BG107614A - РЕЦЕПТОР HA EDb - ФИБРОНЕКТИН-ДОМЕНИ - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до протеин, който се свързва специфично към EDb-фибронектин-домените, до метод за скриниране на съединения, които се свързваткъм рецептор на EDb-фибронектин-домените или към самите EDb-фибронектин-домени, както и до използването на този протеин.

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася дб протеин, който се свързва специфично към EDb-фибронектин- домените.

Предшестващо състояние на техниката

Фибронектините са важен клас матрични гликопротеини. Главната им роля се състои в това, да дават възможност за свързване (прилепване) на клетки към множество различни екстрацелуларни матрици. Наличието на фибронектини на повърхността на нетрансформирани клетки в култура, както и тяхното отсъствие при трансформирани клетки води до идентифициране на фибронектини като важни адхезионни протеини. Те имат обменно действие с различни други молекули, например колаген, хепарансулфат-протеогликани и фибрин, и с това регулират клетъчната форма и изграждането на цитоскелета. Освен това те са отговорни за клетъчната миграция и клетъчната диференциация при ембриогенезата. Също така те са важни за заздравяването на рани, като дават възможност за предвижване на макрофаги и други имунни клетки към засегнатата област и при образуването на кръвни съсиреци, като дават възможност за прилепване на тромбоцитите към увредения регион на кръвоносните съдове.

Фибронектините са димери на два сходни пептида, при което всяка верига е приблизително 60 - 70 нм дълга. Идентифицирани са най-малко 20 различни фибронектинови вериги, при което всички те се получават чрез алтернативно сплитане на RNA-транскрипта на единичния фибронектинов ген. Анализ при протеолитично разграждане на фибронектин показва, че полипептидите се състоят от шест силно нагънати домена, от които всеки от своя страна съдържа така наречените повтарящи се секвенции (“repeats”), чието подобие по отношение на тяхната аминокиселинна секвенция дава възможност за класифицирането им в три типа (тип I, II и III). Централният регион на двете вериги от димера се състои от отрязък на тъй наречения тип-Ш-повторения, които са средно с дължина 90 аминокиселини (Komblihtt AR, Vibe-Pedersen К und Barelle FE, 1983. Isolation and characterization of cDNA clones for human and bovine fibronectins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 3218 - 22). Структурни изследвания са показали, че всеки тип - III повторение се състои от седем бета- щранга, които са нагънати в два антипаралелни нагънати листа, при което са експонирани къси Loopрегиони като потенциални протеин-протеин- места с обменно действие (Leahy DJ, Hendrickson WA, Aukhil I und Erickson HP, 1992. Structure of fibronectin type III domain from tenascin phased by MAD analysis of the selenomethionyl protein. Science, 258, 987 - 91). Тези повторения на тип III дават възможност фибронектините да действат като адхезионни молекули, които взаимодействат с клетъчните повърхностни молекули, т.н. “интегрини”. Понятието интегрини е използвано за първи път 1987 година в една обзорна статия (Hynes R. О., 1987, Cell 48, 549 - 550) за да бъдат описани една сродна група от хетеродимерни клетъчни повърхностни молекули, които действат като посредници между екстрацелуларната матрица и интрацелуларния цитоскелет и така да индуцират клетъчната адхезия и миграция. Тези хетеродимерни рецептори “интегрират” или посредничат за предаването също на сигнали от екстрацелуларната среда със специфични клетъчни функции. До днес са известни 17 бетасубединици, които могат да интегрират специфично и нековалентно с повече от 20 алфа-субединици, и така да образуват повече от 20 различни фамилии (Plow Е. F. et al., 2000, J. Biol. Chem.. 275, 21785 - 21788). Особено секвенцията RODS, която се намира в десетото повторение на тип III фибронектин (III-10), посредничи за обменното действие на фибронектин с най-малко 8 различни интегрини. Нещо повече, показано бе, че най-малко четири интегрина могат да взаимодействат специфично по RGDS-независим начин с фибронектин (Plow Е. F. et al., 2000, J. Biol. Chem., 275, 21785 21788). Групата на повтарящите се секвенции от тип III обхваща освен III7-, III9- и III10- секвенциите, също и повтарящите се секвенции (repeats) EIIIB и ЕША (EDb и ED_a). Функциите на тези две повтарящи се секвенции са до сега неразбрани или само в минимална степен разбрани. Едно изследване на Jamagin W. et al., (Jamagin W. Rockey D. Koteliansky V. Wamg S. und Bissell D. 1994, Expression of variant fibronectines in wound healing: cellular source and biological activity of the EIIIA segment in rat hepatic fibrogenesis. J. Cell Biol., 127, 2037 - 48) допуска, че ED_a - домените участват в ранна реакция на черния дроб при нараняване и освен това изглежда, че ED_a - домените участват в провеждането на клетъчната адхезия. Фибронектинова изоформа, която съдържа EDb секвенцията (EDb FN или ED-Β или EDB) не се доказва в нормална тъкан на възрастен, но има силно експресиране в зародишна тъкан, както и в туморна тъкан и при заздравяването на рани.

При развиването на тумор екстрацелуларната матрица на тъканта, в която расте тумора, се преустройва чрез протеолитично разграждане на вече съществуващи матрични съставни части. При това се създава туморноиндуцирана екстрацелуларна матрица, която се различава от нормалната тъкан, създава една подходяща среда за растежа на тумора и подпомага ангиогенезата. Ангиогенезата е една от най-важните прояви при растежа на тумора и определя процеса, при който се получават нови съдове от съществуващи ендотел-покрити съдове. Ангиогенезата е един инвазивен процес, който подпомага протеолизата на екстрацелуларната матрица, пролиферацията, насоченото предвижване и диференциране на ендоклетки в нови капиляри, които подкрепят растежа на тумора над определена големина.

EDb фибронектин се свързва с растежа на тумора. Освен това EDb FN се обогатява с нови кръвоносни съдове при ангиогенните прояви и с това поставя маркер за ангиогенезата (Castellani Р., Viale G., Dorcaratto A., Nicole G., Kazmarek J., Querze G., Zardi L. (1994) Int. J. Cancer 59: 612 - 618).

EDb домена е една повтаряща се секвенция от типа III, обхващаща 91 аминокиселини, и показва една изключително висока секвентна хомоложност между плъховия и този на пилетата фибронектин, която е между 96 % и 100 %. Вътре в домените няма RGDS- или аминокиселинни секвенции, за които да е известно, че посредничат за взаимодействието с интегрините. Точната функция на ED-Β- домените е до днес неизвестна. Публикувани са три изследвания, които говорят за една обща подпомагаща функция по отношение на адхезията/клетъчно разпространението при различни клетки.

Chen и Culp (1996), Exp. Cells Res., 223. 9 - 19, са показали, че целуларни фибронектини, които съдържат EDb домени и съседни повтарящи се секвенции от тип III евентуално като адхезионно подпомагащи секвенции, могат да бъдат регулирани от клетките чрез алтернативно сплитане на първичния транскрипт на фибронектина.

В едно по-късно проучване (Chen и Culp, 1998, Clin. Exp. Metast., 16, 1, 30 - 42) можа да бъде показано, че ED_b индуцира клетъчни - сигнални прояви, които водят до тирозин - фосфорилиране на фокалните адхезионни протеини, и то с механизъм, който се отличава от този, които има за посредник повтарящите се секвенции ΙΙΙ8-9-10, които разпознават интегрини. Все повече се признава, че клетъчната адхезия е важен източник за екстрацелуларните матрици, респективно за други клетки, за клетъчни сигнали, които са отговорни за регулирането на множество феномени като например растежа на клетките, клетъчното диференциране и клетъчното трансформиране. Индуцирано чрез адхезия даване на сигнали включва активирането на протеин - тирозин - киназите и една каскада от тирозин фосфорилиране на различни сигнални молекули. Авторите на това изследване посочват, че за този сигнален процес от централно значение е 125 kDa фокалната адхезионна киназа (FAK), която свързва клетъчното обменно действие с матричните протеини към активирането на интрацелуларни сигнални молекули, нещо като Src (Xing Z., Chen НС, Nowlen JK, Taylor SJ, Shalloway D. und Guan JL., Direct interaction of v-Src with the focal adhesion kinase mediated by the Src SH2 domain. Mol Biol. Cell., 5, 413 - 21), Grb2 (Schlaepfer DD, Hanks SK, Hunter T und van der Geer P., 1994, Integrin-mediated signal transduction linked to Ras pathway by GRB2 binding to focal adhesion kinase, Nature, 372, 786 - 91) und PI-3-Kinase (Chen HC und Guan JL, 1994, Association of focal adhesion kinase with its potential subsrate phosphatidylinositol 3-kinase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 10148 52). За друг фокален адхезионен протеин pl30cas се приема също така, че взима участие при сигнални случаи с посредник адхезия и при специфични онкогенни процеси, въпреки че точната му функция до сега не е изяснена (Sakai R. Iwamatsu A. Hirano N. et al., 1994, A novel signaling molecule, pl30, fonns stable complexes in vivo with v-Crk and c-Src in a tyrosine phosphorylation-dependent manner. EMBO J. 13, 3748 - 56; Petch LA, Bockholt SM, Bouton A, Parsons JT und Burridge K., 1995, Adhesion-induced tyrosine phosphorylation of the pl30 SRC substrate. J. Cell Sci., 108, 1371 - 9; Polte TR und Hanks SK, 1995, Interaction between focol adhesion kinase and Crkassociated tyrosine kinase substrate pl30^Cas. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92, 10678 - 82).

