PT98419B

PT98419B - Processo para a preparacao de sequencias de adn que codificam para xilanases, de construcoes de adn que contem essas sequencias, paraa transformacao de hospedeiros microbianos com essas construcoes, para a preparacao de xilanases por expressao nesses hospedeiros e para a degradacao de xilano por accao dessas xilanases

Info

Publication number: PT98419B
Application number: PT98419A
Authority: PT
Inventors: Jacob Visser; Leendert Hendrik De Graaff; Henriette C Van Den Broeck; Albert J J Van Ooyen; Jan Dirk Rene Hille; Abraham Harder
Original assignee: Gist Brocades Nv
Priority date: 1990-07-24
Filing date: 1991-07-23
Publication date: 1999-01-29
Also published as: EP0463706B1; IE20040144A1; HU9200961D0; WO1992001793A1; PT98419A; IE912582A1; PL291225A1; IL98941A; NO921133L; IL98941A0; CA2066734A1; ES2086267T1; JPH05501657A; AU647170B2; AU8320591A; NZ239083A; ES2086267T3; EP0468596B1; FI921232A; KR100212232B1

Description

Descrição, referente â patente de invenção de GIST-BROCADES N.V., holandesa, industrial e comercial, com sede em Wateringseweg 1, P.O. Box 1, 2600 MA Delft, Países Baixos, (inventores: Henriette Catharina van den Broeck, Leendert Hendrick de Graaff, Jan Dirk René Hille, Albert Johannes Joseph van Ooyen, Jacob Visser e Abraham Harder, residentes nos Países Baixos), para: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE SEQUÊNCIAS DE ADN QUE CODIFICAM PARA XILANASES, DE CONSTRUÇÕES DE ADN QUE CONTÊM ESSAS SEQUÊNCIAS, PARA A TRANSFORMAÇÃO DE HOS PEDEIROS MICROBIANOS COM ESSAS CONSTRUÇÕES, PARA A PREPARAÇÃO DE XILANASES POR EXPRESSÃO NESSES HOSPEDEIROS E PARA A DEGRADAÇÃO DE XILANO POR ACÇÃO DESSAS XILANASES.

DESCRIÇÃO

A presente invenção estã relacionada com o cam po da biologia molecular. Em particular, a presente invenção diz respeito â clonagem e sobre-expressão de uma sequência de ADN fúngico que codifica para uma proteína que possui a actividade de uma xilanase. A presente invenção proporciona igualmente um processo para a produção e uso de uma única xilanase que pode ser obtida numa forma livre de outras xilanases, e mesmo de outras enzimas em geral.

Antecedentes da invenção

A composição da parede de uma célula vegetal ê complexa e variável. Os polissacarídeos são encontrados principalmente sob a forma de longas cadeias de celulose (o principal componente estrutural da célula de parede vegetal), hemicelulose

(compreendendo várias cadeias β-xilano) e pectina. A ocorrência, a distribuição e as caraeterísticas estruturais dos polissacarídeos da parede de uma célula vegetal são determinadas por (1) espêcie vegetal; (2) variedade; (3) tipo de tecido; (4) condições _;de crescimento; (5) envelhecimento e (6) processamento do materi al da planta durante a preparação dos alimentos.

Existem diferenças básicas entre monocotiledõneas (p.ex. cereais e gramíneas) e dicotiledóneas (p. ex. trevo, colza e soja) e entre as sementes e partes vegetativas da planta (Chesson, 1987; Carrê e Brillouet, 1986). As monocotiledóneas são caracterizadas pela presença de um complexo de arabinoxilano como suporte principal da hemicelulose. A estrutura principal da hemicelulose nas dicotiledóneas é um complexo de xiloglucano. Adicionalmente, encontram-se concentrações de pectina mais eleva das nas dicotiledóneas do gue nas monocotiledóneas. As sementes possuem geralmente altos teores de substâncias pécticas mas teores relativamente baixos de material celulósico.

Na Figura 1 estã representado um diagrama de uma vista em corte de uma célula vegetal. Podem ser distinguidas na parede celular três estruturas de polissacarídeos mais ou menos interactuantes:

(1) A lamela central forma a parede celular exterior. Serve também como ponto de fixa ção entre as células individuais entre si dentro da matriz do tecido vegetal. A lamela central ê constituída principalmente por sais de cálcio de pectinas altamente esterifiçadas;

(2) A parede primêria estã situada precisamen te no interior da lamela central. É uma estrutura bem organizada de microfibrilas de celulose incrustadas numa matriz amorfa de pectina, hemicelulose, ésteres fenõ licos e proteínas;

(3) A parede secundária ê formada â medida que a planta amadurece. Durante a fase de cres cimento e envelhecimento da planta, são depositadas microfibrilas de celulose, he

micelulose e lenhina.

A parede celular primaria de células vegetais maduras e metabolicamente activas (p. ex. mesofila e epiderme) ê mais susceptível a hidrólise enzimática do que a parede celular secundária, que nesta fase jã se encontra altamente lenhificada.

Existe um elevado grau de interacção entre a celulose, a hemicelulose e a pectina na parede celular. A degradação enzimática destas estruturas polissacarídeas com ligações cruzadas bastante intensas não ê um processo simples. Por exemplo, são necessárias pelo menos cinco enzimas diferentes para fragmentar completamente um arabinoxilano. A endo-cisão ê afecta da pelo uso de uma endo-p(l->4)-D-xilanase. A exo-(1- >4)-D-xilanase liberta unidades de xilose na extremidade não redutora do polissacarídeo. Três outras enzimas ( d -glucuronidase, el -L-arabi^ nofuranosidase e esterase de acetilo) são usadas para atacar sub stituintes no suporte do xilano. A escolha das enzimas específicas depende naturalmente da hemicelulose específica que se pretende degradar (McCleary e Matheson, 1986).

Para certas aplicações, no entanto, a degradação completa de toda a hemicelulose em monómeros não ê necessária ou não ê desejável. Na liquefacção do arabinoxilano, por exemplo, basta simplesmente separar o suporte principal do xilano em unidades mais reduzidas. Isto pode ser conseguido pela acção de uma endoxilanase, que em última análise tem como resultado uma mistura de unidades de monómeros de xilano e oligómeros tais como xilobiose e xilotriose. Estas subunidades mais reduzidas são então suficientemente solúveis para o uso desejado.

Os fungos filamentosos são largamente conhecidos pela sua capacidade de segregar grandes quantidades de uma variedade de enzimas hidrolíticas tais como *-amilases, proteases e amiloglucosidades e várias enzimas que degradam a parede celular vegetal tais como celulases, hemicelulases e pectinases. Entre estas, múltiplas enzimas que degradam o xilano têm sido re conhecidas, e mostrou-se que possuem uma variedade de proprieda• des bioquímicas e físicas. Esta heterogeneidade na função da xi. lanase permite a selecção de uma xilanase de interesse que ê a

mais adequada para uma aplicação desejada (ver Wong et al.(1988) Woodward (1984) e Dekker e Riehards (1977)).

Sabe-se que uma multiplicidade de xilanases de vários pesos moleculares são produzidas por micro-organismos tais como Aspergillus niger, Clostridium thermocellum, Trichoder ma reesei, Penicillium janthinellum, assim como espécies de Bacillus e Streptomyces.

Pelo contrário, em leveduras não se observou qualquer multiplicidade de xilanases. Em três géneros de fermento, Trichosporon, Cryptococcus e Aureobasidium, sé foi detectada uma única xilanase.

Na natureza, as xilanases microbianas são sempre produzidas em conjunto com outras enzimas que possuem actividades de degradação dos polissacarídeos, tais como a exo-arabi nanase, esterase de acetilo e celulases. Para algumas aplicações estas actividades enzimãticas não são necessárias ou não são desejadas .

Sabe-se que as condições de fermentação podem sofrer variações para favorecer a produção de uma enzima de inte resse. Sabe-se igualmente que a clonagem do gene que codifica pa ra a enzima desejada e que a sobre-expressa no seu hospedeiro na tural, ou noutro hospedeiro de expressão compatível, vai incrementar especificamente a produção da enzima de interesse. Este último método é particularmente útil se se pretende que a enzima de interesse seja obtida numa forma livre de actividade enzimãti ca indesejada.

A expressão da xilanase bacteriana recombinante foi anteriormente descrita no Pedido de Patente Europeia 121. .138. 0 gene que codifica para a xilanase bacteriana foi isolado a partir de ADN cromossõmico de Bacillus e expresso num hospedei ro E. coli. No entanto, os hospedeiros de expressão E.coli são, em certos casos, considerados perigosos para a produção de prote inas por métodos de ADN recombinante devido à produção de subpro dutos inaceitáveis tais como toxinas nestes microorganismos.

Uma vez que os genes bacterianos não contêm in troes, põe-se poucos problemas no que respeita â clonagem e ex* pressão destes genes em hospedeiros procariõticos. Por outro la• do, a expressão de genes eucariõticos nem sempre ê tão directa.

Ê bem conhecido que genes isolados a partir de estirpes eucariõticas contêm intrões. Inerentemente, isto introduz complicações na clonagem e expressão destes genes, se fôr preferido um hospedeiro procariõtico.

