionalmente idêntica. Consequentemente, cada variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo está implícita em cada sequência descrita.

[047] Quanto a sequências de aminoácidos, uma pessoa de habilidade comum na técnica reconhecerá que substituições, deleções ou adições individuais a uma sequência de ácidos nucleicos, peptídeos, polipeptídeos ou proteínas que alteram, adicionam ou deletam um único aminoácido ou uma pequena porcentagem dos aminoácidos na sequência codificada é uma “variante conservativamente modificada” em que a alteração resulta na deleção de um aminoácido, adição de um aminoácido ou substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente similar. As tabelas de substituição conservativa que fornecem aminoácidos funcionalmente similares são conhecidas por aqueles de habilidade comum na técnica. Tais variantes conservativamente modificadas são adicionais e não excluem variantes polimórficos, homólogos entre espécies e alelos da invenção.

[048] As tabelas de substituição conservativa que fornecem aminoácidos funcionalmente similares são conhecidas por aqueles de habilidade comum na técnica. Os oito grupos a seguir contêm, cada um, aminoácidos que podem ser considerados substituição conservativa um para o outro

[049] 1. Alanina (A), Glicina (G);

[050] 2. Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E);

[051] 3. Asparagina (N), Glutamina (Q);

[052] 4. Arginina (R), Lisina (K);

[053] 5. Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);

[054] 6. Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).

[055] 7. Serina (S), Treonina (T), Cisteína (C);

[056] (consultar, por exemplo, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2ª edição (dezembro de 1993).

[057] Os termos “idêntico” ou “identidade” percentual, no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais. As sequências são “substancialmente idênticas” ou “substancialmente similares” se as mesmas tiverem uma porcentagem de resíduos de aminoácido ou nucleotídeos que e igual (isto é, pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ao longo de uma região especificada), quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação ou região designada conforme medido com o uso de um dos algoritmos de comparação de sequência a seguir (ou outros algoritmos disponíveis a pessoas de habilidade comum na técnica) ou por alinhamento manual e inspeção visual. Esta definição também se refere ao complemento de uma sequência de teste. A identidade pode existir ao longo de uma região que tem pelo menos cerca de 50 aminoácidos ou nucleotídeos de comprimento ou ao longo de uma região que tem 75 a 100 aminoácidos ou nucleotídeos de comprimento ou, quando não especificado, através da sequência inteira de um polinucleotídeo ou polipeptídeo. Um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo dos Fabs quiméricos estabilizados descritos no presente documento, incluindo homólogos de espécies diferentes da humana, pode ser obtido por um processo que compreende as etapas de triar uma biblioteca sob condições de hibridização estringentes com uma sonda identificada que tem uma sequência de polinucleotídeos dos Fabs quiméricos estabilizados descritos no presente documento ou um fragmento dos mesmos e isolar cDNA de comprimento total e clones genômicos contendo a dita sequência de polinucleotídeos. Tais técnicas de hibridização são bem conhecidas pelo versado na técnica.

[058] Os exemplos de um algoritmo que é adequado para determinar a porcentagem de identidade de sequência e similaridade de sequência são os algoritmos BLAST™ e BLAST™ 2.0, que são descritos em Altschul et al. (Nuc. Acids Res. 25:3389-402, 1977) e Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990), respectivamente. O software para realizar análises BLAST™ está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information (consultar a internet em www.ncbi.nlm.nih.gov). As pontuações cumulativas são calculadas com o uso, para sequências de nucleotídeos, dos parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos correspondentes; sempre >0) e N (pontuação de penalidade para resíduos incompatíveis; sempre <0). Para sequências de aminoácidos, uma matriz de pontuação é usada para calcular a pontuação cumulativa. A extensão das ocorrências de palavras em cada direção é interrompida quando: a pontuação de alinhamento cumulativa cai pela quantidade X de seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa vai para zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de pontuação negativa; ou o fim de cada sequência é alcançado. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. Os exemplos de parâmetros de algoritmo para o programa BLASTN (para sequências de nucleotídeo) são comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação entre ambas as fitas. Para as sequências de aminoácidos, os exemplos de parâmetros de algoritmo para o programa BLASTP são comprimento de palavra de 3, expectativa (E) de 10 e a matriz de pontuação BLOSUM62 (consultar Henikoff e Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989).

[059] Diz-se que um derivado, ou uma variante de um polipeptídeo, compartilha “homologia” ou é “homólogo” ao peptídeo se as sequências de aminoácidos do derivado ou variante tiver pelo menos 50% de identidade ao longo de uma sequência que tem 100 aminoácidos de comprimento do peptídeo original. Em certas modalidades, o derivado ou a variante é pelo menos 75% igual a esta do peptídeo ou de um fragmento do peptídeo que tem o mesmo número de resíduos de aminoácido que o derivado. Em certas modalidades, o derivado ou a variante é pelo menos 85% igual a esta do peptídeo ou de um fragmento do peptídeo que tem o mesmo número de resíduos de aminoácido que o derivado. Em certas modalidades, a sequência de aminoácidos do derivado é pelo menos 90% igual ao peptídeo ou um fragmento do peptídeo que tem o mesmo número de resíduos de aminoácido que o derivado. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do derivado é pelo menos 95% igual ao peptídeo ou um fragmento do peptídeo que tem o mesmo número de resíduos de aminoácido que o derivado. Em certas modalidades, o derivado ou a variante é pelo menos 99% igual a esta do peptídeo ou de um fragmento do peptídeo que tem o mesmo número de resíduos de aminoácido que o derivado.

[060] Conforme usado no presente documento, um polipeptídeo ou construto “isolado” significa um construto ou polipeptídeo que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente de cultura celular natural. Os componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que poderiam interferir tipicamente interfere nos usos diagnósticos e terapêuticos para o Fab quimérico estabilizado ou construtos de anticorpo que compreendem o Fab quimérico estabilizado e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteicos ou não proteicos.

[061] Em certas modalidades, conforme usado no presente documento, construtos de anticorpo “isolados” descrevem construtos de anticorpo, incluindo Fabs quiméricos estabilizados que foram identificados e separados e/ou recuperados de um componente de seu ambiente de cultura celular natural. Por exemplo, o Fab quimérico estabilizado descrito no presente documento compreende uma sequência de Fab de cadeia pesada e um construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa (um heterodímero) ou heterodímero “isolado” que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente de cultura celular natural. Os componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que poderiam interferir nos usos diagnósticos e terapêuticos para o heterodímero ou construtos de anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteicos ou não proteicos.

[062] Os Fabs quiméricos estabilizados e construtos de anticorpo que compreendem os mesmos podem ser purificados até homogeneidade substancial. Os sintagmas “substancialmente homogêneo”, “forma substancialmente homogênea” e “homogeneidade substancial” são usados para indicar que o produto corretamente pareado é substancialmente desprovido de subprodutos que se originam de combinações de polipeptídeo indesejadas (por exemplo, homodímeros ou heterodímeros mal pareados). Numa modalidade, um Fab quimérico estabilizado purificado é substancialmente desprovido de dímeros de cadeia leve. Numa modalidade, no contexto de um construto de anticorpo biespecífico, em que H1 (cadeia pesada 1), L1 (cadeia leve 1), H2 (cadeia pesada 2) e L2 (cadeia leve 2) são expressas, o produto corretamente pareado é um par de heterodímeros que compreende H1L1 e H2L2 corretamente pareadas (H1L1H2L2). Em algumas modalidades, no contexto de um construto de anticorpo biespecífico, em que H1, L1, H2 e L2 são expressos, o produto corretamente pareado pode compreender produtos adicionais que exibem pareamento correto em pelo menos uma região Fab, tais como, por exemplo, H1L1H2L1 ou H1L2H2L2, ou em que “meio anticorpos” são produzidos, H1L1 ou H2L2 (consultar a Figura 11). Expressa em termos de pureza, numa modalidade, homogeneidade substancial significa que a quantidade de subprodutos completamente mal pareados não excede 20%, por exemplo, está abaixo de 10%, abaixo de 5%, abaixo de 1% ou abaixo de 0,5% da intensidade de LC-MS total de todas as espécies presentes na mistura, em que as porcentagens refletem os resultados da análise por Espectrometria de Massa.

[063] Aos termos entendidos por aqueles na técnica da tecnologia de anticorpo são, cada um, dados o significado adquirido na técnica, a não ser que expressamente definido de modo diferente no presente documento. Sabe-se que os anticorpos têm regiões variáveis, uma região de dobradiça e domínios constantes. A estrutura e a função da imunoglobulina são revisadas, por exemplo, em Harlow et al, Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Capítulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988).

[064] Conforme usado no presente documento, os termos “anticorpo” e “imunoglobulina” ou “construto de anticorpo” são usados de forma intercambiável. Um “construto de anticorpo” refere-se a um polipeptídeo substancialmente codificado por um gene de imunoglobulina ou genes de imunoglobulina ou um ou mais fragmentos dos mesmos, que se ligam especificamente a um analito (epítopo ou antígeno). Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes de região constante kappa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e mu, assim como os inúmeros genes de região variável de imunoglobulina. As cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon, que, por sua vez, definem as classes de imunoglobulina IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Ademais, o anticorpo pode pertencer a um dente vários subtipos, por exemplo, a IgG pode pertencer às subclasses IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Os anticorpos que compreendem uma cadeia leve kappa são denominados no presente documento “anticorpos kappa”, ao mesmo tempo que os anticorpos que compreendem uma cadeia leve lambda são denominados no presente documento “anticorpos lambda”.

[065] Uma unidade estrutural de imunoglobulina (anticorpo) exemplificativa é composta de dois pares de cadeias de polipeptídeo, sendo que cada par tem uma cadeia “leve” (cerca de 25 kD) de imunoglobulina e uma “pesada” (cerca de 50 a 70 kD) de imunoglobulina. O tipo de unidade estrutural de imunoglobulina ou anticorpo é considerado como sendo “de ocorrência natural” e é também denominado no presente documento como um formato de “Mab”. O termo “cadeia leve” inclui uma cadeia leve de comprimento total e fragmentos da mesma que têm sequência de domínio variável suficiente para conferir especificidade de ligação. Uma cadeia leve de comprimento total inclui um domínio variável, VL, e um domínio constante, CL. O domínio variável da cadeia leve está na terminação amino do polipeptídeo. As cadeias leves incluem cadeias kappa e cadeias lambda. O termo “cadeia pesada” inclui uma cadeia pesada de comprimento total e fragmentos da mesma que têm sequência de região variável suficiente para conferir especificidade de ligação. Uma cadeia pesada de comprimento total inclui um domínio variável, VH, e três domínios constantes, CH1, CH2 e CH3. O domínio VH está na terminação amino do polipeptídeo, e os domínios CH estão na terminação carboxila, com o CH3 estando mais próximo da terminação carbóxi do polipeptídeo. As cadeias pesadas podem ser de qualquer classe, incluindo IgG (incluindo as subclasses IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgA (incluindo as subclasses IgA1 e IgA2), IgM, IgD e IgE. O termo “região variável” ou “domínio variável” refere-se a uma porção das cadeias leve e/ou pesada de um anticorpo geralmente responsável pelo reconhecimento de antígeno, tipicamente incluindo aproximadamente os 120 a 130 aminoácidos amino-terminais na cadeia pesada (VH) e cerca de 100 a 110 aminoácidos amino-terminais na cadeia leve (VL).

[066] Uma “região determinante de complementaridade” ou “CDR” é uma sequência de aminoácidos que contribui para a especificidade e afinidade de ligação a antígeno. As regiões de “framework” (FR) pode auxiliar na manutenção da conformação apropriada das CDRs para promover a ligação entre a região de ligação a antígeno e um antígeno. Estruturalmente, as regiões de framework podem estar localizadas em anticorpos entre as CDRs. As regiões variáveis exibem tipicamente a mesma estrutura geral de regiões de framework (FR) relativamente conservadas unidas por três regiões hipervariáveis, CDRs. As CDRs das duas cadeias de cada par são tipicamente alinhadas pelas regiões de framework, que podem permitir a ligação a um epítopo específico. Do N-terminal ao C-terminal, ambas as regiões variáveis de cadeia leve e pesada compreendem tipicamente os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A atribuição de aminoácidos a cada domínio está, tipicamente, em conformidade com as definições de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 e 1991)), a não ser que determinado de outro modo.

[067] Um “construto de anticorpo multiespecífico” ou “anticorpo multiespecífico” é um que tem como alvo ou se liga a mais do que um antígeno ou epítopo distinto. Um construto de anticorpo ou anticorpo “bispecífico”, “de especificidade dupla” ou “bifuncional” é uma espécie de construto de anticorpo multiespecífico que tem como alvo ou se liga a dois antígenos ou epítopos diferentes. Em geral, um construto de anticorpo biespecífico pode ter dois domínios de ligação a antígeno diferentes. Os dois domínios de ligação a antígeno de um construto de anticorpo ou anticorpo biespecífico irá se ligar a dois epítopos diferentes, que podem residir em alvos moleculares iguais ou diferentes. Numa modalidade, o construto de anticorpo biespecífico está num formato de ocorrência natural. Em outras palavras, o construto de anticorpo biespecífico tem o mesmo formato que um anticorpo IgG, IgA, IgM, IgD ou IgE de ocorrência natural.

[068] O par de cadeias pesadas de anticorpo com cadeias leves de anticorpo e encontram ou fazem contato uma com a outra numa ou mais “interfaces”. Uma “interface” inclui um ou mais resíduos de aminoácido de “contato” num primeiro polipeptídeo que interagem com um ou mais resíduos de aminoácido de “contato” de um segundo polipeptídeo ou com um ou mais resíduos de contato de polipeptídeos adicionais, em que o primeiro polipeptídeo, o segundo polipeptídeo ou polipeptídeos adicionais encontram ou fazem contato um com o outro. Por exemplo, uma interface existe entre os domínios VH e CH1 de uma cadeia pesada, entre os domínios VL e CL de uma cadeia leve, entre dois domínios CH3 de uma região Fc dimerizada, entre o domínio CH1 da cadeia pesada e o domínio CL da cadeia leve e entre o domínio VH da cadeia pesada e o domínio VL da cadeia leve. A “interface” pode ser derivada de um anticorpo IgG e, por exemplo, de um anticorpo IgG1 humano. Alternativamente, uma interface inclui um ou mais resíduos de aminoácido de contato de uma porção de um polipeptídeo que interagem com um ou mais resíduos de contato de uma porção diferente do mesmo polipeptídeo. Por exemplo, uma interface existe entre o domínio variável e o domínio constante de uma cadeia leve.

[069] Por “resíduos de aminoácido de contato”, entende-se resíduos de aminoácido que compreendem minimamente dois resíduos que exibem pelo menos um tipo de ligação não covalente (por exemplo, van der waals, ligação ao hidrogênio etc.) um ao outro.

[070] Um Fab (também denominado fragmento de ligação a antígeno) contém o domínio constante (CL) da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada juntamente com os domínios variáveis VL e VH nas cadeias leve e pesada, respectivamente. Uma sequência de Fab de cadeia pesada é uma cadeia pesada truncada que compreende os domínios VH e CH1. Os domínios variáveis compreendem as alças determinantes de complementariedade (CDR, também denominados região hipervariável) que estão envolvidas na ligação a antígeno. Os fragmentos Fab’ diferem-se de fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carbóxi do domínio de CH1 de cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça de anticorpo. O termo “formato de Fab” destina-se a incluir os construtos de anticorpo, tais como os fragmentos Fabs e Fab’. As porções de cadeia leve dos construtos no formato de Fab podem incluir, porém sem limitação, cadeias leves kappa, cadeias leves lambda ou cadeias leves quiméricas ou combinações das mesmas. As porções de cadeia pesada dos construtos no formato de Fab podem incluir, porém sem limitação, cadeias pesadas derivadas das classes IgG, IgM, IgA, IgE ou IgD.

[071] Um “Fv de cadeia única” ou “scFv” inclui os domínios VH e VL de um anticorpo, em que estes domínios estão presentes numa cadeia única de polipeptídeos. Numa modalidade, o polipeptídeo de scFv compreende, ainda, um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que possibilita que o scFv forme a estrutura desejada para ligação de antígeno. Para uma análise de scFvs, consultar Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, volume 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova York, páginas 269-315 (1994). Os fragmentos scFv de anticorpo HER2 são descritos no documento no WO93/16185; na Patente no U.S. 5.571.894; e na Patente no U.S. 5.587.458.

[072] Um anticorpo no “formato Mab” refere-se a um anticorpo que tem uma estrutura similar a um anticorpo de ocorrência natural. Em outras palavras, os anticorpos no formato Mab podem ter duas cadeias pesadas de comprimento total e duas cadeias leves de comprimento total. As cadeias leves podem incluir, porém sem limitação, cadeias leves kappa, cadeias leves lambda ou cadeias leves quiméricas ou combinações das mesmas. As porções de cadeia pesada dos construtos no formato de Mab podem incluir, porém sem limitação, cadeias pesadas derivadas das classes IgG, IgM, IgA, IgE ou IgD. Os anticorpos no formato de Mab são bivalentes e podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.

[073] O termo “modificações de aminoácido” conforme usado no presente documento inclui, porém sem limitação, inserções de aminoácido, deleções, substituições, modificações químicas, modificações físicas e reorganizações.

[074] Os resíduos de aminoácido para as cadeias pesada e leve de imunoglobulina podem ser numerados de acordo com diversas convenções incluindo Kabat (conforme descrito em Kabat e Wu, 1991; Kabat et al, Sequences of proteins of immunological interest. 5ª Edição - US Department of Health and Human Services, NIH publicação no91-3242, página 647 (1991)), IMGT (conforme apresentado em Lefranc, M.-P., et al. IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system® Nucl. Acids Res, 37, D1006-D1012 (2009), e Lefranc, M.-P., IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System, Cold Spring Harb Protoc. 1 de junho de 2011; 2011(6)), 1JPT (conforme descrito em Katja Faelber, Daniel Kirchhofer, Leonard Presta, Robert F Kelley, Yves A Muller, The 1.85 Å resolution crystal structures of tissue factor in complex with humanized Fab d3h44 and of free humanized Fab d3h44: revisiting the solvation of antigen combining sites1, Journal of Molecular Biology, Volume 313, Versão 1, Páginas 83-97,) e EU (de acordo com o índice EU como em Kabat referindo-se à numeração do anticorpo EU (Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85)). A numeração de Kabat é usada no presente documento para os domínios VH, CH1, CL e VL a não ser que indicado de outro modo. A numeração EU é usada no presente documento para os domínios CH3 e CH2, e a região de dobradiça a não ser que indicado de outro modo. O sistema de numeração AHo (descrito em Honegger, A. e Plückthun, A., Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: An automatic modeling and analysis tool, J. Mol. Biol, 309(2001) 657-670) e o sistema de numeração Chothia (Al-Lazikani B, Lesk AM, Chothia C, Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins J. Mol. Biol, 273(1997) 927-948) podem também ser usados para identificar resíduos de aminoácido nos domínios variáveis das cadeias pesada e leve de imunoglobulina.

[075] A identificação de substituições de aminoácidos em posições ou resíduos de aminoácido específicos pode ser denotada e abreviada em muitos formatos, conforme é conhecido na técnica. Por exemplo, o uso de sublinhado “_” ou barra “/” pode ser usado para separar as substituições de aminoácidos individuais de uma combinação de substituições de aminoácidos. Como um exemplo ilustrativo, a combinação de substituições de aminoácidos 83V, 85T e 105E pode também ser representada como 83V_85T_105E ou como 83V/85T/105E. Estes três tipos de formatos são usados de forma intercambiável nesta divulgação.

FAB QUIMÉRICOS E FABS QUIMÉRICOS ESTABILIZADOS

[076] São fornecidos no presente documento Fabs quiméricos estabilizados que compreendem um construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa modificado e uma cadeia pesada que compreende um domínio VH e CH1. O construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa modificado compreende uma sequência de Vlambda que compreende uma ou uma ou mais modificações de aminoácido estabilizantes que aumentam a estabilidade térmica do Fab quimérico. O termo “Fab quimérico” ou “heterodímero quimérico” conforme usado no presente documento refere-se a um Fab que tem uma cadeia pesada que compreende uma sequência de domínio CH1 e uma sequência de domínio VH e um construto de polipeptídeo de cadeia leve de imunoglobulina quimérico (cadeia leve quimérica Vlambda-Ckappa), em que a sequência de cadeia pesada e o construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa formam uma região Fab que se liga a um epítopo. Uma “sequência de Fab de cadeia pesada” se refere ao fragmento de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo a sequência de domínio CH1 e o domínio VH sequência. Um Fab quimérico é tipicamente o ponto de partida para modificar Fabs quiméricos estabilizados. Assim, Fabs quiméricos estabilizados são baseados em Fabs quiméricos originais que foram geneticamente modificados para incluir uma ou mais modificações de aminoácido estabilizantes que aumentam a estabilidade térmica do Fab quimérico.

[077] Numa modalidade, o Fab quimérico original pode compreender sequências derivadas de um anticorpo original que tem uma cadeia leve lambda (um anticorpo lambda original). Nestas modalidades, o Fab quimérico original compreende uma sequência de Fab de cadeia pesada de um anticorpo lambda original assim como um construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa que tem uma sequência de Vlambda do anticorpo lambda original e uma sequência de Ckappa de uma cadeia leve kappa. Um Fab quimérico original é também denominado heterodímero quimérico do tipo selvagem sem a uma ou mais modificações de aminoácido estabilizantes.

ANTICORPOS LAMBDA ORIGINAL

[078] Vários anticorpos lambda são conhecidos na técnica e são adequados como anticorpos lambda originais, contanto que os mesmos compreendem uma estrutura de cadeia leve lambda de ocorrência natural. “Estrutura de cadeia leve de ocorrência natural” conforme usado no presente documento significa que uma estrutura de cadeia leve que tem e domínios VL e CL lambda. Numa modalidade, o anticorpo lambda original é um anticorpo de ocorrência natural. Em outra modalidade, o anticorpo lambda original é um anticorpo lambda geneticamente modificado. Um anticorpo geneticamente modificado é um que compreende uma ou mais modificações que alteram a sequência de polipeptídeos ou propriedades funcionais do anticorpo. As propriedades funcionais que podem ser alteradas incluem, porém sem limitação, ligação a antígeno, função efetora, estabilidade térmica, pareamento de cadeia pesada e/ou pareamento de cadeia leve no contexto de anticorpos biespecíficos. O anticorpo lambda original pode ser também modificado para melhorar seu perfil farmacocinético/farmacodinâmico e diminuir a imunogenicidade. Estas propriedades funcionais podem ser alteradas por uma ou mais modificações de aminoácido na sequência de polipeptídeos do anticorpo original. Tais métodos para alterar estas propriedades funcionais são conhecidos na técnica, alguns dos quais são descritos em outra parte no presente documento.

[079] Numa modalidade, o anticorpo lambda original é um anticorpo de camundongo, humano ou humanizado. Formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, roedores) são anticorpos que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Para a maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo de receptor) nas quais resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo de doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo a especificidade, afinidade e a capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos de região de arcabouço (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Ademais, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para refinar o desempenho de anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado pode compreender substancialmente todo de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, consultar Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Assim, em algumas modalidades, o anticorpo quimérico original compreende sequências de Fab de cadeia leve de camundongo, humano ou humanizado, ou sequências de Vlambda.

[080] Em algumas modalidades, o Fab quimérico original compreende um construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa que tem uma sequência de Vlambda de um anticorpo lambda humano ou humanizado, e uma sequência de Ckappa. A sequência de um construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa exemplificativa é fornecida na Figura 2 e alinhada contra a sequência da cadeia leve lambda do anticorpo original.

[081] A interface entre o domínio VL e domínio CL de camundongo da cadeia leve lambda de camundongo é muito similar à interface entre o domínio VL e domínio CL humanos da cadeia leve lambda humana, e a interface entre o domínio VL e domínio CL de camundongo da cadeia leve kappa de camundongo é muito similar à interface entre o domínio VL e domínio CL humanos da cadeia leve kappa humana. Assim, é contemplado que as modificações de aminoácido estabilizantes descritas no presente documento podem também ser aplicadas a um Fab quimérico original que compreende um construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa que tem uma sequência de Vlambda de um anticorpo lambda original de camundongo e uma sequência de Ckappa de um anticorpo kappa humano. Assim, numa modalidade, o Fab quimérico estabilizado compreende um Fab quimérico que compreende um construto de cadeia leve quimérico Vlambda- Ckappa que tem uma sequência de Vlambda de um anticorpo lambda de camundongo e uma sequência de Ckappa de um anticorpo kappa humano.

[082] Os domínios CL e VL dos anticorpos lambda compreendem cadeias leves que pertencem a diferentes linhagens germinativas. Numa modalidade, o domínio VL do anticorpo lambda original é selecionado a partir dos subgrupos de linhagem germinativa humana IGLV1, IGLV2, IGLV3, IGLV4, IGLV5, IGLV6, IGLV7, IGLV8, IGLV9, IGLV10 ou IGLV11. Numa modalidade, o domínio VL do anticorpo lambda original é selecionado a partir dos subgrupos de linhagem germinativa humana IGLV1, IGLV2 ou IGLV6.

[083] Os anticorpos lambda podem também compreender domínios de cadeia pesada que pertencem a diferentes linhagens germinativas. Numa modalidade, o anticorpo lambda original compreende uma cadeia pesada com um domínio VH selecionado a partir dos subgrupos de linhagem germinativa de domínio VH humana IGHV1, IGHV2, IGHV3, IGHV4, IGHV5, IGHV6 ou IGHV7. Numa modalidade, o anticorpo lambda original compreende uma cadeia pesada com um domínio VH dos subgrupos de linhagem germinativa de domínio VH humana IGHV1, IGHV3 ou IGHV4. Numa modalidade, o anticorpo lambda original compreende uma cadeia pesada com um domínio VH dos subgrupos de linhagem germinativa de domínio VH humana IGHV3 ou IGHV4. Em outra modalidade, o anticorpo lambda original tem uma cadeia pesada com um segmento J selecionado dentre os genes de linhagem germinativa de segmento J humanos IGHJ1, IGHJ2, IGHJ3, IGHJ4, IGHJ5 ou IGHJ6. Numa modalidade, o anticorpo lambda original tem uma cadeia pesada com um domínio CH1 selecionado dentre os subgrupos de linhagem germinativa de domínio CH1 humana IGHG1, IGHG2, IGHG3 ou IGHG4. Numa modalidade, o anticorpo lambda original tem uma cadeia pesada com um domínio CH1 humano do subgrupo de linhagem germinativa IGHG1.

[084] Numa modalidade, o anticorpo lambda original é um anticorpo terapêutico. Os exemplos não limitantes de anticorpos terapêuticos adequados que compreendem uma cadeia leve lambda e os antígenos aos quais os mesmos são ligados são identificados na Tabela A abaixo: TABELA A: ANTICORPOS TERAPÊUTICOS EXEMPLIFICATIVOS QUE

COMPREENDEM UMA CADEIA LEVE LAMBDA Anticorpo Antígenos Avelumab Ligante 1 de Morte Celular Programada 1 belimumab fator de ativação de célula B bimagrumab Receptor de ativina MB briakinumab Interleucina 12 brontictuzumab Notch1 cixutumumab Receptor de Fator de Crescimento Semelhante à Insulina 1 drozitumab Receptor de Morte de Citocina 5 evolocumab Convertase Subtilisina/Quexina de pró-proteína Tipo 9 exbivirumab Antígeno superficial de vírus da hepatite B fezakinumab Interleucina 22 galiximab CD80 guselkumab Interleucina 23 p19 lexatumumab Receptor de Morte de Citocina 5 mapatumumab Receptor 1 de TRAIL subunidade alfa do receptor de fator estimulador de colônia de mavrilimumab granulócitos e macrófagos narnatumab Receptor de Ron orticumab LDL oxidado otelixizumab Correceptor de célula T CD3 rafivirumab Glicoproteína do vírus da raiva raxibacumab Antígeno Protetor contra Antrax seribantumab Proteína tirosina quinase receptora erbB-3 tesidolumab Componente complementar 5

Anticorpo Antígenos tezepelumab Linfopoietina Estromal Tímica tralokinumab Interleucina 13 vantictumab Receptor frisado

[085] Numa modalidade, o Fab quimérico original compreende uma sequência de Fab de cadeia pesada e uma sequência de Vlambda de um dos anticorpos listados na Tabela A.

[086] As sequências de aminoácidos dos anticorpos listadas na Tabela A, e outros anticorpos originais adequados, terapêuticos ou de outro modo, podem ser facilmente obtidas a partir de publicações que descrevem estes anticorpos, e/ou bancos de dados, tais como TABS, PDB, GenBankTM, todos os quais são acessíveis na internet.

[087] Os exemplos de outros anticorpos lambda originais adequados são o anticorpo CAT-2200, o anticorpo H3 e o anticorpo EP6b_B01. As sequências destes anticorpos são conhecidas na técnica e fornecidas na Tabela 2. Por exemplo, a sequência de aminoácidos do anticorpo CAT-2200 (que se liga à IL-17) pode ser encontrada no PDB entrada 2VXS 9, as sequências de aminoácidos do H3 (que se liga a HER3) podem ser encontradas na Patente no U.S. 8.329.873; e as sequências de aminoácidos de EP6b_B01 (que se liga a Fas) podem ser encontradas no PDB entrada 3THM. scFvs

[088] Conforme indicado acima, em algumas modalidades, os Fabs quiméricos originais podem ser derivados de scFvs. Os Fabs quiméricos originais derivados de scFvs podem ser frequentemente gerados como um resultado da triagem de biblioteca de apresentação em fago de scFv para identificar aglutinantes de interesse. Os métodos para converter scFvs em Fabs são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Steinwand et al. (2014) em Mabs 6:204, e Zuberbuhler et al. (2009) em Protein Engineering, Design & Selection 22: 169-174. Numa modalidade, o Fab quimérico original pode ser construído diretamente das sequências de um scFv. Em outra modalidade, o Fab quimérico original pode ser derivado de um Fab que foi convertido a partir de um scFv.

[089] Muitos scFvs adequados são conhecidos na técnica, conforme descrito em Smirnov et al. (2011) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108: 15954 (que descreve reactibodies), ou em Niemi et al. (2010) J.Mol.Recognit. 24: 209-219; Schneider et al. (2012) J.Mol.Biol. 415: 699-715; e Fenn (2013) Plos One 8: e61953-e61953, que descreve anticorpos originalmente identificados como scFvs. Numa modalidade, um Fab quimérico original pode ser preparado a partir de um scFv terapêutico, por exemplo, a partir de blinatumomab, efungumab, pexelizumab, solitomab e outros. Os Fab quiméricos originais podem ser construtos baseados nas sequências de VL e VH do scFv e fundidos aos domínios CH1 e Ckappa de um anticorpo kappa. Nessas modalidades, o Fab quimérico original compreende um construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa que tem uma sequência de Vlambda de um scFv e uma sequência de Ckappa de uma cadeia leve kappa, ao mesmo tempo que a cadeia pesada Fab sequência compreende um domínio VH do scFv e um domínio CH1. As sequências de domínio CH1 adequadas podem ser selecionadas dentre os domínios CH1 humanos das classes IgG, IgD, IgE, IgM ou IgA. Numa modalidade, as sequências de domínio CH1 são selecionadas dentre os subgrupos de linhagem germinativa de domínio CH1 IGHG1, IGHG2, IGHG3 ou IGHG4. As sequências de Ckappa adequadas são descritos a seguir.

SEQUÊNCIAS DE CKAPPA

[090] A sequência de polipeptídeos do construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa pode ser gerada fundindo-se a sequência de domínio VL (Vlambda) da cadeia leve lambda do anticorpo original à sequência de um domínio constante Ckappa adequado. As sequências de domínio constante Ckappa adequadas são aquelas selecionadas dentre os alelos de linhagem germinativa CL IGKC*01, IGKC*02, IGKC*03, IGKC*04 ou IGKC*05. Numa modalidade, a sequência de domínio constante Ckappa é do subgrupo de linhagem germinativa IGKC*01. As sequências de aminoácido desses domínios constantes Ckappa estão prontamente disponíveis a partir do banco de dados IMGT notado acima.

