BR112014006919B1

BR112014006919B1 - Método para intensificar o crescimento e/ou rendimento de plantas

Info

Publication number: BR112014006919B1
Application number: BR112014006919-0A
Authority: BR
Inventors: R. Stewart Smith; Ahsan Habib
Original assignee: Novozymes Bioag A/S; Novozymes Biologicals, Inc.
Priority date: 2011-09-23
Filing date: 2012-09-24
Publication date: 2019-05-21
Also published as: US12185720B2; CA2849898C; US20210400964A1; NZ622561A; RU2647905C1; AU2012312003A1; CN104066322B; US9055746B2; US11134683B2; BR112014006919A2; US10206396B2; UA114299C2; US9414592B2; WO2013044208A3; AU2015258274A1; CA2849898A1; AR088010A1; RU2015136854A; RU2688455C1; CN107258790A

Abstract

método para intensificar o crescimento e/ou rendimento de plantas são descritos métodos para intensificar o crescimento de plantas, compreendendo tratar as sementes de plantas ou a planta que germina a partir da semente com uma quantidade eficaz de pelo menos um quitooligossacarídeo, em que, na colheita, a planta demonstra pelo menos um rendimento aumentado das plantas medida em termos de 67,25 kg/ha, número de raiz aumentado, comprimento da raiz aumentado, massa da raiz aumentada, volume da raiz aumentado e área da folha aumentada, comparado com as plantas não tratadas ou plantas colhidas a partir de semente não tratada.

Description

“MÉTODO PARA INTENSIFICAR O CRESCIMENTO E/OU RENDIMENTO DE PLANTAS”

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [0001] A simbiose entre as bactérias do solo gram-negativas,

Rhizobiaceae e Bradyrhizobiaceae, e leguminosas como soja, é bem documentada. A base bioquímica para estas relações inclui uma troca de sinalização molecular, em que os compostos sinais da planta para bactérias incluem flavonas, isoflavonas e flavanonas, e os compostos sinais de bactérias para as plantas, que incluem os produtos finais da expressão dos genes nod bradirrizóbicos e rizóbicos, conhecidos como lipoquito-oligossacarídeos (LCOs). A simbiose entre essas bactérias e as leguminosas permite à leguminosa fixar o nitrogênio atmosférico para o crescimento das plantas, eliminando assim a necessidade de fertilizantes nitrogenados. Uma vez que os fertilizantes nitrogenados podem aumentar significativamente o custo dos cultivos e estão associados a uma série de efeitos poluentes, a indústria agrícola continua seus esforços para explorar esta relação biológica e desenvolver novos agentes e métodos para intensificar o rendimento das plantas, sem aumentar o uso de fertilizantes com base em nitrogênio.

[0002] A patente US 6.979.664 ensina um método para intensificar a germinação das sementes ou emergência das plântulas de um cultivo de plantas, compreendendo as etapas de fornecer de uma composição que compreende uma quantidade eficaz de, pelo menos, um lipoquitooligossacarídeo e um carreador agricolamente apropriado e aplicação da composição na proximidade imediata de uma semente ou muda, em uma quantidade eficaz para intensificar a germinação de sementes com emergência das plântulas em comparação com semente ou plântula não tratada.

[0003] Outro desenvolvimento deste conceito é ensinado em WO

2005/ 062899 dirigido a combinações de, pelo menos, um indutor de planta, ou seja, um LCO, em combinação com um fungicida, inseticida, ou combinação dos mesmos, para intensificar uma característica da planta, tais

Petição 870190021084, de 01/03/2019, pág. 9/19 / 52 como permanência em pé, crescimento, vigor e /ou rendimento da planta. As composições e métodos são ensinados como sendo aplicáveis a ambas as leguminosas e não leguminosas, e podem ser usadas para tratar uma semente (logo antes do plantio) plântulas, raízes ou planta.

[0004] Similarmente, WO 2008/085958 ensina composições para intensificar o crescimento das plantas e o rendimento do cultivo em ambas as leguminosas e as não leguminosas, e que contêm LCOs em combinação com outro agente ativo, como uma quitina ou quitosana, um composto flavonóide, ou um herbicida, e que podem ser aplicadas a sementes e/ou plantas concomitantemente ou sequencialmente. Como no caso da Publicação '899, a Publicação '958 ensina o tratamento de sementes logo antes do plantio.

[0005] Mais recentemente, Halford, “Smoke Signals”, em Chem. Eng.

News (12 de abril de 2010), nas páginas 37 - 38 relata que karriquinas ou butenolídeos que estão contidos na fumaça atuam como estimulantes de crescimento e estimulam a germinação de sementes após um incêndio florestal, e podem revigorar sementes como milho, tomate, alface e cebola que tinham sido armazenadas. Estas moléculas são o assunto da Patente US 7.576.213.

[0006] Existe, no entanto, ainda uma necessidade para sistemas para intensificar ou acentuar o crescimento de plantas.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0007] Um primeiro aspecto da presente invenção é dirigido a um método para intensificar o crescimento da planta, compreendendo a) tratar (por exemplo, aplicar a) as sementes de planta ou uma planta que germina a partir da semente, com uma quantidade eficaz de, pelo menos, um quitooligossacarídeo (CO), em que, na colheita, a planta exibe, pelo menos, um dentre um rendimento aumentado de planta medida em termos de 67,25 kg/ha (1 bushel/acre), número de raiz aumentado, comprimento da raiz aumentado, massa da raiz aumentada, volume da raiz aumentado e área foliar aumentada, / 52 em comparação com plantas não tratadas ou plantas colhidas a partir de sementes não tratadas.

[0008] Em algumas formas de realização, pelo menos dois CO's são usados. Em algumas formas de realização, o tratamento da semente inclui a aplicação direta de, pelo menos, um CO sobre a semente, que pode então ser plantada ou armazenada durante um período de tempo, antes do plantio. O tratamento da semente pode também incluir o tratamento indireto, tal como por introdução de, pelo menos, um CO no solo (conhecido na técnica como na aplicação no sulco). Em ainda outras formas de realização, pelo menos, um CO pode ser aplicado à planta, que germina a partir da semente, por exemplo, através de pulverização foliar. Os métodos podem também incluir o uso de outros agentes agronomicamente benéficos, tais como micronutrientes, ácidos graxos e derivados dos mesmos, moléculas sinais de plantas (diferentes de CO's, como lipoquito-oligossacarídeos, compostos quitinosos (diferentes de COs), flavonóides, ácido jasmônico, o ácido linoleico e ácido linoleico e seus derivados, e karriquinas), herbicidas, fungicidas e inseticidas, microrganismos solubilizadores de fosfato, diazotrófos (inoculantes rizóbicos), e/ou fungos micorrízicos.

[0009] Os métodos da presente invenção são aplicáveis para leguminosas e não leguminosas parecidas. Em algumas formas de realização, a semente de leguminosa é a semente de soja. Em algumas outras formas de realização, a semente que é tratada é uma semente de não leguminosa tal como sementes de cultivos de campo, por exemplo, um cereal, como milho, ou uma semente de cultivo de leguminosa, como batata.

[00010] Como demonstrado pelos exemplos de trabalho, que resumem testes realizados tanto em estufa como no campo, os resultados obtidos pelos métodos da presente invenção mostram que a aplicação de, pelo menos, um CO para a semente ou uma planta que germina a partir de uma semente, resulta em crescimento intensificado da planta. Acredita-se que estes / 52 resultados são inesperados, particularmente do ponto de vista de que COS eram conhecidas por estarem envolvidos na resistência adquirida do sistema (SAR), mas não necessariamente envolvidos na intensificação direta de crescimento de plantas. Os resultados aqui descritos mostram que, em alguns casos, os métodos da invenção alcançaram um efeito substancialmente igual ou, em alguns outros casos, superaram a intensificação do crescimento da planta obtida por um LCO. Os resultados obtidos com as experiências em estufa são particularmente significativos a este respeito, na medida em que eles foram conduzidos em condições substancialmente livres de doenças.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [00011] As Figs. 1a e 2a mostram as estruturas químicas de compostos de quito-oligossacarídeo (CO's) utilizáveis na prática da presente invenção.

[00012] As Figs. 1b e 2b mostram as estruturas químicas dos compostos de quito-oligossacarídeo (LCO's) que correspondem aos CO's nas Figs. 1a e 2a, e que são também utilizáveis na prática da presente invenção.

[00013] As Figs. 3a e 4a mostram as estruturas químicas de outros CO's utilizáveis na prática da presente invenção.

[00014] As Figs. 3b e 4b mostram as estruturas químicas dos fatores Myc que correspondem aos CO's nas Figs. 3a e 3b, e que são também utilizáveis na prática da presente invenção.

[00015] A Fig. 5 é um gráfico de barra que ilustra o efeito de um CO _-7 _-8 inventivo (ilustrado na Fig. 2a) em três concentrações diferentes (10 , 10 e 10^-9 M) comparado com duas fontes diferentes do LCO ilustrado na Fig. 1b, e um controle, tratado sobre semente de tomate, expresso em termos de comprimento médio da raiz de plântula.

[00016] A Fig. 6 é um gráfico de barra que ilustra o efeito do CO -7 -8 inventivo (ilustrado na Fig. 2a) em três concentrações diferentes (10 , 10 e 10^-9 M) comparado com duas fontes diferentes do LCO ilustrado na Fig. 1b, e um controle, tratado sobre sementes de tomate, expresso em termos de peso / 52 médio no estado fresco de raiz da plântula.

[00017] A Fig. 7 é um gráfico de barra que ilustra o efeito do CO inventivo (ilustrado na Fig. 2a) em uma concentração média (de três concentrações) comparado com duas fontes diferentes do LCO ilustrado na Fig. 1b, tratado sobre sementes de tomate, expresso em termos de comprimento médio da raiz da plântula.

[00018] A Fig. 8 é um gráfico de barra que ilustra o efeito do CO inventivo (ilustrado na Fig. 2a) em uma concentração média (de três concentrações) comparado com duas fontes diferentes do LCO ilustrado na Fig. 1b, tratado sobre plantas de tomate, expresso em termos de peso médio no estado fresco de raiz da plântula.

[00019] A Fig. 9 é um gráfico de barras que ilustra o efeito do CO inventivo (ilustrado na Fig. 2a) comparado com o LCO ilustrado na Fig. 2b, e um controle, tratado sobre plantas de algodão, expresso em termos de peso seco médio de cada plântula por tratamento.

[00020] As Figs. 10 (experimento 1) e 11 (experimento 2) são gráficos de barra que mostram o efeito do CO ilustrado na Fig. 2a, comparado com o LCO ilustrado na Fig. 2b, e uma mistura de compostos quitinosos (não inventivos) produzidos por quitinase, tratado sobre semente de milho, expresso em termos de peso seco médio de brotos, raízes e peso seco total (combinado com o peso seco de brotos e raízes).

[00021] A Fig. 12 é um gráfico de barras que ilustra o efeito do CO ilustrado na Fig. 2a, comparado com o LCO ilustrado na Fig. 2b, uma mistura de CO's produzidos por quitinase, um isoflavonóide, e um controle, tratado sobre semente de soja, expresso em termos de área de superfície de folha.

[00022] A Fig. 13 é um gráfico de barras que ilustra o efeito do CO ilustrado na Fig. 2a, o LCO ilustrado na Fig. 1b, um isoflavonóide, e a mistura dos compostos quitinosos não inventivos (obtidos a partir de quitosana via um processo enzimático), tratado sobre sementes de soja, expresso em termos de / 52 peso seco médio de planta de soja.

[00023] A Fig. 14 é um gráfico de barras que ilustra o efeito do CO ilustrado na Fig. 2a, sozinho ou em combinação com um ou dois ácidos graxos, comparado com o LCO ilustrado na Fig. 2b, e água, sobre a deformação de cabelo da raiz de Siratro, expresso em termos de porcentagem.

[00024] Fig. 15 é um gráfico que ilustra o efeito do CO ilustrado na Fig. 2a, sozinho ou em combinação com um ou dois ácidos graxos, comparado com o LCO ilustrado na Fig. 2b, e água, tratado sobre semente de canola, expresso em termos de porcentagem de germinação de semente.

[00025] A Fig. 16 é um gráfico que ilustra o efeito do CO ilustrado na Fig. 2a, sozinho ou em combinação com um ou dois ácidos graxos, comparado com o LCO ilustrado na Fig. 2b, e água, tratado sobre semente de trigo, expresso em termos de porcentagem de germinação de semente.

[00026] A Fig. 17 é um gráfico que ilustra o efeito do CO ilustrado na Fig. 2a, sozinho ou em combinação com um ou dois ácidos graxos, comparado com o LCO ilustrado na Fig. 2b, e água, tratado sobre semente de alfafa, expresso em termos de porcentagem de germinação de semente.

[00027] A Fig. 18 é um gráfico de “torta” que ilustra o efeito do CO ilustrado na Fig. 2a, sozinho ou em combinação com um de dois diferentes ácidos graxos, comparado com o LCO ilustrado na Fig. 2b, e água, tratado sobre semente de milho, expresso em termos de porcentagem de germinação de semente.

[00028] A Fig. 19 é um gráfico que ilustra o efeito do CO ilustrado na Fig. 2a, sozinho ou em combinação com um de dois diferentes ácidos graxos, comparado com o LCO ilustrado na Fig. 2b, cada um dos ácidos graxos sozinhos, e um controle, tratado sobre semente de milho, expresso em termos de porcentagem de germinação de semente.

[00029] A Fig. 20 é um gráfico que ilustra o efeito do CO ilustrado na Fig. 2a, sozinho ou em combinação com um de dois diferentes ácidos graxos, / 52 o CO mais ambos os ácidos graxos, comparado com o LCO ilustrado na Fig. 2b, e um controle, tratado sobre semente de trigo, expresso em termos de porcentagem de germinação de semente.

[00030] A Fig. 21 é um gráfico de barras que ilustra o efeito do CO ilustrado na Fig. 2a, sozinho ou em combinação com um de quatro diferentes ácidos graxos, comparado com o LCO ilustrado na Fig. 2b, e água, tratado sobre semente de Vicia sativa, expresso em termos de porcentagem de germinação de semente.