Проучването на Chen и Culp, (1998, виж по-горе) показва, че моноповтарящ се протеин EDb по-силно подпомага за разпространението на Balb/c . ЗТЗ-клетки както и за индуцирането на FAK-тирозин фосфорилиране отколкото съседните repeats III8 и т.н. Допуска се предположението, че при физиологични концентрации на целуларните фибронектини свързването на тетрапептида RGDS от III10 към към интегрините е възможно да не произвежда достатъчно силен сигнал за клетъчната адхезия, така че при механизмите с посредник обменно действие между III10 и интегрин не се стига до тирозин-фосфорилираща реакция. Освен това се предолага, че разликата по отношение на реакцията на различно опосредствената клетъчна адхезия се причинява от различно активиране на различни малки GTP-свързващи протеини. Три от тези протеина cdc42, гас и rho, всички те са членове на ras-суперфамилията, играят важна роля при клетъчно-морфологичните промени. cdc42 действа секвентно нагоре по потока на гас и индуцира директно появата на филоподин (Nobes CD und Hall A., 1995, Rho, rac, und cdc42 GTPases regulate the assembly of multimolecular focal complexes associated with actin stress fibers, lamellipoda, and filopoda, Cell. 81, 53 - 62). Тогава активирането на rac е отговорно за образуването на ламелиродии и за мрежата от актинфиламенти между филоподиите. Освен това по посока на потока надолу rho може да се активира чрез гас и индуцира фокални адхезии и актин спирални влакна. Всички тези прояви зависят от активирането на тирозин киназата и се приема че FAK участват в тях. Chen и Culp изказват предположението, че морфологичните разлики между клетки, които са прикрепени върху 7- EDb -8,· както и клетки, които са прикрепени върху 8-9

10, се основават на различното активиране на малките GTP-свързващи протеини. От това се вади заключение, че адхезия върху 8-9-10 над сигналния път с посредник интегрин води накрая до едно активиране на rho, за да се произведат фокални адхезии и актин-спираловидни влакна, докато адхезията на Balb/с-ЗТЗ-клетки през 7-EDb-8 води само до активирането на cdc42 и rac-протеини, без обаче да активира rho. За споменатите предположения не са представени данни в нито едно от двете проучвания.

Друго изследване (Hashimoto - Uoshima et al., 1997, J. Cell Sci., 110, 2271 - 2280) показва, че клетъчната адхезия на култивирани фибробласти се усилва чрез присъствието на фибронектин - фрагменти, които включват EDb-фибронектин - домени. От тук са вади заключение, че сплетените EDb домени могат да имат важна биологична функция по отношение на усилването на клетъчната функция и клетъчното разпространение. За разлика от това, включването на ED_a във фрагменти в отсъствие на EDb възпрепятства образуването на добри фокални адхезии в клетки. Базирайки се на това, авторите на това изследване разсъждават, че включването на двата домена във фибронектин - молекулата може да образува механизъм, при който се постига в такава степен клетъчна адхезия, че преместванията да се улеснят, за което е нужно както адхезия, така и загуба на адхезия за предвижването на клетки.

Изследвания върху пилешки ембриони и възрастни мишки показват, че ангиогенеза с посредник EDb може чрез инхибиране да блокира ендотелноклетъчния-интегрин σ.3β 1 (Renato et al., AACR 2001, LB-60).

Никое от споменатите проучвания и изследвания не дава все пак ясен отговор по отношение на функцията на EDb - домените, нито се правят изказвания по отношение на идентичността на възможен рецептор или възможни рецептори за EDb - домените.

От тук задачата на изобретението е, по-нататък да се изясни функцията на EDb - домените. Друга задача е да се идентифицира възможен специфичен рецептор за ED_b - домените. Още една задача на изобретението е, изясняването на EDb - специфичния адхезионен механизъм и обменото действие с рецепторните молекули, които могат да взимат участие в процеса на ангиогенезата. Още една задача на изобретението е идентифицирането на отговорните за специфичното свързване EDb - региони.

Техническа същност на изобретението

Задачата се решава чрез протеин,

a) който показва способност за да свързва специфично към EDbфибронектин - домените;

b) който се експримира или активира специфично в ендотелните клетки;

c) който се експримира или активира специфично в стромалните клетки на тумора;

d) който се експримира или активира специфично в туморни клетки;

e) чието свързване към EDb-фибронектин - домените се инхибира чрез полипептид и

f) който има привидно молекулно тегло от 120 - 130 kDa за леката верига и 150 - 160 kDa за тежката верига, установено чрез SDSполиакриламид - гелелектрофореза.

Предпочитан е протеин,

а) който има способността да се свързва специфично към EDb фибронектин- домените, при което свързващият регион се характеризира чрез най-малко една секвенция, която е избрана от групата обхващаща SEQ ID NO: 1-3;

b) който е специфично експримиран или активиран в ендотелни клетки

c) който е специфично експримиран или активиран в стомални клетки на тумора

d) който е специфично експримиран или активиран в туморни клетки

e) чието свързване към EDb - фибронектин- домените се инхибира чрез един полипептид, който обхваща секвенция, която е избрана от групата обхващаща SEQ ID NO: 1 - 3; и

f) който има привидно молекулно тегло 120 - 130 kDa за леката верига и 150 - 160 kDa за тежката верига, определени чрез DSDполиакриламид-гелелектрофореза.

Особено предпочитан е протеин,

a) който има способността да се свързва специфично към EDb фибронектин- домените и който обхваща а2р1-веригата на интегрина;

b) който е специфично експримиран или активиран в ендотелни клетки

c) който е специфично експримиран или активиран в стомални клетки на тумора

d) който е специфично експримиран или активиран в туморни клетки

e) чието свързване към EDb - фибронектин- домените се инхибира чрез един полипептид, който обхваща α2β1 -веригата на интегрина и

f) който има привидно молекулно тегло 120 - 130 kDa за леката верига и 150 - 160 kDa за тежката верига, определени чрез DSDполиакриламид-гелелектрофореза.

При едно предпочитано изпълнение ендотелните клетки са пролифериращи ендотелни клетки.

При едно предпочитано изпълнение стромалните клетки са туморни стромални клетки.

Задачата се разрешава освен това чрез един протеин, чието специфично свързване към ED_b- фибронектин - домените посредичи за адхезията на ендотелни клетки, тумор-строматични клетки и туморни клетки. Свързващият регион може тук да се характеризира с най-малко една секвенция, която е избрана от групата, която обхваща SEQ ID NO: 1 - 3 и по-специално обхваща α2β1- веригата на интегрина.

Задачата с решава също чрез протеин, чието специфично свързване към ED_b- фибронектин - домените индуцира пролиферация на ендотелни клетки. Свързващият регион може тук да се характеризира с най-малко една секвенция, която е избрана от групата, която обхваща SEQ ID NO: 1 - 3 и по-специално обхваща α2β1- веригата на интегрина.

Освен това задачата се решава чрез един протеин, чието специфично свързване към ED_b- фибронектин - домените индуцира пролиферацията, миграцията и диференцирането на ендотелни клетки в колагенна матрица, при което свързващият регион се характеризира с най-малко една секвенция. Свързващият регион може тук да се характеризира с най-малко една секвенция, която е избрана от групата, която обхваща SEQ ID NO: 1 - 3 и по-специално α2β1- веригата на интегрина.

Освен това задачата се решава чрез един протеин, който се свързва към ED_b- фибронектин - домена и индуцира специфични сигнални трансдукционни пътища, при което се индуцира най-малко един ген, който кодира за един протеин, чиито подбор е от групата, която обхваща фокална адхезионна киназа,

CD6-лиганд (ALCAM), а- веригата на витронектин - рецептора, интегрираната алфа 8 -субединица и един/ предшественика за фолистатин-сроден протеин.

Свързващият регион може тук да се характеризира с най-малко една секвенция, която е избрана от групата, която обхваща SEQ ID NO: 1 - 3 и по-специално α2β1- веригата на интегрина.

Предпочита се при индукцията на специфични сигнални трансдукционни пътища най-малко един от споменатите гени да се индуцира най-малко еднократно. При това се предпочита най-малко един от споменатите гени да се индуцира два пъти.

Задачата се решава също така чрез едно антитело, което е в състояние, да се свърже към протеин, съгласно настоящето изобретение.

Освен това задачата се решава чрез едно антитело, което е в състояние, да се свърже към протеин, който обхваща аминокиселинна секвенция, която е избрана от групата, която включва SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.

В едно предпочитано изпълнение, антителото е в състояние да инхибира ефекти, които са специфични за ED_b- домените.

Предпочита се свързването и инхибирането да се извърши in vitro и/или in vivo.

Съгласно едно предпочитано изпълнение антителото е моноклонално или рекомбинантно.

В предпочитано изпълнение антителото е scFv-фрагмент.

Задачата се решава също така чрез една клетка, която експримира едни протеин съгласно настоящето изобретение.

Освен това задачата се решава чрез клетка, която експримира антитело, съгласно настоящето изобретение.

Освен това задачата се решава чрез фаг, който експримира антитело, съгласно настоящето изобретение.

Задачата се решава също чрез метод за скиниране на съединения, които се свързват към рецептор на ED_?- фибронектин - домените, при което методът включва:

Сравняване на отговор на клетки в присъствието на едно или повече от тези съединения с контролния отговор на споменатите клетки в отсъствие на тези съединения, при което клетките експримират протеин съгласно настоящето изобретение или включват нуклеинова киселина, която кодира за този протеин и при което отговора, респективно контролния отговор се предава с посредничеството на рецептор на EDb- фибронектин - домените.

В една предпочитана форма на изпълнение отговора, респективно контролния отговор, обхваща прилепването на клетки към повърхности, които са покрити с EDb- фибронектин - домени или с части от тях.

В една предпочитана форма на изпълнение на метода, се обхваща свързващ регион на EDb- фибронектин - домените със секвенции SEQ ID NO: 1 - 4 или части от тях.

Предпочита се отговора, респективно контролния отговор да обхваща пролиферацията на клетки на повърхности, които са покрити с EDb- фибронектин - домени или с части от тях.

В предпочитана форма на изпълнение отговора, респективно контролния отговор обхваща пролиферацията, миграцията и диференцирането на ендотелни клетки в колагенна матрица, в която има EDb- фибронектин - домени или части от тях.

Предпочита се, съединенията да са подбрани от група, която включва антитела, фрагменти на антитела, изкуствени антитела, пептиди, нискомолекулни съединения, аптамери и огледални аптамери.

Съгласно предпочитано изпълнение антителата са рекомбинантни антитела.

Предпочитат се антителата да са избрани от група, която включва scFv и негови фрагменти.