[091] Em algumas modalidades, o Fab quimérico original pode ser um Fab quimérico conhecido ou descrito na técnica. Por exemplo, o Fab quimérico original pode ser o Fab quimérico descrito em Ponomarenko et al. (2014) em Act

Crystallographica D70: 708-719.

[092] Em algumas modalidades, o Fab quimérico original tem uma estabilidade térmica que é igual a esta do Fab do anticorpo lambda original. Em algumas modalidades, o Fab quimérico original tem uma estabilidade térmica que é pelo menos 10 °C menor do que esta do Fab do anticorpo lambda original. Em algumas modalidades, o Fab quimérico original tem uma estabilidade térmica que é pelo menos 5 °C menor do que esta do Fab do anticorpo lambda original.

MODIFICAÇÕES DE AMINOÁCIDO ESTABILIZANTES

[093] O termo “Fab quimérico estabilizado” conforme usado no presente documento refere-se a um Fab quimérico ou heterodímero quimérico em que a sequência de Vlambda do construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa compreende uma ou mais modificações de aminoácido estabilizantes que aumentam a estabilidade térmica do Fab quimérico original. Assim, numa modalidade, um Fab quimérico estabilizado compreende um construto de polipeptídeo de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende uma sequência de domínio constante de cadeia pesada 1 (CH1) e uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (VH) (sequência de Fab de cadeia pesada) e um construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa que compreende uma ou mais modificações de aminoácido estabilizantes na sequência de Vlambda que aumentam a estabilidade térmica do Fab quimérico original, em que a sequência de Fab de cadeia pesada e o construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa formam uma região Fab que se liga a um epítopo. Os Fabs quiméricos estabilizados são geneticamente modificados de Fabs quiméricos originais e são essencialmente Fabs quiméricos originais que compreendem uma ou mais modificações de aminoácido estabilizantes descritas no presente documento.

[094] O termo “estabilidade térmica” é uma propriedade frequentemente avaliada para anticorpos medindo-se a Tm ou temperatura de fusão de uma região Fab, ou isolada ou num construto de anticorpo. A estabilidade térmica de Fabs pode ser medida com o uso de vários métodos conhecidos conforme descrito em outra parte do presente documento.

[095] As modificações de aminoácido estabilizantes descritas aqui foram identificadas examinando-se as estruturas de cadeias leves de ocorrência natural no formato de Fab (isto é, pareadas com um fragmento de cadeia pesada que tem os domínios VH e CH1) e comparando estas estruturas àquelas de Fabs quiméricos Vlambda-Ckappa. A comparação destas estruturas levou à identificação dos resíduos de aminoácido no domínio lambda variável que pode ser modificado para imitar a interface observada entre os domínios Vkappa-Ckappa resultando na compatibilidade melhorada da interface de Vlambda-Ckappa nos Fabs quiméricos estabilizados.

[096] Numa modalidade, o Fab quimérico estabilizado compreende modificações de aminoácido estabilizantes na sequência de Vlambda nos resíduos de aminoácido na interface entre os domínios Vlambda e Ckappa do construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa. As posições nas quais as modificações de aminoácido estabilizantes ocorrem são identificadas de acordo com o sistema de numeração de Kabat, a não ser que indicado de outro modo.

[097] Numa modalidade, o Fab quimérico estabilizado compreende uma ou mais modificações de aminoácido estabilizantes na sequência de Vlambda do construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa. Numa modalidade, o Fab quimérico estabilizado compreende duas ou mais modificações de aminoácido estabilizantes na sequência de Vlambda do construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa. Numa modalidade, o Fab quimérico estabilizado compreende três ou mais modificações de aminoácido estabilizantes na sequência de Vlambda do construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa. Numa modalidade, o Fab quimérico estabilizado compreende quatro ou mais modificações de aminoácido estabilizantes na sequência de Vlambda do construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa.

[098] As modificações de aminoácido estabilizantes podem estar na interface entre os domínios Vlambda e Ckappa da cadeia leve de Fab quimérico Vlambda-Ckappa. Numa modalidade, as modificações de aminoácido estabilizantes podem estar num resíduo de aminoácido que não é considerado como estando na interface dos domínios Vlambda e Ckappa do construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa.

[099] Em algumas modalidades, o Fab quimérico estabilizado compreende uma ou mais modificações de aminoácido estabilizantes na interface entre os domínios Vlambda e Ckappa do construto de cadeia leve quimérico Vlambda- Ckappa. Os exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido são encontrados nas posições 80, 83, 105 e 106 da sequência de Vlambda. Numa modalidade, o Fab quimérico estabilizado compreende uma modificação de aminoácido estabilizante na sequência de Vlambda no resíduo 83. Numa modalidade, o Fab quimérico estabilizado compreende uma modificação de aminoácido estabilizante na sequência de Vlambda no resíduo 105. Numa modalidade, o Fab quimérico estabilizado compreende uma modificação de aminoácido estabilizante na sequência de Vlambda no resíduo 106. Numa modalidade, o Fab quimérico estabilizado compreende uma modificação de aminoácido estabilizante na sequência de Vlambda no resíduo 80.

[0100] O quimérico estabilizado Fab pode compreender uma modificação de aminoácido estabilizante na sequência de Vlambda num resíduo de aminoácido que não está na interface. Numa modalidade, o Fab quimérico estabilizado compreende uma modificação de aminoácido estabilizante no resíduo 85 na sequência de Vlambda.

[0101] Em algumas modalidades, o Fab quimérico estabilizado pode incluir uma combinação de modificações de aminoácido estabilizantes na sequência de Vlambda em dois resíduos de aminoácido. Em algumas modalidades, o Fab quimérico estabilizado pode incluir uma combinação de modificações de aminoácido estabilizantes nos resíduos 83 e 85; 83 e 106; 105 e 106; 105 e 106A; 83 e 105; 85 e 105; ou 85 e 106. Numa modalidade, o Fab quimérico estabilizado pode compreender uma combinação de modificações de aminoácido estabilizantes nos resíduos 83 e 85; nos resíduos 83 e 106; nos resíduos 105 e 106A; ou nos resíduos 83 e 105.

[0102] Em outras modalidades, os Fabs quiméricos estabilizados podem incluir uma combinação de modificações de aminoácido estabilizantes na sequência de Vlambda em três resíduos de aminoácido. Em certas modalidades, o Fab quimérico estabilizado pode incluir uma combinação de modificações de aminoácido estabilizantes nos resíduos 83, 85 e 105; nos resíduos 83, 105 e 106A; nos resíduos 83, 85 e 106; nos resíduos 83, 105 e 106; ou nos resíduos 85, 105 e

106. Em algumas modalidades, o Fab quimérico estabilizado pode incluir uma combinação de modificações de aminoácido estabilizantes nos resíduos 83, 85 e 105 ou nos resíduos 83, 105 e 106A.

[0103] Em outras modalidades, os Fabs quiméricos estabilizados podem incluir uma combinação de modificações de aminoácido estabilizantes na sequência de Vlambda em quatro ou mais resíduos de aminoácido. Assim, em algumas modalidades, o Fab quimérico estabilizado pode incluir uma combinação de modificações de aminoácido estabilizantes nos resíduos 83, 85, 105 e 106; nos resíduos 80, 83, 105 e 106A; nos resíduos 80, 83, 85 e 105; nos resíduos 80, 83, 85 e 105; nos resíduos 80, 85, 105 e 106; nos resíduos 80, 83, 105 e 106; ou nos resíduos 83, 105, 106 e 106A.

[0104] Em ainda outras modalidades, os Fabs quiméricos estabilizados podem incluir uma combinação de modificações de aminoácido estabilizantes na sequência de Vlambda nos resíduos 80, 83, 85, 105, e 106A; nos resíduos 80, 83, 105, 106 e 106A; nos resíduos 83, 85, 105, 106 e 106A; nos resíduos 80, 83, 85, 105, 106; ou nos resíduos 80, 83, 85, 105, 106 e 106A.

[0105] Conforme indicado acima, as posições de aminoácido nas quais as modificações de aminoácido estabilizantes ocorrem são descritas no presente documento de acordo com o sistema de numeração de Kabat. Entretanto, estas posições de aminoácido podem também ser identificadas de acordo com sistemas de numeração alternativos. Por exemplo, a tabela a seguir identifica as posições de aminoácido específicas selecionadas no domínio Vlambda de acordo com os sistemas de numeração de Kabat, IMGT, AHo e EU. TABELA A1: AMINOÁCIDOS DE DOMÍNIO VLAMBDA SELECIONADOS NUMERADOS DE ACORDO COM OS SISTEMAS DE NUMERAÇÃO DE KABAT, IMGT, AHO E CHOTHIA Sistema de numeração Kabat IMGT AHo Chothia 80 96 98 80 83 99 101 83 85 101 103 85 105 125 146 105 106 126 147 106

106A 127 148 106A

SUBSTITUIÇÕES DE AMINOÁCIDO

[0106] Os resíduos de aminoácido podem ser agrupados de acordo com as propriedades de suas cadeias laterais, tais como hidrofobicidade, polaridade, volume de cadeia lateral e/ou tamanho. Os exemplos de resíduos de aminoácido hidrofóbicos incluem leucina, isoleucina, valina, metionina, prolina, alanina, fenilalanina, cisteína e triptofano. Os exemplos de resíduos de aminoácido não carregados polares incluem glutamina, asparagina, serina, treonina, histidina e tirosina. Os exemplos de resíduos de aminoácido negativamente carregados incluem ácido glutâmico e ácido aspártico. Os exemplos de resíduos de aminoácido positivamente carregados incluem lisina e arginina. Os volumes de cadeia lateral de resíduos de aminoácido foram medidos e são conhecidos na técnica conforme mostrado na Tabela 1 da Patente U.S. No 5.821.333, reproduzida na Tabela B abaixo: TABELA B: PROPRIEDADES DOS RESÍDUOS DE AMINOÁCIDO Propriedades dos Resíduos de Aminoácido Área Superficial Abreviação de MASSAa VOLUMEb Acessível Aminoácido uma Letra (daltons) (Angstrom3) c(Angstrom2) Alanina (Ala) A 71,08 88,6 115 Arginina (Arg) R 156,20 173,4 225 Asparagina (Asn) N 114,11 117,7 160 Ácido Aspártico D 115,09 11,1 150 (Asp) Cisteína (Cys) C 103,14 108,5 135 Glutamina (Gln) Q 128,14 143,9 180 Ácido Glutâmico E 129,12 138,4 190 (Glu) Glicina (Gly) G 57,06 60,1 75 Histidina (His) H 137,15 153,2 195 Isoleucina (Ile) I 113,17 166,7 175 Leucina (Leu) L 113,17 166,7 170 Lisina (Lys) K 128,18 168,6 200

Metionina (Met) M 131,21 162,9 185 Fenilalanina (Phe) F 147,18 189,9 210 Prolina (Pro) P 97,12 122,7 145 Serina (Ser) S 87,08 89,0 115 Treonina (Thr) T 101,11 116,1 140 Triptofano (Trp) W 186,21 227,8 255 Tirosina (Tyr) Y 163,18 193,6 230 Valina (Val) V 99,14 140,0 155 a Peso molecular do aminoácido menos este da água. Valores de Handbook of Chemistry and Physics, 43ª edição, Cleveland, Chemical Rubber Publishing Co.,

1961. b Valores de A. A. Zamyatnin, Prog. Biophys. Mol. Biol. 24:107-123, 1972. c Valores de C. Chothia, J. Mol. Biol. 105:1-14, 1975. A área superficial acessível é definida nas Figuras 6 a 20 desta referência.

[0107] Os Fabs quiméricos estabilizados podem compreender modificações de aminoácido estabilizantes em cada resíduo conforme descrito abaixo. Numa modalidade, o aminoácido na posição 83 do Fab quimérico estabilizado compreende substituição por um aminoácido hidrofóbico. Em algumas modalidades, o aminoácido na posição 83 do Fab quimérico estabilizado compreende substituição por um aminoácido hidrofóbico selecionado dentre F, L, I, V ou A. Em algumas modalidades, o aminoácido na posição 83 do Fab quimérico estabilizado compreende substituição por um aminoácido hidrofóbico selecionado dentre F, I, V, ou A. Numa modalidade, o aminoácido na posição 83 do Fab quimérico estabilizado compreende substituição por um aminoácido não carregado polar. Com base na avaliação estrutural do ambiente circundante imediato para a posição 83, substituições de aminoácidos adicionais nesta posição são contempladas que poderiam ser compatíveis nesta posição e forneceriam contatos através da interface de domínio constante e variável relativamente não rígida na cadeia leve quimérica e, assim, melhorariam a termoestabilidade. Esses aminoácidos adicionais incluem aminoácidos não carregados polares de tamanho e geometria adequados, tais como S, N, H, Q ou T. Assim, em algumas modalidades, o aminoácido na posição 83 do Fab quimérico estabilizado compreende substituição por um aminoácido não carregado polar selecionado dentre S, T, H, N ou Q. Em outras modalidades, o Fab quimérico estabilizado compreende a substituição de aminoácido não carregado polar 83S, 83N, 83H ou 83Q. Numa modalidade, o Fab quimérico estabilizado compreende a substituição de aminoácido 83A, 83F, 83I, 83V, 83L ou 83T.

[0108] Numa modalidade, o aminoácido na posição 85 do Fab quimérico estabilizado compreende substituição por um aminoácido hidrofóbico. Numa modalidade, o aminoácido na posição 85 do Fab quimérico estabilizado compreende substituição por um aminoácido hidrofóbico selecionado dentre 85V ou 85A. Numa modalidade, o aminoácido na posição 85 do Fab quimérico estabilizado compreende substituição por um aminoácido hidrofóbico selecionado dentre 85V. A avaliação estrutural da adequação das substituições de aminoácidos adicionais, no contexto do ambiente circundante imediato da posição 85 indicou que os aminoácidos não carregados polares de tamanho e geometria adequados, tais como T, S, H, N, Q e Y, poderiam contribuir indiretamente para a compatibilidade geral da interface entre os domínios variável e constante na cadeia leve quimérica e, assim, espera-se que contribuam para a melhora na termoestabilidade. Assim, numa modalidade, o aminoácido na posição 85 do Fab quimérico estabilizado pode ser substituído por um aminoácido não carregado polar. Numa modalidade, o Fab quimérico estabilizado compreende a substituição de aminoácido 85T, 85S, 85H, 85N, 85Q ou 85Y. Em outras modalidades, o Fab quimérico estabilizado compreende substituição por um aminoácido não carregado polar selecionado dentre 85S, 85H ou 85Q. Numa modalidade, o Fab quimérico estabilizado compreende a substituição de aminoácido 85T, 85V, 85N, 85A ou 85Y.

[0109] Numa modalidade, o aminoácido na posição 105 do Fab quimérico estabilizado compreende substituição por um aminoácido que é negativamente carregado. Numa modalidade, o aminoácido na posição 105 do Fab quimérico estabilizado compreende a substituição de aminoácido negativamente carregado 105E ou 105D. A avaliação estrutura da adequação das substituições de aminoácidos adicionais a E nesta posição, no contexto do ambiente circundante imediato, indicou que aminoácidos não carregados polares, tais como N ou Q, poderiam fornecer interações similares através da interface de domínio variável e constante na cadeia leve quimérica como aquelas de 105E e poderiam, assim,

também contribuir para a termoestabilidade melhorada. Assim, numa modalidade, o aminoácido na posição 105 do Fab quimérico estabilizado compreende substituição por um aminoácido não carregado polar. Numa modalidade, o aminoácido na posição 105 do Fab quimérico estabilizado compreende a substituição de aminoácido não carregado polar 105N ou 105Q.

[0110] Em algumas modalidades, o aminoácido na posição 106 do Fab quimérico estabilizado compreende substituição por um aminoácido hidrofóbico. Numa modalidade, a substituição de aminoácido hidrofóbico na posição 106 do Fab quimérico estabilizado é selecionada dentre 106I, 106L ou 106M. Numa modalidade, a substituição de aminoácido hidrofóbico na posição 106 do Fab quimérico estabilizado é 106I.

[0111] Em algumas modalidades, o resíduo 80 do Fab quimérico estabilizado compreende substituição por um aminoácido que é hidrofóbico. Em certas modalidades, o Fab quimérico estabilizado compreende uma substituição de aminoácido hidrofóbico selecionada dentre 80A, 80P ou 80V. Em certas modalidades, o Fab quimérico estabilizado compreende uma substituição de aminoácido hidrofóbico selecionada dentre 80A ou 80P. Com base na avaliação estrutural da adequação de outras substituições de aminoácidos nesta posição, no contexto do ambiente circundante imediato, aminoácidos não carregados polares, tais com S, N ou Q poderiam levar a interações similares na interface de domínio variável e constante na cadeia leve quimérica como aquelas de 80A e 80P, e se esperaria, assim, que tivessem uma contribuição menor similar à termoestabilidade melhorada. Assim, em algumas modalidades, o resíduo 80 do Fab quimérico estabilizado compreende substituição por um aminoácido que é polar e não carregado. Em certas modalidades, o Fab quimérico estabilizado compreende uma substituição de aminoácido não carregado polar selecionada dentre 80S, 80N ou 80Q.

[0112] Uma pessoa versada na técnica entenderia que múltiplas combinações das posições e substituições de aminoácido descritas no presente documento podem ser usadas para aumentar a estabilidade de Fabs quiméricos em comparação ao Fab quimérico original. Um número representativo de tais combinações foi descrito e testado nos exemplos, mas a divulgação não é limitada a estas apenas. Por exemplo, é contemplado que, para a combinação de posições de aminoácido descrita nesta divulgação, as substituições de aminoácidos descritas para cada posição podem ser empregadas, e cada combinação de posição (ou posições) e substituições é descrita no presente documento.

[0113] Assim, em modalidades adicionais, o Fab quimérico estabilizado compreende uma substituição de aminoácido ou combinação de substituições de aminoácidos selecionadas dentre aquelas descritas na Tabela 3. Em outras modalidades, o Fab quimérico estabilizado compreende as substituições de aminoácidos 83L e 85T; 83L e 85V; 83L e 105E; 83L e 106I; 83L, 85V e 105E; 83L, 85T e 105E; 83L, 85T, 105E e 106I; ou 83L, 85V, 105E e 106I. Em ainda outras modalidades, o Fab quimérico estabilizado compreende as substituições de aminoácidos 83S e 85T; 83S e 85V; 83S e 105E; 83S e 106I; 83S, 85V e 105E; 83S, 85T e 105E; 83S, 85T, 105E e 106I; ou 83S, 85V, 105E e 106I. Em algumas modalidades, o Fab quimérico estabilizado compreende as substituições de aminoácidos 83T e 85T; 83T e 85V; 83T e 105E; 83T e 106I; 83T, 85V e 105E; 83T, 85T e 105E; 83T, 85T, 105E e 106I; ou 83T, 85V, 105E e 106I. Em modalidades adicionais, o Fab quimérico estabilizado compreende as substituições de aminoácidos 83A e 85S; 83A, 85S e 105E; 83A, 85S, 105E e 106I; 83I e 85S; 83I, 85S e 105E; 83I, 85S, 105E e 106I; 83V e 85S; 83V, 85S e 105E; 83V, 85S, 105E e 106I; 83F e 85S; 83F, 85S e 105E; ou 83F, 85S, 105E e 106I. Em modalidades adicionais, o Fab quimérico estabilizado compreende as substituições de aminoácidos 83A e 105D; 83A, 85T e 105D; 83A, 85V e 105D; 83I e 105D; 83I, 85T e 105D; 83I, 85V e 105D; 83V e 105D; 83V, 85T e 105D; 83V, 85V e 105D; 83F e 105D; 83F, 85T e 105D; ou 83F, 85V e 105.

[0114] Em algumas modalidades, o Fab quimérico estabilizado compreende as substituições de aminoácidos 83F e 85V; 83V e 85V; 83I e 85V; 83A e 85V; 85T e 105E; 85V e 105E; 83F e 85T; 85V e 105E; 83V e 85T; 85V e 105E; 83I e 85T; 85V e 105E; 83A e 85T; ou 85V e 105E.

ESTABILIDADE AUMENTADA

[0115] A estabilidade térmica do Fab quimérico estabilizado é comparada a esta do Fab quimérico original para determinar o aumento na estabilidade exibida pelo Fab quimérico estabilizado em relação ao Fab quimérico original. Numa modalidade, a estabilidade térmica é medida por calorimetria de varredura diferencial (DSC). Em outra modalidade, a estabilidade térmica é medida por fluorimetria de varredura diferencial (DSF). Em algumas modalidades, o Fab quimérico estabilizado pode exibir um aumento na estabilidade térmica maior do que 15 °C em relação ao Fab quimérico original. Em algumas modalidades, os Fabs quiméricos estabilizados que compreendem um ou mais modificações de aminoácido estabilizantes podem exibir um aumento na estabilidade térmica de cerca de 15 °C em relação ao Fab quimérico original. Em algumas modalidades, os Fabs quiméricos estabilizados que compreendem um ou mais modificações de aminoácido estabilizantes podem exibir um aumento na estabilidade térmica de cerca de 10 °C em relação ao Fab quimérico original. Em algumas modalidades, os Fabs quiméricos estabilizados que compreendem um ou mais modificações de aminoácido estabilizantes podem exibir um aumento na estabilidade térmica de cerca de 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 °C em relação ao Fab quimérico original.

[0116] Em algumas modalidades, os Fabs quiméricos estabilizados que compreendem um ou mais modificações de aminoácido estabilizantes podem exibir um aumento na estabilidade térmica de cerca de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 °C em relação ao Fab do anticorpo lambda original. Em algumas modalidades, os Fabs quiméricos estabilizados que compreendem um ou mais modificações de aminoácido estabilizantes podem exibir um aumento na estabilidade térmica de cerca de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 °C em relação ao Fab do anticorpo lambda original, conforme medido por calorimetria de varredura diferencial. Em algumas modalidades, os Fabs quiméricos estabilizados que compreendem um ou mais modificações de aminoácido estabilizantes podem exibir um aumento na estabilidade térmica de cerca de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 °C em relação ao Fab do anticorpo lambda original, conforme medido por fluorimetria de varredura diferencial.

EFEITO NA LIGAÇÃO DE ANTÍGENO

[0117] Um Fab quimérico estabilizado que compreende uma ou mais modificações de aminoácido estabilizantes tem a capacidade de se ligar ao epítopo no antígeno-alvo com uma afinidade que é similar a esta do anticorpo quimérico original ou esta do anticorpo lambda original. Assim, numa modalidade, o Fab quimérico estabilizado tem a capacidade de se ligar ao epítopo no antígeno-alvo com uma afinidade que está dentro de cerca de 10 vezes esta do anticorpo lambda original. Em outras modalidades, o Fab quimérico estabilizado tem a capacidade de se ligar ao epítopo no antígeno-alvo com uma afinidade que está dentro de cerca de 5 vezes esta do anticorpo lambda original. Em ainda outras modalidades, o Fab quimérico estabilizado tem a capacidade de se ligar ao epítopo no antígeno-alvo com uma afinidade que está dentro de cerca de 2,5 vezes esta do anticorpo lambda original. Numa modalidade, a afinidade do Fab quimérico estabilizado é medida com o uso de ressonância plasmônica de superfície (SPR) conforme descrito em outra parte do presente documento.

TRANSFERABILIDADE

[0118] As modificações de aminoácido estabilizantes podem ser geneticamente modificadas em Fab quiméricos originais diferentes daqueles especificamente descritos nos Exemplos. Devido ao fato de que a maior parte dos resíduos de aminoácido na interface entre os domínios variável e constante na cadeia leve lambda é altamente conservada, é esperado que o efeito das modificações de aminoácido estabilizantes descritas seja transferível, em geral, à maioria dos sistemas de Fab e Mab quimérico originais. Assim, as modificações de aminoácido estabilizantes podem aumentar a estabilidade de Fabs quiméricos que compreendem uma cadeia leve quimérica Vlambda-Ckappa, em geral.

MODIFICAÇÕES OPCIONAIS ADICIONAIS

[0119] Em algumas modalidades, os Fabs quiméricos estabilizados descritos no presente documento podem ser adicionalmente modificados (isto é, pela ligação covalente de vários tipos de moléculas) de modo que a ligação covalente não interfira na capacidade do Fab quimérico estabilizado de se ligar ao epítopo do antígeno alvo. Tais modificações incluem, por exemplo, porém sem limitação, glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivação por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou outra proteína, etc. Qualquer uma de inúmeras modificações químicas pode ser executada por técnicas conhecidas, incluindo, porém sem limitação, clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc.

[0120] Numa modalidade, os Fabs quiméricos estabilizados compreendem uma ou mais modificações que podem diminuir potencialmente a imunogenicidade do Fab. Numa modalidade, o Fab quimérico estabilizado compreende modificação de aminoácido no resíduo 106A, de acordo com Kabat. Numa modalidade, o Fab quimérico estabilizado compreende a substituição de aminoácido 106AK.

[0121] Em outras modalidades, os Fabs quiméricos estabilizados descritos no presente documento podem ser conjugados (direta ou indiretamente) a um agente terapêutico ou porção de fármaco que modifica uma determinada resposta biológica. Em certas modalidades, um Fab quimérico estabilizado é conjugado a um fármaco, por exemplo, uma toxina, um agente quimioterápico, um modulador imune ou um radioisótopo. Diversos métodos para preparar ADCs (conjugados de anticorpo-fármaco ou construto de conjugados de anticorpo e fármaco) são conhecidos na técnica e são descritos nas patentes no US 8.624.003 (método pot),

8.163.888 (uma etapa) e 5.208020 (método de duas etapas), por exemplo. Em algumas modalidades, o fármaco é selecionado dentre uma maitansina, auristatina, caliqueamicina ou derivado das mesmas. Em outras modalidades, o fármaco é uma maitansina selecionada dentre DM1 e DM4.

[0122] Em algumas modalidades, o Fab quimérico estabilizado é conjugado a um agente citotóxico. O termo “agente citotóxico” conforme usado no presente documento refere-se a uma substância que inibe ou impede a função das células e/ou causa destruição das células. O termo se destina a incluir isótopos radioativos (por exemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e Lu177), agentes quimioterápicos e toxinas, tais como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes das mesmas.

[0123] Os agentes terapêuticos ou porções químicas de fármaco não devem ser interpretados como limitados aos agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção química de fármaco pode ser uma proteína ou polipeptídeo que tem uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina, tal como abrina, ricina A, Onconase (ou outra RNase citotóxica), exotoxina de pseudomonas, toxina de cólera ou toxina de difteria; uma proteína, tal como fator de necrose tumoral, interferon alfa, interferon beta, fator de crescimento de nervo, fator de crescimento derivado de plaqueta, ativador de plasminogênio de tecido, um agente apoptótico, por exemplo, TNF-alfa, TNF-beta, AIM I (consultar a Publicação Internacional no WO 97/33899), AIM II (consultar a Publicação Internacional no WO 97/34911), Ligante Fas (Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6:1567) e VEGI (consultar a Publicação Internacional no WO 99/23105), um agente trombótico ou um agente antiangiogênico, por exemplo, angiostatina ou endostatina; ou um modificador de resposta biológica, tal como, por exemplo, uma linfocina (por exemplo, interleucina 1 (“IL-1”), interleucina 2 (“IL-2”), interleucina 6 (“IL-6”), fator estimulante de colônia de granulócitos e macrófagos (“GM-CSF”) e fator estimulante de colônia granulócitos (“G-CSF”)) ou um fator de crescimento (por exemplo, hormônio do crescimento (“GH”)).

[0124] Além disso, numa modalidade alternativa, o Fab quimérico estabilizado pode ser conjugado às porções químicas terapêuticas, tal como materiais radioativos ou queladores macrocíclicos úteis para conjugar íons radiometálicos (consultar acima para exemplos de materiais radioativos). Em certas modalidades, o quelador macrocíclico é ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano- N,N’,N”,N”-tetra-acético (DOTA) que pode ser ligado ao anticorpo por meio de uma molécula ligante. Tais moléculas ligantes são comumente conhecidas na técnica e descritas em Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4:2483; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; e Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943.

[0125] Em algumas modalidades, as cadeias pesada e leve de imunoglobulina do Fab quimérico estabilizado são expressas como proteínas de fusão que compreendem uma etiqueta para facilitar a purificação e/ou teste, etc. Conforme referido no presente documento, uma “etiqueta” é qualquer série adicionada de aminoácidos que são fornecidos numa proteína em qualquer uma dentre a terminação C, a terminação N ou internamente que contribui para a identificação ou purificação da proteína. As etiquetas adequadas incluem, porém sem limitação, a etiquetas conhecidas por aqueles versados na técnica como sendo úteis na purificação e/ou teste, tal como domínio de ligação a albumina (ABD), etiqueta His, etiqueta FLAG, glutationa-s-transferase, hemaglutinina (HA) e proteína de ligação a maltose. Tais proteínas com etiqueta podem ser também modificadas para compreender um sítio de clivagem, tal como uma trombina, enteroquinase ou sítio de clivagem de fator X, para facilidade de remoção da etiqueta antes, durante ou após a purificação.

FORMATOS MOLECULARES

[0126] Os Fabs quiméricos estabilizados são úteis como Fabs e podem ser também incorporados em outros formatos moleculares ou construtos de anticorpo. Os formatos moleculares adequados incluem os seguintes exemplos não limitantes: Fabs quiméricos estabilizados ligados com ou sem ligantes a polipeptídeos, tal como albumina ou fragmentos da mesma, peptídeos efetores, toxinas, proteínas extracelulares, domínios de ligação a ligante de citocinas e similares. Os construtos de anticorpo não limitantes exemplificativos podem ser projetados fundindo-se os Fabs quiméricos estabilizados a outros polipeptídeos, tais como Fabs, scFvs quiméricos ou de outro modo, anticorpos de domínio ou anticorpos de ocorrência natural. A sequência de Fab de cadeia pesada e/ou o construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa dos Fabs quiméricos estabilizados podem ser ligados com ou sem ligantes a outros polipeptídeos. Os Fabs quiméricos estabilizados podem ser fundidos a estes outros polipeptídeos em suas terminações N ou C. O Fab quimérico estabilizado pode ser também modificado como um Fab de cadeia única. Tais Fabs de cadeia única são descritos na Publicação de Patente Internacional no WO 2014/018572, Publicações de Patente U.S. nos 2011/0293613 e 2010/0322935A1.

[0127] Em algumas modalidades, o Fab quimérico estabilizado pode ser ligado direta ou indiretamente a um arcabouço. Assim, numa modalidade, um construto de anticorpo compreende pelo menos um Fab quimérico estabilizado, ligado a um arcabouço. Os arcabouços e as modificações adequados dos mesmos são conhecidos na técnica e os arcabouços e as modificações exemplificativos dos mesmos são descritos abaixo.

ARCABOUÇOS

[0128] O Fab quimérico estabilizado pode ser ligado a um arcabouço, por exemplo, um peptídeo, polipeptídeo, polímero, nanopartícula ou outra entidade química. A sequência de Fab de cadeia pesada ou o construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa do Fab quimérico estabilizado pode ser ligado a um arcabouço por suas terminações N ou C. Numa modalidade, o arcabouço é um polipeptídeo de albumina ou polipeptídeo de albumina dividido. Os exemplos de polipeptídeos de albumina divididos adequados são descritos nas Publicações de Patente Internacionais no WO 2012/116453 e WO 2014/012082.

[0129] Em outra modalidade, o Fab quimérico estabilizado pode ser ligado a um arcabouço que é um Fc de imunoglobulina (Fc), ou porção do mesmo. Em algumas modalidades, o Fc compreende pelo menos uma ou duas sequências de domínio CH3. Em algumas modalidades, o Fc compreende adicionalmente pelo menos uma ou duas sequências de domínio CH2. Em algumas modalidades, o Fab quimérico estabilizado é acoplado, com ou sem um ou mais ligantes, ao Fc. Em algumas modalidades, o Fc é um Fc humano. Em algumas modalidades, o Fc é um Fc de IgG ou IgG1 humano. Em algumas modalidades, o Fc é um Fc heterodimérico. Em algumas modalidades, um Fc é um único polipeptídeo. Em algumas modalidades, um Fc são múltiplos peptídeos, por exemplo, dois polipeptídeos.