Adicionalmente, existem certas diferenças, em geral., entre as características físicas das xilanases de origem fúngica e as hacterianas. Em geral, as xilanases fúngicas têm um pH óptimo na gama de pH 3,5 a 5,5, ao passo que as xilanases bac terianas possuem geralmente um pH óptimo na gama de pH 5,0 a 7,0, As xilanases fúngicas têm também normalmente uma gama de estabilidade de pH mais larga (pH 3 a 10) do que as suas homólogas bac terianas (pH 5,0 a 7,5). As xilanases fúngicas têm gerãfaente uma temperatura óptima de cerca de 50°C. As xilanases bacterianas têm têm geralmente uma temperatura óptima entre 50°C e 70°C. Para uma discussão mais aprofundada sobre as características físicas das xilanases ver Wong et al.(1988), Woodward (1984) e Dekker e Richards (1977).

Deste modo, torna-se claro que as xilanases bacterianas são menos adequadas para uso em, por exemplo, proces sos que requeiram condições de mais baixo pH. Noutros casos, as xilanases bacterianas são demasiado termostãveis para certas aplicações tais como a maturação da cerveja (ver Patente Europeia N9 227.159).

Em conformidade, seria de grande importância a obtenção de genes que codifiquem para enzimas de origem fúngica que degradem o xilano que possam ser expressas noutros hospedeiros de expressão microbianos de alta produtividade.

Resumo da Invenção

A presente invenção proporciona sequências de ADN purificadas e isoladas de origem fúngica, que codificam para proteínas com actividade de degradação do xilano. Estas sequências de ADN incluem a sequência de codificação da xilanase e de preferência também as sequências reguladoras 5' e 3' adjacentes.

É também um objectivo da presente invenção pro , porcionar construções para a sobre expressão microbiana das sequências que codificam para a xilanase usando quer as suas sequêr.

cias reguladoras nativas ou, numa concretização alternativa, a sequência de codificação da xilanase ligada operativamente a regiões reguladoras seleccionadas tais como promotores, guias de secreção e sinais de terminação que são capazes de dirigir a sobre expressão da proteína de xilanase num hospedeiro de expressão adequado.

Outro objectivo da presente invenção ê proporcionar hospedeiros de expressão microbiana, transformados com as construções de expressão da presente invenção, que são capazes de realizar a sobre-expressão e, se desejado, a secreção de uma xilanase de origem fúngica.

Outro objectivo da presente invenção ê ainda fornecer métodos para a produção de uma xilanase de interesse que pode, por sua vez, ser usada com vantagens num processo industrial. Tipicamente, um tal processo industrial requer a actividade da xilanase a um pH mais baixo do que aquele para o qual -s xilanáseg de origem bacteriana funcionam a um nível óptimor

Breve Descrição das Figuras

Diagrama de uma secção transversal de uma célula vege tal.

Perfil de eluição de HPLC de um filtrado de cultura obtido a partir de Aspergillus niger DS16813 (CBS 323. .90), Esta estirpe foi mais tarde reclassifiçada como pertencendo mais provavelmente à espécie Aspergillus tubigensis.

Sondas oligonucleotídicas ABBO1 a ABBO6, construídas a partir da sequência de ácidos aminados N-terminal da proteína XYL A de Aspergillus tubigensis (Formula 1) .

Sonda oligonucleotídica AB1255, construída a partir da sequência de ácidos aminados N-terminal de um frag mento de 19 kDa interno da proteína XYL A de Aspergil lus tubigensis, digerida com a endopeptidase de S. au reus V8 (Fórmula 2).

Mapa de restrição da região genomica que contém o gene xln A, conforme derivado por análise de mancha de Sou

Figura 1:

Figura 2:

Figura 3

Figura 4:

Figura 5:

thern do bacteriofago lambda_kln3· Sao indicados os fragmentos de hibridação e os seus respectivos fragmentos .

Figura 6:

Figura 7:

Figura 8:

Figura 9:

Figura 10:

Figura 11:

Figura 12:

Figura 13:

Figura 14:

Figura 15:

Figura 16:

Figura 17:

Estratégia empregue para sequenciar o gene xln A de Aspergillus tubigensis. As setas indicam a direcção e número dos pb sequenciados.

Mapa de restrição de plmlOO contendo o fragmento Sall de 6,9 kb contendo o gene xln A de Aspergillus tubigensis . Para além dos dois locais HinDIII indicados, dois locais HinDIII adicionais estão presentes na inserção do plasmídeo.

Sequência de nucleótidos do gene xln A de Aspergillus tubigensis. As posições do intrão e do propèptídeo são presumíveis.

Representação de um zimograma mostrando a proteína XYL A expressa pelos transformantes TrX2 e TrX9. Electroforese de gel de SDS-poliacrilamida mostrando a expressão da proteína XYL A em A. niger CBS 513.88 (A) e A. niger N593 (B).

PAGE de gradiente nativo mostrando a proteína XYL A expressa pelos transformantes de A. niger CBS 513.88 números 10, 29 e 1.1, corada com ABC (A) e com uma camada de ABR-xilano (B).

Mapa físico de pXYLl contendo o gene xln A num fragmento de 2,1 kpb de PstI em pTZ18R. / Abreviaturas:

H = HindiII; P = PstI; B = BamHI; K = Kpnl; E = EcoRI X = Xhol; e S = Sall 7

Mapa físico de pAB 6-1. A inserção de ADN HindIII de

14,5 kpb em pUC19 contêm todos os locais de amiloglucosidase (AG) de A. niger.

Visão esquemática da geração de fusões de genes de AG promotor/xilanase realizadas por reacçao em cadeia de polimerase.

Via para a construção do plasmídeo intermediário pXYL 2AG. / Abreviaturas: ver Figura 12_/

Via para a construção do plasmídeo intermediário pXYL

2. /Abreviaturas: ver Figura 12_/

Via para a construção do plasmídeo intermediário pXYL

3AG / Abreviaturas: ver Figura 12_/

Figura 18: Via para a construção do plasmídeo intermediário pXYL / Abreviaturas: ver Figura 12_/

Figura 19: Mapa de restrição parcial do fragmento BglII/SalI de

6.5 kb de T. reesei clonado em pEMBL18 (pIMO3Q·) . A caixa sombreada representa o fragmento de hibridação no interior da inserção.

Figura 20: Mapa de restrição parcial do fragmento BamHI/BglII de

7.5 kb de T. reesei clonado em pUC9 (pIMO41). A caixa sombreada representa o fragmento de hibridação no interior da inserção.

Figura 21: Representação esquemática das construções efectuadas pela criação de supressões na região do promotor de xlnA. Para orientação, ê indicado o local Xbal usado na clonagem do gene pYr A de A. niger.

Descrição Pormenorizada da Invenção

A presente invenção descerve sequências de ADN purificadas e isoladas de origem fúngica que codificam para xila nases e variantes genéticas destas sequências. A sequência de ADN inclui de preferência a sequência que codifica para a xilana se e as sequências reguladoras 5' e 3¹, As variantes genéticas incluem sequências de ADN híbrido contendo a sequência que codifica para a xilanase emparelhada com regiões reguladoras, tais como promotores, sinais de secreção e sinais de terminação, com origem em organismos homólogos ou heterólogos. As variantes genê ticas também incluem sequências de ADN que codificam para proteí nas de xilanase mutantes e sequências de ADN degeneradas onde a actividade de degradação da xilanase da enzima é mantida, A presente invenção também inclui sequências de ADN que são capazes de hibridar com as sequências de ADN que codificam para a xilana se e com as suas variantes genéticas, conforme descrito anterior mente, mas que podem diferir na sequência de codões devido à degeneração do código genético ou variações entre espécies.

A presente invenção também proporciona constru ções de ADN para a expressão de uma xilanase de interesse num hospedeiro de expressão pretendido. Estas construções de expres- 8 -

são incluem sequências de ADN híbridas contendo a região que codifica para a xilanase ligada de modo operacional a regiões regu ladoras, tais como promotores, sinais de secreção e sinais de terminação, com origem em organismos homólogos ou heterólogos, sendo estas regiões reguladoras capazes de dirigir a sobre-expre ssão da enzima codificada pela sequência de ADN que codifica para a xilanase num hospedeiro apropriado. De preferência, a construção de expressão serã integrada no genoma do hospedeiro de ex pressão seleccionado.

Para alem disso, a presente invenção proporcio na vectores, de preferência plasmídeos, para a clonagem e/ou transformação de hospedeiros microbianos através da introdução no hospedeiro microbiano das construções de ADN para a expressão da xilanase de interesse,

Adicionalmente, a presente invenção diz respei to a hospedeiros homólogos ou heterólogos transformados por con£ truções de ADN descritas anteriormente. Os hospedeiros de expres são microbiana podem ser seleccionados de entre bactérias, leveduras ou fungos.

No contexto da presente invenção, entende™se que o termo homólogo significa tudo o que ê nativo da sequência de ADN que codifica para a xilanase de interesse, incluindo as suas regiões reguladoras. Um hospedeiro homólogo ê definido como sendo a espécie a partir da qual essas sequências de ADN podem ser isoladas.

termo heterólogo ê definido em consequência como significando tudo o que não ê nativo da sequência de ADN que codifica para a própria xilanase de interesse, incluindo regiões reguladoras. Um hospedeiro heterólogo ê definido como sendo qualquer espécie microbiana que não aquela a partir da qual o gene que codifica para a xilanase foi isolado.