Задачата се решава също така чрез метод за скриниране на съединения, които се свързват към EDb- фибронектин - домени, при което метода включва:

a) поставяне в контакт на клетки с точно определена концентрация от един протеин, който обхваща EDb- фибронектин - домените или протеин с една от представените секвенции SEQ ID NO: 1 - 4, в присъствие на различни концентрации на едно или повече от съединенията и

b) доказване разликите в отговора на клетките към протеин, който обхваща ED_b- фибронектин - домените или протеин с една от представените секвенции SEQ ID NO: 1 - 4, в присъствие на съединенията в сравнение с контролния отговор на клетки към протеин, който обхваща EDbфибронектин - домените или протеин с една от представените секвенции SEQ ID NO: 1 - 4, в отсъствие на съединенията, при което клетките експримират протеин съгласно настоящето изобретение или включват нуклеинова киселина, която кодира за този протеин и при което отговора, респективно контролния отговор се предава чрез рецептор на EDb- фибронектин - домените.

При това се предпочита, отговора, респективно контрония отговор да обхваща прилепването на клетките към повърхности, които са покрити с EDb- фибронектин - домени или с части от тях.

Моноклонални антитела се получават по стандартни методи на хибридоматехнологията и се характеризират имунохистологично върху човешки туморни-криоотрязъци (виж фигура 13).

Примерно: АК AM-EDBr-2 (murines IgG 1/kappa).

В предпочитана форма на изпълнение отговора, респективно контролния отговорт обхваща пролиферацията на клетките на повърхности, които са покрити с EDb- фибронектин - домени или с части от тях.

В друго предпочитано изпълнение отговора, респективно контролния отговор обхваща пролиферацията, миграцията и диферен;ияцията на ендотелни клетки в колагенна матрица, която е покрита с EDb- фибронектин - домени или с части от тях.

Предпочита се, съединенията да са избрани от група, която включва антитела, фрагменти на антитела, изкуствени антитела, пептиди, нискомолекулни съединения, аптамери и огледални аптамери.

Задачата се решава освен това чрез използване на нуклеинова киселина, която кодира за протеина, който обхваща секвенция, която е избрана от групата, която включва SEQ ID NO: 1 - 4, за подбиране на съединения, коите се свързват към рецептор на ED_b- фибронектин домените или към EDb- фибронектин - домените.

Задачата се решава също чрез използване на протеин, съгласно настоящето изобретение, респективно на антитело, съгласно настоящето изобретение, за подбиране на съединения, коите се свързват към рецептор на EDb- фибронектин - домените или към EDb- фибронектин - домените.

Също така задачата се решава чрез използване на клетка, съгласно настоящето изобретение, за подбиране на съединенията, които е свързват към рецептор на EDb- фибронектин - домените или към EDb- фибронектин домените.

Задачата се решава също така чрез използване на нуклеинова киселина, която кодира за протеин, който обхваща секвенция, която е избрана от групата SEQ ED NO: 1 - 4, за развиване на антитела или scFv сляти протеини за диагностични или терапевтични цели.

Задачата се решава също така чрез използване на протеин, съгласно настоящето изобретениеа, за развиването на антитела или scFv сляти протеини за диагностични или терапевтични цели. Под терапевтични цели се има предвид между другото анти-ангиогенното лечение със съединения, които инхибират специфичното взаимодействие между EDb и рецептора. При това антителата са насочени както срещу рецептора, така и срещу EDb, при което се използват както пептиди със секвенция SEQ ID NO: 1 - 3 и тяхни стабилизирани производни, така и нискомолекулни съединения.

Също така задачата се решава чрез използване на клетка, съгласно настоящето изобретение, за развиване на антитела или scFv сляти протеини за диагностични или терапевтични цели.

Също така задачата се решава чрез използване на фаг, съгласно настоящето изобретение, за развиване на антитела или scFv сляти протеини за диагностични или терапевтични цели.

Също така задачата се решава чрез използване на протеин, който обхваща секвенция избрана от групата, която включва SEQ ID NO: 1 - 4 за про-ангиогенна терапия.

Също така задачата се решава чрез използване на протеин, който обхваща секвенция избрана от групата, която включва SEQ ID NO: 1 - 4 за диагностични цели.

Също така задачата се решава чрез използване на протеин, който обхваща секвенция избрана от групата, която включва SEQ ID NO: 1 - 4 за генна терапия.

Също така задачата се решава чрез използване на протеин, който обхваща секвенция избрана от групата, която включва SEQ ID NO: 1 - 4 за покриване на повърхности, към които се свързват ендотелните клетки.

При това се предпочита покриването да става in vitro или in vivo.

Също така задачата се решава чрез използване на протеин, който обхваща секвенция избрана от групата, която включва SEQ ID NO: 1 - 4 в клетъчни кулутури.

Също така задачата се решава чрез използване на протеин, който обхваща секвенция избрана от групата, която включва SEQ ID NO: 1 - 4 заедно с най-малко един трасплантат.

При това се предпочита трансплантата да е избран от група, която включва съд(ове), кожа, корнеа, бъбреци, черен дроб, костен мозък, бял дроб, кости, тимус, тънки черва, панкреас, други вътрешни органи както и части и клетки от тях.

Също така задачата се решава чрез използване на протеин, който обхваща секвенция избрана от групата, която включва SEQ ID NO: 1 - 4 заедно с най-малко един имплантат.

При това се предпочита имплантата да е избран от група, която включва белодробен имплантат, изкуствен пейсмейкер, изкуствени сърдечни клапи, съдови имплантати, ендопротези, винтове, шини, плочи, телове, пирони, пръчки, изкуствени стави, мамаимплантати, изкуствени черепни плочи, изкуствени зъби, пълнежи на зъби и зъбни мостове.

Под “ефекти, които са специфични за EDb- фибронектин - домените” се разбират такива ефекти, които са предизвикани чрез EDb- фибронектин домените, не и чрез EIII7, ЕП1/ 8 и т.н. Такъв ефект е описан примерно от Chen et al., 1998 (виж по-горе), т.е. бързо тирозин - фосфорилиране на повече вътрешноклетъчни протеини, за разлика от по-скоро бавно фосфорилиране на адхезия с посредник областите ЕШ-9-10. Под нискомолекулни съединения се разбират всички съединения, чиято относителна молекулна маса е под около 1000 - 1200. Под аптамери се разбират построени върху нуклеинови киселини молекули, които са в състояние да действат като високоспецифични лиганди за голям брой биомолекули. Под “про-ангиогенна терапия” се разбира всяка форма на терапия, при която се подпомага ангиогенезата. Под “анти-ангиогенно лечение/терапия” се разбира всяка форма на терапия, която има за цел инхибиране на ангиогенезата. Под “генна терапия” се разбира всяка форма на терапия, която има за цел изключването на генобуснована дисфункция, респективно възстановяването на нормалната генна функция, в случайте които се повлияват при елиминиране или доставяне на даден протеин. Тя може да включва вмъкването на чужди-ДНК в телесни клетки, но не трябва да се ограничава до това. Под “клетъчна култура” трябва да се разбира както клетъчни културални среди така и клетъчни културални съдове. Предпочитат се клетъчните културални съдове подбрани от група, която обхваща клетъчни културални шишета, - блюда, -панички, -плочи, микротитърни плаки, 96-кладенчеви-плаки, колби за клетъчни култури и биореактори.

“Диагностични цели” са всички цели, които служат за разпознаване на дадено състояние на организма/органа/клетка, респективно за определяне на актуалното състояние на организма/органа/клетка към дадена категория (например към дадена определена болест), примерно това може да се извърши при използването на дадено устройство/химически реактиви/измервателно съоръжение за определяне на физическа величина като температура и т.н'. или на химическа величина, като концентрация и т.н., без изброеното да служи за ограничение.

“Терапевтични цели” са всички цели, който служат за подобряване, респективно за оздравяване на болестно състояние на организма/органа/клетка. Под понятието “използване на протеин заедно с имплантат” се има предвид или по време или по пространство идентично използване. Примерно могат протеинови молекули да са прикрепени към имплантата при “вграждането” му в телото или те могат да са пространствено разделени от имплантата, но да са приложени по същото време на “вграждането” на имплантата (инжекции и т.н.).

Изобретението се описва подробно с помощта на следните примери и фиг\ри. При това:

Фигура 1 показва схематично използваните при това изследване повторящи се секвенции от типа III;

Фигура 2 показва резултатите от пролиферативно изпитание под влиянието на EDb- фибронектин - домените (ED-Β) върху ендотелни клетки, респективно човешки строматични клетки върху различни субстрати;

Фигура 3 показва резултатите от тест за растеж (tube formation test) на ендотелни клетки под влиянието на ED-B;

Фигура 4 показва резултатите от тест за прилепване, при който се изпитва прилепването на ендотелни клетки към покрити с ED-B повърхности;

Фигура 5 показва резултатите от тест, подобен на този от фигура 4, с изключение на това, че клетката е предварително инкубирана с различни синтетични пептиди, чийто секвенции са частични секвенции на EDbфибронектин - домените;

Фигура 6 показва използваните във фигура 5 частични секвенции на синтетични пептиди от EDb- фибронектин - домените;

Фигура 7 дава резултатите от тест за прилепване на ендотелни клетки към различни синтетични ED-B - пептиди;

Фигура 8 показва разположението на показаните на фигури 6-7 синтетични пептиди в моделна структура на пептидна главна верига на EDВ.;

Фигура 9 показва действието на EDb- фибронектин - домените и на произхождащ от Loop 5 пептид (SEQ ID NO: 2) върху индукцията на капиляроподобни структури в тест за растеж (tube fonnation test);

Фигура 10 показва резултати от афинитетни-хроматографични протичания при използване на Fn-7-8-9, респективно Fn-7-B-8-9 от клетъчни лизати от повърхностно-маркирани човешки кожни ендотелни клетки;

Фигура 11 показва резултати от афинитетни-хроматографични протичания при използване на Fn-7-8-9, респективно Fn-7-B-8-9 от клетъчни лизати от повърхностно-маркирани човешки кожни-строма-клетки;

Фигура 12 показва афинитетно хроматиграфично пречистване на EDbB-рецептора;

Фигура 13 показва имунохистологично охарактеризирани човешки туморни-криоотрязъци.