[0130] Em algumas modalidades, o Fc compreende uma ou mais modificações de aminoácido em pelo menos uma das sequências de domínio CH3. As modificações de aminoácido podem ser feitas ao Fc de imunoglobulina a fim de acionar o pareamento preferencial entre as sequências de domínio CH3 heterodiméricas em relação às sequências de domínio CH3 homodiméricas. Estas modificações de aminoácido são também denominadas no presente documento projetos de pareamento de cadeia pesada. Tais modificações de aminoácido são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, aquelas descritas na Publicação de Patente no US 2012/0149876. Estratégias alternativas para acionar o pareamento preferencial entre sequências de domínio CH3 heterodiméricas em relação às sequências de CH3 homodiméricas, incluindo, por exemplo, “knobs into holes”, resíduos carregados com interações iônicas e tecnologias de domínio modificado por troca de fita (SEED) podem ser também empregadas. As últimas estratégias foram descritas na técnica e são analisadas em Klein et al, supra. A discussão adicional de domínios Fc segue abaixo.

[0131] Em alguns aspectos, Fc é um Fc descrito nos pedidos de patente PCT/CA2011/001238, depositado em 4 de novembro de 2011, ou PCT/CA2012/050780, depositado em 2 de novembro de 2012, cuja divulgação inteira de cada um está incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade para todos os propósitos.

[0132] Em alguns aspectos, o construto de anticorpo compreende um Fab quimérico estabilizado ligado com ou sem um ligante a um Fc heterodimérico que compreende um domínio CH3 modificado que foi modificado assimetricamente. O Fc heterodimérico pode compreender dois polipeptídeos de domínio constante de cadeia pesada: um primeiro polipeptídeo de cadeia pesada e um segundo polipeptídeo de cadeia pesada, que podem ser usados de forma intercambiável contanto que Fc compreenda um primeiro polipeptídeo de cadeia pesada e um segundo polipeptídeo de cadeia pesada. De modo geral, o primeiro polipeptídeo de cadeia pesada compreende uma primeira sequência de CH3 e o segundo polipeptídeo de cadeia pesada compreende uma segunda sequência de CH3.

[0133] Duas sequências de CH3 que compreendem uma ou mais modificações de aminoácido introduzidas de uma forma assimétrica, de modo geral, resultam num Fc heterodimérico, em vez de um homodímero, quando as duas sequências de CH3 dimerizam. Conforme usado no presente documento, “modificações de aminoácido assimétricas” se referem a qualquer modificação em que um aminoácido numa posição específica numa primeira sequência de CH3 é diferente do aminoácido numa segunda sequência de CH3 na mesma posição, e a primeira e a segunda sequências de CH3 de preferência se pareiam para formar um heterodímero, em vez de um homodímero. Esta heterodimerização pode ser um resultado de modificação de apenas um dos dois aminoácidos na mesma respectiva posição de aminoácido em cada sequência; ou modificação de ambos os aminoácidos em cada sequência na mesma respectiva posição em cada uma dentre a primeira e a segunda sequências de CH3. A primeira e a segunda sequências de CH3 de um Fc heterodimérico podem compreender uma ou mais de uma modificação de aminoácido assimétrica.

[0134] A Tabela X fornece a sequência de aminoácidos da sequência de Fc de IgG1 humana, correspondente aos aminoácidos 231 a 447 da cadeia pesada de IgG1 humana de comprimento completo. A sequência de CH3 compreende os aminoácidos 341 a 447 da cadeia pesada de IgG1 humana de comprimento completo.

[0135] Tipicamente, um Fc pode incluir duas sequências de cadeia pesada contíguas (A e B) que têm a capacidade para dimerização. Em alguns aspectos, uma ou ambas as sequências de um Fc incluem uma ou mais mutações ou modificações nas seguintes localizações: L351, F405, Y407, T366, K392, T394, T350, S400 e/ou N390, com o uso da numeração EU. Em alguns aspectos, um Fc inclui uma sequência mutante mostrada na Tabela X. Em alguns aspectos, um Fc inclui as mutações da Variante 1 A-B. Em alguns aspectos, um Fc inclui as mutações da Variante 2 A-B. Em alguns aspectos, um Fc inclui as mutações da Variante 3 A-B. Em alguns aspectos, um Fc inclui as mutações da Variante 4 A-B. Em alguns aspectos, um Fc inclui as mutações da Variante 5 A-B.

Tabela X Sequência de Fc de APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH IgG1 humana 231-447 EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS (numeração EU), SEQ VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ ID NO:29 PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE

WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR

WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Sequência de Fc de Cadeia Mutações IgG1 variante (231-447) 1 A L351Y_F405A_Y407V 1 B T366L_K392M_T394W 2 A L351Y_F405A_Y407V 2 B T366L_K392L_T394W 3 A T350V_L351Y_F405A_Y407V 3 B T350V_T366L_K392L_T394W 4 A T350V_L351Y_F405A_Y407V 4 B T350V_T366L_K392M_T394W 5 A T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V 5 B T350V_T366L_N390R_K392M_T394W

[0136] Em algumas modalidades, o Fc pode compreender uma ou mais modificações de aminoácido em pelo menos uma das sequências de domínio CH2. Várias mutações na sequência de cadeia pesada do Fc são conhecidas na técnica para alterar seletivamente a afinidade do Fc de anticorpo para diferentes receptores Fcgama. Em algumas modalidades, o Fc compreende uma ou mais modificações para alterar a ligação a receptores Fc-gama ao construto de anticorpo.

[0137] O domínio CH2 corresponde aos aminoácidos 231 a 340 da sequência mostrada na Tabela X. As modificações de aminoácido não limitantes exemplificativas que alteram a capacidade do Fc do construto de anticorpo para se ligar a receptores Fc-gama são listadas abaixo:

[0138] S298A/E333A/K334A, S298A/E333A/K334A/K326A (Lu Y, Vernes JM, Chiang N, et al. J Immunol Methods. 28 de fevereiro de 2011;365(1-2):132-41); F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L, F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L (Stavenhagen JB, Gorlatov S, Tuaillon N, et al. Cancer Res. 15 de setembro de 2007;67(18):8882-90; Nordstrom JL, Gorlatov S, Zhang W, et al. Breast Cancer Res. 30 de novembro de 2011;13(6):R123); F243L (Stewart R, Thom G, Levens M, et al. Protein Eng Des Sel. setembro de 2011;24(9):671-8.), S298A/E333A/K334A (Shields RL, Namenuk AK, Hong K, et al. J Biol Chem. 2 de março de 2001;276(9):6591-604); S239D/I332E/A330L, S239D/I332E (Lazar GA, Dang W, Karki S, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 14 de março de 2006;103(11):4005-10); S239D/S267E, S267E/L328F (Chu SY, Vostiar I, Karki S, et al. Mol Immunol. Setembro de 2008;45(15):3926-33); S239D/D265S/S298A/I332E, S239E/S298A/K326A/A327H, G237F/S298A/A330L/ I332E, S239D/I332E/S298A, S239D/K326E/A330L/I332E/S298A, G236A/S239D/D 270L/I332E, S239E/S267E/H268D, L234F/S267E/N325L, G237F/V266L/S267D e outras mutações listadas nos documentos no WO2011/120134 e WO2011/120135, incorporados ao presente documento a título de referência. Therapeutic Antibody Engineering (por William R. Strohl e Lila M. Strohl, Woodhead Publishing series in Biomedicine No 11, ISBN 1 907568 37 9, outubro de 2012) descreve modificações adicionais ao Fc que afetam a ligação do Fc a receptores Fc-gama na página 283.

[0139] Numa modalidade, um construto de anticorpo compreende um Fab quimérico estabilizado e um Fc dimérico em que o Fc dimérico compreende as modificações de aminoácido L234A, L235A e D265S. MODIFICAÇÕES ADICIONAIS PARA MELHORAR A FUNÇÃO EFETORA.

[0140] Em algumas modalidades, o Fc de um construto de anticorpo que compreende um Fab estabilizado descrito no presente documento pode ser modificado para melhorar sua função efetora. Tais modificações são conhecidas na técnica e incluem afucosilação ou modificação genética da afinidade da porção Fc de anticorpos em direção a um receptor de ativação, principalmente FCGR3a para ADCC e em direção a C1q para CDC. A Tabela Y a seguir resume vários projetos relatados na literatura para modificação genética da função efetora. Tabela Y Referência Mutações Efeito

ADCC Lu, 2011, Ferrara 2011, Mizushima Afucosilado aumenta 2011 do

ADCC Lu, 2011 S298A/E333A/K334A aumenta do

ADCC Lu, 2011 S298A/E333A/K334A/K326A aumenta do

ADCC F243L/R292P/Y300L/V305I/P396 Stavenhagen, 2007 aumenta

L do

ADCC F243L/R292P/Y300L/L235V/P396 Nordstrom, 2011 aumenta

L do

ADCC Stewart, 2011 F243L aumenta do

ADCC Shields, 2001 S298A/E333A/K334A aumenta do

ADCC Lazar, 2006 S239D/I332E/A330L aumenta do

ADCC Lazar, 2006 S239D/I332E aumenta do

ADCC AME-D, mutações não Bowles, 2006 aumenta especificadas do

ADCC Heider, 2011 37.1, mutações não divulgadas aumenta do

CDC Moore, 2010 S267E/H268F/S324T aumenta do

[0141] Assim, numa modalidade, um construto de anticorpo compreende um Fab quimérico estabilizado e um Fc dimérico que compreende uma ou mais modificações de aminoácido conforme observado na tabela acima que conferem função efetora melhorada. Em outra modalidade, o construto de anticorpo pode ser afucosilado para melhorar a função efetora.

LIGAÇÃO A FCRN E PARÂMETROS DE PK

[0142] Conforme é mostrado na técnica, a ligação a FcRn recicla o anticorpo endocitosado do endossomo de volta para a corrente sanguínea (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766). Este processo, acoplado à impossibilidade de filtração renal devido ao grande tamanho da molécula de comprimento completo, resulta em meias-vidas séricas de anticorpo favoráveis na faixa de uma a três semanas. A ligação de Fc a FcRn também exerce um papel chave em transporte de anticorpo. Assim, numa modalidade, o Fc compreende uma ou mais modificações de aminoácido que alteram ou promovem a capacidade do Fc para se ligar a FcRn. Os construtos de anticorpo que compreendem um Fab quimérico estabilizado e um Fc podem se ligar a FcRn.

LIGANTES

[0143] Os Fabs quiméricos estabilizados podem ser ligados de modo operacional a um arcabouço conforme descrito no presente documento. Por exemplo, os construtos de anticorpo que compreendem um Fab quimérico estabilizado podem ser ligados de modo operacional a um Fc conforme descrito no presente documento. Uma pessoa versada na técnica entenderia que múltiplas configurações e métodos para ligar construtos de anticorpo que compreendem um Fab quimérico estabilizado são possíveis, todos os quais são abrangidos pelo escopo da divulgação. Em alguns aspectos, o Fc é ligado ao Fab quimérico estabilizado com ou sem um ou mais ligantes. Em alguns aspectos, o Fc é diretamente ligado ao Fab quimérico estabilizado. Em alguns aspectos, o Fc é ligado ao Fab quimérico estabilizado por um ou mais ligantes. Em alguns aspectos,

Fc é ligado à cadeia pesada do Fab quimérico estabilizado por um ligante. Em alguns aspectos, o Fc é ligado à cadeia leve quimérica do Fab quimérico estabilizado por um ligante.

[0144] Em alguns aspectos, o um ou mais ligantes são um ou mais ligantes de polipeptídeo. Em alguns aspectos, o um ou mais ligantes compreendem uma ou mais regiões de dobradiça de anticorpo. Em alguns aspectos, o um ou mais ligantes compreendem uma ou mais regiões de dobradiça de IgG1.

[0145] Em algumas modalidades, o Fab quimérico estabilizado pode ser incorporado num construto de anticorpo que é um construto de anticorpo monovalente, isto é, tem apenas um domínio de ligação a antígeno. Estes construtos de anticorpo monovalentes podem compreendem um Fab quimérico estabilizado e um arcabouço. Numa modalidade, o arcabouço é uma região Fc.

[0146] Em outras modalidades, o Fab quimérico estabilizado pode ser incorporado num construto de anticorpo que é um construto de anticorpo multiespecífico. Em certas modalidades, o Fab quimérico estabilizado pode ser incorporado num construto de anticorpo que é um construto de anticorpo biespecífico. Numa modalidade, um construto de anticorpo biespecífico pode compreender um Fab quimérico estabilizado e um segundo Fab, sendo que o segundo Fab compreende um construto de cadeia leve de imunoglobulina e um construto de cadeia pesada de imunoglobulina. Em certas modalidades, o segundo Fab é também um Fab quimérico estabilizado.

[0147] No contexto de construtos de anticorpo biespecíficos que compreendem um Fab quimérico estabilizado, um segundo Fab e um Fc arcabouço, modificações de aminoácido adicionais podem ser geneticamente modificadas no construto de anticorpo biespecífico a fim de facilitar a preparação do construto de anticorpo biespecífico. Por exemplo, os projetos de pareamento de cadeia pesada e/ou os projetos de pareamento de cadeia leve podem ser modificados no construto de anticorpo biespecífico a fim de promover o pareamento das cadeias pesada e leve para formar o anticorpo biespecífico desejado. Os exemplos de projetos de pareamento de cadeia pesada são descritos em outra parte no presente documento. Os exemplos de projetos de pareamento de cadeia leve são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, nas Publicações de Patente

Internacional nos WO 2014/082179, WO 2015/181805 e WO 2017/059551.

MÉTODOS PARA PREPARAR FABS QUIMÉRICOS ESTABILIZADOS

[0148] Conforme descrito acima, os Fabs quiméricos estabilizados descritos no presente documento compreendem uma cadeia pesada que compreende uma sequência de domínio CH1 e uma sequência de domínio VH (sequência de Fab de cadeia pesada), e um construto de polipeptídeo de cadeia leve de imunoglobulina quimérico (cadeia leve quimérica Vlambda-Ckappa), em que a sequência de Fab de cadeia pesada e o construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa formam uma região Fab que se liga a um epítopo num antígeno alvo. A sequência de Vlambda do construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa compreende uma ou mais modificações de aminoácido estabilizantes que aumentam a estabilidade térmica do Fab quimérico estabilizado em relação ao Fab quimérico original.

[0149] Consequentemente, há tipicamente duas sequências de polipeptídeos que constituem o Fab quimérico estabilizado: uma sequência de Fab de cadeia pesada e um construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa. Em algumas modalidades, os construtos de anticorpo que compreendem Fabs quiméricos estabilizados podem ser preparados como anticorpos bivalentes monoespecíficos ou como anticorpos biespecíficos. Nestas modalidades, há tipicamente quatro sequências de polipeptídeos, duas sequências de polipeptídeos de cadeia pesada de imunoglobulina (incluindo sequências que constituem a região Fc) ou fragmento das mesmas e duas sequências de polipeptídeos de cadeia leve de imunoglobulina, em que pelo menos um dos mesmos é um construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa. Todas estas sequências de polipeptídeos são denominadas polipeptídeos de cadeia pesada e leve de imunoglobulina e podem ser prontamente preparadas usando tecnologia de DNA recombinante conforme conhecido na técnica. Técnicas padrão, tais como, por exemplo, aquelas descritas em Sambrook e Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 3ª edição, 2001); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2ª edição, 1989); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., John Wiley e Sons, New York, 4ª edição, 1999); e Glick e Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM

Press, Washington, D.C., 2ª edição, 1998) podem ser usadas para métodos de ácido nucleico recombinante, síntese de ácido nucleico, cultura celular, incorporação de transgene e expressão de proteína recombinante.

[0150] As sequências de polinucleotídeos e aminoácidos das cadeias pesada e leve de imunoglobulina dos anticorpos lambda originais ou sequências kappa de cadeia leve que constituem o Fab quimérico estabilizado são conhecidas na técnica ou podem ser prontamente determinadas usando métodos de sequenciamento de ácido nucleico e/ou proteína.

[0151] Consequentemente, são também fornecidos polinucleotídeos ou um conjunto de polinucleotídeos que codificam a sequência de Fab de cadeia pesada e construto de cadeia leve de Fab quimérico Vlambda-Ckappa do Fab quimérico estabilizado. Numa modalidade, é fornecido um polinucleotídeo que codifica o construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa do Fab quimérico estabilizado. Tais polinucleotídeos incluem DNA e RNA na forma tanto de fita simples e dita dupla, assim como as sequências complementares correspondentes. O DNA inclui, por exemplo, cDNA, DNA genômico, DNA quimicamente sintetizado, DNA amplificado por PCR e combinações dos mesmos. Os polinucleotídeos incluem genes de comprimento completo ou moléculas de cDNA assim como uma combinação de fragmentos dos mesmos.

[0152] Os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos de cadeia pesada e leve de imunoglobulina modificados descritos no presente documento podem ser preparados por mutagênese sítio-específica de nucleotídeos no DNA que codifica o polipeptídeo, usando cassete ou mutagênese de PCR ou outras técnicas bem conhecidas na técnica, para produzir DNA que codifica os polipeptídeos de cadeia pesada e leve de imunoglobulina modificada e, posteriormente, expressa o DNA recombinante em cultura celular conforme apresentado no presente documento. Entretanto, os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos de cadeia pesada e leve de imunoglobulina modificados podem ser também preparados por síntese de gene in vitro usando técnicas estabelecidas.

[0153] Conforme será percebido por aqueles na técnica, devido à degenerescência do código genético, um número extremamente grande de polinucleotídeos pode ser produzido, todos os quais codificam os polipeptídeos de cadeia pesada e leve de imunoglobulina modificados descritos no presente documento. Assim, tendo identificado uma sequência de aminoácidos particular, aqueles que são versados na técnica poderiam produzir qualquer número de diferentes polinucleotídeos, modificando-se simplesmente a sequência de um ou mais códons de uma forma que não altere a sequência de aminoácidos da proteína codificada.

[0154] São também fornecidos sistemas e construtos de expressão na forma de plasmídeos, vetores de expressão, cassetes de transcrição ou expressão que compreendem pelo menos um polinucleotídeo como acima. São também fornecidas células hospedeiras que compreendem tais sistemas ou construtos de expressão.

[0155] Tipicamente, os vetores de expressão usados nas células hospedeiras conterão sequências para manutenção de plasmídeo e para clonagem e expressão de sequências de nucleotídeos exógenos. Tais sequências, coletivamente denominadas “sequências de flanqueamento”, em certas modalidades, incluirão tipicamente uma ou mais das seguintes sequências de nucleotídeos: um promotor, uma ou mais sequências intensificadoras, uma origem de replicação, uma sequência de terminação transcricional, uma sequência de íntron completa contendo um sítio de splicing doador e aceitante, uma sequência que codifica uma sequência líder para secreção de polipeptídeo, um sítio de ligação a ribossoma, uma sequência de poliadenilação, uma região de poliligante para inserir o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo a ser expresso e um elemento marcador selecionável. O vetor pode ser multicistrônico, isto é, que expressa dois ou mais dos polinucleotídeos que codificam as cadeias pesada e leve de imunoglobulina do Fab quimérico estabilizado, ou o Fab quimérico estabilizado pode ser expresso por um conjunto de vetores, em que cada vetor expressa um ou mais dos polinucleotídeos. O construto de anticorpo pode ser também expresso usando um conjunto de vetores que compreende uma combinação de vetores multicistrônicos e vetores que compreendem um único polinucleotídeo que codifica uma das cadeias pesadas e leves de imunoglobulina.

[0156] Em algumas modalidades, o vetor pode conter uma sequência de codificação de “etiqueta”, isto é, uma molécula de oligonucleotídeo localizada na extremidade 5′ ou 3′ da sequência de codificação de polipeptídeo; a sequência de oligonucleotídeos codifica poliHis (tal como hexaHis), ou outra “etiqueta”, tal como FLAG, HA (hemaglutinina de vírus da gripe), ou myc, para a qual existem anticorpos comercialmente disponíveis. Esta etiqueta é tipicamente fundida ao polipeptídeo mediante a expressão do polipeptídeo, e pode servir como um meio para purificação ou detecção do polipeptídeo a partir da célula hospedeira. A purificação por afinidade pode ser realizada, por exemplo, por cromatografia de coluna usando anticorpos contra a etiqueta como uma matriz de afinidade. Opcionalmente, a etiqueta pode subsequentemente ser removida do polipeptídeo purificado por vários meios, tal como clivagem de peptidase.

[0157] Os vetores tipicamente contêm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e ligado operacionalmente ao polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Os promotores são sequências não transcritas localizadas a montante (isto é, 5′) em relação ao códon inicial de um gene estrutural (de modo geral, dentro de cerca de 100 a 1000 bp) que controlam a transcrição do gene estrutural. Os promotores são convencionalmente agrupados numa das duas classes: promotores induzíveis e promotores constitutivos. Os promotores induzíveis iniciam níveis aumentados de transcrição de DNA sob seu controle em resposta a alguma alteração em condições de cultura, tal como a presença ou ausência de um nutriente ou uma alteração em temperatura. Os promotores constitutivos, por outro lado, transcrevem uniformemente o gene ao qual estão ligados operacionalmente, ou seja, com pouco ou nenhum controle sobre a expressão de genes. Um grande número de promotores, reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais, é bem conhecido.

[0158] Os promotores adequados para uso com hospedeiros de levedura, hospedeiros bacterianos e hospedeiros de inseto são bem conhecidos na técnica. Os intensificadores de levedura são vantajosamente usados com promotores de levedura. Os promotores adequados para uso com células hospedeiras de mamífero são bem conhecidos e incluem, porém sem limitação, aqueles obtidos a partir dos genomas de vírus, tal como poliomavírus, vírus da varíola, adenovírus (tal como Adenovírus 2), papilomavírus bovino, vírus de sarcoma aviário, citomegalovírus, retrovírus, vírus da hepatite B e, com máxima preferência, Vírus

Símio 40 (SV40). Outros promotores de mamífero adequados incluem promotores de mamífero heterólogos, por exemplo, promotores de choque térmico e o promotor de actina.

[0159] O vetor pode conter um ou mais elementos que facilitam a expressão quando o vetor é integrado no genoma da célula hospedeira. Os exemplos incluem um elemento EASE (Aldrich et al. 2003 Biotechnol Prog. 19:1433-38) e uma região de fixação da matriz (MAR). MARs mediam a organização estrutural da cromatina e podem isolar o vetor integrado dos efeitos de “posição”. Assim, MARs são particularmente úteis quando o vetor é usado para criar transfectantes estáveis. Diversos ácidos nucleicos contendo MAR naturais e sintéticos são conhecidos na técnica, por exemplo, Patente no U.S. 6.239.328; 7.326.567; 6.177.612; 6.388.066;

6.245.974; 7.259.010; 6.037.525; 7.422.874; 7.129.062.

[0160] Depois que o vetor foi construído e o polinucleotídeo foi inserido no sítio adequado do vetor, o vetor completo pode ser inserido numa célula hospedeira adequada para amplificação e/ou expressão de polipeptídeo. A transformação de um vetor de expressão numa célula hospedeira selecionada pode ser realizada por métodos bem conhecidos, incluindo transfecção, infecção, coprecipitação de fosfato de cálcio, eletroporação, microinjeção, lipofecção, transfecção mediada por DEAE-dextrano ou outras técnicas conhecidas. O método selecionado será, em parte, uma função do tipo de célula hospedeira a ser usada. As células hospedeiras podem ser transfectadas temporariamente ou as células hospedeiras podem ser transfectadas estavelmente. Estes métodos e outros métodos adequados são bem conhecidos pelo versado na técnica e são apresentados, por exemplo, em Sambrook et al., 2001, supra.

[0161] Para produção de alto rendimento a longo prazo de proteínas recombinantes, a expressão estável é frequentemente preferencial. Por exemplo, as linhagens celulares que expressam estavelmente as cadeias pesada e leve modificadas do Fab quimérico estabilizado podem ser preparadas. Em vez de usar vetores de expressão que contêm origens virais de replicação, células hospedeiras podem ser transformadas com DNA controlado através de elementos de controle de expressão apropriados (por exemplo, promotor, intensificador, sequências, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc.) e um marcador selecionável. Após a introdução do DNA ou polinucleotídeo estrangeiro, as células manipuladas são deixadas proliferar por 1 a 2 dias num meio enriquecido e, então, são deslocadas para um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que as células se integrem de modo estável ao plasmídeo no interior se seus cromossomos e proliferem para formar focos que por sua vez podem ser clonados e expandidos em linhagens celulares.

[0162] Diversos sistemas de seleção podem ser usados, incluindo, porém, sem limitação, a quinase de timidina de vírus simplex de herpes (Wigler et al., 1977, Cell 11 :223), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026) e os genes de adenina fosforribosiltransferase (Lowy et al., 1980, Cell 22:817) podem ser empregados tk-, hgprt- ou aprt-células, respectivamente. Também, a resistência de antimetabólito pode ser usada como base da seleção para os genes dhfr, que confere resistência a metotrexato (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O’Hare et al., 1981 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, que confere resistência a ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, que confere resistência ao aminoglicosídeo G-418 (Colberre-Garapin et al., 1981 , J. Mol. Biol. 150:1); e hygro, que confere resistência à higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30:147).

[0163] Uma célula hospedeira, quando cultivada sob condições adequadas, produz o Fab quimérico estabilizado que pode ser subsequentemente coletado do meio de cultura (se a célula hospedeira secretar o mesmo no meio) ou diretamente da célula hospedeira que produz o mesmo (se não for secretado). A seleção de uma célula hospedeira dependerá de vários fatores, tais como níveis de expressão, modificações de polipeptídeo que são desejáveis ou necessárias para atividade (tal como glicosilação ou fosforilação) e facilidade de enovelamento numa molécula biologicamente ativa. Uma célula hospedeira pode ser eucariótica ou procariótica. Por exemplo, a expressão num sistema bacteriano produzirá um produto não glicosilado e a expressão em levedura produzirá um produto glicosilado. Células hospedeiras eucarióticas que possuem os mecanismos celulares para o processamento apropriado do transcrito primário, a (por exemplo, glicosilação e a fosforilação) do produto de gene podem ser usadas.

[0164] As linhagens celulares de mamífero disponíveis como hospedeiros para expressão são bem conhecidas na técnica e incluem, porém sem limitação, linhagens celulares imortalizadas disponíveis junto à American Type Culture Collection (ATCC) e quaisquer linhagens celulares usadas num sistema de expressão conhecidas na técnica podem ser usadas para produzir os polipeptídeos recombinantes descritos no presente documento. Em geral, as células hospedeiras são transformadas com um vetor de expressão recombinante que compreende DNA que codifica o Fab quimérico estabilizado. Entre as células hospedeiras que podem ser empregadas estão procariontes, levedura ou células eucarióticas superiores. Os procariontes incluem organismos gram-negativos ou gram-positivos, por exemplo, E. coli ou bacilos. As células eucarióticas superiores incluem células de inseto e estabelecidas linhagens celulares de origem em mamífero. Os exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamífero adequadas incluem a linhagem COS-7 de células renais de macaco (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., 1981, Cell 23:175), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovário de hamster chinês (CHO) ou seus derivados, tal como Veggie CHO e linhagens celulares relacionadas que proliferaram em meios sem soro (Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28: 31), células HeLa, linhagens de células BHK (ATCC CRL 10) e a linhagem de células CV1/EBNA derivadas da linhagem de células renais de macaco verde africano CV1 (ATCC CCL 70) conforme descrito por McMahan et al., 1991, EMBO J. 10: 2821, células renais embrionárias humanas, tal como 293, 293 EBNA ou MSR 293, células A431 epidérmicas humanas, células Colo205 humanas, outras linhagens celulares de primata transformadas, células diploides normais, cepas celulares derivadas de cultura in vitro de tecido primário, explantes primários, HL-60, U937, HaK ou células Jurkat. Alternativamente, é possível produzir o polipeptídeo em eucariontes inferiores, tal como levedura, ou em procariontes, tais como bactérias. As leveduras adequadas incluem Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, cepas de Kluyveromyces, Candida ou qualquer cepa de levedura capaz de expressar polipeptídeos heterólogos. As cepas bacterianas adequadas incluem Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium ou qualquer cepa bacteriana capaz de expressar polipeptídeos heterólogos.

[0165] Se o Fab quimérico estabilizado for produzido em leveduras ou bactérias, pode ser desejável modificar o produto produzido no presente documento, por exemplo, por fosforilação ou glicosilação dos sítios adequados, a fim de obter um produto funcional. Tais ligações covalentes podem ser realizadas usando métodos químicos ou enzimáticos conhecidos. O construto de anticorpo pode também ser produzido ligando-se operacionalmente o conjunto de polinucleotídeos a sequências de controle adequadas num ou mais vetores de expressão e empregando-se um sistema de expressão de inseto. Os materiais e métodos para sistemas de expressão de baculovírus/célula de inseto estão comercialmente disponíveis na forma de kit, por exemplo, junto à Invitrogen, San Diego, Calif., EUA (o kit MaxBac™), e tais métodos são bem conhecidos na técnica, conforme descrito em Summers e Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin no 1555 (1987) e Luckow e Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). Os vetores de expressão e clonagem apropriados para o uso com hospedeiros celulares bacterianos, fúngicos, de levedura e de mamíferos são descritos por Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985).

[0166] Em certas modalidades, sistemas de expressão de proteína sem células podem ser utilizados para coexpressar polipeptídeos (por exemplo, polipeptídeos de cadeia pesada e leve) do conjunto de polinucleotídeos sem o uso de células vivas. Em vez disso, todos os componentes necessários para transcrever DNA em RNA e traduzir o RNA em proteína (por exemplo, ribossomos, tRNAs, enzimas, cofatores, aminoácidos) são fornecidos em solução para uso in vitro. Em certas modalidades, a expressão in vitro exige (1) o modelo genético (mRNA ou DNA) que codifica os polipeptídeos de cadeia pesada e leve e (2) uma solução de reação contendo o mecanismo molecular transcricional e traducional necessário. Em certas modalidades, extratos celulares fornece substancialmente os componentes da solução de reação, por exemplo: RNA polimerases para transcrição de mRNA, ribossomos para tradução de polipeptídeo, tRNA, aminoácidos, cofatores enzimáticos, uma fonte de energia e componentes celulares essenciais para enovelamento de proteína adequado. Os sistemas de expressão de proteína sem células podem ser preparados usando lisados derivados de células bacterianas, células de levedura, células de inseto, células vegetais, células de mamífero, células humanas ou combinações das mesmas. Tais lisados celulares podem fornecer a composição e proporção corretas de enzimas e blocos de construção necessários para tradução. Em algumas modalidades, membranas celulares são removidas para deixar apenas os componentes citosólicos e de organelas da célula.

[0167] Diversos sistemas de expressão de proteína sem células são conhecidos na técnica conforme analisado em Carlson et al. (2012) Biotechnol. Adv. 30:1185-1194. Por exemplo, sistemas de expressão de proteína sem células estão disponíveis com base em células procarióticas ou eucarióticas. Os exemplos de sistemas de expressão sem células procarióticas incluem aqueles de E. coli. Os sistemas de expressão de proteína sem células eucarióticas estão disponíveis à base de extratos de reticulócitos de coelho, germe de trigo e células de inseto, por exemplo. Tais sistemas de expressão de proteína sem células procarióticas e eucarióticas estão comercialmente disponíveis junto a empresas tal como Roche, Invitrogen, Qiagen e Novagen. Um versado na técnica poderia prontamente ser capaz de selecionar sistemas de expressão de proteína sem células adequados que poderiam produzir polipeptídeos (por exemplo, polipeptídeos de cadeia pesada e cadeia leve) que são capazes de pareamento uns aos outros. Ademais, o sistema de expressão de proteína sem células pode ser também suplementado com chaperonas (por exemplo, BiP) e isomerases (por exemplo, dissulfeto isomerase) para melhorar a eficiência de enovelamento de IgG.