[00031] A Fig. 22 é um gráfico de barras que ilustra o efeito do CO ilustrado na Fig. 2a, sozinho ou em combinação com um de dois diferentes ácidos graxos, comparado com o LCO ilustrado na Fig. 2b, e um controle, tratado sobre as raízes de Vicia sativa, expresso em termos de comprimento médio da raiz.

[00032] A Fig. 23 é um gráfico de barras que ilustra o efeito do CO ilustrado na Fig. 2a, sozinho ou em combinação com um de dois diferentes ácidos graxos, comparado com o LCO ilustrado na Fig. 2b, e água, tratado sobre semente de feijão mungo verde, feijão lab-lab, lentilha vermelha e trevo vermelho, expresso em termos de porcentagem de germinação de semente.

[00033] A Fig. 24 é um gráfico de barras que ilustra o efeito do CO ilustrado na Fig. 2a, sozinho ou em combinação com um de dois diferentes ácidos graxos, comparado com o LCO ilustrado na Fig. 2b, e água, sobre o crescimento da plântula de tomate, expresso em termos de comprimento médio da raiz.

[00034] A Fig. 25 é um gráfico de barras que ilustra o efeito do CO ilustrado na Fig. 2a, sozinho ou em combinação com um de dois diferentes ácidos graxos, comparado com o LCO ilustrado na Fig. 1b, sobre semente de soja, expresso em termos de comprimento médio do radículo.

[00035] A Fig. 26 é um gráfico de barras que ilustra o efeito do CO ilustrado na Fig. 2a, comparado com o LCO ilustrado na Fig. 2b, e água, / 52 tratado sobre semente de algodão, expresso em termos de peso seco médio da planta.

[00036] A Fig. 27 é um gráfico de barras que ilustra o efeito do CO ilustrado na Fig. 2a, comparado com o LCO ilustrado na Fig. 1b, e uma mistura de CO's produzidos por quitinase, tratado sobre plantas de soja, expresso em termos de biomassa seca média de planta.

[00037] A Fig. 28 é um gráfico de barras que ilustra o efeito do CO ilustrado na Fig. 2a, sozinho ou em combinação com o LCO ilustrado na Fig. 2b, comparado com o LCO ilustrado na Fig. 2b e água, tratado sobre semente de milho, expresso em termos de peso seco médio da planta.

[00038] A Fig. 29 é um gráfico de barras que ilustra o efeito do CO ilustrado na Fig. 2a, sozinho ou em combinação com o LCO ilustrado na Fig. 2b, comparado com o LCO ilustrado na Fig. 2b e água, tratado sobre semente de sorgo, expresso em termos de comprimento médio da raiz da plântula.

[00039] A Fig. 30 é um gráfico de barras que ilustra o efeito do CO ilustrado na Fig. 2a, sozinho ou em combinação com um micronutriente, comparado com água, tratado sobre plantas de algodão, expresso em termos de teor médio de clorofila.

[00040] A Fig. 31 é um gráfico de barras que ilustra o efeito do CO ilustrado na Fig. 2a, sozinho ou em combinação com um micronutriente, comparado com água, tratado sobre plantas de algodão, expresso em termos de peso seco médio da planta.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Quito-oligossacarídeos [00041] COs são conhecidos na arte como estruturas de N-acetil glucosamina β-1-4 ligada identificadas como oligômeros de quitina, também como N-acetilquito-oligossacarídeos. CO's têm decorações de cadeia lateral singulares e diferentes o que os tornam diferentes das moléculas de quitina [(C₈H₁₃NO₅)_n, CAS No. 1398-61-4], e moléculas de quitosana [(C₅HiiNO₄)_n, / 52

CAS No. 9012-76-4]. Ver, por exemplo, Hamel et al, Planta 232: 787- 806 (2010) (por exemplo, a Fig. 1 mostra estruturas de quitina, quitosana, fatores Nod (LCO's) e os CO's correspondentes (que poderiam faltar o grupo acila 18C, 16C ou 20C) Os CO's da presente invenção também são relativamente solúveis em água em comparação com a quitina e quitosana, e em algumas formas de realização, como descrito aqui abaixo, são pentaméricos. Literatura representativa descrevendo a estrutura e a produção de COs que podem ser apropriados para uso na presente invenção é como a seguir: Muller, et al., Plant Physiol. 124:733-9 (2000); Van der Holst, et al., Current Opinion in Structural Biology, 11:608-616 (2001) (por exemplo, Fig. 1 no mesmo); Robina, et al., Tetrahedron 58:521-530 (2002); D'Haeze, et al., Glycobiol. 12(6):79R-105R (2002); Rouge, et al. Chapter 27, “The Molecular Immunology of Complex Carbohydrates” in Advances in Experimental Medicine and Biology, Springer Science; Wan, et al., Plant Cell 21:1053-69 (2009); PCT/F100/00803 (9/21/2000); and Demont-Caulet, et al., Plant Physiol. 120(1):83-92 (1999).

[00042] CO's diferem de LCO's em termos de estrutura principalmente em que são privados da cadeia de ácido graxo pendente. CO's derivados de rizóbios, e derivados sintéticos de ocorrência não natural dos mesmos, que podem ser utilizáveis na prática da presente invenção podem ser representados pela seguinte fórmula:

em que R1 e R2 cada independentemente representa hidrogênio ou metila; R3 representa hidrogênio, acetila ou carbamoíla; R4 representa hidrogênio, acetila ou carbamoíla; R5 representa hidrogênio, acetila ou / 52 carbamoíla; R₆ representa hidrogênio, arabinosila, fucosila, acetila, sulfato éster, 3-0-S-2-0-MeFuc, 2-0-MeFuc, e 4-0-AcFuc; R₇ representa hidrogênio, manosila ou glicerol; R₈ representa hidrogênio, metila, ou -CH₂OH; R₉representa hidrogênio, arabinosila, ou fucosila; R10 representa hidrogênio, acetila ou fucosila; e n representa 0, 1, 2 ou 3. As estruturas de LCO's rizóbicos correspondentes são descritas em D'Haeze, et al., supra.

[00043] Dois CO's apropriados para uso na presente invenção são ilustrados nas Figs. 1a e 2a. Eles correspondem aos LCO's produzidos por Bradyrhizobium japonicum e R. leguminosarum biovar viciae respectivamente, que interagem simbioticamente com soja e ervilha, respectivamente, mas que são privados das cadeias de ácido graxo. Os LCO's correspondentes produzidos por estas rizóbias (e que são também utilizáveis na prática da presente invenção) são ilustrados em Figs. 1b e 2b.

[00044] As estruturas de ainda outros CO's que podem ser apropriados para uso na prática da presente invenção são facilmente deriváveis de LCOs obtidos (isto é, isolados e/ou purificados) a partir de fungos micorrízicos, como fungos do grupo Glomerocycota, por exemplo, Glomus intraradices. Ver, por exemplo, WO 2010/049751 e Maillet, et al., Nature 469:58-63 (2011) (os LCOs descritos nos mesmos também referidos como “fatores Myc”). CO's derivados de fungos micorrízicos representativos são representados pela seguinte estrutura:

HO

OH em que n = 1 ou 2; R₁ representa hidrogênio ou metila; e R₂representa hidrogênio ou SO3H. Dois outros CO's apropriados para uso na / 52 presente invenção, um de que é sulfatado, e o outro sendo não sulfatado, são ilustrados nas Figs. 3a e 4a respectivamente. Eles correspondem a dois LCO's diferentes produzidos pelos fungos micorrízicos Glomus intraradices, e que são ilustrados nas Figs. 3b e 4b (e que são também utilizáveis na prática da presente invenção).

[00045] Os COs podem ser sintéticos ou recombinantes. Métodos para preparação de CO's sintéticos são descritos, por exemplo, em Robina, supra. Métodos para produzir CO's recombinantes, por exemplo, usando E. coli como um hospedeiro, são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Dumon, et al., ChemBioChem 7:359-65 (2006), Samain, et al., Carbohydrate Res. 302:35-42 (1997); Cottaz, et al., Meth. Eng. 7(4):311-7 (2005) e Samain, et al., J. Biotechnol. 72:33-47 (1999) (por exemplo, Fig. 1 no mesmo que mostra estruturas de CO's que podem ser feitas de modo recombinante em E. coli abrigando combinações diferentes de genes nodBCHL). Para os fins da presente invenção, o pelo menos um CO é estruturalmente distinto de quitinas, quitosanas, e outros quito-oligossacarídeos feitos enzimaticamente usando quitina como um material de partida.

[00046] Para fins da presente invenção, o pelo menos um CO recombinante é pelo menos 60% puro, por exemplo, pelo menos 60% puro, pelo menos 65% puro, pelo menos 70% puro, pelo menos 75% puro, pelo menos 80% puro, pelo menos 85% puro, pelo menos 90% puro, pelo menos 91% puro, pelo menos 92% puro, pelo menos 93% puro, pelo menos 94% puro, pelo menos 95% puro, pelo menos 96% puro, pelo menos 97% puro, pelo menos 98% puro, pelo menos 99% puro, até 100% puro.

[00047] As sementes podem ser tratadas com pelo menos um CO em vários modos como pulverização ou gotejamento. A pulverização e o tratamento por gotejamento podem ser conduzidos formulando uma quantidade eficaz de, pelo menos, um CO em um carreador agricolamente aceitável, tipicamente aquoso na natureza, e pulverizar ou gotejando a / 52 composição sobre a semente via um sistema de tratamento contínuo (que é calibrado para aplicar um tratamento em uma taxa pré-definida na proporção do fluxo contínuo de semente), como um tipo de tambor de dispositivo tratador. Estes métodos vantajosamente empregam volumes relativamente pequenos de carreador de modo a permitir a secagem relativamente rápida da semente tratada. Deste modo, grandes volumes de semente podem ser eficientemente tratados. Sistemas de bateladas, em que um tamanho de batelada pré-determinado de semente e composições de moléculas sinais são distribuídos em um misturador, também podem ser empregados. Sistemas e aparelhos para realizar estes processos são comercialmente disponíveis a partir de numerosos fornecedores, por exemplo, Bayer CropScience (Gustafson).

[00048] Em outra forma de realização, o tratamento acarreta revestir as sementes com o pelo menos um CO. Tal processo envolve revestimento da parede interna de um recipiente redondo com a composição, adicionando sementes, então girando o recipiente para levar as sementes a contatar a parede e a composição, um processo conhecido na arte como “revestimento em recipiente”. As sementes podem ser revestidas por combinações de métodos de revestimento. O embebimento tipicamente acarreta uso de uma solução aquosa contendo o agente intensificador do crescimento de plantas. Por exemplo, sementes podem ser embebidas durante cerca de 1 minuto a cerca de 24 horas (por exemplo, durante pelo menos 1 min, 5 min, 10 min, 20 min, 40 min, 80 min, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h). Alguns tipos de sementes (por exemplo, sementes de soja) tendem a ser sensíveis à umidade. Assim, o embebimento de tais sementes durante um período prolongado de tempo pode não ser desejável, em que caso o embebimento é tipicamente realizado durante cerca de 1 minuto a cerca de 20 minutos.

[00049] Nas formas de realização que acarretam o armazenamento de sementes após aplicação de, pelo menos, um CO, aderência do CO à semente / 52 durante qualquer porção de tempo do período de armazenamento não é crítico. Sem pretender ser limitado por qualquer teoria particular de operação, os requerentes acreditam que mesmo na extensão em que o tratamento não pode levar a molécula sinal de plantas a permanecer em contato com a superfície de semente após o tratamento e durante qualquer parte de armazenamento, o CO pode alcançar seu efeito pretendido por um fenômeno conhecido como memória da semente ou percepção da semente. Ver, Macchiavelli, et al., J. Exp. Bot. 55(408):1635-40 (2004). Os Requerentes também acreditam que após o tratamento o CO difunde em direção ao radículo jovem em desenvolvimento e ativam os genes simbióticos e de desenvolvimento que resulta em uma mudança na arquitetura da raiz da planta. Mesmo assim, na extensão desejável, as composições contendo o CO podem ainda conter um agente de aderência ou de revestimento. Para fins estéticos, as composições podem ainda conter um polímero de revestimento e/ou um colorante.

[00050] A quantidade total de, pelo menos, um CO é eficaz para intensificar o crescimento de modo que, na colheita, a planta exibe pelo menos um rendimento da planta aumentado medida em termos de 67,25 kg/ha (1 bushel/acre), número de raiz aumentado, comprimento da raiz aumentado, massa de raiz aumentada, volume de raiz aumentado e área de folha aumentada, em comparação com as plantas não tratadas ou plantas cultivadas a partir de semente não tratada (com um dos ativos). A quantidade eficaz de, pelo menos, um CO usado para tratar a semente, expressa em unidades de concentração, geralmente está nas faixas de cerca de 10^-5 a cerca de 10^-14 M (concentração molar), e em algumas formas de realização, de cerca de 10^-5 a -11 -7 cerca de 10 M, e em algumas outras formas de realização de cerca de 10 a o cerca de 10 M. Expressa em unidades de peso, a quantidade eficaz geralmente está na faixa de cerca de 1 a cerca de 400 gg/50,8 kg (cwt) de semente, e em algumas formas de realização de cerca de 2 a cerca de 70 / 52 gg/50,8 kg (cwt), e em algumas outras formas de realização, de cerca de 2,5 a cerca de 3,0 gg/50,8 kg (cwt) de semente.

[00051] Para fins de tratamento de sementes indiretamente, isto é, no tratamento dentro do sulco, a quantidade eficaz de, pelo menos, um CO geralmente está na faixa de 1 gg/0,404 hectare (2,5 gg/hectare) a cerca de 70 gg/0,404 hectare (173,3 gg/hectare), e em algumas formas de realização, de cerca de 50 gg/0,404 hectare (123,8 gg/hectare) (123,8 gg/hectare) a cerca de 60 gg/0,404 hectare (148,5 gg/hectare) (148,5 gg/hectare). Para fins de aplicação nas plantas, a quantidade eficaz do CO geralmente está na faixa de 1 gg/0,404 hectare (2,5 gg/hectare) (2,5 gg/hectare) a cerca de 30 gg/0,404 hectare (74,3 gg/hectare), e em algumas formas de realização, de cerca de 11 gg/0,404 hectare (2,5 gg/hectare) a cerca de 20 gg/0,404 hectare (49,5 gg/hectare) (49,5 gg/hectare).

