BG100548A - Ензими разграждащи арабиноксилана - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до методи и експресионни структури за клониране и суперекспресия на един разграждащ арабиноксилана ензим с гъбичен произход вподбрани микробиални клетки гостоприемници. Установено е, че ензимът е активен при разграждането наводонеразтворими соли, получени от царевица. Той може да бъде използван за приготвяне на хранителнисъстави за хора и животни и за осъществяване на методи предназначени за индустрията.

Description

Настоящето изобретение се отнася до областта на молекулярната биология. В частност, настоящето изобретение се отнася до клониране и експресия на гени, кодиращи полипептиди, които показват активност за разграждане на арабиноксилан. Тези ензими удобно се прилагат в индустриални процеси като хлебопекарство, получаване на хартия и пулпа и при получаване на фураж и храна (като добавки).

НИВО НАИЗОБРЕТЕНИЕТО

Съставът на клетъчната стена на растенията е комплексен и вариабилен. Полизахариди са установени главно под формата на дълги вериги на целулоза (главната структурна компонента на растителната клетъчна стена), хемицелулоза (включваща различни β- ксиланови вериги) и пектин.

Наличието, разпределението и структурните характеристики на полизахаридите от клетъчната стена на растенията се определя от:

(1) растителният вид; (2) сорта; (3) тъканният тип; (4) условията за развитие; (5) съзряването и (6) обработката на растителния материал преди храненето.

Основни различия съществуват между монокотиледонови (напр. зърнени и тревисти) и дикотиледонови (напр. детелина, зеле и соя) растения и между семената и вегетативните части на растението (Chesson, 1987; Carre and BriUouet, 1986).

Монокотиледоновите растения се характеризират с присъствието на арабиноксиланов комплекс в качеството му нахемицелулозен гръбнак. Основната структура на хемицелулозата 8 дикотиледоновите растения е ксилоглюканов комплекс. Нещо повече, у дикотиледоновите растения е установена по- висока концентрация на пектин в сравнение с тези от монокотиледонови. Семената обикновено са с много високо пектиново съдържание, но с относително ниско съдържание на целулоза.

В клетъчната стена могат да бъдат отличени три повече или помалко взаимодействащи си полизахаридни структури:

(1) Средната ламела формира външната клетъчна стена. Тя служи също и като място за прикрепване на отделните клетки една към друга в рамките на матрикса на растителната тъкан. Средната ламела се състои в основата си от калциеви соли и от високо естерифицирани пектини;

(2) Първичната стена е разположена вътре в средната ламела. Тя е добре организирана структура от целулозни микрофибрили, включени 8 аморфният матрикс на пектин, хемицелулоза, фенолни естери и протеини;

(3) Вторичната стена се формира когато растението съзрее. По време на фазата на растежа и развитието на растението се отлагат целулозните микрофибрили, хемицелулозата и лигнина.

Първичната клетъчна стена на зрелите, метаболитно активни растителни клетки (напр. мезофил и епидермис) са повече податливи на ензимна хидролиза отколкото вторичната клетъчна стена, която на този етап става високо лианифицирана.

Налице е висока степен на взаимодействие между целулоза, хемицелулоза и пектин в клетъчната стена. Ензимното разграждане на тези твърде интензивно кръстосано- свързани полизахаридни стуктури не е елементарен процес. Например, необходими са поне пет различни ензима за пълното разрушаване на арабиноксилана. Вътрешното разграждане се осъществява чрез използване на една ендо- β (1->4) D- ксиланаза. Екзо- (1->4) -D- ксиланаза освобождава ксилозни единици при не- редуциращия край на полизахарида. Три други ензима (а- глюкоринадаза, a- L- арабинофуранозид и ацетил естераза) се използват за разрушаване на заместителите на ксилановия гръбнак. Изборът на специфичните ензими е, разбира се, в зависимост от спецификата на разгражданата хемицелулоза (McCleary and Matheson, 1986).

Ензимите, които атакуват страничните вериги на ксилановия гръбнак са интересни с това, че те променят характеристиката на полимера, като го правят по- подходящ за определени приложения. Нещо повече, тези ензими могат да действат синергитично с ензимите, разграждащи основната верига (виж Kormelink, 1992, PhD thesis, University of Wageningen).

Известен е фрагмент на ДНК, кодиращ активност за разграждане на арабиноксилан. В заявка за Европейски патент 463 706, е описано изолирането, охарактеризирането и клонирането на гена за една ендоксиланаза от Aspergillus tubigensis. Ензимът не е способен да атакува страничните вериги на арабиноксилановия гръбнак.

Ензимни активности, способни да разрушават странични вериги, също са известни от Aspergillus niger (Kormelink, 1992, по- горе, Chapters 6 and 7). Един ензим, наречен Арабинофуранозидаза А (АрафурА) се характеризира със способността да освобождава арабинозни остатъци от олиаозахаридни структури, получени от арабиноксилани. Обаче, Арафур А не е активен за субстрати с Високо молекулно тегло. В допълнение, Aspergillus niger продуцира ензим, наречен Арафур В, който е активен спрямо олигозахарид, а така също и спрямо арабиноксиланови структури с Високо молекулно тегло. Ензимното действие на Арафур В се състои В освобождаване на арабинозни остатъци от крайни самостоятелно заместени ксилозни остатъци. Няма повече

известни ДНК фрагменти.

От Aspergillus awamori е изолирана активност, способна да освобождава арабинозни остатъци от двата олигозахарида, както и от арабиноксиланови структури с Високо молекулно тегло. Този ензим е наречен арабиноксилан арабинофуранозе хидролаза (АХН). Няма данни за ДНК фрагменти и/ или за тяхна последователност. Става ясно, че не Всички ензими, които са включени в разграждането на арабиноксилана са открити (Kormelink 1990). Например, няма все още открит ензим, атакуващ ксилозни молекули, двойно заместени с арабиноза. Причината е в това, че тези ензими

често се секретират в ниски количества. Молекулярното клониране и суперпродукцията в подходящ гостоприемник за тези ензими, макар и да не е лесно, е начин за получаване на достатъчно количество чисти ензими, което на свой ред позволява тяхното прилагане за различни цели.

ОБЩО ЗА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящето изобретение предлага рекомбинантна ДНК, която съдържа ДНК фрагмент, кодиращ полипептид с арабиноксилан разграждаща активност или полипептиден прекурсор за него, характеризиращ се с това, че този ДНК фрагмент е подбран от:

(а) ДНК фрагмент, кодиращ полипептид с амино киселинна последователност, представена от амино киселини от 1 до 306, или полипептиден прекурсор за този полипептид, представена от амино киселини - 27 до 306 в SEQIDNO: 5;

(8) ДНК фрагмент, кодиращ полипептид с амино киселинна последователност, представена от амино киселини от 1 до 306 или прекурсор за този полипептид, представена от амино киселини - 27 до 306 в

(c) ДНК фрагмент, кодиращ вариант или част от полипептидите, представени от амино киселинни остатъци от 1 до 306, посочени на SEQIDNO : 5 или 7, които още имат арабиноксилан разграждаща активност, или полипептиден прекурсор за това;

(d) ДНК фрагмент, кодиращ полипептид с арабиноксилан разграждаща активност и притежаващ нуклеотидната последователност, представена от нуклеотиди 784 до 1779 в SEQIDNO: 7;

(e) ДНК фрагмент кодиращ полипептид с арабиноксилан разграждаща активност, или част от такъв полипептид, чийто ДНК фрагмент е способен да се хибридизира към ДНК фрагмент както е представено от нуклеотиди 784 до 17779 на SEQIDNO : 5 или нуклеотиди 823 до 1818 на SEQIDNO : 7. Рекомбинантната ДНК съгласно изобретението за предпочитане се получава от филаментозни (нишковидни) гъби, поспециално от видовете HaAspergillus. Специално предпочитани рекомбинантни ДНК последователности включват ДНК фрагменти, кодиращи AXD А от Aspergillus niger или tubigensis.

Съгласно друг вариант на изпълнение, рекомбинантната ДНК съгласно изобретението включва 5’ и 3’ регулаторни ДНК сегмента за експресията на

ДНК фрагмента 6 прокариотична или еукариотична гостоприемникова клетка. Регулаторните ДНК последователности за предпочитане са хетероложни по отношение на полипептида кодиращ последователността на този ДНК фрагмент, като за предпочитане тези регулаторни последователности са подбрани така, че да повишат експресията на ДНК фрагмента в гостоприемника по сравнение с експресията на ДНК фрагмента в този същия гостоприемник, когато е свързана към неговите хомоложни

регулаторни ДНК последователности.

Съгласно друг вариант на изобретението, посочената рекомбинантна ДНК е под формата на вектор.

Изобретението по- нататък предлага трансформирана прокариотична или еукариотична гостоприемникова клетка, включваща рекомбинантна ДНК съгласно изобретението, за предпочитане от pogzAspergillus, а така също и метод за получаване на гостоприемникова клетка, способна да повиши експресията на арабиноксилан разграждащия ензим чрез третиране на гостоприемниковата клетка при условията на трансформиране с рекомбинантна ДНК съгласно изобретението и подбор за повишената експресия на този арабиноксилан разграждащ ензим.

Изобретението също предлага метод за получаване на ензим, разграждащ арабиноксилана, включващ етапите на култивиране на гостоприемникови клетки, способни да продуцират посоченият ензим при условия, позволяващи това и възстановяване на този ензим, характеризиращ се с това, че посочените гостоприемникови клетки, или техните предшевственици, са били трансформирани с рекомбинантната ДНК съгласно изобретението.

Съгласно още един вариант, изобретението предлага по същество чист полипептид, притежаващ арабиноксилан разграждаща активност и който се характеризира с амино киселинната последователност, посочена на

SEQIDNO: 8, а така също u генетични Варианти и техни части, които Все още притежават посочената активност. Изобретението също Визира състав, Включващ по същество чист полипептид съгласно претенция 14, във форма, подходяща за приложение като фураж, храна или за получаване на хартия или пулпа, където ензима е незадължително имобилизиран.

Предложени са също и методи за приложение на полипептида съгласно изобретението с оглед разграждане на арабиноксилана, като добавки за

фураж или храна, В процесите за получаване на хартия или пулпа, както и в хлебопекарството.

Претендирани са също фураж или храна, съдържащи полипептид съгласно изобретението.

Съгласно още един Вариант се предлага рекомбинантна ДНК, Включваща ДНК фрагмент, представен от нуклеотиди 1 до 783 на SEQIDNO : 5, или нейн субфрагмент, способен да регулира експресията на ДНК последователност, присъединена към нея, а така също и рекомбинантна ДНК, Включваща ДНК фрагмент, представен от нуклеотиди 1 до 822 от SEQIDNO : 7 или негов субфрагмент, способен да регулира експресията на ДНК последователност, присъединена към него.

Изобретението по- нататък се илюстрира със следните фигури:

Кратко описание на фигурите фигура 1 - Елуационен профил (OD280) на арабиноксилан разграждаща активност Върху HPLC.

фигура 2 - диаграма, показваща активността на AXDA върху Водно неразтворими твърди (WIS) фракции от царевица като функция на pH.

фигура 3 - процент на in vitro разграждане на царевични WIS като функция от количеството на суровия AXDA ензим.

фигура 4 - Рестрикционна карта на р1М3001 фигура 5 - Рестрикционна карта на р!М3002

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящето изобретение предлага пречистени и изолирани ДНК молекули, които включват последователността на гени за арабиноксилан разграждащи ензими и техни генетични варианти. ДНК молекулите може да включват участък за ензима за разграждане на арабиноксилан, както и неговите съседни 5’ и 3’ регулаторни участъци. Генетичните варианти включват ДНК молекули, кодиращи мутантни арабиноксиланови протеини и дегенерирали ДНК молекули, чрез които е получена желаната активност на експресирания от тях ензим.

Настоящето изобретение предлага също ДНК структури за експресия на арабиноксилан разграждащи ензими в желан гостоприемник. Тези експресионни структури включват хибридни ДНК молекули, които съдържат участъци за арабиноксилан разграждащи ензими, оперативно свързани към регулаторни участъци, такива като промотори, секреторни и терминиращи сигнали, произхождащи от хомоложни или хетероложни организми, които са способни да насочват повишената експресия на ензима, кодиран от ДНК молекула за арабиноксилан разграждащ ензим в подходящ гостоприемник. За предпочитане, експресионната структура ще бъде интегрирана в генома на подбрания гостоприемник за експресия.

По- нататък, настоящето изобретение предлага вектори, за предпочитане плазмиди, за клонирането и/ или трансформацията на гостоприемници с микробиален произход чрез въвеждането 6 гостоприемника на ДНК структура за експресия на арабиноксилан разграждащи ензими. В допълнение, настоящето изобретение предлага хомоложни или хетероложни гостоприсмници, трансформирани с вектори, които съдържат описаните по- горе ДНК структури. Хетероложните гостоприсмници могат да бъдат подбрани от бактерии, дрожди или гъби.

В контекста на настоящето изобретение, терминът “хомоложен” означава, че се отнася до всички структури, които са сходни с природната ДНК молекула, кодираща желания арабиноксилан разграждащ ензим, включително неговите регулаторни участъци. Хомоложният гостоприемник се дефинира като видовете, от които могат да бъдат изолирани такива ДНК молекули.

Терминът “хетероложен” се използва за да означи всички молекули, които не са нативни на ДНК молекулата, кодираща желаният арабиноксилан разграждащ ензим, включително регулаторните участъци. Като “хетероложен” гостоприемник се определя такъв гостоприемник от който и да е микробен вид, различен от тези, от които са изолирани гените, кодиращи арабиноксилан разграждащи ензими.

В контекста на настоящето изобретение, фразата “повишена експресия на желан арабиноксилан разграждащ ензим” се определя като експресията на желания арабиноксилан разграждащ ензим при нива над тези, които са отчетени в хомоложният див- тип организъм. В същият този контекст, повишена експресия също предполага експресията на арабиноксилан разграждащи ензими с изключение на въвеждането на ДНК молекулата или експресията на структура, кодираща арабиноксилан разграждащите ензими в хетероложен гостоприемник за експресия. Прогените на тези експресионни структури, разбира се, са също включени в обхвата на настоящето изобретение.

Настоящето изобретение също включва ДНК последователности, които се хибридизират към ДНК последователности, получени от гъбите, описани по- горе, но които може да се различават по кодонната последователност поради дегенерация на генетичният код или вариации при кръстосване на видовете. Така, настоящето изобретение включва ДНК фрагменти, кодиращи арабиноксилан разграждащи ензими, получени от видове, различни от Aspergillus. Обикновено, методите за получаване на аналогични ДНК фрагменти включват скрининг на бактериални или бактериофагни плаки, трансформирани с рекомбинантни плазмиди, съдържащи ДНК фрагменти от познат организъм или предполагащи продуциране на арабиноксилан разграждащи ензими съгласно изобретението. След репликация in situ на ДНК, последната се освобождава от клетките или плаките, и се имобилизира върху филтри (обикновено нитроцелулозни). След това филтрите могат да бъдат екранирани за комплементарни ДНК фрагменти с помощта на белязани сонди нуклеинови киселини, основани на която и да е от последователностите, определени за Aspergillus axdA гените. В зависимост от това дали скринираният организъм е далечно или близко свързан, условията за хибридизация или промиване следва да бъдат адаптирани с оглед улавянето на истинските позитиви или фалшивите позитиви. Типичната процедура за хибридизирането на имобилизираните върху филтър ДНК е описана в Глава 5, Таблица 3, стр. 120 и 121 : Nucleic acid hybridisation - a particular approach, B. D. Hames & S. J. Higgins Eds., 1985, IRL Press, Oxford). Макар оптималните условия обикновено да се определят емпирично, могат да се изведат няколко полезни правила за близко и помалко близко свързаните последователности.

За идентифициране на ДНК фрагменти, много близки до сондата, хибридизацията се осъществява както е описано в Таблица 3 на ames & Higgins, по- горе, с крайни етапи на промиване при строго определени условия

0.1 * SET буфер (20 пъти SET = ЗМ NaCl, 20 тМ EDTA, 0.4 М Tris- Hcl, Ph 7.8,0.1%SDS) npu68°G

За идентифициране на последователностите с ограничена хомоложност спрямо сондата, процедурата която следва да бъде спазвана е такава, както е изложена на Таблица 3 от Hames & Higgms, по- горе, но с намалена температура за хибридизация и промиване. Крайното промиване при 2* SET буфер, 50° С, например, следва да позволи идентифицирането на последователностите с около 75% хомоложност. Както е добре известно на специалистите в областта, точните взаимоотношения между хомологията и условията за хибридизация зависят от дължината на сондата, основният състав (% от G + С) и разпределението на съвпаденията; случайното разпределение притежавало- силен ефект на намаляване върху Т„ в сравнение с неслучайните или клустерните образци на съвпаденията.

Горните условия се прилагат за сонди с дължина от поне 300 Ьр, за предпочитане поне 500 Ьр, и най- вече около 1 kbp, и GC- съдържание на ДНК за сондиране от около 50 ± 10 %. Ако GC-съдържанието на даден организъм е известно, тогава условията могат да бъдат оптимизирани емпирично, като се има предвид следното съотношение (при IM NaCl, в рамките на интервала35% < (%G -I- С)< 75% : Т_Ж =81.5°С + 0.41 * (% G + С). Това означава, че ако GC- съдържанието ( %G + С ) е 10 % повече от средното, строгите условия за хибридизация могат да бъдат достигнати чрез повишаване на температурата за хибридизация и за промиване с около 4°С.