COEXPRESSÃO DE CADEIAS PESADAS E CADEIAS LEVES

[0168] As cadeias pesadas e as cadeias leves de imunoglobulina geneticamente modificadas do Fab quimérico estabilizado descrito no presente documento podem ser coexpressas em células de mamífero, conforme observado acima. Numa modalidade, as cadeias pesadas de imunoglobulina e as cadeiras leves de imunoglobulina do Fab quimérico estabilizado são coexpressas numa célula hospedeira. Assim, no caso de um construto de anticorpo biespecífico que compreende pelo menos um Fab quimérico estabilizado, um segundo Fab e um arcabouço de Fc, duas cadeias pesadas de imunoglobulina (H1 e H2) e duas cadeias leves de imunoglobulina (L1 e L2) são coexpressas numa célula hospedeira para formar um par H1L1 que se liga a um primeiro epítopo e um par H2L2 que se liga a um segundo epítopo. Entretanto, métodos alternativos para produzir construtos de anticorpo biespecífico que não se baseiam no uso de uma única linhagem de células clonal ou temporária que expressa todas as quatro cadeias são também conhecidos na técnica (Gramer, et al. (2013) mAbs 5, 962; Strop et al. (2012) J Mol Biol 420, 204.). Esses métodos se baseiam numa troca de braço pós- produção sob condições redox dos dois pares de cadeia leve e pesada envolvidos na formação de anticorpo biespecífico (produção Redox). Nessa abordagem, os heterodímeros H1L1 e H2L2 podem ser expressos em duas linhagens celulares diferentes para produzir independentemente os dois heterodímeros. Subsequentemente, os dois heterodímeros são misturados sob condições redox seletas para atingir a reassociação das duas cadeias pesadas exclusivas H1 e H2 para formar o construto de anticorpo biespecífico que compreende H1L1H2L2.

[0169] Em algumas modalidades, a quantidade de anticorpo biespecífico desejado resultante da coexpressão de duas cadeias pesadas exclusivas e duas cadeias leves exclusivas é aumentada por modificações de aminoácido nos domínios CH3 das duas cadeias pesadas que promovem pareamento preferencial entre H1 e H2, conforme descrito em outra parte no presente documento. Em algumas modalidades, a quantidade de anticorpo biespecífico desejado resultante da coexpressão de duas cadeias pesadas exclusivas e duas cadeias leves exclusivas é aumentada por modificações de aminoácido nos domínios CH1 e CL e/ou nos domínios VH e VL dessas cadeias que promovem pareamento preferencial entre cadeias pesadas e leves. Os exemplos das últimas modificações de aminoácido são descritos nas Publicações Internacionais nos WO2014/082179 e WO2015/181805.

[0170] Embora o pareamento preferencial seja acionado principalmente pela incorporação das modificações de aminoácido nos domínios CH1/CL e/ou VH/VL nos polipeptídeos de cadeia pesada e leve de imunoglobulina, a quantidade de heterodímeros corretamente pareados pode ser, ainda, otimizada variando-se a razão dos polinucleotídeos que codificam cada polipeptídeo entre si, conforme mostrado nos Exemplos.

TESTE DE FABS QUIMÉRICOS ESTABILIZADOS

[0171] A afinidade de cada Fab quimérico estabilizado a seu respectivo antígeno pode ser testada conforme descrito abaixo. A estabilidade térmica de cada Fab quimérico estabilizado pode ser também testada conforme descrito abaixo.

ESTABILIDADE TÉRMICA

[0172] A estabilidade térmica dos Fabs quiméricos estabilizados pode ser determinada de acordo com os métodos conhecidos na técnica. A temperatura de fusão de cada Fab quimérico estabilizado é indicativa de sua estabilidade térmica. A temperatura de fusão do Fab quimérico estabilizado pode ser medida usando técnicas, tal como calorimetria de varredura diferencial (Chen et al (2003) Pharm Res 20:1.952 a 1.960; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47 a 52) e fluorimetria de varredura diferencial (Niesen et al. (2007) Nature Protocols 2(9): 2.212 a 2.221). Os últimos métodos fornecem uma medida de estabilidade térmica em termos de “temperatura de fusão” ou Tm. Alternativamente, a estabilidade térmica do Fab quimérico estabilizado pode ser medida usando dicroísmo circular (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343 a 349). Numa modalidade, a estabilidade térmica do Fab quimérico estabilizado ou anticorpos que compreende o Fab quimérico estabilizado é medida por calorimetria de varredura diferencial (DSC). Numa modalidade, a estabilidade térmica do Fab quimérico estabilizado ou anticorpos que compreende o Fab quimérico estabilizado é medida por fluorimetria de varredura diferencial (DSF). Numa modalidade, a estabilidade térmica do Fab quimérico estabilizado ou anticorpos que compreende o Fab quimérico estabilizado é medida por DSC ou DSF.

AFINIDADE COM ANTÍGENO

[0173] A afinidade de ligação dos Fabs quiméricos estabilizados com seus respectivos antígenos e a taxa de dissociação da interação pode ser determinada por ensaios de ligação competitiva de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica. Um exemplo de um ensaio de ligação competitiva é um radioimunosensaio que compreende a incubação de antígeno identificado (por exemplo, 3H ou 125I com uma molécula de interesse (por exemplo, Fabs quiméricos estabilizados conforme descrito aqui) na presença de quantidades crescentes de antígeno não identificado, e a detecção da molécula ligada ao ligante identificado. A afinidade dos Fabs quiméricos estabilizados com o antígeno e as taxas de dissociação de ligação pode ser determinada a partir dos dados de saturação por análise de Scatchard.

[0174] Os parâmetros cinéticos para ligação de um Fab quimérico estabilizado descritos no presente documento a um antígeno podem ser também determinados usando ensaios à base de ressonância plasmônica de superfície (SPR) conhecidos na técnica (por exemplo, análise cinética BIAcore). Para uma análise de tecnologia à base de SPR, consultar Mullet et al., 2000, Methods 22: 77 a 91; Dong et al., 2002, Review in Mol. Biotech., 82: 303 a 323; Fivash et al., 1998, Current Opinion in Biotechnology 9: 97 a 101; Rich et al., 2000, Current Opinion in Biotechnology 11: 54 a 61. Adicionalmente, qualquer um dos instrumentos de SPR e métodos à base de SPR para medir as interações entre proteínas descritos nas Patentes U.S. nos 6.373.577; 6.289.286; 5.322.798; 5.341.215; 6.268.125 é contemplado nos métodos para avaliar a capacidade de um Fab quimérico estabilizado para ligação a antígeno. Outros métodos conhecidos na técnica, incluindo FACS e interferometria de biocamada (BLI, descrito em Determining Kinetics and Affinities of Protein Interactions Using a Parallel Real-time Label-free Biosensor, the Octet. Abdiche, Y.N.; Malashock, D. S.; Pinkerton, A; Pons, J. Analytical Biochemistry, 2008, 377(2), 209 a 217), podem ser também usados para medir a afinidade. Numa modalidade, a capacidade de um Fab quimérico estabilizado ou anticorpo que compreende um Fab quimérico estabilizado para ligação ao antígeno alvo é medida por SPR. Numa modalidade, a afinidade de um Fab quimérico estabilizado ou anticorpo que compreende um Fab quimérico estabilizado em relação a seu antígeno alvo é medida por SPR.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[0175] São também fornecidos no presente documento composições farmacêuticas que compreendem os Fabs quiméricos estabilizados ou construtos de anticorpo descritos no presente documento. Tais composições compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz do Fab quimérico estabilizado e um carreador farmaceuticamente aceitável. Numa modalidade específica, o termo “farmaceuticamente aceitável” significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou listado na Farmacopeia dos EUA ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para o uso em animais e, mais particularmente, em seres humanos. O termo “carreador” se refere a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o agente terapêutico é administrado. Tais carreadores farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, como água e óleos, incluindo aqueles derivados de petróleo, animal, origem vegetal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. A água é um carreador preferencial quando a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa. Soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e de glicerol podem também ser empregadas como carreadores líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Os excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado em pó, glicerol, propileno glicol, água, etanol e similares. A composição pode também, se desejado, conter quantidades menores de agentes umectantes ou emulsificantes ou agentes de tamponamento de pH. Essas composições podem assumir a forma de soluções, suspensões, emulsões, tabletes, pílulas, cápsulas, pós, formulações com liberação prolongada e similares. A composição pode ser formulada como um supositório, com ligantes e carreadores tradicionais, tais como triglicerídeos. A formulação oral pode incluir carreadores padrão, como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc. Exemplos de carreadores farmacêuticos adequados são apresentados em “Remington’s Pharmaceutical Sciences” por E. W. Martin. Tais composições conterão uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto, de preferência, em forma purificada juntamente com uma quantidade adequada de carreador de modo a fornecer a forma para a administração apropriada ao paciente. A formulação deve se adequar ao modo de administração.

[0176] Em certas modalidades, a composição que compreende o Fab quimérico estabilizado ou os construtos de anticorpo que compreendem um Fab estabilizado são formulados em conformidade com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a seres humanos. Tipicamente, as composições para administração intravenosa são soluções em tampão aquoso isotônico estéril. Quando necessário, a composição pode também incluir um agente solubilizante e um anestético local tal como lignocaína para aliviar a dor no local da injeção. Geralmente, os ingredientes são supridos ou separadamente ou misturados em conjunto em forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado livre de água num recipiente hermeticamente vedado tal como uma ampola ou sachê indicando a quantidade de agente ativo. Nos casos em que a composição deve que ser administrada por infusão, a mesma pode ser dispensada com uma garrafa de infusão que contém água ou solução salina de grau farmacêutico estéril. Nos casos em que a composição é administrada por injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina pode ser fornecida de modo que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

[0177] Em certas modalidades, as composições descritas no presente documento são formuladas como formas neutras ou salinas. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles formados com ânions tais como aqueles derivados de ácidos clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., e aqueles formados com cátions tais como aqueles derivados de sódio, potássio, amônio, cálcio, hidróxido férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.

[0178] A quantidade da composição descrita no presente documento, que será eficaz no tratamento, inibição e prevenção de uma doença ou distúrbio associado à expressão e/ou atividade anormal de uma proteína terapêutica pode ser determinada por técnicas clínicas padrão. Adicionalmente, ensaios in vitro podem, opcionalmente, ser empregados para auxiliar na identificação de faixas ideais de dosagem. A dose precisa a ser empregada na formulação também dependerá da via de administração e da gravidade da doença ou distúrbio e deve ser decidida de acordo com o julgamento do profissional e com as circunstâncias de cada paciente. As dosagens eficazes são extrapoladas destas curvas de resposta à dosagem derivadas dos sistemas de teste de modelo de animal ou in vitro.

USOS

[0179] Conforme descrito acima, os Fabs quiméricos estabilizados e construtos de anticorpo que compreendem Fabs quiméricos estabilizados são obtidos a partir de um ou mais anticorpos originais. Consequentemente, os mesmos podem ser usados no tratamento ou prevenção das mesmas doenças, distúrbios ou infecções num indivíduo para as quais o anticorpo original ou combinações de anticorpos originais são usadas. Numa modalidade, o indivíduo é um mamífero. Numa modalidade, o indivíduo é um ser humano.

[0180] Em outra modalidade, os Fabs quiméricos estabilizados e construtos de anticorpo que compreendem Fabs quiméricos estabilizados descritos no presente documento podem ser também utilizados em combinação com outros agentes terapêuticos conhecidos na técnica para o tratamento ou prevenção de um câncer, doença autoimune, distúrbios inflamatórios ou doenças infecciosas num indivíduo. Numa modalidade específica, os Fabs quiméricos estabilizados e construtos de anticorpo que compreendem Fabs quiméricos estabilizados descritos no presente documento podem ser usados em combinação com anticorpos monoclonais ou quiméricos, linfocinas ou fatores de crescimento hematopoiéticos (tal como, por exemplo, IL-2, IL-3 e IL-7), que, por exemplo, servem para aumentar o número ou a atividade de células efetoras que interagem com as moléculas e aumentar a resposta imunológica. Os Fabs quiméricos estabilizados e construtos de anticorpo que compreendem Fabs quiméricos estabilizados descritos no presente documento podem ser também utilizados em combinação com um ou mais fármacos usados para tratar uma doença, distúrbio ou infecção, tal como, por exemplo, agentes anticâncer, agentes anti-inflamatórios ou agentes antivirais.

[0181] Em outra modalidade, os Fabs quiméricos estabilizados podem ser usados na preparação de construtos de anticorpo de formatos variados, conforme descrito no presente documento. Em certas modalidades, os Fabs quiméricos estabilizados podem ser usados na preparação de construto de anticorpo biespecífico. Um exemplo de tal uso é descrito no Exemplo 14.

[0182] Em ainda outra modalidade, os Fabs quiméricos estabilizados podem ser usados num método para aumentar a estabilidade de um anticorpo lambda (isto é, um anticorpo lambda original que compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina e uma cadeia leve lambda) ou Fab lambda em casos em que isto é desejável. Por exemplo, a fim de aumentar a estabilidade de um anticorpo lambda original, uma cadeia leve quimérica Vlambda-Ckappa que compreende a sequência de Vlambda do anticorpo lambda original e uma sequência de Ckappa pode ser preparada, em que a sequência de Vlambda compreende uma ou mais das modificações de aminoácido estabilizantes descritas no presente documento. A cadeia leve quimérica Vlambda-Ckappa pode ser, então, usada para preparar um anticorpo que compreende a sequência de Vlambda. Por exemplo, a cadeia leve quimérica Vlambda-Ckappa pode ser coexpressa com a cadeia pesada de imunoglobulina para obter um anticorpo quimérico com estabilidade térmica aumentada em comparação com o anticorpo lambda original. Alternativamente, a cadeia leve quimérica Vlambda-Ckappa pode ser coexpressa com um fragmento de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende os domínios VH e CH1 para obter um Fab quimérico com estabilidade aumentada em comparação com o Fab lambda original.

EXEMPLOS

[0183] Abaixo estão os exemplos de modalidades específicas para produzir e usar os Fabs quiméricos estabilizados descritos no presente documento. Os exemplos são oferecidos para propósitos ilustrativos apenas e não pretendem limitar o escopo da divulgação de nenhuma forma. Foram feitos esforços para garantir a precisão em relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperaturas, etc.), mas algum erro experimental e desvio deve, obviamente, ser permitido.

[0184] Os construtos e métodos descritos no presente documento podem ser preparados e executados empregando-se, a não ser que indicado de outro modo, métodos convencionais de química de proteína, bioquímica, técnicas de DNA recombinante dentro da habilidade da técnica. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura. Consultar, por exemplo, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., adição atual); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª Edição, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ª Edição (Easton, Pensilvânia: Mack Publishing Company, 1990); Carey e Sundberg Advanced Organic Chemistry 3ª Edição (Plenum Press) Volumes A e B (1992).

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: CONSERVAÇÃO DE AMINOÁCIDO E PROJETO GUIADO

POR ESTRUTURA NA INTERFACE ENTRE VLAMBDA E CKAPPA NA CADEIA LEVE DE QUIMERA VLAMBDA-CKAPPA

[0185] Em muitos casos, pode ser observado que os Fabs contendo cadeias leves quiméricas (Fabs quiméricos) exibem uma queda em estabilidade térmica em comparação com Fabs contendo uma cadeia leve do tipo selvagem. Portanto, uma abordagem guiada por estrutura e guiada por conservação de aminoácido foi principalmente usada para manipular soluções para melhorar a estabilidade térmica de Fabs contendo uma cadeia leve quimérica, em que a cadeia leve quimérica é composta por um domínio lambda variável e um domínio kappa constante. Este tipo de cadeia leve quimérica é denominado no presente documento uma cadeia leve quimérica Vlambda-Ckappa (cadeia leve quimérica VL-CK) e um Fab quimérico contendo este tipo de cadeia leve quimérica é denominado no presente documento um Fab quimérico VL-CK. Uma representação de Fab quimérico VL-CK é mostrada na Figura 1. A sequência de uma cadeia leve quimérica VL-CK representativa em comparação com aquela de um Fab lambda do tipo selvagem (CAT-2200) é mostrado na Figura 2.

[0186] A análise guiada por estrutura foi principalmente realizada em estruturas de cristal de raios X representativas de Fabs humanos ou humanizados contendo cadeias leve kappa e em Fabs humanos ou humanizados contendo cadeias leves lambda, assim como nos poucos Fabs disponíveis contendo uma cadeia leve quimérica Vlambda-Ckappa. As estruturas de Fab kappa e lambda foram identificadas da forma a seguir. A análise dos contatos entre domínios da interface domínio variável:constante na cadeia leve foi realizada num conjunto de estruturas de Fab humano/humanizado lambda e kappa não redundantes encontradas no Banco de Dados de Anticorpos Monoclonais hospedado por IMGT® usando uma ferramenta in silico que forneceu uma análise do número de resíduos em contato na interface de interesse, assim como uma análise por resíduo do número de resíduos de contato. Esta análise determinou que há uma distribuição diferente de diversos contatos na interface variável:constante nas cadeias leves de Fab lambda em comparação com a distribuição em Fabs kappa. Os Fabs dos anticorpos D3H44 e CAT-2200 foram escolhidos como Fab kappa representativo e

Fab lambda representativo, respectivamente, para análise. Esses Fabs exibiram um número média de contatos na interface domínio variável:constante para estruturas de Fab kappa e lambda, respectivamente. Uma análise visual da interface variável:constante em cadeias leves dessas estruturas de Fab kappa e lambda representativas foi, então, executada para identifica resíduos importantes em tais interfaces. Juntamente com a análise visual de algumas estruturas de Fab Vlambda-Ckappa disponíveis, a mesma foi, ainda, usada para identificar quaisquer incompatibilidades na interface variável:constante em cadeia leve quimérica. A análise acima foi auxiliada por análise de conservação de resíduo e análise de contato por resíduo obtida com a ferramenta in silico. A análise de conservação de resíduo foi realizada para a interface de cadeia leve de domínio variável:constante realizando-se alinhamentos de sequências de sequências kappa e lambda humanas e humanizadas não redundantes (banco de dados de IMGT) para identificar o tipo de resíduo mais comum nas posições de interesse (resíduos importantes) na interface.

[0187] A análise acima destacou as diferenças na interface de domínio variável:constante de cadeias leves kappa em comparação com as cadeias leves lambda e levou à hipótese de que a compatibilidade subideal na interface quimérica entre os domínios Vlambda e Ckappa da cadeia leve quimérica estava provavelmente relacionada à diminuição observada em estabilidade térmica de Fabs contendo cadeia leve quimérica. Diversos resíduos de ponto de interesse na interface Vlambda:Ckappa foram identificados, incluindo as posições 83, 85 e 105 (numeradas de acordo com Kabat, e conforme mostrado na Tabela 1 e Figura 3). Por todos os exemplos, as posições de aminoácido na região Fab são identificadas de acordo com o sistema de numeração de Kabat, a não ser que indicado de outro modo. Diversos conjuntos de substituições de aminoácido (denominados “projetos”) no domínio variável da cadeia leve quimérica Vlambda-Ckappa foram propostos para melhorar a compatibilidade da interface Vlambda-Ckappa imitando a interface observada entre domínios kappa variáveis e kappa constantes (Vkappa-Ckappa), conforme mostrado na Figura 1 e, assim, melhorar a estabilidade térmica dos respectivos Fabs quiméricos. Portanto, as variantes de Fab quimérico compreenderam uma cadeia pesada que não foi modificada para melhorar a estabilidade térmica e uma cadeia leve de quimera Vlambda-Ckappa, incluindo substituições de aminoácido propostas para melhorar a estabilidade térmica do Fab quimérico VL-CK.

[0188] Três sistemas de teste de Fab quimérico VL-CK representativos foram escolhidos para avaliação dos projetos. Esses sistemas de teste atenderam os seguintes critérios: a) capacidade de ser produzido com rendimento suficiente para possibilitar teste prático, b) exibição de estabilidade térmica diminuída em formato de Fab quimérico VL-CK em comparação com o Fab do anticorpo do tipo selvagem precursor, c) capacidade de ligação a antígeno com afinidade comparável àquela do anticorpo do tipo selvagem precursor e d) cobertura de frameworks humanos distintos (especificamente, subgrupos de VH humana e VL lambda). Os Fabs quiméricos VL-CK representativos continham cadeias leves quiméricas que têm um domínio Vlambda dos seguintes anticorpos: CAT-2200 Fab (anti-IL17; hIGHV3, hIGLV6), H3 (anti-HER3; hIGHV3, hIGLV2) e EP6b_B01 (anti-Fas; hIGHV4, hIGLV1). O construto de cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa foi composto pela sequência de domínio variável lambda terminada na posição L106A e a sequência de domínio constante kappa correspondente a IGKC*01 (uma das sequências de alelo kappa humano mais comuns) começando na posição R108. A Figura 2 fornece um exemplo de uma sequência de cadeia leve quimérica, nesse caso, para o CAT-2200 Fab. Para referência, a Tabela 1 fornece a numeração de aminoácidos para os domínios variáveis de cadeia leve para CAT-2200, H3 e EP6b_B01, de acordo com Kabat. EXEMPLO 2: PROJETOS DE OTIMIZAÇÃO DE ESTABILIDADE

[0189] Com base na análise descrita no Exemplo 1, diversos projetos foram propostos para melhorar a estabilidade térmica de Fabs quiméricos VL-CK. As substituições de aminoácido nas posições de ponto de interesse 83, 85 e 105 no domínio Vlambda e em outras posições secundárias foram selecionadas para introduzir o tipo de aminoácido mais conservado nessas posições em domínios variáveis kappa (por exemplo, 83F) assim como tipos de aminoácido menos conservados (por exemplo, 83V/83I/83A). Como um ponto de interesse principal, as substituições de aminoácido na posição 83 definem aquelas denominadas nos exemplos como “temas de projeto”, por exemplo, “tema 83F”, “tema 83V”, “tema

83I” ou “tema 83A”. Um total de 39 projetos foram propostos para teste, conforme mostrado na Tabela 3. As substituições de aminoácido introduzidas nas cadeias leves quiméricas VL-CK para melhorar a estabilidade térmica são denominas no presente documento “projetos de otimização de estabilidade” ou simplesmente “projetos”. Conforme observado em outra parte, as posições de aminoácido substituídas nos projetos são identificadas por todo o pedido usando o sistema de numeração de Kabat. A Tabela 1 fornece uma referência à numeração de Kabat de domínios variáveis das cadeias leves lambda CAT-2200, H3 e EP6b_B01.

[0190] Os 39 projetos de otimização de estabilidade listados na Tabela 3 foram testados quanto à sua capacidade de melhorar a estabilidade de Fabs quiméricos VL-CK, conforme descrito nos exemplos a seguir. EXEMPLO 3: PREPARAÇÃO DE CONSTRUTOS DE CONTROLE E

CONSTRUTOS COM PROJETOS DE OTIMIZAÇÃO DE ESTABILIDADE

[0191] Os projetos de otimização de estabilidade foram testados em formato de Fab e em formato de Mab, ambos os quais são formatos monoespecíficos neste exemplo, com base nos anticorpos originais CAT-2200, H3 e EP6b_B01 (observa- se que o sistema EP6b_B01 não foi testado em formato de Mab). O formato de Fab foi usado como um sistema simplificado em que são testadas as rodadas iniciais de projetos. Os projetos selecionados foram subsequentemente testados no contexto de um anticorpo de tamanho completo, em formato de Mab.

[0192] Os construtos no formato de Fab incluíram uma cadeia pesada truncada que compreende domínios CH1 e VH e uma cadeia leve lambda precursora (controles de Fab do tipo selvagem) ou uma cadeia quimérica VL-CK (Fabs quiméricos VL-CK), em que a cadeia pesada truncada e o domínio Vlambda da cadeia leve quimérica VL-CK são do anticorpo original, e o domínio Ckappa da cadeia leve quimérica VL-CK é a sequência de domínio constante kappa correspondente a IGKC*01. Os construtos no formato de Fab, com projetos de otimização de estabilidade na cadeia leve quimérica VL-CK são denominados “Fabs quiméricos projetados” (consultar a Figura 1 para uma representação desse tipo de construto).

[0193] Os construtos no formato de Mab tiveram duas cadeias pesadas de comprimento completo idênticas correspondentes ao anticorpo original, e duas cadeias leves lambda originais idênticas (controles de Mab do tipo selvagem) ou duas cadeias leves quiméricas VL-CK idênticas, em que o domínio Vlambda de cada cadeia leve quimérica VL-CK é do anticorpo original, e o domínio Ckappa é a sequência de domínio constante kappa correspondente a IGKC*01 (Mabs quiméricos). Os construtos no formato de Mab, com projetos de otimização de estabilidade na cadeia leve quimérica VL-CK são denominados “Mabs quiméricos projetados”. A Figura 4 fornece estruturas exemplificativas desses construtos de Mab.

PREPARAÇÃO DE CONSTRUTOS EM FORMATO DE FAB

[0194] Dois tipos de controles de formato de Fab foram usados para a avaliação dos projetos. Os construtos de Fab lambda do “tipo selvagem” com base nos anticorpos originais CAT-2200, H3 e EP6b_B01 continham uma cadeia pesada não modificada truncada (que tem domínios VH e CH1) e uma cadeia leve lambda do tipo selvagem do anticorpo original. Os construtos de Fab quiméricos continham cadeias pesadas truncadas não modificadas e uma cadeia leve quimérica VL-CK com o domínio Vlambda e domínio Ckappa originais com sequência correspondente a IGKC*01. A Figura 1 apresenta representações de um construto de Fab lambda do tipo selvagem (Fab lambda WT) e de um construto de Fab quimérico (Fab quimérico Vλ-Cκ).

[0195] A cadeia pesada truncada, a cadeia leve do tipo selvagem e a cadeia leve quimérica VL-CK do anticorpo original CAT-2200 foram preparadas conforme segue. As sequências de proteínas da cadeia leve de CAT-2200 Fab (cadeia L de 2VXS, SEQ ID NO:8) e cadeia pesada truncada (cadeia H de 2VXS, SEQ ID NO:7), incluindo a dobradiça de IgG1 superior “EPKSCDKTHT” (SEQ ID NO:30) foram tomadas a partir da entrada de PDB 2VXS 9, traduzidas reversamente em DNA, sofreram otimização de códon para expressão em mamífero e síntese de gene (SEQ ID NOs: 23 e 22, respectivamente). A cadeia leve de quimera Vlambda- Ckappa foi composta pela sequência de domínio Vlambda CAT-2200, terminada na posição L106A e a sequência de domínio Ckappa correspondente a IGKC*01, da posição R108 da sequência Ckappa, conforme mostrado na Figura 2. A sequências de proteínas para a cadeia leve de quimera CAT-2200 Vlambda-Ckappa é apresentada na SEQ ID NO: 9 e a sequência de DNA é apresentada na SEQ ID

NO: 24.

[0196] A cadeia pesada truncada, a cadeia leve do tipo selvagem e a cadeia leve quimérica VL-CK do anticorpo original H3 foram preparadas conforme segue. A sequência de proteínas do domínio VL de anticorpo H3 foi obtida a partir da SEQ ID NO: 4, resíduos 156 a 267 da Patente U.S. no 8329873, e a sequência de proteínas do domínio VH deste anticorpo foi obtida a partir da SEQ ID NO:4, resíduos 23 a 140 da mesma patente. A sequência de domínio VH foi anexada à sequência de domínio CH1 de IGHG1*01 (SEQ ID NO:31) para obter uma sequência de proteínas para a cadeia pesada truncada para o Fab (SEQ ID NO:1), incluindo a dobradiça de IgG1 superior “EPKSCDKTHT” (SEQ ID NO:30). A sequência de domínio VL foi anexada à sequência CL lambda de IGLC2 para obter uma sequência de proteínas para uma cadeia leve “do tipo selvagem” para o anticorpo H3 (SEQ ID NO:2). Essas sequências foram traduzidas reversamente em DNA, sofreram otimização de códon para expressão em mamífero e síntese de gene (SEQ ID NO:17 para a cadeia leve e SEQ ID NO:16, para a cadeia pesada truncada). A sequência de proteínas para a cadeia leve de quimera Vlambda- Ckappa H3 foi obtida conforme descrito para o anticorpo CAT-2200, e a sequência de aminoácidos resultante é apresentada na SEQ ID NO:3. A sequência de DNA que codifica a cadeia leve quimérica VL-CK H3 é apresentada na SEQ ID NO: 18.

[0197] A cadeia pesada truncada, a cadeia leve do tipo selvagem e a cadeia leve quimérica VL-CK do anticorpo original EP6b_B01 foram preparadas conforme segue. As sequências de proteínas da cadeia leve de Fab EP6b_B01 (cadeia L de 3THM, SEQ ID NO:5) e cadeia pesada (cadeia H de 3THM, excluindo a sequência 10xHis-tag C-terminal, SEQ ID NO:4), incluindo a dobradiça de IgG1 superior “EPKSCDKTHT” (SEQ ID NO:30) foram tomadas a partir da entrada de PDB 3THM, traduzidas reversamente em DNA, sofreram otimização de códon para expressão em mamífero e síntese de gene (SEQ ID NOs: 20 e 19, respectivamente). A sequência de proteínas para a cadeia leve de quimera Vlambda-Ckappa EP6b_B01 foi obtida conforme descrito para o anticorpo CAT-2200 e é apresentada na SEQ ID NO:6. A sequência de DNA que codifica a cadeia leve quimérica VL-CK EP6b_B01 é apresentada na SEQ ID NO: 21.

[0198] As sequências de polipeptídeo e DNA das cadeias pesadas de anticorpo indicadas acima, cadeias leves e cadeias leves quiméricas VL-CK são fornecidas na Tabela 2.

[0199] Substituições de aminoácido de cadeia leve correspondentes aos projetos de otimização de estabilidade de Fabs quiméricos projetados foram geradas em sequências de DNA de cadeia leve quimérica VL-CK, principalmente por mutagênese sítio-dirigida (Braman J, Papworth C & Greener A., Methods Mol. Biol. (1996) 57:31-44).

[0200] Insertos de vetor de cadeia leve, consistindo num sítio de corte 5’- EcoRI – peptídeo de sinalização HLA-A – cadeia leve do tipo selvagem ou sequências de cadeia leve quiméricas VL-CK – “parada de TGA ou TAA” – sítio de corte BamH1-3’, foram ligados num vetor pTT5 (Durocher Y et al., Nucl. Acids Res. 2002; 30, No.2 e9) para produzir vetores de expressão de cadeia leve. Os vetores de expressão de cadeia leve resultantes foram sequenciados para confirmar o quadro de leitura correto e a sequência do DNA de codificação. Similarmente, insertos de vetor de cadeia pesada, consistindo num sítio de restrição 5’-EcoR1 – peptídeo de sinalização HLA-A – sequência de cadeia pesada (que termina em T238 (numeração de Kabat) – parada de TGA ou TAA’ – sítio de corte BamH1-3’, foram ligados a um vetor pTT5 para produzir vetores de expressão de cadeia pesada. Os vetores de expressão de cadeia pesada resultantes foram também sequenciados para confirmar o quadro de leitura correto e a sequência do DNA de codificação.

PREPARAÇÃO DE CONSTRUTOS EM FORMATO DE MAB

[0201] Como para o formato de Fab, dois tipos análogos de controles de formato de Mab foram usados para a avaliação dos projetos: Os construtos de Mab lambda do “tipo selvagem” com base nos anticorpos originais CAT-2200, H3 e EP6b_B01 continham cadeias pesadas e cadeias leves não modificadas de comprimento completo do anticorpo original. Os construtos de Mab quiméricos continham uma cadeia pesada não modificada e uma cadeia leve quimérica.