[00052] Semente pode ser tratada com o pelo menos um CO logo antes de ou no momento do plantio. O tratamento no momento do plantio pode incluir aplicação direta na semente como descrito acima, ou em algumas outras formas de realização, introduzindo os ativos no solo, conhecido na arte como no tratamento dentro do sulco. Nas formas de realização que acarretam o tratamento de semente seguido por armazenamento, a semente pode ser então embalada, por exemplo, em sacos de 22,67kg ou de 45,3 kg ou sacos em bruto ou contêineres, de acordo com técnicas padrões. A semente pode ser armazenada durante pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 meses, e mesmo mais, por exemplo, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 meses, ou ainda mais tempo, sob condições de armazenamento apropriadas que são conhecidas na arte. Enquanto que a semente de soja pode precisar ser plantada na estação seguinte, as sementes de milho podem ser armazenadas durante períodos muito mais longos de tempo incluindo até 3 anos.

/ 52

Outros agentes agronomicamente benéficos [00053] A presente invenção pode ainda incluir tratamento da semente ou as plantas que germinam a partir da semente com pelo menos um agente agricolamente/agronomicamente benéfico. Como usado aqui e na arte, o termo “agricolamente ou agronomicamente benéfico” refere-se aos agentes que quando aplicados às sementes ou plantas resultam em uma intensificação acentuada (que pode ser estatisticamente significante) de características da planta como permanência em pé da planta, crescimento (por exemplo, como definido em conexão com CO's), ou vigor em comparação com sementes ou plantas não tratadas. Estes agentes podem ser formulados juntos com pelo menos um CO ou aplicados à semente ou planta via uma formulação separada. Exemplos representativos de tais agentes que podem ser utilizáveis na prática da presente invenção incluem micronutrientes (por exemplo, vitaminas e minerais em traços), ácidos graxos e derivados dos mesmos, moléculas sinais de plantas (diferente de CO's), herbicidas, fungicidas e inseticidas, microrganismos solubilizadores de fosfato, diazótrofos (inoculantes rizóbicos), e/ou fungos micorrízicos.

Micronutrientes [00054] Vitaminas representativas que podem ser utilizáveis na prática da presente invenção incluem pantotenato de cálcio, ácido fólico, biotina, e vitamina C. Exemplos representativos de minerais em traços que podem ser utilizáveis na prática da presente invenção incluem boro, cloro, manganês, ferro, zinco, cobre, molibdênio, níquel, selênio e sódio.

[00055] A quantidade de, pelo menos, um micronutriente usado para tratar a semente, expressa em unidades de concentração, geralmente está na faixa de 10 ppm e 100 ppm, e em algumas formas de realização, de cerca de 2 ppm a cerca de 100 ppm. Expressa em unidades de peso, a quantidade eficaz geralmente está na faixa, em uma forma de realização, de cerca de 180 gg a cerca de 9 mg/50,8 kg (cwt) de semente, e em algumas formas de realização / 52 de cerca de 4 gg a cerca de 200 gg/planta quando aplicado em folhagem. Em outras palavras, para fins de tratamento de semente a quantidade eficaz de, pelo menos, um micronutriente geralmente na faixa de 30 iig/0,404 hectare (74,3 gg/hectare) a cerca de 1,5 mg/0,404 hectare (3,71 gg/hectare), e em algumas formas de realização, de cerca de 120 mg/0,404 hectare (297,1 gg/hectare) a cerca de 6 g/0,404 hectare (14,9 gg/hectare) quando aplicado foliarmente.

Ácidos graxos [00056] Os ácidos graxos representativos que podem ser úteis na prática da presente invenção incluem os ácidos graxos que são substituintes no LCO de ocorrência natural, tais como os ácidos esteárico e palmítico. Outros ácidos graxos que podem ser úteis incluem ácidos graxos C12 - 18 saturados que (além de ácidos palmítico e esteárico) incluem o ácido láurico e ácido mirístico, e ácidos graxos C12 - 18insaturados tais como o ácido miristoleico, ácido palmitoleico, ácido sapiênico, oleico, ácido elaídico, ácido vacênico, ácido linoleico, ácido linolênico, e ácido linoelaídico. O ácido linoleico e ácido linolênico são produzidos no curso da biossíntese do ácido jasmônico (que, como descrito abaixo, é também um agente agronomicamente benéfico para os fins da presente invenção). O ácido linoleico e ácido linolênico (e seus derivados) são relatados como sendo indutores de expressão de genes nod ou produção de LCO por rizobactérias. Ver, por exemplo, Mabood, Fazli, “Linoleic and linolenic acid induce the expression of nod genes in Bradyrhizobium japonicum” USDA 3, 17 de maio de 2001.

[00057] Derivados utilizáveis de ácidos graxos que podem ser úteis na prática da presente invenção incluem ésteres, amidas, glicosídeos e sais. Ésteres representativos são compostos em que o grupo carboxila do ácido graxo, por exemplo, ácido linoleico e ácido linolênico, foi substituído com um grupo -COR, em que R é um grupo OR¹, em que R¹ é: um grupo alquila, tal / 52 como grupo alquila C₁ - C₈ não ramificado ou ramificado, por exemplo, um grupo metila, etila ou propila, um grupo alquenila, tal como um grupo alquenila C₂-C₈ não ramificado ou ramificado, um grupo alquinila, tal como um grupo alquinila C₂-C₈ não ramificado ou ramificado, um grupo arila tendo, por exemplo, de 6 a 10 átomos de carbono, ou um grupo heteroarila tendo, por exemplo, 4 a 9 átomos de carbono, em que os heteroátomos no grupo heteroarila podem ser, por exemplo, N, O, P, ou S. As amidas representativas são compostos nos quais o grupo carboxila do ácido graxo, por exemplo, ácido linoleico e ácido linolênico, foi substituído com um grupo -COR, em que R é um grupo NR R , em que R e R são independentemente : hidrogênio ; um grupo alquila, tal como um grupo alquila C₁-C₈ não ramificado ou ramificado, por exemplo, um grupo metila, etila ou propila, um grupo alquenila, tal como um grupo alquenila C2-C8 não ramificado ou ramificado, um grupo alquinila, tal como um grupo alquinila C2-C8 não ramificado ou ramificado; um grupo arila com, por exemplo, de 6 a 10 átomos de carbono, ou um grupo heteroarila tendo, por exemplo, 4 a 9 átomos de carbono, em que os heteroátomos no grupo heteroarila podem ser, por exemplo, N, O, P ou S. Ésteres podem ser preparados por métodos conhecidos, tais como adição nucleofílica catalisada por ácido, em que o ácido carboxílico é reagido com um álcool na presença de uma quantidade catalítica de um ácido mineral. As amidas também podem ser preparadas por métodos conhecidos, tais como por reação do ácido carboxílico com a amina apropriada na presença de um agente de copulação, tal como diciclohexil carbodi-imida (DCC), sob condições neutras. Os sais adequados de ácidos graxos, por exemplo, ácido linoleico e ácido linolênico, incluem, por exemplo, sais de adição de base. As bases que podem ser usadas como reagentes para preparar sais de base metabolicamente aceitáveis destes compostos incluem aqueles derivados a partir de cátions tais como cátions de metais alcalinos (por exemplo, potássio e sódio) e cátions de metais alcalinos / 52 terrosos (por exemplo, cálcio e magnésio). Estes sais podem ser facilmente preparados pela mistura de uma solução do ácido graxo com uma solução da base. O sal pode ser precipitado a partir da solução e pode ser coletado por filtração ou pode ser recuperado por outros meios tais como evaporação do solvente.

[00058] As quantidades do ácido graxo ou derivado do mesmo estão tipicamente entre cerca de 10% a cerca de 30% e, em algumas formas de realização cerca de 25% da quantidade do, pelo menos, um CO.

Moléculas sinais de plantas [00059] A presente invenção também pode incluir tratamento de semente ou planta com uma molécula sinal de plantas diferente de um CO. Para fins da presente invenção, o termo “molécula sinal de plantas”, que pode ser usado de modo interpermutável com “agente intensificador do crescimento de plantas” amplamente refere-se a qualquer agente, ambos de ocorrência natural em plantas ou micróbios, como sintéticos (e que podem ser de ocorrência não natural) que diretamente ou indiretamente ativam uma via bioquímica de planta, resultando no crescimento de planta aumentado, mensurável pelo menos em termos de, pelo menos, um de rendimento medido aumentado em termos de 67,25 kg/ha (bushels/acre), número de raízes aumentado, comprimento da raiz aumentado, massa de raiz aumentada, volume de raiz aumentado e área de folha aumentada, em comparação com as plantas não tratadas ou plantas cultivadas a partir de sementes não tratadas. Exemplos representativos de moléculas sinais de plantas que podem ser utilizáveis na prática da presente invenção incluem lipo-quitooligossacarídeos, compostos quitinosos (diferentes de COs), flavonóides, ácido jasmônico, ácido linoleico e ácido linolênico e seus derivados (supra), e karriquinas.

[00060] Compostos de lipo-quito-oligossacarídeos (LCO's), também conhecidos na arte como sinais Nod simbióticos ou fatores Nod, consistem de / 52 uma estrutura dorsal de oligossacarídeo de resíduos de A-acetil-Dglucosamina P-l,4-ligada (“GIcNAc”) com uma cadeia acila graxa N-ligada condensada na extremidade não redutora. LCO's diferem no número de resíduos de GIcNAc na estrutura dorsal, no comprimento e grau de saturação da cadeia acila graxa, e nas substituições de resíduos de açúcar redutor e não redutor. Ver, por exemplo, Denarie, et al., Ann. Rev. Biochem. 65:503-35 (1996), Hamel, et al., supra, Prome et al (Pure & Appl. Chem. 70(1) 55-60 (1998). (Um exemplo de um LCO é apresentado abaixo como fórmula I

G é uma hexosamina que pode ser substituída, por exemplo, por um grupo acetila no nitrogênio, um grupo sulfato, um grupo acetila e/ou um grupo éter em um oxigênio,

R1, R2, R3, R5, R6 e R7, que podem ser iguais ou indiferentes, representam H, CH3 CO--, Cx Hy CO-- onde x é um número inteiro entre 0 e 17, e y é um número inteiro entre 1 e 35, ou qualquer outro grupo acila como, por exemplo uma carbamoíla,

R4 representa uma cadeia alifática mono-, di- ou tri-insaturada contendo pelo menos 12 átomos de carbono, e n é um número inteiro entre 1 e

4.

[00061] LCOs podem ser obtidos (isolados e/ou purificados) a partir de bactérias como Rhizobia, por exemplo, Rhizobium sp., Bradyrhizobium sp., Sinorhizobium sp. e Azorhizobium sp. As estruturas de LCO são características para cada tais espécies bacterianas, e cada cepa pode produzir / 52

LOC's múltiplos com estruturas diferentes. Por exemplo, LCOs específicos de S. meliloti também foram descritos na Patente US 5.549.718 como tendo a

em que R representa H ou CH₃ CO-- e n é igual a 2 ou 3.

[00062] LCOs ainda mais específicos incluem NodRM, NodRM-1, NodRM-3. Quando acetilado (o R=CH3 CO--), eles tornam-se AcNodRM-1, e

AcNodRM-3, respectivamente (Patente US 5.545.718).

[00063] LCOs de Bradyrhizobium japonicum são descritos nas Patentes US 5.175.149 e 5.321.011. Amplamente, eles são fitohormônios de pentassacarídeos compreendendo metilfucose. Um número destes LCOs derivados de B. japonicum são descritos: BjNod-V (C_18:1); BjNod-V (A_C, Ci8:i), BjNod-V (C_16:1); e BjNod-V (A_C, C_16:0), com “V” indicando a presença de cinco N-acetilglucosaminas; “Ac” uma acetilação; o número seguindo o “C” indicando o número de carbonos na cadeia lateral de ácido graxo; e o número seguindo o”:” o número de ligações duplas.

/ 52 [00064] LCO's usados nas formas de realização da invenção podem ser obtidos (isto é, isolados e/ou purificados) de cepas bacterianas que produzem LCO's, como cepas de Azorhizobium, Bradyrhizobium (incluindo B. japonicum), Mesorhizobium, Rhizobium (incluindo R. leguminosarum), Sinorhizobium (incluindo S. meliloti), e cepas bacterianas geneticamente engenheiradas para produzir LCO's.

[00065] LCO's são os determinantes primários de especificidade de hospedeiros em simbiose de leguminosas (Diaz, et al., Mol. Plant-Microbe Interactions 75:268-276 (2000)). Assim, dentro da família das leguminosas, gêneros específicos e espécies de rizóbios desenvolvem uma relação de fixação de nitrogênio simbiótica com um hospedeiro da leguminosa específico. Estas combinações planta-hospedeiro /bactérias são descritas em Hungria, et al., Soil Biol. Biochem. 29:819-830 (1997). Exemplos destas parcerias bactérias /leguminosa simbióticas incluem S. meliloti/ alfafa e trevo doce; R. leguminosarum biovar viciae/ervilhas e lentilhas; R. leguminosarum biovar phaseoli/feijões; Bradyrhizobium japonicum/sojas; e R. leguminosarum biovar trifolii/trevo vermelho. Hungria também relaciona os indutores do gene Nod de flavonóide eficazes das espécies rizóbicas, e as estruturas de LCO específicas que são produzidas pelas diferentes espécies rizóbicas. No entanto, especificidade LCO é apenas requerida para estabelecer nodulação em leguminosas. Na prática da presente invenção, uso de um dado LCO não é limitado ao tratamento de sementes ou seu parceiro simbiótico de leguminosa, a fim de obter rendimento da planta aumentado medido em termos de 67,25 kg/ha (1 bushel/acre), número de raiz aumentado, comprimento da raiz aumentado, massa de raiz aumentada, volume de raiz aumentado e área de folha aumentada, ou comparado com as plantas colhidas a partir de sementes não tratadas, ou em comparação com as plantas colhidas a partir da semente tratada com a molécula sinal logo antes de ou dentro de uma semana ou menos do plantio.

