BG104903A

BG104903A - Метод за получаване на свързани със смола циклични пептиди

Info

Publication number: BG104903A
Application number: BG104903A
Authority: BG
Inventors: Adam SLEDESKI; James Mencel
Original assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc.
Priority date: 1998-04-15
Filing date: 2000-11-02
Publication date: 2001-07-31
Also published as: JP2002511483A; AP1117A; CN1323313A; CN1552737A; PL347103A1; NO20005165D0; CA2325572A1; CZ20003798A3; CN1163504C; EA200001071A1; US6569993B1; EP1093458A4; KR20010085236A; UA72460C2; NO20005165L; AP2000001972A0; OA11501A; AU3567999A; SK15352000A3; EP1093458A1

Abstract

Изобретението се отнася до метод за твърдофазен синтез на база фрагмент на свързани със смола циклични пептидни аналози на паратироидни хормони и аналози на свързани с паратироидните хормони протеини, като аналози съдържат поне един мост между страничните вериги на два несъседни аминокиселинни остатъка. Изобретението се отнася и до използваните зацелта пептидни фрагменти.

Description

Област на техниката

Настоящото изобретение се отнася до метод за получаване на свързани със смола циклични пептидни аналози на паратироидни хормони и аналози на свързани с паратироидните хормони протеини, на база фрагмент, които аналози съдържат поне един мост между страничните вериги на два несъседни аминокиселинни остатъка. По-специално, настоящото изобретение се отнася до метод за твърдофазен синтез на такива циклични пептидни аналози и до използваните пептидни фрагменти.

nW

Предшестващо състояние'на техниката

Цикличните пептидни звена присъстват в голям брой пептиди, притежаващи полезна биологична активност, включващи аналози на паратироидните хормони и свързани с паратироидни хормони аналози на протеина, аналози на вазоактивни пептиди, аналози на холецистокинина, пептиди с туморен некрозисен фактор (TNF), аналози на калцитонина, аналози на соматостатина, модулатори на клетъчната адхезия, аналози на фактора на растежния хормон (GRF), антагонисти на брадикинина, аналози на тирозиновите активиращи мотиви (ТАМ Mimics) и амилинови агонисти. Особен интерес представляват аналозите на цикличния пептиден паратироиден хормон (ЬРТН) и свързаните с паратироиден хормон аналози на протеина (ЬРТНгР).

Човешкият паратироиден хормон (hPTH) е протеин от 84 аминокиселини, който е главен регулатор на калциевата хомеостаза. Протеинът, свързан с паратироидния хормон (ЬРТНгР), представлява протеин от 139 до 171 аминокиселини с хомология по краен азотен атом с човешкия паратироиден хормон (ЬРТН). Фрагментите от човешки паратироиден хормон (ЬРТН) и протеин, свързан с паратироиден хормон (ЬРТНгР), с краен азотен атом, особено тези, състоящи се от аминокиселини 1-34, запазват изцяло биологичната активност на изходните хормони.

Човешкият паратироиден хормон (ЬРТН) (1-34) се състои от следната аминокиселинна последователност: Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gin-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-SerMet-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe.

Протеинът, свързан с паратироиден хормон (ЬРТНгР) (1-34) се състои от следната аминокиселинна последователност:

• · ·· · ··· ·· ···« 9 9 9 · 9 9 99

9 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 9 9 99

Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-FTis-ksp-Lys-Giy-Lys-Ser-Ile-Gln-AspLeu-Arg-Arg-Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Ile-Ala-Glu-Ile-His-Thr-Ala.

Биологичната активност на човешкия паратироиден хормон (hPTH) се изразява в две вторични съобщителни системи: активност на G-протеин, свързан с аденилил циклаза (АС) и активност на G-протеин, свързан и несвързан с протеин киназа С (РКС). Показано е, че фрагментите с краен азотен атом на човешкия паратироиден хормон hPTH(l34)ОН и hPTH(l-31)NH₂ са анаболни по отношение на образуването на костно вещество, съответно, при хората и при плъхове с отрязани яйчници. Показано е, че ускорявенето на растежа на костите е свързано със стимулиране на активността на аденилил циклазата. Аналозите на тези фрагменти с краен азотен атом притежават значителен терапевтичен потенциал за лечение на физиологични състояния, свързани с регулирането на калция в костните клетки, включващи хипокалцемия, остеопороза, остеопения; и нарушения, свързани с остеопороза и остеопения, като хиперпаратироидизъм, хипопаратироидизъм и синдром на Cushings; глюкокортикоид- и имуносупресант-индуцирана остеопения; фрактура на костите и коригиране на фрактура на костите.

Установено е, също така, че премахването на до 6 аминокиселинни остатъка от азотния край на човешкия паратироиден хормон hPTH (1-34) забележимо понижава получената способност на аналога да стимулира аденилил циклазата, показвайки слаб ефект върху рецепторното свързване. Следователно, аналозите на човешкия паратироиден хормон hPTH (1-34), съкратени с до 6 аминокиселинни остатъка от азотния край, понижават действието на паратироидния хормон (РТН) и са ефикасни при лечение на нарушения, характеризиращи се с излишък на паратироиден хормон (РТН), като хиперпаратироидизъм и свързана с хиперпаратироидизъм хиперкалцемия, злокачествена хиперкалцемия, бъбречно увреждане и високо кръвно налягане.

Μ ^Ύ ♦· 9 9 9999

9 9 9 9 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 99

9 9 · 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 99

Ациклени аналози на човешкия паратироиден хормон hPTH (1

27) до (1-34) са описани в USA Patent No. 4,086,196. Ациклени аналози на човешкия паратироиден хормон hPTH (1-34) и на протеина, свързан с паратироидния хормон (hPTHrP) (1-34) са описани в USA Patent No. 5,589,452. [Nle⁸, Nle¹⁸, Tyr³⁴ или Phe³⁴]hPTH(l-34) са описани в USA Patent No. 4,656,250. [Nle⁸, Nle¹⁸, Tyr³⁴]hPTH(l-34) и техни, съкратени при азота производни са описани в USA Patent Nos.4,771,124 и 4,423,037. Други ациклени аналози на паратироидния хормон РТН (134) са описани в USA Patent Nos. 5,723,577 и 5,434,246, WO 97/02834, ЕРА 561 412-Al, ЕРА 747 817-А2, WO 94/02510, WO 96/03437 и WO

95/11988-Al. Аналози на човешкия паратироиден хормон hPTH(l28)ЯН₂до hPTH(l-31)NH₂H [Leu²⁷]hPTH(l-28)NH2ao [Leu²⁷]hPTH(l 33)NH2 са описани в USA Patent No. 5,556,940. Ациклени антагонисти на рецептора на паратироидния хормон РТН, включващи съкратени при крайния азот аналози на паратироидния хормон РТН, са описани в USA Patent Nos. 5,446,130; 5,229,489; 4,771,124 и 4,423,037.

Описани са циклични и бициклични аналози на човешкия паратироиден хормон hPTH и на протеина, свързан с паратироидния хормон (hPTHrP). 4nKjro(Lys²⁶-Asp³⁰)[Leu²⁷]hPTH(l-34)NH2H qHioio(Lys²⁷-Asp³⁰) hPTH(l-34)NH2 са описани в USA Patent No. 5,556,940. H,Hioio(Lys²⁶Asp³⁰)[Leu²⁷]hPTH(l-31)NH2, nHioio(Glu²²-Lys²⁶)[Leu²'⁷]hPTH(l-31)NH2 и цикло (Lys²⁷-Asp³⁰)hPTH(l-31)NH2ca описани от Barbier, et al., J. Med. Chem., 1997, 40, 1373. Моноциклични и бициклични производни на човешкия паратироиден хормон hPTH(l-34) или на протеина, свързан с паратироидния хормон hPTHrP(l-34) са описани в WO 96/40193, DE 19508672-А1 и от A.Bisello, et al., Biochemistry, 1997,36, 3293. Цикло (Lys¹³-Asp¹⁷)hPTHrP(7-34)NH2, силен антагонист на рецептора на паратироидния хормон РТН, е описан от M.Chorev, et al., Biochemistry, 1991, 30, 5698. Също така, Kanmera, et al., описват серии от амид-съдържащи ···· ·« · * · · ·· • · · · · · · ·· _ν · ·· · »····· • · · · · · ·· аналози на протеина, свързан с паратироидния хормон HPTHrP, Peptide

Chemistry, 1993: Okada, Y., ed.; Protein Research Foundation, Osaka,

1994, 321-324.

B WO 98/51324 са описани циклични пептидни съединения с формула I:

X-Aio-An-Ai2-Ai3-Ai4-Ai5-Ai6-Ai7-Ai8“Ai9-A20“A21’A22-A23-A24A25-A26-A27-Y техни фармацевтично приемливи соли и техни прекурсори, в които,

X се подбира от групата, състояща се от (а) Ии-Ао-АгАг-Аз-Ад-АгАб-Ат-Ав-А®-, (б) Ri_a-A2“A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-, (в) Rib-A3-A4-A5-A6-A7-Ag-A9-, (г) Ии-Ад-Аз-Аб-АгАв-А®-, (д) Ria-As-Ae-AT-As-Ag-, (е) И^-Аб-Ат-Ад-Агг, (ж) Rja-Ar-Ae-A®-, (з) Ria-As-A^, (и) Ria-Air, (Й) Ria-;

Y се подбира от групата, състояща се от ® (а)-Яз, (б) -A28-R3» (в) -A28-A29-R3, (г) -A28-A29-A30-R3, (д) -A28-A29-A30-A31-R3, (е) -А28“А29Азо-Аз1 -A32-R3, (Ж) -A28-A29-A30-A31-A32-A33-R3, (3) -A28-A29-A30-A31-A32-A33-A34-R3;

Ria е водород, алкил, аралкил или -COR₂;

Rib e Ria или група с формула

R₂ е алкил, алкенил, алкинил, арил или аралкил;

R₃ е група с формула A₃5-OR4 или A35-NR4R5;

R4 и R₅ независимо един от друг са водород или нисш алкил;

R₆ и R₉ независимо един от друг са водород или алкил;

R₇ е алкил;

Rs е водород, алкил или -COR₂;

R10 е водород или халоген;

Rh е алкил или аралкил;

ш е 1, 2 или 3;

η е 3 или 4;

Ао отсъства или е пептид, състоящ се от 1 до 6 аминокиселинни остатъка;

Al е Ser, Ala, Gly или D-Pro, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

А₂ е Ala, Vai или Gly, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

А₃ е Ala, Ser, Gly или D-Pro или тяхна еквивалентна аминокиселина;

А4 е Glu, Ala или Gly, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

А₅ е lie, His, Ala или Gly, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

Аб е Ala, Gin, Gly или D-Pro, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

А₇ е Ala, Leu, Gly или тяхна еквивалентна аминокиселина;

• ft ·· · · ·· ·· ft ft ft ft · ft · · ft ft ft ft • ft ft ft ft ···· • ft ·· ft ft · ft ft · ft ft·· ft · ft···

А» e Leu, Nle, Gly или D-Pr0‘, иЛи тяхна еквивалентна аминокиселина;

А§ е His, Ala, Gly или D-Pro, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

Аю е Ala, Asn, Asp, Cys, хомо-Cys, Glu, Gly, Lys, Om, Ser, Thr, DPro, -NHCH(CH₂)mNH₂)CO- или -NHCH[(CH₂)_nCO₂H]CO-;

An ^e Ala, Gly, Leu или Lys, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

Ao е Ala или Gly, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

Ab е Ala, Asn, Asp, Cys, хомо-Cys, Glu, Gly, Lys, Om, Ser, Thr, -NHCH(CH₂)_mNH₂)CO- или -NHCH[(CH₂)nCO2H]CO-;

Au e Ala, Asn, Asp, Cys, хомо-Cys, Glu, Gly, His, Lys, Om, Ser, Thr, D-Pro, -NHCH(CH₂)mNH2)CO- или -NHCH[(CH₂)nCO2H]CO-;

Ai5 e Ala, Gly, Leu, He или D-Pro, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

Ale е Asn, Ala, Gly, D-Pro или Gin, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

Ар е Ala, Asn, Asp, Cys, хомо-Cys, Glu, Gly, Lys, Om, Ser, Thr, DPro, -NHCH(CH2)mNH2KJO- или -NHCH[(CH₂)nCO2H]CO-;

Ale e Asp, Cys, хомо-Cys, Glu, His, Leu, Lys, Om, Nle, Ser, Thr, -NHCH(CH2)mNH2)CO- или -NHCH[(CH₂)nCO2H]CO-;

Ai9 e Arg или Glu, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

А20 е Arg или негова еквивалентна аминокиселина;

A₂i е Arg, Asp, Cys, хомо-Cys, Glu, Lys, Om, Ser, Thr, Vai, -NHCH(CH2)niNH2)CO- или -NHCHKO^O^HJCO-;

A22 e Asp, Cys, хомо-Cys, Glu, His, Lys, Om, Phe, Ser, Thr, -NHCH(CH₂)mNH2)CO- или -NHCH[(CH₂)nCO₂H]CO-;

A23 e Leu, Phe или Trp, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

• * I ·· ····

Предпочитано подреждане на пептидните съединения с формула I се състои от последователност на пептидни съединения, в които X се подбира от групата, състояща се от (а) Кщ-Ао-АрАг-Аз-Ад^-Аб-Ау-Ав-Ад-, (б) Ri_a-A₂-A₃-A4-A₅-A₆-A₇-A₈-A9-, (в) Rib-Aj-ArAs-A^-Av-Ag-Ag-, (г) Ria-Af-As-Ae-Ar-As-A^, (д) Ria-As-Afi-Ar-Ag-A^, (е) Ria-As-AT-Ag-As-, (ж) Ria-Ar-Ag-A?-, (з) Ria-Ag-A?-, (и) Ria-Air, (й) RiaS

Y се подбира от групата, състояща се от (а) -R₃, (б) -A28-R3, (в) -A28-A29-R3, (г) -A28-A29-A30-R3, (д) -A28-A29-A30-A31-R3, (е) -A28-A29-A30-A31-A32-R3, (Ж) -А28А29-Азо“Аз1-Аз2-Азз^з, (з) -A28-A29-A30-A31-A32-A33-A34-R3;

Ria е водород, алкил, аралкил или -COR2;

Rib е Ria или група с формула

A₂₄ e Leu или негова еквивалентна аминокиселина;

А₂₅ е Arg, Asp, Cys, хомо-Cys, Glu, His, Lys, Om, D-Pro, Ser, Thr, -NHCHiCH^NH^O- или -NHCH[(CH₂)„CO₂H]CO-;

A₂₆ e Asp, Cys, хомо-Cys, Glu, His, Lys, Om, Ser, Thr, -NHCH(CH₂)mNH₂)CO- или -NHCH[(CH₂)nCO₂H]CO-·,

A₂7 e Leu или Lys, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

А28 е Пе или Leu, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

А₂₉ е Ala, Asp, Cys, хомо-Cys, Glu, Gin, Lys, Om, Ser, Thr, -NHCHCCH^NH^O- или -ННСН[(СН₂)пСО₂Н]СО-;

A30 e Asp, Cys, хомо-Cys, Glu, Gly, Lys, Om, Ser, Thr, -ΝΗΟΗ(ΟΗ₂^ΝΗ₂)ΟΟ- или -NHCH[(CH₂)nCO₂H]CO-;

A31 e He, Leu или Vai, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

А₃₂ е His или негова еквивалентна аминокиселина;

А33 е Asn или Thr, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

А34 е Ala или Phe, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

А35 отсъства или е пептид, съставен от 1 до 4 аминокиселини; и страничните вериги на поне една от следните двойки аминокиселинни остатъци, Аю и А_м, А_п и Ап, А_м и Aj₈, Ап и А_2Ь А_!8 и А₂₂, Α₂ι и А₂₅, А₂₅ и А^ Агб и А30, са свързани през амид, естер, дисулфид или лантиотин до формиране на мост; и страничната верига на всеки от следните аминокиселинни остатъци, Аю, А13, Am, An, Αι₈, Α₂ι, Аи, A^, A₂₆, A₂₉, и A30, спомага, най-вече, за формиране на единичен мост; при условие, че, когато страничните вериги на следните двойки аминокиселинни остатъци, Ай и Ап или Α_Μ и А30, са свързани през амид, дисулфид или лантиотин до формиране на мост, тогава страничните вериги на една от следните двойки аминокиселинни остатъци, Аю и А_м, А_м и Аю, Ап и Α₂ι, Аю и А₂₂, Α₂ι и А₂₅, А₂₅ и А&, също са свързани през амид, естер, дисулфид или лантиотин.