Фигура 1 показва различни използвани при това изследване рекомбинантни фибронектинови фрагменти, които показват различна структура на домените с различна повторяемост на секвенциите от типа III. При това Fn-7-B-8-9 обхващат фибронектин- домените 7, EDb, 8 и 9, Fn-7-8-9 домените 7, 8 и 9, ED-В домена EDb, Fn-10 домена 10 и Fn-б домена 6. Тези протеини се експримират като с His-Tag снабдени протеини в Е. coli и се пречистват върху никел-хелатна-сефарозна колона. Използваното при това изследване номериране отговаря на използваното в литературата. При това съкращенията FN-B, ED-В и Edb, означават съответните ED_b- фибронектин домени и трябва да се приемат като синоними.

Фигура 2 показва резултатите от пролиферативно изпитание, при което се изследва действието на EDb- фибронектин - домените (ED-В) върху пролиферацията на ендотелни клетки (ЕС), респективно строма-клетки (SC). 1000 клетки за кладенче се инкубират в 96- кладенчеви плаки. Към средата се прибавя разтворими ED-B (10 мкг/л) през време на пролиферативното изпитание. След три дни се определя броя на клетките с MTS. Пролиферирането на клетките се индуцира чрез базов фибронектиноврастежен фактор (bFGF). Оказва се, че ED-В няма активност в отсъствие на bFGF и също така не можа да се докаже активност за фибронектин-домена 10 от тип III в присъствие на bFGF върху клетките (данните не са показани). Можа да се установи активност за ED-B върху човешка ендотелна клетъчна пролиферация при клетки, които са поставени върху желатин (ЕС/желатин), също така при клетки, поставени върху колаген (EC/колаген), при все този последен ефект не е така ясен както при поставянето върху желатин. При човешки строма-клетки върху желатин (SC/желатин) има пролиферация дори в отсъствие на bFGF, която е значително над тази при човешки ентотелни клетки. Тя не можа да се повиши чрез прибавяне на bFGF, респективно на bFGF + ED-B. Като мярка за броя на клетките се определя екстинкцията при 490 нм.

При пролиферативното изпитание се използва следния експериментален метод:

Материал: 96-кладенчева плака (с плоско дъно), Nunc

Среда: MCDB 131, Pen/Strep, амфотерицин (0.25 мкг/мл), хепарин (20 мк/мл), топлинно инактиверан FCS (5 %)

Метод:

Клетки, 500 - 1000 за кладенче (96 кладенчева плака) в 100 мкл, се култивират 3 дни в среда с bFGF (1-3 нг/мл) или VEGF (3- 5- нг/мл). Точното количество се определя при всека партида чрез титруване: оптималното е минималната концентрация, която постига максимално стимулиране на пролиферацията. Не е необходимо синхронизиране на клетките преди експеримента, но може да се направи. След 3 дни се определя броя на клетките с MTS-апарат (Promega) съгласно указанието на производителя. Препоръчва се, да се измери абсорбцията при повече времена за да се получи максимална абсорбция в линейната област (0.5; 1; 2; 4 часа).

Контроли:

Отрицателна контрола, без митоген (няма пролиферация) (bFGF/VEGF)

Положителна контрола, с метоген (максимална стимулация) (+bFGF/VEGF)

Фигура 3 показва действието на ED-B върху растежа на ендотелни клетки от сфероиди. За целта HUVEC - сфероиди (Human Umbilical Vein Endothelial Cells = човешки ендотелни клетки от пъпна връв) се поставят в колаген и чрез прибавяне на 10 мкг/мл bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) се индуцират за растеж в присъствие и отсъствие на 6 мкг/мл ED-B. Оказва се, че чрез прибавянето само на bFGF се индуцира растежа и след това след прибавянето на ED-B можа да се стимулира по-нататък (+ bFGF + ED-B).

Преди теста за растеж (tube formation test) се използва следната експериментална методика:

Материал:

метилцелулоза, с най-голям вискозитет (Sigma) трипсин/EDTA за клетъчна култура (Gibco) облодънни 96-кладенчеви-плаки (Greiner #650185) рекомбинантен bFGF (Gibco # 13256 - 029) рекомбинантен VEGF (R & D System) анти-плъх- CD 31 (RDI # RDI-CD31TLD) хепарин (Gibco # 15077 - 027)

Разтвори:

PBS'антибиотик: клетъчна култура-PBS, 10 х Pen/Strep, 2.5 мкг/мл амфотерицин % желатин (Difco, автоклавиране и след охлаждане се прибавя Pen/Strep и амфотерицин (0.25 мкг/мл)

Среда: MCDB 131, глутамин, Pen/Strep, амфотерицин (0.25 мкг/мл), хепарин (20 мкг/мл), топлинно инактивепан FCS (10%)

Растежна среда:Среда с 2 нг/мл bFGF и 10 нг/мл VEGF

Клетки:

HUVEC дермални MVEC (пасаж >4)

Методика:

Ендотелни клетки се отделят с трипсин/ EDTA и се разреждат до 5000 клетки в милилитър с 0.24 % метилцелулоза. По 200 мкм (1000 клетки) се поставят в кладенче на Greiner плака и се инкубират една нощ. С помощта на 1-мл пипета с отрязан връх се събират кръгли клетъчни купчинки (сфероиди) и се отцентрофугират. Сфероидите се ресуспендират в

1.2 % метилцелулоза/FCS и се смесват с неутрализиан колагенов гел. Edb и bFGF се съполимеризират.

Както ясно се вижда от фигурата, чрез прибавяне на ED-В настъпва ясно увеличаване на растежа над този индуциран чрез bFGF.

Фигура 4 показва резултатите от тест за адхезия на ендотелни клетки към микротитърни кладенчеви плаки, които са покрити с ED-В. За целта ендотелни клетки се отделят с помощта на трипсиниране (трипсин/ EDTA) от тяхния субстрат и след това се инкубират в микротитърни кладенчеви плаки, които са покрити с различни концентрации (0, 1, 2, 3, 5, 10, 20, 40 мкг/мл) ED-В и се оставят един час за да прилепнат. Като отрицателна контрола служат кладенчета, които са покрити с 1 мг/мл BSA (говежди серумен албумин); адхезията върху BSA (< 10 %) се изважда.

Количественото определяне на прилепването се извършва чрез оцветяване с кристално виолетово, последвано от лизиране с SDS. Количественото определяне се получава чрез измерване на екстинкцията при 595 нм. Поставената хоризонтална линия във фигурата при А595 нм « 1.06 показва 100 % адхезия към плазма - фибронектин.

Резултатите от този опит показват, че клеткити се прилерват към покритите с ED-Β повърхности, което подсказва за наличието на рецептор за ED-Β върху клетъчната повърхност.

За прилепващия/адхезионния тест се използва следната експериментална методика:

Разтвори % BSA (Sigma, етанол-преципитиран) % серум в PBS (или трипсин-неутрализиращ разтвор)

Среда: MCDB 131, Pen/Strep, амфотерицин (0.25 мкг/мл), хепарин (20 мкг/мл), 1 % BSA (Sigma, етанол-преципитиран)

0.1 % кристално виолетово, 2 % глутаралдехид в PBS, стерилно филтруван % SDS

Методика:

Кладенчета на 96 кладенчева плака (Nunc) се покриват в продължение на един час при 37° С с протеин. При по-малки протеини (<20 kDa) или пептиди се препоръчва те да се оставят да изсъхнат върху плаката (за една нощ без капак под стерилна банка). След това кладенчетата се насищат с 1 % BSA в продължение на 1 час при 37° С. Клетките се отделят с 1 х трипсин, промиват се с 2 % серум за инактивиране на трипсина и се суспендират отново в средата. Когато се изпитват антитела или пептиди, клетките се прединкубират в суспензия от тях за 30 минути при 37° С. За кладенче (96 кладенчева плака) 10⁴ клетки се инкубират в обем от 50-100 мкл за 1 час при 37° С. Горната част внимателно се отлива, плаката се оставя 1 минута обърната да престои върху книжна кърпа за да се отцеди и задържаните клетки се оцветяват и фиксират с кристално виолетово/глутаров алдехид за 15 минути. Кладенчетата се промиват 3 пъти с PBS и клетките след това се лизират чрез прибавяне на 2 % SDS (15 минути върху клатачната машина). Абсорбцията се измерва при 595 нм. След трикратно промиване с вода клетките могат при желание отново да се оцветят.

Контроли:

Отрицателна контрола: празни кладенчета (BSA контрола) Положителна контрола: плазма - фибронектин (2.5 мкг/мл) % адхезия = А595 (проба): 100 х А595 (фибронектин)

Фигура 5 показва резултатите от тест, подобен на този от фигура 4 с изключение, че преди свързването към покритите с ED-Β микротитърни кладенчеви плаки, ендотелните клетки са предварително инкубирани с 250 мкМ различни синтетични пептиди, чията секвенция е била частична секвенция на ED_b- фибронектин -домените. Адхезията се определя чрез определяне на екстинкцията при 595 нм (А595). Нанесените във фигурата пептидни определения се обясняват във фигура 6. При това пептидната секвенция No 043 отговаря на изобразената в SEQ ID NO: 1 секвенция, пептидната секвенция No 553 на SEQ ID NO: 2, пептидната секвенция No 038 на SEQ ID NO: 3. Висока стойност на А595 отговаря на неинхибирано прилепване, докато малка стойност на А595 отговаря на инхибирано чрез съответния пептид прилепване.

Следва се метода описан за фигура 4.

Фигура 6 показва отнетите от цялата секвенция на ED_b- фибронектин - домени частични секвенции на синтетичните ED-Β пептиди с избраните за тях секвентни означения. Използва се еднобуквен код за аминокиселините.

Фигура 7 показва резултатите от тест, подобен на този от фигура 5, с изключение на това, че кладенчетат в микротитърните плаки не са наслоени . - Λ с ED_b- фибронектин -домени, а с оказали се във фигура 5 като инхибиторни пептиди, респективно не-инхибиторно оказали се пептиди, с които се прединкубират и с това се наслояват с тях. При това се оказва, че клетките в този тест при наслояване с някои от инхибиторските пептиди показват прилепване, измерено със стойността А595, докато във фигура 5 неинхибиторски оказал се пептид не води до прилепване.

Следва се метода описан за фигура 4.