За целите на това описание, ДНК фрагмент, който се хибридизира към ДНК фрагмента съгласно изобретението, се дефинира като даващ позитивен сигнал върху имобилизирана ДНК след хибридизиране със сонда от поне 300 bp, за предпочитане 500 bp, и най- вече 1 kbp от която и да е от последователностите, показани на SEQIDNO: 5 или 7 и след помиване, следвайки процедурата от Таблица 3 в Глава 5 от Hames & Higgins при температура 50 ° С, 2 *SET.

Основните моменти от процедурата, описана на Таблица 3, Глава 5 от Hames & Higgins са следните:

(1) прехибридизация на филтрите в отсъствие на сонда, © (2) хибридизация при температура между 50 и 68° С в 0.1 до 4* SET буфер (в зависимост от ограничението), 10 * разтвор на Denhadt' (100 * разтвор на Denhardt съдържа 2% телешки серумен албумин, 2% фикол, 2% поливинилпиролидон), 0.1 % SDS, 0.1% натриев пирофосфат, 50 pg/ ml спермална ДНК от пъстърва (от щок, получаван чрез разтваряне на на 1 mg/ ml спермална ДНК от пъстърва, обработена с ултразвук до дължина 200 до 500 Ьр, оставена на водна баня за 20 мин., и разредена с вода до крайна концентрация 1 mg/ ml); времето за хибридизация не е твърде критично и може да бъде между 1 и 24 часа, за предпочитане около 16 часа (о/ п);

сондата обикновено се бележи с използване на Р³² като радиоактивен маркер ©

за специфична активност от между 5 * 10 ⁷ и 5 * 10 ’ с. р. т. / pg;

(3) (повтаря се) промиване на филтъра с 3 * SET, 0.1% SDS, 0.1% натриев пирофосфат при 68° С при температура от 50° до 68 ° С (в зависимост от желаното ограничение), повтаряне на промиването до понижаване на концентрацията на SET до 0.1 %, промиване еднократно за 20 мин. в 4* SET при стайна температура, изсушаване на филтрите върху 3 ММ хартия, подлагане на филтрите на рентгенов филм в касета при - 70° С за от около 1 час до 96 часа (в зависимост от силата на сигнала) и развитие на филма.

Обикновено, обемът от прехибридизационата и хибридизационна смеси следва да бъдат пазени при минимум. Всички “мокри” етапи следва да бъдат провеждани в малки запечатани торбички в предварително затоплена водна баня.

Горната процедура служи за определяне на ДНК фрагментите за хибридизиране съгласно изобретението. Задължително следва да бъдат направени множество модификации на процедурата за идентифициране и изолиране на ДНК фрагменти съгласно изобретението. Следва да се разбере, че така получените ДНК фрагменти, попадат под ограниченията на претенциите независимо къде са намерени следвайки горната процедура, и независимо дали са били действително идентифицирани и/ или изолирани с помощта на настоящата процедура.

В литературата са описани много методики, които могат да бъдат използвани за идентифициране и изолиране на ДНК фрагменти съгласно изобретението, включително тази на Hames & Higgins, по- горе.

Горната процедура е за полинуклеотидна сонда. Когато се използват

олигонуклеотидни сонди, взаимооотношенията между T_d и температурата, при която перфектно съвпадащите хибриди са напълно дисоциирани, се оценяват със съотношението: Ί\ = 4°С за GC двойка бази + 2°С за АТ двойка бази. На основата на съществуващите методики и с помощта на това правило, могат да бъдат конструирани олигонуклеотидни сонди за ефективно изолиране на ДНК фрагменти, кодиращи арабиноксилан разграждащи ензими съгласно изобретението от сродни и по- отдалечени организми. Процедурата с участието на олигонуклеошиди е специално приложима ако даден ензим е пречистен от различен източник и част от амино киселинната последователност е определена. С помощта на тази последователност може да бъде създадена система от дегенериращи сонди за скрининг на ДНК библиотека или Southern blot, по същество както е описано по- горе.

Добри кандидати за скрининг са други нишковидни гъби, като

Trichoderma, PeniciUium, Dichotomitus squalus, Disporotrichum dimorphosporum, u бактерии като Bacilus species и др. подобни. Ако първоначалното скриниране води go получаване на клонове, които очевидно съдържат хибридизиращи фрагменти, то тези фрагменти могат да бъдат изолирани и, по желание, съгласувани за определяне на секвенционните сходства.

След като веднъж е идентифициран даден желан арабиноксилан разграждащ ензим, ДНК последователността кодираща такъв ензим може да бъде получена от нишковидните гъби, които естествено ги продуцират чрез култивиране на гъбите в арабиноксилан съдържаща среда, изолиране на желаният арабиноксилан разграждащ ензим с помощта на известни методи като този, описан в Пример 1 и определяне на поне част от амино киселинната последователност на пречистения протеин.

ДНК сонди след това могат да бъдат получени чрез конструиране на олигонуклеотидни последователности, основани на изведените частични амино киселинни последователности. Последните могат да бъдат определени от N- края на пълния протеин и/ или от N- края на вътрешните пептидни фрагменти, получени чрез протеолитично или химично разграждане на пълния протеин. Веднъж получена, ДНК сондата (те) се използват за скрининг на геномна или сДНК библиотека.

Геномна библиотека може да бъде изготвена чрез частично разграждане на гъбна хромозомна ДНК с помощта на рестрикционни ензими, които разпознават ДНК последователност от четири последователни нуклеотида, като напр. Sau3A, и клониране на получените в резултат фрагменти 6 подходящ плазмид или вектор на ламбда фага, напр. ламбда GEM-11.

Обратно, сДНК библиотека може да бъде изготвена чрез клониране на сДНК, синтезирана от тРНК изолирана от гъбни клетки, индуцирани за синтез на арабиноксилан разграждащ ензим, в подходящ фагов вектор, като напр. ламбда gt 10.

Съответно, след наслояване на достатъчно количество колонии или

плаки, геномната или сДНК библиотека може да бъде скринирана с подходяща ДНК сонда.

Ако този метод не е успешен, геномната или сДНК библиотека може да бъде диференциално скринирана с сДНК сонди, получени от тРНК от неиндуцирани клетки. Индуцирани тРНК се изготвят от клетки, развиващи се върху среда съдържаща арабиноксилан като въглероден източник, докато неиндуцирана тРНК трябва да бъде изолирана от клетки, развиващи се върху въглероден източник, различен от арабиноксилан, напр. глюкоза. Сред клоновете, които се хибридизират само с индуцираната сДНК сонда, може да бъде възстановен клон, съдържащ ген за желаният арабиноксилан разграждащ ензим. Обратно, ген за арабиноксилан разграждащия ензим може да бъде идентифициран чрез кръстосана хибридизация със сходна последователност.

За предпочитане, олигонуклеотидни сонди могат да бъдат получени от N- крайна амино киселинна последователност (виж Пример 1.5.1) от арабиноксилан разграждащ ензим, притежаващ молекулно тегло от 32 kDa пречистен от филтрат на култура иа Aspergillus niger и/ или от амино киселинната последователност на вътрешен пептиден фрагмент (виж Пример 1. 5.2), получен чрез разграждане на ензима с CNBr.

Олиаонуклеотидншпе смеси могат да бъдат използвани за хибридизация както на геномна, така и на сДНК библиотеки.

Обратно, както е илюстрирано по- горе. Пречистеният AXDA ензим се използва за получаване на антитела. Антителата се използват имунологичното изследване на експресионни библиотеки. Така AXDA експресионните клонове се идентифицират. Следва да бъде отбелязано, че протеинът е изолиран от A. niger var. tubigensis и сДНК се изолира от A. niger N400, което показва, че разичните представители на Aspergillus съдържат AXDA активност.

С откриването на новите ДНК амплификационни техники, като директна или инвертна PCR, става възможно да се клонират ДНК фрагменти in vitro след като веднъж терминалните последователности на кодиращия участък са известни.

Наличието на ДНК последователност, кодираща арабиноксилан разграждащ ензим позволява конструирането на мутантни ензимни

молекули посредством сайт- насочена мутагенеза. Ако третичната структура на арабиноксилан разграждащият ензим е известна, и нейните каталитични и субстрат- свързващи участъци са локализирани, могат да бъдат подбрани амино киселини за мутагенезис (напр. с цел компютърно моделиране), които като че пораждат каталитичните и/ или субстратсвързващите функции. Ако третичната структура на протеина е неизвестна, могат да бъдат генерирани случайни мутации по продължение на цялата кодираща последователност, или третичната структура може да бъде предсказана чрез сравняване със сходни познати ензими, изолирани от друг микроорганизъм.

За улесняване инсерцията на ДНК фрагмента, съдържащ AXDA кодираща последователност в експресионни структури, включващи една или повече хетероложни регулаторни участъка, може да бъде използвана полимеразна верижна реакция (PCR) ( PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, (1989) H. A. Ehrlich, ed,, Stockton Press, New York) за въвеждане на подходящи места за рестрикционни ензими в 5' и 3* краищата на AXDA кодиращата последователност. Изборът на местата за рестрикция зависи от ДНК последователността на експресионния вектор, т. е. от присъствието на други рестрикционни сайтове в рамките на ДНК молекулата.

За получаване на повишена експресия на AXD А протеини в оригиналните (хомоложни) продуктивни видове, или обратно - в хетероложни гъбни щамове, AXDA кодираще ДНК участъци, включително техните собствени контролни участъци, се въвеждат в избрани гостоприемници за експресия с оглед повишаване броя на копията от гена и, съответно, протеиновата експресия.

Ако се предпочитат хетероложните гостоприемници за експресия и са подбрани дрождеви или бактериални щамове, се използва една непрекъсната (без наличие на интрони) ДНК молекула за конструиране на хетероложен експресионен вектор за да бъдат избягнати случаите когато сплис сигналите, останали в геномния врагмент не могат да бъдат разпознати от хетероложния гостоприемник. Тази непрекъсната ДНК молекула може да бъде получена от сДНК библиотека, конструирана от тРНК, изолирана от клетки, индуцирани за синтез на AXDA Тази библиотека може да бъде скринирана с олигонуклеотид или сДНК сонда, получена както е описано порано. Обратно, една непрекъсната ДНК молекула може да бъде получена чрез прилагане на полимеразна верижна реакция с помощта на подходящи 5' и 3' олигонуклеотиди върху първата верига сДНК, синтезирана от РНК на арабиноксилан- индуцирани клетки.

Повишена експресия на желаната AXDA може да бъде постигната също чрез подбор нахетероложни регулаторни участъци, напр. промотори, секреторни лидери и терминаторни участъци, които служат за повишаване на експресията и, по желание, на секреционните нива на желаният протеин от избрания гостоприемник за експресия и/ или за осигуряване на индуктивен контрол на експресията на желания AXDA.

Освен отестествения промотор на AXDA, могат да бъдат използвани

и други промотори за насочане на експресията им. Промотора може да бъде подбран по тяхната ефективност за насочване на експресията на желаната

AXDA в желания гостоприемник за експресия.

В друг вариант може да бъде подбран конститутивен промотор за насочване на експресията на желаната AXDA, относително свободна от други ензими. Подобна експресионна структура е с много преимущества, тъй като тя обуславя необходимостта от култивиране на гостоприемника за експресия върху среда, съдържаща арабиноксилани като индукционен субстрат.

Примери за строго конститутивни и / или индуктивни промотори, които са предпочитани за приложение при гостоприемници за експресия гъби, са АТф- синтетазен, субединица 9 (oliC), триозо фосфат изомеразен (tri), алкохол дехидрогеназен (adhA), а- амилазен (ату), глюкоамилазен (gam), ацетамидазен (amdS) и глицералдехид- 3- фосфат дехидрогеназен (gpd) промотори.

Примери за строго констшпутимни дрождеви промотори са алкохол дехидрогеназният, лактазен, 3- фосфоглицерат киназен, и триозофосфат изомеразен промотори.

Примери за строго конститутивни бактериални промотори са аамилазен и Spo2 промотори както и промотори от екстрацелуларни протеазни гени.

Хибридни промотори могат също да бъдат използвани с преимущество за повишаване индуктивната регулация на експресионната структура.

Често е желателно за AXD А да бъде секретирана от гостоприемника

за експресия в културалната среда.

Съгласно настоящето изобретение, AXD А на желаната природна секреционна лидерна последователност може да бъде използвана за да въздейства върху секрецията на експресионната AXDA.

Обаче, повишаването на експресията на ензима понякога води до продуциране на протеина в нива, над които гостоприемника е способен да произвежда и секретира, създавайки тясно място, където протеиновият продукт се акумулира вътре в клетката. Съответно, настоящето изобретение също предлага хетероложни лидерни последователности за осигуряване на по- ефективна секреция на ензима от избрания гостоприемник за експресия.

Съгласно настоящето изобретение, секреторният лидер може да бъде подбран на базата на желания гостоприемник за експресия. Хетероложният секреторен лидер може да бъде избран така, че да е хомоложен на други регулаторни участъци от експресионната структура. Например, лидерът на високо секретируемият глюкоамилазен протеин може да бъде използван в комбинация с глюкоамилазният промотор сам по себе си, а така също в комбинация с други промотори. Хибридни сигнални последователности също могат да бъдат използвани с предимство в контекста на настоящето изобретение.

Примери за предпочитани хетероложни секреторни лидерни последователности са произхождащите от глюкоамилазният ген (гъби), схг факторният ген (дрожди) или а- амилазния ген (Bacilus).

Най- общо, терминаторите не се считат за критичи елементи при повишена експресия на гените. По желание, терминатор може да бъде подбран от същите гени както промоторите, или обратно, може да бъде използван хомоложен терминатор.

В допълнение към отбелязания по- горе геномен фрагмент, трансформационната ДНК може да съдържа селекционен маркер за разпознаване на на клетки, които са включили желаният ген от нетрансформираните клетки. Този селекционен маркер, предоставен заедно с подходящите 5’ и 3’ регулататорни последователности, могат да съществуват в същата ДНК молекула, съдържаща желаният ген или да се намира в отделна молекула. В по- късен етап може да бъде осъществена котрансформация. Съотношението между експресионният вектор и селекционният вектор може да бъде така направено, че висок процент от подбраните трансформанти да включват вектора, съдържащ експресионната структура от желаният AXDA.

Повечето подходящи системи за селекция на производствени микроорганизми са формирани от групата на селекционните маркери, които не изискват мутация в гостоприемниковия организъм. Примери за селекционни маркери от гъби са гените за ацетамидаза (amdS), АТф синтетаза, субединица 9 (oliC) и беномил резистентност (ЬепА). Пример заселекционни маркери от не- гъбен произход са бактериалният G418 ген за резистентност (той може да бъде използван също в дрожди, но не в гъби), генът за резистентност спрямо ампицилин (Е. coli) и генът за резистентност спрямо неомицин (Bacillus).

След като веднъж е сглобена желаната експресионна структура, тя се трансформира в подходящ гостоприемник за клониране като напр. Е. coli за размножаване на структурата. След това експресионната структура се въвежда в подходящ остоприемник за експресия, където експресионната структура се интегрира в генома. Същински гостоприемници като видовете

от Bacillus могат да бъдат използвани както като клониращи, така и като гостоприемници за експресия, като по този начин водат до един екстра трансформационен етап.

Съгласно настоящето изобретение, могат да бъдат използвани различни организми като гостоприемници за получаване на желания AXDA В един от вариантите може да бъде използван хомоложен експресионен гостоприемник. Това включва въвеждането на експресионната стуктура обратно в щама от който е изолирана AXD А кодиращата ДНК последователност както при повишен брой на копията на гена, така и под контрола на хетероложни регулаторни участъци както е описано по- горе, или и двете.

В друг вариант на изобретението, желаната AXDA може да бъде продуцирана чрез въвеждане и експресия на ДНК структура, кодираща арабиноксилан разграждащият ензим под контрола на подходящи регулаторни участъци в хетероложни гостоприемници като бактерии, дрожди или гъби. За тази цел, ДНК последователностите кодиращи желаната AXDA зе предпочитане се експресират под контрола на промоторни и терминаторни последователности, произхождащи от хетероложния гостоприемник. В допълнение, може да бъде необходимо да се замести природната секреторна лидерна последователност с лидерна последователност, хомоложна на експресионния гостоприемник за постигане на най- ефективна експресия и секреция на продукта.

фактори като размера (молекулно тегло), необходимостта от гликозилация или желателността за екстрацелуларна секреция на AXDA, играе важна роля при подбора на експресионния гостоприемник.

Грам- негативната бактерия Е. coli широко се използва като гостоприемник за хетероложна генна експресия. Обаче, голямо количество

хетероложен протеин се акумулира вътре в клетката. Понякога пречистването на желания протеин от вътреклетъчното протеиново съдържимо на Е. coli може да бъде особено трудно.

В противоположност на това, бактериите от род Bacillus са много подходящи като хетероложни гостоприемници поради способността им да секретират протеини вътре в културалната среда.