[0202] As sequências de proteínas para cadeias leves do tipo selvagem e as cadeias leves quiméricas VL-CK para cada construto de controle de Mab foram obtidas conforme descrito para os construtos no formato de Fab. A sequência para a cadeia pesada de comprimento completo do anticorpo CAT-2200 foi obtida a partir da entrada de PDB 2VXS, correspondente à cadeia pesada curta conforme descrito na seção “Preparação de construtos em formato de Fab”, seguido por anexação da sequência da dobradiça de IgG1 inferior (“CPPCP”, SEQ ID NO:32), domínios CH2 e CH3 (SEQ ID NO 15 na Tabela 2). Esta sequência foi traduzida reversamente em DNA, sofreu otimização de códon para expressão em mamífero e síntese de gene. A sequência de proteínas para a cadeia pesada de comprimento completo do anticorpo H3 de uma maneira similar, com base na sequência de cadeia pesada de H3.

[0203] Os vetores de cadeia leve e cadeia leve quimérica para criar contatos de Mab foram preparados da mesma maneira que para construtos de Fab, com substituições de aminoácido de cadeia leve correspondentes aos projetos de otimização de estabilidade que são gerados conforme descrito acima. Os insertos de vetor de cadeia pesada, consistindo num sítio de restrição 5’-EcoR1 – peptídeo de sinalização HLA-A – clone de cadeia pesada que termina em G446 (numeração de EU) de CH3 – parada de TGA ou TAA’ – sítio de corte BamH1-3’, foram ligados a um vetor pTT5 para produzir vetores de expressão de cadeia pesada. Conforme descrito acima, os vetores de expressão de cadeia pesada resultantes foram também sequenciados para confirmar o quadro de leitura correto e a sequência do DNA de codificação. EXEMPLO 4: EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE FABS QUIMÉRICOS

PROJETADOS E MABS QUIMÉRICOS PROJETADOS

[0204] As cadeias pesada e leve de construtos de Fab e Mab de controle, assim como construtos de Fab quimérico projetado e Mab quimérico projetado foram expressas em 50 ou 200 ml de culturas de células CHO-3E7. Células CHO- 3E7, numa densidade de 1,7 a 2 x 106 células/ml, foram cultivadas a 37 °C em meio F17 FreeStyleTM (Gibco número de catálogo A-1383501) suplementado com glutamina 4 mM (Hiclone número de catálogo SH30034.01) e 0,1% de KoliphorP188 (Sigma no K4894). Um volume total de 50 ou 200 ml foi transfectado com um total de 50 ou 200 μg de DNA (por exemplo, para o caso de 200μg, 100 μg de DNA de Fab/Mab e 100 μg de GFP/AKT/DNA preenchedor) usando PEI-pro, respectivamente (Polyplus número de catálogo 115-375) numa razão DNA:PEI de 1:2,5 ou PEI-max (Polyscience catálogo: 24765) numa razão DNA:PEI de 1:4. Vinte e quatro horas após a adição da mistura de DNA-PEI, ácido valproico 0,5 mM (concentração final) e 1% em p/v de Triptona (concentração final) foram adicionados às células (+ antibiótico 1X de Hi-clone número de catálogo SV30079) que foram, então, transferidos a 32 °C e incubados por 7 dias antes da coleta.

PURIFICAÇÃO DE CONTRUTO DE FAB

[0205] Os construtos de Fab quimérico de controle e projetados foram purificados de sobrenadante clarificado (após coleta de células) por captura por afinidade usando IgG-CH1 CaptureSelect™ (Life Technologies™, número de catálogo: 194-320-005) por lote ou lote misturado:cromatografia em coluna. Os sobrenadantes foram diluídos a 20 a 25% de sobrenadante clarificado em tampão de equilíbrio (solução salinha tamponada por fosfato de Dulbecco (DPBS) sem Cálcio, Magnésio e vermelho de fenol (HyClone™ no SH30028.02)) ou, em alguns casos, incubados diretamente com mistura por 16 horas com IgG-CH1 CaptureSelect™ (anteriormente equilibrado com o tampão de equilíbrio) a 4 °C. A resina contendo proteínas ligadas com vertida em colunas Econo (Bio-Rad) ou foi coletada por centrifugação e transferida para uma placa vitrificada de 96 poços. Ambos os métodos incluíram uma etapa de lavagem com tampão de equilíbrio, seguida por etapa de eluição realizada com glicina HCl 100 mM pH 2,6 a 2,7 e neutralização imediata das amostras eluídas em pH 6,0 a 7,0 usando 10% (v/v) de Tris 1 M pH 9,0. A quantificação de proteína foi realizada por A280 nm (NanoDrop).

[0206] Nos casos em os Fabs quiméricos projetados e/ou controles exibiram perfis de ligação abaixo do ideal para IgG-CH1 CaptureSelect™, estes Fabs foram purificados do sobrenadante clarificado usando resina de seleção kappa conforme segue. As proteínas foram purificadas usando resina KappaSelect (GE Healthcare), em modo a batelada ou usando colunas HiTrap de 1 ml embaladas usando um instrumento Protein Maker (Protein BioSolutions). A resina foi equilibrada em DPBS e o sobrenadante clarificado aplicado a uma coluna HiTrap de 1 ml pré-embalada com um tempo de permanência de 3 min/ml ou para purificação a batelada, a resina foi adicionada a sobrenadante clarificado com agitação de um dia para o outro a 4 °C. Após a ligação da proteína à resina, uma etapa de lavagem foi realizada com o tampão de equilíbrio, que foi seguida pela etapa de eluição usando glicina HCl 100 mM pH 2,6 a 2,7. As amostras eluídas tiveram o pH imediatamente ajustado em pH

6 a 7 usando 10% (v/v) de base Tris 1 M pH 9. A quantificação de proteína foi realizada por A280 nm (NanoDrop).

PURIFICAÇÃO DE CONTRUTO DE MAB

[0207] Amostras de sobrenadante clarificado foram aplicadas a colunas de 1 ml HiTrap mAb Select SuRe (GE Healthcare) equilibradas em DPBS ou incubadas com pasta fluida de resina mAb Select SuRe (anteriormente equilibrada em tampão de DPBS) de um dia para o outro a 2 a 8 °C (modo a batelada). A mistura a batelada foi, então, transferida para uma coluna de cromatografia e fluxo passante foi coletado. As colunas foram lavadas com DPBS e a proteína eluída com tampão citrato de sódio 100 mM pH 3,0. As eluições foram realizadas em 10% (v/v) de Tris 1 M pH 8 para produzir um pH final de 6 a 7. A proteína foi quantificada com base em A280 nm (Nanodrop).

[0208] Após a purificação, a expressão de ambos os construtos de Fab e Mab foi avaliada por ensaio High Throughput Protein Express não redutor usando Caliper LabChip GXII (Perkin Elmer no 760499). Os procedimentos foram executados de acordo com o HT Protein Express LabChip User Guide version2 LabChip GXII User Manual, com as seguintes modificações. As amostras de Fab/Mab, a 2 μl ou 5 μl (faixa de concentração 5 a 2000 ng/µl) foram adicionadas para separar poços em placas de 96 poços (BioRad no HSP9601) juntamente com 7 µl de HT Protein Express Sample Buffer (Perkin Elmer no 760328). As amostras de Fab/Mab/bsAb foram, então, desnaturadas a 70 °C por 15 minutos. O instrumento LabChip foi operado usando o HT Protein Express Chip (Perkin Elmer no 760499) e o ajuste de ensaio Ab-200.

EFEITO DE PROJETOS DE OTIMIZAÇÃO DE ESTABILIDADE EM EXPRESSÃO DE PROTEÍNA

[0209] A Figura 5 compara o título de construtos de Fab e Mab para controles e Fabs quiméricos projetados selecionados ou Mabs quiméricos projetados no anticorpo CAT-2200 original. A expressão do Fab quimérico e Fabs quiméricos projetados foi um tanto inferior em comparação com expressão do Fab lambda do tipo selvagem. A expressão de Mabs quiméricos projetados foi um tanto inferior em comparação com o Mab lambda do tipo selvagem e Mab quimérico. A inclusão de mutações de otimização de estabilidade no formato quimérico não teve um impacto significativo sobre a expressão de proteína (comparar a expressão de Fabs quiméricos projetados com aquela do Fab lambda do tipo selvagem e a expressão do Mab quimérico projetado com aquela do Mab lambda do tipo selvagem).

[0210] Conforme observado no Exemplo 3, alguns Fabs quiméricos projetados exibiram eficiência de purificação abaixo do ideal com a abordagem IgG- CH1 CaptureSelect, entretanto, quando estes mesmos Fabs quiméricos projetados foram purificados por KappaSelect ou os Mabs quiméricos projetados análogos foram purificados por proteína A, os mesmos se comportaram similarmente aos outros Fabs quiméricos projetados/Mabs quiméricos projetados. Alguns desses Fabs quiméricos projetados/Mabs quiméricos projetados pertenciam aos temas 83A ou 83V. Sem se limitar de qualquer forma ao seguinte, a variabilidade observada em ligação à resina IgG-CH1CaptureSelect pode ser devido à dinâmica conformacional variável na interface cadeia leve:pesada ou interface variável: constante (por exemplo, como uma consequência de substituição de aminoácido menor no caso, por exemplo, do tema 83A vs. do tema 83F, para a qual a eficiência de purificação foi comparável àquela do tipo selvagem) em vez de como uma consequência da integridade estrutural comprometida destes construtos de Fab quimérico projetados, por exemplo. Esta hipótese é sustentada pela eficiência de purificação comparável de tais Fabs quiméricos projetados/Mabs quiméricos projetados ao restante dos Fabs quiméricos projetados/Mabs quiméricos projetados pelos dois outros métodos de purificação alternativos (descritos acima), respectivamente. EXEMPLO 5: CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO DE TAMANHO PREPARATÓRIA (SEC) DE FABS QUIMÉRICOS PROJETADOS E MABS

QUIMÉRICOS PROJETADOS PARA CARACTERIZAÇÃO BIOFÍSICA

[0211] Fabs quiméricos projetados, Mabs quiméricos projetados e controles, preparados conforme descrito no Exemplo 4, foram submetidos a SEC preparatória para remover quaisquer impurezas, antes de avaliar suas características biofísicas. SEC preparatória foi executada conforme segue. As espécies de anticorpo nas amostras foram separadas usando uma coluna Superdex 200 10/300 ou Superdex 200 10/300 Increase (GE Healthcare) montada em um sistema GE Healthcare ÄKTA Avant 25 equipado com um autoamostrador ALIAS Bio Cool (Spark-Holland)

usado para injetar amostras na coluna. As amostras em formatos de Fab ou Mab (0,9 ml) em PBS pH 7,4 (Hyclone DPBS/modificado, sem cálcio, sem magnésio, número de catálogo SH-300028.02) foram automaticamente carregadas num circuito de 2 ml preenchido com PBS. As amostras foram, então, injetadas automaticamente na coluna e separadas a 0,5 ml/min com um volume de eluição de 1 CV (com algumas das bateladas de purificação anteriores, o carregamento de amostra foi realizado manualmente com um circuito de amostra de 1 ml). A eluição de proteína foi monitorada a OD280 e coletada em frações de 0,5 ml. Para cada amostra, as frações que compreenderam o pico principal (as frações foram avaliadas por Caliper) foram agrupadas e, ainda, biofisicamente caracterizadas conforme descrito nos Exemplos 7 a 11. EXEMPLO 6: CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ULTRADESEMPENHO ACOPLADA A CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO DE TAMANHO (UPLC-SEC)

PARA AVALIAÇÃO DE QUALIDADE DE FABS QUIMÉRICOS PROJETADOS E MABS QUIMÉRICOS PROJETADOS

[0212] As amostras de Fab quimérico projetado purificadas pela etapa de cromatografia de afinidade inicial (IgG-CH1CaptureSelect ou KappaSelect) descrita no Exemplo 4, assim como amostras de Mab quimérico projetado purificadas por SEC preparatória descrita no Exemplo 5, foram submetidas a UPLC-SEC a fim de avaliar a monodispersidade das amostras após a purificação inicial no caso de Fabs quiméricos projetados ou durante o curso do estudo de estabilidade de bancada no caso de Mabs quiméricos projetados (consultar o Exemplo 13).

[0213] UPLC-SEC foi realizada usando uma coluna Waters Acquity BEH200 SEC (2,5 ml, 4,6 x 150 mm, aço inoxidável, partículas de 1,7 μm) ajustada a 30°C e montada num sistema Waters Acquity UPLC H-Class Bio com um detector PDA. Os tempos de execução consistiram em 7 min e um volume total por injeção de 2,8 ml com um tampão contínuo de DPBS ou DPBS com 0,02% de Tween 20 pH 7,4 a 0,4 ml/min. A eluição foi monitorada por absorbância de UV na faixa 210 a 500 nm, e cromatogramas foram extraídos a 280 nm. A integração de pico foi realizada usando software Empower 3.

[0214] A análise por UPLC-SEC de amostras de Fab quimérico projetado purificadas por IgG-CH1CaptureSelect foi reflexiva da homogeneidade de espécies.

Os perfis de UPLC-SEC de Fabs quiméricos projetados purificados por impurezas refletidas por KappaSelect provavelmente relacionados a várias espécies contendo cadeia leve, a maioria dos quais foi subsequentemente removido por SEC preparatória. EXEMPLO 7: EFEITO DE PROJETOS SOBRE ESTABILIDADE TÉRMICA

DE FABS QUIMÉRICOS PROJETADOS

[0215] A fim de determinar a efetividade dos projetos de otimização de estabilidade, a estabilidade térmica dos Fabs quiméricos projetados e controles foi avaliada por métodos de fluorescência de varredura diferencial (DSF) e/ou calorimetria de varredura diferencial (DSC) e em comparação com a estabilidade térmica do respectivo Fab quimérico. Os Fabs quiméricos projetados e controles foram purificados conforme descrito no Exemplo 5.

MEDIÇÃO DE ESTABILIDADE TÉRMICA POR DSC

[0216] A estabilidade térmica de Fabs quiméricos projetados e controles foi medida usando DSC conforme segue. 400 μl de amostras purificadas principalmente a concentrações de 0,4 mg/ml (o pequeno subconjunto de Fabs quiméricos projetados estava em concentração de 0,175 mg/ml) em PBS foram usados para análise por DSC com um VP-Capillary DSC (GE Healthcare). Ao início de cada rodada de DSC, 5 injeções de branco de tampão foram realizadas para estabilizar a linha de base, e uma injeção de tampão foi posicionada antes de cada injeção de amostra para referência. Cada amostra foi submetida à varredura de 20 a 100 ˚C a uma taxa de 60 ˚C/h, com baixa retroalimentação, filtro por 8 segundos, termostato de pré-varredura por 3 ou 5 min e pressão de nitrogênio de 482,63 kPa (70 psi). Os termogramas resultantes foram mencionados e analisados usando o software Origin 7 para determinar a temperatura de fusão (Tm) como um indicador de estabilidade térmica.

MEDIÇÃO DE ESTABILIDADE TÉRMICA POR DSF

[0217] A estabilidade térmica de Fabs quiméricos projetados e controles foi medida usando DSF conforme segue. Cada Fab quimérico projetado purificado foi diluído a 0,67 mg/ml em DPBS (solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, HyClone número de catálogo SH30028.02). Um estoque de trabalho de mancha de gel Sypro Orange (Life Technologies número de catálogo S-6650) foi preparado por diluição a 1:1000 em DPBS. As amostras de DSF foram preparadas adicionando- se 15 μl de 0,67 mg/ml de proteína (10 μg) a 15 μl do estoque de trabalho de mancha de gel Sypro Orange. Entretanto, para proteínas que tiveram uma concentração menor que 0,67 mg/ml, cada amostra de DSF foi preparada adicionando-se 15 μl de 0,27 mg/ml (4 μg) de proteína ou proteína não diluída a 15 μl de um estoque de trabalho de corante Sypro Orange. A análise por DSF foi, então, conduzida em alíquotas de 30 μl usando o instrumento Rotor-Gene 6000 qPCR (QiaGen Inc). Cada amostra foi submetida à varredura de 30°C a 94°C usando intervalos de 1°C com um equilíbrio de 10 segundos entre cada etapa e um tempo de espera de 30 segundos no início. Um filtro de excitação de 470 nm e filtro de emissão de 610 nm foram usados com o ganho manualmente ajustado entre 7 a 10 para garantir que as amostras não estivessem saturando e estivessem dentro da faixa dinâmica do detector. Os dados foram analisados com o software Rotor- Gene 6000 usando o valor máximo do primeiro derivado da curva de desnaturação como a Tm (temperatura de fusão).

RESULTADOS ESTABILIDADE TÉRMICA DE CONTROLES

[0218] Conforme observado no Exemplo 1, um dos critérios para selecionar Fabs representativos para testar os projetos de otimização de estabilidade foi que um Fab quimérico VL-CK exibiu uma diminuição em estabilidade térmica comparada a um Fab lambda do tipo selvagem do anticorpo original. A Tabela 4 mostra os valores de Tm obtidos para os Fabs lambda do tipo selvagem e os Fabs quiméricos VL-CK (identificados como “WT” e “quimera” na Tabela 4). As colunas 8 a 13 mostra a Tm para estes controles conforme medido por DSC, enquanto as colunas 2 a 7 mostram a Tm para estes controles conforme medido por DSF. Em todos os casos, os Fabs quiméricos VL-CK exibiram uma diminuição em Tm, com a quantidade da diminuição variando dependendo do anticorpo original. A Tm média para o construto de Fab lambda CAT-2200 do tipo selvagem foi determinada como sendo 78,8°C e para o Fab quimérico CAT-2200 foi determinado como sendo 73,1°C. A Tm média para o construto Fab lambda H3 do tipo selvagem foi determinada como sendo 80,9°C e para o Fab quimérico foi determinada como sendo 76,0°C. A Tm média para o construto de Fab EP6b_B01 lambda do tipo selvagem foi determinada como sendo 85,4°C e para o Fab quimérico foi determinada como sendo 80,5°C. Estes dados demonstram que a conversão de Fab lambda do tipo selvagem no Fab quimérico Vlambda-Ckappa é acompanhada pela perda em estabilidade térmica na faixa de 4,9 a 5,7°C conforme medido por DSF, enquanto a diminuição em Tm medida por DSC estava entre 3,7 e 4,6 °C, sugerindo que a mesma é uma tendência provável em outros sistemas também.

ESTABILIDADE TÉRMICA DE FABS QUIMÉRICOS PROJETADOS

[0219] Com base na estratégia de projeto descrita no Exemplo 1, um conjunto inicial de 8 projetos (projetos 1 a 8 conforme listado na Tabela 3) foi testado no sistema único CAT-2200 por DSC. Com base nos resultados, um segundo conjunto de projetos (projetos 9 a 39 na Tabela 3) foi testado por DSF nos sistemas CAT- 2200 e H3 a fim de identificar as substituições de aminoácido que foram mais importantes no aumento da estabilidade térmica dos Fabs quiméricos VL-CK. Embora DSF seja conhecida como sendo um método menos preciso para medir as temperaturas de fusão, a mesma foi usada aqui devido ao fato de que é um método de alto rendimento para medir a estabilidade térmica e é adequada para avaliar o efeito relativo sobre a estabilidade em comparação com os controles.

[0220] Os resultados de DSC para Fabs quiméricos projetados com os projetados 1 a 8 são relatados na Tabela 4 (colunas 8 a 13). Os dados de estabilidade térmica para os três sistemas são relatados nas colunas 8 (CAT-2200), 10 (H3) e 12 (EP6b_B01). Comparações dos valores de Tm de Fab quimérico projetado em relação ao valor de Tm do respectivo sistema de quimera Vlambda- Ckappa são relatadas nas colunas 9 (CAT-2200), 11 (H3) e 13 (EP6b_B01). Para Fabs quiméricos projetados em que repetições foram conduzidas, o valor de Tm relatado é o valor médio.

[0221] Os resultados de DSF para Fabs quiméricos projetados são relatados na Tabela 4 (colunas 2 a 7). Os dados de estabilidade térmica para três sistemas de teste diferentes são relatados nas colunas 2 (CAT-2200), 4 (H3) e 6 (EP6b_B01). Para Fabs quiméricos projetados em que repetições foram conduzidas, o valor de Tm relatado é o valor médio. Comparações dos valores de Tm de Fab quimérico projetado em relação ao valor de Tm do respectivo sistema de quimera Vlambda- Ckappa são relatadas nas colunas 3 (CAT-2200), 5 (H3) e 7 (EP6b_B01).

[0222] Os dados na Tabela 4 demonstram que com a estratégia de projeto escolhida, a estabilidade do tipo selvagem não foi apenas recuperada, mas também superada por até 7,6°C (projeto 39 no sistema H3) conforme medido por DSF. Os dados baseados em dois sistemas, CAT-2200 e H3, indicam que a introdução de tão pouco quanto uma única substituição de aminoácido no resíduo 83X (em que X=F/V/I/A, em que estes resíduos de aminoácido são os tipos de aminoácido mais conservados na cadeia leve kappa, com F sendo o mais conservado de todos), pode levar à melhora dimensionável em estabilidade térmica em comparação com aquela de Fab quimérico correspondente, exibindo um aumento em estabilidade entre 1,8 a 7,4°C (Consultar a Figura 6A, a Figura 6B e a Tabela 4: projetos 14, 23, 30 e 35). Os projetos em que o aminoácido na posição 83 foi substituído por V, I ou A têm uma Tm que supera aquela mesmo do Fab lambda do tipo selvagem. Portanto, o E83X foi determinado como sendo uma posição central para substituição. A substituição por aminoácido L nesta posição foi testada experimentalmente no sistema CAT-2200 em formato de Fab quimérico (dados não fornecidos) e variantes contendo tal substituição (por exemplo: 83L_105E_106AK, e outros combos incluindo 85T e 106I) demonstrou comportamento similar em termos de melhora de termoestabilidade às substituições de aminoácido hidrofóbicas para as quais os dados são fornecidos no presente documento.

[0223] A introdução de uma substituição de aminoácido adicional na posição 85 para obter o projeto 83X_85T resultou num aumento adicional em estabilidade térmica, cuja extensão pareceu ser dependente de sistema (Figura 6A, Figura 6B e Tabela 4: projetos 17, 26, 32 e 37). A extensão adicional do projeto a 83X_85T/V_105E ou 83X_85T_105E_106I levou a melhora ainda maior em Tm, cuja extensão foi dependente do sistema testado (Figura 6A, Figura 6B e Tabela 4). As substituições de aminoácido na posição 85 com tipos de aminoácido mais conservadas na cadeia leve kappa, a saber T e V, no contexto dos projetos testados contribuíram para a melhora idêntica em Tm. EXEMPLO 8: TRANSFERABILIDADE DO EFEITO DE PROJETOS DE

OTIMIZAÇÃO DE ESTABILIDADE EM FORMATO DE FAB

[0224] A fim de avaliar adicionalmente a transferabilidade de projetos de otimização de estabilidade, um subconjunto de projetos do tipo 83X_85T,

83X_85T_105E_106I, em que X=V/I/A e 83F_85T_105E foram selecionados para teste num terceiro sistema de Fab, EP6b_B01, por DSF. As medições de estabilidade térmica para este conjunto de 7 projetos foram também realizadas por DSC (como um método mais preciso dos dois) em todos os três sistemas, CAT- 2200, H3 e EP6b_B01.

[0225] Estes projetos foram selecionados para teste com base nos seguintes: a) os projetos tiveram um número mínimo de substituições de aminoácido enquanto ainda exibem desempenho ideal: 83X_85T; ou b) os projetos tiveram melhor desempenho (isto é, demonstraram ganho de Tm máximo) independentemente do número de mutações: 83X_85T_105E_106I. Como o tema 83F foi menos eficaz que os outros temas 83X, apenas o projeto 83F_85T_105E foi selecionado, representando um conjunto mínimo de mutações para o ganho de Tm máximo com base nos dados dos dois sistemas CAT-2200 e H3. Os projetos selecionados, assim, incluíram os projetos 18, 26, 29, 32, 34, 37 e 39, conforme listado na Tabela

3.

[0226] As medições de DSF e DSC foram executadas conforme descrito no Exemplo 7.

[0227] Os dados na Tabela 4 e na Figura 7 demonstraram que os projetos testados se transferem para o Fab quimérico VL-CK de um terceiro sistema, EP6b_B01. Tendências similares na Tm de projetos foram observadas por aqueles observados nos outros dois sistemas. Conforme anteriormente observado, variações dependentes de sistema até o ponto da mudança de Tm em comparação com quimera inicial foram observadas aqui também. Destaca-se que os valores de Tm determinados por DSC são, de modo geral, mais baixos que aqueles observados por DSF (descrito no Exemplo 7) e, portanto, há uma discrepância em valores de Tm para o mesmo projeto quando medido por DSC ou DSF (conforme mostrado na Tabela 4). Entretanto, as tendências relativas entre projetos e através dos sistemas são mantidas. EXEMPLO 9: TRANSFERABILIDADE DO EFEITO DE PROJETOS DE

OTIMIZAÇÃO DE ESTABILIDADE EM FORMATO DE MAB

[0228] Nos Exemplos 7 e 8, a transferabilidade de projetos de otimização de estabilidade selecionados foi demonstrada no formato de Fab. A fim de testar a transferabilidade no formato de Mab, medições de estabilidade térmica para o conjunto de 7 projetos descrito no Exemplo 8 foram realizadas em dois sistemas, CAT-2200 e H3 por DSC.

[0229] Os Mabs testados foram purificados por SEC preparatória conforme descrito no Exemplo 5. DSC foi realizada conforme descrito no Exemplo 7. Como nos Exemplos 7 e 8, os valores de Tm para os Mabs quiméricos projetados foram comparados àqueles do respectivo controle de Mab quimérico (quimera) e Mab lambda do tipo selvagem (WT). Os resultados de DSC para os Mabs quiméricos projetados são relatados na Tabela 5, com valores de Tm para os dois sistemas testados relatados nas colunas 2 (CAT-2200) e 4 (H3). A mudança em Tm em relação à Tm do respectivo Mab quimérico é relatada nas colunas 3 (CAT-2200) e 5 (H3).

[0230] Todos os 7 projetos selecionados foram capazes de aumentar a Tm dos Mabs quiméricos projetados em comparação com o respectivo Mab quimérico, conforme mostrado na Tabela 5. A Figura 8 fornece uma comparação dos valores de Tm obtidos para Fabs e Mabs quiméricos projetados nos dois sistemas testados. Tendências idênticas entre projetos, em relação a valores de Tm muito similares, foram observadas para os projetos testados em formatos de Fab e Mab. Termogramas de DSC típicos obtidos para Fabs quiméricos projetados (transição única) e Mabs quiméricos projetados (transição de Fab proeminente única e transições de CH2 ou/e CH3 são observadas quando não mascaradas por transição de Fab) são fornecidos na Figura 9. Esses termogramas mostraram as transições esperadas.

[0231] Os resultados mostrados nos Exemplos 7, 8 e 9 demonstram a transferabilidade dos projetos de otimização de estabilidade através dos sistemas e formatos de anticorpo. EXEMPLO 10: MEDIÇÕES DE AFINIDADE DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO

DE FABS QUIMÉRICOS PROJETADOS E MABS QUIMÉRICOS PROJETADOS

[0232] A capacidade dos Fabs quiméricos projetados (Fabs quiméricos projetados de temas E83X, portando os projetos 14 a 39) e Mabs quiméricos projetados (portando os projetos 18, 26, 29, 32, 34, 37 e 39, os mesmos 7 Mabs quiméricos projetados testados nos Exemplos 8 e 9) para ligar os antígenos adequados foi avaliada a fim de determinar se as substituições de aminoácido dos projetos de otimização de estabilidade tiveram qualquer efeito sobre a afinidade de ligação a antígeno. Os Fabs e Mabs quiméricos projetados foram purificados conforme descrito no Exemplo 5. A afinidade de ligação a antígeno foi determinada por SPR nos sistemas CAT-2200, H3 e EP6b_B01 para Fabs quiméricos projetados e nos sistemas CAT-2200 e H3 para Mabs quiméricos projetados, conforme segue.

ENSAIO DE BIOSSENSOR DE SPR

[0233] Para estudos em Biacore T200: Chip de sensor CM5 Series S, kit de acoplamento de amina Biacore (NHS, EDC e etanolamina 1 M) e tampões acetato de sódio 10 mM foram adquiridos junto à GE Healthcare Life Science (Mississauga, ON, Canadá). Para estudos em Biorad ProteOn: Chips de sensor GLC, o kit de acoplamento de amina Biorad ProteOn (EDC, sNHS e etanolamina) e tampões acetato de sódio 10 mM foram adquiridos junto à Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON). Tampão contínuo PBS com 0,05% de Tween20 (PBST) foi adquirido junto à Teknova Inc. (Hollister, CA). Anticorpo Fc anti-humano policlonal de cabra foi adquirido junto à Jackson Immuno Research Laboratories Inc. (West Grove, PA). Antígenos: HER3 humano recombinante adquirido junto à ACRObiosystems (Newark, DE), receptor de sFase humano recombinante foi adquirido junto à Pepro Tech Inc. (Rocky Hill, NJ) e IL-17A humana recombinante foi adquirida junto à R&D Systems (Mineapolis, MN).