No âmbito da presente invenção, entende-se que as xilanases de interesse incluem qualquer enzima que degrade o xilano que seja produzida naturalmente por um fungo filamentoso. As xilanases de interesse particular são aquelas que são produzi das naturalmente por fungos filamentosos dos gêneros Aspergillus . Disporotrichum,Penicillium, Neurospora, Fusarium e Trichoderma.

São especialmente preferidas as xilanases com origem em Aspergillus awamori, Aspergillus aculeatus, Aspergillus tubigensis, Dis porotrichum dimorphosporum e Trichoderma reesei. As xilanases às quais ê dado um maior grau de preferência são aquelas com origem em Aspergillus tubigensis e Trichoderma reesei.

Uma endo-xilanase de interesse pode ser identi. ficada através de métodos de ensaio que não são críticos para a presente invenção, tais como um teste de mancha. De acordo com este método, um filtrado obtido a partir de um microorganismo in duzido (p.ex. com xilano de aveia bastarda) para produzir uma en doxilanase pode ser ensaiado no que respeita à presença de actividade de endo-xilanase. Depositam-se gotas das fracções de elui ção individualmente numa película de agar-agar contendo um tampão de citrato-fosfato (ver Exemplo 1.1, mais à frente) e xilano de aveia bastarda. A película ê então incubada. Se estã presente alguma actividade de endo-xilanase, a localização das gotas indi viduais na película de agar ê claramente visível.

A partir do momento em que uma xilanase de interesse foi identificada, a sequência de ADN que codifica para essa xilanase pode ser obtida a partir do fungo filamentoso que a produz naturalmente por cultura do fungo num meio eontendo xilano, isolando a xilanase desejada através de métodos conhecidos tais como cromatografia de coluna (p.ex. HPLC - ver Figura 2) e determinando pelo menos uma porção da sequência de ácidos aminados da proteína purificada.

As sondas de ADN podem daí em diante ser construidas por síntese das sequências oligonucleotídicas baseadas na sequência de ácidos aminados parcial. As sequências de ácidos aminados podem ser determinadas a partir da extremidade N-terminal da proteína completa e/ou a partir das extremidades N-termi nais de fragmentos de peptídeos internos obtidos por digestão proteolítica ou química da proteína completa. Uma vez obtidas, a (s) sonda(s) de ADN são então usadas para proceder a uma busca num banco genõmico ou de ADNc.

Se este método não fôr coroado de êxito, ê possível proceder a uma busca diferenciada do banco genómico com sor das de ADNc obtidas a partir do ARNm de células induzidas e não

induzidas. 0 ARN induzido é preparado a partir de células cultivadas num meio que contém xilano como fonte de carbono, enquanto que o ARNm não induzido deve ser isolado a partir de células cul tivadas numa fonte de carbono que não seja xilano, por exemplo glucose. De entre os clones que hibridam apenas com a sonda de ADNc induzida, ê possível recuperar um clone que contenha o gene da xilanase pretendido. Em alternativa, pode identificar-se um gene de xilanase por hibridação cruzada com uma sequência de xilanase relacionada (ver Exemplo 7 seguidamente).

Pode preparar-se um banco genõmico por digestão parcial do ADN dos cromossomas fúngicos com uma enzima de restrição apropriada, por exemplo Sau3A, e clonagem dos fragmentos resultantes num plasmídeo apropriado ou num vector fãgico lambda, por exemplo lambda EMBL 3. Em seguida, após inoculação de cápsulas de Petri com uma quantidade suficiente de colónias ou de placas, o banco genõmico ou de ADNc pode ser submetido a uma busca com uma sonda de ADN adequada.

Em alternativa, pode preparar-se um banco de ADNc por clonagem de ADNc, sintetizado a partir de ARNm isolado a partir de células fúngicas induzidas para a síntese de xilanase, num vector fãgico apropriado, por exemplo, lambda gt 10 ou lambda gt 11. O banco de ADNc pode em seguida ser submetido a uma busca com uma sonda de ADN ou em alternativa usando meios imunolõgicos ou por meio de uma análise de placas.

Numa forma preferida de concretização da prese nte invenção, projectam-se sondas oligonucleotídicas a partir da sequência de ãcidos aminados N-terminal (ver Figura 3, formula 1) ou de uma xilanase com um peso molecular aparente de 25 kDa purificada a partir de um filtrado de cultura de Aspergillus tubigensis e/ou a partir da sequência de ãcidos aminados de um fra gmento peptídico interno (ver Figura 4, fórmula 2) obtido por di gestão da xilanase com endoprotease VB de Staphylococcus aureus. As misturas oligonucleotídicas apresentadas nas Figuras 3 e 4 são complementares do ARNm da xilanase correspondente deduzido. Obtiveram-se quatro clones fãgicos a partir de uma busca de um banco lambda EMBL 3, preparado a partir de ADN isolado de Asper• gillus niger DS16813 digerido parcialmente com Sau3A, com a mis11

tura oligo N-terminal AB 800 (unia mistura de quantidades iguais de AB801 a AB806, ver Figura 3). Depositou-se Aspergillus niger DS16813, mais tarde classificado como pertencendo mais provavelmente â espécie Aspergillus tubigensis (Kusters-van Someren et al., (1991)), no Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Países Baixos, em 20 de Julho de 1990, sendo-lhe atribuido a designação CBS 323.90.

Isolou-se ADN a partir dos quatro clones fãgicos hibridados com a mistura oligo N-terminal bem como com a mis tura oligo derivada da sequência de ãcidos aminados do fragmento interno (ver Figura 4). Uma análise com enzimas de restrição revelou que os quatro clones continham ADN da mesma região genõmicu de A.tubigensis.

Sequenciou-se uma região de aproximadamente

2,1 kb que híbrida com as duas misturas oligo. A sequência nucle õtidica, conforme se representa na Figura 8, contêm uma sequência de 681 pb que codifica para uma xilanase (que ê interrompida por um pequeno intrão de 49 pb a partir da posição 1179 até â po sição 1230), bem como sequências de 949 e 423 nucleõtidos das re giões de flanco 5' e 3’, respectivamente.

Também se descobriram variantes entre as proteínas xilanase purificadas. Determinou-se que as xilanases correspondentes têm três extremidades N-terminais diferentes, possi velmente como resultado das condições de fermentação. Aproximada mente um terço destas xilanases possuem serina como o ãcido aminado N-terminal (Figura 8, posição 1), aproximadamente outro ter ço das xilanases possuem alina como o ãcido aminado N-terminal (Figura 8, posição 2) e as proteínas restantes possuem glicina como o ãcido aminado N-terminal (Figura 8, posição 3).

A disponibilidade de uma sequência de ADN que codifica para uma proteína xilanase possibilita a construção de xilanases mutantes por mutagénese dirigida a locais determinados. Se as estrutura terciária da xilanase é conhecida, e os seus domínios catalítico e de ligação ao substrato se encontram localizados, podem seleccionar-se ãcidos aminados para a mutagenese (por exemplo com a ajuda de modelação por computador) que com to da a probabilidade afectam as funções catalítica e/ou de ligação ao substrato. Se a mistura terciária da proteína não ê conhecida

ção integral ou a estrutura da proteína pode ser prevista por comparação com xilanases conhecidas semelhantes isoladas a partir de outros microorganismos.

A fim de facilitar a inserção do fragmento de ADN que contém a sequência que codifica para a xilanase em construções de expressão que contêm uma ou vãrias regiões de regulação heterõlogas, pode usar-se a reacção de polimerase em cadeia (polimerase chain reaction = PCR) (Ehrlich, H.A. (editor), 1986) para a introdução de locais de enzimas de restrição apropriadas nas extremidades 5’ e 3' da sequencia que codifica para a xilana se. A escolha de locais de restrição depende da sequência de ADN do vector de expressão, isto ê, da presença de outros locais de restrição na molécula de ADN.

A fim de obter uma sobre-expressão da proteína xilanase nas espécies de produção originais (homologas), ou em alternativa numa outra estirpe fúngica, introduz-se um fragmento Sall de 6,9 kb (ver Figura 5) contendo o gene completo com as suas regiões 5’ e 3¹, ou em alternativa o gene completo fundido às regiões de regulação ou a outros genes, no hospedeiro de expressão seleccionado a fim de aumentar o número de copias do gene e, em consequência, a expressão da proteína.

Se se prefarir um hospedeiro de expressão hete rõlogo e se seleccionar uma levedura ou uma estirpe bacteriana, usa-se uma sequência de ADN ininterrupta (sem intrões) para a construção de um vector de expressão heterõlogo a fim de evitar a possibilidade de que sinais de corte que residam no fragmento genómico não sejam conhecidos pelo hospedeiro heterõlogo. Esta sequência de ADN inirterrupta pode ser obtida a partir de um banco de ADNc construido a partir de ARNm isolado das células, indu zido para a síntese de xilanase. Este banco pode ser submetido a uma busca com um oligonucleõtido ou com uma sonda de ADNc obtida como descrito anteriormente. Em alternativa, ê possível obter-se uma sequência de ADN ininterrupta por aplicação de uma reacção de polimerase em cadeia usando oligonucleótidos 5¹ e 3¹ apropria dos no ADNc da primeira cadeia sintetizado a partir do ARN de cê lulas induzidas por xilano.