В зависимост от самата ДНК молекула, кодираща AXDA и/ или от желанието за по- нататъшно получаване на експресирания протеин, могат да бъдат предпочитани еукариотични гостоприемници като дрожди или гъби. Най- общо, дрождевите клетки се предпочитат пред гъбните тъй като те по- лесно се манипулират. Независимо от това, някои протеини се секретират слабо от дрождеви клетки, или в някои случаи не се получават (напр. хипергликозилация в дрожди). В тези случаи следва да се селекционира гостоприемников организъм от гъбен произход.

Може да бъде избран хитироложен гостоприемник за експресия на желана AXDA, по същество чиста от други полизахарид- разграждащи ензими чрез избор на гостоприемник, който обикновено не продуцира такива ензими, напр. Kluyveromyces lactis.

Примери за предпочитан гостоприемник за експресия в рамките на обхвата на настоящето изобретение са гъби от род Aspergillus ( описани в ЕР

4·

184 438 u EP 284 603) u pog Trichoderma, бактерии от pog Bacillus (описани в EP 134 048) и дрожди от род Kluyveromyces (описани в ЕР 96 430 и ЕР 301670) и род Saccharomyces.

Специално предпочитани аостоприемници за експресия могат да бъдат селекционирани от Aspergillus niger, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus aculeatus, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Kluyveromyces lactis u Saccharomyces cerevisiae.

Експресията на желаният AXDA ензим се осъществява посредством култивиране на гостоприемник за експресия, който е трансформиран с подходяща експресионна структура в подходяща хранителна ферментационна среда.

ферментационната среда се състои от обичайната културална среда, съдържаща източник на въглерод (напр. глюкоза, малтоза, меласи и др.), азотен източник (като амониев сулфат, амониев нитрат, амониев хлорид и др.), източник на органичен азот (като дрождев екстракт, сладов експракт, пептон и др.) и източник на неорганични вещества ( като фосфат, магнезий, натрий, цинк, желязо и др.). Незадължително се включва индуциращ фактор (арабиноксилан).

Подбора на подходяща среда може да се основава на избора на гостоприемници за експресия и/ или на необходимостта от регулиране на експресионната структура. Подобна среда е добре позната на специалистите в областта. По желание средата може да съдържа компоненти, които оцветяват трансформирания гостоприемник за експресия повече от другите потенциално контаминиращи микроорганизми.

ферментацията се осъществява за период от 0. 5 до 20 дни в бач или fed- бач процес при температура 8 интервала между 0 и 45 °C и pH между 2 и

10. Предпочитани условия за ферментация са температура в интервала между 20 и 37°С и pH между 3 и 9. Подходящите условия са подбрани с оглед избора на гостоприемника за експресия.

След ферментация, клетките се отстраняват от ферментационния бульон чрез центрофугиране и филтрация. След отстраняване на клетките, ензимът може да бъде възстановен и, по желание, да бъде пречистен и изолиран по обичайните начини.

Продуктът е в стабилна форма както в течен, така и в изсушен вид. За дадени приложения може да се предпочита имобилизация върху твърда повърхност.

Ензимите, получени посредством настоящето изобретение могат да бъдат прилагани както самостоятелно, така и заедно с други подбрани ензими в различни процеси, изискващи участието на арабиноксиланразграждащи ензими.

Арабиноксилан разграждащ ензим от настоящето изобретение се прилага за лечение или за получаване на храна (напр. хляб), фураж или напитки (напр. бира и плодови сокове).

Арабиноксилан- разграждащият ензим се използва преимуществено при получаването и третирането на хартия и пулпа, по- специално в комбинация с ендоксиланази.

Като илюстрация в настоящето изобретение арабиноксилан разграждащият ензим се добавя към храната за животни, която е богата на арабиноксилан. При добавяне към фуража (включително силаж) за едностомашни животни (напр. домашни птици или свине), който съдържа зърнени храни като ечемик, пшеница, царевица, ръж или овес или продукти от преработката на зърнени храни като пшеничени или царевични трици, ензима значително подобрява разрушаването на расителните клетъчни стени, което води до по- добро усвояване на растителните хранителни вещества от страна на животните. Като следствие на това скоростта на растеж и/ или превръщането на фуража се подобряват. Нещо повече, разграждащите арабиноксиланите ензими могат да бъдат използвани за редуциране вискозитета на фуражните храни, съдържащи арабиноксилани.

Към фуража или силажа предварително могат да бъдат включени арабиноксилан разграждащи ензими ако се предпочитат предварително омокрени или влажни храни. Преимуществено, AXDA, продуцирани чрез настоящето изобретение продължават да хидролизират арабиноксилани във фуража in vivo.

Арабиноксилан разграждащи ензими се използват също при получаване на хляб както е показано в Пример 8.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛНА ЧАСТ

Щамове

Е. coli ВВ4 (Silvay et al., 1984):

el4 (mcrA) hsdR514, supE44, supF58, lacYl, Δ (laclZY) 6, galK2, galT22, metBl, trpR55, Δ (argF- lac) U169 [ F’, proAB, lacl’ ΖΔΜ15, TnlO, (tet')]

E. coli DH5a (Hanahan, 1983) :

supE44, AlacU169, (O801acZAM15), hsdR17, recAl, endAl, gyrA96, thi-1, relAl

E. coli LE 392 (Murray, 1977):

e!4 (mcrA) hsdR514, supE44, supF58, lacY 1, или A(laclZY) 6, galK2, galT22, metBl, trpR55

E. coli XL1- Blue MRF' (Jerpseth et al., 1992):

Δ (mcrA)183, Δ (mcrCB- hsdSMR- mrr) 173, endAl, supE44, thi-1, recAl, gyrA96, rel Al, lac, proAB, lacl’ ΖΔΜ15, TnlO, (let⁷)].

Aspergillus niger N400 (CBS 120.49)

Aspergillus niger N402 (csp Al) Goosen et al., 1987)

Aspergillus niger NW219 (leuAl, nicAl, pyrA6)

Вектори ф pBluescript SK +/-(Short, J. M , et al., 1988) pUC19 (Yaish- Perron et al., 1985)

Следните разтвори са изготвени no Sambrook et al. (1989):

Буфери: ТЕ, 50TAE, 20*SSC; хибридизация, 100*Denhardts, SM, ДНК натоварващ

Разтворът на Визниак се изготвя no Visniac and Santer (1957).

ПРИМЕРИ:

Пример 1; Изолиране,на ензима ** Пример 1. 1:

Пречистване и охарактеризирано на арабиноксилан деградираща активност A (AXDA) от A. niger var. tubigensis

A niger var tubigensis Ds 16813 се култивира както е описано в заявка за ЕР N 0 463 706 без дрождев екстракт и 2 % сурова пшенична арабиноксиланова фракция вместо зрял ксилан от овес. Клетките се отстраняват чрез филтрация и супернатантата се изсушава чрез ултрафилтрация.

За пречистването на AXDA, 5 грама от суровия ензимен препарат се разреждат в 100 ml 10 тМ Tris/ HCI с pH 8.0. Ензимният разтвор се филтрува (Seitz/supro по 250 и Setz/supro EKS) и се разрежда до крайна концентрация на протеина (Biorad протеиново изпитване) възлизащо на 5.2 g/1. Суровият ензим се фракционира чрез HPLC (Waters Preparative 650 Advanced Protein Purification System) върху DEAE TSK 650 (M) анийоно обменна колона (600 ml) ( скорост 25 ml/ min). Колоната се еквилибрира с 25 тМ Tris/HQ (pH 8. 0). Пробата (3g протеин) се прилага на колоната и се елуира с градиент на еквилибрационния буфер съдържащ 100 тМ NaCl. AXDA ензимът се елуира при концентрация на NaCl възлизаща на 53 тМ както е показано на фигура 1.

Пример 1.2; pH оптимум

За определянето на pH оптимума на AXDA суров ензимен препарат, се използват водно неразтворими соли (WIS) полимерни фракции на царевица като субстрат. 1. 6 mg от суровия ензимен препарат се добавят към 0.5 g WIS и се разреждат до 5 ml с буфер (100 тМ NaAc) довеждащ pH от 3. 40 до 7.65. Пробите се инкубират за 60 мин при 39°С и се центрофугират за 15 мин (2 800 g). Редуциращите захари в супернатантата се измерват с помощта на реагента на Sumner.

Получаване на Сумнеровия реагент: 10 g фенол се добавят към 22 ml 10% NaOH, обемът след това се довежда до 100 ml с деминерализирана вода Добавят се 10 g NaHSO₃. Към 70 ml от този разтвор се добавят 300 ml 4. 5% NaOH, последвано от 255 g K/Na тартарат и 800 ml 1% 3,5динитросалицилова киселина. Сместа след това се разбърква при стайна температура до разтваряне на химикалите.

Към 200 ml проба се добаВят 0.5 ml Сумнеров реактив и се вари в продължение на 10 мин. След охлаждане се добавят 5 ml деминерализирана вода. Екстинцията се измерва при 515 пт. Съдържанието на редуциращи захари в пробата се изчислява с помощта на калибрационна крива на ксилоза.

pH оптимумът за ензима е 5.0 както е показано на фигура 2.

Пример 1.3 : Амино киселинен състав

От фракциите AXDA на DEAE колоната, амино киселинният състав се измерва на PICO-TAG 150 ММ колона (откриване при 254 пт). Установен е следният състав :

амино-киселина	шМ	изчислен мол (¾.)
ASP	1.11	13.43
GLU	0.66	8.13
SER	1.00	12.113
GLN	0.00	0.00
GLY	0.84	10.25
HIS	0.12	1.30
ARG/ASN	0.18	2.12
THR	0.71	8.48
ALA	0.74	8.83
PRO	0.34	4.00
TYR	0.46	5.54
VAL	0.43	5. 06
MET	0.11	1.30
ILE	0.29	3.42

LEU

0.52

6.12

PHE

0.43

5.18

LYS

0.38

4.59

Таблица 1: Амино киселинен състав на AXDA

HPLC помпа: СМ4000; откриване М 440, 254 пт; инжектиране на 4 ul, Gilson 232; колона PICO- Tag 150 ММ; данни система Maxima.

Пример 1.4:

Биохимична характеристика (IEP и молекулно тегло)

IEP на AXD А се определя на минигел Pharmacia с pH 3- 9. Протеинът се оцветява със сребърен разтвор Pharmacia. IEP на AXDA ензима се определя на Pharmacia мини градиент SDS- гел (10-15%) и протеините се откриват чрез сребърно оцветяване (Pharmacia). Молекулното тегло на AXDA е измерено на 32 kDa.

Пример 1.5:

Съгласуване на протеина с арабиноксилан разграждаща активност А (AXDA) от A niger var. tubingensis

Пример 1. 5.1: Съгласуване на амино киселините на N- края на арабиноксилановата активност A (AXDA) на A. niger var tubigensis

Приблизително 1 nmol (« 30 pg) AXDA се подлагат на електрофореза върху 15% SDS- полиакриламиден гел, последвано от разслояване с електрически ток Върху мембрана Immubilon- Р (Millipore), съгласно метода, описан όχά Matsudaira (1987). Мембранният фрагмент съдържащ основната ивица с молекулно тегло (SDS- page) от 32 Kda се подлага на газово- фазно съгласуване (Amons, 1987) (SON facility, Leiden). Определена е следната последователност:

Lys- ?- Ala- Leu- Pro- Ser- Ser- Tyr (SEQIDNO: 1)

Пример 1. 5.2:

Определяне на амино киселинната последователност на CNBr пептида на арабиноксилан разграждаща активност A (AXDA)

Приблизително 2 nmolAXDAce подлагат на химично разграждане с CNBr. Приблизително 2 nmol (« 60 ng) AXDA се изсушават чрез замразяване и се ресуспендират в 60 μΐ 70% мравчена киселина, съдържаща 125 pg CNBr (2. 5 mg/ ml). Тази реакционна смес се инкубира на тъмно при стайна температура за 48 часа. Течността се изпарява в Speedvac, промива се със стерилна бидестилирана вода и се изпорява отново. Този етап на промиване се повтаря двукратно. След това реакционната смес се подлага на електрофореза върху 15% SDS- полиакриламиден гел, последвано от разслояване с електрически ток върху мембрана Immfbilon - Р (Millipore), съгласно метода, описан от Matsudaira (1987). Мембранният фрагмент, съдържащ основната ивица с молекулно тегло (SDS- page) от около 9 kDa се подлага на секвенционен анализ в газово- фазно секвениране (Amons, 1987) (SON facility, Leiden). Определена е следната последователност:

CNBr nenmug :

lie- Vai- Glu- Ala- lie- Gly- Ser- Thr- Gly- His- Arg- Tyr- Phe- (Arg/ Asn)(Ser)- (Phe)- (Thr) (SEQIDNO : 2)

Двусмислените амино киселини са дадени в скоби

Пример 2 : Ензимен профил на AXDA а- Арабинофуранозидазната активност се измерва върху параншпро фенил арабинофуранозиден субстрат (Sigma). Към 1 ml от субстрата се добавят 300 μΐ ензимен разтвор. След инкубация в продължение на 15 минути при 30°С, реакцията се спира с 5 ml Na₂ CO ₃ (5М). Екстинцията се измерва при 402 пт. а- арабинофуранозидазната активност се изчислява като отношението (обем * екстинция) / (Е* време).

Суровият ензимен продукт, съдържа а- арабинофуранозидазна активност от порядъка на 0.30 pNPAF U/mg. Арабинофуранозидазно активният пул съдържа 3. 0 pNPAF U/mg (виж фигура 1). Не са намерени други фракции с а- фуранозидазна активност, а- арабинофуранозидазно активният пул по- късно се тества на водно неразтворима полимерна фракция от царевица и в този субстрат не е измерена активност.

Това показва, че AXDA не притежава сс- арабинофуранозидазна активност върху паранитрофенилен субстрат.

В по- нататъшен опит да се идентифицира ензимната активност на AXDA, филтратите на култура от Aspergillus niger, трансформирани с axdAген на Aspergillus tubigensis се скринират за активност върху субстрат от пшеничен арабиноксилан. Генът на tubigensis се поставя под контрола на пируват киназен (гликолитична) промотор и условията за растеж се избират така, че да улеснят експресията на трансгена, заобикаляйки експресията на ендогенните арабиноза деградиращи ензими.

Съответно, определено е, че AXDA притежава арабинозоосвобождаваща активност на арабиноксиланови субстрати с високо молекулно тегло. Протеновото съдържание се определя с помощта на метода на Sedmak. Активността на AXDA се определя чрез добавяне на 100 μΐ от различни разреждания (в 10 mM Na- ацетатен буфер с pH 5.0) на ф културалните филтрати към 150 μΐ 50 mM Na- ацетат (pH 5.0) и 250 μΐ 0.

4% пшеничен арабиноксилан (Megazyme), и инкубация при 40 °C за един час. Реакцията се спира чрез нагряване на смесите в продължение на 10 мин при 100°С. Арабиноксилан разграждащите продукти се наблюдават с помощта на НРАЕС (високо ефективна анийонообменна хроматография), с помощта на инактивирани на горещо проби.

Резултатите са следните:

Таблица 0 Активност на Aspergillus tubigensis AXDA върху пшеничен арабиноксилан

Проба	Протеиново съдържимо (mg/100 mg)	Единици AXDA/ml	Специфична активност
А 3003 # 12 (сопс)	0.057	22.4	191.5
В 3003#15 (сопс)	0.064	31. 48	233.2
С 3003# 12 (perm)	♦	0.028	-
D 3003# 15 (perm)	4	0.032	-

@ Една единица арабинозофуранохидролазна активност се определя като количеството ензим, способно да освободи 1 рмол арабиноза от арабиноксилана за минута.

Заключението е, че AXDA ензимът от Aspergillus tubigensis притежава арабинофуранохидролазна активност (АХН).

Арабиназната активност се измерва с арабиназен тест кит от Megazyme съгласно инструкциите. В експериментите AXDA пула от DEAE колоната не показва активност върху линеарен арабинан.

Това показва, че AXDA не е арабиназа.

Ендоксиланазната активност се измерва върху овесен зрял ксилан. 10 ml 5% ксиланова суспенсия (100 тМ NaAc pH 3.5) се вари за 10 мин. След охлаждане, суспенсията се инкубира при 39°С за 10 мин. Реакцията стартира чрез добавяне на 0. 5 ml ензимен разтвор. След няколко периода на инкубация (5,10,15,20 и 25 минути), 1.5 ml проба от инкубираната смес се добавят към

1.5 ml деминерализирана вода и се вари за 10 мин. Пробите се центрофугират за 15 мин (2800 g). Редуциращи захари се откриват със Сумнеров реактив

W (Виж Пример 1. 2).

В пула на AXDA фракцията се установява ендоксиланазна активност, възлизаща на 399.0 U/mg. Ендоксиланазата и AXDA по- късно се тестуват в in vitro система за разграждане (виж Пример 6).

От това може да се заключи, че ендоксиланазната активност в AXDA фракционният пул е активност, която се асоциира с различна полипептидна активност. По- нататък, Kormelink (1992, PhD. Thesis, Chapter 6, ρ. 107, last two paragraphs and page 108) установява, че полипептид c етдо- ксиланаза се ко33 елюира с ензим, сходен на AXDA Това сочи, че AXDA не притежава ендо ксиланазна активност сама по себе си.