[0234] Ensaios de ressonância de plásmon de superfície (SPR) com antígenos HER3 (Fabs) e Fas foram executados usando um instrumento Biacore T200 (GE Healthcare) com tampão contínuo PBS-T (PBS + 0,05% (v/v) de Tween 20) (com solução de estoque de EDTA 0,5 M adicionada à concentração final de 3,4 mM) a uma temperatura de 25°C. Os ensaios de ressonância de plásmon de superfície com antígenos IL-17 e HER3 (Mabs) foram executados usando instrumento BioRad ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON)) com tampão contínuo PBST a uma temperatura de 25 °C. H3: DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE COM HER3 EM FABS

[0235] A determinação de afinidade com HER3 em Fabs foi executada conforme segue. A triagem de Fabs (purificados por SEC preparatória) para ligação a antígeno HER3 ocorreu em duas etapas: uma captura indireta de HER3 no anticorpo anti-His, seguida pela injeção de cinco concentrações de Fabs, para análise cinética usando cinética de ciclo único. A superfície de captura de anticorpo anti-His foi preparada num chip de sensor CM5 Series S por acoplamento de amina de aproximadamente 10000 RUs de anticorpo anti-His (GE Healthcare) nas células de fluxo ativas e de referência, de acordo com as instruções do fabricante. HER3 foi injetado a 4 a 8 µg/ml sobre a célula de fluxo ativa por 60 s a uma taxa de fluxo de 10 μl/min. Em geral, isto resultou na captura de aproximadamente 100 a 200 RUs de HER3 na superfície do anticorpo anti-His. HER3 não foi capturado na célula de fluxo de referência (branco). A etapa de captura foi seguida por cinco concentrações de Fabs (200 nM e diluições de 2 vezes) que foram sequencialmente injetadas sobre ambas as células de fluxo ativas e de referência a 50 μl/min por 90 s com uma fase de dissociação de 300 s. As superfícies de HER3 capturadas foram regeneradas por glicina 10 mM pH 1,5 por 120 s a 30 μl/min para preparar as superfícies para o ciclo de injeção seguinte. Pelo menos duas injeções de tampão simulado foram realizadas para cada injeção de analito e usadas para referência. Os sensogramas de cinética de ciclo única resultante foram analisados usando o software Biacore T200 BiaEvaluation versão 3.0 e ajustado ao modelo de ligação 1:1. DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE COM H3:HER3 EM MABS

[0236] A determinação de afinidade com HER3 em Mabs foi executada conforme segue. A triagem de Mabs pela ligação a antígeno HER3 ocorreu em duas etapas: uma captura indireta de Mabs na superfície de anticorpo policlonal específico para Fc anti-humano, seguida pela injeção de cinco concentrações de HER3. A superfície de Fc anti-humano foi preparada num chip de sensor GLC por acoplamento de amina. A superfície de chip de sensor GLC foi ativada por uma diluição 1:10 das soluções BioRad sNHS/EDC padrão injetadas por 140 s a 100 μl/min na diluição de analito (horizontal). Imediatamente após a ativação, 25 microg/ml de solução de Fc anti-humano em NaOAc 10 mM pH 4,5 foram injetados na direção de ligante (vertical) a uma taxa de fluxo de 25 microl/min por 240 s até aproximadamente 3000 unidades de ressonância (RUs) terem sido imobilizadas. Os grupos ativos remanescentes foram bruscamente arrefecidos por uma injeção por 140 s de etanolamina 1 M a 100 μl/min também na direção de analito. Mabs para análise foram indiretamente capturados na superfície anti-Fc inejtando-se 20 microg/ml de soluções na direção de ligante (vertical) a uma taxa de fluxo de 25 microl/min por 240 s. HER3 foi subsequentemente injetado na direção de analito (horizontal). Primeiramente, duas injeções de tampão por 30 s a 100 microl/min na direção de analito (horizontal) foram usadas para estabilizar a linha de base. Cinco concentrações de uma série de diluições de 3 vezes de cada H3 Mab, começando em 180 nM, com um controle de tampão branco foram, então, simultaneamente injetadas a 25 microl/min por 120 s com uma fase de dissociação de 10 minutos, resultando num conjunto de sensogramas de ligação com uma referência de tampão. As superfícies Fc anti-humano foram regeneradas para preparação para o ciclo de injeção seguinte por dois pulsos de 0,85% de ácido fosfórico por 18 s a 100 microl/min. Os sensogramas foram alinhados e duplamente referidos usando a injeção de branco de tampão e interspots, e os sensorgramas resultantes foram analisados usando software ProteOn Manager v3.1. Os sensogramas duplamente referidos foram ajustados ao modelo de ligação de Langmuir. DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE COM EP6B_B01:FAS

[0237] A determinação de afinidade com Fas foi executada conforme segue. Fas foi diluído em tampão acetato 10 mM pH 5,5 e diretamente imunizado por meio de acoplamento de amina num chip de sensor CM5 Series S. Isto resultou em aproximadamente 100 RUs de Fas imobilizado. A célula de fluxo de referência foi deixada vazia (bloqueada por etanolamina) para uso como um controle em branco. Fabs foram injetados sobre tanto a superfície de referência bloqueada por etanolamina quando a superfície de Fas para análise cinética usando cinética de ciclo único. Especificamente, cinco concentrações (5 nM e diluições de 2 vezes) de Fabs purificados (purificados por SEC preparatória) foram sequencialmente injetadas sobre ambas as células de fluxo ativas e de referência a 30 μl/min por 600 s com uma fase de dissociação de 3600 s. As superfícies de Fas foram regeneradas usando 2 ciclos de glicina 10 mM pH 1,5 por 120 s a 30 μl/min para preparar as superfícies para o ciclo de injeção seguinte. Pelo menos duas injeções de tampão simulado foram realizadas para cada injeção de analito a ser usada para referência. Os sensogramas de cinética de ciclo única resultante foram analisados usando o software Biacore T200 BiaEvaluation versão 3.0 e ajustado ao modelo de ligação

1:1. DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE COM CAT-2200:IL-17

[0238] A determinação de afinidade com IL-17 foi executada conforme segue. A superfície de IL-17A foi gerada usando um chip de sensor GLC ativado por uma diluição a 1:10 das soluções BioRad sNHS/EDC padrão injetadas por 140 s a 100 μl/min na direção de ligante (vertical). Imediatamente após a ativação, 1 a 4 microg/ml de solução de IL-17A em NaOAc 10 mM pH 4,5 foram injetados na direção de ligante (vertical) a uma taxa de fluxo de 25 ou 100 microl/min até aproximadamente 75 a 200 unidades de ressonância (RUs) terem sido imobilizadas. Os grupos ativos remanescentes foram bruscamente arrefecidos por uma injeção por 140 s de etanolamina 1 M a 100 μl/min também na direção de ligante. A triagem dos Fabs/Mabs para ligação a IL-17A foi realizada por injeção de CAT-2200 Fabs/Mabs purificados na direção de analito (horizontal). Primeiramente, duas injeções de tampão por 30 s a 100 microl/min na direção de analito (horizontal) foram usadas para estabilizar a linha de base. Cinco concentrações de uma série de diluições de 3 vezes de cada CAT-2200 Fab/Mab (60 nM, 20 nM, 6,7 nM, 2,2 nM, 0,74 nM) com um controle de tampão branco foram simultaneamente injetadas a 50 microl/min por 120 s com uma fase de dissociação de 10 ou 15 minutos, resultando num conjunto de sensogramas de ligação com uma referência de tampão. Os complexos CAT-2200:IL-17A na superfície de SPR são dissociados, e a superfície de IL-17A regenerada para preparação para o ciclo de injeção seguinte por dois pulsos de 0,85% de ácido fosfórico por 18 s a 100 microl/min. Os sensogramas foram alinhados e duplamente referidos usando a injeção de branco de tampão e interspots, e os sensorgramas resultantes foram analisados usando software ProteOn Manager v3.1. Os sensogramas duplamente referidos foram ajustados ao modelo de ligação de Langmuir.

RESULTADOS

[0239] Para Fabs/Mabs quiméricos projetados em que repetições foram conduzidas, o valor de KD relatado é o valor médio.

[0240] As afinidades de ligação a antígeno dos Fabs quiméricos projetados foram avaliadas em referência aos respectivos Fab lambda do tipo selvagem e Fab quimérico. Os resultados de SPR para Fabs quiméricos projetados são relatados na Tabela 6, em que os valores de KD determinados para os três sistemas testados são relatados nas colunas 2, (CAT-2200), 3 (H3) e 4 (EP6b_B01). Em todos os sistemas testados, a afinidade de ligação a antígeno do controle de Fab quimérico (quimera) foi muito similar ao controle de Fab lambda do tipo selvagem (WT). Os dados na Tabela 6 mostram que a afinidade de ligação a antígeno dos Fabs quiméricos projetados com base no anticorpo original CAT-2200 estava dentro de cerca de 2 vezes aquela do Fab lambda do tipo selvagem e do Fab quimérico. A afinidade de ligação a antígeno dos Fabs quiméricos projetados com base no anticorpo original H3 estava também dentro de cerca de 2 vezes aquela do Fab lambda do tipo selvagem e do Fab quimérico. Embora menos Fabs quiméricos projetados tenham sido testados no sistema EP6b_B01, a mesma tendência foi observada.

[0241] As afinidades de ligação a antígeno dos Mabs quiméricos projetados foram avaliadas em referência aos respectivos Mab lambda do tipo selvagem e Mab quimérico. Os resultados de SPR para Mabs quiméricos projetados são relatados na Tabela 7, em que os valores de KD para os dois sistemas testados são relatados nas colunas 2, (CAT-2200) e 3 (H3). Em ambos os sistemas testados, as afinidades de ligação a antígeno do controle de Mab lambda do tipo selvagem (WT) e controle de Mab quimérico correspondente estavam dentro de 1,5 vez entre si. Os Mabs quiméricos projetados foram capazes de se ligar a antígeno com um KD muito similar aos controles acima.

[0242] Conforme pode ser visto a partir das Tabelas 6 e 7, os Mabs ou Fabs quiméricos projetados que portam substituições de aminoácido correspondentes aos projetos de otimização de estabilidade foram capazes de se liga a antígeno com valores de KD comparáveis àqueles de Fabs e Mabs lambda do tipo selvagem, respectivamente. EXEMPLO 11: EFEITO DE PROJETOS DE OTIMIZAÇÃO DE ESTABILIDADE EM LIGAÇÃO A FCγR

[0243] Os anticorpos IgG1 do tipo selvagem são capazes de se ligar a receptores R de Fc gama R (FcγR) para mediar as funções efetoras, tal como ADCC e ADCP. A fim de determinar se as substituições de aminoácido dos projetos de otimização de estabilidade poderiam ter qualquer efeito sobre a capacidade de

Mabs quiméricos projetados de ligação a FcγR, a afinidade de um conjunto selecionado de Mabs quiméricos projetados (portando projetos 29, 37 e 39) com FcγR foi medida. As afinidades de ligação de Mabs quiméricos projetados a quatro tipos diferentes de receptores FcγR, CD16aV, CD32bF, CD32aR e CD32aH, foram avaliadas. Os Mabs quiméricos projetados foram purificados conforme descrito no Exemplo 5. As afinidades de ligação foram determinadas por SPR conforme segue.

[0244] Os ensaios de ressonância de plásmon de superfície foram executados usando instrumento BioRad ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories (Canadá) Ltd. (Mississauga, ON)) com tampão contínuo PBST a uma temperatura de 25C. Chips de sensor GLC, o kit de acoplamento de amina Biorad ProteOn (EDC, sNHS e etanolamina) e tampões acetato de sódio 10 mM foram adquiridos junto à Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON). Tampão contínuo PBS com 0,05% de Tween20 (PBST) foi adquirido junto à Teknova Inc. (Hollister, CA). Anticorpo Fc anti-humano policlonal de cabra foi adquirido junto à Jackson Immuno Research Laboratories Inc. (West Grove, PA). Antígenos: FcRn recombinante humano foi produzido internamente. Receptores FcγR recombinantes humanos: CD16aV, CD32bF, CD32aR e CD32aH foram expressos como construtos contendo um His10-tag na terminação C e purificados por cromatografia de afinidade com Ni seguida por remoção de His-tag e purificação por SEC. MAB: DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE COM FCγR

[0245] A determinação de afinidade com FcγR foi executada conforme segue. A triagem de Mabs pela ligação a vários receptores FcγR ocorreu em duas etapas: uma captura indireta de amostras de Mab na superfície de anticorpo policlonal específico para Fc anti-humano, seguida pela injeção de cinco concentrações de cada um dos receptores FcγR. A superfície de Fc anti-humano foi preparada num chip de sensor GLC por acoplamento de amina. A superfície de chip de sensor GLC foi ativada por uma diluição 1:10 das soluções BioRad sNHS/EDC padrão injetadas por 140 s a 100 μl/min na diluição de analito (horizontal). Imediatamente após a ativação, 25 microg/ml de solução de Fc anti-humano em NaOAc 10 mM pH 4,5 foram injetados na direção de analito a uma taxa de fluxo de 25 microl/min por 240 s até aproximadamente 4500 ou 2500 unidades de ressonância (RUs) terem sido imobilizadas. Os grupos ativos remanescentes foram bruscamente arrefecidos por uma injeção por 300 s de etanolamina 1 M a 30 μl/min também na direção de analito. Mabs para análise foram indiretamente capturados na superfície de Fc anti- humano injetando-se 10 microg/ml de soluções na direção de ligante (vertical) a uma taxa de fluxo de 25 microl/min por 240 s. Cada um dos receptores FcγR foi subsequentemente injetado na direção de analito (horizontal). Primeiramente, duas injeções de tampão por 30 s a 100 microl/min na direção de analito (horizontal) foram usadas para estabilizar a linha de base. Cinco concentrações de uma série de diluições de 3 vezes de cada um dos quatro receptores FcγR, começando em 10 μM, com um controle de tampão branco foram, então, simultaneamente injetadas a 50 microl/min por 120 s com uma fase de dissociação de 3 minutos, resultando num conjunto de sensogramas de ligação com uma referência de tampão. As superfícies Fc anti-humano foram regeneradas para preparação para o ciclo de injeção seguinte por dois pulsos de 0,85% de ácido fosfórico por 18 s a 100 microl/min. Os sensogramas foram alinhados e duplamente referidos usando a injeção de branco de tampão e interspots, e os sensorgramas resultantes foram analisados usando software ProteOn Manager v3.1. Os sensogramas duplamente referidos foram ajustados ao modelo de ligação de Langmuir ou foram ajustados ao modelo de ligação em equilíbrio para determinação de KD em regime permanente.

RESULTADOS

[0246] A Tabela 8 mostra os resultados de SPR para Mabs quiméricos projetados em dois sistemas (CAT-2200 e H3). Os valores de KD determinados para ligação ao receptor de CD16aV são relatados na coluna 2, para CD32bF na coluna 3, para CD32aR na coluna 4, para CD32aH na coluna 5. Para Mabs quiméricos projetados testados em que repetições foram conduzidas, o valor de KD relatado é o valor médio. Conforme pode ser visto a partir da Tabela 8, os valores de KD medidos para os Mabs quiméricos projetados foram comparáveis àqueles para os respectivos controles de Mab lambda do tipo selvagem (WT) para os receptores FcγR testados. EXEMPLO 12: EFEITO DE PROJETOS DE OTIMIZAÇÃO DE

ESTABILIDADE EM LIGAÇÃO A FCRN

[0247] Os anticorpos IgG1 do tipo selvagem são capazes de ligação a receptores FcRn (receptores neonatais), resultando em sua meia-vida longa. A fim de determinar se as substituições de aminoácido dos projetos de otimização de estabilidade tiveram qualquer efeito sobre a capacidade dos Mabs quiméricos projetados de ligação a FcRn, a afinidade de um conjunto selecionado de Mabs quiméricos projetados (portando projetos 29, 37 e 39) com FcRn foi medida. Os Mabs quiméricos projetados foram purificados conforme descrito no exemplo 5 e as afinidades de ligação foram determinadas por SPR conforme segue. DETERMINAÇÃO DE AFINIDADE COM MAB:FCRN

[0248] A determinação de afinidade com FcRn foi executada conforme segue. A superfície de FcRn foi gerada usando um chip de sensor GLC ativado por uma diluição a 1:10 das soluções BioRad sNHS/EDC padrão injetadas por 140 s a 100 μl/min na direção de ligante (vertical). Imediatamente após a ativação, 10 microg/ml de solução de FcRn em NaOAc 10 mM pH 4,5 foram injetados na direção de ligante (vertical) a uma taxa de fluxo de 25 microl/min por 120 s até aproximadamente 2000 unidades de ressonância (RUs) terem sido imobilizadas. Os grupos ativos remanescentes foram bruscamente arrefecidos por uma injeção por 140 s de etanolamina 1 M a 30 μl/min também na direção de ligante. O tampão contínuo usado na superfície de FcRn foi PBST pH 5,8. A triagem dos Mabs para ligação a FcRn foi realizada por injeção de Mabs purificados na direção de analito (horizontal). Primeiramente, duas injeções de tampão por 30 s a 100 microl/min na direção de analito (horizontal) foram usadas para estabilizar a linha de base. Cinco concentrações de uma série de diluições de 3 vezes de cada Mab, começando em 100 nM, com um controle de tampão branco foram simultaneamente injetadas a 50 microl/min por 120 s com uma fase de dissociação de 10 minutos, resultando num conjunto de sensogramas de ligação com uma referência de tampão. Os complexos Mab:FcRn na superfície de SPR são dissociados, e a superfície de FcRn regenerada para preparação para o ciclo de injeção seguinte por dois pulsos de PBST pH 7,4 por 18 s a 100 microl/min. Os sensogramas foram alinhados e duplamente referidos usando a injeção de branco de tampão e interspots, e os sensorgramas resultantes foram analisados usando software ProteOn Manager v3.1. Os sensogramas duplamente referidos foram ajustados ao modelo de ligação de Langmuir.

[0249] A Tabela 8 mostra os resultados de SPR para Mabs quiméricos projetados em dois sistemas (CAT-2200 e H3). Os valores de KD determinados para ligação a FcRn são relatados na coluna 6. Para Mabs quiméricos projetados testados em que repetições foram conduzidas, o valor de KD relatado é o valor médio. Conforme pode ser visto a partir da Tabela 8, a afinidade de ligação de Mabs quiméricos projetados testados, tanto CAT-2200 quanto H3, para FcRn está dentro de 1,5 a 2 vezes aquela dos respectivos controles de Mab lambda do tipo selvagem (WT). EXEMPLO 13: EFEITO DE PROJETOS DE OTIMIZAÇÃO DE

ESTABILIDADE SOBRE ESTABILIDADE DE BANCADA DE MABS QUIMÉRICOS PROJETADOS SELECIONADOS

[0250] A estabilidade de Mabs quiméricos projetados ao longo do tempo foi medida para Mabs quiméricos projetados portando projetos de otimização de estabilidade 29, 37 e 39, conforme descrito abaixo. Mabs quiméricos projetados foram testados nos anticorpos originais CAT-2200 e H3.

[0251] Os Mabs quiméricos projetados foram concentrados até 5 mg/ml em PBS pH 7,4 e incubados a 37 °C por 30 dias. As amostras foram tomadas em pontos no tempo nos dias 0, 6, 10, 20 e 30. Cada amostra foi centrifugada e o sobrenadante avaliado por análise por UPLC-SEC e Caliper. A análise por UPLC-SEC e Caliper de amostras nos dias 0, 6, 10, 20 e 30 foi realizada assim como quantificação de proteína por A280 nm (NanoDrop) a fim de avaliar quaisquer mudanças na monodispersidade das amostras. UPLC-SEC foi realizado conforme descrito no Exemplo 6.

[0252] A Figura 10 representa perfis de UPLC-SEC típicos observados nos dias 0, 20 e 30 de incubação a 37 °C para estes Mabs quiméricos projetados, num exemplo de Mab lambda do tipo selvagem H3 e um Mab quimérico projetado H3 com substituições de aminoácido correspondentes ao projeto 37. Os painéis A e B contrastam os perfis de UPLC-SEC no dia 0, os painéis C e D no dia 20 e E e F no dia 30, para controle de Mab do tipo selvagem e projeto 37 no sistema H3, respectivamente. Os perfis de UPLC-SEC observados demonstraram a ausência de qualquer mudança na monodispersidade de moléculas de Mab durante o período de incubação. A medição de concentração de proteína não refletiu nenhuma perda de proteína a qualquer agregação potencial (dados não fornecidos). EXEMPLO 14: AVALIAÇÃO DE PAREAMENTO PREFERENCIAL ENTRE

CADEIAS PESADA E LEVE EM ANTICORPOS BIESPECÍFICOS QUIMÉRICOS PROJETADOS

[0253] As cadeias leves quiméricas podem ser úteis na preparação de anticorpos biespecíficos, particularmente em casos em que um ou ambos os anticorpos originais têm uma cadeia leve lambda. Este exemplo descreve o uso de projetos de otimização de estabilidade para preparar anticorpos biespecíficos, em que um anticorpo original do anticorpo biespecífico tem uma cadeia leve lambda.

[0254] Os projetos de otimização de estabilidade usados foram aqueles correspondentes aos projetos 29 e 39, descritos na Tabela 3. Dois sistemas de anticorpo biespecífico foram testados. O primeiro foi um anticorpo biespecífico CAT- 2200/D3H44, em que o anticorpo original CAT-2200 tem uma cadeia leve lambda e o anticorpo D3H44 tem uma cadeia leve kappa. O segundo sistema foi um anticorpo biespecífico H3/pertuzumab, em que o anticorpo H3 tem uma cadeia leve lambda e o anticorpo pertuzumab tem uma cadeia leve kappa. CAT-2200 e H3 são anticorpos humanos, enquanto pertuzumab e D3H44 são anticorpos humanizados. Neste sistema, as cadeias leves dos anticorpos CAT-2200 e H3 foram construídas como cadeias leves quiméricas VL-CK, conforme descrito no Exemplo 3.

[0255] Os anticorpos biespecíficos foram preparados usando substituições de aminoácido nas regiões Fab (projetos de pareamento de cadeia leve) dos anticorpos originais para acionar o pareamento. Tais substituições de aminoácido são conhecidas na técnica e descritas em diversas publicações, incluindo as Publicações de Patente Internacional nos WO 2014/082179 e WO 2015/181805. Dois tais projetos foram testados neste exemplo, conforme mostrado na Tabela A abaixo: TABELA A: PROJETOS DE PAREAMENTO DE CADEIA LEVE KAPPA- KAPPA (NUMERAÇÃO DE AMINOÁCIDO DE ACORDO COM KABAT) Proj Anticorpo 1 Anticorpo 2 eto H1 L1 H2 L2

906 A139W_L143E_K F116A_Q124R_L1 Q179K Q124E_L135W_ 0- 145T_Q179E 35V_T178R Q160E_T180E 975 6 982 Q39R_H172R_Q1 Q38E_Q124E_Q1 Q39E_L143E_K Q38R_Q124R_Q 0- 79K 60E_T180E 145T_Q179E 160K_T178R 982 3

[0256] As substituições de aminoácido foram também introduzidas nos domínios CH3 das cadeias pesadas para promover heterodimerização das cadeias pesadas (projetos de pareamento de cadeia pesada). Estas substituições de aminoácido também foram descritas na técnica, incluindo nas Publicações de Patente Internacional nos WO 2012/058768 e WO2013/063702. Um projeto exemplificativo foi testado neste exemplo, conforme mostrado na Tabela B abaixo: TABELA B: PROJETOS DE PAREAMENTO DE CADEIA PESADA (POSIÇÕES DE AMINOÁCIDOS NUMERADAS DE ACORDO COM O SISTEMA DE NUMERAÇÃO EU) Cadeia Pesada A T350V L351Y F405A Y407V Cadeia Pesada B T350V T366L K392L T394W

[0257] As quatro cadeias de polipeptídeo de cada anticorpo biespecífico foram coexpressas e o aumento na quantidade de anticorpo biespecífico desejado determinado no ensaio SMCA descrito abaixo. FORMATO DE ENSAIO (SMCA)

[0258] O ensaio é baseado na coexpressão das quatro cadeias dos dois anticorpos originais (as cadeias pesada e leve de anticorpo original 1, H1 e L1, respectivamente, com as cadeias pesada e leve de anticorpo original 2, H2 e L2, respectivamente) e detecção da presença de anticorpo biespecífico corretamente formado usando espectrometria de massa (LC-MS). A Figura 11 fornece uma representação esquemática das quatro cadeias de polipeptídeo iniciais e os produtos potenciais resultantes da coexpressão destas cadeias de polipeptídeo iniciais na ausência de pareamento preferencial entre cadeias pesada e leve (em ambas as regiões Fab e Fc) dos pares de heterodímeros. Dois construtos de cadeia pesada de comprimento completo foram coexpressos com dois construtos de cadeia leve únicos, produzindo dez espécies de anticorpo possíveis (também denominadas espécies de Ab): H1L1_H1L1, H1L2_H1L2, H1L1_H1L2, H2L1_H2L1, H2L2_H2L2, H2L1_H2L2, H1L1_H2L1, H1L2_H2L2, H1L2_H2L1 e H1L1_H2L2. A espécie H1L1_H2L2 é o anticorpo biespecífico corretamente pareado (Figura 11, espécie A). Quatro tipos de espécies de meio anticorpo (meio Ab) são também possíveis, conforme mostrado na Figura 11. Quando as modificações são introduzidas na região Fc para promover heterodimerização das cadeias pesadas exclusivas, o número de espécies de anticorpo potenciais diminui (isto é, menos espécies E a J são observadas). A especificidade de pareamento relativa em termos de quantidade de espécies de anticorpo biespecífico corretamente pareadas H1L1_H2L2 vs. outra espécie foi determinada usando LC- MS após a purificação e desglicosilação de proteína A (pA). Quando possível, as cadeias foram deixadas sem etiqueta, contanto que todas as espécies de anticorpo e espécies de meio Ab seja diferente entre si em pelo menos 50 Da. Quando diferenças de massa excluem esta possibilidade, a etiqueta FLAG N-terminal foi adicionada às cadeias leves a fim de fornecer diferenciação de massa suficiente entre espécies.

SEQUÊNCIAS DE POLIPEPTÍDEOS

[0259] As sequências de proteínas das cadeias pesadas CAT-2200 e H3 e cadeias leves quiméricas VL-CK foram obtidas conforme descrito no Exemplo 3.

[0260] As sequências de proteínas da cadeia leve (SEQ ID NO:13) e cadeia pesada (SEQ ID NO:12) de D3H44 corresponderam àquelas na entrada de PDB 1JPT e foram traduzidas reversamente em DNA, submetidas a otimização de códon para expressão de mamífero e síntese de gene (SEQ ID NO:28 e 27, respectivamente). As sequências de proteínas da cadeia leve (número de acesso ao GenBank HC359025.1, SEQ ID NO:11) e cadeia pesada (número de acesso ao GenBank HC359024.1, SEQ ID NO:10) de pertuzumab foram reversamente traduzidas em DNA, submetidas a otimização de códon e síntese de gene (SEQ ID NOs: 26 e 25, respectivamente). As sequências de polipeptídeos e DNA destas cadeias pesada e leve de anticorpo são mostradas na Tabela 2.

[0261] Os conjuntos a seguir de construtos de controle de anticorpo quiméricos biespecíficos foram preparados para avaliar a quantidade de pareamento de cadeia leve intrínseca a cada sistema biespecífico.

[0262] A. Um conjunto de construtos que codificam o anticorpo biespecífico quimérico H3/pertuzumab de controle foram preparados (correspondendo ao anticorpo biespecífico (1) na Tabela 9):

[0263] ● Um construto que codifica cadeia pesada de H3 de comprimento completo (H1), incluindo os projetos de pareamento de cadeia pesada para a cadeia A ou B, e um construto que codifica a cadeia leve quimérica VL-CK de H3 (L1).

[0264] ● Um construto que codifica cadeia pesada de pertuzumab de comprimento completo (H2), com projetos de pareamento de cadeia pesada para a cadeia complementar a H1, e um construto que codifica a cadeia leve kappa de pertuzumab (L2).

[0265] B. Um conjunto de construtos que codificam anticorpo biespecífico quimérico CAT-2200/D3H44 de controle foi preparado (correspondendo aos anticorpos biespecíficos (2) e (3) na Tabela 9):

[0266] ● Um construto que codifica cadeia pesada de CAT-2200 de comprimento completo (H1), incluindo os projetos de pareamento de cadeia pesada para a cadeia A ou B, e um construto que codifica a cadeia leve quimérica VL-CK de CAT-2200 (L1).

[0267] ● Um construto que codifica cadeia pesada de D3H44 de comprimento completo (H2), com projetos de pareamento de cadeia pesada para a cadeia complementar a H1, e um construto que codifica a cadeia leve kappa de D3H44 (L2).

[0268] Os seguintes construtos adicionais foram preparados com base nos controles de anticorpo quimérico biespecífico descritos acima:

[0269] a. Controles de projeto de otimização – estes construtos são similares aos controles de anticorpo quimérico biespecífico, mas incluem um projeto de otimização de estabilidade. Estes controles correspondem a anticorpos biespecíficos (4) a (7) na Tabela 9.

[0270] b. Anticorpos quiméricos biespecíficos projetados – estes construtos são similares aos controles de anticorpo quimérico biespecífico, mas incluem um projeto de otimização de estabilidade e um projeto de pareamento de cadeia leve.

Estes construtos correspondem a anticorpos biespecíficos (8) a (15) na Tabela 9.

[0271] A Figura 12 fornece uma estrutura de anticorpo quimérico biespecífico representativo, mostrando os diferentes tipos de modificações incluídos num anticorpo quimérico biespecífico projetado.

[0272] Os construtos que codificam as cadeias leves quiméricas Vlambda- Ckappa de CAT-2200 e H3, cadeias leves kappa de D3H44 e pertuzumab e respectivas cadeias pesadas de IgG, que compreendem modificações de aminoácido de acordo com os projetos, foram preparados conforme segue. As sequências de cadeia leve de CAT-2200, H3, D3H44 e pertuzumab foram preparadas conforme descrito no Exemplo 3 com modificações de aminoácido de acordo com o projeto de otimização de estabilidade e/ou o projeto de pareamento de cadeia leve kappa-kappa para promover a heterodimerização de cadeias leves. As sequências de cadeia pesada de comprimento completo para estes anticorpos foram criadas conforme descrito no Exemplo 3 com modificações de aminoácido para promover a heterodimerização das cadeias pesadas. Destaca-se que o resíduo de lisina de cadeia pesada C-terminal canônico foi removido a fim de impedir a heterogeneidade de sinal de LC-MS devido ao recorte de lisina C-terminal (Lawrence W. Dick Jr. et al., Biotechnol. Bioeng. (2008) 100:1132-43). Em alguns casos, uma etiqueta FLAG foi adicionada à cadeia leve a fim de obter uma diferença de 50 Da entre todas as espécies de anticorpo e meio Ab, em cujo caso os insertos de vetor de cadeia leve consistiram num a 5’-sítio de corte EcoRI – peptídeo de sinalização HLA-A – etiqueta FLAG – clone de Ig de cadeia leve – “parada de TGA ou TAA” – sítio de corte BamH1-3’.

[0273] Os anticorpos biespecíficos quiméricos com projetos de otimização de estabilidade foram apenas também preparados a fim de ser capaz de avaliar se tais projetos têm qualquer efeito no pareamento preferencial exercido pelo projeto de pareamento de cadeia leve introduzido. TRANSFECTION, EXPRESSION AND PURIFICATION OF BISPECIFIC

CHIMERIC ANTIBODY CONSTRUCTS

[0274] Os construtos que codificam as duas cadeias pesadas e as duas cadeias leves de cada sistema de anticorpo biespecífico, em que os conjuntos de cadeia leve são cadeia leve de quimera Vlambda-Ckappa e cadeia leve kappa, ou cadeia leve de quimera Vlambda-Ckappa com projeto de otimização de estabilidade e cadeia leve kappa com ou sem projeto kappa-kappa introduzido, foram transfectados em células CHO-3E7 conforme anteriormente descrito no Exemplo 4, em que um volume total de 50 ml foi transfectado com um total de 50 μg de DNA em razão de 15:15:35:35 de H1:H2:L1:L2.

[0275] O meio de cultura foi coletado por centrifugação e filtrado a vácuo usando um filtro de 0,22 μm Stericup (Millipore número de catálogo SCGPU05RE). O meio de cultura filtrado foi, então, purificado usando resina MabSelect SuRe de proteína A (GE Healthcare no 17-5438-02) que foi anteriormente equilibrado com PBS pH 7,4. As espécies de anticorpo ligadas à resina foram, então, lavadas com PBS pH 7,4 e eluídas com tampão citrato de sódio 100 mM pH 3,6. As espécies de anticorpo eluídas foram concentradas e tiveram o tampão trocado em PBS pH 7,4 por centrifugação usando filtro de centrífuga Amicon ultra 15 Ultracel 10K (Millipore no UFC901024). Parte das amostras de anticorpo biespecífico expressas foi alternativamente purificada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 3 para a purificação de construto de Mab (modo a batelada). As amostras de SMCA purificadas com proteína A resultantes contendo as espécies de anticorpo foram avaliadas por Caliper antes da desglicosilação e LC-MS.

MÉTODO DE ESPECTROMETRIA DE MASSA

[0276] O grau de pareamento preferencial de heterodímeros acionados pelos projetos kappa-kappa no contexto de um anticorpo biespecífico foi avaliado usando espectrometria de massa após purificação por proteína A e desglicosilação não desnaturante. Como o anticorpo biespecífico continha glicanos ligados a N de Fc apenas, as amostras de SMCA foram tratadas com apenas uma enzima, N- glicosidase F (PNGase-F). As amostras purificadas foram desglicosiladas com PNGaseF conforme segue: 0,2 U de PNGaseF/μg de anticorpo em Tris-HCl 50 mM pH 7,0, incubação de um dia para outro a 37 °C, concentração final de proteína de 0,5 mg/ml. Após a desglicosilação, as amostras foram armazenadas a 4°C antes da análise por LC-MS.

[0277] As amostras desglicosiladas foram analisadas por LC-MS intacto usando um sistema de HPLC Agilent 1100 acoplado a um espectrômetro de massa LTQ-Orbitrap XL (ThermoFisher Scientific) por meio de uma fonte de eletroaspersão Ion Max (ThermoFisher). As amostras (5 μg) foram injetadas numa coluna de fase reversa 2,1 x 30 mm Poros R2 (Applied Biosystems) e separadas usando as seguintes condições de gradiente: 0 a 3 min: 20% de solvente B; 3 a 6 min: 20 a 90% de solvente B; 6 a 7 min: 90 a 20% de Solvente B; 7 a 9 min: 20% de solvente B. O solvente A foi ácido fórmico aquoso a 0,1% desgaseificado e o solvente B foi acetonitrila desgaseificada. A taxa de fluxo foi 3 ml/min. O fluxo foi dividido após a coluna para direcionar 100 μl/ml na interface de eletroaspersão. A coluna foi aquecida até 82,5 °C e solventes foram aquecidos em pré-coluna até 80 °C para melhorar o formato de pico de proteína. Antes da análise, o LTQ-Orbitrap XL foi calibrado usando solução de calibração LTQ Positive Ion ESI da ThermoFisher Scientific (cafeína, MRFA e Ultramark 1621) e ajustado usando soluções a 10 mg/ml de CsI. A voltagem de cone (ambiente de fragmentação de fonte) foi aproximadamente 48 V, a solução de FT foi 7500 e a faixa de varredura foi m/z 400 a 4000. O LTQ-Orbitrap XL foi ajustado para detecção ideal de proteínas maiores (>50 kDa). O sistema de LC-MS foi avaliado para análise de amostra de IgG usando um padrão de IgG desglicosilada (padrão de IgG Waters) assim como uma mistura padrão de mAb desglicosilada (25:75 de meio mAb:mAb de comprimento completo).