..10..

· t. ϊ. · ι J

R₃ е група с формула A35-OR4 или A35-NR4R5;

R^ и R₉ независимо един от друг са водород или алкил;

R₇ е алкил;

Rs е водород, алкил или -COR₂;

R₁₀ е водород или халоген;

Rn е алкил или аралкил;

Ао отсъства или е пептид, състоящ се от 1 до 6 аминокиселинни

остатъка;

At е Ser, Ala, Gly или D-Pro, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

Ад е Glu, Ala или Gly, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

А₅ е Пе, His, Ala или Gly, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

As е Leu, Nle, Gly или D-Pro, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

А₉ е His, Ala, Gly или D-Pro, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

Аю е Ala, Asn, Gly, Lys, Asp или D- Pro, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

An е Ala, Gly, Leu или Lys, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

··и»., » · ла ·· >’ ·' · '· ’ Й1 :

. _А1 Чк ..·

А₁₂ е Ala или Gly, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

Ab е Ala, Gly или Lys, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

Ай е Ala, Gly, His, Ser, Asp, Lys или D-Pro, или тяхна еквивалент на аминокиселина;

А15 е Ala, Gly, He, Leu, или D-Pro, или тяхна еквивалентна амино киселина;

Ai6 е Asn, Ala, Gly, D-Pro или Gin, или тяхна еквивалентна амино

киселина;

Ар е Ala, Asp, Gly, Lys, Ser или D- Pro, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

Ate е Lys или негова еквивалентна аминокиселина;

Al? е Arg или Glu, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

А₂о е Arg или негова еквивалентна аминокиселина;

A₂i е Arg, Asp, Lys, Vai, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

А₂₂ е Asp, Glu, Lys, От, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

А₂з е Leu, Phe или Тгр, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

А₂₄ е Leu или негова еквивалентна аминокиселина;

A^ е Arg, Asp, Glu, His, Lys или тяхна еквивалентна аминокисели-

на;

А₂₆ е His или Lys, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

А₂₇ е Leu или Lys, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

А^ е Пе или Leu, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

А₂9 е Ala, Asp, Glu или Gin, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

А30 е Asp, Glu или Lys, или тяхна еквивалентна аминокиселина; А₃1 е lie, Leu или Vai, или тяхна еквивалентна аминокиселина;

Аз5 отсъства или е пептид, съставен от 1 до 4 аминокиселини. Горепосочените пептидни съединения са описани в WO 98/51324 като притежаващи полезни свойства, по-специално, фармацевтични свойства. Те са особено ефикасни при лечение на болестни състояния, които могат да се регулират със съединения, които се свързват към рецепторите на паратироидния хорман със или без едновременно стимулиране на активността на аденилил циклазата. Настоящото изобретение се отнася до подобрен метод за синтезиране на тези пептидни съедине-

ния.

Твърдофазният синтез на циклични пептиди обикновено включва последователно прибавяне на аминокиселини към смолата за пептиден синтез до получаване на свързан със смола пептид, притежаващ цялата или част от аминокиселинната последователност на желания цикличен пептид. След това, на траничната верига на аминокиселинните остатъци, която се циклизира, се премахва защитата и се осъществява циклизирането. Ако циклизирането се осъществява преди завършване на цялата аминокиселинна последователност, се прибавят останалите аминокиселини и полученият пептид след това се отцепва от смолата и се пре

чиства.

Линейният начин за получаване на пептиди и, най-общо, на циклични пептиди, обаче, често не е ефикасен и, следователно, не може да бъде ефективен при получаване на големи количества пептид. В случаите, когато пептидът се получава в линейна форма, пептидът се пречиства по-трудно, тъй като броят на аминокиселинните остатъци в пептида се повишава. Още повече, при цикличните пептиди, получаването на мостове от странични вериги в края на синтеза създава проблеми, свързани с получаване на моста от странични вериги, включващи нисък добив, странични реакции и отделяне на примеси от пептида. Следовател-

• ft ft

но, въвеждането на циклично звено по дължината на пептида повишава трудностите при синтеза на линеен пептид. Промишлено приложимият синтез на циклични аналози на човешки пептиден паратироиден хормон (hPTH), като тези, описани в WO 98/51324, цитиран по-горе, изисква синтетичен метод, при който да се преодолеят сложните фактори спрямо линейните и циклични компоненти и, който да осигури получаването на промишлено ефективни количества в контекста на производството на лекарства. Настоящото изобретение се отнася до по-ефективно получаване на аналози на цикличния човешки пептиден паратироиден хормон (hPTH) и на протеина, свързан с паратироидния хормон (hPTHrP) по метод, използващ фрагменти със и без мостове.

Настоящото изобретение се отнася до метод за получаване на аналози на цикличния човешки пептиден паратироиден хормон (hPTH) и на протеина, свързан с паратироидния хормон (ЬРТНгР) с формула

в която

J, L и М са линейни пептидни фрагменти;

Κι отсъства или е цикличен пептиден фермент, и

К₂ е цикличен пептиден фермент, като този метод се състои от следните етапи:

(1) получаване на М - ® чрез последователно закачане на подходящо защитени аминокиселинни остатъци към смола до получаване на •I •♦14 ·· 9 · ···· ···· ·· ·· ···· • · · 9 9 9 ♦ ·· • · 9 9 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 99

9999 999 999 9999

Μ - ®III където ® е подходяща за пептидния синтез смола и М е полипептиден фрагмент, (2) отделно получаване, посредством конвенционален пептиден синтез, на цикличен полипептиден фрагмент със защитен краен азотен атом с формула IV

PHN-K₂-CO₂H IV където Р е подходяща група, защитаваща амина, (3) свързване на III с IV до получаване на пептид с формула V

PHN-K₂-M-® V (4) ако К₂ отсъства, тогава (а) полипептидните фрагменти J и L се получават като единичен полипептид с формула VI

PHN-J-L-CO₂H

VI

и полипептид VI се свързва с пептид V до получаване на пептид с формула VII

PHN - J-L - К₂-Μ - ® VII или, възможно е, (б) защитените индивидуални аминокиселинни елементи на полипептидите J и L последователно да се прибавят към пептидния фрагмент с формула V, ·· ·· • · ·9 • · ·· • · ·· • · ·· ··

..15..

• · 9 · · • · · • · · или, възможно е, (в) поотделно или и двата’J и L да се получат независимо като полипептидни фрагменти и да се свържат с растящия пептид, започващ с фрагмент с формула V, (5) когато присъства цикличен пептид К_ь тогава (а) полипептидният фрагмент с формула VIII

PHN-Kj-CCbH

VIII в която Р е подходяща група, защитаваща амина, се получава отделно посредством конвенционални пептидни синтетични методи, (б) получава се пептиден фрагмент с формула IX phn-l-co₂h

IX и се свързва с пептиден фрагмент V до получаване на пептиден фрагмент с формула X

PHN-L-K₂-M-® и (в) цикличният пептиден фрагмент VIII се свързва с пептиден фрагмент с формула X до получаване на пептиден фрагмент с формула XI

PHN-K1-L-K₂-M-® (г) получава се пептиден фрагмент с формула XII

PHN-J-CO₂H

XII

XI ·· ·· • ·· • ·· • ·· ·· • »16 е* • · · · • * · • · · който се свързва с пептиден фрагмент с формула XI, и (6) отцепване на смолата и премахване на защитата.

При описания в настоящото изобретение метод цикличните пеп

тидни фрагменти се получават поотделно за свързване със смола или със свързан със смола пептид. Отделното получаване на цикличните пептидни фрагменти позволява конвергентен синтез на свързани със смола циклични пептиди, което води до повишаване на добива и производителността на получените циклични пептиди. Трудностите, свързани с получаването на мостов фрагмент, се ограничават до получаване на по-малко пептидно звено, което може да бъде пречистено преди свързването със смолата в твърда фаза. Практиката на този метод за получаване на предпочитани аналози на цикличния човешки пептиден паратироиден хормон (hPTH) и на протеина, свързан с паратироидния хормон (ЬРТНгР) изисква синтез на нови пептидни фрагменти и нови последователности.

Подробно описание на изобретението

Използваните по-горе и в описанието термини, ако не е споменато друго, имат следните значения.

Дефиниране на термините “Алкил” означава алифатна въглеводородна група, която може да бъде с права или разклонена верига, имаща от около 1 до около 20 въглеродни атома във веригата. Разклонен означава, че една или повече нисши алкилови групи са закачени към линейна алкилова верига. “Нисш алкил” означава от около 1 до около 4 въглеродни атома във веригата, която може да бъде права или разклонена. Примерни алкилови групи са метил, етил, п- и iso-пропил, η-, sec-, iso- и tert-бутил и други.

··

··!/·· · · ·· ···· ·· ······ • · · · ····· • · · · · ······ • · · · ····· ·· ···· ··· ··· ·· ·· “Алкенил” означава алифатна въглеводородна група, съдържаща въглерод-въглеродна двойна връзка и, която може да бъде с права или разклонена верига, имаща от около 2 до около 20 въглеродни атома във веригата. “Нисш алкенил” означава от около 2 до около 4 въглеродни атома във веригата, която може да бъде права или разклонена. Примерни алкилови групи са етенил, пропенил, п-бутенил, i-бутенил, 3-метилбут-2-енил, n-пентенил, хептенил, октенил, циклохексилбутенил и деценил.

“Алкинил” означава алифатна въглеводородна група, съдържаща въглерод-въглеродна тройна връзка и, която може да бъде с права или разклонена верига, имаща от около 2 до около 20 въглеродни атома във веригата. “Нисш алкинил” означава от около 2 до около 4 въглеродни атома във веригата, която може да бъде права или разклонена. Примерни алкилови групи са етинил, пропинил, п-бутинил, З-метилбут-2-инил, n-пентинил, хептинил, октинил и децинил.

“Алкилен” означава двувалентна група, получена от наситен въглеводород с права или разклонена верига чрез отделяне на два водородни атома, например метилен, 1,2-етилен, 1,1-етилен, 1,3-пропилен, 2,2диметилпропилен и други.

“Фенилалкил” означава фенилова група, свързана с част от изходната молекула посредством алкиленова група. Предпочита се, алкиленовата група да има от 1 до 7 въглеродни атома. Примерните фенилалкилови групи включват бензил, 2-фенилетил, 2-пропилфенил и други.

“Група, защитаваща аминогрупата” означава лесно отделяща се група, известна на специалистите в областта за защитаване на аминогрупата от нежелани взаимодействия през време на синтетичните методи и, която може да се отделя селективно. Използването на група, която защитава аминогрупата, е известно на специалистите в областта за защитаване на аминогрупата от нежелани взаимодействия през време на

•·18 ·· · ·«· ·· • · · · ·· · · · · • · · · ····· • · ·· · ···*·· • · · · ····· ·· ···· *·« ·»··· ·· синтетичните методи и са известни много такива защитаващи групи, cf, например, T.W.Green, P.G.M.Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis, 2 edition, John Wiley & Sons, New York, 1991, даден за сравнение. Предпочитани групи, които защитават аминогрупата са ацил, включващ формил, ацетил, хлорацетил, трихлорацетил, о-нитрофенилацетил, о-нитрофеноксиацетил, трифлуорацетил, ацетоацетил, 4-хлорбутирил, изобутирил, о-нитросинамоил, пиколиноил, ацилизотиоцианат, аминокапроил, бензоил и др. и ацилокси, включващ метоксикарбонил, 9-флуоренилметоксикарбонил, 2,2,2-трифлуоретоксикарбонил, 2триметилсилилетоксикарбонил, винилоксикарбонил, алилоксикарбонил, t-бутилоксикарбонил (ВОС), 1,1-диметилпропинилоксикарбонил, бензилоксикарбонил (CBZ), р-нитрофенилсулфинил, р-нитробензилоксикарбонил, 2,4-дихлорбензилоксикарбонил, алилоксикарбонил (Alloc) идр.

“Аминокиселина” означава аминокиселина, подбрана от групата, съдържаща природни и неприродни аминокиселини. Аминокиселините могат да бъдат неутрални, положителни или отрицателни в зависимост от заместителите в страничната верига. “Неутрална аминокиселина” означава аминокиселина, включваща заместители в страничната верига без заряд. Примерните неутрални аминокиселини включват аланин, валии, леуцин, изолеуцин, пролин, фенилаланин, триптофан, метионин, глицин, серин, треонин и цистеин. “Положителна аминокиселина” означава аминокиселина, включваща заместители в страничната верига с положителен заряд при физиологично pH. Примерните положителни аминокиселини включват лизин, аргинин и хистидин. “Отрицателна аминокиселина” означава аминокиселина, включваща заместители в страничната верига с отрицателен заряд при физиологично pH. Примерните отрицателни аминокиселини включват аспартинова киселина и глутаминова киселина. Предпочитаните аминокиселини са а-аминоки-

.49.. • · · · • ft ·	ft • · ft	ft • ft ft	ft· ft ft · ft ft ft
ft · · •ft ft···	ft ···	ft ft · ft	ft ft ft • ft

селяните. Най-предпочитаните аминокиселини са α-аминокиселините с L-стереохимия при α-въглеродния атом.

“Аминокиселинен остатък” означава отделни аминокиселинни звена, въведени в пептид или пептиден фрагмент.