Пример 3 : Констуиране на сДНК експресионна библиотека

Пример 3.1: Индукция и изолиране на тРНК

Култура на A niger N400 се развива за 69 и 81 часа съответно, както е

описано в ЕРА 0 463 706 без дрождев екстракт и 2 % от суровата арабиноксиланова фракция вместо овесен зрял ксилан, след което мицелът се събира чрез филтруване и след това се промива със стерилен разтвор на соли. След това мицелът се замразява в течен азот, след което се развращава с Microdismembrator (Braun). Общата РНК се изолира от мицелната пудра по метод с участието на гуанидин тиоцианат / CsCl, описан от Sambrook et al. (1989), освен че РНК се центрофугира двукратно с помощта на CsQ градиент.Поли А* тРНК се изолира от 5 mg обща РНК чрез олиго(дТ)- целулозна хроматография (Aviv and Leder, 1972, Sambrook et al., 1989) със следните модификации: SDS се пропуска от всички разтвори и буфера за натоварване се замества с 9% (v/v) диметилсулфоксид.

Пример 3.2: Конструиране на сДНК библиотека сДНК се синтезира от 7 pg поли А* тРНК и се свързва в бактериофаа ламбда λ Uni- ZAP XR c помощта на кит за синтеза ZAP ™ - сДНК (Stratagene) съгласно инструкциите на производителя. След свързване на сДНК в Uni- ZAP XR векторни рамена, фагът ДНКсе опакова с помощта на екстракти Packagene ™ (Promega) съгласно инструкциите на производителя. Свързването на 120 ng сДНК 6 1. 2 pg векторни рамена и последващо опаковане на реакционната смес води до първична библиотека, състояща се от 3. 5 * 10⁴ рекомбинантни фаги. Тази първична библиотека се амплифицира с помощта на Е. coli XL1- Blue MRF, подлага се на титруване и се съхранява на 4°С.

Пример 4: Скрининг на сДНК библиотека от A niger N400 за (axdA) с антитела срещу AXDA и изолиране на сДНК клонове

Пример 4.1: Получаване на антитела срещу AXDA в заек

500 pg AXDA се подлагат на диализа срещу 1 тМ фосфатен буфер pH 7. 0 и се изсушава чрез охлаждане. Протеинът се ресуспендира в 1 ml стерилен PBS (0.136 М NaCI; 2.7 тМ КС1; 8 тМ Na₂ РО₄; pH 7.4). Към тази протеинова смес се добавя 1 ml пълен аджувант на Фройнд и се завърта 30 мин до получаване на стабилна емулсия. Тази смес се инжектира на заека субкутанно. На шестата седмица се дава бустер чрез инжектиране на 250 pg AXDA в 0. 5 ml стерилен PBS, към който се добавят 0.5 ml непълен аджувант на фройнд. На седмата седмица се взима кръв от заека и серумът

се тестува. На седмица 13 на заека се дава Втори бустер от 250 pg, последвано от повторно взимане на кръв на седмица 14. Тази процедура на бустери с един интервал от 6 седмици, последвана от кръвопускане може да бъде повторена няколко пъти.

Събраната кръв се инкубира за 30 минути при 37°С и след това се съхранява на 4°С за 16 часа. След центрофугиране при 5000 грт във високо скоростна центрофуга на Sorvall, серумът се събира.

Пример 4. 2: Имунологично изпитване на A niger N400 сДНК библиотеката с антитела срещу ΑΧΠΑ_π.₂

За скриниране на A. niger N400 сДНК библиотека, констуирана както е описано в Пример 3.2, за ахс!АсДНК клонове 5* 10³ pfu за паничка се посяват в NZYCM топааароза, съдържаща 0.7% ааароза върху 85- ттдиаметърни NZYCM (1. 5% ааар) панички както е описано (Maniatis et al., 1982, рр. 64) с помощта на Е. соК.

Направени са два репликата от всяка паничка върху нитроцелулозни филтри (Schleicher and Schull ВА85) както е описано от Sambrook et al (1989, ρρ. 12.16-12.17). AXDA_mg. се визуализира с помощта на антитела срещу пречистен AXDA_n7S (Пример 4.1) след имунооцветяване както е описано в

ЕРА 91205944. 5 (публикация No 0 463 706 Al). Имунологично оцветените плаки се идентифицират; одбрани са 8 позитивни плаки. Всяка позитивна плака се изтегля от паничката с помощта на Пастъорова пипета и фазите се елуират от агара в 1 ml SM буфер, съдържащ 20 μΐ хлороформ, както е описано от Maniatis et al. (1982, рр. 64). Получените фаги се филтруват чрез повтаряне на процедурата, описана по- горе с помощта на филтърни репликати от панички, съдържащи 50 -100 плаки от изолираните фаги.

След пречистване, фагите се размножават чрез посяване на 5х 10’ фаги върху среда NZYCM. След инкубация в продължение на една нощ при 37°С се получават сливащи се панички, от които се елуират фагите чрез добавяне на 5 ml SM буфер и съхраняването на паничките за 2 часа при 4°С с разклащане от време на време. След събиране на супернатантата с помощта на пипета, бактериите се отстраняват от пазтвора с помощта на центрофугиране при 4 000 х g за 10 мин при 4°С. Към супернатантата се добавят 0. 3% хлороформ и се определя броя на pfu. Този щок от фаги съдържа около 10¹⁰pfu/ml.

Пример 4. 3 : Рестрикционен анализ на axdA сДНК клонове

Рекомбинантните Uni- ZAP XR клонове, съдържащи axdA сДНК се превръщат в Bluescript фазови средства с помощта на суперинфекция с филаментозен хелперен фаа ExAssistкойто е включен в 21АР^Ш- сДНК кит за синтеза от Stratagene, съгласно инструкциите на производителя, фазовата ДНК съответно се изолира както е описано в Sambrook et al.

(1989, рр. 1.25-1.28).

Изолираната от 8 axdA сДНК клонове ДНК се подлага на рестрикционен анализ с помощта на следните рестрикционни ензими: EcoRI и XhoL ДНК се разгражда за 2 часа при 37°С 6 реакционна смес, съставена от следните разтвори: 2 pl (»lpg) ДНК разтвор; 2μ1 от подходящ 10* React буфер (BRL); 10U от всеки рестрикционен ензим (BRL) и стерилна дестилирана вода до получаване на обем от 20 μΐ. След добавяне на 4 μΐ ДНК натоварващ буфер, пробите се натоварват върху 0.7% ТАЕ- агарозен гел. ДНК фрагментите се разделят чрез електролиза при 80V за 1.5 часа.

Рестрикционният анализ показва, че axdA сДНК клоновете притежават размер на молекулите приблизително 1. 2 kb.

Пример 4. 4: Секвенционен анализ на axdA сДНК клонове от A niger

Първичната структура на сДНК клоновете се определя чрез секвенционен анализ в комбинация със специфични олигонуклеотиди като праймери в реакции на съгласуване.

Нуклеотидните последователности се определят чрез дидезоксинуклеотид верижна терминираща реакция (Sanger et al., 1977) с помощта на съгласуващ 17 ДНК полимеразата кит - Pharmacia. Компютърен анализ се осъществява с помощта на програмата PC/ GENE.

Пример 4.5 : Маркиране на фрагмент с Р^и

Изолира се фрагмент axdA от сДНК клон на A niger и се маркира както е описано 6 заявка за Европейски патент 91205944.5 (публикация No 0 463 706 Al, Примери 2.2 и 7.1, включен в литературната справка).

Пример 4. 6 : Скрининг на геномна библиотека на A niger var. niger за axdA ген и изолиране на гена

За скрининга на геномната библиотека на A niger var. niger, конструирана както е описана от Harmsen et al. (1990), за наличие на axdA гена, върху NZYCM топ- агарозен гел съдържащ 0.7% агароза се поставят Зх 10³ pfu. за паничка в пет 85- мм в диаметър NZYCM (1. 5% агар) панички, както е описано от Maniatis et al., 1982, pp. 64 с участието на Е. coli LE392 като бактерия за посявка.

След инкубация на паничките при 37°С за една нощ, се правят две препечатки от всяка паничка върху филтри на HybondN (Amersham) както е описано в Maniatis et aL (1982, pp. 320- 321).

След намокряне на в Зх SSC, филтрите се промиват за 60 мин на стайна температура в Зх SSC. филтрите се прехибридизират при 65°С за два часа в прехибридизационен буфер, съдържащ 6х SDS, 0.5% SDS, 10х разтвор на Denhardt, 0.01 М EDTAu 100 pg/ ml денатурирана на горещо спермална ДНК (Boeringer Mannheim). След два часа прехибридизиране, прехибридизационният буфер се замества от прехибридизационен буфер, който е идентичен на първия, но съдържа маркиран с Р^И фрагмент с размери 1.2 kb, съдържащ axdA с ДНК клон от A niger (виж Пример 4. 3), изготвен както е описано в Пример 4. 5. филтрите се хибридизират за 18 часа при температура 65°С.

След хибридизация, филтрите първо се промиват при 65°С в продължение на 30 минути в 2* SSCZ 0.1% SDS. След това филтрите се промиват при 65°С за 30 минути с 0.1/ SSD/ 0.1% SDS, последвано от последно промиване при 65°С за 30 мин в 0.1/ ЯЯЪл Изсушените на въздуха филтри се поставят върху парче хартия на Whatman ЗММ, маркировката на която е направена с радиоактивно мастило и Ватмановата хартия и филтрите се покриват сопаковка на Saran. Хибридизационните плаки се идентифицират чрез експониране на филм на Кодак XAR на рентгенови лъчи за 72 часа при -70°С с помощта на усилващ екран.

Установени са десет позитивни хибридизационни плаки, очевидно дуплики върху репликационните филтри. От тях са извлечени четири позитивни плаки с помощта на пипета на Пастъор и фазите се елуират от агаровата пресовка в 1 ml SM буфер, съдържащ 20 μΐ хлороформ, както е описано от Maniatis et а! (1982, рр. 64). Получените фаги се пречистват чрез повтаряне на процедурата, описана по- горе с помощта на филтерни реплики от панички, съдържащи 50 -100 плаки от изолираните фаги.

След пречистване, фазите се размножават чрез посяване на 5 х 10³ фаги върху среда NZYCM. След инкубиране в продължение на една нощ при 37° се получават слети плаки, от които фазите се елуират чрез добавяне на 5 ml SM буфер и съхраняване на плаките за 2 часа при 4°С и разклащане от време на време. След събиране на супернатантата с помощта на пипета, бактерията се отстранява от разтвора чрез центрофугиране на 4 000 х g за 10 минути при 4°С. Към супернатантата се добавят 0. 3% хлороформ и се определя броя на pfu. Този щок от фаги съдържа приблизително 10⁷ pfu/ ml.

Пример 4. Ί: Изолиране на ДНК от бактериофаг ламбда

Всеки от изолираните фази се размножава чрез комбиниране на

5*10® бактерии от Е. coli LE392 в 300 μΐ SM буфер с 2 * 10^б фааи и инкубиране при 37°С за 15 минути. След инкубационният период инфектираната бактерия се използва за инокулиране на 100 ml предварително затопла (на 37°С) NZYCM среда и след това се инкубира за 9 -12 часа при 37°С в ротационен шейкер New Brunswick при 250 грт,след който период бактерията лизира. Бактериалните дебриси се отстраняват чрез центрофугиране за 10 мин при 10 000 грт при 4°С във високо скоростна центрофуга на Sorvall. фагите преципитират от супернатантата, получена (100 ml) чрез добавяне на 10 g полиетиленгликол- 6000 и 11. 7 g Nad и съхраняване на разтвора в продължение на една нощ при 4°С.

Преципитираните фаги се събират чрез центрофугиране при 14 ОООх g при 4°С за 20 мин. Супернатантата се отстранява чрез изсмукване, а последните остатъци от течността се отстраняват с помощта на попивателна хартия, фагите внимателно се ресуспендират в 4 ml SM буфер и се екстрахират еднократно с еднакъв обем хлороформ.

Преди ДНК да бъде екстрахирана от частичките на фага, ДНК и РНК произхождащи от лизираната бактерия се отстранява чрез инкубиране на фаговата суспенсия с дезоксирибонуклеаза (Опаза) I и рибонуклеаза (Ипаза) А ( и двете 100pg/ ml) за 30 мин при 37°С. фаговата ДНК след това се освобождава от фагите чрез добавяне на EDTA до крайна концентрация 20 тМ докато протеинът се отстранява от разтвора чрез екстрахиране двукратно с еднакъв обем фенол/хлороформ/ изоамилов алкохол (25: 24:1). След разделяне на фазите с използване на центрофуга на Сорвал (14 ОООх g, 10 мин), водната фаза се екстрахира еднократно с еднакъв обем хлороформ/ изоамилоб алкохол (24:1). фазите се сепарират чрез центрофугиране след което ДНК се преципитира от водната фаза чрез добавянето на 0.1 обема 5 М натриев перхлорат и 0.1 обема изопропанол и инкубиране върху лед за 30 мин. ДНК се възстановява чрез центрофугиране за 10 мин при 4°С (14 ОООх g). Супернатантата се отстранява чрез изсмукване, след което ДНК се ресуспендира в 400 pl ТЕ буфер. ДНК се преципитира още веднъж от този разтвор чрез добавяне на 0.1 обема 3 М натриев ацетат и 2 обема етанол. ДНК се събира чрез центрофугиране за 10 мин при 4°С (14 000 х g). Супернатантата се отстранява чрез изсмукване, остатъка бързо се изсушава под вакуум, след което ДНК се ресуспендира в 125 pl ТЕ буфер, съдържащ 0.1 pg/ ml Рибонуклеаза А. Тази процедура на пречистване води до изолиране на приблизително 50 -100 pg ДНК от всеки фаг.

Пример 4. 8 : Southern анализ на axdA ДНК от A. niger var niger, съдържаща фаги

Изолираната ДНК от фагите до се анализира чрез Southern анализ с помощта на следните рестрикционни ензими: Kpnl; Sall; SstI; Xbal и Xhol и комбинациите Kpnl + Xbal; Kpnl + SstI u Kpnl + Xhol за пет часа при 37° в реакционна смес съставена от следните разтвори: 5 μΐ («1 pg) ДНК разтвор; 2 pl от подходящия 10 х реакционен буфер (BRL); 10 U рестрикционен ензим (BRL) и стерилна дестилирана вода за получаване на краен обем от 20 рк След разграждане, ДНК се преципитира чрез добавяне на 0.1 обема 3 М NaAc и 2 обема етанол. ДНК се събира чрез центрофугиране за 10 мин при стайна температура (14 000 х g). Супернатантата се отстранява чрез изсмукване, остатъка бързо се изсушава под вакуум и се ресуспендира в стерилна дестилирана вода. След добавяне на 4 pl ДНК натоварващ буфер, пробите се инкубират за 10 мин при 65°С и се охлаждат върху лед, преди натоварване на пробите върху 0. 6% ааарозен гел в ТАЕ буфер. ДНК фрагментите се разделят чрез електрофореза при 25 V за 15-18 часа

След електрофореза, ДНК се прехвърля и се денатурира чрез натриево вакуумно разслояване (VacuGene XI, Pharmacia LKB) върху найлонова мембрана (HybondN, Amersham) както е описано в ръководството за използване (рр. 25- 26) и след това се прехибридизира с помощта на белязан axdA сДНК клон от A. niger както е описано в Пример 4.6 и хибридизационни условия както е описано в Пример 3.3. Хибридизационните образци са получени чрез експониране на филм Кодак XAR- 5 на действието на рентгенови лъчи за 18 часа при 70°С с помощта на усилващ екран.

От получените резултати се заключава, че ДНК от всички четири изолирани клона се хибридизират с A niger axdA сДНК Във всички 4 клона са намерени фрагменти, произхождащи от същия геномен участък.

Пример 4. 9 : Субклониране на axdA гена от A. niger var niger

Фрагментът Xhol с размер 3.7 kb от се изолира от 0.7% агарозен гел по метода freeze- squeeze: След електрофореза, подходящата ивица се отделя и внимателно се разклаща 30 минути в 1 ml FS1 разтвор (0. 3 М NaAc pH 7.0; 1 тМ EDTA). Агарозните срези се прехвърлят към 5 ml епруветка на Епендорф с малка тапа от стъклена вата, обработена със силикон и отбор на дъното и се изсушават в течен азот. Епруветката от 0. 5 ml след това се прехвърля към 1. 5 ml епруветка на Епендорф с последващо центрофугиране за 10 минути. Към супернатантата се добавя 1/ 50 обем от FS2 разтвор (0. 5 М MgCl₂; 5% оцетна киселина) и 2. 5 обема 100% етанол.

След 20 минути инкубация при - 70°С, ДНК се събира чрез центрофугиране за 15 минути при 14 000*g при 4°С. След отстраняване на супернатантата, утайката от ДНК се изсушава с помощта на Savant Speedvac вакуумна центрофуга. ДНК се разтваря в 10 μΐ ТЕ буфер и концентрацията се определя чрез агарозна електрофореза с помощта на ламбда ДНК с позната концентрация като справка и оцветяване с етидиум бромид за откриване на ДНК.