/ 52 [00066] Assim, a título de outros exemplos, LCO's e derivados de ocorrência não natural dos mesmos que podem ser utilizáveis na prática da presente invenção são representados pela seguinte fórmula:

em que R₁ representa C14:0, 3OH-C14:0, iso-C15:0, C16:0, 3OH-C16:0, iso-C15:0, C16:1, C16:2, C16:3, iso-C17:0, iso-C17:1, C18:0,

3OH-C18:0, C18:0/3-OH, C18:1, OH-C18:1, C18:2, C18:3, C18:4, C19:1 carbamoíla, C20:0, C20:1, 3-OH-C20:1, C20:1/3-OH, C20:2, C20:3, C22:1, e

C18-26(®-1)-OH (que de acordo com D'Haeze, et al., supra, inclui espécies hidroxiladas C18, C20, C22, C24 e C26 e C16:1A9, C16:2 (Δ2,9) e C16:3 (Δ2,4,9)); R₂ representa hidrogênio ou metila; R₃ representa hidrogênio, acetila ou carbamoíla; R4 representa hidrogênio, acetila ou carbamoíla; R5 representa hidrogênio, acetila ou carbamoíla; R6 representa hidrogênio, arabinosila, fucosila, acetila, sulfato éster, 3-0-S-2-0-MeFuc, 2-0-MeFuc, e 4

0-AcFuc; R₇ representa hidrogênio, manosila ou glicerol; R₈ representa hidrogênio, metila, ou -CH₂OH; R₉ representa hidrogênio, arabinosila, ou fucosila; R₁₀ representa hidrogênio, acetila ou fucosila; e n representa 0, 1, 2 ou 3. As estruturas dos LCO's rizóbicos de ocorrência natural englobados por esta estrutura são descritas em D'Haeze, et al., supra.

[00067] A título de ainda outros exemplos adicionais, um LCO obtido a partir de B. japonicum, ilustrado na Fig. 1b, pode ser usado para tratar semente de leguminosa diferente de soja e semente não leguminosa como milho. Como outro exemplo, o LCO obtenível a partir de Rhizobium leguminosarum biovar viciae ilustrado na Fig. 2b (designado LCO-V (C18:1), SP104) pode ser usado para tratar semente de leguminosas diferentes de / 52 ervilha e não leguminosas também.

[00068] Também englobado pela presente invenção é o uso de LCO's obtidos (isto é, isolados e/ou purificados) a partir de fungos micorrízicos, como fungos do grupo Glomerocycota, por exemplo, Glomus intraradicus. As estruturas de LCOs representativos obtidos a partir destes fungos são descritas em WO 2010/049751 e WO 2010/049751 (os LCOs descritos nos mesmos também referidos como “fatores Myc”). LCO's derivados de fungos micorrízicos representativos e derivados de ocorrência não natural dos

C18:1A9Z ou C18:1A11Z; e R₂ representa hidrogênio ou SO₃H. Em algumas formas de realização, os LCO's são produzidos pelos fungos micorrízicos que são ilustrados nas Figs. 3b e 4b.

[00069] Ainda englobado pela presente invenção é o uso de compostos de LCO sintéticos, como os descritos em WO 2005/063784, e LCO's recombinantes produzidos através da engenharia genética. A estrutura de LCO de ocorrência natural básica pode conter modificações ou substituições encontradas em LCO's de ocorrência natural, como os descritos em Spaink, Crit. Rev. Plant Sci. 54:257-288 (2000) e D'Haeze, et al., Glycobiology 72:79R-105R (2002). . Moléculas de oligossacarídeos precursores (COs), que, como descrito abaixo, também são utilizáveis como moléculas sinais de plantas na presente invenção) para a construção de LCOs também podem ser sintetizadas por organismos geneticamente engenheirados, por exemplo, como descrito em Samain, et al., Carbohydrate Res. 302:35-42 (1997);

/ 52

Cottaz, et al., Meth. Eng. 7(4):311-7 (2005) e Samain, et al., J. Biotechnol.

72:33-47 (1999) (por exemplo, Fig. 1 na referência mostra estruturas de CO's que podem ser feitas de modo recombinante em E. coli abrigando diferentes combinações de genes nodBCHL).

[00070] LCO's podem ser utilizados em várias formas de pureza e podem ser usados sozinhos ou na forma de um cultivo de bactérias ou fungos produzindo LCO. Por exemplo, OPTIMIZE® (comercialmente disponível a partir de Novozymes BioAg Limited) contém um cultivo de B. japonicum que produz um LCO (LCO-V(C18:1, MeFuc), MOR116) que é ilustrado na Fig. 1b. Métodos para fornecer LCO's substancialmente puros incluem simplesmente remover as células microbianas a partir de uma mistura de LCOs e o micróbio, ou continuar a isolar e purificar as moléculas de LCO através da separação de fase solvente LCO seguido por cromatografia de HPLC como descrito, por exemplo, na Patente US 5.549.718. A purificação pode ser intensificada por HPLC repetido, e as moléculas de LCO purificadas podem ser secadas por congelamento para armazenamento a longo prazo. Quito-oligossacarídeos (COs) como descritos acima podem ser usados como materiais de partida para a produção de LCOs sintéticos. Para fins da presente invenção, LCO's recombinantes apropriados para uso na presente invenção são pelo menos 60% puros, por exemplo, pelo menos 60% puros, pelo menos 65% puros, pelo menos 70% puros, pelo menos 75% puros, pelo menos 80% puros, pelo menos 85% puros, pelo menos 90% puros, pelo menos 91% puros, pelo menos 92% puros, pelo menos 93% puros, pelo menos 94% puros, pelo menos 95% puros, pelo menos 96% puros, pelo menos 97% puros, pelo menos 98% puros, pelo menos 99% puros, até 100% puros.

[00071] Outros compostos quitinosos incluem quitinas e quitosanas, que são componentes principais das paredes celulares de fungos e os exoesqueletos de insetos e crustáceos, também são compostos de resíduos de GIcNAc. Compostos quitinosos incluem quitina (IUPAC: N-[5-[[3 / 52 acetilamino-4,5-di-hidroxi-6-(hidroximetil)oxan-2il]metoximetil]-2-[[5acetilamino-4,6-di-hidroxi-2-(hidroxi metil)oxan-3-iI]metoximetil]-4-hidroxi6-(hidroximetil)oxan-3-is]etanamida), e quitosana, (IUPAC: 5-amino-6-[5amino-6-[5-amino-4,6-di-hidroxi-2(hidroximetil)oxan-3-il]oxi-4-hidroxi-2(hidroximetil)oxan-3-il]oxi-2(hidroximetil)oxano-3,4-diol). Estes compostos podem ser obtidos comercialmente, por exemplo, de Sigma-Aldrich, ou preparados a partir de insetos, cascas de crustáceos, ou paredes celulares fúngicas. Métodos para a preparação de quitina e quitosana são conhecidos na arte, e foram descritos, por exemplo, na Patente US 4.536.207 (preparação de cascas de crustáceos), Pochanavanich, et al., Lett. Appl. Microbiol. 55:17-21 (2002) (preparação de paredes celulares fúngicas), e Patente US 5.965.545 (preparação de cascas de caranguejo e hidrólise de quitosana comercial). Ver, também, Jung, et al., Carbohydrate Polymers 67:256-59 (2007); Khan, et al., Photosynthetica 40(4):621-4 (2002). As quitinas e quitosanas desacetiladas podem ser obtidas as quais estão em uma faixa de menos do que 35% para mais do que 90% de desacetilação, e cobrem um espectro amplo de pesos moleculares, por exemplo, oligômeros de quitosana de peso molecular baixo de menos do que 15kD e oligômeros de quitina de 0,5 a 2kD; quitosana “tipo prático” com um peso molecular de cerca de 150kD; e quitosana de peso molecular elevado de até 700kD. As composições de quitina e quitosana formuladas para tratamento de sementes também são comercialmente disponíveis. Produtos comerciais incluem, por exemplo, ELEXA® (Plant Defense Boosters, Inc.) e BEYOND™ (Agrihouse, Inc.).

[00072] Flavonóides são compostos fenólicos tendo a estrutura geral de dois anéis aromáticos conectados por uma ponte de três carbonos. Flavonóides são produzidos por plantas e têm muitas funções, por exemplo, como moléculas sinais benéficas, e como proteção contra insetos, animais, fungos e bactérias. Classes de flavonóides incluem calconas, antocianidinas, cumarinas, flavonas, flavanóis, flavonóis, flavanonas, e isoflavonas. Ver, Jain, / 52 et al., J. Plant Biochem. & Biotechnol. 11:1-10 (2002); Shaw, et al., Environmental Microbiol. 11:1867-80 (2006).

[00073] Flavonóides representativos que podem ser utilizáveis na prática da presente invenção incluem genisteína, daidzeína, formononetina, naringenina, hesperetina, luteolina, e apigenina. Compostos flavonóides são comercialmente disponíveis, por exemplo, de Natland International Corp., Research Triangle Park, NC; MP Biomedicals, Irvine, CA; LC Laboratories, Woburn MA. Compostos flavonóides podem ser isolados de plantas ou sementes, por exemplo, como descrito nas Patentes US 5.702.752; 5.990.291; e 6.146.668. Compostos flavonóides também podem ser produzidos por organismos geneticamente engenheirados, como levedura, como descrito em Ralston, et al., Plant Physiology 137:1375-88 (2005).

[00074] Ácido jasmônico (JA, [1R-[1a,2P(Z)]]-3-oxo-2-(ácido pentenil) ciclopentanoacético) e seus derivados (que incluem ácido linoleico e ácido linolênico (que são descritos acima em conexão com ácidos graxos e seus derivados), podem ser usados na prática da presente invenção. Ácido jasmônico e seu metil éster, jasmonato de metila (MeJA), coletivamente conhecido como jasmonatos, são compostos com base em octadecanóide que ocorre naturalmente nas plantas. Ácido jasmônico é produzido pelas raízes de plântulas de trigo, e por microrganismos fúngicos como Botryodiplodia theobromae e Gibbrella fujikuroi, levedura (Saccharomyces cerevisiae), e cepas patogênicas e não patogênicas de Escherichia coli. Ácido linoleico e ácido linolênico são produzidos no curso da biossíntese de ácido jasmônico. Como ácido linoleico e ácido linolênico, jasmonatos (e seus derivados) são relatados para serem indutores de expressão do gene nod ou produção de LCO por rizobactérias. Ver, por exemplo, Mabood, Fazli, Jasmonates induce the expression of nod genes in Bradyrhizobium japonicum, 17 de maio de 2001.

[00075] Derivados utilizáveis de ácido jasmônico que podem ser utilizáveis na prática da presente invenção incluem ésteres, amidas, / 52 glicosídeos e sais. Esteres representativos são compostos em que o grupo carboxila de ácido jasmônico foram substituídos com um grupo -COR, onde R é um grupo --OR¹, em que R¹ é: um grupo alquila, como um grupo C₁-C₈alquila não ramificado ou ramificado, por exemplo, um grupo metila, etila ou propila; um grupo alquenila, como um grupo C2-C8 alquenila não ramificado ou ramificado; um grupo alquinila, como um grupo C2-C8 alquinila não ramificado ou ramificado; um grupo arila tendo, por exemplo, 6 a 10 átomos de carbono; ou um grupo heteroarila tendo, por exemplo, 4 a 9 átomos de carbono, em que os heteroátomos no grupo heteroarila podem ser, por exemplo, N, O, P, ou S. Amidas representativas são compostos em que o grupo carboxila de ácido jasmônico foram substituídos com um grupo -COR, onde R é um grupo NR R , em que R e R são independentemente: hidrogênio; um grupo alquila, como um grupo C₁-C₈ alquila não ramificado ou ramificado, por exemplo, um grupo metila, etila ou propila; um grupo alquenila, como um grupo C2-C8 alquenila não ramificado ou ramificado; um grupo alquinila, como um grupo C2-C8 alquinila não ramificado ou ramificado; um grupo arila tendo, por exemplo, 6 a 10 átomos de carbono; ou um grupo heteroarila tendo, por exemplo, 4 a 9 átomos de carbono, em que os heteroátomos no grupo heteroarila podem ser, por exemplo, N, O, P, ou S. Esteres podem ser preparados por métodos conhecidos, como adição nucleofílica catalisada por ácido, em que o ácido carboxílico é reagido com um álcool na presença de uma quantidade catalítica de um ácido mineral. Amidas também podem ser preparadas por métodos conhecidos, como por reagir o ácido carboxílico com a amina apropriada na presença de um agente de copulação como diciclohexil carbodi-imida (DCC), sob condições neutras. Sais apropriados de ácido jasmônico incluem, por exemplo, sais de adição de base. As bases que podem ser usadas como reagentes para preparar sais de base metabolicamente aceitáveis destes compostos incluem os derivados de cátions como cátions de metal alcalino (por exemplo, potássio e sódio) e / 52 cátions de metal alcalino terroso (por exemplo, cálcio e magnésio). Estes sais podem ser prontamente preparados por mistura junto com uma solução de ácido linoleico, ácido linolênico, ou ácido jasmônico com uma solução da base. O sal pode ser precipitado a partir de uma solução e ser coletado por filtração ou pode ser recuperado por outros meios, como por evaporação do solvente.