No contexto da presente invenção, define-se so bre-expressão como a expressão da xilanase de interesse a níveis superiores aos encontrados normalmente no organismo homólogo de tipo selvagem. No mesmo contexto, sobre-expressão também signifà ca a expressão da xilanase de interesse num organismo heterõlogo que não produz normalmente a referida xilanase excepto por ter sido introduzida uma sequência de ADN que codifica para a xilana se de interesse no hospedeiro de expressão heterõlogo. A descendência destes hospedeiros de expressão são, como ê evidente, tam bem considerados abrangidos na presente invenção.

A sobre expressão da xilanase de interesse pode também ser conseguida pela selecçao de regiões reguladoras heterõlogas, por exemplo regiões do promotor, do guia de secreção e do terminador, que servem para aumentar a expressão e, se pretendido, os níveis de secreção da proteína de interesse a partir do hospedeiro de expressão escolhido e/ou para proporcionar a re gulação inductível da expressão da xilanase de interesse.

Para além do promotor nativo da xilanase de interesse, podem ser usados outros promotores a fim de dirigir a respectiva expressão. 0 promotor pode ser seleccionado pela respectiva eficácia na direcção da expressão da xilanase de interes se no hospedeiro de expressão pretendido.

Numa outra forma de concretização, pode seleccionar-se um promotor constitutivo a fim de dirigir a expressão da xilanase pretendida, relativamente isenta de outras xilanases. Uma construção de expressão como esta ê além de tudo vanfejosa uma vez que ultrapassa a necessidade de cultivar o hospedeiro de expressão num meio que contenha xilanos sólidos para substrato indutor.

São exemplo de promotores constitutivos e/ou inductíveis fortes que são preferidos para utilização em hospedei ros de expressão fúngicos os promotores da sintetase de ATP, da subunidade 9 (oliC), da isomerase de triose-fosfato (tpi), da de sidrogenase de álcool (adhA), da-amilase (amy), da amiloglucosidade (AG), da acetamidase (amdS) e da desidrogenase de glicaraldeído-3-fosfato (hPd.) * São exemplos de promotores fortes de leveduras • os promotores da desidrogenase de álcool, da lactase, da quinase de 3-fosfoglicerato e da isomerase de triose-fosfato.

São exemplos de promotores fortes bacterianos oa promotores da <-amilase e Spo2bem como os promotores dos genes de proteases extracelulares.

Podem também ser usados com vantagem promotores híbridos a fim de melhorar a regulação inductível da constru ção de expressão.

Os promotores preferidos para a presente inven ção são os que são provenientes do gene da amiloglucosidase (AG) e os promotores da xilanase nativa.

É muitas vezes desejável que a xilanase de interesse seja segregada pelo hospedeiro de expressão para o meio de cultura de onde a xilanse pode ser recuperada mais facilmente

De acordo com a presente invenção, a sequência guia de secreção nativa da xilanase de interesse pode ser usada para promover a secreção da xilanase expressa.

No entanto, um aumento da expressão da xilanase muitas vezes tem como resultado a produção da proteína a níveis para lã do que o hospedeiro de expressão ê capaz de processar e de segregar, provocando uma acumulação da proteína no inte rior da célula devido a um engarrafamento no transporte da proteína através da parede da célula. Deste modo, a presente invenção proporciona também sequências guia heterólogas a fim de proporcionar uma secreção mais eficaz da xilanase a partir do hospe deiro de expressão escolhido.

De acordo com a presente invenção, o guia de secreção pode ser seleccionado com base no hospedeiro de expressão pretendido. Pode escolher-se um guia de secreção heterólogo que seja homólogo de outras regiões reguladoras na construção de expressão. Por exemplo, pode usar-se o guia da proteína amiloglu cosidade que é segregada em alto grau em combinação com o próprio promotor de amiloglucosidade, bem como em combinação com ou tros promotores. Podem também ser usadas com vantagem no contexto da presente invenção sequências de sinal híbridas.

São exemplos de sequências guia de secreção he terólogas preferidas as provenientes do gene da amiloglucosidade (fungos) , do gene do factor . oí (leveduras) ou do gene da<< -amilase (Bacillus).

As sequências guia de secreção especialmente preferidas de acordo com a presente invenção são as provenientes do gene da amilo glucosidade (AG) e a sequência guia da xilanase nativa.

Em geral não se considera que os terminadores sejam elementos críticos para a sobre-expressão de genes, Se pre tendido, pode seleccionar-se um terrninador dos mesmos genes dos promotores ou em alternativa pode utilizar-se o terrninador homólogo.

Para alêm do fragmento genómico mencionado anteriormente, o ADN de transformação pode conter um marcador de selecçâo a fim de discriminar as células que incorporam o gene pretendido a partir do conjunto das células não transformadas. Este marcador de selecçâo, que contem as sequências de regulação 5’ e 3' apropriadas, pode residir na mesma molécula de ADN que contêm o gene pretendido ou pode estar presente numa molécula separada. No último caso, deve efectuar-se uma co-transformação. A proporção entre o vector de expressão e o vector de selec ção deve ser ajustada de tal modo que uma percentagem elevada dos transformantes seleccionados incorpore também o vector que contêm a construção de expressão da xilanase de interesse.

Os sistemas de selecçâo mais adequados para mi cro-organismos industriais sao os formados pelo grupo de marcado res de selecçâo que não necessitam uma mutação no organismo hospedeiro. São exemplos de marcadores de selecçâo fúngicos os genes da acetamidase (amdS), da sintetase de ATP, da subunidade 9 (oliC) e da resistência a benomil (benA). São exemplos de marcadores de selecçâo não fúngicos o gene de resistência a G418 (levedura) , o gene de resistência a ampicilina (E. coli) e o gene de resistência a neomicina (Bacillus).

Uma vez pronta a construção de expressão pretendida, transforma-se com esta construção o hospedeiro de clona gem adequado como por exemplo E.coli a fim de a propagar. Em seguida, introduz-se a construção de expressão num hospedeiro de expressão adequado em que a construção de expressão seja de preferência integrada no genoma. Podem ser usados certos hospedeiros, como por exemplo espécies de Bacillus tanto para hospedeiros de clonagem como para hospedeiros de expressão, evitando des^

te modo una operação, adicional de transformação.

De acordo com a presente invenção, podem usar-se vários hospedeiros de expressão a fim de sobre-expressar a xilanase de interesse. Numa forma de concretização, pode usar-se um hospedeiro de expressão heterólogo. Neste caso torna-se neces sãrio dfectuar a introdução da construção de expressão pretendida novamente na estirpe de onde se isolou a sequência de ADN que co difica para a xilanase num maior número de cópias do gene ou sob a regulação de regiões de regulação heterólogas, conforme descri to seguidamente, ou conjugando estas duas circunstâncias.

Numa outra forma de concretização, pode obter-se a sobre-expressão de uma xilanase de interesse por introdução e expressão da construção de ADN que codifica para a xilanase de interesse sob a regulação das regiões de regulação apropri adas em hospedeiros heterólogos como sejam bactérias, leveduras ou fungos. Para este fim, a sequência de ADN que codifica para a xilanase é de preferência expressa sob a regulação das sequências do promotor e do terminador provenientes do hospedeiro heteró logo. Para além disso, pode ser necessário substituir a sequência guia de secreção nativa da xilanase de interesse por uma sequência guia homóloga do hospedeiro de expressão a fim de obter a expressão e a secreção do produto da maior eficácia possível.

Factores como a dimensão (peso molecular), a possível necessidade de glicosilação ou a vantagem de obter uma secreção extracelular da xilanase de interesse desempenham um papel importante na selecção do hospedeiro de expressão.

A bactéria Gram-negativa E.coli ê largamente usada como hospedeira para a expressão de genes heterólogos, mas na maioria dos casos verifica-se a acumulação de grandes quantiiades da proteína heteróloga no interior da célula. A purificação subsequente da proteína pretendida a partir do conjunto das proteínas intracelulares de E.coli pode por vezes ser difícil.

Ao contrário do que se passa com E.coli, as bac vêrias do gênero Baclllus são muito adequadas como hospedeiros íeterólogos em virtude da sua capacidade de segregar proteínas pa :a o meio de cultura.

, Em alternativa, pode preferir-se um hospedeiro \ leterõlogo a partir de leveduras ou de fungos. Em geral as celu- 17 -

las de leveduras são preferidas as células fúngicas em virtude de serem mais fãceis de manipular. No entanto algumas proteínas são segregadas pelas células de leveduras apenas em quantidades reduzidas, ou em certos casos não são processadas de modo adequa do (p. ex. hiperglicosilação em leveduras). Nestes casos deve se leccionar-se um organismo hospedeiro fúngico.