Векторът Pbluescript SK, разграден с Xhol и дефосфорилиран с алкална фосфатаза се изготвя както следва: 1 μΐ (lpg/ μΐ) pBluescript се смесва с 2 μΐ 10* React 2 (BRL), Ιμΐ ( 1 U/ μΐ/) Xhol и 16 μΐ стерилна дестилирана вода. ДНК се разгражда за 2 часа при 37 °C, след което се добавят 0. 5 μΐ алкална фосфатаза (1 U/ μΐ) (Pharmacia), последвано от по- нататъшна инкубация при 37°С за още 30 минути. Линеарният вектор се изолира от 0. 7% агарозен гел както е описано по- горе.

Фрагментът Xhol с размер 3.7 kb се свързва В Xhol разграден, дефосфорилиран pBluescript SK' посредством следната процедура: 40 ng pBluescript фрагмент се смесва с 300 ng 3. 7 kb Xhol фрагмент и 4 μΐ 5* буфер за свързване (500 тМ Tris- Hcl, pH 7. 6; 100 тМ MgCl₂; 10 тМ АТф; 10 мМ дитиотреитол; 25% Са- HEPES pH 7. 0 буфер. 10 μΐ от разредената смес се използва за трансформиране на Е. coli DH5a компетентни клетки, получени както следва: 200 μΐ нощна култура на Е. coli DH5a предварително развивала се в LB среда (LB среда за 1000 ml: 10 g триптичен пепюн (BBL), 5 g дрождев екстракт (BBL), 10 g NaCl, 0.5 тМ Tris- Hcl pH 7.5). Тази култура се инкубира в орбитален шейкер при 37° докато нейната плътност стане съответна на О. D._60C от 0.15- 0. 2. Бактериите след това се събират чрез центрофугиране при 5000 грт при 4°. След отстраняване на супернатантата, клетките се съхраняват постоянно върху лед. Утайката от бактерииите се промива 8 100 ml 100 тМ MgCl₂,5 тМ Tris- HCI pH 7.4 чрез ресуспендиране на тези клетки, последвано от центрофугиране както е описано по- горе. Това се повтаря със 100 ml 100 тМ CaCI _г, 5 тМ Tris- Hcl pH 7.4. Накрая клетките се ресуспендират в 2 ml 100 тМ CaCI₂,5 тМ Tris - Hcl pH 7.4,14% глицерол. Аликвотите (50 pl) се използват незабавно или за трансформация или за замразяване при - 70°С.

Компетентните клетки Е. coli DH5a се използват в трансформационните експерименти чрез комбиниране на 50 р! от клетъчната супернатанта с 4. 5 pl от сместа за свързване. След 30 минутен инкубационен период върху лед, клетките се инкубират за 2 минути при 42°С. След това се добавят 1 ml от среда LB и клетките се инкубират при 37° за 1 час. След това бактериите се събират чрез центрофугиране при 14 000 g за 30 секунди. След отстраняване на супернатантата, клетките се ресуспендират в 200 μΐ среда LB. Получената в резултат бактериална суспенсия се посява върху среда LB, съдържаща 100 pg/ ml ампицилин, 50 pg/ ml X- gal и 60 pg/ ml IPTG.

Подбират се дванадесет от получените в резултат колонии, които се култивират в продължение на една нощ в среда LB, съдържаща 100 pg/ ml ампицилин. От културите се изолира плазмидна ДНК чрез метода на алкалния лизис, описан от Maniatis et al. (1982, рр. 368- 369), който се използва в рестрикционния анализ, както е описано в Пример 4. 3 за подбор на клон, пораждащ желания плазмид. Плазмидната ДНК се изолира в голям мащаб от 250 ml култури на Е. coli DH5a, съдържаща плазмида р1М3002, култивиран върху среда LB, която съдържа 100 pg/ ml ампицилин с помощта на кит Nucleobond PC- 500 (agel) съобразно инструкциите на производителя.

Плазмида pIM3002 по- нататък се анализира чрез рестрикционни ензими, за получаване на рестрикционна карта показана на фигура 4. Проба от Е. coli DH5a, съдържаща р1М3002 е депозирана на 28. август, 1995 6 CBS, Baam, The Netherlands, под номер CBS 637. 95.

Пример 4.10: Суперекспресия налонираният ген 6 A niger NW219

Пример 4.10.1: Въвеждане на A niger var. niger axdA B A niger NW219 чрез котрансформация

Плазмида р1М3002, получен В Пример 4. 9 се Въвежда 6 A. niger чрез котрансформация на A niger NW219 с помощта на A niger ругА като селектиВен маркер за плазмида pGW635 (Goosen etal., 1987) и плазмида ΡΪΜ3002 като котрансформиращ плазмид. Проба от A niger NW219 е депозирана на 25. август 1995 в CBS, Baam, The Netherlands, под номер CBS 635. 95.

Изготвят се протопласти от мицел чрез култивиране на A niger NW219 върху минимална хранителна среда, заместена с 0.5% дрождев екстракт, 0.2% казаминова киселина, 50 тМ глюкоза, 10тМ никотинамид и 10 тМ уридин за 18 часа при 30°С. Получаването на протопласти от A niger NW219 и трансформационната процедура се осъществяват както е описано от Goosen et al., 1987. Получените 8 резултат PYR ‘ трансформанти се анализират за експресия на axdA гена от A. niger var niger чрез Western blot анализ.

Пример 4.10.2: Скриниг на трансформанти за експресия на axdA гена на A. niger var niger

Трансформантшпе, получени 8 Пример 4.10.1 се анализират за формирането на axdA аенния продукт на A. niger var. niger, AXDA_MC протеина. Деветнадесет от тези трансформанти се използват за култивационния експеримент за анализ на АХОА_Ж експресията. Щамът А niger N402 се използва като див тип контрола. Трансформантите се култивират както е описано в пример 3.1, за 24,40,48 и 68 часа. След култивирането, мицелът се отстранява чрез филтрация и културалният

филтрат се анализира чрез разслояване no Westwni с помощта на антитела срещу АХОАпи в заек (Пример 4.1). По тази процедура е установено, че единадесет от деветнадесетте анализирани трансформанта суперпродуцират AXDA_MG.

Пример 4.11: Секбенционен анализ и описание на axdA аена на A. niger var niger

Последователността на гена axdA на A. niger var niger, неговият промоторно/ регулаторен участък, структурната част на гена и терминиращият участък, се определят чрез субклониращи фрагменти от р1М3002 в pBluescript SK“ и pUC19 в комбинация с приложението на специфични олигонуклеотиди като праймери в секвенционните реакции. Нуклеотидната последователност се определя както е описано в Пример 4.4 ( SEQIDNO: 5).

Получената последователност обхваща 2101 Ьр, 783 Ьр в 5’ некодиращият участък и 322 Ьр в 3’ в некодиращият участък. В 5’ некодиращият участък у намерена ТАТА кутия при позиции 665- 670. Кодиращата част на axdA гена A niger е 996 Ьр дълга и не е прекъсната от интрони. N- крайната последователност, както е определено в Пример 1. 5.1 се основава на AXD А протеин от A niger var. tubigensis, и се предшевства от препептид с дължина възлизаща на 26 амино киселини. Зрелият протеин е с 306 амино киселини в размер и притежава предсказуемо молекулно тегло от 33.101 kDa и теоретична изоелектрична точка 4. 07.

Пример 5.1: Клониране на сДНК фрагмент, съдържащ последователности наЛ. niger var. tubigensis, получени чрез PCR

Пример 5.1. 1: Генериране на сДНК фрагменти чрез PCR

Частичната амино киселинна последователност от вътрения CNBr фрагмент (SEQIDNO : 2) както е определена за AXDA^ се използва за конструиране на олигонуклеотидна смес. Получена е следната смес:

5’- ATG ATK GTI GAR ATK GG-3’ (20- MER) (SEQIDNO: 3), в който I означава инозид; К за А, Т или С и R за А или G. Този олигонуклеотид е получен от вътрешната амино киселинна последователност на AXDA^j, както е описано по- горе в Пример 1.4.2 от амино киселина 1 (I) до амино киселина 6 G. ATG е получен от метионина, за който се знае че се намира в N- края на пептидният фрагмент, поради механизма на CNBr.

Олигонуклеотидната смес се използва в PCR (Saiki et al., 1988) в комбинация с олигонуклеотид Т7 (Stratagene)

- AAT ACG ACT CAC TAT AG-‘ (17-mer) (SEQIDNO: 4 ) c помощта на сДНК, изолирана както е описана в Пример 4. 7.

За PCR, 2 μ1 от получената в резултат λ- сДНК се комбинирас 5 μΐ 10* реакционен буфер (100 тМ Tris- Hcl, pH 8. 3; 500 тМ Кс1; 15 тМ MgCI₂; 0.01% желатин); 4.0 μι 1. 25 тМ от всеки от четирите дезоксинуклеотид шрифосфаша и 0.5 pg от олигонуклеотидите 8 краен обем от 50 pL Реакционната смес се смесва и се добавят 0.5 pl TAQ полимераза (5 U/ pl) (НТ Biotechnology, Cambridge UK). ДНК се денатурира на аорещо чрез инкубиране за 3 минути при 95°С, последвано то 25 цикъла от по 1 минута при 95°С, 1 минута при 42°С и 1 минута при 72°С. След тези 25 цикъла, сместа се инкубира за 5 минути при 72°С. Анализът на реакционните продукти показва два дискретни продута от около 500 Ьр и 600 Ьр. На базата на

очевидно молекулно тегло от 32 kDa за AXDA и очевидно молекулно тегло от 9 kDa за CNBr пептида, фрагментът е в очакваните граници.

Пример 5.1. 2: Клониране и анализ на 500 Ьр и 600 bp PCR фрагменти Пример 5.1.2.1: Клониране на 500 Ьр и 600 bp PCR фрагменти

Както 500 Ьр, така и 600 bp PCR фрагмента се свързват в pGEM²- Т (Promega) вектор съгласно инструкциите на производителя. След инкубация в продължение на 16 часа при 14°С, 4. 5 μΐ от свързващата смес се използва за трансформиране на Е. coli DH5a компетентни клетки. Подбраните шест от получените в резултат на всяко свързване колонии се култивират за една нощ в среда LB, съдържаща 100 μΐ/ ml ампицилин. По метода на алкалния лизис от културите е изолирана плазмидна ДНК, както е описано от Maniatis et al., (1982, рр. 368- 369).

Пример 5.1. 2. 2: Секвенционен анализ на 500 Ьр и 600 bp PCR фрагментите

Първичната структура на двата 500 Ьр и 600 bp PCR фрагмента се определя чрез съгласуване на фрагментите както е описано в Пример 4.4.

Компютърен анализ на нуклеотидните последователности на двата PCR фрагмента показва, че 600 bp PCR фрагмента няма никакво сходство с познатите арабиноксилан разграждащи гени и поради това се отнася като PCR артефакт. Нуклеотидната последователност на 500 PCR фрагмента е много сходна с нуклеотидната последователност на сДНК клона, показана на фигура 4 от нуклеотид 706 до 1204.

Пример 5.2: Маркиране на 500 bp PCR фрагмента с Р³² фрагментът 500 Ьр, получен чрез PCR се изолира и бележи както е описано в заявка за Евопейски патент 91205944. 5 (публикация N 0 463 706 А1,

Примери 2. 2 и 7. 1, включен в литературната справка).

Пример 5. 3: Скрининг на геномна библиотека от A. niger var tubigensis за axdA ген

За скриниране на геномната билиотека на A. niger var tubigensis, конструирана както е описано в случая на заявка за Европейски патент 91205944. 5 (пубикация N 0. 463 706), Пример 2, за axdA ген 3 х 10³ pfu за паничка се посяват както е описано в Пример 4. 6, с PCR фрагмент, белязан с Р³², изготвен както е описано в Пример 5.1.1, като сонда.

Три от хибридизационните плаки, изявяващи се като дуплики върху репликационните фелтри, се идентифицират и се означават като λ_Λ4β3Α1 до Кьоаз- Фагшпе се изолират и размножават както е описано в Пример 4. 6.

Пример 5. 4 : Southern анализ на axdA ДНК отЛ. niger var tubigensis, съдържаща фаги

Изолира се ДНК от ламбда бактериофааи както е описано 8 Пример 4. 7. Изолираната ДНК от фазите λ_Λ4βί1 до λ_Λίβββ се анализира по метода на Southern с помощта на рестрикционните ензими: BamHI; EcoRI; HindHI;

Kpnl; Sall; SstI u Xhol. Анализът no Southern се провежда както е описано в Пример 4. 8.

От получените резултати се заключава, че ДНК от всичките три изолирани клона се хибридизира с axdA сДНК от A. niger var. tubigensis. Във всичките три клона са намерени фрагменти, произхождащи от същия геномен участък.

Пример 5. 5: Субклониране на axdA гена от A. niger var tubigensis

Изолира се SstI фрагмент с размер 5.5 kb от λ_ΛίίΠΒβ и се свързва във вектора р Bluescript SK SstI, разграден и дефосфорилиран както е описан в Пример 4. 9, което води до получаване на плазмид, обозначен като р1М3001. по- нататък този плазмид се анализира чрез рестрикционни ензими, което боди до получаването на рестрикционна карта, показана на фигура 6. Проба от Е. coli DH5a, който дава р1М3001 е депозиран на 28. август, 1995 в CBS, Ваят, The Netherlands, под номер CBS 636. 95.

Пример 5. 6 : Експресия на клонирания A niger var tubigensis axdA ген в A niger NW219

Пример 5. 6.1: Въвеждане на axdA гена от A niger var tubigensis в A niger NW219 чрез котрансформация

Плазмидът р1М3001, получен в Пример 5. 5 се въвежда в A niger чрез съпътстваща трансформация (котрансформация) на A niger NW219 както е описано в Пример 4.10.1. Получените P YR трансформанти след това се анализираш за експресията на axdA гена от A niger var tubigensis чрез Westwm blot анализ.

Пример 5. 6. 2: Скрининг на трансформанти за експресията на axdA гена на A niger var tubigensis

Трансформантите, получени в Пример 5. 6.1 се анализират за формиране на axdA генният продукт на A. niger var tubigensis, AXDA^ протеина. Деветнадесет от тези трансформанти се използват в култивационният експеримент за анализ на AXD А_П7В експресиятя. Щамът A niger N402 се използва като див тип контрола. Трансформантите се култивират както е описано на Пример 3.1 за 20,41,60 и 86 часа. След култивирането мицелът се отстранява чрез филтруване и филтрата от културата се анализира чрез разслояване no Westwm с помощта на антитела срещу AXDA^ у заек (Пример 4.1). Дванадесет от деветнадесетте анализирани трансформанта продуцират AXDA^ протеин както е установено по този метод.

Пример 5.7: Секвенционен анализ и описание на axdA гена от A. niger var tubigensis

Последователността на axdA гена, неговият промоторен / регулаторен участък, структурната част от гена и терминиращият участък, се определят чрез субклониране на фрагменти от р1М3001 в pBlueskript SK и pUC-19 в комбинация с употребата на специфични олигонуклеотиди като праймери в реакциите по съгласуване. Нуклеотидната последователност се определя както е описано в Пример 4. 4 (виж SEQIDNO: 7).

Получената последователност обхваща 2859 Ьр, 823 Ьр в 5’ некодиращият участък и 1041 Ьр в 3’ в некодиращият участък. В 5’

I некодиращият участък е установена СААТ кутия при позиции 651-655 и ί

TATA кутия при позиции 713- 720. Кодиращата част от axdA аена на A nier var. tubigensis е дълъг 996 bp и не се прекъсва от интрони. Генът кодира протеин 6 размер на 332 амино киселини. N- крайната последователност, както е определена в Пример 1.5.1, се предшевства от препептид в размер

на 26 амино киселини. Зрелият протеин се състои от 306 амино киселини и притежава предсказано молекулно тегло от 33. 250 kDa и теоретична изоелектрична точка 4. 20.

Пример 6. Разграждане in vitro на царевица с AXDA

Пример 6.1 Изолиране на водно неразтворими соли (WIS)

За системата за разграждане in vitro се изолира неразтворима полимерна фракция от царевица Царевицата се смила на мелница на Retch и се обезмаслява с хексан за 6 часа След обезмасляване, царевицата се изсушава на 105°С и се смила отново (1 тт, мелница Retch). Към 400 g от смляната царевица се добавят 1. 51,1.5% SDS/ 0.05% β-меркаптоетанол и се бърка на стайна температура за 1 час (за разрушаване на протеините) след което се провежда центрофугиране за 15 минути при 24 000 g. След денатуриране на протеина утайката се промива трикратно с 11SDS/ β- меркаптоетанол и два пъти с 11 деминерализирана вода. Утайката се ресуспендира в 41 деминерализирана вода и се пресява през сито с размер 32 рт. Процедурата по промиването и пресяването се повтаря. Суровата WIS фракция от утайката (по- голяма от 32 цт) се разтваря в 11 малеатен буфер (pH 6. 5) и се инкубира на 90°С за 50 мин. Добавят се 2 mg ос- амилаза (Махату1^И/ Gist52 brocades) u се инкубира за 16 часа при 30°С, след което се центрофугира за 15 минути (24 000 g). Ензимното разграждане се повтаря, след което утайката се промива три пъти с деминерализирана вода при 65°С Утайката (WIS) се изсушава чрез замразяване. WIS съдържа 30 % ксилоза, 29% арабиноза, 23% глюкоза и 7% галактоза. Определената глюкоза не представлява нишесте (Boeringer Mannheim, starch test kit).