[00076] Karriquinas são 4H-pironas análogas de vinila, por exemplo, 2H-furo[2,3-c]piran-2-onas incluindo derivados e análogos dos mesmos. Exemplos destes compostos são representados pela seguinte estrutura:

em que; Z é O, S ou NR₅; R₁, R₂, R₃, e R₄ são cada independentemente H, alquila, alquenila, alquinila, fenila, benzila, hidróxi, hidroxialquila, alcóxi, fenilóxi, benzilóxi, CN, COR6, COOR=, halogênio, NR6R7, ou NO2; e R5, R6, e R7 são cada independentemente H, alquila ou alquenila, ou um sal biologicamente aceitável do mesmo. Exemplos de sais biologicamente aceitáveis de compostos ésteres podem incluir sais de adição de ácido formados com ácidos biologicamente aceitáveis, cujos exemplos incluem cloridrato, bromidrato, sulfato ou bissulfato, fosfato ou fosfato de hidrogênio, acetato, benzoato, sucinato, fumarato, maleato, lactato, citrato, tartarato, gluconato; metanossulfonato, benzenossulfonato e ácido ptoluenossulfônico. Sais de metal biologicamente aceitáveis adicionais podem incluir sais de metal alcalino, com bases, cujos exemplos incluem os sais de sódio e potássio. Exemplos de compostos englobados pela estrutura e que podem ser apropriados para uso na presente invenção incluem o seguinte: 3metil-2H-furo[2,3-c]piran-2-ona (onde R1=CH3, R2, R3, R4=H), 2H-furo[2,3 / 52

c]piran-2-ona (onde R₁, R₂, R₃, R4=H), 7-metil-2H-furo[2,3-c]piran-2-ona (onde R₁, R₂, R₄=H, R₃=CH₃), 5-metil-2H-furo[2,3-c]piran-2-ona (onde R₁, R₂, R₃=H, R₄=CH₃), 3,7-dimetil-2H-furo[2,3-c]piran-2-ona (onde R₁, R₃=CH₃, R₂, R₄=H), 3,5-dimetil-2H-furo[2,3-c]piran-2-ona (onde R₁, R₄=CH₃, R₂, R₃=H), 3,5,7-trimetil-2H-furo[2,3-c]piran-2-ona (onde R₁, R₃, R₄=CH₃, R₂=H), 5-metoximetil-3-metil-2H-furo[2,3-c]piran-2-ona (onde R₁=CH₃, R₂, R₃=H, R₄=CH₂OCH₃), 4-bromo-3,7-dimetil-2H-furo[2,3-c]piran-

2-ona (onde R_b R₃=CH₃, R₂=Br, R₄=H), 3-metilfuro[2,3-c]piridin-2(3H)-ona (onde Z=NH, R₁=CH₃, R₂, R₃, R₄=H), 3,6-dimetilfuro[2,3-c]piridin-2(6H)ona (onde Z=N--CH₃, R₁=CH₃, R₂, R₃, R₄=H). Ver, Patente US 7.576.213. Estas moléculas também são conhecidas como karriquinas. Ver, Halford, supra.

[00077] A quantidade de, pelo menos, uma molécula sinal de plantas usada para tratar a semente, expressa em unidades de concentração, geralmente nas faixas de cerca de 10^-5 e cerca de 10^-14 M (concentração molar), e em algumas formas de realização, de cerca de 10^-5 e cerca de 10^-11 _-7 _-8

M, e em algumas outras formas de realização de cerca de 10 e cerca de 10 M. Expressa em unidades de peso, a quantidade eficaz geralmente ranges de cerca de 1 e cerca de 400 iig/50,8 kg (cwt) semente, e em algumas formas de realização de cerca de 2 e cerca de 70 gg50,8 kg (cwt), e em algumas outras formas de realização, de cerca de 2,5 e cerca de 3,0 gg/50,8 kg (cwt) de semente.

[00078] Para fins de tratamento de sementes indiretamente, isto é, no tratamento no sulco, a quantidade eficaz de, pelo menos, uma molécula sinal de plantas geralmente está na faixa de 1 iig/0,404 hectare (2,5 gg/hectare) e cerca de 70 gg/0,404 hectare (173,3 gg/hectare), e em algumas formas de realização, de cerca de 50 gg/0,404 hectare (123,8 gg/hectare) e cerca de 60 gg/0,404 hectare (148,5 gg/hectare). Para fins de aplicação nas plantas, a quantidade eficaz de, pelo menos, uma molécula sinal de plantas geralmente / 52 ranges de 1 iig/0,404 hectare (2,5 gg/hectare) e cerca de 30 gg/0,404 hectare (74,3 gg/hectare), e em algumas formas de realização, de cerca de 11 iig/0,404 hectare (2,5 gg/hectare) e cerca de 20 gg/0,404 hectare (49,5 gg/hectare).

Herbicidas, Fungicidas e inseticidas [00079] Herbicidas apropriadas incluem bentazon, acifluorfen, chlorimuron, lactofen, clomazona, fluazifop, glufosinato, glifosato, setoxidim, imazetapir, imazamox, fomesafe, flumiclorac, imazaquin, e cletodim. Produtos comerciais contendo cada de compostos ésteres são prontamente disponíveis. Concentração herbicida na composição geralmente irá corresponder a taxa de uso rotulada para uma herbicida particular.

[00080] Um “fungicida” como usado aqui e na arte é um agente que mata ou inibe o crescimento de fungos. Como usado aqui, um fungicida “exibe atividade contra” uma espécie particular de fungos se o tratamento com os resultados de fungicida em matar ou a inibição do crescimento de uma população fúngica (por exemplo, no solo) relativo a uma população não tratada. Fungicidas eficazes de acordo com a invenção apropriadamente exibirão uma atividade contra uma faixa ampla de patógenos, incluindo, mas não limitados a Phytophthora, Rhizoctonia, Fusarium, Pythium, Phomopsis ou Selerotinia e Phakopsora e combinações dos mesmos.

[00081] Fungicidas comerciais podem ser apropriados para uso na presente invenção. Fungicidas comercialmente disponíveis apropriados incluem PROTÉGÉ, RIVAL ou ALLEGIANCE FL ou LS (Gustafson, Plano, TX), WARDEN RTA (Agrilance, St. Paul, MN), APRON XL, APRON MAXX RTA ou RFC, MAXIM 4FS ou XL (Syngenta, Wilmington, DE), CAPTAN (Arvesta, Guelph, Ontario) e PROTREAT (Nitragin Argentina, Buenos Ares, Argentina). Ingredientes ativos nestes e outros fungicidas comerciais incluem, mas não são limitados a, fludioxonil, mefenoxam, azoxistrobina e metalaxila. Fungicidas comerciais são os mais / 52 apropriadamente usados de acordo com as instruções do fabricante nas concentrações recomendadas.

[00082] Como usado aqui, um inseticida “exibe atividade contra” uma espécie particular de inseto se o tratamento com o inseticida resultar em morte ou inibição de uma população de insetos com relação a uma população não tratada. Inseticidas eficazes de acordo com a invenção exibirão apropriadamente atividade contra uma faixa ampla de insetos incluindo, mas não limitados a, brocas, agrótis, as larvas, crisomelídeo da raiz do milho do milho, gusanos do milho de semente, besouros de pulga, percevejos, afídeos, besouros de folha e insetos que fedem.

[00083] Inseticidas comerciais podem ser apropriados para uso na presente invenção. Inseticidas comercialmente disponíveis apropriados incluem CRUISER (Syngenta, Wilmington, DE), GAUCHO e PONCHO (Gustafson, Plano, TX). Ingredientes ativos nessas e outros inseticidas comerciais incluem tiametoxam, clotianidina, e imidacloprid. Inseticidas comerciais são os mais apropriadamente usados de acordo com as instruções do fabricante nas concentrações recomendadas.

Microrganismos solubilizadores em fosfatos, diazótrofos (inoculantes rizóbicos), e/ou fungos micorrízicos.

[00084] A presente invenção pode ainda incluir tratamento da semente com um microrganismo solubilizador de fosfato. Como usado aqui, “microrganismo solubilizador de fosfato” é um microrganismo, que é capaz de aumentar a quantidade de fósforo disponível para uma planta. Microrganismos solubilizadores de em fosfatos incluem cepas fúngicas e bacterianas. Na forma de realização, o microrganismo solubilizador de fosfato é um microrganismo formador de esporo.

[00085] Exemplos não limitativos de microrganismos solubilizadores de fosfatos incluem espécies de um gênero selecionado dentre o grupo consistindo de Acinetobacter, Arthrobacter, Arthrobotrys, Aspergillus, / 52

Azospirillum, Bacillus, Burkholderia, Candida Chryseomonas, Enterobacter,

Eupenicillium, Exiguobacterium, Klebsiella, Kluyvera, Microbacterium,

Mucor, Paecilomyces, Paenibacillus, Penicillium, Pseudomonas, Serratia,

Stenotrophomonas, Streptomyces, Streptosporangium, Swaminathania,

Thiobacillus, Torulospora, Vibrio, Xanthobacter, e Xanthomonas.

[00086] Exemplos não limitativos de microrganismos solubilizadores de fosfatos são selecionados dentre o grupo consistindo de Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter sp, Arthrobacter sp., Arthrobotrys oligospora, Aspergillus niger, Aspergillus sp., Azospirillum halopraeferans, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus atrophaeus, Bacillus circulans,Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Burkholderia vietnamiensis, Candida krissii, Chryseomonas luteola, Enterobacter aerogenes, Enterobacter asburiae, Enterobacter sp., Enterobacter taylorae, Eupenicillium parvum, Exiguobacterium sp., Klebsiella sp., Kluyvera cryocrescens, Microbacterium sp., Mucor ramosissimus, Paecilomyces hepialid, Paecilomyces marquandii, Paenibacillus macerans, Paenibacillus mucilaginosus, Pantoea aglomerans, Penicillium expansum, Pseudomonas corrugate, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas lutea, Pseudomonas poae, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas trivialis, Serratia marcescens, Stenotrophomonas maltophilia, Streptomyces sp., Streptosporangium sp., Swaminathania salitolerans, Thiobacillus ferrooxidans, Torulospora globosa, Vibrio proteolyticus, Xanthobacter agilis, and Xanthomonas campestris.

[00087] Em uma forma de realização particular, o microrganismo solubilizador de fosfato é uma cepa do fungo Penicillium. Cepas do fungo Penicillium que podem ser utilizáveis na prática da presente invenção incluem P. bilaiae (anteriormente conhecido como P. bilaii), P. albidum, P. aurantiogriseum, P. chrysogenum, P. citreonigrum, P. citrinum, P. digitatum, P. frequentas, P. fuscum, P. gaestrivorus, P. glabrum, P. griseofulvum, P.

/ 52 implicatum, P. janthinellum, P. lilacinum, P. minioluteum, P. montanense, P.

nigricans, P. oxalicum, P. pinetorum, P. pinophilum, P. purpurogenum, P.

radicans, P. radicum, P. raistrickii, P. rugulosum, P. simplicissimum, P.

solitum, P. variabile, P. velutinum, P. viridicatum, P. glaucum, P. fussiporus, e P. expansum.

[00088] Em uma forma de realização particular, a espécie de Penicillium é P. bilaiae. Em outra forma de realização particular as cepas de P. bilaiae são selecionadas dentre o grupo consistindo de ATCC 20851, NRRL 50169, ATCC 22348, ATCC 18309, NRRL 50162 (Wakelin, et al., 2004. Biol Fertil Soils 40:36-43). Em outra forma de realização particular a espécie de Penicillium é P. gaestrivorus, por exemplo, NRRL 50170 (Ver, Wakelin, supra.).

[00089] Em algumas formas de realização, mais do que um microrganismo solubilizador de fosfato é usado, como, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos 6, incluindo qualquer combinação de Acinetobacter, Arthrobacter, Arthrobotrys, Aspergillus, Azospirillum, Bacillus, Burkholderia, Candida Chryseomonas, Enterobacter, Eupenicillium, Exiguobacterium, Klebsiella, Kluyvera, Microbacterium, Mucor, Paecilomyces, Paenibacillus, Penicillium, Pseudomonas, Serratia, Stenotrophomonas, Streptomyces,

Streptosporangium, Swaminathania, Thiobacillus, Torulospora, Vibrio, Xanthobacter, e Xanthomonas, incluindo uma espécie selecionada dentre o seguinte grupo: Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter sp, Arthrobacter sp., Arthrobotrys oligospora, Aspergillus niger, Aspergillus sp., Azospirillum halopraeferans, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus atrophaeus, Bacillus circulans,Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Burkholderia vietnamiensis, Candida krissii, Chryseomonas luteola, Enterobacter aerogenes, Enterobacter asburiae, Enterobacter sp., Enterobacter taylorae, Eupenicillium parvum, Exiguobacterium sp., / 52

Klebsiella sp., Kluyvera cryocrescens, Microbacterium sp., Mucor ramosissimus, Paecilomyces hepialid, Paecilomyces marquandii, Paenibacillus macerans, Paenibacillus mucilaginosus, Pantoea aglomerans, Penicillium expansum, Pseudomonas corrugate, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas lutea, Pseudomonas poae, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas trivialis, Serratia marcescens, Stenotrophomonas maltophilia, Streptomyces sp., Streptosporangium sp., Swaminathania salitolerans, Thiobacillus ferrooxidans, Torulospora globosa, Vibrio proteolyticus, Xanthobacter agilis, e Xanthomonas campestris [00090] Em algumas formas de realização, duas cepas diferentes da mesma espécie também podem ser combinadas, por exemplo, pelo menos duas cepas diferentes de Penicillium são usadas. O uso de uma combinação de, pelo menos, duas cepas Penicillium diferentes tem as seguintes vantagens. Quando aplicadas ao solo já contendo fosfatos insolúveis (ou pouco solúveis), o uso das cepas fúngicas combinadas irá resultar em um aumento em uma quantidade de fósforo disponível para absorção pela planta em comparação ao uso de apenas uma cepa de Penicillium. Isto pode resultar, por sua vez, em um aumento em absorção de fosfato e/ou um aumento no rendimento das plantas cultivadas no solo em comparação ao uso de cepas individuais sozinhas. A combinação de cepas também permite fosfatos de rochas insolúveis sejam usados como um fertilizante eficaz para solos que têm quantidades inadequadas de fósforo disponíveis. Assim, em algumas formas de realização, uma cepa de P. bilaiae e uma cepa de P. gaestrivorus são usadas. Em outras formas de realização, as duas cepas são NRRL 50169 e NRRL 50162. Em outras formas de realização, as pelo menos duas cepas são NRRL 50169 e NRRL 50170. Em ainda outras formas de realização, as pelo menos duas cepas são NRRL 50162 e NRRL 50170.