Pode escolher-se também um hospedeiro heterélo go para expressar a xilanase de interesse substancialmente isenta de outras enzimas de degradação de polissacarídeos por selecção de um hospedeiro que não produza normalmente esta enzima, co mo por exemplo Kluyveromyces lactis.

São exemplos de hospedeiros de expressão prefe ridos abrangidos pelo âmbito da presente invenção fungos, como espécies de Aspergillus (descritas em EP 184 438 e EP 284 603) e espécies de Trichoderma, bactérias como sejam espécies de Bacillus (descritas na EP 134 048) e leveduras, como por exemplo espe cies de Kluyveromyces (descritas em EP 96 430 e EP 301 670) e es pêcies de Saccharomyces.

Podem seleccionar-se vectores de expressão par ticularmente preferidos de Aspergillus niger, Aspergillus awamori Aspergillus aculeatos, Aspergillus oryzae, Aspergillus tubigensie Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Kluyveromyces lactis e Saccharomyces cerevisiae.

A sobre-expressão da xilanase de interesse ê efectuada por meio da cultura dos hospedeiros de expressão que foram transformados com a construção de expressão da xilanase nun meio nutriente de fermentação normal.

meio de fermentação é um meio de fermentação normal constituido por uma fonte de carbono (por exemplo, glucose, maltose, melaço, etc.), uma fonte de azoto (por exemplo, sulfato de amónio, nitrato de amónio, cloreto de amónio, etc.), uma fonte de azoto orgânico (por exemplo, extracto de levedura, extra eto de malte, peptona, etc.) e nutrientes inorgânicos (por exemplo, fosfato, magnésio, potássio, zinco, ferro, etc.). Opcionalmente pode incluir-se um indutor (por exemplo, xitano de aveia bastarda).

>

, A selecção do meio apropriado pode ser baseada na escolha de hospedeiros de expressão e/ou baseada nas necessi- 18 -

dades de regulação da construção de expressão. Estes meios são bem conhecidos dos especialistas da matéria. 0 meio pode, se assim se pretender, conter outros componentes que favorecem os hoss pedeiros de expressão transformados em relação de outros micro-organismos potenciais contaminantes.

A fermentação ê efectuada durante um período de 0,5 a 20 dias num processo descontínuo ou com alimentações parciais a uma temperatura da ordem de 0 a 45°C e a um pH entre 2 e 10. As condições preferidas de fermentação são uma temperatu ra entre 20 e 37°C e um pH entre 3 e 9. As condições apropriadas são seleccionadas com base na escolha do hospedeiro de expressão,

Apõs a fermentação, as células são removidas do caldo de fermentação por meio de centrifugação ou de filtração. Apõs remoção das células, a xilanase de interesse pode ser então recuperada e, se assim se pretender, purificada e isolada por técnicas normais.

produto pode ser formulado de modo estável em formas líquidas ou sólidas. Para determinadas aplicações pode ser preferida a imobilização da enzima numa matriz solida.

As xilanses de interesse produzidas por meio da presente invenção podem ser aplicadas isoladamente ou em conjunto com outras enzimas seleccionadas em vários processos que necessitam a acção de uma enzima de degradação de xilano. Para além disso, as xilanases fúngicas da presente invenção, que geralmente possuem valores de pH óptimos mais baixos do que as xilanases de origem bacteriana, são especialmente adequadas para utilização em processos industriais que são efectuadas a baixo pE.

De acordo com a presente invenção, verificou-se: que as xilanases produzidas por meio do processo da presente invenção podem ser usadas em panificação. A incorporação de pequenas quantidades de xilanase na farinha confere características favoráveis à massa e deste modo ao próprio pão, como por exemplo aumento de volume e melhores características de textura, como se jam as qualidades de quebra e esmigalhamento e a qualidade do mi olo.

Também é possível adicionar xilanases a alimen tos compostos para animais que sejam ricos em arabinoxilanos e

glicoxilanos.

Quando se adicionam xilanases a alimentos (incluindo silagem) para animais monogástricos (por exemplo, aves de capoeira ou suinos) que contem cereais como cevada, trigo, mi lho, centeio ou aveia ou a sub-produtos de cereais, como por exemplo farelo de trigo ou farelo de milho, a enzima melhora significativamente a decomposição das paredes celulares o que possi bilita uma melhor utilização dos nutrientes da planta pelo animal. Como consequência, a velocidade de crescimento e/ou a conversão do alimento são melhorados. Para além disso, pode usar-se xilanase para reduzir a viscosidade de alimentos que contenham xilano.

A xilanase pode ser adicionada previamente aos alimentos ou à silagem se se preferem dietas pré-humedecidas ou húmidas. De modo especialmente vantajoso, no entanto, as xilanases produzidas por meio da presente invenção quando adicionadas aos alimentos continuam a hidrolisar os xilanos no alimento in vivo. As xilanases fúngicas, que geralmente possuem valores de pH óptimo mais baixos, são capazes de libertar nutrientes importantes nestes ambientes ácidos como o do estômago dos animais que ingerem estes alimentos suplementados como xilanase.

As xilanases produzidas por meio da presente invenção são também eficazes para melhorar a filtração e a remoção das substâncias orgânicas dissolvidas do caldo em processos em que os resíduos de destilarias de maçãs são convertidos por via biológica em biomassa microbiana. As xilanases provenientes de fungos filamentosos podem ser usadas com vaniagem nestes processos .

Também de acordo com a presente invenção, produzem-se xaropes de glucose com uma facilidade de filtração e/ou uma viscosidade mais baixa a partir de amido impuro de cereais submetendo o amido impuro em primeiro lugar â acção de uma << -ami lase, em seguida de xilanases fúngicas por meio da presente invenção e finalmente a uma hidrólise. De modo semelhante, as xila nases da presente invenção podem ser usadas na indústria cervejeira para melhorar a facilidade de filtração do mosto.

Também se podem usar xilanases para remover as lenhinas da pasta kraft e deste modo facilitar o branqueamento

reduzindo a quantidade de cloro necessário na preparação de papel.

Para alem disso, as xilanases produzidas por meio da presente invenção podem ser usadas noutros processos como por exemplo para aumentar o rendimento na preparação de sumos de frutos ou de vegetais ou na hidrólise enzimática da polpa de açúcar de beterraba, sendo a fracção hidrolisada resultante apro priada para utilização em meios de cultura de micro-organismos; de resíduos agrícolas como sabugo de milho, palha de trigo e cas cas de nozes moídas; e de determinados materiais recicláveis, co mo resíduos de papel.

Os exemplos que se seguem são apresentados a fim de proporcionar aos especialistas na matéria uma divulgação e uma descrição completa de como fazer uso da invenção e não devem ser considerados como podendo significar qualquer limitação do âmbito do objecto da invenção tal como ele-ê entendido pelos seus inventores. Foram feitos os melhores esforços para assegurar a precisão dos dados numéricos apresentados (por exemplo, quantidades, temperaturas, pH, etc.) mas podem ter ocorrido erros experimentais e desvios. Sempre que nada em contrário seja indicado, a temperatura é em graus Celsius e a pressão ê a atmosféri ca ou próximo desta.

EXEMPLO I

Purificação e caracterização de endo-xilanase XYL A de Aspergillus tubigensis.

Exemplo 1.1

Purificação de endo-xilanase XYL A de Aspergillus tubigensis.

Obteve-se um filtrado de cultura fazendo uma cultura de Aspergillus niger DS16813 (CBS 323.90 - mais tarde re classificado como pertencendo mais provavelmente â espécie A. tu bigensis; Kusters-van Someren et al. (1991)) num meio contendo (por litro): 30 g de xilano de aveia bastarda (Sigma); 7,5 g de . NH₄NO₃, 0,5 g de KCl, 0,5 g de MgSO₄, 15 g de KH₂PO₄ e 0,5 g de • extracto de levedura (pH 6,0). Concentrou-se o filtrado da cultu - ra atê um volume de aproximadamente 35 ml que em seguida se sub- 21 -

meteu a ultrafiltração num filtro Diaflo PM 10 num modulo Amicon de 50 ml para eliminar os sais.

Concentrou-se em seguida o sobrenadante atê um volume de 10 ml e lavou-se o retentado duas vezes com 25 ml de tampão de tris-HCl 25 mM (pH 7,0). Apõs a lavagem, ajustou-se o volume do produto retentado a 25 ml.

Injectou-se este retentado em quantidades de 1 ml numa coluna Syn Chropak AX 300 (dimensões: 10 x 250 mm) e

regime de	HPLC:
ml/min
tris-HCl	25 mM	de pH	7,0
tris-HCl	25 mM	de pH	7,0 + NaCl 1 M
ι: tempo
(min)	Q. Ό	de A	% de B
0		99	1
12		97	3
30		80	20
50		50	50
70		0	100
90		0	100
95		99	1

Recolheram-se fracções de 1 ml cada. A detecção da proteína eluida foi efectuada por medição contínua da absorção de UV a 280 nm. Na Figura 2 mostra-se o perfil de eluição,

Analisaram-se as fracções para detectar a presença de actividade de endoxilanase por meio de uma análise de mancha.