Пример 6.2 In vitro разграждаща система на домашни птици

Съдържанието на сухото вещество от WIS се определя (95. 73%) посредством определяне на теглото на WIS преди и след изсушаване при 120°С. В in vitro разграждащата система на домашни птици, към 1 g от WIS се добавят 200 μ NaN3 (Merck) и 1т1 вътрешен стандарт (сорбитол; 35 mg/ ml, Sigma). За ензимното разграждане на зърното (със (200 pg протеин) или без ензим), пробата се запълва с буфер (NaAc, pH 5. 5) до 15 ml и се инкубира при 39°С за 1 час. За разграждане на стомашното съдържимо се добавят 5 ml пепсин (5. 28 g/1, pH 3.0; Mwrck) и се инкубира в продължение на 1. 5 часа при 39°. За разграждане на чревното съдържимо се добавят 2.5 ml панкреатин/ жлючни соли (16 g/1, 0.1 g/1 съответно; Merck) и се инкубира в продължение на 1. 5 часа при 39°С. Пробата се центрофугира за 15 мин (2800 g). Супернатантата се използва за измерване на монозахари (HPLC, Spectra Physics; НРХ- 87Р колона, Biorad) които се освобождават по време на ензимното разграждане. Утайката се изсушава при 120°С и се определя теглото. Процента на сухата материя се изчислява

Като контрола в in vitro системата се добавя доза отговор на суровия ензимен препарат (резултатите са показани на фигура 3). AXDA ензима (добавят се 200 pg от AXDA протеина) показва относително повишение на разграждането на сухото вещество в сравнение с празната проба.

Процента на разграждане на сухото вещество, възлизащ за WIS фракцията от царевица представлява повишение от 4.1% спрямата празната проба от царевична WIS.

Пример 7: Експеримент с царевично WIS относно in vitro възможността за разграждане

Пример 7.1: Изолиране на царевични WIS

Изолирането на царевични WIS се осъществява както е описано 6 пример 6 с някои модификации, дължащи се на инкубиране с SDS/ меркапто етанол, което може да не се използва за храна на животни. Процедурата по изолирането се осъществява върху 1 kg обезмаслена царевица. Към 1 kg от обезмаслената царевица се добавят 4 g папаин (Gist- brocades) / 100 g царевичен протеин и суспендира при 30°С за 2 часа. След това суспенсията се разгражда с Maxamyl™ (Gist- brocades) (2 ml/1) при 100°C и се центрофугира (15 мин 24 000 g). Супернатантата се отстранява и процедурата по ензимното разграждане се повтаря върху утайката. Суспенсията отново се центрофугира и промива трикратно с деминерализирана вода (11). След промиване, утайката (водно неразтворими соли) се изсушава чрез замразяване.

Моно/ олиго захаридното съдържимо в царевични WIS се определя чрез анализ с трифлуор оцетна киселина (TFA). Към 0.3 g WIS се добавят 1 ml 35 mg/ ml сорбитол (вътрешен стандарт), 2 ml деминерализирана вода и 450 μΐ TFA, последвано от хидролиза за 1 час при 120°С. След охлаждане се добавят 20 ml деминерализирана вода и хидролизирането продължава за 1 час при

120°С. След охлаждане пробите се изсушават чрез замразяване и ресуспендират в 3 ml деминерализирана вода. Монозахаридите се отстраняват върху НРХ- 87Р колона (Biorad) в HPLC система (Spectra Physics). WIS полимерната фракция от царевица съдържа: 124. 8 mg/ g ксилоза; 96. 6 mg/ g арабиноза; 28.2 mg/ g галактоза и 156. 0 mg/ g глюкоза. Поради високото съдържание на глюкоза WIS фракцията се анализира за скорбяла (тест кит за скорбяла, Boeringer Mannheim). Във WIS фракцията не е установено съдържание на скорбяла).

Пример 7.2: Ексеримент за разграждане с бройлери

Проведен е експеримент за установяване въздействието на ензимна AXDA върху действителното енергитично съдържание на метаболити с диета, която предвижда добавка на 20 % WIS от царевица. Използваният метод е модифицирана “ sibbald- проба”.

Мъжки бройлери (на възраст 3 седмици) се отглеждат индивидуално в клетки в помещение с контролирана околна среда. Животните се оставят без храна в продължение на 48 часа. След това се дава точно определено количество фураж с тръба. За корекция на загубата на ендоенергитични компоненти, в експеримента се включва контролна група. Животните се хранят с 10 g D- глюкоза, докато другите получават 10 g фураж, фураж се дава на 6 животни Контролираната за глюкоза група се състои от 5 животни

Животните се оставят да гладуват за още 48 часа, по време на които се събира цялото количество екскременти. Последните се съхраняват при 20°С докато се провеждат анализите. За целия период на изследване на животните се дава достъп до вода само веднъж и само веднъж им се дава вода с тръбата.

Събраните екскременти се изсушават чрез замразяване и се претеглят след еквилибриране на въздуха. Пробите от фуража и пробите от сухите екскременти се анализират за азотно и енергийно съдържимо.

Резултатите от контролните животни се използват за корекция на резултатите от изхранването на животните с експерименталната диета. Приложеният метод е адаптация на методиката на експеримента, описан от McNab и Blair, 1988. Там са описани методите за анализ и изчисляване.

Представени са начините за измерване възможността за in vitro разграждане съгласно метода, описан в Пример 6. 2.

Експериментите се провеждат както следва:

I основна храна царевица (таблица 2)

П основна храна царевица + 10% царевични WIS

III основна храна царевица + 20% царевични WIS

IV основна храна царевица + 20% царевични WIS + 100 mg/ kg AXDA

V основна храна царевица + 20% царевични WIS + 45 mg/ kg суров ензим

VI основна храна царевица + 20% царевичини WIS + 90 mg/ kg суров ензим

VII царевична основна храна + 20% царевични WIS + 200 mg/ kg ендоксиланаза.

Съставът на основната диета е даден на Таблица 2.

Таблица 2 : Състав на основната диета, използвана в експеримента

основно съдържание на фуража	състав (%)
царевица	50.00
тапиока	19. 69
соево брашно (50% суров протеин)	19. 45
месокостно брашно	3.60
грах (22. 8% ср)	3. 50
рибно брашно	1.0
соево масло	1.0
брашно от пера (хидролизирано)	1.0
монокалциев фосфат	1.23
варовик	0.90
сол	0.30
L- лизин. НС1	0.13
DL- метионин	0.20
витаминно/ минерален премикс*	1.0

* Витаминно/ минералният премикс, разпределен за kg от фуража: рибофлавин, 4mg; ниацин, 40 mg; d- пантотенова киселина, 12 mg; холинхлорид, 500 mg; В12,15pg; КЗ, 5 mg; ретинилацетат, 3. 44 mg; холекалциферол 50 pg; биотин, 0.1 mg; фолиева киселина, 0.75 mg; FeSO₄.7Н2О, 300 mg; МпО2,100 mg; CuSO4. %H20.100 mg; ZnSO4.7H20,150 mg; Na2SeO3,0.15 mg; антиоксидант, 100 mg и виргиниамицин, 20 mg.

Резултатите (действителниата метаболитна енергия, коригирана за азот (ТМЕп) и резултатите от in vitro изследването) са дадени на Таблица 3.

Таблица 3 : Действителна метаболитна енергия (коригирана за азот: ТМЕп) и възможност за разграждане in vitro

третиране	добавен ензим	ТМЕп (KJ/g)	in vitro разграждане (%)
I	-	13. 59 а*)	36.4
П	-	12.39 b	36.2
Ш	-	11.17 с	31.9
IV	AXDA	12.37	39.7
V	суров ензим	11. 87 Ьс	31.4
VI	суров ензим	11. 63 Ьс	33.2
VII	ендоксиланаза	11. 95 b	32.6

*) Остатъчна стандартна грешка: 0.42

LSD (5%): 0.76

ТМЕп - степени с различни букви са значително различни (Р< 0. 05) съгласно LSD-mecma

Нивото на ТМЕп се повишава значително с повишаване на количеството добавяни WIS от царевица.

Всички ензимни препарати подобряват степените на ТМЕп, но само за ендоксиланаза (+ 7. 0%) и AXDA (4-10. 7%) те са значими. AXDA повишава степента на енергията до нивото на основния фураж, заместен с 10 % царевични WIS.

В модела in vitro (симулиращ процеса на разграждане у пилета), AXDA подобри разграждането на сухото вещество значително (+ 24. 5%). Ендоксиланазата и суровия ензим в този модел не са така ефективни както AXDA

Пример 8: AXDA при печенето на хляб

AXDA се тестува 8 тест за печене на кравайчета, използвайки тънки хлебчета. Кравайчетата се пекат от парчета тесто по 150 g, получено чрез замесване на 200 g брашно (Robijn“/ Columbus' 80/ 20), 104 ml вода, 1. 4 g сухи хлебни дрожди (Fermipan') 4 g сол, 3 g захар, 400 mg СаС1₂.2Н₂ О, 3 mg (15 ppm) аскорбинова киселина и 5 mg (25 ppm) гъбна алфа амилаза (Fermizyme' Р200) и 25 ug пречистена AXDA След омесване за 6 мин и 15 s при 52 грт, тестото се разделя, оставя се да набухне за 45 мин при 30°С, бие се, набухва за още 25 мин, формира се и се поставя в съдовете. След последното набухване за 70 мин при 30°С, тестото се пече за 20 мин при 225°С. Обемът на кравайчетата нараства от 490 ml (контрола) до 535 ml за тези, съдържащи AXDA - т. е. повишение от 9%.

ЛИТЕРАТУРНА СПРАВКА

Amons, R. (1987), FEBS left., 212:68- 72.

Carre, B. and BrillouetJ. M. (1986), J. Science and Food Agric. 37:341- 351.

Chesson, A. (1987), Recent Advances in Animal Food Nutrition.

Goosen, T. et cd. (1987) Curr. Genet. 11: 499- 503.

Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol. 166:557.

Harmsen, J. A. M et al., (1990) Curr. Genet. 18:161-166

Haresign, W. and Cole D. J. A., eds. Butterworth, London, 71- 89.

Jerpseth, B. ,et al (1992), Strategies 5: 81- 83

Maniatis T., E. F. Fritsch, J. Sambrook (1982): Molecular cloning, a Laboratory

Manual; Cold Spring Harbor Lab., New York.

Matsudaira, P. (1987), J. Biol. Chem., 262:10035-10038.

McCleary, В. V. and Matheson, N. K (1986), Adv. Carb. Chem. and Biochem. 44:147276.

McNab, J. M. and Blair J. C. (1988), British Poultry Science 29: 697- 707.

Murray, N. (1977), Mol. Gen. Genet. 150:53- 58

Saiki R. K etal. (1988), Science, 239, 487- 491

Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989). In: Molekular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edn., Cold Spring Harbor Labatory Press, NY.

Sanger, F., Nickelen, S. and Coulson, A. R. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 74: 5463-5467

Sdvay, T. J., Berman, M. L., and Enquist, L. W. (1984) Experiments with gene fusions, Cold Spring Harbor Labatory: New York, pp. xi- xii

Short, J. M. et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16: 7583- 7600.

Visniac, W and Santer, M. (1957), Bact. Rev. 21:195- 213

Yanishperron, C. etal. (1985) Gene33,103-119.

СЕКВЕНЦИОНЕН ЛИСТИНГ (1) ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ (i) ЗАЯВИТЕЛ (A) ИМЕ: Gist - Brocades В. V.

(B) УЛИЦА: Waterinsweg 1 (C) ГРАД : Delft (E) ДЪРЖАВА: The Netherlands (F) ПОЩЕНСКИ КОД (ZIP) : 2611 X (ii) ЗАГЛАВИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО: Ензими разграждащи арабиноксилана (iii) БРОЙ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ: 8 (iv) КОМПЮТЪРНОЧИТАЕМАФОРМА:

(A) СРЕДЕН ТИП: флопидиск (B) ДЪЛЖИНА: IBM PC compatible (C) ОПЕРАТИВНА СИСТЕМА: PC-DOS/MS- DOS (D) СОФТУЕР: Patentin Realise #1.0, Version #1.25 (EPO) (2) ИНФОРМАЦИЯ 3A SEQ ID NO: 1:

(i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА:

(A) ДЪЛЖИНА: 8 амино киселини (B) ТИП: амино киселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП : пептид (iii) ХИПОТЕТИЧНОСГ: няма (iv) АНТИ- СМИСЛЕНОСТ: няма (v) ТИП НА ФРАГМЕНТА: N- краен (vi) ИЗТОЧНИК НА ПРОИЗХОДА :

(A) ОРГАНИЗЪМ: Aspergillus niger var. tubigensis (B) ЩАМ : DS16813 xaa= cys (xi) ОПИСАНИЕ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 1 Lys Xaa Ala Leu Pro Ser Ser Tyr

5 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 2:

(i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА:

(A) ДЪЛЖИНА: 17 амино киселини (B) ТИП : амино киселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: nenmug (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: няма (iv) АНТИ-СМИСРЕНОСТ: няма (v) ТИП НА ФРАГМЕНТА: вътрешен (vi) ИЗТОЧНИК НА ПРОИЗХОДА :

(A) ОРГАНИЗЪМ : Aspergillus niger var. tubigensis (B) ЩАМ : DS16813

ХАРАКТЕРИСТИКА:

(A) ИМЕ / КЛЮЧ: амино киселинен остатък (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ : 14 (D) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ: Arg или Asn ХАРАКТЕРИСТИКА:

(A) ИМЕ / КЛЮЧ: амино киселинен остатък (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 15 (D) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ : остатък = неопределен ХАРАКТЕРИСТИКА:

(A) ИМЕ / КЛЮЧ: амино киселинен остатък (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ : 16

(D) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ: остатък = неопределен (ix) ХАРАКТЕРИСТИКА:

(A) ИМЕ/КЛЮЧ: амино киселинен остатък (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 17 (D) ДРУГА ИНфОРМАЦИЯ: остатък = неопределен (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 2:

Пе Vai Glu Ala He Gly Ser Thr Gly His Arg Tyr Phe Xaa Ser Phe Thr 15 10 15 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 3:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА :

(A) ДЪЛЖИНА: 20 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (аеномна) (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: няма (iii) АНТИ- СМИСЛЕНОСТ: няма (vi) ИЗТОЧНИК НА ПРОИЗХОДА:

(A) ОРГАНИЗЪМ : Aspergillus niger var. tubigensis (B) ЩАМ : DS16813 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID NO: 3: ATGATKGTIG ARGCIATKGG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 4:

(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:

(A) ДЪЛЖИНА : 17 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна

(D) ТОПОЛОГИЯ : линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: няма (iii) АНТИ-СМИСЛЕНОСТ: няма (vi) ИЗТОЧНИК НА ПРОИЗХОДА:

(A) ОРГАНИЗЪМ : Aspergillus niger var. tubigensis (B) ЩАМ: DS16813 (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ ID NO: 4: ф AATACGACTC ACTATAG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 5:

(i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА:

(A) ДЪЛЖИНА: 2101 двойки бази (B) ТИП : нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ; едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП : ДНК (геномна) (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: няма €(iii) АНТИ-СМИСЛЕНОСТ: няма (vi) ИЗТОЧНИК НА ПРОИЗХОДА:

(А) ОРГАНИЗЪМ : Aspergillus niger (В) ЩАМ: CBS 120.49 (к) ХАРАКТЕРИСТИКА:

(А) ИМЕ/КЛЮЧ: ТАТА_ сигнал (В) ЛОКАЛИЗАЦИЯ : 665.. 670 (к) ХАРАКТЕРИСТИКА:

(А) ИМЕ/КЛЮЧ: cds (В) ЛОКАЛИЗАЦИЯ : 784.. 1779 (Д) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ : / продукт = “ензим разграждащ арабиноксилана” ген = “axdA” / стандартно име = “ арабино ксилан разграждащ ензим” iix) ХАРАКТЕРИ СГИ KA:

( А) ИМЕ ^; КЛЮЧ : еиг _ пептид

Ш) ЛОКАЛИЗАЦИЯ :>784.. 861 · (ix) ХАРАКТЕРИСТИКА:

I А) И МЕ - КЛЮЧ : мат_ пептид ! В ί ЛОКАЛИЗАЦИЯ : S62 .. 1778

txi) ОПИСАНИЕ НА ПОСАЕДОЕЛ!ЕЛНОСГ! A : SEO Ю NO: 5:

V. » t

Ч

CTGATTGGGA TTCTGCAGGA ATTCTCTGGG GTATGCCAAA AAAGTATACC GACCTGTAAA 60 AGTCCAACCA GTTCGAAATT ACTAACAATA TGTTTTTGAT CAGGATATCT TTGGCATCTA 120 TGGTGAGAGC САТАТСАТСА ТСТСГТСТТС CGGCAGCTGT CAACTGCCTG CCGAAAGTAC 180 TGGAAGCCAT TGTGTTTTAA GGTGAAACAA GATCAGGGCG GCTATGTGTC AGGGTAGAAC 240 CAGTTTGCTT AGCGCCATCA GGGTCCACGT CTAGACTTTC GATGCCCGGA GTTATTCGCC 300 TTCCCACAGC AGTCATTTCC CCGAATCTAA ACCGATGGAC GGATATTGTG GTGTAATGAT 360 AGAACAACAC GGTGTAGTGT AGTTTTAAGT GCCGTGCTAG ACACGGCAAC GTTCCGGTGG 420 GCGATTGTTT CTGGCTAATG TACTCCGTAG TTTAGGCAAC AGGCCGATCA ТСТТСССССА 480 TAGGAAAGGA CCCTGAATAG TGCGTCAAAA AGAGCTTGAG GCAAAGGAGG ACTGCACTTT 540