“Природна аминокиселина” означава α-аминокиселина, подбрана от групата, състояща се от аланин, валии, леуцин, изолеуцин, пролин, фенилаланин, триптофан, метионин, глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин, глутамин, лизин, аргинин, хистидин, аспартинова киселина и глутаминова киселина.

“Неприродна аминокиселина” означава аминокиселина, при която няма кодон (триплет от нуклеотиди). Примерите за неприродни аминокиселини включват, например, D-изомерите на природните а-аминокиселини, както е посочено по-горе; Aib (аминобутирова киселина), bAib (3-аминоизобутирова киселина), Nva (норвалин), β-Ala, Aad (2аминоадипинова киселина), bAad (3-аминоадипинова киселина), Abu (2-аминобутирова киселина), Gaba (γ-аминобутирова киселина), Аср (6аминокапроилова киселина), Dbu (2,4-диаминобутирова киселина), ааминопимелинова киселина, TMSA (триметилсилил-Ala), alle (allo-изолеуцин), Nle (норлеуцин), tert-Leu, Cit (цитрулин), Om, Dpm (2,2’-диаминопимелинова киселина), Dpr (2,3-диаминопропионова киселина), а- или β- Nal, Cha (циклохексил-Ala), хидроксипролин, Sar (саркозин) и други; циклични аминокиселини; Ν-α-алкилирани аминокиселини, като MeGly (Ν-α-метилглицин), EtGly (Ν-α-етилглицин), EtAsn (Ν-α-етиласпарагин); и аминокиселини, при които от α-въглеродния атом излизат два заместителя на страничната верига.

“Еквивалентна аминокиселина” означава аминокиселина, която може да бъде заменена от друга аминокиселина в пептидите, съгласно настоящото изобретение, без да губи функциите си. При такава замяна, •20 ♦ 4 · 444 ·· • 4 4 4 44 ······ ·· 4 4 4 4 4 44

4 44 4 444444

444 4 44444

4444 444 444 44 44 заместването на аминокиселините се извършва на базата на относителна подобност на заместителите в страничната верига по отношение, например, на размер, заряд, хидрофилност, водолечебни свойства и хидрофобност.

Както е описано в USA Patent No. 4,554,101, даден за сравнение, аминокиселинните остатъци имат следните стойности на хидрофилност: Arg (+3.0); Lys (+3.0); Asp (+3.0); Glu (+3.0); Ser (+0.3); Asn (+0.2); Gin (+0.2); Gly (0); Pro (-0.5); Thr (-0.4); Ala (-0.5); His (-0.5); Cys (-1.0), Met (-1.3); Vai (-1.5); Leu (-1.8); He (-1.8); Tyr (-2.3); Phe (-2.5) и Trp (-3.4). Ясно е, че аминокиселинният остатък може да бъде заместен с друг, притежаващ подобна стойност на хидрофилност (например, стойност от плюс или минус 2.0) и така да се получи биологично еквивалентен полипептид.

По същия начин, заместване може да се извърши на база на подобието на индекса на водолечебни свойства. Всеки аминокиселинен остатък притежава индекс на водолечебни свойства на база на неговата хидрофилност и зарядни характеристики. Тези стойности на индекса на водолечебни свойства са: lie (+4.5); Vai (+4.2); Leu (+3.8); Phe (+2.8); Cys (+2.5), Met (+1.9); Ala (+1.8); Gly (-0.4); Thr (-0.7); Ser (-0.8); Trp (-0.9); Tyr (-1.3); Pro (-1.6); His (-3.2); Glu (-3.5); Gin (-3.5); Asp (-3.5); Asn (-3.5); Lys (-3.9) и Arg (-4.5). При извършване на заместването на база индекса на водолечебни свойства се предпочитат стойности от плюс или минус 2.0.

“Пептид и полипептид” означават полимер, в който мономерите са аминокиселинни остатъци, свързани през амидни връзки. Предпочитани пептиди, съгласно настоящото изобретение, са тези, съдържащи ааминокиселини. Най-предпочитани пептиди, съгласно настоящото изобретение, включват α-аминокиселини с L-стереохимия при а-въглерод ния атом.

•421 ·· • · · · • · ·	• ·· •	• ·· •	·· • · · • · ·
• · · ·· ····	• ···	• • ··	• · · ··

“Цикличен пептид” означава пептид, съдържащ един или повече циклични пептидни фрагменти, дефинирани по-долу.

“Пептиден фрагмент” означава пептидно подзвено от изходния пептид. “Пептиден фрагмент” може да включва линейно, разклонено или циклично подзвено от пептида.

“Линеен пептид” означава пептид или полипептид, където аминокиселините се свързват една с друга през амидна връзка между краен азотен атом на единия и краен въглероден атом на другия.

“Разклонен пептид” означава пептид или полипептид, където от една или няколко съставни отделни аминокиселини се получават странични вериги от карбонова киселина или амин, които са свързани с друг пептиден заместител през тези странични вериги.

“Цикличен пептиден фрагмент” означава пептиден фрагмент, както е дефиниран по-горе, в който заместител при един аминокиселинен остатък се свързва със заместител при друг аминокиселинен остатък в пептидния фрагмент. Предпочита се свързване между страничните вериги на два аминокиселинни остатъка в пептидния фрагмент, за предпочитане, през естер, амид, дисулфид или лантионин. В настоящото изобретение, свързването между страничните вериги на две аминокиселини е означено като | |.

Естер, амид, дисулфид или лантионин, които свързват два аминокиселинни остатъка от цикличния пептид се формират между функционалностите на страничните вериги. Следователно, амид се образува между карбоксилна група в страничната верига на киселинен аминокиселинен остатък и аминогрупа в страничната верига на основен аминокиселинен остатък; естер се образува между карбоксилна група в страничната верига на киселинен аминокиселинен остатък и хидроксилна

• · · ·· · • · · ·· ···· ··· ··· ···· • · ·· • · ·· • · ·· • · ·· ···· група в страничната верига на хидроксилсъдържащ аминокиселинен остатък; дисулфиди се образуват от аминокиселинни остатъци, съдър жащи сулфхидрилни групи в страничната верига; лантиониови мостове се образуват при десулфуризация на съответния дисулфид.

Броят на атомите на моста, формиран от естер, амид, дисулфид или лантионин, получени, както е описано по-горе, се изменя в зависимост от дължината на страничната верига и вида на връзката (т.е. естер, амид, дисулфид или лантионин). Предпочита се, мостът да включва от 2 до 12 атома, още повече се предпочита, от 6 до 10 атома. Най-предпочитаният брой атоми в моста е 7, предпочита се, този мост да включва амидна връзка между функционалностите на страничните вериги на Lys и Asp остатъците.

“Смола” означава твърд носител, който е модифициран с реакционоспособна група, така че твърдият носител да може да се свързва с крайни карбоксилни групи или краен азот на аминокиселинен, пептиден или цикличен пептиден фрагмент, както са описани по-горе. Примерните смоли включват смола на Merrifield (хлорметилиран полистирен), хидроксиметилова смола, 2-хлортритилхлоридна смола, тритилхлоридна смола, кисела смола на Rink (4-хидроксиметилбензилокси-2’, 4’-диметоксибензхидролна смола), тритилалкохолна смола, РАМ смола (4-хидроксиметилфенилацетамидометилова смола), смола на Wang (смола на р-бензилоксибензиловия алкохол), МВНА смола (р-метилбензхидриламинна смола), ВНА смола (бензхидриламинна смола), амидна смола на Rink (4-(2’,4’-диметоксифенил-Ртос-аминометил)фенокси смола) и PAL смола (5-(4-Ртос-аминометил-3,5-диметоксифенокси)валерианова киселина-МВНА). Предпочитаните смоли са хлортритилова смола, кисела смола на Rink и амидна смола на Rink.

“Твърд носител” означава субстрат, който е инертен спрямо опи саните реагенти и реакционни условия, както и, е значително неразтво-

··· · · · · · · рим в използваната среда. Приме^нйТб твърди носители‘включва! неорганични вещества като кизелгур, силикагел и стъкло с контролилани пори; органични полимери, включващи полистирен, включващ 1-2% съполимер на полистирен и дивинилбензен (под формата на гел) и 2040% съполимер на полистирен и дивинилбензен (под макропореста форма), полипропилен, полиетиленгликол, полиакриламид, целулоза и други; композитни неорганични/полимерни състави, като полиакриламид, напълнен в матрица от частици на кизелгур. Виж J.M.Stewart, J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2 Ed., Pierce Chemical Co. (Chicago, IL, 1984).

Още повече, “твърд носител” включва твърд носител, както е описан по-горе, който е фиксиран към втори инертен носител, описан в Technical Manual, MultipinTM SPOC, Chiron Technologies (1995) и включената там литература, който включва способен да се отдели полиетилен или полипропилен, присаден върху аминофункционализиран метакрилатен съполимер и инертна ос.

Още повече, “твърд носител” включва полимерни пълнители като полиетиленгликол, описан от Janda et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 92, 6419-6423 (1995) и S.Brenner, WO 95/16918, които са разтворими в много разтворители, но могат да се утаяват при прибавяне на утаител.

Наименованията на природните и неприродните аминокиселини и техни остатъци, които са използвани в настоящото изобретение, следват номенклатурата на IUPAC Commission on the Nomenclature of Organic Chemistry и IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature дадени в “Nomenclature of α-Amino Acids (Recommendations, 1974)” Biochemistry, 14(2), (1975). Тъй като наименованията и съкращенията на аминокиселините и техните остатъци, използвани в настоящото описание и приложените патентни претенции се • · · · • · ·· • · ·· • · · ·· • · ·· • ···_·_ • · · ·

V · · · · • · · • · · различават от споменатите, разлрМайШщте се наименования и съкращения ще бъдат изяснени.

Показан е примерен пептид, получен по метода съгласно настоящото изобретение, например, HH^oCLys^-Asp^fAla^Nle^Lys^Asp²², Leu²⁷]hPTH(l-31)NH₂ със свързани аминокиселинни остатъци в малките скоби след “цикло” и със заместени аминокиселини от естествената последователност, поставени в средните скоби. hPTH се отнася за човешки пептиден паратироиден хормон (hPTH) и ЬРТНгР се отнася за човешки, свързани с паратироиден хормон аналози на протеина (ЬРТНгР). Броят във вторите малки скоби се отнася до брой аминокиселинни остатъци в пептида, започващи от крайния азотен атом (т.е. първите 31 аминокиселини в човешкия пептиден паратироиден хормон (hPTH).

Предпочитани аспекти

Както е показано на Схема I, получаването на свързан със смола цикличен пептид включва свързване на циклични и нециклични пептидни фрагменти към смола, свързана със смола аминокиселина или свързан със смола пептид.

Схема I

Стандартен метод

Премахване на защитата на свързване на крайния N атом

Т-®------------> PHN-E-T-®---------------> PHN-Q-HN-E-T-®

PHN-Е-СОг PHN-Q-CO₂H при краен азотен атом.

® е смола, подходяща за пептиден синтез.

Т е аминогрупа или аминокиселина, или цикличен или нецикличен пептид.

Е и Q независимо един от друг са аминокиселина, защитена при краен азотен атом или цикличен или нецикличен пептиден фрагмент, защитен

• ·

Предпочита се, свързването* йа се осъществи между крайна карбо ксилна група на пептидния фрагмент и смола, свързана със смола ами нокиселина или свързан със смола пептид. Когато пептидният фрагмент е свързан със свързана със смола аминокиселина или пептид, предпочита се, свързването да се извърши през амидна връзка между крайната карбоксилна група на цикличния пептиден фрагмент и крайния азотен

атом на свързаната със смола аминокиселина или пептид.

За да протече реакция на свързване, карбоксилната група на пептидния фрагмент трябва да се активира. За метода съгласно настоящото изобретение могат да се използват редица методи на активиране, които

включват, например, предварително получени симетрични анхидриди (PSA), предварително получени смесени анхидриди (РМА), киселинни хлориди, активни естери и in situ активиране на карбонова киселина, дадено в Fields and Noble, 1990, “Solid phase peptide synthesis utilizing 9fluorenylmethoxycarbonyl amino acids”, Int.J.Pept.Protein Res., 35:161-214.

Примерните активиращи агенти включват изопропилхлорформиат, диизопропилкарбодиимид (DIC), диизопропилкарбодиимид (DIC) смесен с 1-хидроксибензо-триазол (НОВТ), 1-(3-диметиламинопропил)3-етилкарбодиимид (EDC), Ь1з(2-оксо-3-оксазолидинил)фосфониев хлорид (ВОР-С1), бензотриазол-1-илокси4п8((диметиламино)фосфониев) хексафлуорфосфат (ВОР), бензотриазол-1-илокси-Н18-пиролидино-фосфониев хексафлуорфосфат (РуВОР), бром-Шв-пиролидино-фосфониев хексафлуорфосфат (PyBROP), О-(7-азабензотриазол-1-ил)-Н,Н,Ν’,Ν’тетраметилурониев хексафлуорфосфат (HATU), 2-(1Н-бензотриазол-1ил)-1.1.3.3- тетраметилурониев тетрафлуорборат (TBTU), 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1.1.3.3- тетраметилурониев хексафлуорфосфат (HBTU), 2[2-oKco-l -(2Н)-пиридил]-1,1,3,3-биспентаметиленурониев тетрафлуорборат (TOPPipU), Ν,Ν’-дициклохексилкарбодиимид (DCC), Ν,Ν’-дициклохексилкарбодиимид (DCC) смесен с 1-хидроксибензотриазол (НОВТ)

.,26_>е ......

···· ·· · · · · · · • · · · · · · · · • · · · · ······ ··· · · ···· и други. Подходящите разтворители’за’реакцията на* свързване включват дихлорметан, диметилформамид, диметилсулфоксид, толуен, тетрахидрофуран и други. Времето за свързване варира от около 1 до около 48 часа в зависимост от смолата и производното на карбоновата киселина, които ще се свързват, активиращия агент, разтворителя и температурата. Свързването се осъществява при от около -10°С до около 50°С, за предпочитане, при стайна температура.

За да се избегне протичането на гореописаната реакция на свързване в нежелана посока, крайният азотен атом на цикличната пептидна фракция се защитава с група, чувствителна по отношение на киселина или база. Такива защитаващи групи трябва да бъдат стабилни към условията на формиране на амидна връзка, а от друга страна, да могат лесно да се отделят без разрушаване на растящата пептидна верига или рацемизация на някой от хиралните центрове. Подходящи защитаващи групи са 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc), t-бутилоксикарбонил (ВОС), бензилоксикарбонил (CBZ), бифенилизопропилоксикарбонил, tамилоксикарбонил, изоборнилоксикарбонил, (а.а)диметил-3,5-диметоксибензилоксикарбонил, о-нитрофенилсулфенил, 2-циано4-бутилоксикарбонил и други. Предпочитана група е 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc).