[00091] Os microrganismos solubilizadores de fosfatos podem ser preparados usando qualquer método apropriado conhecido pelo versado na / 52 arte, como, estado sólido ou fermentação líquida usando uma fonte de carbono apropriado. O microrganismo solubilizador de fosfato é preferivelmente preparado na forma de um esporo estável.

[00092] Em uma forma de realização, o microrganismo solubilizador de fosfato é um fungo Penicillium. O fungo Penicillium de acordo com a invenção pode ser cultivado usando estado sólido ou fermentação líquida e uma fonte de carbono apropriada. Isolados de Penicillium podem ser cultivados usando qualquer método apropriado conhecido pelo versado na arte. Por exemplo, o fungo pode ser cultivado em um meio de crescimento sólido como dextrose agar de batata ou agar de extrato de malte, ou em frascos contendo meio líquido apropriado como meio Czapek-Dox ou caldo de dextrose de batata. Estes métodos de cultivo podem ser usados na preparação de um inóculo de Penicillium spp. para tratar (por exemplo, revestir) sementes e/ou aplicação a um carreador agronomicamente aceitável para ser aplicado no solo. O termo “inóculo” como usado neste relatório é destinado para significar qualquer forma de microrganismo solubilizador de fosfato, células de fungos, micélio ou esporos, células bacterianas ou esporos bacterianos, que é capaz de propagar sobre ou no solo quando as condições de temperatura, umidade, etc., são favoráveis para crescimento fúngico.

[00093] Produção em estado sólido de esporos Penicillium pode ser obtida inoculando um meio sólido como um substrato com base em turfa ou vermiculite, ou grãos incluindo, mas não limitado para, aveias, trigo, cevada, ou arroz. O meio esterilizado (obtido através de autoclave ou irradiação) é inoculado com uma suspensão de esporos (1x10 -1x10 cfu/ml) do Penicillium spp. apropriado e a umidade ajustada a 20 a 50%, dependendo do substrato. O material é incubado durante 2 a 8 semanas em temperatura ambiente. Os esporos também podem ser produzidos por fermentação líquida (Cunningham et al., 1990. Can J Bot. 68:2270-2274). Produção líquida pode ser obtida por cultivar o fungo em qualquer meio apropriado, como caldo de / 52 dextrose de batata ou meio de extrato de levedura de sacarose, sob condições de pH e temperatura apropriadas que podem ser determinadas de acordo com os procedimentos padrão na arte.

[00094] O material resultante pode ser usado diretamente, ou os esporos podem ser colhidos, concentrados por centrifugação, formulados, e então secados usando secagem ao ar, secagem por congelamento, ou técnicas de secagem de fluidos em leito (Friesen, et al., 2005, Appl. Microbiol. Biotechnol. 68:397-404) para produzir um pó umectável. O pó umectável é então colocado em suspensão em água, aplicado na superfície de sementes, e deixado secar antes do plantio. O pó umectável pode ser usado em conjunto com outros tratamentos de sementes, como, mas não limitado para, tratamentos de sementes químicos, carreadores (por exemplo, talco, argila, caulim, gel de sílica, caulinita) ou polímeros (por exemplo, metilcelulose, polivinilpirrolidona). Alternativamente, a suspensão de esporos do Penicillium spp. apropriada pode ser aplicado a um carreador compatível ao solo apropriado (por exemplo, pó à base de turfa ou grânulo) para teor de umidade final apropriado. O material pode ser incubado em temperatura ambiente, tipicamente durante cerca de 1 dia e cerca de 8 semanas, antes do uso.

[00095] Além dos ingredientes usados para cultivar o microrganismo solubilizador de fosfato, incluindo, por exemplo, ingredientes referidos acima no cultivo de Penicillium, o microrganismo solubilizador de fosfato pode ser formulado usando outros carreadores agronomicamente aceitáveis. Como usado aqui em conexão com “carreador”, o termo “agronomicamente aceitável” refere-se a qualquer material que pode ser usado para liberar os ativos em uma semente, solo ou planta, e preferivelmente cujo carreador pode ser adicionado (na semente, solo ou planta) sem ter um efeito adverso no crescimento das plantas, estrutura do solo, drenagem do solo ou outros. Os carreadores apropriados compreendem, mas não são limitados para, joio do / 52 trigo, farelo, palha de trigo triturada, pós à base de turfas ou grânulos, grânulos à base de gesso, e argilas (por exemplo, caulim, bentonita, montmorilonita). Quando os esporos são adicionados ao solo uma formulação granular será preferível. Formulações como líquidos, turfa, ou pó umectável serão apropriadas para revestimento de sementes. Quando usado para revestir as sementes, o material pode ser misturado com água, aplicado nas sementes e deixado secar. Exemplos de ainda outros carreadores incluem farelo umedecido, secado, peneirado e aplicado às sementes antes de revestimento comum adesivo, por exemplo, goma arábica. Nas formas de realização que empregam a formulação dos ativos em uma composição única, o carreador agronomicamente aceitável pode ser aquoso.

[00096] A quantidade de, pelo menos, um microrganismo solubilizador de fosfato varia dependendo do tipo de semente ou solo, o tipo de plantas de cultivos, a quantidades da fonte de fósforo e/ou micronutrientes presentes no solo ou adicionado ao mesmo, etc. Uma quantidade apropriada pode ser encontrada por experiência simples e experiências de acertos e erros para cada caso particular. Normalmente, para Penicillium, por exemplo, a quantidade de aplicação está na faixa de 0,001-1,0 Kg de esporos de fungos e micélios (peso fresco) por hectare, ou 10²-10⁶ unidades formadoras de colônia (cfu) por semente (quando sementes revestidas são usadas), ou em um carreador granular aplicando entre 1x10⁶ e 1x10¹¹ unidades formadoras de colônia por hectare. As células fúngicas na forma de, por exemplo, esporos e o carreador podem ser adicionados a uma fileira de sementes do solo ao nível da raiz ou pode ser usado para revestir sementes antes do plantio.

[00097] Nas formas de realização, por exemplo, que empregam o uso de, pelo menos, duas cepas de um microrganismo solubilizador de fosfato, como, duas cepas de Penicillium, fertilizantes comerciais podem ser adicionados ao solo ao invés de (ou ainda assim como) fosfato de rocha natural. A fonte de fósforo pode conter uma fonte de fósforo nativo no solo.

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Em outras formas de realização, a fonte de fósforo pode ser adicionada no solo. Em uma forma de realização a fonte é fosfato de rocha. Em outra forma de realização a fonte é um fertilizante fabricado. Fertilizantes de fosfato fabricados comercialmente disponíveis são de muitos tipos. Alguns dos mais comuns são os contendo fosfato de monoamônio (MAP), fosfato super triplo (TSP), fosfato de diamônio, superfosfato comum e polifosfato de amônio. Todos estes fertilizantes são produzidos por processamento químico de fosfatos de rochas naturais insolúveis em facilidades de fabricação de fertilizantes em grande escala e o produto é caro. Por meios da presente invenção é possível reduzir a quantidade destes fertilizantes aplicados no solo enquanto ainda mantendo a mesma quantidade de absorção de fósforo a partir do solo.

[00098] Em outra forma de realização, a fonte ou fósforo é orgânico. Um fertilizador orgânico refere-se a um corretivo do solo derivado de fontes naturais que garante, pelo menos, as percentagens mínimas de nitrogênio, fosfato, e potassa. Exemplos incluem subprodutos de plantas e animais, pós de rochas, algas, inoculantes, e condicionadores. Exemplos representativos específicos incluem farinha de ossos, farinha de carne, estrume de animal, adubo composto, lama de esgoto, ou guano.

[00099] Outros fertilizantes, como fontes de nitrogênio, ou outros corretivos do solo podem, como evidente, também ser adicionado no solo a aproximadamente ao mesmo tempo como o microrganismo solubilizador de fosfato ou em outros momentos, considerando que os outros materiais não sejam tóxicos para o fungo.

[000100] Diazótrofos são bactérias e arqueas que fixam o gás nitrogênio atmosférico em uma forma mais utilizável como amônia. Exemplos de diazótrofos incluem bactérias dos gêneros Rhizobium spp. (por exemplo, R. cellulosilyticum, R. daejeonense, R. etli, R. galegae, R. gallicum, R. giardinii, R. hainanense, R. huautlense, R. indigoferae, R. leguminosarum, R. loessense, / 52

R. lupini, R. lusitanum, R. meliloti, R. mongolense, R. miluonense, R. sullae, R. tropici, R. undicola, e/ou R. yanglingense), Bradyrhizobium spp. (por exemplo, B. bete, B. canariense, B. elkanii, B. iriomotense, B. japonicum, B. jicamae, B. liaoningense, B. pachyrhizi, e/ou B. yuanmingense), Azorhizobium spp. (por exemplo, A. caulinodans e/ou A. doebereinerae), Sinorhizobium spp. (por exemplo, S. abri, S. adhaerens, S. americanum, S. aboris, S. fredii, S. indiaense, S. kostiense, S. kummerowiae, S. medicae, S. meliloti, S. mexicanus, S. morelense, S. saheli, S. terangae, and/or S. xinjiangense), Mesorhizobium spp., (M. albiziae, M. amorphae, M. chacoense, M. ciceri, M. huakuii, M. loti, M. mediterraneum, M. pluifarium, M. septentrionale, M. temperatum, e/ou M. tianshanense), e combinações dos mesmos. Em uma forma de realização particular, o diazótrofo é selecionado dentre o grupo consistindo de B. japonicum, R leguminosarum, R meliloti, S. meliloti, e combinações dos mesmos. Em outra forma de realização, o diazótrofo é B. japonicum. Em outra forma de realização, o diazótrofo é R leguminosarum. Em outra forma de realização, o diazótrofo é R meliloti. Em outra forma de realização, o diazótrofo é S. meliloti.

[000101] Os fungos micorrízicos formam associações simbióticas com as raízes de uma planta vascular, e proporcionam, por exemplo, a capacidade de absorção de água e nutrientes minerais devido à área de superfície comparativamente grande de micélio. Fungos micorrízicos incluem fungos endomicorrízicos (também chamado de micorrizas arbusculares vesicular, VAMs, micorrizas arbusculares, ou AMs), fungos ectomicorrízicos, ou uma combinação dos mesmos. Em uma forma de realização, o fungo micorrízico é um endomicorriza do filo Glomeromycota e gêneros Glomus e Gigaspora. Em ainda outra forma de realização, o endomicorriza é uma cepa de Glomus aggregatum, Glomus brasilianum, Glomus clarum, Glomus deserticola, Glomus etunicatum, Glomus fasciculatum, Glomus intraradices, Glomus monosporum, ou Glomus mosseae, Gigaspora margarita, ou uma combinação / 52 das mesmas.

[000102] Exemplos de fungos micorrízicos incluem ectomicorrizas do filo Basidiomycota, Ascomycota, e Zygomycota. Outros exemplos incluem uma cepa de Laccaria bicolor, Laccaria laccata, Pisolithus tinctorius, Rhizopogon amylopogon, Rhizopogon fulvigleba, Rhizopogon luteolus, Rhizopogon villosuli, Scleroderma cepa, Scleroderma citrinum, ou uma combinação das mesmas.

[000103] Os fungos micorrízicos incluem micorrizas ecróides, micorrizas arbutóides, ou micorrizas monotropóides. Arbusculares e ectomicorrizas formam micorrizas ericóides com muitas plantas pertencentes à ordem Ericales, enquanto alguns Ericales formam micorrizas arbutóides e monotropóides. Em uma forma de realização, as micorrizas podem ser micorrizas ericóides, preferivelmente do filo Ascomycota, como Hymenoscyphous ericae ou Oidiodendron sp. Em outra forma de realização, as micorrizas também podem ser uma micorriza arbutóides, preferivelmente do filo Basidiomycota. Em ainda outra forma de realização, as micorrizas podem ser micorrizas monotripóides, preferivelmente do filo Basidiomycota. Em ainda outra forma de realização, as micorrizas podem ser micorriza orquidóide, preferivelmente do gênero Rhizoctonia.

[000104] Os métodos da presente invenção são aplicáveis em semente leguminosa, exemplos representativos incluindo soja, alfafa, amendoim, ervilha, lentilha, feijão e trevo. Os métodos da presente invenção também são aplicáveis a uma semente de não leguminosa, por exemplo, Poaceae, Cucurbitaceae, Malvaceae, Asteraceae, Chenopodiaceae e Solonaceae. Exemplos representativos de sementes não leguminosas incluem cultivos de campo como milho, arroz, aveia, centeio, cevada e trigo, algodão e canola, e cultivos de planta como batatas, tomates, pepinos, beterrabas, alface e melão cantaloupe.

[000105] A invenção será descrita em termos dos seguintes exemplos / 52 não limitativos. Salvo indicado em contrário, água foi usada como o controle (indicado como “controle” ou “CHK”).

Exemplos

1-17: Experimentos em estufa

Exemplos 1: Bioteste de crescimento da raiz da plântula de tomate in vitro [000106] Sementes de tomate de tomate híbrido var. Royal Mounty foram esterilizadas na superfície com 10% de solução alvejante durante 10 minutos seguido por 3 enxágues com água destilada esterilizada. As sementes foram então secadas em uma coifa de fluxo de ar laminar durante 3 horas. As sementes foram então colocadas em placas de petri em meio de agar solidificado contendo várias concentrações de fontes diferentes do LCO ilustrado na Fig. 1b (fabricado por Darmstadt, Alemanha e Grenoble, França) (também referido nos exemplos como o “LCO soja”) e o CO inventivo ilustrado na Fig. 2a (também referido nos exemplos como “CO ervilha” ou “CO-V”). As raízes de plântulas foram medidas por uma régua manual e os pesos no estado fresco de raiz foram tomados em um microequilíbrio em dia

7. O estudo de crescimento foi feito em uma câmara de cultivo a 22°C.

[000107] Como refletido pela comparação entre CO ervilha (forma de realização inventiva) e LCOs (não inventivo e comparável), o CO ervilha _7 _9 _8 exibiu um melhor (a 10 M e 10 M) ou igual (a 10 M) para LCO quando o comprimento da raiz da plântula de tomate foi medido (Fig. 5). Em termos de peso no estado fresco de raiz da plântula, CO ervilha superou LCO em todos os três níveis de concentrações (Fig. 6). Ambos LCOs e CO foram significantemente melhores do que plântulas de controle no aumento do comprimento da raiz e peso no estado fresco. Quando o crescimento médio da raiz de todas 3 concentrações foi traçado em gráfico, pareceu que CO é significantemente melhor do que LCOs no aumento do crescimento da raiz de tomate (Figs. 7 e 8).