Esta análise de mancha consiste na adição de 12 ml de tampão de citrato fosfato (preparado por mistura de 900 ml de Na2HPO^ 0,2 M e 125 ml de ãcido cítrico 0,5 M seguida de um ajustamento do pH da solução a pH 5,6 usando ácido cítrico 0,5 M ou Na2HPO^ 0,2 M) contendo 0,5% de xilano de aveia bastarda (Sigma) a 180 mg de agar-agar (Difco) e aquecimento da mistura a 100°C a fim de dissolver o agar-agar. Apõs arrefecimento atê 60°C, verte-se a mistura de agar-agar regularmente numa pelí • cuia revestida de gel de agarose. Depositam-se gotas das fracções

de eluição individualmente sobre a película e incuba-se durante 30 min. a 30°C. Se estiver presente qualquer actividade de endoxilanase, a localização de cada gota ê visível nitidamente na pe· lícula de agar-agar.

Determinou-se quantitativamente a actividade total das fracções recolhidas por medição da quantidade de açúca res redutores produzidos durante um período de tempo prê-determi nado na microanãlise descrita por Leathers et al. (1984), usando como substrato xilano de aveia bastarda em acetato de sódio 50 mM a pH 5,0. As unidades de actividade são também as definidas por Leathers (supra).

Determinou-se a actividade de exo-xilanase nas fracções eluidas pelo método descrito por Poutanen e Puis (1988) usando como substrato p-nitro-fenil-^-D-xilopiranosido (0,3 mM), Sigma) a pH 5,0 e a 30°C.

Por meio da análise de mancha verificou-se que as fracções eluidas correspondentes aos picos Β, F e K (ver Figu ra 2) continham actividade de endo-xilanase. A análise da xilana se total revelou actividade nas fracções eluidas dos picos B, F, H e K. Verificou-se que as fracções eluidas dos picos B e H continham actividade de exo-xilanase.

Purificaram-se as fracções eluidas dos picos F (proteína XYL2) e K (proteína XYL A) por cromatografia de permuta iónica repetida. Caracterizaram-se as endo-xilanases contidas nestas fracções por SDS-PAGE (Moonen et al., 1982) e focagem iso -elêctrica (3,5 pH 9,5) em equipamento LKB de acordo com as instruções do fabricante. O peso molecular aparente da endo-xila nase F era de aproximadamente 22 kDa, por determinação por SDS-PAGE; o peso molecular aparente da endo-xilanase K era de aproximadamente 24 kDa. O ponto iso-elêctrico (PIE) da endo-xilanase F era de aproximadamente pH 4,0, enquanto que se verificou que o PIE da endo-xilanase K era inferior a pH 3,5.

Exemplo 1.2

Sequenciação de ácidos aminados da extremidade N-terminal da endo-xilanase XYL A do Aspergillus tubigensis.

Submeteram-se aproximadamente 5 ug de endo-xi23

lanase, purificada conforme se descreve no Exemplo 1.1, a electroforese num gel de SDS-poliacrilamida a 12%, seguida de deposi ção eléctrica de gotas sobre uma membrana de Immobilon P (Millipore), de acordo com o método descrito por Matsudaira (1987). Submeteu-se o fragmento de membrana que contêm a banda principal com um peso molecular aparente (SDS-PAGE) de 25 kDa a análise de sequenciação num sequenciador de fase gasosa (Eurosequence, Groningen). Determinou-se a seguinte sequência N-terminal:

10

Ala-Gly-Ile-Asn-Tyr-Val-Gln-Asn-Tyr-Asn (Figura 3, Fórmula 1)

No entanto descobriram-se também quantidades aproximadamente iguais de outras duas variantes em que se verifi cou que o ácido aminado N-terminal era uma serina (Figura 8, posição 1) ou uma glicina (Figura 8, posição 3).

Exemplo 1.3

Determinação da sequência de ácidos aminados dos peptídeos da endo-xilanase XYL A libertados pela endo-protei nase Glu-C.

Dissolveram-se cerca de 260 yug de endo-xilanase, purificada conforme descrito no exemplo 1.1, em 110 ^.<1 de uma solução contendo tampão de bicarbonato de amónio 50 mM de pH

7,5 e 2 mg/ml de SDS. Após aquecimento da solução durante 3 minu tos a 100°C arrefecimento atê à temperatura ambiente, adicionou-se -endo-proteinase Glu-C (protease VB de Staphylococcus aureus) num excesso molar, de 18 vezes. Levou-se a efeito uma digestão das proteínas durante 20 minutos â temperatura ambiente, depois do que se aqueceu a mistura reaccional durante três minutos a 100°C.

Submeteu-se cerca de um quinto da mistura reac cional a electroforese num gel de SDS-poliacrilamida a 15%, seguida de depósito de gotas sobre uma membrana de Immobilon P (Mi llipore) de acordo com o método descrito por Matsudaira (1987) . Foram observados três fragmentos com uma massa molecular de 19, 16 e 4 kDa, respectivamente. Usaram-se os dois fragmentos maiores (19 e 16 kDa) numa sequenciação de fase gasosa (Sequenciador

de proteínas modelo 470A de Applied Biosystems, Eurosequenee, Groningen). Lavaram-se fragmentos da membrana contendo 2 a 3 nmo L do peptídeo e submeteram-se a análise de sequenciação, de acordo com o programa descrito por Amons (1987).

Determinou-se a seguinte sequência de ácidos aminados N-terminal a partir do fragmento de 19 kDa:

10 14

Tyr-Tyr-Ile-Val-Glu-Asp-Tyr-Gly- X -Tyr-Asn-Pro-Cys-(Ser) (Figura 4, Formula 2)

Não foi possível determinar a identidade do ácido aminado na posição 9 (X), Na posição 14 determinou-se apenas um traço de Ser, como se indica por meio dos parêntesis.

Determinou-se a seguinte sequência de ácidos aminados a partir da extremidade N-terminal do fragmento de 16 kDa:

10 14

Tyr-Tyr-Ile-Val-Glu-Asp-Tyr-Gly-(Ser)- X -Asn-Pro-Cys-Ser (Figura 4, Fórmula 3)

Não foi possível determinar a identidade do ácido aminado na posição lo. A sequência determinada para este fragmento ê quase idêntica à sequência do fragmento de 19 kDa. Ambos os peptídeos apresentam a mesma sequência N-terminal, que não é idêntica à sequência N-terminal determinada para a proteína intacta (Exemplo 1.2, Fórmula 1). Verificou-se que estes dois fragmentos internos correspondem à sequência que começa na posição 79, conforme se ilustra na Figura 8.

EXEMPLO 2

Construção de um banco genómico da estirpe de Aspergillus niger DS16813 (CBS 323.90; mais tarde reclassificado com A. tubigensis).

Exemplo 2.1

Isolamento de ADN de Aspergillus niger DS16813 (CBS 323.90; mais tarde reclassificado com A. tubigensis).

Isolou-se o ADN fúngico por meio do procedimen to descrito por de Graaft et al., (1988). Recolheu-se o micêlio,

cultivado de um dia para o outro em meio mínimo líquido (por 1000 ml: 6,0 g de NaNO₃; 1,5 g de KH₂PC>₄; 0,5 g de BgSD₄.7H₂O; 0,5 g de KC1; 1 ml de solução Visniac / Visniac e Santer, 1957: 10 g de EDTA; 4,4 g de ZnSO_4<.7H₂O; 1,0 g de MnCl₂.4H₂O; 0,32 g de CoCl₂.6H₂0; 1,0 g FeSO₄.7H₂O; pH 4,0/; pH 6,0) suplementado com 0,2% de ácidos casamínicos e 0,5% de extracto de levedura, lavou-se com salina fria, congelou-se em azoto líquido e armazenou-se a -80°C. Isolaram-se ácidos nucleicos por disrupção de 0,5 g de micélio congelado usando um microdesmembrador (Braun).

O põ de micélio obtido foi extraído com tampão de extracção preparado de fresco.

Preparou-se o tampão de extracção do modo seguinte :

ílisturou-se bem 1 ml de ãcido tri-isopropilnaf talenossulfônico (TNS) (20 mg/ml) eom 1 ml de ãcido p-aminossali cílico (PAS) (120 mg/ml) e adicionaram-se 0,5 ml de tampão 5 x RNB (por cada 1000 ml: 121,10 g de tris; 73,04 g de NaCl; 95,10 g de EGTA; ajustado a pH 8,5 com HCl). Após adição de 1,5 ml de fenol, equilibrou-se o tampão de extracção durante 10 minutos a 55°C. Adicionou-se em seguida o tampão quente ao micélio em põ e misturou-se bem a suspensão durante 1 minuto usando um mistura dor de vortex. Após adição de 1 ml de clorofórmio, misturou-se ~ ~ 4 novamente a suspensão durante 1 min. Apos centrifugação a 10 x x g durante 10 minutos usando uma centrífuga de alta velocidade Sorvall, extraiu-se a fase aquosa uma vez mais com um volume igual de fenol/clorofórmio (1:1) e em seguida extraiu-se duas vezes com clorofórmio. Isolou-se o ADN a partir da fase aquosa usando o seguinte procedimento: precipitou-se imediatamente o ADN com 2 volumes de etanol â temperatura ambiente e em seguida sepa rou-se por centrifugação usando uma centrífuga de alta velocida4 de Sorvall a 10 x g durante 10 min., lavou-se duas vezes por re dissolução do ADN em ãgua destilada estéril e precipitou-se nova mente eom etanol. Eliminou-se o ARN por adição de RNase A (20 g /^g/ml) à solução final.