Може да е необходимо да бъдат защитени и други реактивоспособни странични функционални групи в цикличния пептиден фрагмент. Особено предпочитани защитаващи групи на страничната верига са, за странични аминогрупи в лизин и аргинин: 2,2,5,7,8-пентаметилхроман6-сулфонил (ртс), нитро, р-толуенсулфонил, 4-метоксибензенсулфонил, бензилоксикарбонил (CBZ), t-бутилоксикарбонил (ВОС), Alloc (алилоксикарбонил) и адамантилоксикарбонил; в тирозин: бензил, о-бромбензилоксикарбонил, 2,6-дихлорбензил, изопропил, t-бутил (t-Bu), циклохексил, циклопентил и ацетил (Ас); в серин: t-бутил (t-Bu), бензил и тет27.

9 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 · · ·· рахидропиранил; в хистидин: трития* бензил, бензилоксикарбонил (CBZ), р-толуенсулфонил и 2,4-динитрофенил; в триптофан: формил и t-бутилоксикарбонил (ВОС); в аспарагин и глутамин: тритил (Trt); в аспартинова киселина и глутаминова киселина: O-t-бутил и О-алил и Обензил.

Свързването на фрагментите със смолата или със свързания със смола пептид, за предпочитане, се провежда при около стайна температура при използване на около 2 моларни еквивалента (по отношение на смолата) цикличен пептиден фрагмент, защитен с 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc), активиран с около еквимоларна порция бензотриазолилокси4пз[пиролидино]фосфониев хексафлуорацетат (РуВОР) и хидроксибензотриазол хидрат в присъствие на около 4 еквивалента диизопропилетил амин в диметилформамид в продължение на около 16-48

часа.

Завършването на реакцията на свързване трябва да може да се прецени. Специалистите в областта прилагат тестове за контролиране с нинхидрин (тест на Keiser), пикринова киселина, 2,4,6-тринитробензенсулфонова киселина (TNBS), флуоресамин и хлоранил, които се базират на взаимодействие на реагента със свободни аминогрупи до получаване на хромофорно съединение. Ако се използват иминокиселини (например, Pro и Нур), предпочитан метод е контролиране с изатин. Fields and Noble, supra. Краят на реакцията се контролира количествено, например, както е описано от Salisbury et al. (International Patent Publication No. WO 91/03485).

При синтеза c 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc) се предпочитат тестовете на Keiser и с 2,4,6-тринитробензенсулфонова киселина (TNBS). При теста на Keiser, проба от свързания със смола пептид може да се тества с нинхидрин, доставен от Pierce Chemical, по метод, описан от Sarin et al. (1981, Anal.Biochem. 117:147-157). По същия начин, проба

• · · · · V·· ·· от свързания със смола пептид дц*с₽ тфтв’4 црр ф^юЬзване на ··· · ····· ·· ···· ··· ····· ·· тринитробензенсулфонова киселина (TNBS), доставена от Fluka по метод, описан от Takajashi (1984, Chem.Lett. 1:127).

Ако реакцията на свързване не е завършила според резултатите от някой от горепосочените тестове, тя може да бъде накарана да завърши по метод, известен на специалистите, включващ (а) повторна реакция на свързване при използване на от един до пет-кратен излишък на за-

щитена аминокиселина, (б) повторна реакция на свързване при използване на различни или допълнителни разтворители (например, трифлуоретан), или (в) прибавяне на хаотропни соли, например, натриев перхлорат или литиев бромид (Klis and Stewart, 1990, “Peptides: Chemistry, Structure and Biology”, Rivier and Marshall, eds., ESCOM Publ., p.904906).

Предпочитаният цикличен пептиден фрагмент, свързан със смола има формула II

P-A-Ai8”Ai9-A20“A2i-A22“B-C-D-® II където w е смола;

Р е защитаваща амина група;

I I

А отсъства или е група с формула -А1з-А₁₄-А₁₅-А_1б-А₁₇В е група с формула

С е група с формула

De където

-А23-А24-А25-А26-А27-А28-А29-А30-; и

-А31-А32-А33-А34-;

| | е мост от лактам, естер, дисулфид или лантионин; А_п, А₁₇,

Ale и А₂2 са аминокиселинни остатъци; А_м е His (Trt) или Ser (tBu); А15 и

A28 независимо един от друг са lie или Leu; Ser (tBu) или Leu; А₁₆ е Asn

• · (Trt) или Gin (Tri); A_i9 e Arg (Ршс)*йлй tilu A₂₀’e Arg (Pmc); A₂i e

Arg (Pmc) или Vai; A23 e Phe (Pmc) или His (Trt); А₂₆ и А_зо са аминокиселинни остатъци, в които страничните вериги на А^ и А₃₀ са възможно свързани през амид, дисулфид или лантионин; А₂₇е Leu или Lys (Вос); А₂₉ е Ala или Gin (Trt); А₃₁ е Пе или Vai; А₃₂ е His (Trt); А₃₃ е Asn (Trt) или

Thr (tBu); и Ам е Ala или Phe.

Друг предпочитан цикличен пептиден фрагмент, свързан със смола има формула II, в която | | е лактамов мост и страничните вериги на Ам и А₃₀ са възможно свързани през амидна връзка.

Друг предпочитан цикличен пептиден фрагмент, свързан със смола има формула II, в която | | е лактамов мост; А₁₃ и Αι₈ са Lys; Ар и А₂₂ са Asp; А^ е Lys (Вос) Ai₈; и А_зо е Asp (OtBu); или страничните вериги на А^ и А₃₀ са възможно свързани през амидна връзка.

Друг предпочитан цикличен пептиден фрагмент, свързан със смола има формула III • I I

Fmoc-Ai8-Ai₉-A₂o-A₂i-A₂₂-A₂₃-A₂4-A₂5-A₂6-A₂7-A₂₈-A₂₉-A₃o-A₃i-® III в която | | е лактамов мост;

А18 е Lys; А₁₉ е Glu (OtBu); А₂₀ е Arg (Pmc); А₂₁ е Vai; А₂₂ е Asp; А^ е Тгр (Вос); А₂4 е Leu; А25 е Arg (Pmc); А26 е Lys (Вос); А27 е Leu; && е Leu; А₂₉ е Gin (Trt); А₃₀ е Asp (OtBu); и A_3i е Vai.

Свързаният със смола пептид, получен, както е описано по-горе, може след това да бъде разработен, например, чрез свързване с един ···· ·· ·* · · ·· · · · · · · ·· • · ·· · ··>··♦

9 9 9 9 9 9 99 или повече допълнителни цикли^ни*пептидни*ф*рагментй, чрез свързване с един или повече пептидни фрагменти, чрез последователно добавяне на отделни аминокиселини, или чрез комбинация от горните.

Крайният цикличен пептид след това се отцепва от смолата и се пречиства. Защитаващите групи могат да бъдат отделени преди, след или едновременно с отцепването от смолата. Пептидът, на който изцяло е премахната защитата може да бъде пречистен, самостоятелно или в комбинация посредством екстракция с киселина-основа, прекристализация, лиофилизиране, последователно хроматографиране, прилагайки различни типове хроматография: йонообменна върху слабо базична смола под формата на ацетат; хидрофобна адсорбционна хроматография върху полистирен-дивинилбензен (например, AMBERLITE® XAD); адсорбционна хроматография над силикагел; йонообменна хроматография над карбоксиметилцелулоза; разделителна хроматография, например, над SEPHADEX® G-25, LH-20 или противотоково разпределение; високоефективна течна хроматография (HPLC), по-специално, високоефективна течна хроматография с обръщане на фазите над пакет колони с октил- или октадецилсилил-силициев двуокис.

Получаване на пептидния фрагмент

Фрагментът се получава при синтезиране на пептидния скелет, който влече след себе си съвкупност от аминокиселини, изграждащи фрагмента в характерен ред. Пептидният скелет на фрагмента може да бъде синтезиран по кой да е от известните на специалистите методи. За пептиден синтез в твърда фаза, кратко описание на редица методи може да се намери в J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W.H.Freeman Co. (San Francisco), 1963 и J.Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, vol.2, p.46, Academic Press (New York), 1973. Класическият синтез в разтвор е описан в Ό.Schroder and’K.L’upke, The

Peptides, vol.l, Academic Press (New York), 1965.

Както е известно на специалистите, методът за пептиден синтез върху твърд носител обкновено включва изграждане на пептида от карбоксилна група или краен въглероден атом, където крайният въглероден атом на аминокиселината с нейна α-защитена аминогрупа се свързва с твърдофазен полимер. След това N-защитаващата група се отцепва и следващата аминокиселина, също N-защитена, се свързва с пептидна връзка към α-аминогрупата на аминокиселината, свързана с твърдия носител, както е описано по-горе. Цикълът на премахване на защитата на аминокиселината и свързване на следваща аминокиселина се повтаря до изграждане на пептида. Реактивоспособните странични вериги на аминокиселините са защитени с химични групи, които издържат на свързване и премахване на ^-защитата, но могат да се отделят в края на синтеза. Когато пептидният фрагмент се получава посредством методи в твърда фаза, фрагментът е такъв, че може да се използва за свързване с други фрагменти при отцепване от смолата.

Цикличен фрагмент се получава по същия начин. Формирането на скелета, обаче, се следва от (1) селективно премахване на защитата на функционалностите на страничната верига, които ще се циклизират, (2) циклизиране и (3) отделяне на оставащите защитаващи групи.

Една стратегия на пептидния синтез е използването на Fmoc аминокиселини. Вос (t-бутилоксикарбонил-защитена аминогрупа) стратегията може също да бъде използвана за получаване на пептид, свързан с твърд носител (например, Geysen et al., 1987, J. Immunol. Methods, 102: 259-274).

Аминокиселините, използвани в пептидния синтез, могат да бъдат страндартни Вос (№-аминозащитени ^4-бутилоксикарбонил)ами-

нокиселини, описани от Merrifield* (1963, J.Xm.Chem’Soc* *85:2149-2154) или лабилни на база №-аминозащитени 9-флуоренилметоксикарбонил (Fmoc) аминокиселини, описани най-напред от Carpino и Нап (1972, J. Org.Chem. 37:3403-3409). И Fmoc, и Вос ЪГ-аминозащитените аминокиселини могат да бъдат доставени от Fluka, Bachem, Advanced Chemtech, Sigma, Cambridge Research Biochemical, Bachem, или Peninsula Labs, или други химически компании за производство. Още повече, методът, съгласно настоящото изобретение, може да бъде използван с други ^-защитаващи групи, известни на специалистите. Твърдофазният пептиден синтез може да се осъществи по известен на специалистите метод, например, описан в Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Second Edition, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Fields и Noble, 1990, Int.J.Pept. Protein Res.35:161-214, или в автоматични синтезатори, като тези, продавани от ABS.

Въпреки че синтезът на пептиди с крайни азотни атоми от такива с крайни въглеродни атоми е стандартен, на специалистите в областта е ясно, че пептидният фрагмент е лесно податлив на синтез на фрагмент с крайни въглеродни атоми от такъв с крайни азотни атоми.

Получаване на лактамовия мост

Цикличните пептидни фрагменти, свързани с лактамов мост се получават посредством формиране на амидна връзка между карбоксилната група на страничната верига на киселинния аминокиселинен остатък и аминогрупата на страничната верига на базичния аминокиселинен остатък в присъствие на активиращ агент, както е описано по-горе. Предпочитаните киселинни аминокиселинни остатъци включват Asp, Glu, -NHCH[(CH₂)₃CO₂H]CO- и -NHCH[(CH₂)₄CO₂H]CO-. Най-много се предпочита Asp. Предпочитаните базични аминокиселинни остатъци

включват His, Lys, Om, -ИНСН(СП₂Ж)СС/-и^,-^:ПНСИ[(ГН₂)₂ЯН₂]СО-, като най-много се предпочита Lys.

В случаите, когато пептидният прекурсор на цикличния пептиден фрагмент съдържа повече от един киселинен или базичен аминокиселинен остатък, защитаващите групи за присъединителните киселинни или базични аминокиселини в цикличния пептиден фрагмент се подбират така, че на аминокиселините, които ще се циклизират, селективно да може да им се премахне защитата. Предпочита се, защитата на желаните киселинни и базични аминокиселинни остатъка да се премахне едновременно. Още повече, реагентите трябва да бъдат стабилни при премахване на защитата на подбраните киселинни и базични аминокиселинни остатъци, а защитаващите групи върху останалите аминокиселинни остатъци се подбират да бъдат стабилни на прилаганите условия на циклизиране.

Терминът “ортогоналност”, използван при защитаващите групи в страничната верига, се отнася до ситуация, в която има два или повече класа защитаващи групи в молекулата, като всеки клас се отделя найоптимално при специфични условия, докато остава стабилен спрямо условията, използвани при отделяне на защитаващите групи в други класове. Следователно, всички защитаващи групи от един клас могат да бъдат отделени, докато всички други остават.

Предпочитаните защитаващи групи с желана ортогоналност са: за киселинния аминокиселинен остатък, който ще се циклизира: алил; за базичния аминокиселинен остатък, който ще се циклизира: алилоксикарбонил (alloc); за всеки допълнителен киселинен аминокиселинен остатък: tert-бутил (tBu); и за всеки допълнителен базичен аминокиселинен остатък: tert-бутилоксикарбонил (Вос).

След синтеза на пептидния скелет на цикличния пептиден фрагмент в твърда фаза или в разтвор, алиловата и алилоксикарбониловата • · · · ·· ·· · * ·· ·· · · · j · ·· ··· · · · · ·· групи се отделят едновременно пбсредством третиране с паладий, за предпочитане, тетракис(трифенилфосфин)паладий(0) в присъствие на N-метиланилин. След това, формирането на лактамовия мост се осъществява, както е описано за формирането на амидната връзка.

Предпочитаните циклични пептидни фрагменти, използвани при получаване на свързани със смола циклични пептиди, съгласно настоящото изобретение, имат формули XV, XVI или XVII.

P-A13-A14-A15-A16-A17-OH	XV
1 1 Р-Аю-Аи-Аго-АгпАгг-ОН	XVI
1 1 Р-А₂6-А₂₇-А₂₈-А₂9-Азо*ОН	XVII

където | | е мост от лактам, дисулфид или лантионин; Р е защитаваща амина група; A_n, Ап, А₁₈, А₂₂, А₂₆ и А₃₀ са аминокиселинни остатъци; Au е His (Trt) или Ser (tBu); Ai₅ e Ser (tBu) или Leu; Ai₆ e Asn (Trt) или Gin (Trt); An e Arg (Pmc) или Glu (OtBu); A20 e Arg (Pmc); A₂i e Arg (Pmc) или Vai; A₂₇ e Leu или Lys (Вос); A₂₈ e lie или Leu; и A^ e Ala или Gin (Trt).