Фигура 8 показва моделна структура на EDb- фибронектин - домени • (ED-Β), от която произлизат положението на инхибиторските пептиди No 1 . (=SEQ ID NO: 1), No 2 (=SEQ ID NO: 2) и No 3 (= SEQ ID NO: 3). Оказва се, че тези инхибиторски пептиди се намират върху Loop 1, респективно Loop 5 на ED-Β структурата и с това идентифицират регионите на домените, през които се осъществява свързването към клетката, респективно към намиращия се върху клетката рецептор. Показаната на фигура 8 моделна структура на ED-Β домените почива на вече откритата структура на фибронектиновите домени 7 от типа III. N-Т и С-Т означават N-, респективно С-терминали.

Фигура 9 показва резултатите от тест, при който се проучва действието при прибавяне на ED-Β и открития по-рано като инхибиторен пептид No 2, както и прибавянето на фибронектин- домени 6 от типа III върху индукцията на капилярно-подобни структури (tube formation) в теста за растеж. Оказва се, че над базалното, чрез bFGF индуцирано проникване в колегановото желе, най-голямата активност се получава чрез прилепващия инхибиторен пептид SEQ ID NO: 2. Този пептид има стимулиращо действие върху¹ пронкиването на ендотелин клетки в колагеновото желе. Този пептид отговаря поради това на свързващия регион на EDb и стимулира, аналогично на самия EDb, проникването на ендотелни клетки в колагена.

Следва се метода описан за фигура 3.

Фигура 10 показва резултатите от афиннтетна хроматография на клетка-лизат от повърхностно-маркирани човешки кожни ендотелни клетки. За целта се лизират пролифериращи, на повърхността на клетката биотинилирани ендотелни клетки с детергент и се подлагат на афинитетна хроматография, при която къси фрагменти фибронектин са свързани с или без вмъкнати EDb- фибронектин - домени към сефароза (с EDbфибронектин - домените = Fn-7-B-8-9, без EDb- фибронектин домените = Fn - 7 - 8 - 9). Можа да се покаже, че биотинилиран протеин с привидно молекулно тегло 120 - 130 kDa се свързва специфично към ED-B съдържащия фрагмент (виж стрелката). Елуирането се извършва чрез EDTA. Събират се повече, описани по-долу, фракции. След това фракциите се подлагат на SDS - PAGE и се изследват с Western - Blot със стрептавидин

- пероксидаза и хемолуминисценция (ECL). Следите 1 и 5 показват предварителни елуентни фракции, докато следите 2, 3, 4 респективно 6, 7, 8 показват елуираните фракции 1, 2 и 3. Следите 1 - 4 показват хроматографията с Fn - 7 - 8 - 9, докато следите 5-8 показват хроматографията с Fn - 7 - В - 8 - 9. Показаният тук резултат е силна индикация за това, че изтъкнатите ивици с молекулно тегло между 120 - 130 kDa е протеин, който се свързва специфично към EDb- съдържащите фибронектин - области и с това представлява рецептор за EDb- фибронектин

- домените.

За биотинилирането и лизирането на ендотелните клетки се използва следната експериментална методика:

Материал: З-сулфо-М-хидроксисукцинимиден - естер на биотинамидохексанова киселина, Sigma PBS т/о Mg/Са (Dulbecco)

Hepes - буфер: 20 мМ Hepes pH 7.6, 1 мМ CaCI₂, 1 мкМ MgCl₂, 0.1 %NaN₃, % CHAPS (V/V) и Boehringer цялостен мини-протеазен инхибитор, свободен от EDTA коктейл - таблети

Методика: Клетъчните културални шишета преди и след биотилирането се промиват всеки път с PBS w/Ca + Mg. Преди последното промиване се прибавя биотидиновия буфер (1 мг/15 мл PBS). Във всяко от шишетата се пипетират бавно по 5 мл от буфера (за 225 см³) или по 12.5 мл (500 см³ плаки) в средата на дъното, така че обема при разклащане да може да се разпредели по цялото дъно на шишето. След това първото културално шише се третира с половината обем на лизиращия буфер. Буферът се пипетира също в средата на дъното на шишето и се разпределя по цялата повърхност. След това клетките се остъргват с помощта на клетъчно стъргало. Цялият обем на първото културално шише се пипетира във второто шише, като се повтаря същата процедура. След последното шише обемът се пренася в 50 мл-ова конична центрофугална епруветка. С другата половина на лизиращия буфер се повтаря тази процедура във всички културални шишета (без клетъчен стъргач) и крайният обем се поставя също в центрофугална епруветка. Центрофугира се в 50 мл -ови конични клетъчни културални епруветки при 3000 об/мин, 5 мин при стайна температура (Heraeus - Tischzentrifuge). Лизатът се отпипетирва и в идеалния случай трябва веднага да се използва за афинитетна хроматография (в краен случай може да се замрази при -80° С).

За ковалентно свързване на протеини към сефароза се избира следния начин на работа:

Материал: активирана СН сефароза 4 В Pharmacia Biotech,

Code-No. 17-0490-01 ммол HCI, 2.2 % NaHCO₃

Методика: HCI се охлажда в ледена баня, сефарозата се оставя да се затопли до стайна температура.

След това сефарозата се промива с 1 мм HCI. За мл сефароза са необходими 10 мл HCI. Сефарозата се оставя бавно да се стича в предварително охладената епруветка, където тя набъбва в продължение на около 15 минути. (1 г сефароза отговаря на 3 мл набъбнала сефароза). След това епруветката се центрофугира 1 минута при 800 об/мин. Горната част се отпипетирва и се изхвърля.

Тази процедура се повтаря 3 пъти.

След третото промиване отново се прибавя HCI, епруветката се разклаща и 3 - 5 мин се ценрофугира при 800 об/мин. Горната част се отпипетирва и пелета се разтваря с 20 мл Millipore - вода и се пренася в две нови цетрофугални епруветки (1 епруветка за 7- ED-B-8-9 сефароза и за 7-89 сефароза, т.е. сефароза, към която е свързан полипептид с repeats III7, ED_b, III8 и III9, респективно III7, III8 и III9). Епруветките веднага се центрофугират, горната част се отпипетирва и могат да се свържат 1 - 5 мг протеин/мл сефароза.

(т.е. 2 мг протеин/мл сефароза 7-8-9 мг протеин/мл 7- ED-B-8-9)

Епруветките се размесват чрез разклащане. След това енергично се прибавя 2.2 % NaHCO₃ (50 мкл/мл гел). С това се неутрализира остатъчната HCI. Епруветките се обръщат и се размесват на “Wipptisch” в продължение на 1 - 5 часа при най-висока степен.

Накрая епруветките отново се центрофугират.

За определяне на протеиновата концентрация, която трябва да се прибави при ковалентното свързване на сефароза, се провежда теста на Bradfort:

Материал: BSA - основен разтвор 2 мг/мл реактив на Bradfort

Методика: BSA - разтворът се нанася както следва върху NuncImmuno-плака (Maxi Sorp): 5мкг - 4 мкг - 3 мкг - 2 мкг -1 мкг (80 мкл обем + 20 мкл изпитателен разтвор) ·

Разреждане за BSA: 5 мкг/50 мкл = 0.1 мг/мл

Основният разтвор 2 мг/мл се разреждат чрез 1:20 разреждане до концентрация от 0.1 мг/мл.

За провеждане на афинитетната хломатография, респективно за елуиране се избира следната процедура:

а) афинитетна хроматография

Материал: активирана СН сефароза 4В Pharmacia Biotech,

Code-No. 17-0490-01 буфер A: (20 мМ Hepes pH 7.6, 1 мМ CaC^, 1 мкМ MgCh, 0.1 % NaN₃, буфер В (буфер А + 150 мМ NaCI + 0.1 % Chaps) буфер С (буфер А + 0.1 % Chaps) pH 4 - буфер (Millipore - вода + 0.1% ледена оцетна киселина + 0.1 % Chaps)

EDTA - буфер (буфер А + 200 мМ EDTA pH 8.5 + 0.1 % Chaps)

Методика: Лизатът се прекарва първоначално 3 х през колоната

Под колоната се намира епруветка за хващане на течността. Първите 2 мл от лизата се поставят внимателно с Eppendorf-пипета върху гела. За останалия обем от лизата се използва мерителна пипета. Да се внимава колоната да е отвесна. Ако колоната се използва за първи път, то преди действителното протичане се провежда “сухо протичане” с всички свободни от протеини буфери. Пълнежът на колоната може да се използва най-много 5 пъти.

Ако лизатът е в замразено състояние (-80° С), тогава той трябва първоначално да се размрази във водна баня и след това да се центрофугира (5 мин при 3000 об/мин).

Винаги трябва да се предпочете пресен лизат пред замразен.

От лизатът се отпипетирват 500 мкл в Eppendorf-съд. Това служи за изследване на лизата преди и след хроматографията.

Ако се използват две колони (по една за 7- 8- 9 сефароза и за 7-В-8-9 сефароза) то всеки път през всяка от колоните се пропуска по половината от лизатния обем. И двете колони трябва да имат еднаква скорост на протичане. Ако не е така, “по-бавната” колона ще е съответно по-дълго затворена. Идеалната скороста на протичане е 0.2 - 0.5 мл/мин.

След като лизатът премине три пъти през колоната, от протеклото през колоната количество, след размесването му, се отпипетирват 500 мкл в Eppendorf-съд, за да може и тук да се проведе изследване.

След това през колоната се пропускат по 10 колонни обема буфер В и буфер С с което се приключва процеса на промиване.

Ь) Елуиране

Предварително елуиране: Буфер С се пропуска през колоната, за да се установи, дали въпреки процеса на промиване са останали още протеини. 500 мкл се хващат в съд на Eppendorf (При две колони съответно 2 х 500 мкл).

EDTA - елуиране: EDTA комплексира Са- и Mg-йони. Чрез това се елуират ендотелните клетки - протеините, за които е необходимо Са и Mg за свързването. 2 х 4 мл EDTA - буфер се прекарват през колоната (респективно през двете колони) и се хващат в две фракции (Е1 и Е2/ ВЕ1 и ВЕ2) в Falcon - епруветки. След това съдържанието на епруветките се размесва и 5000 мкл се отпипетирват в един (респективно в два) съда на Eppendorf.

pH 4 - елуиране: Същинската pH стойност на буфера възлиза на 3.7. Извън неутралната pH-област (pH 6-8) може да се възпрепятства свързването на рецептора към своя протеин. И тук, както при EDTA елуирането, през колоната се изпращат 2 х 4 мл РН 4 - буфер, събира се в две фракции и всеки път се отпипетирват по 500 мкл (4.1 и 4.2/ В 4.1 и В 4.2).