Exemplo 2.2

Digestão parcial de ADN de Aspergillus tubigen sis com Sau 3A e isolamento dos fragmentos de ADN apõs electofo rese em gel de agarose.

Digeriu-se parcialmente ADN (30 ,ug) , isolado a partir de Aspergillus niger DS16813 (recentemente reclassifiçado como A tubigensis) conforme descrito no exemplo 2.1, por incubação do ADN com 0,1 de Sau 3A durante 30 minutos a 37°C. Fraccionaram-se os fragmentos resultantes de acordo com a dimensão de cada um por electoforese em agarose a 0,4% em tampão de TAE contendo 0,5 ug/ml de brometo de etídeo. Recolherem-se fragmentos de 14 kb a 22 kb de dimensão, por comparação com fragmentos de ADN do bacteriófago lambda digerido com BglII (22,0, 13,3, 9,7,

2,4 0,65 e 0,44 kb) como marcadores de dimensão, a partir do gel por corte das regiões apropriadas do gel.

Recuperaram-se estes fragmentos a partir da fracção de agarose por electro-eluição usando receptãculos ISCO. Montou-se uma membrana de dialise nos dois contentores do receptãculo, no contentor maior e no contentor menor, encheu-se o receptãculo com 0,005 x TAE (diluido a partir de solução mãe 50 x x TAE (por 1000 ml); 242,0 g de tris; 57,1 ml de ácido acético glacial; e 100 ml de EDTA 0,5 M; ajustado a pH 8,0 com HCl) e co locou-se a fracção de agarose no contentor maior do receptáculo. Em seguida colocou-se o receptáculo no aparelho de electro-eluição, com o contentor maior na câmara do cátodo contendo TAE e o contentor menor na câmara do anodo contendo TAE/NaCl 3M. Electro -eluiram-se os fragmentos a 100 V durante um período de 2 horas. Em seguida retirou-se o receptáculo do aparelho de electro-eluição e eliminou-se o tampão do contentor maior, enquanto que do contentor menor apenas se eliminou o tampão da parte superior.

O tampão restante (200 ^ul) contendo os fragmentos de ADN foi dia lisado no receptáculo contra ãgua destilada durante um período de 30 minutos. Por fim, precipitou-se o ADN por adição de 0,1 vo lume de NaAc 3 M a pH 5,6 e 2 volumes de etanol frio (-20°C). Re colheu-se o ADN por centrifugação (centrífuga de Eppendorf) durante 30 minutos a 14 000 x g a 4°C. Apõs remoção do sobrenadante, secou-se o agregado de ADN usando uma centrífuga de vácuo Sa vant Speedvac. Apõs precipitação com etanol, dissolveu-se o ADN em 10 /a1 de tampão TE (tris.HCl 10 mM de pH 8,0; EDTA lmM de pH 8,0) e determinou-se a concentração por electoforese em agarose,

usando ADN de bacteriófago lambda com uma concentração conhecida como referência e coloração por brometo de etídio para detecção do ADN.

Exemplo 2.3

Colnagem dos fragmentos de ADN de Aspergillus tubigensis no bacteriófago lambda EMBL 3.

Ligaram-se nos braços do bacteriófago lamba EMBL 3 BamHI, fornecido por Promega, fragmentos obtidos por digestão parcial de ADN genómico, conforme descrito no Exemplo 2.2 pelo procedimento seguinte: Pipetaram-se 4 /XL (2 pg) de ADN de EMBL 3, 1 /XL (50 ng) de fragmentos de ADN genómico, 0,75 /λ1 de 10 x tampão de ligação (Maniatis et al., 1982, pp. 474: tris.HCl 660 mM; MgClg 50 mM; ditiotreitol 50 mM; e ATP 10 mM; a pH 7,6), 0,75 de ATP 10 mM; a pH 7,6) , o,75 /j1 de ATP 10 mM e 2 pl (1,5 U/jlCL) de ligase de ADN T₄ (BRL) , misturou-se cuidadosamente e incubou-se durante 6 horas a 14°C. Após este período de incubação, adicionou-se 1 /.<1 de ligase de ADN à mistura reaccio nal e continuou-se a reacção durante mais 4 horas â temperatura ambiente.

Empacotou-se o ADN ligado in vitro usando extracto de empacotamento Gogapack II Gold (Stratagene) e depositou-se em E. coli LE392 (Murray, 1977) usando meio NZYCM (por 1000 ml: 10 g de amina NZ; 5 g de NaCl; 5 g de extracto de levedura; 1 g de ácidos casamínicos; 2 g de MgSO^^H^O; pH 7,5; para preparação de placas adicionaram-se 12 g de agar-agar), de acordo com as instruções do fornecedor.

Repetiu-se uma vez a reacção completa descrita anteriormente usando 3 yXL de fragmentos de ADN genómico num volume final de 10 JlaI.

Exemplo 2.4

Titulação e amplificação do banco genómico de

Aspergillus tubigensis.

Prepararam-se diluições do banco genómico primário em tampão SM (por 1000 ml: 5,8 g de NaCl; 2 g de MgSO₄-7H2

O; 50 ml de tris.HCl; a pH 7,5; 5 ml de gelatina a 20%) e deposi

taram-se em E. coli LE392 para hospedeiro conforme descrito por Maniatis et al., (1982, ,pp. 64) usando meio NZYCM. Após incubação de um dia para o outro a 37°C, contaram-se as placas resultantes e calculou-se a quantidade de fagos. A primeira ligação e empacotamento teve como resultado cerca de 7 x 10 pfu (unidades de formação de placas = plaque forming units) e a segunda

5 cerca de 4 x 10 pfu, dando um total de cerca de 5 x 10 pfu.

Amplificou-se o banco genõmico deste modo obti do por depósito de 5 x 10 pfu por cápsula de 85 mm de diâmetro (total de cinco cápsulas) em meio NZYCM conforme descrito por Maniatis et al., pp. 293-294). Após incubação de um dia para o outro a 37°C, eluiram-se os fagos das cápsulas confluentes resul tantes por adição de 5 ml de tampão SM. Mantiveram-se as cápsulas a 4°C durante duas horas com agitação intermitente. Após remoção do sobrenadante, removeram-se as bactérias da solução por centrifugação a 4 000 g durante 10 min a 4°C. Adicionou-se 3% de clorofórmio ao sobrenadante e determinou-se o númzro de pfu. Esta amostra de fagos continha aproximadamente 10pfu/ml.

EXEMPLO 3

Busca no banco genõmico de Aspergillus tublgen sis do gene A da endo-xilanase (xln A) e isolamento do gene.

Exemplo 3.1 ~ 32

Marcaçao por P de oligonucleótidos sintéticos .

Usou-se a sequência de ácidos aminados derivada no Exemplo 1.2 (Fórmula 1) a fim de sintetizar conjuntos de oligonucleótidos correspondentes à sequência de ãcidos aminados N-terminal. Os oligonucleótidos foram sintetizados pelo método da fosforamidite, usando um sintetizador de oligonucleótidos da Appleid Biosystems.

Misturaram-se os conjuntos de oligonucleótidos AB801 a AB806 (Figura 3) em quantidades iguais, obtendo-se o con junto seguidamente designado por conjunto AB800, a fim de se ob• ter uma concentração final de 37 pmol de oligonucleótidos por /jl, . Esta mistura de oligonucleótidos foi marcada numa mistura reaccio

nal com a seguinte composição: 37 pmol da mistura oligonucleotídica, tris.HCl 66 mM de pH 7,6, ATP 1 mM, espermidina 1 mM, Mg

Cl„ 10 mM, ditiotreitol 15 mM, 200 y^g/ml de BSA, 34 pmol de ATP 32 gama P (NEN, 6000 Ci/mMol) e 30 U de quinase de polinucleõtido T^ (BRL) num volume final de 50 jwl. Incubou-se a mistura reac cional durante 60 min a 37°C, depois do que se fez terminar a re acção por adição de 4 de EDTA 0,5 M de pH 8,0.

Marcou-se a mistura oligonucleõtidica AB1255, derivada da sequência de ãcidos aminados obtida no Exemplo 1.3 (Fórmula s 2 e 3) (Figura 4), por meio do mesmo procedimento des. crito anteriormente. Usaram-se as misturas de oligonucleótidos na busca do banco genõmico (Exemplo 3.2) e em analise de mancha de Southern (Exemplos 3.4 e 3.5) sem qualquer outra purificação.

Exemplo 3.2

Busca do gene xln A no banco genõmico de Asper gillus tubigensis.

A fim de proceder a uma busca do gene xln A num banco genõmico de Aspergillus tubigensis, depositaram-se 3 x 3 x 10 pfu por capsula numa camada superior de agarose NZYCM contendo 0,7% de agarose (meio de NZYCM com 7 g de agarose) em quatro cápsulas de 85 mm de diâmetro com NZYCM (1,2% de agar-agar) conforme descrito por Maniatis et al., (1982, pp. 64), Usou-se para bactéria de cultura E.coli LE392.