По-предпочитани са циклични пептидни фрагменти, c формули IV, V или VI, в които | | е лактамов мост; Р е Fmoc; Α_ί3, Αι₈ и А^ са Lys; Ап, А^ и

А30 са Asp; Ам е His (Trt) или Ser (tBu); А15 е Ser (tBu) или Leu; A_i6 e Asn (Trt) или Gin (Trt); An e Arg (Pmc) или Glu (OtBu); A₂₀ e Arg (Pmc); A_2i e Arg (Pmc) или Vai; A₂₇e Leu или Lys (Вос); A28 е Пе или Leu; и A₂₉ e Ala или Gin (Trt).

35...........

. ' 3 ' ’ , ' ' ' Ο _» 3 3

Още по-предпочитан цикличенпептиденфрагментза използване при получаването на свързани със смола циклични пептиди, съгласно настоящото изобретение, е Fmoc-4Hioio(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu>Arg (Pmc)-Val-Asp-OH.

Аналозите на цикличния пептиден паратироиден хормон и аналозите на протеина, свързан с паратироидния хормон, приложими в метода, съгласно настоящото изобретение, са описани в:

1. Condon et al., U.S. Ser. No. 60/046,472 (подаден 14.05.1997);

2. Willick et al., U.S. Pat. No. 5,556,940 (17.09.1997);

3. Chorev et al., U.S. Pat. No. 5,717,062 (10.02.1998);

4. Vickery et al., WO 96/40775 (публикуван 19.12.1996). Предпочитаният цикличен пептид, подходящ за метода, съгласно настоящото изобретение, има формула I

Χ-Α7-Α8-Α9-Α10-Α11-Α12-Α13-Α14-Α15-Α16-Α17-Α18-Α19-Α20Ά21А22А23-А24-А25А2б-А27-А12“А29-Азо-Аз1-У

I в която

X се подбира от групата, състояща се от (а) Ri_a-Ai-A₂-A₃-A4-A₅-A6-, *

(б) К.1ь-А2-Аз-А4-А5-Аб-, (в) Яи/Аз-Ад-А^Аб-, (г) Rib-ArAs-Ae-, (д) Rib-AsАб-, (е) Rib-Аб- и (ж) Rib-, в които R_ia се подбира от групата, състояща се от (1) водород, (2) пептид, състоящ се от 1 до 6 аминокиселини, (3) алкил, (4) фенилалкил, (5) -COR2, където R2 се подбира между алкил, алкенил, алкинил, фенил, нафтил и фенилалкил, Ri_b се подбира от групата, състояща се от (1) водород, (2) алкил, (4) фенилалкил и (4) -COR2, където R₂ се подбира между алкил, алкенил, алкинил, фенил, нафтил и фенилалкил, Αι се подбира между Ser и Ala или техен еквивалентен аминокиселинен остатък, А₂, А₃, Ад и Аб са аминокиселинни остатъци и

А₅ се подбира между Пе и His или*техен еквивалентен аминокиселинен остатък;

А₇, Ар, Ап и An са аминокиселинни остатъци;

As е Leu или Nle или техен еквивалентен аминокиселинен остатък;

А₁₀ е Asn или Asp, или техен еквивалентен аминокиселинен остатък;

Ab и An са аминокиселинни остатъци, в които страничните вериги на Ab и Ар са свързани през амидна връзка;

А₁₄ е His или Ser, или техен еквивалентен аминокиселинен остатък;

А15 и А28 независимо един от друг са lie или Leu, или техен еквивалентен аминокиселинен остатък;

А1б е Asn или Gin, или техен еквивалентен аминокиселинен остатък;

A1S и А₂₂ са аминокиселинни остатъци, в които страничните вериги на Au и А₂₂ са свързани през амидна връзка;

А19 е Arg или Glu, или техен еквивалентен аминокиселинен остатък;

А₂о е Arg или негов еквивалентен аминокиселинен остатък;

A₂i е Arg или Vai, или техен еквивалентен аминокиселинен остатък;

А₂₃ е Phe или Тгр, или техен еквивалентен аминокиселинен остатък;

А₂4 е Leu или негов еквивалентен аминокиселинен остатък;

А25 е Arg или His, или техен еквивалентен аминокиселинен остатък;

Агб и А30 са аминокиселинни остатъци, в които страничните вериги на А26 и А30 са свързани през амидна връзка;

• ' ·· · ··· ·· ···· ·· ······ • · · · · · · · · ·· ·· · ······ ··· · ·····

А₂7 е Leu или Lys, или техен еквивалентен аминокиселинен остатък;

А₂9 е Ala или Gin, или техен еквивалентен аминокиселинен остатък;

А₃1 е Пе или Vai, или техен еквивалентен аминокиселинен остатък;

Y се подбира от групата, състояща се от (a) -R3, (б) -A₃₂-R3, (в) -A₃₂-A33-R₃ и (г) -Аз2-Азз-Аз4^з, където R₃ е -ОН или NR4R5, където R4 и R₅ независимо един от друг са подбрани между водород и нисш алкил, А₃₂ е His или негов еквивалентен аминокиселинен остатък; А₃₃ е Asn или Thr, или техен еквивалентен аминокиселинен остатък; и А34 е Ala или Phe, или техен еквивалентен аминокиселинен остатък.

Пептидите с формула I притежават полезни фармацевтични свойства. Те са особено ефикасни при лечение на болестни състояния, които могат да се регулират посредством съединения, които се свързват с рецепторите на паратироидния хормон със или без стимулиране на cAMPase активността. Виж, U.S. Ser. No. 60/046,472.

Примерните предпочитани циклични пептиди, подходящи за приложение по метода, съгласно настоящото изобретение, включват, но без да е ограничение: WiiaioCLys^-Asp^fAla^NleUys^^p^Leu^hPTHil-SONH^ HHioioCLys^-Asp^tAla^^Nle^Lys^^p^Leu^hPTHCl-SONH,, UHicjio(Lys¹⁸-Asp²²)[Ala¹’³,Nle⁸,Lys¹⁸,Asp²²,Leu²⁷]hPTH(l-31)NH2, HHioio(Lys¹⁸-Asp²²)[Ala¹’⁴,Nle⁸,Lys¹⁸,Asp²²,Leu²⁷]hPTH(l-31)NH2, UMicno(Lys¹⁸-Asp²²)[Ala¹’⁵,Nle⁸,Lys¹⁸,Asp²²,Leu²⁷]hPTH(l-31)NH2, 4HKno(Lys¹⁸-Asp²²)[Ala¹’⁶,Nle⁸,Lys¹⁸,Asp²²,Leu²⁷]hPTH(l-31)NH2, 4Hioio(Lys¹⁸-Asp²²)[Ala¹¹⁷,Nle⁸,Lys¹⁸,Asp²²Leu²⁷]hPTH(l-31)NH₂, HHioioCLys^-Asp^tAla^^Nle^Lys^^p^Leu^hPTHCl-SONH,,

···· ·· ·· · · · · • · · · · · · · · ·· ·· · ······

4Hioio(Lys¹⁸-Asp²²)[Ala^1,10,Nle⁸,Lys^w,Aip^e2,Leu²⁷lfiPTiC(*l-^I)NH2, 4Hioio(Lys¹⁸-Asp²²)[Ala¹’¹¹,Nle⁸,Lys¹⁸,Asp²²,Leu²⁷]hPTH(l-31)NH2, 4Hiuio(Lys¹⁸-Asp²²)[Ala¹’¹²,Nle⁸,Lys¹⁸,Asp²² Leu²⁷]hPTH(l-31 )NH₂,

HHiuio(Lys¹⁸-Asp²²)[Ala¹’¹³,Nle⁸,Lys¹⁸,Asp²² Leu²⁷]hPTH( 1-31 )NH₂,

4Hioio(Lys¹⁸-Asp²²)[Ala¹’¹⁴,Nle⁸,Lys¹⁸,Asp²²,Leu²⁷]hPTH(l-31)NH₂,

UHioio(Lys^I8-Asp²²)[Ala^1,15,Nle⁸,Lys¹⁸,Asp²²,Leu²⁷]hPTH(l-31)NH₂,

UHioio(Lys¹⁸-Asp²²)[Ala¹’¹⁶,NIe⁸,Lys¹⁸,Asp²²,Leu²⁷]hPTH(l -31 )NH₂,

6HiiHicno(Lys¹³-Asp¹⁷Lys^l8-Asp²²)[Ala¹,Nle⁸,Lys¹⁸,Asp¹⁷’²², Leu²⁷]hPTH (1-31)NH₂, 6H4HKno(Lys¹⁸-Asp²²,Lys²⁶-Asp³⁰)[Ala¹,Nle⁸,Lys^l8,Asp²²,Leu²⁷]hPTH(l-31)

NH₂,

HHioio(Lys¹⁸-Asp²²)[Ala¹,Nle⁸,Lys¹⁸,Asp²²,Leu²⁷]hPTH(l-34)NH2, 6HUHioio(Lys¹³-Asp¹⁷,Lys¹⁸-Asp²²)[Ala¹,Nle⁸,Lys¹⁸,Asp¹⁷’²²,Leu²⁷]hPTH (1-34)NH2,

6H4Hiuio(Lys¹⁸-Asp²²,Lys²⁶-Asp³⁰)[Ala¹,Nle⁸,Lys¹⁸,Asp²²,Leu²⁷]hPTH( 1 -34)

NH₂, ₄Hioio(Lys¹⁸-Asp²²)[Lys¹⁸,Asp²²]hPTHrP(l-34)NH₂,

UHioio(Lys¹⁸-Asp²²)[Lys^18>26130,Asp²²,Leu²³’^28>31,Glu²⁵’²⁹]hPTHrP(l-34)NH₂, ₄Hioio(Lys¹⁸-Asp²²)[Nle⁸,Lys¹⁸,Asp²² Leu²⁷]hPTH(7-34)NH₂,

UHioio(Lys¹⁸-Asp²²)[Lys¹⁸,Asp²²]hPTHrP(7-34)NH₂,

6HUHiaio(Lys¹³-Asp¹⁷, Lys¹⁸-Asp²²)[Nle⁸,Lys¹⁸,Asp²²,Leu²⁷]hPTH(7-34)NH2, 6H4Hioio(Lys¹⁸-Asp²²3Lys²⁶-Asp³⁰)[Nle⁸,Lys¹⁸,Asp²²,Leu²⁷]hPTH(7-34)NH₂.

Друг предпочитан цикличен пептид, подходящ за приложение по метода, съгласно настоящото изобретение, има формула I, в която аминокиселините остатъци са α-аминокиселинни остатъци с L стереохи мия при α-въглероден атом.

Друг предпочитан цикличен пептид, подходящ за приложение по метода, съгласно настоящото изобретение, има формула I, в която X се подбира от групата, състояща се от (a) Ri_a-Ai-A₂-A₃-A4-A5-A6-, в която •••^•^·· · ··· ·· • · · · ·· ·· · »· · ·· · * ····· ·· ·· · ·····* ··· · ·····

Ri_a е водород или Pro, Ai e Ser илй*А1а’’А₂ e VaI,’X₃ e’Ser’Aj e Glu, A5 e He или His, Аб e Gin, (6) Rib-A₂-A₃-A₄-A5-A₆-, в която A₂, A3, Ад, A₅ и A са, както са дефинирани по-горе и Rib е водород, (в) Rib-ArApAs-A^, в която Rib, А₃, А», А₅ и Аб са, както са дефинирани по-горе, (г) Rib-ApAsАб-, в която Rib, А4, А₅ и Аб са, както са дефинирани по-горе, (д) Rib-A₅Аб-, в която R^, А₅ и Аб са, както са дефинирани по-горе, (е) Rib-Аб-, в която Rib и Аб са, както са дефинирани по-горе, и (ж) Rib-, където Rib е, както е дефиниран по-горе, А₇ е Leu, Ag е Leu или Nle, А₉ е His, Ащ е Asp или Asn, An е Leu, A_n е Gly, A_n, A_n, Ai₈, A₂₂ и A₃₀ независимо един от друг се подбират между Ser, Thr, Lys, Cys, хомо-Cys, Om, Asp, Glu, -NHCH(CH₂NH₂)CO-, -NHCH[(CH₂)₂NH₂]CO-, -NHCH[(CH₂bCO₂H]COи -NHCH[(CH₂)₄CO₂H]CO-; A_J4 e His или Ser, A15 e Leu или Ser, A_i6 e Asn или Gin, Ai9 e Arg или Glu, A₂₀ e Arg, A_2i e Arg или Vai, A₂₃ e Phe или Trp, A₂₄ e Leu, A₂₅ e His или Arg, A₂₆ e His или се подбира от групата, състояща се от Ser, Thr, Lys, Cys, хомо-Cys, Om, Asp, Glu, -NHCH(CH₂NH₂)CO-, -NHCH[(CH₂)2NH₂]CO-, -NHCH[(CH₂)₃CO₂H]COи -NHCH[(CH₂)₄CO₂H]CO-; A₂₇ e Leu или Lys, A^ e Leu или lie, A29 e Ala или Gin, A31 e lie или Vai, и Y се подбира от групата, състояща се от (a) R₃, където R₃ е -ОН или NR₄R₅, където Ид и R₅ независимо един от друг са подбрани между водород и алкил, имащ от 1 до 4 въглеродни атома, (б) -A₃₂-R₃, където R₃ е, както е дефиниран по-горе и А₃₂ е His, (в) -A₃₂-A₃₃-R₃, където R₃ и А₃₂ са, както са дефинирани по-горе и А₃₃ е Asn или Thr, и (г) -Аз₂-Азз-А₃₄-, където А₃₄ е Ala или Phe.

Друг предпочитан цикличен пептид, подходящ за приложение по метода, съгласно настоящото изобретение, има формула I, в която (i) страничните вериги на Α_ί8 и А₂₂ са свързани през амидна връзка, (ii) страничните вериги на А13 и A_i7 са свързани през амидна връзка, и страничните вериги на А^ и А₂₂ са свързани през амидна връзка, _e#40_et · ··· ·· • · · · ♦♦ ······ ·· · · ····· ·· · · · ···♦·♦ • · · · · · · · · (iii) страничните вериги на А₁₈ и К₂г са*свързани пре*з амидна връзка, и страничните вериги на А₂₆ и Азо са свързани през амидна връзка, или (iv) страничните вериги на А_п и Ар са свързани през амидна връзка, страничните вериги на Аш и А^ са свързани през амидна връзка, и страничните вериги на Агв и Азо са свързани през амидна връзка.

Друг предпочитан цикличен пептид, подходящ за приложение по метода, съгласно настоящото изобретение, има формула I, в която А_п се подбира между Lys и Ala, An се подбира между Ser и Asp, Ai₈ е Lys, А₂₂е Asp, А₂₆ е Lys и А30 е Asp.

Друг предпочитан цикличен пептид, подходящ за приложение по метода, съгласно настоящото изобретение, има формула I, в която X е

R1 а’А] -А₂-А₃-А4-Ag-Ag-.

Друг предпочитан цикличен пептид, подходящ за приложение по метода, съгласно настоящото изобретение, има формула I, в която Aj е Ala, As е Nle и А₂₇ е Leu.