След това върху колонат се прилагат 3 колонни обема буфер А за промиването й. Последният колонен обем остава в колоната. Колоната се затваря и се съхранява в хладилник.

500 мкл-овите фракции в съдовете на Eppendorf се замрамязат в продължение на най-малко 15 минути при -80° С и след това се сушат чрез замразяване н “Speed vac”.

W Така получените фракции, респективно предварителни-елуентни фракции се разделят с SDS - PAGE и при редуциращи условия се поставят в Western Blot.

Фигура 11 показва същия експеримент като фигура 10, с изключение на това, че тук не се използват лизирани ендотелни клетки, а лизирани стромални клетки. В показания на фигура 11 Western Blot следите 1 - 3 показват елуирането на афинитетна колона с Fn-7-8-9, докато следите 4-6 показват елуата на афинитетна колона с Fn-7-B-8-9. Следите 1 и 4 са предварителни елуационни фактори, докато следите 2, 3 респективно 5, 6 фракциите 1 и 2 на съответното елуатно протичане. Изявена ивица с привидно молекулно тегло 120 - 130 kDa, каквато се вижда във фигура 10, не можа да се установи при този клетъчен лизат от човешки стромални клетки.

В настоящето описание, в претенциите и чертежите, показани признаци на изобретението могат единично или в произволни комбинации да са от значение при осъществяването на изобретението в неговите различни форми на изпълнение.

Фигура 12 показва ED-В-свързващия протеин, който може да се пречисти съгласно описаната афинитетна хроматография, а чрез SDSградиентна гелелектрофореза (4-12 %) да се раздели. Специфично обогатените двойни ленти (стрелки) се изрязват и се анализират посредством масова спектроскопия.

Секвентният анализ идентифицира изолирания протеин еднозначно като алфа2-бета1-интегрин, при което предоминантата отговаря на тежки ленти на бета 1-, леката лента на алфа2- субединици.

Това откритие говори, че свързването към ED-Β става главно чрез посредничеството на бета1-субединица на интегрина. Съгласно изследваните клетъчни типове могат и други алфа-субединици (например алфа2) комбинирани с бета 1 да посредничат за свързването към EDB-FN.

Фигура 13 показва имунохистологично характеризирани човешки туморни-криоразрези, при които

A. означава бъбречно-клетъчен карцином, стрелките показват специфичното оцветяване чрез АК AM-EDBr-2

B. означава close-up на същия препарат

C. означава хепатоцелуларен карцином

D. означава меланом (тук не бе намерено специфично оцветяване) .Анализ на EDB- рецептора

Лентите се изгрязват от ID-гел, промиват се с NH4HCO3- разтвор и ацетонитрил, сушат се и се прибавя трипсинов разтвор за протеолиза на протеините в гела. От гела в разграждащия разтвор елуираните пептиди се концентрират върху mkCjs- колони, обезсоляват се и се измерват с MALDIмасова спектрометрия (=лист от пептидни маси на разградения протеин).

С намерените пептидни маси от всяка гелова лента се провеждат изследвания с базаданни. При нееднозначини резултати се измерват допълнително MALDI-PSD-спектри (фрагментни спектри) на отделния пептид. Спектрите се използват за директно потвърждаване на предполагаема пептидна секвенция (интерпретиране на спектъра) или се провежда търсене с тези спектри в базаданните.

Изследвани ивици:

Лента А = лента 1 от препарат 6 лента 4 от препарат 5 лента 6 от киселия елуат

Резултат: Интегрин ос2 виж резултат от търсенето в базаданни в лента 4 спектрите от ленти 1 и 6 показват еднакви интензивни пептиди един PSD-спектър на пептид от лента 1 потвърждава една частична секвенция от интегрин а2

Лента В= лента 1 от препарат 6 лента 5 от препарат 5 лента 7 от киселия елуат

Резултат: Интегрин β 1 виж резултат от търсенето в базаданни в лента 5 и 7 спектъра от лента 2 показва еднакви интензивни пептиди търсенето в базаданните с един PSD-спектър от лента 2 потвърждава интегрин β 1

BSA съдържа се във всички три ленти потвърждава се чрез търсенето в базаданни с един PSD-спектър и множество пептидни маси.

(ABP) (HISTAMINASE)

4.2e-013 - qil7656867lrefINP 055059.11 a disintegrin-like and 12 6.8 134

al	CJ IO	cd σ>	CD σ>
	σ>|	ml	ini

ProFound - Search Result Summary

o	co	T~	co
		CO	σ>
T-l	T~|		CM|
C\ll	CMI	T-l	cmI

Τί-	Ό-	Τί-
τ-	τ-	τ-	τ-
ο	Ο	ο	Ο
Φ	Φ	Φ	Φ
CO	in	q	h;
CO	CD	• tn	• Tt
r-	co +	σ>	O T

φ
Ю	1—'
c	c
co		c/>
CO	w Φ	Φ
a	« CO JQ	E E
Φ C	CO *-* CO	CO E
o	Ό
•Q		CO
LL	K-	ra
m	c	E
Q	co	E
Ш	Q	CO
Z
Q	Φ	>%
	V)	E o
Φ	co .Q

Protein Mass Ra 80- 135 kDa

-36Protein pl Range 0.0 -14.0

Search for Single protein only

Digest Chemistry Trypsin

Max Missed Cut 2

Modifications +C3H5ON@C(Partial); +O@M(Partial);

Ф 2 CD

Ф CL

E

CL

CL

O p

ra ra

	CM	co	b-	CM
CO’	b-	CD	co	o
Y*	b-	CD	r-	ID
co	l<	CO	CO	CM
co	o	CD	co	CO
r-	b-	CD	CM	CD
	T-	T—	CM	CM
*“	co	CD	b-	CO
cd	co	CD	o>	CO
co	co	CD	p	co
CD	co'	CO	Xf	CM
b*	co	b-	CM	o
o	CD	CD	CM	CD
co	T~	τ-	CM	CM
*”	y-	Ο	co	CD
	o	CD	CD	CO
co	co	CD	o	CO
b-	CD	b-’	6	cm'
r<	CO	M·	ID	b-
r-	ID	CD	t—	00
CM	4—	τ-	CM	CM
T—	co	Ο	ID	XT
CD	co	CO	CD	o
CM	b-	CD	p	p
b-	l<		to	to
CM	CD	CO	CD
CM	CD	CD	O	r-
CM	τ—	τ’-	CM	CM
r~	CD	CD	ID	co
ID	CD	ID	CD	CM
co	CO	CD	O
<0	co'	ID	CD	ID
σ>	CD	V-	CD	o
b-	CD	CD	O	r-
t—	T-	t—	CM	CM
	to	CO	b-	ТГ	CM
M-	co	CD		,--	4-
o	co	p	O	CM	ID
io	6	T-			ό
b-’		lD	ID	o	co
o	IO	co	O	ID	CM
o	Т“	τ-	CM	CM	co
Ύ—	co	Ο	CO	ID	•M·
CD	co	co	CD	T—	CM
co	co	co	p	t—’	M
ID	CD	CD	Μ	M-	CM
IO	b-	1—	m·	’M’	to
co	xr	co	O	co	o
CD	t—	r—	CM	CM	co

v> Ф v> v> ra S ф Ό *5 CL

Ф CL

O Έ.

o o « o c o 2 ra Q

Ф c o c cф c o c >4 jo

CL от

TJ ώ >. от

Ш JC g x: 5

II >s Λ

CL

OT T5 _Φ >4 OT

co

T— + C o tn

I— >

ProFound - Search Result Summary

II

o c

CL O -J o

CO Q

tn φ ο с <D LJ СГ <D tn

W Ό Έ ®

c

Ф

4-» o b_ CL

CO IO CO CO CO r00 00 1- CO o

CO co co m· co’ τ00 CM to IO

CO CM co

co

co

ID

ID

CO

co

CO -Γ-

CD

CO

’M

CM

CO

b-

1^2

o

co

co

co

o

CO

b-

CO

M

ΟΟ ID

co

тГ

CO

CD

o>

CO

o>

CM

σ>

CM

CM

σ>

σ>

co

σ>

CO

o

1^

id

CD

ID

id'

ID

ID

σ>

σ>

o>

σ>|

COI

21

coi

COI

2|

21

coi

21

» 'ί-	I CD	t	1 CO	> CD	I CO	1 CD	1 co
Ο	O		o	O	o	O	o
o	O		o	O	o	O	o
Φ	Φ		Φ	Ф	Ф	Φ	Φ
σ>	b-		co	T-;	Τ-	xr
	u	t .		1—	Ο	CM
CM	co +		M·	ID	CO		CO

<0	o	CO CO	σ> τ-
CD	CD CD	o cd	ο o
	CD	CO	00
CD	ID	CD	co’
		1-1
Ol	col	•-I

+9 9.9е-007 - αίΙ9910260lrefINP 064581.11 HCNP protein ho o

I

Φ CD o o +

ш ΙΟ z

cs E E 3 CD <3 a c

O Φ CO o erf

Φ E I—

O <5 φ co

O H 23 o o CM m· -φ o o o o x>

Φ u_

T>

Φ

Φ

E ΙΟ»

Φ CO Q in φ T> c C3 co

CM CO o c

φ c o

D ll

Q Q Ш

D o> a E cs co

Φ V) co X»

CS +·· cs Q

Category

Protein Mass Ra 80-100 kDa

-40nge

Protein pl Range 0.0 -14.0

Search for Single protein only Digest Chemistry Trypsin

Max Missed Cut 2

Ф ra

4-* ω ο σ> ъ— ra .c O

co	co
		co	o
		CO	CM
	CM •V co	CO	ό b-
	b-	M·
	cm’		CM
	cm
	•M·	co	1—
	Τ-	co	co
		co	τ-
	Ο CM CO	co co	ο co
	co	CM
	co	T—	CM
	b~
	co	CM	co
		•M	co
		b-	o
	CD co CD	r<	tn
	CD in	CM CM
	CM	T—	CM
	CM
	CM	CM	O)	in
		tn	M·	b-
		co	CD	CD
	in CM ID	co’	M·’	r<
	in	Ί-	co
	in	ο	co
	r<	τ-	CM	co
	o
	o	τ-	in	CM
	T—	Ο)	co	τ-
		b-	,—	ο
	co σ>	o>	o>	co
	b-	Τ-	CM
		rf	Ο	co
	co’	,—	CM	co
	co
	σ>	b·	co	Ю
		o>		T—
	tn	b;	o	M;
	o>	in	v—	CD
	M	I~-	co	o>
	r<	M·	o>	CM
	CM	Ύ-	T-	co
	cn
е		M	CM	T—
Lh	co	tn	o>	V—
Q. CL	co CM	co o>	CO in	co
	V“	co	V—	M-
o	co	•M·	o	v—
T-	co	t—	T-	CO