Exemplos 2: Experimento foliar de algodão / 52 [000108] Sementes de algodão foram plantadas e cultivadas no estágio -8

V4 (4 estágios com folhas) e então foram pulverizadas com 10 M do LCO ilustrado na Fig. 2b (também referido nos exemplos como o “LCO ervilha”) e o CO ervilha e então deixadas crescer até 4 semanas com rega ocasional com solução de Hoagland. As plantas de controle foram pulverizadas com água.

[000109] Os resultados obtidos pela forma de realização inventiva (CO) mostraram que ambos CO e LCO (não inventivo e comparável) significantemente aumentaram os pesos no estado fresco da planta sobre o controle, mas CO mostrou 1,14 % um maior aumento do peso no estado fresco da planta sobre LCO (Fig. 9).

Exemplos 3: Tratamento de sementes de milho [000110] Dois experimentos de tratamento de sementes usando apenas LCO ervilha, CO ervilha e as misturas CO obtidas a partir de quitosana por processo enzimático (estruturalmente distinto de CO ervilha, e também referido nos exemplos como “CO feijão-chinês”) foram realizados em estufa. Sementes de milho híbrido (92L90, Peterson Farm, USA) foram tratadas com solução de tratamento (10-8 M) à taxa de 88,7 ml /45,3 kg de semente. As sementes foram plantadas em vasos plásticos contendo 1:1 mistura Areia:perlite. As sementes foram deixadas crescer durante cerca de 3-4 semanas e então foram colhidas e seu peso seco medido.

[000111] Os resultados obtidos a partir de ambos os experimentos indicaram que LCO inventivo (CO ervilha) mostrou maior aumento de broto, raiz e biomassa total sobre o LCO não inventivo e comparável. Para a primeira experiência CO tem um aumento de 11,84% de peso seco sobre LCO (Fig. 10). Na segunda experiência, CO tem um aumento de 12,63% de peso seco LCO (Fig. 11). CO feijão-chinês, que também pode ser considerado como uma fonte substituta de CO ervilha, também demonstrou aumento de peso seco da planta como comparado com o LCO não inventivo.

Exemplos 4: Tratamento de soja com vários ativos / 52 [000112] As sementes de soja (semente Jung, var. 8168NRR) foram tratadas com várias moléculas ativas. As sementes foram tratadas com uma taxa de dose líquida de 88,7 ml / 45,3 kg de semente. As sementes foram deixadas secar durante 2 horas e plantadas em estufa em vasos plásticos contendo 1:1 mistura de areia: perlite. As plântulas foram cultivadas durante 4 semanas com aplicações de fertilizantes líquidos ocasionais e então as plantas foram colhidas. A folhinha central a partir do segundo trifoliato (de baixo para cima) foi isolada e medida por área de superfície em um escaner WinRhizo. O resto das plantas foi usado para o peso seco da planta (DW).

[000113] Os resultados obtidos a partir da experiência elucidaram que o LCO ervilha não inventivo, o CO ervilha inventivo e o CO feijão-chinês mostraram um aumento significante na área de superfície da folha. Mas, dentre estes três ativos, o CO ervilha produziu a maior área de superfície da folha (significantemente maior do que o controle (água)) e relativamente maior do que CO feijão-chinês (Fig. 12). Em outro experimento, CO produziu os maiores pesos secos da planta em termos de broto, ou raiz ou biomassa total da planta. Assim, foi evidente que o aumento de biomassa por CO foi melhor do que o LCO soja ou quaisquer outros tratamentos incluindo água como um controle e isoflavonóides como uma molécula sinal de planta separada (Fig. 13).

Exemplos 5: Bioteste de deformação do cabelo da raiz [000114] Sementes de Siratro (Macroptelium atropurpureum) foram germinadas em papel de filtro úmido em placas de petri. Quando as raízes das plântulas alcançam de cerca de 2,54 cm de comprimento, elas são cortadas o das plântulas e tratadas com 2 ml de soluções de tratamento10 M em tubos de teste durante 4 horas no escuro. Após o tempo de tratamento terminar, as soluções são coloridas com vermelho Congo durante 10 minutos. Depois que os segmentos de raiz são observados sob um microscópio composto para contar o número de cabelos da raiz deformados na zona mais sensível do / 52 segmento da raiz. O bioteste de deformação do cabelo da raiz também foi realizado usando trevo vermelho em um modo similar como Siratro acima e apenas a observação visual foi feita e relatada em forma de texto.

[000115] Ambas as soluções de LCO e CO induziram a deformação da cabelo da raiz nos segmentos da raiz (Fig. 14). As combinações de CO e de ácido graxo (ácido esteárico ou ácido palmítico) também mostraram deformação do cabelo da raiz com CO mais ácido palmítico e CO mais tanto ácido palmítico como ácido esteárico fornecendo numericamente uma melhor deformação do cabelo da raiz do que LCO ou CO. No todo, CO foi igual a LCO na resposta de deformação do cabelo da raiz. Adição de ácido palmítico melhorou a resposta de deformação. Controle ou CHK foi tratado com água destilada.

[000116] O padrão de deformação do cabelo da raiz em trevo vermelho foi muito melhor e proeminente para CO como comparado com LCO. CO com ou ácido palmítico ou ácido esteárico tem um padrão de deformação similar a LCO. No todo, CO foi o melhor deformador de cabelo da raiz em trevo vermelho.

Exemplos 6: Germinação de sementes de canola e trigo [000117] Em placas de petri em papel de filtro úmido umedecido com solução de tratamento 10^-9 M, sementes de canola e trigo foram colocadas na placa para germinação. Em 18 h após a colocação, CO ervilha induziu maior germinação de sementes de canola e trigo como comparado com LCO ervilha. Durante um período de 21 a 24 horas, a taxa de germinação de semente para LCO e CO foi nivelada. O experimento mostra uma indução da germinação prematura por CO sobre LCO (Figs. 15 e 16).

Exemplos 7: Germinação da semente de alfafa [000118] Sementes de alfafa (Medicago sativa) foram germinadas em placas de petri em papel de filtro úmido contendo soluções de tratamento de o

LCO ervilha e CO ervilha (10 M) e as placas de petri foram mantidas no / 52 escuro em temperatura ambiente (22°C). Após 20 e 27 h, as sementes foram observadas para germinação. A 20 h, não se notou diferença na taxa de germinação entre controle, LCO e CO, mas a 27 h, CO mostrou 6% mais germinação sobre o controle e LCO. Isto mostrou que LCO ervilha pode não ser eficaz em sementes de alfafa, mas CO ervilha pode positivamente impactar a germinação da semente sobre LCO ervilha e controle (Fig. 17). Exemplos 8: Germinação de sementes de milho e de trigo em placas de petri [000119] As sementes de milho e trigo foram colocadas em placas de petri contendo 5 ml de solução de tratamento sobre um papel de filtro. As sementes de milho foram colocadas em papel de filtro úmido para germinação. Similarmente, as sementes de trigo (trigo de primavera) foram colocadas em placas de petri. As sementes de milho e trigo observadas para plântulas germinadas 5 dias após a colocação na placa. As raízes foram colhidas e seu comprimento medido por sistema WinRhizo.

[000120] Em milho, LCO ervilha, CO ervilha e CO com ácido palmítico mostraram uma germinação aumentada (Fig. 18) e eles significantemente aumentaram o comprimento da raiz da plântula sobre o controle também. Seu efeito não foi estatisticamente diferente, CO com ácido palmítico sendo o melhor para germinação e comprimento da raiz. A adição de ácido palmítico com CO pareceu ser levemente benéfico (não estatisticamente) sobre LCO ou CO (Fig. 19). Em trigo, CO superou LCO por produzir raízes mais longas. O aumento no comprimento da raiz por LCO e CO em trigo não foi estatisticamente significante, mas consistentemente maior (Fig. 20).

Exemplos 9: Germinação das sementes de vícia (Vicia sativa) comuns [000121] As sementes de vícia comum foram colocadas em placas de petri contendo 5 ml de soluções de tratamento em papel de filtro. A germinação das sementes a 22°C foi contada após 24 h e o comprimento da raiz da plântula foi medido no dia 5 com sistema WinRhizo.

[000122] No experimento de germinação LCO ervilha, e CO ervilha em / 52 combinação com 4 ácidos graxos diferentes foram usados. Verificou-se que CO sozinho ou com ácido palmítico ou ácido esteárico induziu a germinação prematura da semente. Um dia após a colocação em placas de petri, CO tem 25% maior germinação sobre o controle e LCO (Fig. 21). Quando o comprimento da raiz foi medido, somente LCO e CO com ácido palmítico significantemente aumentaram o comprimento da raiz da plântula sobre o controle (Fig. 22).

Exemplos 10: Germinação das sementes em cultivos múltiplas [000123] Similar ao experimento de germinação das sementes acima mencionado, as sementes de cultivos diferentes foram colocadas em papel de filtro úmido em placas de petri contendo 5 ml líquido em cada. Placas de petri com sementes foram então mantidas no escuro a 22°C. Após 24 h (exceto para feijão lab-lab que foi 30 h), as sementes foram observadas para germinação.

[000124] A germinação da semente total por CO ervilha foi melhor do que LCO ervilha. Dentre as quatro cultivos (feijão mungo, feijão lab-lab, lentilha vermelha e trevo vermelho), CO mostrou melhor germinação em três cultivos exceto para lentilha vermelha (Fig. 23). CO mais ácido palmítico induziu a maior germinação em feijão mungo verde e trevo vermelho. LCO foi apenas melhor do que CO ou CO mais ácido palmítico para lentilha vermelha.

Exemplos 11: Crescimento da raiz da plântula de tomate [000125] Em processo de germinação de sementes em placas de petri, sementes de tomate Var. Royal Mounty foram colocadas em papel de filtro úmido embebido com 5 ml de solução de tratamento. A 22°C e após 5 dias no escuro, as raízes de plântulas de tomate foram medidas para crescimento por sistema WinRhizo.

[000126] LCO ervilha, CO ervilha e CO com ácidos graxos todos mostraram aumento do comprimento da raiz como comparado ao controle / 52 com água. Comprimento da raiz da plântula médio por CO foi melhor do que

LCO, mas não foi significantemente melhor. CO com ou ácido palmítico ou esteárico significantemente aumentou o comprimento da raiz da plântula de tomate (Fig. 24).

Exemplos 12: Tratamento de semente de soja [000127] As sementes de soja (Pioneer 9oM80) foram colocadas em placas de petri em papel de germinação úmido embebido com 5 ml de solução de tratamento contendo ou água ou LCO soja, CO ervilha e CO mais ácidos graxos. As radículas de plântulas foram isoladas após 48 horas e medidas para seu comprimento.

[000128] LCO mostrou uma intensificação acentuada de crescimento radicular de sementes sobre o controle e CO, mas foi CO mais ácido esteárico ou ácido palmítico que exibiram um aumento significante no comprimento radicular. CO sozinho é menos eficaz que LCO em soja, mas a adição de ácido graxo ou ácido palmítico ou esteárico com CO poderia ainda intensificar o crescimento radicular de plântula (Fig. 25).

Exemplos 13: Tratamento de sementes de algodão [000129] As sementes de algodão foram tratadas com LCO e CO 10^-8 M de soluções de tratamento a uma taxa de dose de 88,7 ml / 45,3 kg de sementes. As sementes foram plantadas no dia seguinte em vasos plásticos contendo 1:1 mistura areia:perlite. As sementes foram cultivadas em estufa durante 4 semanas e então elas foram colhidas.

[000130] Não houve diferenças significantes na planta de algodão de peso seco para controlar, LCO e CO. No entanto, CO produzido relativamente maior peso seco da planta sobre o controle e LCO. O peso seco da planta total aumentou por CO over controle foi de 3,29% (Fig. 26).

Exemplos 14: Tratamento foliar de soja com vários ativos [000131] As plantas de soja (semente Jung, var. 8168NRR) foram tratadas com várias moléculas ativas a VA estágio de crescimento. As plantas foram / 52 cultivadas a partir de sementes em estufa em vasos plásticos contendo 1:1 mistura areia:perlite. As plântulas foram cultivadas durante 4 semanas com aplicações de fertilizantes líquidos ocasionais e então as plantas foram colhidas.

[000132] Aplicação foliar de LCO soja, CO ervilha ou CO feijão-chinês não tem efeito significante em aumento da biomassa seca de planta (Fig. 27). A biomassa para cada um de LCO, CO e CO feijão-chinês foi relativamente maior do que as plantas de controle, com os ativos igualmente eficazes. Exemplos 15: Aplicação de sementes de milho [000133] As sementes de milho foram tratadas com várias combinações de CO ervilha (10_⁸ M) e LCO ervilha (10_⁸, 10_⁹ M). As sementes foram plantadas em vasos de plástico em estufa contendo 1:1 mistura areia:perlite. As plântulas foram colhidas 10 dias após plantio, lavadas até ficarem limpas e então secadas em um forno a 60 C durante 48 h.