[0278] As faixas contendo íons multiplamente carregados dos anticorpos de tamanho completo e os meios anticorpos (tipicamente m/z 2000 a 3800 e m/z 1400 a 2000, respectivamente) foram separadamente desconvolucionados em perfis de peso molecular usando módulo MaxEnt 1 de MassLynx, o software de controle de instrumento e análise de dados (Waters). Brevemente, os dados de LC-MS de proteína bruta foram primeiramente abertos em QualBrowser, o módulo de visualização de espectro de Xcalibur (Thermo Scientific) e convertidos para serem compatíveis com MassLynx usando Databridge, um programa de conversão de arquivo fornecido por Waters. Os espectros de proteína convertidos foram visualizados no módulo Spectrum de MassLynx e desconvolucionados usando MaxEnt 1. A quantidade evidente de cada espécie de anticorpo em cada amostra foi determinada a partir de suas alturas de pico nos perfis de peso molecular resultantes.

RESULTADOS

[0279] Em geral, na maioria dos casos, os tratamentos de desglicosilação resultaram na capacidade de identificar todas as possíveis espécies de anticorpo diferentes identificadas por LC-MS. Em muitos casos, cada espécie de anticorpo foi representada por um único pico de LC-MS. As exceções incluíram picos laterais que provavelmente também correspondem às espécies biespecíficas desejadas (possivelmente adutos ou heterogeneidade na clivagem de peptídeos líder); entretanto, devido ao fato de que a identidade das espécies resultantes nos picos laterais não foi clara, estes picos laterais não foram considerados nas contribuições às espécies biespecíficas. As espécies biespecíficas desejadas, H1L1_H2L2, não podem ser, de modo geral, distinguidas experimentalmente do tipo mal pareado, H1L2_H2L1, com base em LC-MS. Como tal, quando o teor de anticorpo biespecífico é relatado nas tabelas, não pode ser completamente excluído que o mesmo não contém este tipo de espécies mal pareadas. Entretanto, o teor muito baixo observado para espécies tais como H1L2_H1L2 e H2L1_H2L1, assim como os meio anticorpos H1L2 e H2L1, é indicativo que apenas contaminação menor, caso haja, das espécies biespecíficas com espécies mal pareadas ocorreu.

[0280] Os resultados de análise por LC-MS são relatados na Tabela 9. Na coluna 8, os cálculos sobre a quantidade de anticorpo biespecífico corretamente pareado (H1L1_H2L2 e H1L2_H2L1) como uma percentagem de todas as espécies de anticorpo presentes (a Figura 11 representa todas as espécies possíveis mediante coexpressão de quatro cadeias: H1, L1 H2, L2, espécies A a J). Na coluna 6, os cálculos da quantidade de anticorpo biespecífico corretamente pareado (H1L1_H2L2 e H1L2_H2L1**) como uma porcentagem de todas as espécies de anticorpo de tamanho completo apenas são fornecidos, para medir pareamento que exclui espécies de meio anticorpo. A comparação da quantidade de anticorpos biespecíficos quiméricos corretamente pareados, com projetos de otimização de estabilidade sozinhos ou com projeto de otimização de estabilidade em combinação com projetos de pareamento de cadeia leve kappa-kappa (anticorpo biespecífico quimérico projetado), àquela do controle de anticorpo biespecífico quimérico é relatada nas colunas 7 e 9, respectivamente. No caso do sistema de H3/pertuzumab, a comparação equivalente não foi possível, devido ao fato de que a etiqueta FLAG foi necessária na cadeia leve de pertuzumab a fim de obter uma diferença de 50 Da entre todos as espécies de anticorpo e meio: Ab. Para este sistema, uma comparação foi realizada a um construto similar (isto é, um controle de anticorpo biespecífico quimérico contendo uma etiqueta FLAG na cadeia leve de pertuzumab) indicado por “*” próximo aos valores relatados. As espécies mal pareadas predominantes presentes nas amostras biespecíficas analisadas foi H1H2L1L1, cuja quantidade como uma porcentagem de todas as espécies de anticorpo presentes na amostra é relatada na coluna 10.

[0281] Em ambos os sistemas, o teor de anticorpo biespecífico H3/pertuzumab e CAT-2200/D3H44 diminuiu até um pequeno grau mediante introdução do projeto de otimização de estabilidade no anticorpo quimérico biespecífico (coluna 9) em comparação com o controle de Ab quimérico biespecífico. Nos sistemas de H3/pertuzumab e CAT-2200/D3H44, o teor de anticorpo biespecífico do anticorpo quimérico biespecífico projetado, isto é, com um projeto de pareamento de cadeia leve kappa-kappa juntamente com um projeto de otimização de estabilidade, conforme definido na coluna 8, foi amplamente comparável através de 2 conjuntos de projetos de otimização de estabilidade testados e 2 conjuntos de projetos de pareamento de cadeia leve kappa-kappa e estava na faixa de 64,6 a 86,4%. Isto se traduziu num aumento de teor de espécies biespecíficas desejadas em comparação com aquele de controle quimérico biespecífico de 25,3 a 36% em sistema de H3/pertuzumab e 46,3 a 80,4% em sistema de CAT-2200/D3H44 (coluna 9). O tipo específico de projeto kappa-kappa (isto é, projeto 9060-9756 ou 9820-9823) foi predominantemente responsável pela variação observada (faixa) de valores no sistema de CAT-2200/D3H44. Uma faixa similar de melhora em teor biespecífico destes projetos, conforme indicado na coluna 7, reflete o baixo teor de espécies de meio anticorpo em amostras testadas.

[0282] Os dados na Tabela 9 demonstram que os projetos de pareamento de cadeia leve kappa-kappa testados foram capazes de promover um aumento substancial em teor de anticorpo biespecífico de anticorpos quiméricos biespecíficos projetados em comparação com aquele do controle de anticorpo quimérico biespecífico. Isto indica que os projetos de otimização de estabilidade na cadeia leve quimérica Vlambda-Ckappa são compatíveis com os projetos de pareamento de cadeia leve kappa-kappa testados aqui.

[0283] Todas as referências, patentes expedidas, pedidos de patente e números de acesso a sequência (por exemplo, números de acesso ao Genbank) citados dentro do corpo do presente relatório descritivo estão incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade, para todos os propósitos.

TABELA 1. NUMERAÇÃO DE KABAT DAS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DE DOMÍNIO VARIÁVEL DE CADEIA LEVE DE H3, EP6B_B01 E CAT-2200

Tabela 1 Tabela 1 Origem de cadeia leve Origem de cadeia leve Numer Numer EP6b_B CAT- EP6b_B CAT- ação H3 ação H3 01 2200 01 2200 de (SEQ ID de (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID KABA No. 3) KABA No. 3) No. 6) No. 9) No. 6) No. 9)

T T 1 Q Q N 26 T N S 2 S S F 27 S S S 3 A V M 27A S S G 4 L L L 27B D N S 5 T T T 27C V - - 6 Q Q Q 28 G I L 7 P P P 29 G G A 8 A P H 30 Y R N 9 S S S 31 N Y Y 10 - - - 32 F P Y 11 V V V 33 V V V 12 S S S 34 S N Q 13 G E E 35 W W W 14 S A S 36 Y Y Y 15 P P P 37 Q Q Q 16 G R G 38 Q Q Q 17 Q Q K 39 H L R 18 S T T 40 P P P 19 I V V 41 G G G 20 T T T 42 K K S 21 I I I 43 A A S 22 S S S 44 P P P 23 C C C 45 K K T 24 T S T 46 L L I 25 G G R 47 M L V

T T 48 I I I 71 A A A 49 Y Y F 72 S S S 50 D S A 73 L L L 51 V D N 74 I A T 52 S N N 75 I I I 53 D L Q 76 S R S 54 R R R 77 G D G 55 P F P 78 L L L 56 S S S 79 Q L K 57 G G G 80 A S T 58 V V V 81 D E E 59 S P P 82 D D D 60 D D D 83 E E E 61 R R R 84 A A A 62 F F F 85 D D D 63 S S S 86 Y Y Y 64 G G G 87 Y Y Y 65 S S S 88 C C C 66 K K I 89 S S Q 66A - - D 90 S T T 66B - - S 91 Y W Y 67 S S S 92 G D D 68 G G S 93 S D P 69 N T N 94 S T Y 70 T T S 95 S L S

Tabela 1 Origem de cadeia leve Numer EP6b_B CAT- ação H3 01 2200 de (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID KABA No. 3) No. 6) No. 9)

T 95A T E - 95B H G - 96 V W V 97 I V V 98 F F F 99 G G G 100 G G G 101 G G G 102 T T T 103 K K K 104 V V L 105 T T T 106 V V V 106A L L L 107 - - - 108 R R R 109 T T T “-“ indica nenhum resíduo correspondente

TABELA 2. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDO E DNA DE CONSTRUTOS DE CADEIA PESADA DO TIPO SELVAGEM, LEVE E LEVE QUIMÉRICA VλΛ-Cκ DE H3, EP6b_B01 E CAT-2200

SE DESCRIÇÃO SEQUÊNCIA Q ID

NO 1 Fab de cadeia QVQLQESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQ pesada de H3 APGKGLEWVANINRDGSASYYVDSVKGRFTISRDDAKNSLY (Limites de LQMNSLRAEDTAVYYCARDRGVGYFDLWGRGTLVTVSSAS domínio: VH; TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS Q1-S118; CH1; GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV A119-V216, NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT Dobradiça (parcial); E217- T226) 2 Cadeia leve QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNFVSWYQQH deH3 (lambda) PGKAPKLMIYDVSDRPSGVSDRFSGSKSGNTASLIISGLQAD (Limites de DEADYYCSSYGSSSTHVIFGGGTKVTVLGQPKAAPSVTLFP domínio: VL; PSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVE Q1-L111, CL; TTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGS G112-S217) TVEKTVAPTECS 3 Cadeia leve QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNFVSWYQQH quimérica Vλ- PGKAPKLMIYDVSDRPSGVSDRFSGSKSGNTASLIISGLQAD Cκ de H3 DEADYYCSSYGSSSTHVIFGGGTKVTVLRTVAAPSVFIFPPS (Limites de DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE domínio: VL; SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS Q1-L111, CL; SPVTKSFNRGEC R112-C218) 4 Fab de cadeia QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGASISANSYYGVWVRQ pesada de SPGKGLEWVGSIAYRGNSNSGSTYYNPSLKSRATVSVDSSK EP6b_B01 NQVSLRLTSVTAADTALYYCARRQLLDDGTGYQWAAFDVW (Limites de GQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD domínio: VH; YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP Q1-S132; CH1; SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT A133-V230, Dobradiça (parcial); E231- T240) 5 Cadeia leve de QSVLTQPPSVSEAPRQTVTISCSGNSSNIGRYPVNWYQQLP

EP6b_B01 GKAPKLLIYSDNLRFSGVPDRFSGSKSGTTASLAIRDLLSED (lambda) EADYYCSTWDDTLEGWVFGGGTKVTVLGQPKAAPSVTLFP (Limites de PSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVE domínio: VL; TTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGS Q1-L110, CL; TVEKTVAPTECS G111-S216) 6 Cadeia leve QSVLTQPPSVSEAPRQTVTISCSGNSSNIGRYPVNWYQQLP quimérica Vλ- GKAPKLLIYSDNLRFSGVPDRFSGSKSGTTASLAIRDLLSED Cκ de EADYYCSTWDDTLEGWVFGGGTKVTVLRTVAAPSVFIFPPS EP6b_B01 DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE (Limites de SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS domínio: VL; SPVTKSFNRGEC Q1-L110, CL; R111-C217) 7 Fab de cadeia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQA pesada PGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYL deCAT-2200 QMNSLRAEDTAVYYCARDLIHGVTRNWGQGTLVTVSSAST (limites de KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPQPVTVSWNS domínio: VH; GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV E1-S118, CH1; NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT A119-V216, Dobradiça (parcial); E217- T226) 8 Cadeia leve de NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSLANYYVQWYQQR CAT-2200 PGSSPTIVIFANNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKT (lambda) EDEADYYCQTYDPYSVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPP (Limites de SSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVET domínio: VL; TTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGST N1-L110, CL; VEKTVAPTECS G111-S216) 9 Cadeia leve NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSLANYYVQWYQQR quimérica Vλ- PGSSPTIVIFANNQRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKT Cκ de CAT- EDEADYYCQTYDPYSVVFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSD 2200 (limites EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES de domínio: VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS VL; N1-L110, PVTKSFNRGEC CL; R111- C217) 10 Fab de cadeia EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQA pesada de PGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYL pertuzumab QMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSAS

(Limites de TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS domínio: VH; GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV E1 – S119, NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT CH1; A120 – V217, Dobradiça (parcial); E218 – T227) 11 Cadeia leve de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPG pertuzumab KAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF (kappa) ATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL (Limites de KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE domínio: VL; QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT D1 – K107, CL; KSFNRGEC R108 – C214) 12 Fab de cadeia EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKEYYMHWVRQA pesada de PGKGLEWVGLIDPEQGNTIYDPKFQDRATISADNSKNTAYLQ D3H44 MNSLRAEDTAVYYCARDTAAYFDYWGQGTLVTVSSASTKG (Limites de PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL domínio: VH; TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK E1-S117, CH1; PSNTKVDKKVEPKSCDKTHT A118-V215, Dobradiça (parcial); E216- T225) 13 Cadeia leve de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIKSYLNWYQQKPG D3H44 (kappa) KAPKVLIYYATSLAEGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDF (Limites de ATYYCLQHGESPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL domínio: VL; KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTE D1-K107, C; QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT R108-C214) KSFNRGEC 14 Fc de IgG1 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV (Limites de VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV domínio:Dobra VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR diça (parcial); EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG D1 - P10, CH2; QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC A11 - K120, SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK CH3; G121 - K227) 15 Fc de IgG1 GATAAGACCCACACCTGCCCTCCCTGTCCAGCTCCAGAA

CTGCTGGGAGGACCTAGCGTGTTCCTGTTTCCCCCTAAG CCAAAAGACACTCTGATGATTTCCAGGACTCCCGAGGTG ACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCTCACGAGGACCCCGAA GTGAAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAAGTGCAT AATGCTAAGACAAAACCAAGAGAGGAACAGTACAACTCCA CTTATCGCGTCGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGG ACTGGCTGAACGGGAAGGAGTATAAGTGCAAAGTCAGTA ATAAGGCCCTGCCTGCTCCAATCGAAAAAACCATCTCTAA GGCCAAAGGCCAGCCAAGGGAGCCCCAGGTGTACACAC TGCCACCCAGCAGAGACGAACTGACCAAGAACCAGGTGT CCCTGACATGTCTGGTGAAAGGCTTCTATCCTAGTGATAT TGCTGTGGAGTGGGAATCAAATGGACAGCCAGAGAACAA TTACAAGACCACACCTCCAGTGCTGGACAGCGATGGCAG CTTCTTCCTGTATTCCAAGCTGACAGTGGATAAATCTCGA TGGCAGCAGGGGAACGTGTTTAGTTGTTCAGTGATGCAT GAAGCCCTGCACAATCATTACACTCAGAAGAGCCTGTCC

CTGTCTCCCGGCAAA 16 Fab de cadeia CAGGTCCAGCTGCAGGAATCTGGCGGAGGACTGGTCAAA pesada de H3 CCTGGAGGCTCTCTGAGACTGTCATGTGCTGCTAGTGGC

TTTACTTTCAGCTCCTACTGGATGTCTTGGGTGCGACAGG CCCCCGGCAAGGGACTGGAGTGGGTCGCAAACATCAATA GAGACGGATCTGCCAGTTACTATGTGGATAGCGTCAAGG GCCGGTTCACCATTTCAAGAGACGATGCTAAAAACAGCCT GTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCCGAAGACACAGC TGTGTACTATTGCGCACGCGATCGCGGCGTGGGATATTT CGATCTGTGGGGCCGCGGAACCCTGGTGACCGTCTCATC TGCTAGCACTAAGGGGCCTTCCGTGTTTCCACTGGCTCC CTCTAGTAAATCCACCTCTGGAGGCACAGCTGCACTGGG ATGTCTGGTGAAGGATTACTTCCCTGAACCAGTCACAGTG AGTTGGAACTCAGGGGCTCTGACAAGTGGAGTCCATACT TTTCCCGCAGTGCTGCAGTCAAGCGGACTGTACTCCCTG TCCTCTGTGGTCACCGTGCCTAGTTCAAGCCTGGGCACC CAGACATATATCTGCAACGTGAATCACAAGCCATCAAATA CAAAAGTCGACAAGAAGGTGGAACCAAAAAGCTGCGATA

AAACCCATACA 17 Cadeia leve de CAGAGCGCACTGACTCAGCCTGCTTCCGTGTCCGGCTCC H3 (lambda) CCTGGGCAGAGTATTACAATCTCATGCACTGGCACCTCAT

CCGACGTGGGCGGGTACAACTTTGTCAGCTGGTATCAGC AGCACCCAGGCAAGGCCCCCAAACTGATGATCTACGACG TGTCCGATCGGCCTTCCGGGGTCTCTGACAGATTCTCCG GATCTAAGAGTGGCAATACCGCCAGCCTGATCATTTCCG GGCTGCAGGCAGACGATGAGGCCGATTACTATTGCAGCT CCTATGGATCTAGTTCAACACATGTGATCTTCGGAGGCGG GACCAAGGTGACAGTCCTGGGGCAGCCTAAAGCGGCGC CCTCTGTGACTCTGTTTCCCCCTAGCTCCGAGGAACTGCA GGCTAACAAGGCAACTCTGGTGTGTCTGATTAGCGACTTC TACCCAGGAGCTGTGACCGTCGCCTGGAAGGCTGATTCT AGTCCCGTGAAAGCAGGCGTCGAGACCACAACTCCTAGT AAGCAGTCAAACAACAAGTACGCAGCCTCAAGCTATCTGT CTCTGACACCCGAACAGTGGAAAAGTCACAGGTCATATA GCTGCCAGGTGACTCACGAGGGCTCAACTGTGGAGAAAA

CCGTCGCACCAACCGAATGTTCC 18 Cadeia leve CAGAGCGCACTGACTCAGCCTGCATCCGTGTCCGGGTCC quimérica Vλ- CCTGGGCAGAGCATTACTATTTCATGTACTGGAACTTCTT Cκ de H3 CAGACGTGGGCGGGTACAACTTCGTGTCCTGGTATCAGC

AGCACCCCGGCAAGGCACCTAAACTGATGATCTACGACG TGAGCGATCGACCAAGCGGGGTCTCCGACAGATTTTCTG GAAGTAAATCAGGCAATACCGCCTCTCTGATCATTAGTGG GCTGCAGGCCGACGATGAGGCTGATTACTATTGCAGCTC CTATGGATCTAGTAGCACCCATGTCATTTTCGGAGGCGGA ACAAAGGTCACCGTCCTGAGAACCGTGGCGGCGCCCAGT GTCTTCATTTTTCCCCCTAGCGACGAACAGCTGAAGTCTG GGACAGCCAGTGTGGTCTGTCTGCTGAACAACTTCTACC CTCGCGAGGCTAAAGTGCAGTGGAAGGTCGATAACGCAC TGCAGTCCGGAAATTCTCAGGAGAGTGTGACTGAACAGG ACTCAAAAGATAGCACCTATTCCCTGTCAAGCACACTGAC TCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAAGTGTATGC TTGTGAAGTCACCCACCAGGGGCTGAGTTCACCAGTCAC

AAAATCATTCAACAGAGGGGAGTGC 19 Fab de cadeia CAGCTGCAGCTGCAGGAAAGCGGGCCTGGGCTGGTGAA pesada de ACCTTCCGAAACACTGTCCCTGACTTGTACTGTGAGCGG EP6b_B01 GGCATCAATTAGTGCCAACTCATACTATGGCGTGTGGGTC

CGACAGAGTCCAGGAAAGGGACTGGAGTGGGTGGGGTC CATCGCCTACAGAGGAAACAGTAATTCAGGCAGCACATA CTATAACCCTAGCCTGAAGTCCAGGGCTACTGTGAGCGT GGACAGCTCCAAAAATCAGGTGTCACTGCGCCTGACTAG CGTCACCGCCGCTGATACCGCCCTGTACTATTGCGCTCG GAGACAGCTGCTGGACGATGGGACAGGATACCAGTGGG CAGCCTTCGACGTGTGGGGACAGGGGACAATGGTGACT GTCTCTAGTGCTAGCACCAAGGGGCCAAGCGTGTTCCCA CTGGCACCCTCAAGCAAATCCACCTCTGGAGGAACAGCT GCACTGGGATGCCTGGTGAAGGATTATTTCCCCGAACCT GTGACTGTCTCTTGGAATAGTGGGGCACTGACTTCTGGA GTGCACACCTTTCCCGCCGTCCTGCAGTCCTCTGGACTG TACTCCCTGAGTTCAGTGGTCACAGTGCCTAGCTCCTCTC TGGGCACCCAGACATACATCTGTAACGTGAACCATAAGC CATCAAACACTAAAGTCGACAAGAAGGTGGAGCCAAAGT CCTGTGACAAGACCCATACA

20 Cadeia leve de CAGAGCGTCCTGACTCAGCCTCCCTCCGTGTCCGAAGCA EP6b_B01 CCTCGGCAGACTGTGACTATCTCATGTTCTGGCAACTCAT (lambda) CAAATATCGGAAGGTACCCAGTGAACTGGTATCAGCAGC

TGCCCGGCAAGGCACCTAAACTGCTGATCTACAGTGACA ATCTGCGGTTCTCAGGGGTCCCCGATCGGTTCAGCGGCT CCAAGTCTGGGACCACAGCCAGCCTGGCTATTCGGGACC TGCTGTCCGAGGACGAAGCCGATTACTATTGCAGTACCT GGGACGATACCCTGGAAGGATGGGTCTTCGGCGGCGGC ACAAAAGTCACCGTCCTGGGGCAGCCAAAGGCGGCGCC CAGTGTCACACTGTTTCCCCCTAGCTCCGAGGAACTGCA GGCTAACAAAGCAACACTGGTGTGTCTGATCAGCGACTT CTACCCTGGAGCTGTGACTGTCGCCTGGAAGGCTGATTC TAGTCCAGTGAAAGCAGGCGTCGAGACCACAACTCCCTC TAAGCAGAGTAACAACAAGTACGCAGCCTCAAGCTATCTG TCACTGACCCCAGAACAGTGGAAGAGCCACCGGAGCTAT TCCTGCCAGGTCACTCACGAAGGCTCCACTGTCGAGAAA

ACCGTCGCTCCCACCGAATGTTCA 21 Cadeia leve CAGAGCGTCCTGACTCAGCCTCCTTCCGTGTCCGAGGCA quimérica Vλ- CCCCGCCAGACCGTGACTATCTCATGTTCCGGCAACTCC Cκ de TCAAATATCGGAAGGTACCCAGTGAACTGGTATCAGCAG EP6b_B01 CTGCCCGGCAAGGCACCTAAACTGCTGATCTACAGTGAC

AATCTGCGGTTCTCAGGGGTCCCCGATCGGTTCAGCGGC TCCAAGTCTGGGACCACAGCCAGCCTGGCTATTCGGGAC CTGCTGTCCGAGGACGAAGCCGATTACTATTGCAGTACC TGGGATGATACCCTGGAAGGATGGGTCTTTGGAGGAGGA ACTAAAGTCACCGTGCTGAGAACCGTGGCGGCGCCCAGT GTCTTCATTTTTCCCCCTAGCGACGAACAGCTGAAGTCTG GGACAGCCAGTGTGGTCTGTCTGCTGAACAACTTCTACC CTAGAGAGGCTAAAGTGCAGTGGAAGGTCGATAACGCAC TGCAGTCCGGAAATTCTCAGGAGAGTGTGACTGAACAGG ACTCAAAAGATAGCACCTATTCCCTGTCAAGCACACTGAC TCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAAGTGTATGC TTGTGAAGTCACCCACCAGGGGCTGAGTTCACCAGTCAC

AAAATCATTCAACAGAGGGGAGTGC 22 Fab de cadeia GAGGTGCAGCTGCTGGAATCTGGGGGGGGCCTGGTGCA pesada de GCCTGGGGGGTCCCTGAGACTGTCATGTGCTGCCAGCG CAT-2200 GGTTTACTTTCAGCTCCTACGCTATGTCCTGGGTGCGACA

GGCACCCGGGAAGGGACTGGAGTGGGTCTCTGCAATCA GTGGGTCAGGCGGGAGTACTTACTATGCCGACAGCGTGA AGGGACGGTTCACTATCTCAAGAGATAACAGCAAGAACA CCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCAGAAGACA CAGCCGTGTACTATTGCGCCAGGGATCTGATCCACGGAG TCACTCGCAATTGGGGCCAGGGGACTCTGGTGACCGTCT CTAGTGCTAGCACAAAGGGGCCCTCTGTGTTTCCACTGG CCCCCTCAAGCAAAAGCACATCCGGAGGAACTGCAGCTC TGGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCCCAGCCTGTGA CCGTCTCTTGGAACAGTGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGC ACACATTTCCTGCTGTCCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTC CCTGAGTTCAGTGGTCACAGTGCCTAGCTCCTCTCTGGG GACCCAGACATATATTTGCAACGTGAATCATAAACCAAGC AACACTAAGGTCGACAAGAAAGTGGAGCCCAAGAGCTGT

GATAAAACTCATACC 23 Cadeia leve de AACTTTATGCTGACTCAGCCCCACTCCGTGTCCGAGAGC CAT-2200 CCTGGCAAAACTGTGACTATTTCATGTACCCGATCATCTG (lambda) GAAGCCTGGCCAACTACTATGTGCAGTGGTACCAGCAGA

GGCCAGGCAGCTCCCCCACTATCGTGATTTTCGCTAACA ATCAGCGGCCTTCCGGCGTCCCAGACAGATTTTCCGGGT CTATCGATTCTAGTTCAAATAGTGCATCACTGACTATTTCC GGGCTGAAGACCGAGGACGAAGCCGATTACTATTGCCAG ACCTACGACCCCTATTCTGTGGTCTTCGGCGGGGGAACC AAGCTGACAGTGCTGGGACAGCCAAAAGCGGCGCCCAG TGTCACACTGTTTCCCCCTAGCTCCGAGGAACTGCAGGC TAACAAAGCAACACTGGTGTGTCTGATCAGCGACTTCTAC CCTGGAGCTGTGACTGTCGCCTGGAAGGCTGATTCTAGT CCAGTGAAAGCAGGCGTCGAGACCACAACTCCCTCTAAG CAGAGTAACAACAAGTACGCAGCCTCAAGCTATCTGTCAC TGACCCCAGAACAGTGGAAGAGCCACCGGAGCTATTCCT GCCAGGTCACTCACGAAGGCTCCACTGTCGAGAAAACCG

TCGCTCCCACCGAATGTTCA 24 Cadeia leve AACTTTATGCTGACACAGCCTCACTCTGTGAGTGAGTCAC quimérica Vλ- CCGGAAAGACCGTCACAATCTCTTGCACTAGGAGCTCCG Cκ de CAT- GCAGCCTGGCAAACTACTATGTGCAGTGGTACCAGCAGC 2200 GGCCCGGGTCTAGTCCTACCATCGTGATTTTCGCCAACA

ATCAGCGACCATCCGGAGTCCCAGACCGGTTCAGCGGGT CCATCGATTCAAGCTCCAATTCTGCCAGTCTGACTATTAG CGGCCTGAAAACCGAGGACGAAGCTGATTACTATTGTCA GACATACGATCCATATAGCGTGGTCTTTGGCGGAGGAAC TAAGCTGACCGTGCTGAGAACCGTGGCGGCGCCCAGTGT CTTCATTTTTCCCCCTAGCGACGAACAGCTGAAGTCTGGG ACAGCCAGTGTGGTCTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCTA GAGAGGCTAAAGTGCAGTGGAAGGTCGATAACGCACTGC AGTCCGGAAATTCTCAGGAGAGTGTGACTGAACAGGACT CAAAAGATAGCACCTATTCCCTGTCAAGCACACTGACTCT GAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCATAAAGTGTATGCTTG TGAAGTCACCCACCAGGGGCTGAGTTCACCAGTCACAAA

ATCATTCAACAGAGGGGAGTGC 25 Fab de cadeia GAAGTGCAGCTGGTCGAATCTGGAGGAGGACTGGTGCA pesada de GCCAGGAGGGTCCCTGCGCCTGTCTTGCGCCGCTAGTG pertuzumab GCTTCACTTTTACCGACTACACCATGGATTGGGTGCGACA

GGCACCTGGAAAGGGCCTGGAGTGGGTCGCCGATGTGA ACCCAAATAGCGGAGGCTCCATCTACAACCAGCGGTTCA AGGGCCGGTTCACCCTGTCAGTGGACCGGAGCAAAAACA CCCTGTATCTGCAGATGAATAGCCTGCGAGCCGAAGATA CTGCTGTGTACTATTGCGCCCGGAATCTGGGGCCCTCCT TCTACTTTGACTATTGGGGGCAGGGAACTCTGGTCACCG TGAGCTCCGCCTCCACCAAGGGACCTTCTGTGTTCCCAC TGGCTCCCTCTAGTAAATCCACATCTGGGGGAACTGCAG CCCTGGGCTGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCAGAGCCCG TCACAGTGTCTTGGAACAGTGGCGCTCTGACTTCTGGGG TCCACACCTTTCCTGCAGTGCTGCAGTCAAGCGGGCTGT ACAGCCTGTCCTCTGTGGTCACCGTGCCAAGTTCAAGCC TGGGAACACAGACTTATATCTGCAACGTGAATCACAAGCC ATCCAATACAAAAGTCGACAAGAAAGTGGAACCCAAGTCT

TGTGATAAAACCCATACA 26 Cadeia leve de GATATTCAGATGACCCAGTCCCCAAGCTCCCTGAGTGCC pertuzumab TCAGTGGGCGACCGAGTCACCATCACATGCAAGGCTTCC (kappa) CAGGATGTGTCTATTGGAGTCGCATGGTACCAGCAGAAG

CCAGGCAAAGCACCCAAGCTGCTGATCTATAGCGCCTCC TACCGGTATACCGGCGTGCCCTCTAGATTCTCTGGCAGT GGGTCAGGAACAGACTTTACTCTGACCATCTCTAGTCTGC AGCCTGAGGATTTCGCTACCTACTATTGCCAGCAGTACTA TATCTACCCATATACCTTTGGCCAGGGGACAAAAGTGGAG ATCAAGAGGACTGTGGCCGCTCCCTCCGTCTTCATTTTTC CCCCTTCTGACGAACAGCTGAAAAGTGGCACAGCCAGCG TGGTCTGTCTGCTGAACAATTTCTACCCTCGCGAAGCCAA AGTGCAGTGGAAGGTCGATAACGCTCTGCAGAGCGGCAA CAGCCAGGAGTCTGTGACTGAACAGGACAGTAAAGATTC AACCTATAGCCTGTCAAGCACACTGACTCTGAGCAAGGC AGACTACGAGAAGCACAAAGTGTATGCCTGCGAAGTCAC ACATCAGGGGCTGTCCTCTCCTGTGACTAAGAGCTTTAAC

AGAGGAGAGTGT 27 Fab de cadeia GAGGTCCAGCTGGTCGAGTCTGGAGGAGGACTGGTGCA pesada de GCCAGGAGGGAGCCTGCGACTGTCCTGCGCCGCTTCTG D3H44 GCTTCAACATCAAGGAATACTATATGCACTGGGTGAGACA