E

CL

CL

O o ό

Ю

ID CM

V)		z-*»	tn	o		Τ-	OT
Ф	Ф	0	Ф		z	Ο	Φ
tn tn ro	O) ra L. Ф	> <	tn tn a	u. o ΤΟ	o 2	i— φ £1	Ό ‘P CL
2	>		2	tn	eT	E	Φ
Ф TO	< ra	o c ra	ф	o c	o c ro	□ z	□_
♦5	Q	k.	♦5	o	b.
CL		Ф	• CL	2	o
Ф		o	Ф		o
□l		1-	CL	ro ΓΊ	1-

от φ

> 'c z>

Ж— _ф

Ф *ф o tr

Ф JZ H ra n c

o LL

O

1— Q_

C o

Ό Ф

OT ra от

TJ c

Zi o u_ o (X

function expandlt(whichEI) {whichEl.style.display = (whichEI.style.display == none)? 'T'none;

-41 ProFound - Search Result Summary

I mi r’i νΊ

RECEPTOR BETA SUBUNIT PRECURSOR (INTEGRIN BETA- 12 5.7

	CO Ю	cd co	cd r-
1 тГ	CO CM	CO Τ-	00 co
CO	co	ΟΟ	CO
id	to	to	to*
	CM!	OJI	CM!
	T-l	’-I	•H

; co	ID τ-	co co	co σ>	•M IO	CM b-	CM CD	0 CM
1 Μ-	Ο CO	co o	CO ID	σ> cd	o> co	σ> co	co oo	w co
co	CO	CM	o	σ>	o	o	CD	Tfr
ID	ID	ID	l<	ID	CD	co	CD	CD
21	21		21	COI	COI	COI	21	21

CD O O <	b~ o o - 1	bo o	bo o
Φ	Φ b~	1 Φ b-	1 Φ co
co	Γ-	• co’
CM	+ co	T	ID

65.4е-008 - gill586344lprfll2203411A reeler gene IMus musculusl 10 5.7

o	CM	τ-	ю	co
σ>	ID	ΙΟ	σ>	ιό
<D|			Ю|	COI
T-l	т-l	σ>ι	τ-Ι	τ-Ι

Τ_
Tt		σ>		co	co
CO				co	M·
σ>		Ο		N
		Κ		Ю	Ю
co		CO		ΙΟ	Ю
ο		Ο		ο	o
CL		CL		CL	CL
Ζ		Ζ		Ζ	z
		Η—
φ		α>		φ	Φ
Χ-		Χ-		X—	Χ-
ΙΟ		ΙΟ		μ-	ΙΟ
κ		σ>		co	co
CM		ь-		м·	4·
	Φ	co	φ	см	CM
00	b-	CD	CD
CD	W (ΰ	σ>	W	CD	CD
CD	CD	b·
““	C
σ	1S	'σ		σ	σ

1	1	1
CO	00	CO	co
o	o	o	o
o	o	o	o .
Φ	Ф	Ф	Φ
o		CM	CM
co	T-'		IO
Γ·	+ CD	σ>

Input Summary

Date & Time Wed Feb 07 10:07:52 2001 UTC (Search Time: 5.88 sec.)

-44Sample ID EDB Fibronektin, #0824, Bande 7 Database NCBInr [..\databases\nr] Taxonomy Mammalia (mammals)

Category

Protein Mass Ra 80-100 kDa o CD c

>T

C O

CM

O

T3 ω w

S

	Ю	CO	co
						ф-	σ>	CD
					т—	CD	o	φ
					см co	ID	Φ*	CM
					T—	Φ	ID
					CO	CD	co	Ο
					b-	τ-	CM	CO
					ТГ
					т-	ο		co
						co	o	ID
					СМ	co	T—	ID
					ь<о	CD	co	CM
					T—	co	b-
					см	co	CM	co
					см	Т“	CM	CM
					ф
						CD	v·	ID
						co	co	φ
					co	co	o	Ю
					cd co	T—	Φ	0
					co	CM	φ
					co	b-	CM	00
					bco	№	CM	CM
					CO	Τ-	co	CM
• ·.						Ю	Ο	to	b-
					r*	co		co	ID
a •e					CD ID	CD	co	CD	co’
				co	co	Гч	CD
ГО					CD	co	o	b-	CM
cl					CO	r—	CM	CM	co
					CM
s					T—	ID	o	φ	T—
						CM	ID	co	b-
©					ID	b-	T—	CM	ID
o					CD		CD	id	0
+					co		o	co
					CM	io	o	b-	CM
					CM	1—	CM	CM	co
j?					CM
					o		IO	CD
						to	ID		ID
CO					CD	co	O	CM	ID
Q.					b-	co’	τ-		cd’
o					CO	ID	Ο	O	ID
©					ID	cd	ID	Т“
				co	τ-	τ—	CM	CO
z					CD	ο
O				Р		τ—	y—	•φ
				CO	co	CO	o	CD
ID X ω O	+			Q-	Т“ CM	rcd	σ>	CM o’	Φ co
τ			г—ч	T—	r-	co	b-	Φ
е<1_				co	Φ	CD	ф·	τ-
+				т—	co		Τ-	CM	Ο
v>	Ф	V)	^ч			V)	Ο	T—4
c o ♦3	*-» го 4-« V)	ф W <0	ф σ> се к.	ϋ > <		Φ w ω	‘ο. ο
<3	ф CD к-	го	ф			π	ο
o	S ф	> <	o' ο с		2 Φ	ν> ο
’σ	го	2	го’	я		D	C
ο 2	£ о	*3 Q.	Q	ь. _Ф		CL	ο 2
		Ф		о		Φ
		О.		н		CL	Я

E

CL

CL

O o ό to

Number of 32

Peptides roteoMetrics’ ProFound is based on ProFound at The Rockefeller University [search + transmission time: >=5.91 sec]

-45Протокол на секвенциите <110> Schering AG <120> Рецептор на EDb - фибронектин-домените <130>s5495 <140>

<141>

<160>4 <170> Patentin Ver. 2.1 <210> 1 <211> 15 <212>PRT <213> свързваща секвенция No I за предполагаем EDB-рецептор върху

EDB-молекулата <400> 1

Val Asp He Thr Asp Ser Ser lie Gly Leu Arg Trp Thr Pro Leu

10 15 <210>2 <211> 15 <212>PRT <213> свързваща секвенция No II за предполагаем EDB-рецептор върху EDB-молекулата

-46<400>2

Gly Tyr Tyr Thr Vai Thr Gly Leu Glu Pro Gly lie Asp Tyr Asp

5 10 15 <210>3 <211> 15 <212> PRT <213> свързваща секвенция No III за предполагаем EDB-рецептор върху

EDB-молекулата <400> 3

Thr Gly Leu Glu Pro Gly lie Asp Tyr Asp lie Ser Vai lie Thr

10 15 <210>4 <211 >91 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 4

Glu Vai Pro Gin Leu Thr Asp Leu Ser Phe Vai Asp lie Thr Asp Ser

5 1015

Ser lie Gly Leu Arg Trp Thr Pro Leu Asn Ser Ser Thr lie lie Gly

2530

Tyr Arg lie Thr Vai Vai Ala Ala Gly Glu Gly lie Pro lie Phe Glu

4045

Asp Phe Vai Asp Ser Ser Vai Gly Tyr Tyr Thr Vai Thr Gly Leu Glu

-4750 5560

Pro Gly lie Asp Tyr Asp lie Ser Val He Thr Leu lie Asn Gly Gly

70 7580

Glu Ser Ala Pro Thr Thr Leu Thr Gin Gin Thr

8590

Claims (39)

1. Патентни претенции

   1. Протеин,

   a) който има способността да се свързва специфично към ED_b фибронектин-домените

   b) който е специфично експримиран или активиран в ендотелни клетки

   c) който е специфично експримиран или активиран в стомални клетки на тумора

   d) който е специфично експримиран или активиран в туморни клетки

   e) чието свързване към ED_b - фибронектин-домените се инхибира чрез един полипептид и

   f) който има привидно молекулно тегло 120 - 130 kDa за леката верига и 150 - 160 kDa за тежката верига, определени чрез DSDполиакриламид-гелелектрофореза.
2. 2. Протеин съгласно претенция 1,

   a) който има способността да се свързва специфично към ED_b фибронектин - домените, при което свързващият регион се характеризира чрез най-малко една секвенция, която е избрана от групата обхващаща SEQ IDNO: 1 -3;

   b) който е специфично експримиран или активиран в ендотелни клетки

   c) който е специфично експримиран или активиран в стомални клетки на тумора

   d) който е специфично експримиран или активиран в туморни клетки

   e) чието свързване към EDb - фибронектин- домените се инхибира чрез един полипептид, който обхваща секвенция, която е избрана от групата обхващаща SEQ ID NO: 1 - 3; и

   f) който има привидно молекулно тегло 120 - 130 kDa за леката верига и 150 - 160 kDa за тежката верига, определени чрез DSDполиакриламид-гелелектрофореза.
3. 3. Протеин, съгласно претенции 1 до 2,

   a) който има способността да се свързва специфично към EDb фибронектин- домените и който обхваща α2β1-веригата на интегрина;

   b) който е специфично експримиран или активиран в ендотелни клетки

   c) който е специфично експримиран или активиран в стомални клетки на тумора

   d) който е специфично експримиран или активиран в туморни клетки

   e) чието свързване към EDb - фибронектин- домените се инхибира чрез един полипептид, който обхваща α-веригата на интегрина и