[000134] Como ilustrado na Fig. 28, ambos CO (10_⁸ M) (designado _8

CO8) e LCO (10 M) (designado SP8) sozinhos aumentaram o peso seco da -9 -8 plântula de milho. Somente o LCO a 10 /CO em combinação 10 aumentou peso seco da plântula de milho mais do que LCO ervilha (SP) ou CO ervilha. Exemplos 16: Germinação de sementes de sorgo em placas de petri [000135] As sementes de sorgo foram germinadas em placas de petri contendo soluções de tratamento líquidas. As plântulas foram colhidas após 5 dias e as suas raízes foram medidas usando escaner WinRHIZO. Como ilustrado na Fig. 29, ambos CO ervilha (10^-8 M) e LCO ervilha (10^-8 M) aumentaram o comprimento da raiz da plântula e a combinação de CO a 10 e LCO a 10^-9 aumentou o comprimento da raiz da plântula ainda mais do que o aumento com CO ou LCO sozinho.

Exemplos 17: Aplicação foliar de algodão [000136] As plantas de algodão foram cultivadas a partir de sementes em vasos de plástico em estufa contendo areia:perlite em uma mistura 1:1. Quando as plântulas estavam no estágio V, elas foram pulverizadas / 52 foliarmente com CO ervilha (10 M) e CO mais micronutrientes (Capantotenato e ácido bórico), cada em quantidades diminutas.

[000137] As plantas foram colhidas 4 semanas após o tratamento. Antes de colher, a verdor das folhas foi medido por medidor de clorofila SPAD. Como ilustrado nas Figs. 30 e 31, CO significantemente aumentou o verdor da folha e produziu um aumento numérico em um peso médio de planta seca comparado ao controle, e o tratamento com a combinação com CO e micronutrientes alcançou um aumento ainda maior.

18-20: Experiências de campo

Exemplos 18: Soja [000138] Dezenove experiências de campo foram conduzidas para avaliar as formas de realização da presente invenção sobre o rendimento de grãos quando aplicados em folhagem de soja. As experiências de campo foram conduzidas em oito estados com várias características de solo e condições ambientais.

[000139] Os tratamentos usados nas experiências foram o controle (água), CO puro (quito-oligossacarídeo) - CO-V (ilustrado na Fig. 2a) e LCO puro (lipo-quito-oligossacarídeo) - SP104 (ilustrado na Fig. 2b). Tratamentos com CO e LCO foram 8 x 10 de concentração molar resultando em 12 pg/0,404 hectare aplicados. Diferentes variedades de soja comerciais foram empregadas. Os tratamentos foram adicionados ao herbicida glifosato e pulverizados sobre a folhagem no estágio vegetativo da planta V4 a V5. 280 gramas por hectare do tratamento foram combinados com o herbicida e água foi aplicada a uma taxa de 18,9 a 37,8 litros por 0,404 hectare. Sojas foram cultivadas até maturidade, colhidas e o rendimento de grãos determinado.

Os resultados são especificados na Tabela 1.

	RENDIMENTO (67,25 kg/ha)
	Controle	LCO (SP104)	CO (CO-V)
Média (N = 19)	56,5	58,3	58,2
Resposta (67,25 kg/ha)		1,8	1,7
Aumento de resposta (% de controle)		3%	3%
Resposta de rendimento positivo (%)		68,4	68,4

/ 52 [000140] Como refletido por comparação entre controle e CO, o rendimento foi intensificado por tratamento CO foliar por 114 kg/ha, resultando em um aumento de 3% sobre o controle, em uma intensificação do rendimento positivo ocorreu em 68,4% das experiências.

[000141] Em comparação com a resposta de LCO foliar, o rendimento média de CO foi de 6,75 kg/ha, menor, mas o mesmo aumento percentual de rendimento sobre o controle e a mesma intensificação percentual de rendimento positiva. Assim, ambos CO e LCO proporcionaram intensificações do rendimento substancialmente iguais como um tratamento foliar.

Exemplos 19: Milho [000142] Dezesseis (16) experiências de campo foram conduzidas para avaliar as formas de realização da presente invenção em rendimento de grãos quando aplicadas na folhagem de milho. As experiências de campo foram conduzidas em oito estados com várias características do solo e condições ambientais.

[000143] Os tratamentos usados nas experiências foram o controle (água), CO puro (quito-oligossacarídeo) - CO-V (ilustrado na Fig. 2a) e LCO puro (lipo-quito-oligossacarídeo) - SP104 (ilustrado na Fig. 2b). Híbridos comerciais de milho diferentes foram empregados. Os tratamentos foram adicionados ao herbicida glifosato e pulverizados sobre a folhagem no momento de aplicação de herbicida normal. 280 gramas por hectare dos tratamentos foram combinadas com o herbicida, além de água e aplicadas a uma taxa de 18,9 a 37,8 litros por 0,404 hectare. O milho foi cultivado até maturidade, colhido e o rendimento de grãos determinado.

Tabela 2

	RENDIMENTO (67,25 kg/ha)
	Controle	LCO (SP104)	CO (CO-V)
Média (N = 16)	192,6	196,8	201,8
Resposta (67,25 kg/ha)		4,2	9,2
Aumento de resposta (% de controle)		2,2	4,8
Resposta de rendimento positiva (%)		75,0	93,8

/ 52 [000144] Como refletido por comparação entre controle e CO, o rendimento foi intensificado por tratamento CO foliar por 114 kg/ha, resultando em um aumento do rendimento a 4,8% sobre o controle, em uma intensificação de rendimento positivo ocorreu em 93,8% das experiências.

[000145] Em comparação com a resposta LCO foliar, o rendimento média de CO foi de 336,2 kg/ha melhor, proporcionando um aumento do rendimento 2,6% maior e as experiências com uma resposta positiva foram 18,8% melhores.

[000146] Assim, ambos CO e LCO proporcionaram intensificação do rendimento como um tratamento foliar, mas o CO teve um desempenho pelo menos duas vezes melhor do que o LCO.

Exemplo 20: Milho [000147] Dez experiências de campo foram conduzidas para avaliar as formas de realização da presente invenção sobre o rendimento de grãos quando aplicadas nas sementes de milho antes do plantio. Cinco experiências de campo foram conduzidas em cinco estados, e cinco experiências foram conduzidas na Argentina.

[000148] Os tratamentos usados nas experiências foram controle (água), CO puro (quito-oligossacarídeo) - CO-V (ilustrado na Fig. 2a) e LCO puro (lipo-quito-oligossacarídeo) - SP104 (ilustrado na Fig. 2b). Tratamentos com _-8

CO e LCO foram com uma concentração 1 x 10 molar resultando em 1 gg/0,404 hectare (2,5 gg/hectare) aplicado. Híbridos comerciais de milho diferentes foram empregados. 88,7 gramas do tratamento foram aplicados a 22,67 kg de semente antes do plantio. O milho foi cultivado até maturidade, colhido e o rendimento de grãos determinado.

Os resultados são especificados na Tabela 3.

	RENDIMENTO (67,25 kg/ha)
	Controle	LCO (SP104)	CO (CO-V)
Média (N = 10)	181,5	192,6	188,0
Resposta (67,25 kg/ha)		11,1	6,5
Aumento de resposta (% de controle)		6,1	3,6
Resposta de rendimento positivo (%)		90,0	80,0

/ 52 [000149] Como refletido por comparação entre controle e CO, o rendimento foi intensificado por aplicação das sementes de tratamento de CO por 437 kg/ha, resultando em um aumento de 3,6% sobre o controle, em uma intensificação do rendimento positivo ocorreu em 80,0% das experiências.

[000150] Em comparação entre CO e LCO, o rendimento média de CO foi de 309 kg/ha menos, resultando em um aumento do rendimento 2,5% menor acima do controle, e respostas de rendimento 10,0% menos positivas dentre as dez experiências.

[000151] Ambos os tratamentos com CO e LCO proporcionaram intensificações do rendimento acima do controle quando aplicados às sementes de milho, com o LCO oferecendo a melhor resposta.

[000152] Todas as publicações de patentes e não patentes citadas neste relatório são indicativas do nível de conhecimento do versado na arte à qual esta invenção pertence. Todas estas publicações são incorporadas aqui por referência na mesma extensão como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada por referência.

[000153] Embora a invenção tenha sido descrita aqui com referência às formas de realização particulares, deve ser entendido que estas formas de realização são apenas ilustrativas dos princípios e aplicações da presente invenção. Assim, deve ser entendido que modificações numerosas podem ser feitas nas formas de realização ilustrativas e que outros arranjos podem ser projetados sem sair do espírito e do escopo da presente invenção como definido pelas reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para intensificar o crescimento e/ou rendimento de plantas, caracterizado pelo fato de compreender tratar as sementes de plantas ou a planta que germina a partir da semente com composição compreendendo pelo menos um oligômero de quitina em uma concentração de 10^-5 a 10^-14Molar,em que o pelo menos um oligômero de quitina é representado pela fórmula:

em que

R1 representa hidrogênio ou metil;

R₂ representa hidrogênio ou metil;

R₃ representa hidrogênio, acetila ou carbamoíla;

R4 representa hidrogênio, acetila ou carbamoíla;

R5 representa hidrogênio, acetila ou carbamoíla;

R₆ representa hidrogênio, arabinosila, fucosila, acetila, sulfato éster, 3-0-S-2-0-MeFuc, 2-0-MeFuc, or 4-0-AcFuc;

R₇ representa hidrogênio, manosila ou glicerol;

R₈ representa hidrogênio, metila, ou -CH₂OH;

R9 representa hidrogênio, arabinosila, ou fucosila;

R₁₀ representa hidrogênio, acetila ou fucosila; e n representa 0, 1, 2 ou 3.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um oligômero de quitina compreende um oligômero de quitina representado pela estrutura:

Petição 870190021084, de 01/03/2019, pág. 10/19

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3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um oligômero de quitina compreende um oligômero de quitina representado pela estrutura:
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um oligômero de quitina compreende um oligômero de quitina representado pela fórmula:

em que η = 1 ou 2; Ri representa hidrogênio ou metila; e R₂representa hidrogênio ou SO₃H.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um oligômero de quitina compreende um oligômero de quitina representado pela estrutura:

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6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um oligômero de quitina compreende um oligômero de quitina representado pela estrutura:
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um oligômero de quitina compreende um oligômero de quitina sintético.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um oligômero de quitina compreende um oligômero de quitina recombinante.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um oligômero de quitina é aplicado à semente antes da plantação e/ou no momento do plantio.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um oligômero de quitina é aplicado à semente pelo menos 30 dias antes da plantação da semente em um

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11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um oligômero de quitina é aplicado à semente pelo menos 60 dias antes da plantação da semente em um meio de crescimento de plantas.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um oligômero de quitina é aplicado à semente pelo menos 90 dias antes da plantação da semente em um meio de crescimento de plantas.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um oligômero de quitina é aplicado à semente pelo menos 180 dias antes da plantação da semente em um meio de crescimento de plantas.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um oligômero de quitina é aplicado à semente pelo menos 365 dias antes da plantação da semente em um meio de crescimento de plantas.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um oligômero de quitina é aplicado à semente no sulco.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um oligômero de quitina é aplicado à planta via tratamento foliar.
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um oligômero de quitina está presente em uma concentração de 10^-5 a 10^-11 Molar.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um oligômero de quitina está presente em uma concentração de 10^-7 a 10^-8 Molar.

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19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um oligômero de quitina é aplicado a uma taxa de 1 gg/0,404 hectare (2,5 gg/hectare) a 70 gg/0,404 hectare (173,3 gg/hectare).
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um oligômero de quitina é aplicado a uma taxa de 1 gg/0,404 hectare (2,5 gg/hectare) a 30 gg/0,404 hectare (74,3 gg/hectare).
21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um oligômero de quitina é aplicado a uma taxa de 11 gg/0,404 hectare (2,5 gg/hectare) a 20 gg/0,404 hectare (49,5 gg/hectare) (49,5 gg/hectare).
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um oligômero de quitina é aplicado a uma taxa de 50 gg/0,404 hectare (123,8 gg/hectare) e 60 gg/0,404 hectare (148,5 gg/hectare).
23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda aplicar pelo menos um micronutriente à semente e/ou à planta que germina a partir da semente.
24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que pelo menos um micronutriente compreende um ou mais vitaminas e/ou minerais em traços.
25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda aplicar um ácido graxo ou um derivado do mesmo à semente e/ou à planta que germina a partir da semente.
26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda aplicar pelo

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6/9 menos um lipo-quito-oligossacarídeo (LCO) à semente e/ou à planta que germina a partir da semente.
27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o LCO compreende um LCO representado pela estrutura:
28. Método de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um LCO compreende um LCO representado pela estrutura:
29. Método de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um LCO compreende um LCO representado pela estrutura:

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30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

26 a 29, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um LCO compreende um LCO representado pela estrutura:
31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda aplicar pelo menos uma molécula sinal de planta à semente e/ou à planta que germina a partir da semente, em que a pelo menos uma molécula sinal de planta

Petição 870190021084, de 01/03/2019, pág. 16/19 compreende uma molécula sinal de planta selecionada dentre o grupo consistindo de compostos quitinosos, flavonóides, ácido jasmônico e derivados dos mesmos, ácido linoleico e derivados dos mesmos, ácido linolênico e derivados dos mesmos, e karriquinas e derivados das mesmas.
32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma molécula sinal de planta compreende quitina e/ou quitosana.
33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda aplicar um ou mais herbicidas, inseticidas e/ou fungicidas à semente e/ou à planta que germina a partir da semente.
34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda aplicar pelo menos um microrganismo que solubiliza fosfato à semente e/ou à planta que germina a partir da semente.
35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda aplicar pelo menos um diazótrofo à semente e/ou à planta que germina a partir da semente.
36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda aplicar pelo menos um fungo micorrízico à semente e/ou à planta que germina a partir da semente.
37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a semente é leguminosa.
38. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta ou semente da mesma é não leguminosa.
39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de que a semente é uma semente Poaceae, Cucurbitaceae, Malvaceae, Asteraceae, Chenopodiaceae e Solonaceae.

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40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de que a semente é uma semente de soja.
41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de que a semente é uma semente de trigo.
42. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de que a semente é uma semente de arroz.
43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de que a semente é uma semente de milho.
44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de que a semente é uma semente de feijão.
45. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de que a semente é uma semente de fruta.