CCAAGGCCGA AGTGGGGGGG GGGGATAACC AAGCAGCCCA АСТТТТАТСС GAAACCTTTC 600 AGGTGTCATC TAATTTGGAT AAATCCGGAT TGTTCTTCGG CATATGTGGA TGTCACCATG 660 AGCCATAAAT ACAAATATCT GGACAAGCTG TTGCCCTTTG TTCAAGTTAT TCGTTCTCTG 720 TGGACCACGA ТСССААССАТ TGATCTCTTT TGTTTGTTCC TCAGCGGATA AAGTCATACG 780

ААА

ATG AAA

TTC CTC AAA Phe Leu Lys

GCC AAG GGT AGC TTG CTG TCG TCT GGC ATA

828

Met

Lys -25

Ala Lys -20

Gly

Ser

Leu Leu

Ser -15

Ser Gly

lie

ТАС

CTC

ATT

GCA

TTG

GCC

CCC

TTT

GTC

AAC

GCA

AAA

TGC

GCT

CTT

CCG

876

Туг

Leu

lie

Ala

Leu

Ala

Pro

Phe

Vai

Asn

Ala

Lys

Cys

Ala

Leu

Pro

-10

-5

1

5

TCG

ACA

TAT

AGT

TGG

ACT

TCG

ACC

GAT

GCT

CTC

GCC

ACC

CCA

AAG

TCC

924

Ser

Thr

Tyr

Ser

Trp

Thr

Ser

Thr

Asp

Ala

Leu

Ala

Thr

Pro

Lys

Ser

Го

15

20

GGA

TGG

ACT

GCA

CTC

AAG

GAC

TTC

ACC

GAT

GTC

GTC

TCT

AAC

GGC. AAA

972

Gly

Trp

Thr

Ala

Leu

Lys

Asp

Phe

Thr

Asp

Vai

Vai

Ser

Asn

Gly Lys

25

30

35

CAT

ATT

GTC

TAT

GCG

TCC

ACT

ACC

GAC

ACA

CAG

GGA

AAT

TAC

GGC

TCC

1020

His

lie

Vai

Tyr

Ala

Ser

Thr

Thr

Asp

Thr

Gin

Gly

Asn

Tyr

Gly

Ser

40

45

50

ATG GGC TTT GGC GCC

TTT TCG GAC TGG TCG GAC ATG GCA TCC GCT AGT

1068

Met Gly Phe

Gly

Ala

Phe Ser 60

Asp

Trp

Ser Asp

Met 65

Ala

Ser

Ala Ser

55

CAA

ACG

GCC

ACA

AGC

TTC

AGC

GCC

GTA

GCT

CCA

ACC

TTG

TTC

TAC

TTC

1116

Gin

Thr

Ala

Thr

Ser

Phe

Ser

Ala

Vai

Ala

Pro

Thr

Leu

Phe

Tyr

Phe

70

75

80

85

CAG

CCA

AAG

AGT

ATC

TGG

GTT

CTG

GCC

TAC

CAA

TGG

GGC

TCC

AGC

ACT

1164

Gin

Pro

Lys

Ser

lie

Trp

Vai

Leu

Ala

Tyr

Gin

Trp

Gly

Ser

Ser

Thr

90

95

100

TTC

ACC

TAC

CGC

ACC

TCT

•CAA

GAT

CCC

ACC

AAT

GTC

AAC

GGC

TGG

TCA

1212

Phe

Thr

Tyr Arg

Thr

Ser

Gin

Asp

Pro

Thr

Asn

Vai

Asn

Gly

Trp

Ser

105

110

115

TCC

GAG

CAA

GCT

CTT

TTC

ACG

GGC

AAA

ATC

AGC

GGC

TCA

AGT

ACC

GGT

1260

Ser

Glu

Gin

Ala

Leu

Phe

Thr

Gly Lys

He

Ser

Gly

Ser

Ser

Thr

Gly

120

125

130

GCC

ATT

GAT

CAG

ACT

GTG

ATT

GGT

GAT

GAT

ACG

AAT

ATG

TAT

CTT

TTC

1308

Ala

He

Asp

Gin

Thr

Vai

He

Gly Asp

Asp

Thr

Asn

Met

Tyr

Leu

Phe

135

140

145

TTT

GCC

GGC

GAC

AAT

GGC

AAG

ATC

TAC

CGA

TCC

AGC

ATG

TCT

ATC

AAT

1356

Phe

Ala

Gly Asp

Asn

Gly Lys

lie

Tyr

Arg

Ser

Ser

Met

Ser

He

Asn

150

155

160

165

GAC

TTC

CCC

GGA

AGC

TTC

GGC

AGC

CAG

TAC

GAG

GAG

ATC

CTC

AGC

GGC

1404

Asp

Phe

Pro

Gly

Ser

Phe

Gly

Ser

Gin

Tyr

Glu

Glu

He

Leu

Ser

Gly

170

175

180

GCG

ACC

AAC

GAT

TTG

TTC

GAG

GCG

GTC

CAA

GTG

TAC

ACC

GTC

GAC

GGC

1452

Ala

Thr

Asn

Asp

Leu

Phe

Glu

Ala

Vai

Gin

Vai

Tyr

Thr

Vai

Asp

Gly

185

190

195

GGC

GAG

GGT

GAC

AGC

AAG

TAC

CTC

ATG

ATC

GTC

GAG

GCG

ATC

GGT

TCC

1500

Gly

Glu

Gly Asp

Ser

Lys

Tyr

Leu

Met

He

Vai

Glu

Ala

He

Gly

Ser

200

205

210

ACC

GGA

CAT

CGT

TAT

TTC

CGC

TCC

TTC

ACG

GCC

AGC

AGT

CTC

GGC

GGA

1548

Thr

Gly

His

Arg

Tyr

Phe

Arg

Ser

Phe

Thr

Ala

Ser

Ser

Leu

Gly Gly

215

220

225

GAG

TGG

ACA

GCC

CAG

GCG

GCA

AGT

GAA

GAT

CAA

CCC

TTC

GCG

GGC

AAA

1596

Glu

Trp

Thr

Ala

Gin

Ala

Ala

Ser

Glu

Asp

Gin

Pro

Phe

Ala

Gly

Lys

230

235

240

245

GCC

AAC

AGT

GGC

GCC

ACC

TGG

ACC

GAC

GAC

ATC

AGT

CAT

GGT

GAC

TTG

1644

Ala

Asn

Ser

Gly

Ala

Thr

Trp

Thr

Asp

Asp

He

Ser

His

Gly Asp

Leu

250

255

260

GTT

CGC

AAC

AAC

CCT

GAT

CAA

ACC

ATG

ACG

GTC

GAT

CCT

TGC

AAC

CTC

1692

Vai

Arg

Asn

Asn

Pro

Asp

Gin

Thr

Met

Thr

Vai

Asp

Pro

Cvs

Asn

Leu

265

270

275

CAG

CTT

CTC

TAC

CAG

GGC

CAT

GAC

CCC

AAC

AGC

AAT

AGT

GAC

TAC

AAC

1740

Gin

Leu

Leu

Tyr

Gin

Gly

His

Asp

Pro

Asn

Ser

Asn

Ser

Asp

Tyr

Asn

280

285

290

CTC

TTG

CCC

TGG

AAG

CCA

GGA

GTT

CTT

ACC

TTG

AAG

CAG

TGAAAGGCTT

1789

Leu

Leu

Pro

Trp

Lys

Pro

Gly

Vai

Leu

Thr

Leu

Lys

Gin

295

300

305

ATCATTTGGT	TGCAGACCGG	GGTTTTCTTC	CCCTTCCTTG	AGTAGTATTG	TTGGTGGAAG	1849
ACAGCGGGAT	GGGGAGTGAA	TACTATCTTG	GGCTCAATTG	AGGTGGAATC	CTGTCAGACT	1909
GTGTACATAG	GCTACATGCG	AATGATTTGG	TTTATTCACA	AATAGTATTA	ACAGATAGTG	1969
TAGTATACAC	CTCTGTATTC	ACAGGTGATA	GCCTGTCTAC	TAGTAGTAGA	GATGTGGCTC	2029
GAGATGACTG	CACGTGATGA	TCACATCATC	ATCATCGCAG	TCGCTCACGC	GACAGTCTCA	2089
GACACACACA	TA					2101

(2) ИНФОРМАЦИИ ЗА SEQ ID NO: 6:

i i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА :

(A) ДЪЛЖИНА : 332 амино киселини (B) ТИП : амино киселина (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна ( ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: протеин (xi) ОПИСАНИЕ НА ГЮСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 6:

Met

Lys -25

Phe

Leu Lys Ala

Lys Gly Ser Leu Leu Ser Ser Gly He Tyr

-20

-15

Leu

lie

Ala

Leu

Ala

Pro

Phe

val

Asn

Ala

Lys

Cys

Ala

Leu

Pro

Ser

-10

-5

1

5

Thr

Tyr

Ser

Tro

Thr

Ser

Thr

Asp

Ala

Leu

Ala

Thr

Pro

Lys

Ser

Gly

10

15

20

Trp

Thr

Ala

Leu

Lys

Asp

Phe

Thr

Asp

Val

Val

Ser

Asn

Gly

Lys

His

25

30

35

lie

Vai

Tyr

Ala

Ser

Thr

Thr

Asp

Thr

Gin

Gly

Asn

Tyr

Gly

Ser

Met

40

45

50

Gly

Phe

Gly

Ala

Phe

Ser

Asp

Trp

Ser

Asp

Met

Ala

Ser

Ala

Ser

Gin

55

60

65

70

Thr

Ala

Thr

Ser

Phe

Ser

Ala

Val

Ala

Pro

Thr

Leu

Phe

Tyr

Phe

Gin

75

80

85

Pro

Lys

Ser

lie

Trp

Vai

Leu

Ala

Tyr

Gin

Trp

Gly

Ser

Ser

Thr

Phe

90

95

100

Thr

Tyr

Arg

Thr

Ser

Gin

Asp

Pro

Thr

Asn

Val

Asn

Gly Trp

Ser

Ser

105

110

115

Glu

Gin

Ala

Leu

Phe

Thr

Gly

Lys

He

Ser

Gly

Ser

Ser

Thr

Gly

Ala

120

125

130

lie

Asp

Gin

Thr

Vai

lie

Gly Asp

Asp

Thr

Asn

Met

Tyr

Leu

Phe

Phe

135

140

145

150

Ala

Gly Aso

Asn

Gly

Lys

lie

Tyr

Arg

Ser

Ser

Met

Ser

He

Asn

Asp

155

160

165

Phe

Pro

Gly

Ser

Phe

Gly

Ser

Gin

Tyr

Glu

Glu

He

Leu

Ser

Gly

Ala

170

175

180

Thr

Asn

ASD

Leu

Phe

Glu

Ala

Val

Gin

Val

Tyr

Thr

Val

Asp

Gly

Gly

185

190

195

Glu

Gly

Asp

Ser

Lys

Tyr

Leu

Met

He

Val

Glu

Ala

He

Gly

Ser

Thr

200

205

210

Gly

His

Arg

Tyr

Phe

Arg

Ser

Phe

Thr

Ala

Ser

Ser

Leu

Gly

Gly

Glu

215

220

225

230

Trp

Thr

Ala

Gin

Ala

Ala

Ser

Glu

Asp

Gin

Pro

Phe

Ala

Gly

Lys

Ala

235

240

245

Asn

Ser

Gly

Ala

Thr

Trp

Thr

Asp

Asp

He

Ser

His

Gly Asp

Leu

Val

250

255

260

Arg

Asn

Asn

Pro

Asp

Gin

Thr

Met

Thr

Val

Asp

Pro

Cys

Asn

Leu

Gin

265

270

275

Leu

Leu

Tyr

Gin

Gly

His

Asp

Pro

Asn

Ser

Asn

Ser

Asp

Tyr

Asn

Leu

280

285

290

Leu

Pro

Trp

Lys

Pro

Gly

Vai

Leu

Thr

Leu

Lys

Gin

О ОС *ΪΛΛ П ξ $

н (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 7:

(ί) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА:

(A) ДЪЛЖИНА: 2859 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП : ДНК(геномна) ©(iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: няма (iii) АНТИ-СМИСЛЕНОСТ: няма (vi) ИЗТОЧНИК НА ПРОИЗХОДА:

(А) ОРГАНИЗЪМ : Aspergillus niger var. tubigensis (В) ЩАМ : DS16813 (ix) ХАРАКТЕРИСТИКА:

(А) ИМЕ/КЛЮЧ: СААТ_ сигнал (В) ЛОКАЛИЗАЦИЯ : 651.. 655 (ix) ХАРАКТЕРИСТИКА:

(А) ИМЕ/КЛЮЧ: ТАТА_сигнал (В) ЛОКАЛИЗАЦИЯ : 713 .. 720 ф (ix) ХАРАКТЕРИСТИКА:

(А) ИМЕ/КЛЮЧ: CDS (В) ЛОКАЛИЗАЦИЯ : 823.. 1818 (D) ДРУГА ИНФОРМАЦИЯ : / продукт = “ ензим разграждащ арабиноксилана” / ген = “axdA” / стандартмо_ име = “ ензим разграждащ арабиноксилана” (ix) ХАРАКТЕРИСТИКА:

(А) ИМЕ / КЛЮЧ : сиг _ пептид (В) ЛОКАЛИЗАЦИЯ : 823 . . 901

_ς - fSj* (ix) ХАРАКТЕРИСТИКА:

(A) ИМЕ / КЛЮЧ: мат_ nenmug (B) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 901.. 1818 (») ОПИСАНИЕ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ ID NO: 7:

CATACTGGGT GTGGTACTGT AGGGAACCTG CAGATGCTCT GCCGAAGGTC TGCAAATAGT	60
CCCTGGAGTT TGGTAGTAAA GAGTACCAAC TCGTAAAAGT AGTATGTCCA ACCAATTTGA	120
AAGTACAAAC TTTTAGTTTG ATTGATTAAA ATACTTTTGG TGTGTACAGT GACAGCCAAA	180
ATATCATCTC TTCAGCCGAT AGATGTCAAC TGCCCGCCGA AAGTACCGGA AGGTCGTGGT	240
GTTTTAAGGT GAAACACTAT CAGGGCGGCA ATGTGTCAAA GTAGAACCAG TTTGCTTAGC	300
GCCATTAGGG TCCACGCCTA GACCCCTCGA TGCCCGGGAG TCATCCGTCC TGTCACAGCA	360
ATTATTTCCC CGAGTCTACT GCCGAAGAAG AGCTATTGTG GCGTAATCAT GGAATTACCC	420
TCTGTGTAGG GTAGTCTTGA ACGCCGTTCT AGACACGGCA ACGTTCCGGT GGACGATCGT	480
TTCTGGCTAA TGTACTCCGT AGTTTAGGCA GCTAGCTGAT CATCTTCCCC CTAGGGAAAG	540
GACCTGAATA- GTGCGCCAAA ATGAGCTTGA GCAAAGGAAT GTTCTTTCTA AGCCAAAGTG	600
GGGGAAATAA CCAAGCAGCC CACTTTTATC CGAAACGTTT CTGGTGTCAT CCAATATGGA	660
TAAATCCCGA TTGTTCTTCT GCACGTATCA GTATTGCCAT CAACGTAACT ACATATATTT	720
GAACATGGTC TGGTCCTCCG TTCGATTTAT TCGTTCTCCG TGGCCAACGA CTTCAGCCAT	780
TGATCTCTTT TGTTTCTTTC CTGCGGCTAA ACCCATTCGA AG ATG AAG TTC TTC Met Lys Phe Phe	834