GGCACCAGGCAAAGGACTGGAGTGGGTGGGCCTGATCG ACCCTGAACAGGGGAACACCATCTACGACCCAAAGTTTC AGGATCGGGCCACTATTAGTGCTGACAACTCAAAAAATAC CGCATATCTGCAGATGAACAGCCTGAGGGCAGAGGATAC AGCCGTGTACTATTGCGCCCGGGACACTGCAGCCTACTT CGATTATTGGGGACAGGGCACACTGGTCACTGTGAGCTC CGCTAGCACTAAGGGGCCTTCCGTGTTTCCACTGGCTCC CTCTAGTAAATCCACCTCTGGAGGCACAGCTGCACTGGG ATGTCTGGTGAAGGATTACTTCCCTGAACCAGTCACAGTG AGTTGGAACTCAGGGGCTCTGACAAGTGGAGTCCATACT TTTCCCGCAGTGCTGCAGTCAAGCGGACTGTACTCCCTG TCCTCTGTGGTCACCGTGCCTAGTTCAAGCCTGGGCACC CAGACATATATCTGCAACGTGAATCACAAGCCATCAAATA CAAAAGTCGACAAGAAAGTGGAGCCCAAGAGCTGTGATA

AAACTCATACCTGCCCACCTTGTCCGGCGCCAGAAC 28 Cadeia leve de GACATCCAGATGACCCAGTCCCCTAGCTCCCTGTCCGCC D3H44 (kappa) TCTGTGGGCGACAGGGTGACCATCACATGCCGGGCCAG

CAGAGATATCAAGTCCTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAG CCCGGCAAGGCCCCTAAGGTGCTGATCTACTATGCCACA TCTCTGGCCGAGGGAGTGCCAAGCCGCTTCAGCGGCTC CGGCTCTGGAACCGACTACACCCTGACAATCTCTAGCCT GCAGCCAGAGGATTTCGCCACATACTATTGTCTGCAGCA CGGCGAGTCTCCCTGGACCTTTGGCCAGGGCACAAAGGT GGAGATCAAGCGGACCGTGGCGGCGCCCAGTGTCTTCAT TTTTCCCCCTAGCGACGAACAGCTGAAGTCTGGGACAGC CAGTGTGGTCTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCTAGAGAG GCTAAAGTGCAGTGGAAGGTCGATAACGCACTGCAGTCC GGAAATTCTCAGGAGAGTGTGACTGAACAGGACTCAAAA GATAGCACCTATTCCCTGTCAAGCACACTGACTCTGAGCA AGGCCGACTACGAGAAGCATAAAGTGTATGCTTGTGAAG TCACCCACCAGGGGCTGAGTTCACCAGTCACAAAATCATT

CAACAGAGGGGAGTGC 29 Sequência de APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE Fc de IgG1 Fc VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD 231 a 447 WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS (numeração RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP EU), sem PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH dobradiça YTQKSLSLSPGK 30 Dobradiça de EPKSCDKTHT IgG1 superior 31 Domínio RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW Ckappa (CH1) KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH de IGKC*01 KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 32 Dobradiça de CPPCP IgG1 inferior

TABELA 3: BIBLIOTECA DE PROJETO DE OTIMIZAÇÃO DE

ESTABILIDADE Identificador Mutação de cadeia leve quimérica Vλ-Cκ (Kabat) de projeto 1 T105E_L106AK 2 E83F_T105E_L106AK 3 E83F_T105E_V106I_L106AK 4 T80A_E83F_T105E_L106AK 5 T80A_E83F_T105E_V106I_L106AK 6 T80A_E83F_D85T_T105E_L106AK 7 T80A_E83F_D85T_T105E_V106I_L106AK 8 T80P_E83F_D85T_T105E_V106I_L106AK 9 D85T 10 D85V 11 T105E 12 L106AK 13 V106I 14 E83F 15 E83F_T105E 16 E83F_V106I 17 E83F_D85T 18 E83F_D85T_T105E 19 E83F_D85V_T105E 20 E83F_D85T_T105E_V106I 21 E83F_D85V_T105E_V106I 22 E83F_D85T_T105E_V106I_L106AK 23 E83V 24 E83V_T105E 25 E83V_V106I 26 E83V_D85T 27 E83V_D85T_T105E

Identificador Mutação de cadeia leve quimérica Vλ-Cκ (Kabat) de projeto 28 E83V_D85V_T105E 29 E83V_D85T_T105E_V106I 30 E83I 31 E83I_T105E 32 E83I_D85T 33 E83I_D85T_T105E 34 E83I_D85T_T105E_V106I 35 E83A 36 E83A_T105E 37 E83A_D85T 38 E83A_D85T_T105E 39 E83A_D85T_T105E_V106I

TABELA 4: AVALIAÇÃO DE ESTABILIDADE TÉRMICA DOS FABS QUIMÉRICOS Vλ-Cκ PROJETADOS

Coluna Coluna Coluna Coluna Coluna Coluna Coluna Coluna Coluna Colun Colun Coluna 1 Coluna 3 2 5 6 7 8 9 10 11 12 a 13 a 14 Mudan Mudan Mudan Mudan ça em ça em Mudan Tm ça em Tm (°C) Mudança ça em Tm (°C) Tm Tm (°C) Tm ça em (°C) Tm de em Tm Tm (°C) Tm de (DSF) de (DSC) Tm (°C) Tm de (DSC) Identifica CAT- (DSF) de de H3 (DSF) EP6b_ de CAT- de de H3 (DSC) EP6b_ de dor de 2200 CAT-2200 projeta de H3 B01 EP6b_ 2200 CAT- projeta de H3 B01 EP6b_ projeto projeta projetado do, por projeta projeta B01 projeta 2200 do, por projeta projeta B01 do, por vs DSF do vs do, por projeta do, por projeta DSC do vs do, projeta DSF quimera quimer DSF do vs DSC do vs quimer por do vs

118/129 a quimer quimer a DSC quimer a a a WT *78,8 5,7 *80,9 4,9 *85,4 4,9 72,6 4,6 75,3 3,7 81,1 4,4 quimera 73,1 N/A 76,0 N/A 80,5 N/A 68,0 N/A 71,6 N/A 76,7 N/A 1 / / / / / / *68,2 0,2 / / / / 2 / / / / / / *73,0 5,0 / / / / 3 / / / / / / *73,3 5,3 / / / / 4 / / / / / / *73,1 5,1 / / / / 5 / / / / / / *73,1 5,1 / / / / 6 / / / / / / *75,8 7,8 / / / / 7 / / / / / / *76,0 8,0 / / / / 8 / / / / / / *76,3 8,3 / / / / 9 74,8 1,7 77,7 1,7 / / / / / / / /

Coluna Coluna Coluna Coluna Coluna Coluna Coluna Coluna Coluna Colun Colun Coluna 1 Coluna 3 2 5 6 7 8 9 10 11 12 a 13 a 14 Mudan Mudan Mudan Mudan ça em ça em Mudan Tm ça em Tm (°C) Mudança ça em Tm (°C) Tm Tm (°C) Tm ça em (°C) Tm de em Tm Tm (°C) Tm de (DSF) de (DSC) Tm (°C) Tm de (DSC) Identifica CAT- (DSF) de de H3 (DSF) EP6b_ de CAT- de de H3 (DSC) EP6b_ de dor de 2200 CAT-2200 projeta de H3 B01 EP6b_ 2200 CAT- projeta de H3 B01 EP6b_ projeto projeta projetado do, por projeta projeta B01 projeta 2200 do, por projeta projeta B01 do, por vs DSF do vs do, por projeta do, por projeta DSC do vs do, projeta DSF quimera quimer DSF do vs DSC do vs quimer por do vs a quimer quimer a DSC quimer

119/129 a a a 10 74,5 1,4 77,5 1,5 / / / / / / / / 11 73,3 0,2 76,0 0 / / / / / / / / 12 73,0 0 76,0 0 / / / / / / / / 13 73,2 0,1 76,2 0,2 / / / / / / / / 14 76,25 3,2 77,8 1,8 / / / / / / / / 15 77,0 3,9 78,7 2,7 / / / / / / / / 16 76,2 3,1 77,5 1,5 / / / / / / / / 17 78,9 5,8 80,5 4,5 / / / / / / / / 18 79,2 6,1 82,3 6,3 *88,7 8,2 75,4 7,4 78,3 6,7 84,6 7,9 19 79,3 6,2 82,2 6,2 / / / / / / / / 20 79,2 6,1 82,0 6,0 / / / / / / / / 21 79,5 6,4 81,5 5,5 / / / / / / / /

120/129 a a a 22 / / 81,5 5,5 / / / / / / / / 23 80,0 6,9 81,2 5,2 / / / / / / / / 24 79,8 6,7 81,5 5,5 / / / / / / / / 25 80,3 7,2 82,8 6,8 / / / / / / / / 26 81,0 7,9 84,2 8,2 #90,8 10,3 77,6 9,6 80,5 8,9 88,2 11,4 27 81,0 7,9 85,0 9,0 / / / / / / / / 28 81,3 8,2 85,0 9,0 / / / / / / / / 29 81,0 7,9 87,0 11,0 #90,3 9,8 77,6 9,6 83,4 11,8 87,7 11 30 79,5 6,4 81,0 5,0 / / / / / / / / 31 79,7 6,6 81,0 5,0 / / / / / / / / 32 80,5 7,4 84,0 8,0 #91,9 11,4 77,6 9,6 80,2 8,6 88,9 12,2 33 81,0 7,9 85,0 9,0 / / / / / / / /

Coluna Coluna Coluna Coluna Coluna Coluna Coluna Coluna Coluna Colun Colun Coluna 1 Coluna 3 2 5 6 7 8 9 10 11 12 a 13 a 14 Mudan Mudan Mudan Mudan ça em ça em Mudan Tm ça em Tm (°C) Mudança ça em Tm (°C) Tm Tm (°C) Tm ça em (°C) Tm de em Tm Tm (°C) Tm de (DSF) de (DSC) Tm (°C) Tm de (DSC) Identifica CAT- (DSF) de de H3 (DSF) EP6b_ de CAT- de de H3 (DSC) EP6b_ de dor de 2200 CAT-2200 projeta de H3 B01 EP6b_ 2200 CAT- projeta de H3 B01 EP6b_ projeto projeta projetado do, por projeta projeta B01 projeta 2200 do, por projeta projeta B01 do, por vs DSF do vs do, por projeta do, por projeta DSC do vs do, projeta DSF quimera quimer DSF do vs DSC do vs quimer por do vs a quimer quimer a DSC quimer 121/129 a a a 34 81,0 7,9 86,5 10,5 #91,1 10,6 77,7 9,7 82,8 11,2 88,5 11,8 35 80,5 7,4 84,0 8,0 / / / / / / / / 36 80,7 7,6 84,2 8,2 / / / / / / / / 37 81,2 8,1 86,5 10,5 #90,6 10,1 77,5 9,5 82,6 11,0 87,9 11,2 38 81,2 8,1 87,3 11,3 / / / / / / / / 39 81,5 8,4 88,5 12,5 92,0 11,5 78,0 10,0 85,0 13,4 / / # *Média de 2 medições; Média de 4 medições; /-não determinado; TABELA 5: AVALIAÇÃO DE ESTABILIDADE TÉRMICA DOS MABS QUIMÉRICOS Vλ-Cκ PROJETADOS

SELECIONADOS

Coluna 1 Coluna 2 Coluna 3 Coluna 4 Coluna 5 Tm (°C) de Mudança em Tm Mudança em Tm (°C) de Identificador de CAT-2200 (DSC) de CAT- Tm (DSC) de H3 projetado, projeto projetado, por 2200 projetado vs H3 projetado por DSC* DSC* quimera vs quimera WT 71,2 4,1 73,8 3,4 quimera 67,1 N/A 70,4 N/A 18 74,8 7,7 78,1 7,7 26 77,2 10,1 80,4 10,0 122/129 29 77,3 10,2 83,3 12,9 32 77,2 10,1 80,2 9,8 34 77,4 10,3 82,7 12,3 37 77,2 10,1 82,5 12,1 39 77,7 10,6 84,2 13,8 *As medições são média de n=3 TABELA 6: AVALIAÇÃO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO DOS FABS DE QUIMERA Vλ-Cκ PROJETADOS

SELECIONADOS Coluna 1 Coluna 2 Coluna 3 Coluna 4 Identificador de projeto KD (nM) de CAT-2200 projetado KD (nM) de H3 projetado KD (pM) de EP6b_B01 projetado WT #0,3 #92,4 54,6 quimera #0,2 #92,7 51,2

Coluna 1 Coluna 2 Coluna 3 Coluna 4 Identificador de projeto KD (nM) de CAT-2200 projetado KD (nM) de H3 projetado KD (pM) de EP6b_B01 projetado 14 0,3 92,6 */ 15 0,3 90,8 */ 16 0,3 88,5 */ 17 0,3 83,1 */ 18 0,3 90,5 44,9 19 0,3 83,0 */ 20 0,3 85,8 */

123/129 21 0,3 82,6 */ 22 */ 80,5 */ 23 0,2 95,7 */ 24 0,3 102,0 */ 25 0,4 80,6 */ 26 0,3 82,1 48,6 27 0,2 84,1 */ 28 0,2 89,2 */ 29 0,3 77,0 47,9 30 0,3 95,1 */ 31 0,3 82,7 */ 32 0,3 83,8 47,1 33 0,3 89,0 */

Coluna 1 Coluna 2 Coluna 3 Coluna 4 Identificador de projeto KD (nM) de CAT-2200 projetado KD (nM) de H3 projetado KD (pM) de EP6b_B01 projetado 34 0,2 75,4 48,4 35 0,2 59,1 */ 36 0,3 66,4 */ 37 0,2 83,5 49,2 38 0,2 72,2 */ 39 0,2 89,6 */ # */Não determinado; As medições são média de n=3; 124/129 TABELA 7: AVALIAÇÃO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO DOS MABS DE QUIMERA Vλ-Cκ PROJETADOS

SELECIONADOS Coluna 1 Coluna 2 Coluna 3 Identificador de KD (pM) de CAT- KD (nM) de H3 projeto 2200 projetado projetado WT 27,0 85,0 quimera 42,0 63,0 18 48,0 66,0 26 48,0 56,0 29 49,0 64,0 32 50,0 67,0

Coluna 1 Coluna 2 Coluna 3 Identificador de KD (pM) de CAT- KD (nM) de H3 projeto 2200 projetado projetado 34 53,0 60,0 37 48,0 67,0 39 44,0 61,0 TABELA 8: AVALIAÇÃO DE AFINIDADE COM FcγR E FcRn DOS MABS DE QUIMERA Vλ-Cκ PROJETADOS

SELECIONADOS 125/129 Coluna 1 Coluna 2 Coluna 3 Coluna 4 Coluna 5 Coluna 6 Coluna 7 KD (μM) de KD (μM) de KD (μM) de KD (μM) de KD (nM) de Identificador de Mab:CD16aV# # Mab:CD32bF Mab: CD32aR Mab:CD32aH Mab:FcRn Mab projeto projetado projetado projetado projetado projetado WT 1,2 2,9 2,4 0,7 14,2 CAT-2200 quimera */ */ 2,5 0,6 14,3 CAT-2200 29 1,3 2,9 2,3 0,6 27,9 CAT-2200 37 1,4 3,1 2,4 0,6 23,4 CAT-2200 39 1,3 3,0 2,4 0,7 24,7 CAT-2200 WT 1,1 3,3 3,4 0,6 48,6 H3 quimera 1,2 3,4 4,1 0,6 74,6 H3 29 1,1 3,2 4,9 0,6 86,1 H3 37 1,3 3,3 3,4 0,6 80,2 H3

Coluna 1 Coluna 2 Coluna 3 Coluna 4 Coluna 5 Coluna 6 Coluna 7 KD (μM) de KD (μM) de KD (μM) de KD (μM) de KD (nM) de Identificador de Mab:CD16aV# Mab:CD32bF# Mab: CD32aR Mab:CD32aH Mab:FcRn Mab projeto projetado projetado projetado projetado projetado 39 1,4 3,4 3,1 0,7 96,7 H3 *Não determinado; #As medições são média de n=2;

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TABELA 9: DADOS DE PAREAMENTO POR LC-MS PARA ABS

QUIMÉRICOS BIESPECÍFICOS PROJETADOS Coluna 10 Coluna 1 Coluna 2 Coluna 3 Coluna 4 Coluna 5 Coluna 6 Coluna 7 Coluna 8 Coluna 9 Mudança em H1H2_L1L2 e H1H2_L2L1** e Mudança em H1H2_L1L2 e H1H2_L2L1 de Projeto de otimização de estabilidade de H1H2_L1L2 e H1H2_L1L2 e H1H2_L2L1** H1H2_L2L1 H1H2_L1L1 Sistema (Anticorpo no), H1L1/H2L2 kappa-kappa kappa-quimera kappa-quimera quimera Vλ-Cκ Etiqueta H1L1 Etiqueta H2L2 #projeto (1) H3/Pertuzumab

FLA / / (controle de Ab / 53,6 0 44,2 0 23,8

G quimérico biespecífico) (2) CAT- 2200/D3H44 / / controle de Ab / / 7,6 0 6,0 0 67,2 quimérico biespecífico) (3) CAT- 2200/D3H44

FLA / / (controle de Ab / 22,4 0 18,3 0 57,4

G quimérico biespecífico) (4) FLA 39 / / 29,1 -24,5 20,7 -23,5 45 H3/Pertuzumab G

(controle de projeto de otimização de estabilidade) (5) H3/Pertuzumab (controle de FLA 29 / / 40,4 -13,3 31,6 -12,6 40,5 projeto de G otimização de estabilidade l) (6) CAT- 2200/D3H44 (controle de 39 / / / 1,9 -5,8 1,4 -4,6 70,3 projeto de otimização de estabilidade) (7) CAT- 2200/D3H44 (controle de 29 / / / 4,9 -2,6 4,0 -2,0 69,8 projeto de otimização de estabilidade) (8) H3/Pertuzumab 9060- 39 (Ab quimérico / / 86,4 *32,8 77,9 *33,8 6,8 9756 biespecífico projetado) (9) H3/Pertuzumab 9820- 39 (Ab quimérico / / 76,4 *22,8 69,4 *25,3 1,1 9823 biespecífico projetado) (10) H3/Pertuuzmab 9060- 29 (Ab quimérico / / 88,4 *34,8 80,2 *36,0 1,7 9756 biespecífico projetado) (11) H3/Pertuzumab 9820- 29 (Ab quimérico / / 86,3 *32,6 76,9 *32,8 0,2 9823 biespecífico projetado) 9060- (12) CAT- FLA 39 / 76,2 53,8 64,6 46,3 15,4 9756 2200/D3H44 G

(Ab quimérico biespecífico projetado) (13) CAT- 2200/D3H44 9820- 39 (Ab quimérico / / 96,0 88,4 86,4 80,4 0,5 9823 biespecífico projetado) (14) CAT- 2200/D3H44 9060- FLA 29 (Ab quimérico / 77,4 55,0 65,7 47,4 15,5 9756 G biespecífico projetado) (15) CAT- 2200/D3H44 9820- 29 (Ab quimérico / / 92,6 85,0 84,3 78,3 1,9 9823 biespecífico projetado) *Mudança estimada em relação a controle de Ab quimérico biespecífico; ** Espécies de Ab complete consideradas apenas

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Heterodímero quimérico caracterizado pelo fato de que compreende: a) um primeiro construto de polipeptídeo de cadeia pesada de imunoglobulina (H1) que compreende uma sequência de domínio constante de cadeia pesada 1 (CH1) e uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (VH), e b) um primeiro construto de polipeptídeo de cadeia leve de imunoglobulina quimérico (L1) que compreende uma sequência de domínio constante de cadeia leve kappa (Ckappa) e uma sequência de domínio variável de cadeia leve lambda (Vlambda), em que a sequência de Vlambda compreende uma ou mais modificações de aminoácido estabilizantes que aumentam a estabilidade térmica do heterodímero quimérico em comparação com um heterodímero quimérico do tipo selvagem correspondente sem as modificações de aminoácido estabilizantes, em que H1 e L1 formam uma primeira região Fab que se liga a um primeiro epítopo.

2. Heterodímero quimérico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de Vlambda compreende uma ou mais modificações de aminoácido estabilizantes num ou mais aminoácidos na interface entre a sequência de Ckappa e a sequência de Vlambda.

3. Heterodímero quimérico, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a sequência de Vlambda compreende uma ou mais modificações de aminoácido estabilizantes nas posições selecionadas dentre um ou mais dos resíduos 80, 83, 105 e 106, em que a numeração de resíduos de aminoácidos está de acordo com Kabat.

4. Heterodímero quimérico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o resíduo 83 é substituído por um aminoácido hidrofóbico.

5. Heterodímero quimérico, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o aminoácido hidrofóbico é F, L, I, V ou A.

6. Heterodímero quimérico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o resíduo 83 é substituído por um aminoácido não carregado polar.

7. Heterodímero quimérico, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o aminoácido não carregado polar é S, T, H, N ou Q.

8. Heterodímero quimérico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o resíduo 83 é substituído por A, F, I, V, L, T, S, N, H ou Q.

9. Heterodímero quimérico, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o resíduo 83 é substituído por A.

10. Heterodímero quimérico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o resíduo 105 é substituído por um aminoácido negativamente carregado.

11. Heterodímero quimérico, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o aminoácido negativamente carregado é D ou E.

12. Heterodímero quimérico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o resíduo 105 é substituído por um aminoácido não carregado polar.

13. Heterodímero quimérico, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o aminoácido não carregado polar é N ou Q.

14. Heterodímero quimérico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o resíduo 105 é substituído por E, D, N ou Q, e o resíduo 106 é substituído por I, L ou M.

15. Heterodímero quimérico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de Vlambda compreende uma ou mais modificações de aminoácido estabilizantes no resíduo 85, em que a numeração de resíduos está de acordo com Kabat.

16. Heterodímero quimérico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o resíduo 85 é substituído por um aminoácido não carregado polar.

17. Heterodímero quimérico, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o aminoácido não carregado polar é S, H, ou Q.

18. Heterodímero quimérico, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o resíduo 85 é substituído por um aminoácido hidrofóbico.

19. Heterodímero quimérico, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o aminoácido hidrofóbico é V ou A.

20. Heterodímero quimérico, de acordo com a reivindicação 15,

caracterizado pelo fato de que o resíduo 85 é substituído por T V, N, A, Y, S, H ou Q.

21. Heterodímero quimérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a sequência de Vlambda compreende uma combinação de modificações de aminoácido estabilizantes nas posições selecionadas dentre os resíduos 83, 85, 105 e 106.

22. Heterodímero quimérico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o resíduo 80 é substituído por um aminoácido não carregado polar.

23. Heterodímero quimérico, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o aminoácido não carregado polar é S, N ou Q.

24. Heterodímero quimérico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o resíduo 80 é substituído por um aminoácido hidrofóbico.

25. Heterodímero quimérico, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o aminoácido hidrofóbico é A, P ou V.

26. Heterodímero quimérico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o resíduo 80 é substituído por A, P, V, S, N ou Q.

27. Heterodímero quimérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 26, caracterizado pelo fato de que a sequência de Vlambda compreende modificações de aminoácido estabilizantes nos resíduos 83 e 85; nos resíduos 83 e 106; nos resíduos 105 e 106; nos resíduos 105 e 106A; nos resíduos 83 e 105; nos resíduos 85 e 105; nos resíduos 85 e 106; resíduos 83, 85 e 105; nos resíduos 83, 105, e 106A; nos resíduos 83, 85 e 106; nos resíduos 83, 105 e 106; nos resíduos 85, 105 e 106; nos resíduos 80, 83, 85 e 105; nos resíduos 80, 83, 85 e 105; nos resíduos 80, 85, 105 e 106; nos resíduos 80, 83, 105 e 106; nos resíduos 80, 83, 85, 105, 106; nos resíduos 83, 85, 105 e 106; nos resíduos 80, 83, 105 e 106A; nos resíduos 83, 105, 106 e 106A; nos resíduos 80, 83, 85, 105 e 106A; nos resíduos 80, 83, 105, 106 e 106A; nos resíduos 83, 85, 105, 106 e 106A; ou nos resíduos 80, 83, 85, 105, 106 e 106A.

28. Heterodímero quimérico, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que as substituições de aminoácido estabilizantes são

83F e 85T; 83V e 85T; 83I e 85T; 83A e 85T; 83F e 105E; 83V e 105E; 83I e 105E; 83A e 105E; 83F e 106I; 83V e 106I; 83I e 106I; 83A e 106I; 83F, 85T ou 85V, 105E, e 106I; 83V, 85T ou 85V, 105E e 106I; 83I, 85T ou 85V, 105E e 106I; 83A, 85T ou 85V, 105E e 106I; 83F, 105E e 106AK; 83F, 105E, 106I e 106AK; 80A, 83F, 105E e 106AK; 80A, 83F, 105E, 106I e 106AK; 80A, 83F, 85T, 105E e 106AK; 80A, 83F, 85T, 105E, 106I e 106AK; ou 80P, 83F, 85T, 105E, 106I e 106AK.

29. Heterodímero quimérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que H1 e L1 são sequências humanas ou humanizadas.

30. Heterodímero quimérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que o heterodímero quimérico é conjugado a um fármaco.

31. Construto de anticorpo caracterizado pelo fato de que compreende: a) um primeiro heterodímero, em que o primeiro heterodímero é o heterodímero quimérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, e b) um arcabouço em que pelo menos um dentre H1 e L1 do dito primeiro heterodímero está ligado com ou sem um ligante ao arcabouço.

32. Construto de anticorpo, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, um segundo heterodímero, em que o segundo heterodímero compreende; i) um segundo construto de polipeptídeo de cadeia pesada de imunoglobulina (H2) que compreende uma sequência de domínio constante de cadeia pesada 1 (CH1) e uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (VH), e ii) um segundo construto de polipeptídeo de cadeia leve de imunoglobulina (L2) que compreende uma sequência de domínio constante de cadeia leve (CL) e uma sequência de domínio variável de cadeia leve (VL), em que H2 e L2 formam uma segunda região Fab que se liga a um segundo epítopo, e pelo menos um dentre H2 e L2 está ligado com ou sem ligantes ao arcabouço.

33. Construto de anticorpo, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o segundo heterodímero é um heterodímero quimérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29.

34. Construto de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33, caracterizado pelo fato de que o primeiro epítopo e o segundo epítopo são iguais.

35. Construto de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33, caracterizado pelo fato de que o primeiro epítopo e o segundo epítopo são diferentes um do outro.

36. Construto de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 35, caracterizado pelo fato de que o primeiro e/ou segundo heterodímeros compreendem, ainda, uma ou mais substituições de aminoácidos que promovem pareamento de cadeia leve.

37. Construto de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 36, caracterizado pelo fato de que o arcabouço é uma região Fc que compreende uma primeira sequência de domínio constante de cadeia pesada 3 (CH3) e uma segunda sequência de CH3.

38. Construto de anticorpo, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a primeira sequência de CH3 e a segunda sequência de CH3 compreendem, cada uma, uma ou mais modificações de aminoácido que promovem a formação de um domínio CH3 heterodimérico em comparação com um domínio CH3 homodimérico.

39. Construto de anticorpo, de acordo com a reivindicação 37 ou 38, caracterizado pelo fato de que a região Fc compreende, ainda, uma primeira sequência de domínio constante 2 (CH2) e uma segunda sequência de CH2.

40. Construto de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 39, caracterizado pelo fato de que a região Fc é um Fc humano, um Fc de IgG1 humano, um Fc de IgA humano, um Gc de IgG humano, um Fc de IgD humano, um Fc de IgE humano, um Fc de IgM humano, um Fc de IgG2 humano, um Fc de IgG3 humano ou um Fc de IgG4 humano.

41. Construto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 40, caracterizado pelo fato de que os ligantes são um ou mais ligantes de polipeptídeo.

42. Construto, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que os ligantes compreendem uma ou mais regiões de dobradiça de anticorpo.

43. Construto, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que os ligantes compreendem uma ou mais regiões de dobradiça de IgG1.

44. Construto de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 43, caracterizado pelo fato de que o construto de anticorpo é conjugado a um fármaco.

45. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o heterodímero quimérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, ou o construto de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 44, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

46. Polinucleotídeo ou conjunto de polinucleotídeos caracterizado pelo fato de que codifica o heterodímero quimérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, ou o construto de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 44.

47. Vetor ou conjunto de vetores caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais dos polinucleotídeos ou conjuntos de polinucleotídeos, de acordo com a reivindicação 46.

48. Vetor ou conjunto de vetores, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o vetor ou pelo menos um vetor do conjunto de vetores é multicistrônico.

49. Célula isolada caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo ou conjunto de polinucleotídeos, de acordo com a reivindicação 46, ou o vetor ou conjunto de vetores, de acordo com a reivindicação 47 ou 48.

50. Célula isolada, de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula de levedura, uma célula bacteriana, uma célula de inseto ou uma célula de mamífero.

51. Célula isolada, de acordo com a reivindicação 50, caracterizada pelo fato de que a célula é estavelmente transfectada ou temporariamente transfectada com o polinucleotídeo ou conjunto de polinucleotídeos, de acordo com a reivindicação 46, ou o vetor ou conjunto de vetores, de acordo com a reivindicação 47 ou 48.

52. Método para preparar o heterodímero quimérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, ou o construto de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 44, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) obter uma célula hospedeira que compreende um polinucleotídeo ou conjunto de polinucleotídeos que codifica o heterodímero quimérico ou construto de anticorpo; (b) cultivar a célula hospedeira numa cultura de células hospedeiras sob condições que permitem a expressão do heterodímero quimérico ou construto de anticorpo, e (c) coletar o heterodímero quimérico ou construto de anticorpo da cultura de células hospedeiras.

53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é temporariamente transfectada ou estavelmente transfectada com o polinucleotídeo ou conjunto de polinucleotídeos.

54. Construto de polipeptídeo de cadeia leve quimérico caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de domínio constante de cadeia leve kappa (Ckappa) e uma sequência de domínio variável de cadeia leve lambda (Vlambda), em que a sequência de Vlambda compreende uma ou mais substituições de aminoácido estabilizantes que aumentam a estabilidade térmica de um heterodímero quimérico que compreende a cadeia leve quimérica.

55. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o construto de polipeptídeo de cadeia leve quimérico, de acordo com a reivindicação 54, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

56. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de que codifica o construto de polipeptídeo de cadeia leve quimérico, de acordo com a reivindicação 54.

57. Método para aumentar a estabilidade térmica de um anticorpo caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia leve de imunoglobulina lambda e uma cadeia pesada de imunoglobulina, em que o método compreende: a) preparar uma cadeia leve quimérico Vlambda-Ckappa que compreende a sequência de Vlambda do anticorpo, e uma sequência de Ckappa de um anticorpo que tem uma cadeia leve kappa, em que a sequência de Vlambda compreende uma ou mais modificações de aminoácido estabilizantes, e b) expressar a cadeia leve quimérica Vlambda-Ckappa com a cadeia pesada de imunoglobulina para obter um anticorpo com estabilidade térmica aumentada.

58. Método para tratar câncer, doença autoimune, um distúrbio inflamatório ou uma doença infecciosa num indivíduo caracterizado pelo fato de que que compreende administrar uma quantidade eficaz do heterodímero quimérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, ou do construto de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 44.

59. Uso de uma quantidade eficaz do heterodímero quimérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, ou do construto de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 44, caracterizado pelo fato de que é no tratamento de câncer, doença autoimune, um distúrbio inflamatório ou uma doença infecciosa num indivíduo.

60. Uso do heterodímero quimérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, ou do construto de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 44, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para o tratamento de câncer, doença autoimune, um distúrbio inflamatório ou uma doença infecciosa.

61. Heterodímero quimérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, ou do construto de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 44, caracterizado pelo fato de que para uso no tratamento de câncer, doença autoimune, um distúrbio inflamatório ou uma doença infecciosa num indivíduo.