   f) който има привидно молекулно тегло 120 - 130 kDa за леката верига и 150 - 160 kDa за тежката верига, определени чрез DSDполиакриламид-гелелектрофореза.
4. 4. Протеин съгласно претенциите 1 до 3, характеризиращ се с това, че ендотелните клетки са пролифериращи ентоделни клетки.
5. 5. Протеин, чието специфично свързване към EDb - фибронектиндомените посредничи за адхезията на ендотелни клетки, туморнистроматични - клетки и туморни клетки.
6. 6. Протеин, чието специфично свързване към EDb - фибронектиндомените посредничи за адхезията на ендотелни клетки, туморнистроматични - клетки и туморни клетки, при което свързващият регион се характеризира с най-малко една секвенция, която е избрана от групата обхващаща SEQ Ю N0: 1-3.
7. 7. Протеин съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че свързващият регион обхваща α2β1-веригата на интегрина.
8. 8. Протеин, чието специфично свързване към EDb - фибронектиндомените индуцира пролиферацията на ендотелни клетки.
9. 9. Протеин, чието специфично свързване към EDb - фибронектиндомените индуцира пролиферацията на ендотелни клетки, при което свързващият регион се характеризира с най-малко една секвенция, която е избрана от групата обхващаща SEQ ID N0: 1-3.
10. 10. Протеин съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че свързващият регион обхваща α2β1 -веригата на интегрина.
11. 11. Протеин, чието специфично свързване към EDb - фибронектиндомените индуцира пролиферацията, миграцията и диференциацията на ендотелни клетки в една колагенна матрица.
12. 12. Протеин, чието специфично свързване към EDb - фибронектиндомените индуцира пролиферацията, миграцията и диференциацията на ендотелни клетки в една колагенна матрица, при което региона на свързване се характеризира с най-малко една секвенция, която е избрана от групата обхващаща SEQ ID N0: 1-3.
13. 13. Протеин съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че свързващият регион обхваща α2β 1 -веригата на интегрина.
14. 14. Протеин, който се свързва към EDb - фибронектин- домените и индуцира специфични сигнални трансдукционни пътища, при което се индуцира най-малко един ген, който кодира за протеин, който е избран от групата обхващаща фокална адхезионна киназа,

    ED6 - лиганд (ALCAM), α-веригата на витронектин - рецептора, интегрираната алфа 8 субединица и един/предшествените на сроден на фолистатин протеин.
15. 15. Протеин, който се свързва към EDb - фибронектин- домените и индуцира специфични сигнални трансдукционни пътища, при което се индуцира най-малко един ген, който кодира за протеин, който е избран от групата обхващаща фокална адхезионна киназа,

    ED6 - лиганд (ALCAM), α-веригата на витронектин - рецептора, интегрираната алфа 8 субединица и един/предшествените на сродния на фолистатин протеин, и при което свързващия регион се характеризира с най-малко една секвенция, която е избрана от групата обхващаща SEQ ID N0: 1-3.
16. 16. Протеин съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че свързващият регион обхваща α2β 1-веригата на интегрина.
17. 17. Антитело, което е в състояние да се свърже към протеин съгласно една от претенциите 1 -10.
18. 18. Антитело, което е в състояние да се свърже към протеин, който обхваща аминокиселинна секвенция, която е избрана от групата обхващаща SEQ ID NO: 1 - 4.
19. 19. Антитело съгласно една от претенциите 17 - 18, което е в състояние да инхибира ефекти, който са специфични за EDb фибронектин- домените.
20. 20. Антитело съгласно една от претенциите 17 - 18, при което свързването и инхибирането се извършва in vitro и/или in vivo.
21. 21. Антитело съгласно една от претенциите 17 - 20, което се характерезира, че е моноклонално или рекомбинантно.
22. 22. Антитело съгласно една от претенциите 17 - 21, което се характеризира, че е scFv-фрагмент.
23. 23. Клетка, която експримира протеин съгласно една от претенциите 1-10.
24. 24. Клетка, която експримира антитела съгласно една от претенциите 17 - 22.
25. 25. Фаг, който експримира антитела съгласно една от претенциите 17-22.
26. 26. Метод за скриниране на съединения, които се свързват към рецептор на ED_b - фибронектин- домените, характеризиращ се с това, че включва:

    сравняване на отговор на клетки в присъствието на едно или повече от тези съединения с контролния отговор на споменатите клетки в отсъствие на тези съединения, при което клетките експримират протеин съгласно една от претенциите 1-10 или обхващат една нуклеинова киселина, която кодира за този протеин и отговора, рестерктивно контролния отговор се посредничи от един рецептор на ED_b - фибронектин- домените.
27. 27. Метод съгласно претенция 26, характеризиращ се с това, че отговора, респективно контролния отговор обхваща прилепването на клетки върху повърхности, които са покрити с ED_b - фибронектин- домени или части от тях.
28. 28. Метод съгласно едно от претенциите 26 - 27, характеризиращ се с това, че свързващ регион на ED_b - фибронектин-домените обхващат секвенциите SEQ ID NO: 1 - 4 или части от тях.
29. 29. Метод съгласно претенция 26, характеризиращ се с това, че отговора, респективно контролния отговор обхваща пролиферирането на клетките върху повърхности, които са покрити с ED_b - фибронектиндомени или части от тях. ·
30. 30. Метод съгласно претенция 26, характеризиращ се с това, че отговора, респективно контролния отговор обхваща пролиферирането, мигрирането и диференцирането на ендотелни клетки в колагенна матрица, в която има EDb - фибронектин-домени или части от тях.
31. 31. Метод съгласно една от претенциите 26 т 30, характеризиращ се с това, че съединенията са избрани от групата, включваща антитела, изкуствени антитела, фрагменти на антитела, пептиди, нискомолекулни вещества, аптамери и огледални аптамери.
32. 32. Метод съгласно претенция 31, характеризиращ се с това, че антителата са рекомбинантни антитела.
33. 33. Метод съгласно претенция 31, характеризиращ се с това, че антителата са избрани от група, която обхваща scFv и фрагменти от тях.
34. 34. Метод за скриниране на съединения, които се свързват към EDb - фибронектин-домени, характеризиращ се с това, че обхваща:

    a) поставяне в контакт на клетки с определена концентрация на протеин, който обхваща ED_b - фибронектин-домените или протеин с SEQ ID NO: 1 - 4 изобразени секвенции, в присъствие на различни концентрации от едно или повече съединения и

    b) доказване на разлики в отговора на клетки върху протеина, който обхваща EDb - фибронектин-домените или протеин с SEQ ID NO: 1 - 4 изобразени секвенции, в присъствие на съединения в сравнение с контролния отговор на клетките върху протеина, който обхваща EDb фибронектин-домените или протеин с SEQ ID NO: 1 - 4 изобразени секвенции, в отсъствие на тези съединения, при което клетките екпримират протеин съгласно една от претенциите 1-10 или обхващат нуклеинова киселина, която кодира за тази киселина, и при което отговора, респективно контролния отговор се посредничи от рецептор на ED₀ - фибронектин-домените.
35. 35. Метод съгласно претенция 34, характеризиращ се с това, че отговора, респективно контролния отговор обхваща прилепването на клетки върху повърхности, който са покрити с EDb - фибронектин-домени или части от тях.
36. 36. Метод съгласно претенция 34, характеризиращ се с това, че отговора, респективно контролния отговор, обхваща пролиферирането на клетки върху повърхности, който са покрити с EDb - фибронектин-домени или части от тях.
37. 37. Метод съгласно претенция 34, характеризиращ се с това, че отговора, респективно контролния отговор, обхваща пролиферирането, мигрирането и диференцирането на ендотелни клетки в колагенна матрица, в която има ED_b - фибронектин-домени или части от тях.
38. 38. Метод съгласно една от претенциите 34 - 37, характеризиращ се с това, че съединенията са избрани от граната включваща антитела, изкуствени антитела, фрагменти на антитела, пептиди, нискомолекулни вещества, аптамери и огледални аптамери.
39. 39. Използване на нуклеинова киселина, която кодира за един протеин, който обхваща секвенция, която е избрана от група включваща SEQ ID NO: 1 - 4, за скриниране на съединения, които се свързват към

    46. Използване на протеин, който обхваща секвенция избрана от групата SEQ ID NO: 1 - 4, за про-ангиогенна терапия.

    47. Използване на протеин, който обхваща секвенция избрана от групата SEQ ED NO: 1 - 4, за диагностични цели.

    48. Използване на протеин, който обхваща секвенция избрана от групата SEQ ID NO: 1 - 4, за генна терапия.

    49. Използване на протеин, който обхваща секвенция избрана от групата SEQ ID NO: 1 - 4, за наслояване на повърхности, към които се свързват ендотелни клетки.

    50. Използване съгласно претенция 49, при което наслояването се извършва in vitro или in vivo.

    51. Използване на протеин, който обхваща секвенция избрана от групата SEQ ID NO: 1 - 4, в клетъчни култури.

    52. Използване на протеин, който обхваща секвенция избрана от групата SEQ ID NO: 1 - 4, заедно с най-малко един трансплантат.

    53. Използване съгласно претенция 52, при което използваният трансплантат е от групата избрана от съд(ове), кожа, корнеа, бъбреци, черен дроб, костен мозък, сърце, бял дроб, кости, тимус, тънки черва, панкреас, други вътрешни органи както и части и клетки от тях.

    54. Използване на протеин, който включва секвенция, избрана от групата SEQ ID NO: 1-4, заедно с най-малко един инплантат.

    55. Използване съгласно претенция 54, при което имплантата е избран от групата белодробни инплантати, изкуствени пейсмейкери, изкуствени сърдечни клапи, съдови имплантати, ендопротези, винтове, шини, плочи, телове, пирони, пръчки, изкуствени стави, мамаимплантати, изкуствени черепни плаки, изкуствени зъби, зъбни пълнежи и зъбни мостове.

    РЕЦЕПТОР НА EDb-ФИБРОНЕКТИН-ДОМЕНИ

    Реферат

    Изобретението се отнася до протеин, който се свързва специфично към EDb - фибронектин-домените, метод за скриниране на съединения, които се свързват към рецептор на EDb - фибронектин-домените или към самите EDb - фибронектин-домени, както и до използването на този протеин.