AAA Lys

GCC AAA GGC AGC TTG

CTG TCA TCA GGC ATC TAC CTC ATT GCA TTA

882

Ala Lys -20

Gly Ser Leu

Leu Ser -15

Ser

Gly

He Tyr Leu -10

He

Ala

Leu

ACC

ccc

TTT

GTC

AAC

GCC

AAA

TGT

GCT

CTT

CCG

TCG

TCC

TAT

AGT

TGG

930

Thr

Pro

Phe

Vai

Asn

Ala

Lys

Cys

Ala

Leu

Pro

Ser

Ser

Tyr

Ser

Trp

-5

1

5

10

AGT

TCA

ACC

GAT

GCT

CTC

GCA

ACT

CCA

AAG

TCA

GGA

TGG

ACC

GCA

CTG

978

Ser

Ser

Thr

Asp

Ala

Leu

Ala

Thr

Pro

Lys

Ser

Gly

Trp

Thr

Ala

Leu

IS

20

25

AAG

GAC

TTT

ACT

GAT

GTT

GTC

TCG

GAC

GGC

AAA

CAT

ATT

GTC

TAT

GCG

1026

Lys

Asp

Phe

Thr

Asp

Vai

Vai

Ser

Asp

Gly Lys

His

lie

Vai

Tyr

Ala

30

35

40

£4

TCC ACT ACT Ser Thr Thr

GAT GAA GCG

GGA AAC TAT GGC TCG ATG ACC' TTT. GGC GCC

1074

Asp Glu

Ala

Gly Asn 50

Tyr

Gly

Ser Met

Thr 55

Phe Gly Ala

45

TTC

TCA

GAG

TGG

TCG

AAC

ATG

GCA

TCC

GCT

AGC

CAG

ACA

GCC

ACC

CCC

1122

Phe

Ser 60

Glu

Trp

Ser

Asn

Met 65

Ala

Ser

Ala

Ser

Gin 70

Thr

Ala

Thr

Pro

TTC

AAT

GCC

GTG

GCT

CCT

ACC

CTG

TTC

TAC

TTC

AAG

CCG

AAA

AGT

ATC

1170

Phe 75

Asn

Ala

Vai

Ala

Pro 80

Thr Leu

Phe

Tyr

Phe 85

Lys

Pro

Lys

Ser

lie 90

TGG

GTT

CTG

GCC

TAC

CAA

TGG

GGC

TCC

AGC

ACA

TTC

ACC

TAC

CGC

ACC

1218

Trp

Vai

Leu

Ala

Tyr 95

Gin

Trp

Gly

Ser

Ser 100

Thr

Phe

Thr

Tyr

Arg 105

Thr

TCC

CAA

GAT

CCC

ACC

AAT

GTC

AAT

GGC

TGG

TCG

TCG GAG

CAG

GCG

CTT

1266

Ser

Gin

Asp

Pro 110

Thr

Asn

Vai

Asn

Gly 115

Trp

Ser

Ser

Glu

Gin 120

Ala

Leu

TTC

ACC

GGC

AAA

ATC

AGC

GAC

TCA

AGC

ACC

AAT

GCC

ATT

GAC

CAG

ACG

1314

Phe

Thr

Gly Lys 125

He

Ser

Asp

Ser 130

Ser

Thr

Asn

Ala

lie 135

Asp

Gin

Thr

GTG

ATT

GGC

GAT

GAT

ACG

AAT

ATG

TAT

CTC

TTC

TTC

GCC

GGC

GAC

AAC

1362

Vai

He 140

Gly

Asp

Asp

Thr

Asn Met 145

Tyr

Leu

Phe

Phe 150

Ala

Gly Asp

Asn

GGC

AAG

ATC

TAC

CGA

TCC

AGC

ATG

TCC

ATC

AAT

GAC

TTC

CCC

GGA

AGC

1410

Gly 155

Lys

lie

Tyr

Arg

Ser 160

Ser

Met

Ser

He

Asn 165

Asp

Phe

Pro

Gly

Ser 170

TTC

GGC

AGC

CAG

TAC

GAG

GTG

ATC

CTG

AGT

GGC

GCC

CGC

AAC

GAT

CTA

1458

Phe

Gly

Ser

Gin

Tyr 175

Glu

Vai

He

Leu

Ser 180

Gly

Ala

Arg

Asn

Asp 185

Leu

TTC

GAG

GCG

GTC

CAA

GTA

TAC

ACC

GTC

GAC

GGC

GGT

GAG

GGC

GAC

ACG

1506

Phe

Glu

Ala

Vai 190

Gin

Vai

Tyr

Thr

Vai 195

Asp

Gly

Gly

Glu

Gly Asp 200

Thr

AAG

TAT

CTC-

ATG

ATC

GTT

GAG

GCG

ATC

GGG

TCC

ACC

GGA

CAT

CGT

TAT

1554

Lys

Tyr

Leu 205

Met

He

Vai

G1U

Ala 210

He

Gly

Ser

Thr

Gly 215

His

Arg

Tyr

TTC

CGC

TCC

TTC

ACG

GCC

AGC

AGT

CTG

GGT

GGA

GAG

TGG

ACA

GCC

CAG

1602

Phe

Arg 220

Ser

Phe

Thr

Ala

Ser 225

Ser

Leu

Gly Gly

Glu 230

Trp

Thr

Ala

Gin

GCG

GCA

AGT

GAG

GAT

CAA

CCC

TTC

GCA

GGC

AAA

GCC

AAC

AGT

GGT

GCC

1650

Ala 235

Ala

Ser

Glu

Asp

Gin 240

Pro

Phe

Ala

Gly

Lys 245

Ala

Asn

Ser

Gly

Ala 250

ACC

TGG

ACC

GAA

GAC

ATT

AGC

CAT

GGT

GAC

TTG

GTT

CGC

AAC

AAC

CCT

1698

Thr

Trp

Thr

Glu

Asp 255

He

Ser

His

Gly

Asp 260

Leu

Vai

Arg

Asn

Asn 265

Pro

GAT

CAA

ACG

ATG

ACT

GTC

GAT

CCT

TGC

AAC

CTC

CAG

TTG

CTC

TAT

CAG

1746

Asp

Gin

Thr

Met 270

Thr

Vai

Asp

Pro

Cys 275

Asn

Leu

Gin

Leu

Leu 280

туг

Gin

GGC

CAT

GAC

CCC

AAC

AGC

AGT

GGC

GAC

TAC

AAC

CTC

TTG

CCG

TGG

AAG

1794

Gly

His

Asp 285

Pro

Asn

Ser

Ser

Gly Asp 290

Tyr

Asn

Leu

Leu 295

Pro

Trp

Lys

CCG Pro

GGC Gly 300

GTC Vai

CTT Leu

ACC Thr

TTG Leu

AAG Lys 305

CAG Gin

TGAAGGTATT ATAATTAGTT GCAGATTGTG

1848

7ο

ТТТТСАТТСС	TTCTTCAAGA	gtgcttagtg	GTGGAAGACA	GCAGAAGGTG	GTCACTATCT	1908
TAGGCTCAGT	TGGGGTGGGC	TTGTGTCCAT	AGGCTAGTAA	TGTGCGCATA	ATTCAGTTCA	1968
TTGGCAAGGA	GTGCGGTATA	AATACCTGTT	CTCACAAAAA	AAAATAGGCC	CGGTGGTCAT	2028
ACTCCGTATT	GGGATAGAGA	TCTCGTAGTA	GTAGGATTGT	GGGCCTCAGA	GGATGACCGA	2088
CACGTGAGCA	GTCTCCTTCT	ACGGCTAGTC	GCGTTCTACA	TAAGAAATAG	TCAGCTCAGA	2148
GTTTGTTTTT	TGGCTACTTT	GAAGGATGGC	CTATCGAATC	GCACGTCTCC	TCAATTGGCC	2208
AGGTATTGGC	ATTCACTCTC	CGCGCTTTGC	GGGTGCCGGC	ACGAGATGTC	TCCTGGAGAA	2268
ACTGGGCAAC	GAGCAGACTA	CGGATATGGG	AGATTGTTGA	CGACGTTCTT	CTTGGTAAAT	2328
TTGAACCCTT	CAGGGGCTCT	ATAAAGGCGG	AAATCTAAAT	CTCATGTGCC	CTAACGTGTC	2388
CGACCACGGT	GTTGATCAGC	ACCTATTAGA	TCAGACAACA	ACCTTTGGCT	CGGAAATTGA	2448
ACAGGTAGCT	CTTGAATGAC	ACTCTGGATC	CTGATTCAAT	TTATAATGCG	TCACTTGAGC	2508
GTGCAAGGGG	TGCTATATTC	acatcttgcc	CCAATCCAAG	GGGCGTCGGA	TCCCATTGTG	2568
CTCGACAGCC	TGGAACTTCG	CCGACAGTAT	TCTTACGACG	TCGATACTGA	AATAGTCCAC	2628
CTGGTGTGCA	TTCGTACGCC	GGAAAGACCC	TCGTCCGACC	GCGTGGCCTT	GATTCTGACG	2688
AGATGCTTCA	ACAAGCGGCC	AATTCGATGC	CAGCTGTTCA	TCGGTTAGAT	GTGCTACACA	2748
GTGACCTGAT	TCCAGGAAAC	ATATTCTGGA	ACGAAGGAAA	TGGCCGCGTC	AATTTTCATT	2808
GACTTTGAGT	GTGCAATAAC	CCAAAATAAC	GAAATAATGA	ACGACCGCTG	T	2859

ί2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ Π) VO: 8:

(ί) ХАРАКТЕРИСТИКА ИЛ ПОСЛЕДОВАТЕЛ I TOCIT’A :

!

TUI

1 r - Λ i

<ΊΜί!

Ή·' knee \

•D)

ТОПОЛОГ

- t л- r-r

: линсар

•на

ii) MO\

• Λ Γϊ

r Τ' L J

ΤΠ7 . J/iJ ; .

iiii ОПИ

CAI

ΒΊΕ

Ϊ 1 4

< :k

' Λ

ЕДОВЛ

ГЕЛ

НОСТГ.

л S

EO

LI-·*

NO

Met

Lys -25

Phe

Phe

Lys

Ala

Lys -20

Gly

Ser

Leu

Leu

Ser -15

Ser

Gly

lie

Tyr

Leu -10

lie

Ala

Leu

Thr

Pro -5

Phe

Val

Asn

Ala

Lys 1

Cys

Ala

Leu

Pro 5

Ser

Ser

Tyr

Ser

Trp 10

Ser

Ser

Thr

Asp

Ala 15

Leu

Ala

Thr

Pro

Lys 20

Ser

Gly

Trp

Thr

Ala 25

Leu

Lys

Asp

Phe

Thr 30

Asp

Val

Val

Ser

Asp 35

Gly

Lys

His

lie

Val 40

Tyr

Ala

Ser

Thr

Thr 45

Asp

Glu

Ala

Gly

Asn 50

Tyr

Gly

Ser

Met

Thr 55

Phe

Gly

Ala

Phe

Ser 60

Glu

Trp

Ser

Asn

Met 65

Ala

Ser

Ala

Ser

Gin 70

Thr

Ala

Thr

Pro

Phe 75

Asn

Ala

Val

Ala

Pro 80

Thr

Leu

Phe

Tyr

Phe 85

Lys

7/

Pro Lys Ser lie Trp Val Leu Ala Tyr Gin Trp Gly Ser Ser Thr Phe

90

95

100

Thr

Tyr Arg

Thr

Ser

Gin

Asp

Pro

Thr

Asn

Val

Asn

Gly

Trp

Ser

Ser

105

110

115

Glu

Gin

Ala

Leu

Phe

Thr

Gly Lys

He

Ser

Asp

Ser

Ser

Thr

Asn

Ala

120

125

130

lie

Asp

Gin

Thr

Val

He

Gly Asp

Asp

Thr

Asn

Met

Tyr

Leu

Phe

Phe

135

140

145

150

Ala

Gly Asp

Asn

Gly

Lys

lie

Tyr

Arg

Ser

Ser

Met

Ser

He

Asn

Asp

155

160

165

Phe

Pro

Gly

Ser

Phe

Gly

Ser

Gin

Tyr

Glu

Val

He

Leu

Ser

Gly

Ala

170

175

180

Arg

Asn

Asp

Leu

Phe

Glu

Ala

Val

Gin

Val

Tyr

Thr

Val

Asp

Gly

Gly

185

190

195

Glu

Gly

Asp

Thr

Lys

Tyr

Leu

Met

He

Val

Glu

Ala

He

Gly

Ser

Thr

200

205

210

Gly

His

Arg

Tyr

Phe

Arg

Ser

Phe

Thr

Ala

Ser

Ser

Leu

Gly

Gly

Glu

215

220

225

230

Trp

Thr

Ala

Gin

Ala

Ala

Ser

Glu

Asp

Gin

Pro

Phe

Ala

Gly

Lys

Ala

235

240

245

Asn

Ser

Gly

Ala

Thr

Trp

Thr

Glu

Asp

He

Ser

His

Gly Asp

Leu

Val

250

255

260

Arg

Asn

Asn

Pro

Asp

Gin

Thr

Met

Thr

Val

Asp

Pro

Cys

Asn

Leu

Gin

265

270

275

Leu

Leu

Tyr

Gin

Gly

His

Asp

Pro

Asn

Ser

Ser

Gly

Asp

Tyr

Asn

Leu

2S0

285

290

Leu

Pro

Trp

Lys

Pro

Gly

Val

Leu

Thr

Leu

Lys

Gin

295

-

300

305

Claims (23)

1. Рекомбинантна ДНК, която включва ДНК фрагмент кодиращ полипептид с активност за разграждане на арабиноксилана, или полипептиден прекурсор за него, арактеризиращ се с това, че посоченият

ДНК фрагмент е подбран от:

(а) ДНК фагмент, кодиращ полипептид с амино киселинна последователност, представена от амино киселини от 1 до 306, или полипептиден прекурсор на дадения полипептид, представен от амино киселини - 27 до 306 в SEQIDNO: 5:;

(b) ДНК фрагмент, кодиращ полипептид с амино киселинната последователност, представена от амино киселини 1 до 306, или прекурсор на този полипептид, представен от амино киселини - 27 до 306 в SEQIDNO: 7;

(c) ДНК фрагмент, кодиращ вариант или част от полипептидите, представени от амино киселинни остатъци 1 до 306, показани на SEQIDNO :

5 или 7, които все още притежават активност за разграждане на арабиноксилана, или полипептиден прекурсор за това;

(d) ДНК фрагмент кодиращ полипептид с активност за разграждане на арабиноксилана, с нуклеотидната последователност, представена от нуклеотиди 784 до 1779 в SEQIDNO : 5 или нуклеотиди 923 до 1818 в SEQIDNO : 7;

(е) ДНК фрагмент кодиращ полипептид с активност за разграждане на арабиноксилана, или част от този полипептид, който ДНК фрагмент е способен да се хибридизира с ДНК фрагмент както е представен от нуклеотиди 784 до 1779 на SEQIDNO : 5 или нуклеотиди 823 до 1818 на

SEQIDNO : 7.

2. Рекомбинантна ДНК съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че активността за разграждане на арабиноксилана може да бъде получена от нишковидни гъби.

3. Рекомбинантна ДНК съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че нишковидната гъба е Aspergillus species.

4. Рекомбинантна ДНК съгласно претенция 3, характеризираща се с това, че нишковидната гъба е Aspergillus niger или tubigensis.

5. Рекомбинантна ДНК съгласно претенция 1, която обхващай регулаторни ДНК последователности, необходими за експресията на ДНК фрагмента в прокариотична или еукариотична гостоприемникова клетка.

6. Рекомбинантна ДНК съгласно претенция 6, характеризиаща се с това, че регулаторните последователности са хетероложни по отношение на последователността, кодираща полипептида от даденият ДНК фрагмент.

7. Рекомбинантна ДНК съгласно претенция 6, където хетероложните регулаторни последователности са подбрани така, че да повишат експресията на ДНК фрагмента в гостоприемника в сравнение с експресията на ДНК фрагмента 6 дадения гостоприемник, когато е свързан към неговите хомоложни регулаторни ДНК последователности.

8. Рекомбинантна ДНК съгласно която и да е от претенции от 1 до 7, която е под формата на вектор.

9. Трансформирана еукариотична или прокариотична гостоприемникоВа клетка, включваща рекомбинантна ДНК съгласно която и да е от претенции от 1 до 8.

10. Трансформирана еукариотична гостоприемникова клетка съгласно претенция 9, който гостоприемник принадлежи на рода Aspergillus.

11. Метод за получаване на гостоприемникова клетка способна да повиши експресията на ензим, който разгражда арабиноксилана последством поставяне на гостоприемниковата клетка в условия за трансформиране с рекомбинантна ДНК съгласно претенция 8 и подбор за повишена експресия на посочения арабиноксилан разграждащ ензим.

12. Метод съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че посочената гостоприемникова клетка е гостоприемникова клетка от вида Aspergillus species.

13. Метод за получаване на ензим, разграждащ арабиноксилана който включва етапите на култивиране на гостоприемникови клетки, способни да продуцират дадения ензим при контролирани условия и възстановяване на ензима, характеризиращ се с това, че дадените гостоприемникови клетки, или техните предшевственици, са били трансформирани с рекомбинантна ДНК съгласно претенция 8.

14. По същество чист полипептид с арабиноксилан разграждаща активност, характеризиращ се с амино киселинната последователност, показана на SEQIDNO : 6 или SEQIDNO : 8, а така също и генетични варианти и техни части, които все още притежават посочената активност.

15. Състав, който съдържа по същество чист полипептид съгласно претенция 14, създаден за приложение като храна, фураж или за получаване на хартия или пулпа.

16. Състав съгласно претенция 15, където ензима е имобилизиран.

17. Приложение на полипептид съгласно претенция 14, за подпомагане разграждането на арабиноксилана.

18. Приложение на полипептид съгласно претенция 14 като фуражна или хранителна добавка.

19. Приложение на полипептид съгласно претенция 14 за получаване на хартия или пулпа.

20. Приложение на полипептид съгласно претенция 14 за печене на хляб.

21. Храна или фураж съдържащи полипептид съгласно претенция 14.

22. Рекомбинантна ДНК вкючВаща ДНК фрагмент представен от нуклеотиди 1 до 783 от SEQIDNO: 5, или негов субфрагмент, способен да регулира експресията на присъединена към него ДНК последователност.

23. Рекомбинантна ДНК, включваща ДНК фрагмент, представена от нуклеотиди 1 до 822 от SEQIDNO : 7, или негов субфрагмент, способен да регулира експресията на присъединена към него ДНК последователност.