Друг предпочитан цикличен пептид, подходящ за приложение по метода, съгласно настоящото изобретение, има формула I, в която Rj_a е водород и Y е NH₂.

Друг предпочитан цикличен пептид, подходящ за приложение по метода, съгласно настоящото изобретение, има формула I, в която Ri_a е водород и Y е -A₃₂-A33-A34-NH₂.

Друг предпочитан цикличен пептид, подходящ за приложение по метода, съгласно настоящото изобретение, има формула I, в която X се подбира от групата, състояща се от (a) Rib-A₂-A₃-A4-A₅-A6-, (б) Rib-A₃А4-А5-А6-, (в) Rib-A4-A₅-A6-, (г) Rib-As-A^-, (д) Rib-A^- и (е) Rib-.

Друг предпочитан цикличен пептид, подходящ за приложение по метода, съгласно настоящото изобретение, има формула I, в която As е Nle и А₂₇ е Leu.

♦ · · ···· ···· ·· ·· · · ·· • · · « · · · «· • · 9 9 9 9 9 9 9 99

9 9 ·» *» * ·* *··*

Друг предпочитан цикличен*пептид, подходящ за приложение по метода, съгласно настоящото изобретение, има формула I, в която X е водород и Y е -A₃₂-A₃3-A34-NH₂.

По-предпочитаните циклични пептиди, подходящи за приложение по метода, съгласно настоящото изобретение, се подбират между UHiaio(Lys‘⁸-Asp²²)[Ala',Nle⁸,Lys¹⁸,Asp²²,Leu²⁷]hPTH(l-31)NH2, paicno(Lys^l8-Asp²²)[Ala^I'²,Nle⁸,Lys¹⁸,Asp²²,Leu²⁷]hPTH(l-31)NH2f UHiuio(Lys¹⁸-A.sp²²)[Ala¹³,Nle⁸,Lys¹⁸,Asp²²,Leu²⁷]hPTH(l-31)NH2, mnaio(Lys¹⁸-Asp²²)[Ala¹’⁴>Nle⁸,Lys¹⁸, Asp²²,Leu²⁷]hPTH( 1-31 )NH2, UHiuio(Lys¹⁸-Asp²²)[Ala^,'⁵,Nle⁸>Lys^l8,Asp²²,Leu²⁷]hPTH(l-31)NH_2j® UHKJK>(Lys¹⁸-Asp²²)[Ala^li,Nle⁸,Lys¹⁸, Asp²²,Leu²⁷]hPTH( 1-31 )NH2, imicio(Lys^l8-Asp²²)[Ala^l'⁷,Nle⁸,Lys¹⁸,Asp²²,Leu²⁷]hPTH( 1-31 )NH2, UHioio(Lys^l8-Asp²²)[Ala^1,8,Nle⁸,Lys¹⁸,Asp²²,Leu²⁷]hPTH(l-31 )NHb umaio(Lys¹⁸-Asp²²)[Ala¹¹’Nle⁸,Lys¹⁸,Asp²²,Leu²⁷]hPTH(l-31)NH2, UHiciio(Lys¹⁸-Asp²²)[Ala^ul,Nle⁸,Lys¹⁸,Aap²²,Leu²⁷]hPTH(l -31 )NHi UHKao(Lys¹⁸-Aap²²)[Ala¹¹²,Nle⁸,Lys¹⁸,Asp²²>Leu²⁷]hPTH(l-31)NH2, UHiuio(Lys¹⁸-Asp²²)[Ala^11,,Nle⁸,Lys^l8,Asp²²,Leu²⁷]hPTH(l-31)NHb UHKao(Lys¹⁸-Asp²²)[Ala¹¹’,Nle⁸>Lys¹⁸,Asp²²,Leu²⁷]hPTH(l-31)NH2, цшакХЬуз^-Аар^Ак^^Нк^Ьуз^Аар^Ьеи^ЬРТНСЬЗЦКНг, • mnoio(Lys¹⁸-Asp²²)[Ala¹“,Nle⁸,Lys¹⁸, Asp^Leu^JhPTHi 1 -31 )NH₂,

GanHOolLys^-Asp'^Lys^-Asp+tAla'.Nle^Lys^.Asp^+Lei+jhPTH (1-31)NH2,

SHUHKJioCLys^-Asp^Lys^-Asp^XAla^Nle^Lys¹⁸, Asp^.Leu^JhPTHC 1-31) NH₂.

Още по-предпочитаните циклични пептиди, подходящи за приложе-ние по метода, съгласно настоящото изобретение, се подбират между uiuaio(Lys¹⁸-Asp²²)[Ala¹,Nle⁸,Lys¹⁸,Asp²²,Leu²⁷]hPTH(l-31)NH2,

6inmKJio(Lys^I3-Asp¹⁷,Lys¹⁸-Asp²²)[Ala^I,Nle⁸,Lys¹⁸,Asp^17,22,Leu²⁷]hPTH

		И 9 ··	99
• 9	• ·	99	99	9 9	9 ·
9 ·	•	9	9	9 9	• ·

• ·	•	9	9	9 9	9 9
··		999	9 99	99	99

6HLiHicio(Lys¹⁸-Asp²²,Lys²⁶-Asp³⁰)[Ala¹,Nle⁸,Lys¹⁸, Asp²²,Leu²⁷]hPTH( 1-31) nh₂.

Най-предпочитаният цикличен пептид, подходящ за приложение, по метода, съгласно настоящото изобретение е nHooCLys^-Asp^EAla^Nle^Lys'^Asp^Leu^hPTHCl-SnN^.

Примери за изпълнение на изобретението

Следващият пример спомага за по-доброто разбиране на гореизложеното описание и илюстрира настоящото изобретение, без да ограничава неговия обхват.

ПРИМЕР 1

Получаване на 4Hiuio(Lys¹⁸-Asp²²)[Ala¹,Nle⁸,Lys¹⁸,Asp²²,Leu²⁷]hPTH (1-31)NH₂

Ala-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Lzeu-Nle-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-AsnSer-Lys-Glu-Arg-Val-Asp-Trp-Leu-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Val-NH₂

Етап 1:

Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-ValNH-смола

Амидна MBHA смола на Rink (0.5-0.7 meq/g титър, Nova Biochem,

LaJolla, CA, USA), 5 g (0.64 mmol/g, 3.2 mmol) набъбва при разклащане c 60 ml диметилформамид, след което смолата се изцежда и се промива ft· ·· · · · ·· · ft··· ·· · ····· ·· · · ····· ·· ·· · ······ ··· · ·· ··· c 2 порции от по 60 ml диметилффйМАид/След това 9-флуоренилметоксикарбониловата група (Fmoc) се отделя посредством третиране на смолата с 60 ml 20% пиперидин/диметилформамид в продължение на 20 минути, последвано от четирикратно промиване на смолата с 60 ml диметилформамид (TNBS: положително). Fmoc-Val-OH (2.17 g, 6.4 mmol) и 2.43 g (6.4 mmol) О-бензотриазол-1-ил-М,М,Я’,№-тетраметилурониев хексафлуорфосфат (HBTU) в 150 ml диметилформамид се третират с 32 ml (12.8 mmol) N-метилморфолин при 0°С в продължение на 10 минути, след което сместа се прибавя към пептид, свързан със смола и сместа се разбърква посредством разклащане при стайна температура в продължение на 1.3 часа. Смолата се изцежда и се промива с три порции от по 150 ml диметилформамид (TNBS: отрицателно). Смолата се промива с две порции диетилов етер и се отцежда в продължение на една нощ. Постигнатото при свързването тегло е 0.88 g, включващо добавянето на 2.75 mmol Vai). Синтезът продължава при последователно отстраняване на Fmoc (както по-горе) и свързване (както по-горе) с по 5.6 мола Fmoc-Asp(OtBu), Fmoc-Gln(trt), Fmoc-Leu, Fmoc-Leu, Fmoc-Lys (Вос), Fmoc-Arg(Pmc), Fmoc-Leu и Fmoc-Trp(Boc), при използване на 5.6 моларни еквивалента HBTU, 11.2 mmol N-метилморфолин и 50 ml диметилформамид за всяко свързване. Крайният тегловен добив е 5.8 g. Отделя се аликвотна част за тестване на пептида от заглавието за остатъчен Fmoc, но с премахната защита на страничните вериги, чистота 86А%. LC-MS: 1390.6; изчислено 1390.8).

Етап 2:

Fmoc-nHicno(Lys-Asp)-Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp

Fmoc-Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OH • 9 • · ·· • · ·· • 9 99

9 99

99 9 • · · · • · · · ·

9 9

Метод А: Синтез в твърда фаза.......

а. Последователност:

Синтез на Fmoc-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp(OAllyl) хлортритилова смола

Куплирането на Fmoc-Asp(OAllyl)-OH до 15 g 1% омрежваща хлортритилова смола при натоварване 1.05 meq/g (общо 15.75 mmol) се осъществява при използване на 7.89 g (18.9 mmol) Fmoc-Asp(OAllyl)ОН, 82 g (39.9 mmol) бензотриазолилокси-1п8[пиролидино]фосфониев хексафлуорацетат (РуВОР) и 10.2 g (78.8 mmol) диизопропилетиламин в 150 ml дихлорметан. Сместа се разбърква посредством разклащане, след което се отцежда и смолата се промива с три порции от по 150 ml дихлорметан/метанол/диизопропилетиламин (17:2:1) последвани от три порции от по 150 ml дихлорметан. Взима се проба от смолата за TNBS тест, който е отрицателен. 9-Флуоренилметоксикарбониловата група (Fmoc) с краен азотен атом се отделя чрез третиране на Fmoc-защитената, свързаната със смола аминокиселина със 150 ml 5% пиперидин в дихлорметан/диметилформамид (1:1) в продължение на 10 минути, последвано от 150 ml 20% пиперидин в диметилформамид в продължение на 30 минути. Свързаната със смола аминокиселина се промива, както е описано по-горе. Всеки от Fmoc-Val-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH (10% аликвотна част, отделена след този етап), Fmoc-Glu(OtBu)-OH и Fmoc-Lys(eА11ос)-ОН се куплира по същия начин и се разработва със същата последователност, с тази разлика, че се прилагат от 3 до 5 промивки с диметилформамид вместо 3 промивки с дихлорметан преди TNBS теста. Не се изисква дублиране на куплирането. Крайният свързан със смола пептид се промива със 150 ml тетрахидрофуран и 150 ml диетилов етер, след което се суши под вакуум до получаване на 27.23 g.

.. 4¾. ..

• · · · ···· • · · ·♦ • · · ··

б. Отстраняване на Allyl и Alloc от Lys¹⁸ и Asp^M*

Синтез на Fmoc-Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-xjiopTpni3WOBa смола g От получената по-горе Fmoc-(Lys-Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)Уа1-Азр(ОА11у1)-хлортритилова смола се третират при набъбване в шейкър със 100 ml диметилсулфоксид/диметилформамид/дихлорметан (1:1:0.2,06./06./06.) в продължение на 20 минути, след което смолата внимателно се отцежда. Прибавя се разтвор на 2.9 g тетракисфенилфосфин паладий(О) в 240 ml диметилсулфоксид/диметилформамид (1:1, об./об.), последвани от 60 ml дихлорметан и 16.2 g (150 mmol) N-метиланилин, след което сместа се разбърква чрез разклащане в продължение на 2 часа. Смолата се отцежда и се промива с 3x100 ml порции дихлорметан. След това смолата се набъбва със 100 ml диметилсулфоксид/диметилформамид (1:1, об./об.), след което смолата внимателно се отцежда и се използва директно в Lys^-Asp²³ циклизирането.

в. Формиране на Lys¹⁸-Asp²² лактамов мост:

Синтез на Fmoc-nHKJio(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Aspхлортритилова смола

Свързаният със смола пептид от горния етап се третира с 5.2 g (10 mmol) бензотриазолилокси4п8[пиролидино]фосфониев хексафлуорацетат (РуВОР) и 2.6 g (20 mmol) диизопропилетиламин в 100 ml диметилсулфоксид/диметилформамид (1:1, об./об.), след което сместа се разбърква в продължение на 4 часа. Смолата се отцежда и се промива с 3x100 ml порции диметилформамид, след което аликвотна част от изцедената смола се подлага на TNBS тест (отрицателен). Сместа се промива с по 100 ml тетрахидрофуран и диетилов етер и се суши под вакуум.

г. Отцепване на смолата и изолиране на продукта OT’Fnioc-UHiaio(LysAsp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp

Свързаният със смола пептид от горния етап за получаване на Lys^-Asp²² лактамов мост се третира в шейкър със 130 ml оцетна киселина/дихлорметан/2,2,2-трифлуоретанол (1:8:1) в продължение на 20 минути. Течността се отцежда от смолата и се третира с 500 ml метил-tбутилов етер и 100 ml диетилов етер и сместа се центрофугира. Супернатантът се отделя и към остатъка се прибавя диетилов етер, последван от центрофугиране. Супернатантът се отделя и остатъкът се суши в продължение на една нощ до получаване на 2.77 g жълто твърдо вещество (MS: 1172; 41% стехиометричен добив, сурово). Следва пречистване посредством колонна хроматография под налягане (85:15 до 60:40) дихлорметан:метанол) до получаване на 1 g Fmoc-4Hiuio(Lys-Asp)Lys-Glu (OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OH (15% добив по отношение на смолата) с чистота 85А%.

Метод Б: Синтез в разтвор

а. Последователност:

Синтез на Boc-Asp(OAllyl)-OBzl

В тригърлена колба от 3 L се поставят бензилов естер на 1,1-диметилетоксикарбонил-(Е)-аспартиновата киселина (50 g, 154.4 mmol), дихлорметан (96 ml), алилов алкохол (9.43 g, 162.3 mmol) и 4-Ν,Νдиметиламинопиридин (10 g) при стайна температура. Реакционната смес се охлажда до 8°С и в продължение на 1.5 часа при 8-11°С се прибавя разтвор на дициклохексилкарбодиимид (32 g, 154.4 mmol) в дихлорметан (100 ml). При прибавянето на разтвора на дициклохексилкарбодиимид се утаява дициклохексилкарбамид. Реакционната смес се

разбърква в продължение на 2 часа при 11-Г2°С* когато данните от високоефективната течна хроматография не показват изходни вещества. Дициклохексилкарбамидът се отфилтрува и филтратът се концентрира. Масленият остатък се поставя в метил-Гбутилов етер (250 ml) и разтворът се филтрува за отделяне на остатъчния дициклохексилкарбамид, промива се с 30 ml 0.2N солна киселина, 30 ml вода, 20 ml наситен воден разтвор на натриев бикарбонат, 30 ml вода и две порции по 50 ml разсол, суши се над магнезиев сулфат, филтрува се и се концентрира до получаване на 55.88 g Boc-(L)Asp(OAllyl)-OBzl под формата на масло. (Мизч. 363.4; М+1_ПОл. 364).

Синтез на HCl-Asp(OAllyl)-OBzl

Разтвор на Boc-Asp(OAllyl)-OBzl (110.5 g, 302.7 mmol) в 500 ml етилацетат, поставен в тригърлена колба от 3 L с механична бъркалка, се охлажда до 5°С и през реакционната смес, в продължение на 2.5 часа се пропуска да барботира газообразен хлороводород, през което време реакционната температура достига около 22°С. Данните от високоефективната течна хроматография не показват изходни вещества. В продължение на една нощ, през разтвора се пропуска да барботира азот, при което се образува бяла утайка, която се отделя чрез филтруване и се промива със 100 ml етилацетат. Остатъкът се суши под вакуум до получаване на 84 g HCl-Asp(OAllyl)-OBzl като бяло кристално (микроскопия) вещество. (М^ 263; М+1_ПОл. 264).

Синтез на Boc-Val-Asp(OAllyl)-OBzl

Към разтвор на Boc-Val-OH (25.4 g, 116.7 mmol) в етилацетат (85 ml) се прибавя хидроксибензотриазол хидрат (16.55 g, 122.5 mmol) в

48.

диметилформамид (122.3 ml). Сместа се охлажда до 5°С и в продължение на 1 час се прибавя разтвор на дициклохексилкарбодиимид (25.2 g, 122.5 mmol) в етилацетат (58.7 ml), през което време реакционната температура достига около 18°С и се утаява дициклохексилкарбамид. Охлаждането се спира и сместа се разбърква в продължение на 2 часа, и, в продължение на 25 минути, се прибавя разтвор на HCl.H₂N-Asp(OAllyl)OBzl (35 g, 116.7 mmol) в 189 ml диметилформамид. Бавно се прибавя N-метилморфолин (12.8 ml) в продължение на 0.5 часа до достигане на pH на реакционната смес 7 и сместа се разбърква при стайна температура в продължение на 36 часа. Реакционната смес се филтрува до отстраняване на дициклохексилкарбамида, филтратът се разрежда с метил-tбутилов етер, разбърква се в продължение на 2 часа, след което отново се филтрува. Филтратът се промива със 100 ml вода, 100 ml 0.5М водна лимонена киселина, 100 ml вода, 100 ml наситен воден разтвор на натриев бикарбонат, 100 ml разсол, суши се над магнезиев сулфат, филтрува се и се концентрира до получаване на 41.3 g Boc-Val-Asp(OAllyl)OBzl под формата на масло. (Μ^. 462; М+1_пол. 463).

Синтез на HCl-Val-Asp(OAllyl)-OBzl

При 2-4°С, разтвор на Boc-Val-Asp(OAllyl)-OBzl (31.7 g, 68.5 mmol) в етилацетат (300 ml) се смесва с газообразен хлороводород в продължение на 2 часа. Охлаждането се спира и сместа се разбърква в продължение на 48 часа. Азот барботира през разтвора в продължение на 1 час. Реакционната смес се концентрира в ротационен изпарител до получаване на 38.3 g бяло твърдо вещество, което изкристализира от етилацетат до получаване на 24.2 g HCl-Val-Asp(OAllyl)-OBzl. (Мизч. 362; М+1_пол, 363).

·· '^У»« · · ·· ·· ···· · · ·· · · « ·

Синтез на Fmoc-Arg(Pmc)-Val-Asp{CiAllyl)-0Lzf.....

В тригърлена колба от 3 L, снабдена с механична бъркалка, се поставят 17.25 g (26 mmol) Fmoc-Arg(Pmc) и 300 ml ацетонитрил и сместа се разбърква при стайна температура, докато се получи бистър разтвор. Прибавя се бензотриазолилокси-1г18[пиролидино]фосфониев хексафлуорацетат (РуВОР), разтворът се охлажда до 2°С и се прибавят 2.6 g (26 mmol) N-метилморфолин, образувайки бяла смола. Бавно се прибавя диметилформамид (52 ml) докато смолата се разтвори и сместа се разбърква при 3°С в продължение на 30 минути. В продължение на 20 минути, при 2-3°С се прибавя разтвор на HCl-Val-Asp(OAllyl)-OBzl (10.4 g, 26 mmol) в 39 ml диметилформамид, последвани от N-метилморфолин (7.5 ml) до установяване на pH 7. Охлаждането се спира и сместа се разбърква в продължение на 2.5 часа. Сместа след това се разрежда с 250 ml вода и 250 ml етилацетат. Етилацетатният слой се отстранява и се промива с вода (2x100 ml) и разсол (2x100 ml) и се концентрира до получаване на бяло твърдо вещество, което кристализира от 175 ml етилацетат до получаване на 18.5 g Fmoc-Arg(Pmc)-Val-Asp(OAllyl)OBzl (95А%). Етилацетатният филтрат се концентрира и смолистият остатък се тритурира с етилацетат до получаване на допълнителни 3.12 g от продукта. (М^ 1007; М+1_пол. 1008).

Синтез на Arg(Pmc)-Val-Asp(OAllyl)-OBzl

Към разтвор на Fmoc-Arg(Pmc)-Val-Asp(OAllyl)-OBzl (16 g, 15.9 mmol) в дихлорметан (267 ml), при стайна температура се прибавя пиперидин (23 g, 27 mmol, 26.7 ml). Реакционната смес се разбърква в продължение на 2.5 часа, след което се промива с вода (2x60 ml) и разсол (2x60 ml), суши се над магнезиев сулфат, филтрува се и се концент рира до получаване на полутвърдо* вещество.* Полутвърдото вещество се поставя в 400 ml етилацетат и разтворът се оставя да престои 3 дни и след това се филтрува. Филтратът се промива с вода (2x60 ml), суши се над магнезиев сулфат, филтрува се и се концентрира до получаване на 23.5 g продукт, замърсен с пиперидин-бензофулвен (MS анализ). Твърдото вещество се разтваря в 400 ml етилацетат, филтрува се, промива се с вода (2x60 ml), суши се над магнезиев сулфат се концентрира до получаване на твърдо вещество, което се суши в продължение на една нощ под вакуум до получаване на 12.55 g Arg(Pmc)-Val-Asp(OAllyl)-OBzl като бяло твърдо вещество. (Μ^. 784; М+1_П0Л 785).

Синтез на Fmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp(OAllyl)-OBzl

Към разтвор на Fmoc-Glu(OtBu) (6.73 g, 15.8 mmol) и бензотриазолилокси-1п8[пиролидино]фосфониев хексафлуорацетат (РуВОР) (8.18 g, 15.8 mmol) в 105 ml ацетонитрил при 2°С се прибавя N-метилморфолин (1.58 g, 15.8 mmol) и реакционната смес се разбърква при 2-4°С в продължение на 30 минути. При 2°С в продължение на 20 минути се прибавя разтвор на (L) Arg(Pmc)-Val-Asp(OAnyl)-OBzl (12.4 g, 15.8 mmol) в 70 ml ацетонитрил. След това се прибавя N-метилморфолин за постигане на pH 7. Охлаждането се спира и сместа се оставя да се стопли до стайна температура, след което разбъркването продължава общо 3 часа. Млечната реакционна смес се филтрува (бавно) и белият остатък се суши върху филтъра в продължение на една нощ до получаване на 10.8 g Fmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pmc>Val-Asp(OAllyl)-OBzl. Филтратът се концентрира до получаване на смола, която се поставя в 30 ml ацетонитрил и се оставя да престои в продължение на 48 часа като се получават допълнително 3.45 g продукт. Общият добив на Fmoc-Glu(OtBu)Arg(Pmc)-Val-Asp(OAllyl)-OBzl е 14.3 g. (Мизч. 1192; М+1_ПОл. 1192.4).

Синтез на Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp(OAflyl)-0’Bzl

•^1 ·· ' · ···· ·· · · · • · · · · ς.

• · ·· · 9·· • · · · · ·

Към разтвор на Fmoc-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp(OAllyl)-OBzl (12.3 g, 10.3 mmol) в 105 ml дихлорметан при стайна температура се прибавя пиперидин (3.5 g, 41.3 mmol). Сместа се разбърква в продължение на 2 часа, след което се разрежда с хептан, концентрира се до половин обем и се оставя да престои във фризер в продължение на една нощ. Ликьорът се декантира от масления остатък, който след това се поставя в дихлорметан. Разтворът се промива с 0.5М водна лимонена киселина, вода и разсол, суши се над магнезиев сулфат, филтрува се и се концентрира. Суровото твърдо вещество се тритурира два пъти с хептан и се филтрува до получаване на 9.0 g Glu(OtBuXL)Arg(Pmc)-Val-Asp (OAllyl)-OBzl като бял прах. (Мизч. 970.2; М+1_пол. 971).

Синтез на Fmoc-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp(OAllyl)-OBzl

Суспензия на Fmoc-Lys(Alloc) (4.2 g, 9.3 mmol) и бензотриазолилокси-1П8[пиролидино]фосфониев хексафлуорацетат (РуВОР) (4.8 g, 9.3 mmol) в 69 ml ацетонитрил при 5°С се третира с N-метилморфолин (0.94 g, 9.3 mmol), което води до получаване на разтвор, който се разбърква при 5°С в продължение на 30 минути. Прибавя се суспензия на Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp(OAllyl)-OBzl (9 g, 9.3 mmol) в 52 ml ацетонитрил, при което реакционната смес става мътнобяла. Прибавя се Nметилморфолин, докато pH на реакционната смес стане 7, след което сместа се оставя да се стопли до стайна температура и се разбърква в продължение на 1.33 часа. Сместа се филтрува и твърдият остатък се промива с ацетонитрил (2x40 ml) и се суши в продължение на една нощ под вакуум под азот до получаване на 12.8 g почти бяло твърдо вещество като кора, което се тритурира с 200 ml метилЧ-бутилов етер, отделя ·· се чрез филтруване и се суши под вакуум до получаване’на 9.7 g FmocLys(Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp(OAllyl)-OBzl. (М^ 1404.7;

М+1_ПОЛ. 1406).

б. Отстраняване на Allyl и Alloc от Lys¹⁸ и Asp²²: Синтез на Fmoc-Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OBzl

В тригърлена колба от 1 L, снабдена с механична бъркалка и вход за азот, при стайна температура се поставят 167 ml дихлорметан и 1.37 g (1.18 mmol, 0.2 eq.) Pd(PPh₃)₄. През оранжевия разтвор се пропуска азот в продължение на 2 минути, след което се прибавя разтвор на 8.3 g (5.91 mmol, 1.0 eq.) Fmoc-Lys(Alloc)-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp (OAllyl)-OBzl в 66.4 ml диметилформамид, последван от 13.3 g (124 mmol, 21 eq.) метиланилин. Разтворът се разбърква при стайна температура в продължение на 1 час. Сместа се разрежда със 700 ml метил-tбутилов етер, при което се образува твърдо вещество. Суспензията се разбърква в продължение на 1 час и се филтрува. Твърдият остатък се тритурира с 200 ml метил-Гбутилов етер, филтрува се и се суши до получаване на 5.0 g бледожьлто твърдо вещество. От филтрата се добиват още 1.1 g бледожьлто твърдо вещество и се получава общ добив от 6.1 g Fmoc-Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc>Val-Asp-OBzl. (Мии.1280.6; М+1_ПОЛ,1281).

в. Формиране на Lys¹⁸-Asp²² лактамов мост:

Синтез на Fmoc-mnoio(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OBzl

В тригърлена колба от 1 L се разтварят 6.0 g (4.69 mmol) FmocLys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OBzl в 300 ml диметилформамид при стайна температура под азот и се прибавят 3.44 g (6.61 mmol, 1.41 eq.) бензотриазолилокси4Й8[пиролидино]фосфониев хексафлуорацетат (РуВОР), 0.89 g (6.57 mmol, 1.40 eq.)’хидрокси§ензотриа*зо1о<идрат и

1.73 g (13.4 mmol, 2.85 eq.) диизопропилетиламин. Оранжевият разтвор се разбърква в продължение на 1 час при стайна температура, след което се разрежда с 300 ml вода, което води до получаване на маслен остатък. Мътната течност, съдържаща най-вече онечиствания, се декантира. Масленият остатък се разбърква в продължение на една нощ със 100 ml вода, при което се получава твърдо вещество като кора, което се отделя чрез филтруване, като се получават 4.2 g бледожълто твърдо вещество. От филтрата се добиват още 1. g бледожълто твърдо вещество и се получава общ добив от 5.2 g Fmoc-HHiaio(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)Val-Asp-OBzl. (Мизч. 1262; М+1_пол. 1262.5).

г. Отстраняване на бензилов естер: Синтез на Fmoc-HHiuio(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OH

Раствор на 5.9 g (4.7 mmol) Fmoc-HHioio(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)Arg(Pmc)-Val-Asp-OBzl в 25 ml диметилформамид се третира с 5.9 g активен въглен и се филтрува, след което се третира с 0.59 g 10% паладий върху въглерод и се поставя под налягане на водород 50 psig в апарат на Parr. След 1.5 часа сместа се филтрува, отново се третира с активен въглен, филтрува се и отново се третира с 0.59 g 10% паладий върху въглерод и се поставя под налягане на водород 50 psig в продължение на още 2 часа. Сместа се филтрува и филтратът се разрежда с 50 ml вода и се екстрахира с три порции от по 200 ml метиленхлорид. Събраните метиленхлоридни екстракти се концентрират до получаване на 1.2 g Fmoc-qHKno(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OH като масло. (Мизч. 1171; M+lnoH. 1172.3).

Пречистване

..

•· · · •· · •· · · • ·· ·· ···· • * ·· ·· ·· ·· · · ·· • · · · ·· « ······ I · · · ·· ··· ··· ·· ··

Проба от 400 mg Fmoc-runoio(Lys-Asp)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)Val-Asp-OH се разтваря в 10 ml 1:1 трифлуоретанол/изопропанол. Пробата се инжектира на две кювети от по 5 ml в колона за препаративна високоефективна течна хроматография (Microsorb MV Cl 8, 300Ang, 8u, 41.4x250 mm) калибрирана c 55% B (A=0.1% vl/vl водна трифлуороцетна киселина; B=v/v ацетонитрил/25% изопропанол с 0.1% трифлуороцетна киселина). Елуира се при 70 ml/минута с градиент от 55% В до 65% В в продължение на 30 минути, от 65% В до 95% В в продължение на 1 минута, последвано от промиване в колоната с равно количество от 95% В в продължение на 10 минути. Изтичането се контролира посредством UV при 210 пт. Фракциите с чистота 93.5А% или по-висока, се събират и концентрират посредством ротационен вакуумизпарител. При лиофилизиране на остатъка се получават 200 mg Fmoc-цикло (Lys-Asp)Lys-Glu-Arg-Val-Asp-OH. (M^. 1171; М+1_пои. 1172.6).

Етап 3:

Fmoc-Lys-Glu-Arg-Val-Asp-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pmc)Lys(Boc)-I^u-I^u-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-NH-CMO.iia

Fmoc-Trp²³(Boc),Arg²⁵(Pmc),Lys²⁶(Boc),Leu²⁷,Gln²⁹(Trt)hPTH(2331)-хлортритилова смола (1 g, 0.185 mmol) се набъбва в 10 ml диметилформамид при разбъркване чрез разклащане в продължение на 30 минути, след което се отцежда и третира с 10 ml 20% пиперидин/диметилформамид (об./об.) при разбъркване чрез разклащане в продължение на 30 минути. Смолата се отцежда и промива с 3x20 ml порции ди•55 ·· · · ·· ·· ···· ·· ·· ···· ·· · · · · · · · ·· ·· · ······ ··· · · ···· метилформамид. Прибавя се разтвор на 240*mg’(0.20^mmol, 1.1 eq.) Fmoc-HHiuio(Lys¹⁸-Asp²²)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OH, 312 mg (0.6 mmol, 3 eq.) бензотриазолилокси4пз[пиролидино]фосфониев хексафлуорацетат (PyBOP) и 156 mg (1.2 mmol, 6 eq.) диизопропилетиламин в 10 ml диметилформамид и сместа се разбърква в продължение на 16 часа. Смолата се отцежда и промива с 3x20 ml порции диметилформамид (TNBS положително) и отново се третира с Fmoc-цикло (Lys¹⁸-Asp²²)Lys-Glu(OtBu)-Arg(Pmc)-Val-Asp-OH/PyBOP/iPr2NEt в продължение на още 16 часа, след което Смолата се отцежда и промива с 3x10 ml порции диметилформамид (TNBS: отрицателно). Аликвотна част от пептида съгласно заглавието се отцепва от смолата, както е описано при Етап 2, Метод А при използване на реактив К, до получаване на пептиден фрагмент с незащитена странична верига. (LC-MS: Мизч. 2001; М+1_ПОл. 2000.5). Остатъкът се използва в Етап 4.

Етап 4:

Fmoc-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(OtBu)Lys-Glu(OtBu)- Arg(Pmc)-Val-Asp-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pmc)Lys(Boc)- Ьеи-Ееи-О1п(Тг1)-А8р(С)1Ви)-Уа1^Н-смола

Желаният, свързан със смола пептид, се получава при отстраняване на Fmoc защитаващата група от 1.38 g (0.244 mmol на база титър при Тгр²³) на свързания със смола пептид от Етап 3, както при Етап 1, последвано от цикли на отстраняване на Fmoc и свързване с по 0.5 mmol Fmoc-Ser(OtBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-His(Trt)OH и Fmoc-Lys(Boc)-OH, както при Етап 1, при използване на 190 mg (0.5 mmol) О-бензотриазол-1-ил-ННН’,Х’-тетраметилурониев хексафлуорфосфат (HBTU) и 2 mmol N-метилморфолин в 25 ml диметил·· 5^· · ··· ·· ···· ·· ·»···· • · · · ····· ·· 4 4 · 444444

444 4*4 4^*4 4**· формамид. Свързването се осъществява при*стайна температура за около 1 час. Крайният, свързан със смола пептид, се промива с порции от по 25 ml диметилформамид, тетрахидрофуран и диетилов етер и се суши под вакуум. Аликвотна част (1.93 g) от пептида, съгласно заглавието, се отцепва от смолата, както е описано по-долу (реактив К), до получаване на пептиден фрагмент с незащитена странична верига. (LC-MS: Млзч. 2579.4; М+1_пол. 2580.7) с чистота 52 А%.

Етап 5: Fmoc-Ala-Val-Ser(CftBu)-Glu(CrtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Nle-His(Trt)• Asn(Trt)-Leu-Gly-OH

Fmoc-[Ala¹,Ser³(OtBu),Glu⁴(OtBu),Gln⁶(Trt),His⁹(Trt),Asn¹⁰(Trt),Nle⁸] hPTH(l-12)

Пептидът от заглавието се получава при свързване на 2.65 g (5 mmol) Fmoc-Leu-OH с 5 g (3 mmol) 1% омрежваща Gly-2-хлортритилова смола 0.6 meq/g с 3.9 g (7.5 mmol) бензотриазолилокси4п8[пиролидино] фосфониев хексафлуорацетат (РуВОР) и 1.94 g (15 mmol) диизопропилетиламин в 50 ml диметилформамид/тетрахидрофуран (об./об.) при раз© бъркване посредством разклащане в продължение на 0.5 часа. Смолата се отцежда, след което се промива с пет порции диметилформамид/тетрахидрофуран и една порция метанол (нинхидрин: отрицателно). Смолата се промива веднъж с диметилформамид, след това се третира два пъти с 60 ml 20% пиперидин/диметилформамид в продължение на 15 минути всеки път, с три порции от по 60 ml диметилформамид и с по една порция от 60 ml метанол между всяко третиране. След второто такова третиране, нинхидринът е силно положителен. Цикълът се повтаря при единично третиране в продължение на 0.5 часа с пиперидин/диметилформамид във всеки следващ случай и използване на по 2.5 молар• ·

.$7 ..

• ft · · ft* ·· ft··· • ft ft ft ft ft··· • ft ·· ft ft····· ··· ft ft ftftftft ни еквивалента от Fmoc-Asn(Trt), Pm0c-llis(Trt)’’Pmoc-Nle, Fmoc-Gln (Trt), Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Ile, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ser(OtBu), Fmoc-Val и Fmoc-Ala и на no 2.5 моларни еквивалента от РуВОР) и диизопропилетиламин. Свързаният със смола пептид се отцепва при разклащане със 100 ml оцетна киселина/трифлуоретилен/дихлорметан (1:1:8) в продължение на 1 час. Течността се отцежда от смолата и смолата се промива с 200 ml дихлорметан; след това промивната вода се събира с основната порция течност. След това се изпарява последователно от хексан, етилацетат и изопропанол. Остатъкът се тритурира с диетилов етер, след което се суши (една нощ, вакуум) до получаване на 2.24 g пептид от заглавието (чистота HPLC: 83 А%). Смолата отново се третира при условията на отцепването и течността се третира, както след първото отцепване, като, накрая се получават още 2.75 g от пептида, съгласно заглавието (чистота HPLC: 00 А%). Получават се общо 4.95 g (2.1 mmol, 70% добив от смола). (LC-MS: М^ч. 1514.8; М+1_пол. 1514.7). Този продукт се използва, както е получен, в Етап 6.

Етап 6:

Fmoc-Ala- Val-Ser(Offiu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Nle-His(Trt)Asn(Trt)-Leu-Gly- Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(OtBu)Lys-Glu(OtBu>- Arg(Pmc)-Val-Asp-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pmc)Lys(Boc> Leu-Leu-Gln(T rt)-Asp(OtBu)-Val-NH-cMo.iia

Пептидът, получен в Етап 5 (900 mg, 0.114 mmol) се набъбва в 15 ml диметилформамид в продължение на 40 минути при разбъркване посредством разклащане, след което смолата се отцежда и третира с 15 ml

20% пиперидин/диметилформамид (об./об.) в продължение на 45 мину«МИЙ

•_Ф58 ·· · · ··♦· • · · · ·· ·· · ·· · • · · · · · ·· · • · ·· · ······ • · · · · · ·9**9 ти. Смолата се отцежда и промива с три порции от по 30 ml диметилформамид (TNBS тест: положителен). Прибавят се 15 ml диметилформамид, 775 mg (0.33 mmol, 2.7 моларни еквивалента, базирани на титър в позиция 23) Fmoc-[Ala\Ser³(CHBu),Glu⁴(OtBu),Gln⁶(Trt),His⁹(Trt),Asn¹⁰(Trt),Nle⁸]hPTH(l-12) (от Етап 4), 151 mg (0.29 mmol, 0.21 моларни еквивалента) бензотриазолилокси4п8[пиролидино]фосфониев хексафлуорацетат (РуВОР), 39 mg (0.25 mol) хидроксибензотриазолхидрат и 75 mg (0.58 mmol) диизопропилетиламин и сместа се разбърква посредством разклащане в продължение на 3 дни. Смолата се отцежда, след което се промива с три порции от по 30 ml диметилформамид (TNBS: смес от слабо положителни и отрицателни зърна), третира се с 15 ml 20% пиперидин/диметилформамид (об./об.), отцежда се и се промива с три порции от по 15 ml диметилформамид, тетрахидрофуран и диетилов етер, премахва се защитата и се отцепва от смолата в Етап 7.

Етап 7:

Ala-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Nle-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-SerLys-Glu-Arg-Val-Asp-Trp-Leu-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Val-NH₂

Свързаният със смола пептид от Етап 6 се третира за отстраняване на Fmoc от Ala, както в Етап 1, Метод 1, при едновременно отцепване и премахване на защитата в 33/2/2/1/2 смес на трифлуороцетна киселина, фенол, тиоанизол, етандитиол и вода (реактив К, общо разреждане на свързания със смола пептид 10 ml/g) в продължение на 3 часа. Смолата се отцежда и продуктът се утаява от филтрата посредством прибавяне на реакционната смес към студен t-бутилметилов етер (50 ml/g свързан със смола пептид). Сместа се оставя да престои 15 минути и след това се центрофугира (2000 оборота за минута, 5 минути). Теч• r-⁷ ·· · ··· ·· • · · е ♦ · ·· · · ·« • · · * · · · ·· • · · · · ······ • · · · · · · ·· ·· ···· ♦♦· ♦·· ·· ·· ността се декантира и оставащото твърдо вещество се промива с диетилов етер, супернатантът се отделя чрез центрофугиране и се отстранява. Полученото твърдо вещество се разбърква в 0.1% водна трифлуороцетна киселина (6 ml/g свързан със смола пептид) в продължение на 1 час до пълно отстраняване на чувствителните киселинни групи. Разтворът се лиофилизира до получаване на 414 mg пептид, съгласно заглавието, (чистота 37 А%, чистота 26.3 тегл.%, добив от Тгр²³ 26.3%) като бяло твърдо вещество.). (LC-MS: Мизч. 3632.0; М+1_пол. 3633.4).

Етап 8:

Пречистване

g от получения по-горе продукт се разтваря в 10 ml вода и разтворът се инжектира върху 2” X 25 cm препаративна HPLC (10 микрона, 120А или 300А) колона, предварително калибрирана с 75/5/20 0.1% водна трифлуороцетна киселина (А)/ 0.1% водна трифлуороцетна киселина в ацетонитрил (В)/ изопропанол (С). Колоната се елуира при 115 ml за минута с градиент от 75А/5В/20С до 60А/20В/20С в продължение на 30 минути, след което се промива с 30% А, 60% В, 20% С и отново се калибрира с 75А/5В/20С. Промивните води се контролират посредством UV детекция при 280 пт. Фракциите, съдържащи пептида от заглавието с около 75 А% чистота, се събират и се концентрират посредством ротационен вакуумизпарител («35°C). Концентрираният воден разтвор се впръсква върху същата препаративна колона и се пропуска отново със същия 30 минутен градиент. Фракциите, съдържащи пептида от заглавието с 90 А% или по-голяма чистота, се събират и се концентрират посредством ротационен вакуумизпарител (»35°С). Концентрираният воден разтвор се впръсква върху същата препаративна колона, която е предварително калибрирана с 75% 0.1М воден амониев аце-

	J ··	•	•	··
• ·	• ·	··	··	• ·	•
• ·	•	•	•	• ·	•
• ·	•	•	•	• ·	•
··	····	···	*··	··

____ ___ ___ __ ·· тат (pH 6 с оцетна киселина (D)/15% ацетонитрил (Е)/10% изопропанол (С). Колоната се елуира при 115 ml/min с от 75D/15Е/10С до 60D/30E/

10С в продължение на 30 минути, след което се пропуска 30D/60E/20C.

Фракциите, съдържащи пептида от заглавието с 95 А% или по-голяма чистота, се събират и лиофилизират, като се получава пречистен про дукт като твърдо вещество, ацетатна сол (от 1 g суров продукт се получават приблизително 100-200 mg @ чистота около 95 А%). На същия етап фракциите се анализрат за чистота, посредством аналитична високоефективна течна колонна хроматография с С18 колона (4.6 mm х 25 cm, 5 микрона, 120А или 300А) с градиент 25-40%В (А=0.1% трифлуороцетна киселина/вода; В=0.1% трифлуороцетна киселина/ацетонитрил) в продължение на 30 минути при поток 1 ml/min и контролиране посредством UV при 220 nm.

Claims

I. Метод за получаване

J-Ki-L-Кз-М II в която

J, L и М са линейни пептидни фрагменти;

Κι отсъства или е цикличен пептиден фермент, и

К₂ е цикличен пептиден фермент;

характеризиращ се с това, че този метод се състои от следните етапи:

(1) получаване на М - ® чрез последователно закачане на подходящо защитени аминокиселинни остатъци към смола до получаване на м - ® in където ® е подходяща за пептидния синтез смола и М е полипептиден фрагмент, (2) отделно получаване, посредством конвенционален пептиден синтез, на цикличен полипептиден фрагмент със защитен краен азотен атом с формула IV

PHN-K₂-CO₂HIV където Р е подходяща група, защитаваща амина, (3) свързване на III с IV до получаване на пептид с формула V

PHN-K₂-M-®V (4) ако К₂ отсъства, тогава (а) полипептидните фрагменти J и L се получават като единичен полипептид с формула VI

PHN - J - L - СО₂НVI и полипептид VI се свързва с пептид V до получаване на пептид с формула VII • · ·

PHN- J-L-K₂-M-’®

VII или, възможно е, (б) защитените индивидуални аминокиселинни елементи на полипептидите J и L последователно да се прибавят към пептидния фрагмент с формула V, или. възможно е, (в) поотделно или и двата J и L да се получат независимо като полипептидни фрагменти и да се свържат с растящия пептид, започващ с фрагмент с формула V, (5) когато присъства цикличен пептид К_ь тогава (а) полипептидният фрагмент с формула VIII

PHN-K!-CO₂HVIII в която Р е подходяща група, защитаваща амина, се получава отделно посредством конвенционални пептидни синтетични методи, (б) получава се пептиден фрагмент с формула IX

PHN - L - СО₂НIX и се свързва с пептиден фрагмент V до получаване на пептиден фрагмент с формула X

PHN-L-K₂-M-®X и (в) цикличният пептиден фрагмент VIII се свързва с пептиден фрагмент с формула X до получаване на пептиден фрагмент с формула XI PHN-Ki-L-K.-M-®XI (г) получава се пептиден фрагмент с формула XII

PHN - J - СО₂НXII който се свързва с пептиден фрагмент с формула XI, и (6) отцепване на смолата и премахване на защитата.
2. Метод, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че пептидът с формула I е цикличен пептид с формула X-Aio-Aii-Ai₂-Ai3-Ai4-Ai5-Ai6-Ai7-Ai8-Ai9-A₂o-A2i-A₂2-A₂3-A24-A₂5-A₂6-A27-Y