Apõs incubação das cápsulas de um dia para o outro a 37°C, fizeram-se duas réplicas de cada cápsula em filtros de nitrocelulose (Schleicher & Schull BA85) conforme descrito por Maniatis et al., (1982, pp. 320-321).

Apõs cozedura dos filtros durante duas horas a 80°C, humedeceram-se os filtros e lavaram-se durante 60 minutos â temperatura ambiente em 3 x SSC (diluido a partir de solução mãe 20 x SSC (por 1000 ml: 175,3 g de NaCl; 107,1 g de citrato de sõdio.5,5 HgO; a pH 7,0). Prê-hibridaram-se os filtros a 65°

C durante duas horas num tampão de prê-hibridação contendo: 6 x SSC (diluido a partir de solução mae 20 x SSC (ver acima), 0,5% , de SDS, 10 x solução de Denhardt (por 5000 ml; 10 g de Ficoll• -400; 10 g de polivinilpirrolidona; 10 g de albumina de soro de “ bovino (fracção V Pentax) e 100 y^g/ml de ADN de esperma de aren- 30 -

que desnaturado pelo calor (Boerhinger Mannheim). Após duas horas de prê-hibridação, substitui-se o tampão de prê-hibridação pelo tampão de hibridação, o qual ê idêntico ao tampão de prê-hibridação excepto em que este tampão não contém ADN de esperma de arenque, mas contêm o conjunto de oligonucleótidos AB800 mar32 cado com P, preparado conforme descrito no Exemplo 3.1. Hibridaram-se os filtros durante 18 horas a uma temperatura final de 38°C alcançada por arrefecimento lento controlado a partir da temperatura inicial de 65°C.

Após hibridação, lavaram-se em primeiro lugar os filtros em 2 x SSC, depois do que se lavaram os filtros em tampão de hibridação previamente aquecido a 38°C durante o mesmo período de tempo. Por fim, lavaram-se os filtros durante 30 minu tos a 38°C em 6 x SSC com 0,05% de pirofosfato de sódio. Fixaram

-se com adesivo os filtros secos ao ar sobre uma folha de papel

Khatman 3MM, fizeram-se marcas de referência com tinta radioacti PR va e cobriu-se o papel Whatman e os filtros com Saran Wrap .

Identificaram-se as placas de hibridação por exposição de película Kodak XAR X durante 72 horas a -70°C usando uma pantalha intensificadora.

Identificaram-se quatro das placas de hibridação da mistura de oligonucleótidos que apareciam em duplicado nos filtros réplica e designaram-se por lambda_xlnl a lambda_xln4· Retirou-se da cápsula cada placa positiva usando uma pipeta de Pasteur e eluiram-se os fagos a partir do cilindro de agar-agar em 1 ml de tampão SM contendo 20 jjI de clorofórmio, conforme des crito por Maniatis et al., (1982, p. 64). Purificaram-se os fagos obtidos por repetição do procedimento descrito anteriormente usando réplicas em filtros a partir de cápsulas contendo 50 a 100 placas dos fagos isolados.

Após purificação, propagaram-se os fagos por inoculação de 5 x 10 fagos em meio NZYCM. Após incubaçao de um dia para o outro a 37°C, obtiveram-se cápsulas confluentes a par tir das quâis se eluiram os fagos por adição de 5 ml de tampão SM a conservando as cápsulas durante duas horas a 4°C com agitação intermitente. Após remoção do sobrenadante, removeram-se as bactérias da solução por centrifugação a 4 000 x g durante 10 mi nutos a 4°C. Adicionou-se clorofórmio (0,3%) ao sobrenadante e

determinou-se o número de pfu. Estas amostras de fagos continham aproximadamente 10pfu/ml.

Exemplo 3.3

Isolamento de ADN a partir de bacteriófago lam bda.

Propagou-se cada um dos fagos isolados lambda ^a lambda _χ4η4 conforme descrito no Exemplo 3.2 usando cinco capsulas para cada um dos fagos. Precipitaram-se os fagos a partir do sobrenadante obtido deste modo (25 ml) por adição de um volume igual de uma solução contendo 20% de PEG-6000 (p/v) e NaCjL 2M, seguida de homogeneização e incubação sobre gelo durante 60 minutos. Separaram-se os fagos precipitados por centrifugação a 14 000 x g a 4°C durante 20 minutos. Removeu-se o sobrenadante por aspiração, enquanto que os últimos traços de líquido foram removidos usando um papel absorvente. Resuspenderam-se cuidadosamente os fagos em 4 ml de tampão SM e extrairam-se uma vez com clorofórmio.

Antes de extrair o ADN das partículas fágicas, removeram-se o ADN e o ARN provenientes das bactérias lisadas por incubação da suspensão fãgica com DNase I e RNase A (ambos a

100 /^g/ml) durante 30 minutos a 37°C. Em seguida libertou-se o

ADN fãgico por adição de SDS e de EDTA até uma concentração fi~ O nal de 0,1% e 20 mM respectivamente, seguida de incubaçao a 65 C durante 10 minutos. Removeu-se a proteina da solução por dupla extracção com um volume igual de fenol/clorofõrmio/ãlcool isoamí lico (25:24:1). Após separação das fases por centrifugação numa centrífuga de Eppendorf (14 ooo x g, 10 min), extraiu-se a fase aquosa uma vez com um volume igual de clorofõrmio/ãlcool isoamílico (24:1). Separaram-se as fases por centrifugação numa centri fuga de Eppendorf (14 000 x g, 10 min), depois do que se precipi tou o ADN a partir da fase aquosa por adição de 0,1 volume de perclorato de sódio 5 Me 0,1 volume de isopropanol e incubação sobre gelo durante 30 min. Recuperou-se o ADN por centrifugação durante 10 minutos a 4°C (14 000 x g). Removeu-se o sobrenadante por aspitação, depois do que se ressupendeu em 400 ,ul de tampão TE. Precipitou-se o ADN novamente com etanol. Separou-se o ADN

por centrifugação durante 10 minutos a 4°C (14 000 x g). Removeu -se o sobrenadante por aspiração, secou-se rapidamente sob vãcuo o agregado restante, depois do que se ressuspendeu o ADN em 125 /J- de tampão TE contendo 0,1 yjg/ml de RNase A. Por meio deste procedimento de purificação isolaram-se aproximadamente 40 a 50 jug de ADN a partir de cada fago.

Exemplo 3.4

Analise de restrição dos fagos que contêm xln

A.

a lambda _η .

xln4 de restrição Xbal e Xhól.

Analisou-se o ADN isolado por análise de Southern usando BamHI; BglII; EcoRI; hindiii;

dos fagos lambda_xlnlas seguintes enzimas Kpnl; Sall; SstI;

Digeriu-se o ADN durante 3 horas a 37°C, em du plicado, numa mistura reaccional composta pelas seguintes soluções: 3 >ul de solução de ADN; 1 yul de espermidina 0,5 M; 5 jxl do tampão 10 x React apropriado (BRL); 20 U de enzima de restrição (BRL) e ãgua destilada estéril de modo a obter-se um volume final de 50 jul. Após digestão, precipitou-se o ADN por adição de 0,1 volume de NaAc 3 M e 2 volumes de etanol. Separou-se o ADN por centrifugação durante 10 minutos à temperatura ambiente (14 000 x g). Removeu-se o sobrenadante por aspiração. Secou-se rapidamente o agregado restante sob vãcuo e ressuspendeu-se em ãgua destilada estéril. Após adição de 4 jnl de tampão de carga de ADN (0,25% (p/v) de azul de bromofenol; 0,25% (p/v) de xileno-cianol; 15% (p/v) de Ficoll tipo 400 em H20), incubaram-se as amostras durante 10 minutos a 65°C e arrefeceu-se rapidamente so bre gelo. Em seguida carregaram-se as amostras num gel de agarose a 0,6% em tampão 1 χ TAE. Separaram-se os fragmentos de ADN por electroforese a 25 V durante 15 a 18 horas.

Apõs electroforese, desnaturou-se o ADN e tran sferiu-se para uma membrana de nitrocelulose conforme descrito por Maniatis et al., (1982, pp. 383-386) e em seguida submeteu-se a prê-hibridação e a hibridação usando os conjuntos de oligo . nucleótidos marcados AB800 e AB1255 conforme descrito no Exemplo * 3.1 e nas condições de hibridação descritas no Exemplo 3.2. Obte

ve-se o padrão de hibridação de cada conjunto de oligonucleótidos por exposição de película Kodak XAR-5 X durante 18 horas a -70°C usando uma pantalha intensificadora.

A partir dos resultados, concluiu-se que o ADN dos quatro clones isolados hibridavam com a mistura de oligonucleótidos derivada da sequência de ácidos aminados N-terminal (conjunto AB800), bem como com a mistura de oligonucleótidos derivada da sequência de ácidos aminados obtida a partir do peptídeo isolado após digestão de S. aureus V8 (AB1255). Encontraram-se nos quatro clones fragmentos provenientes da mesma região ge nomica.

Usaram-se os padrões de fragmentos de resttrição e os padrões de hibridação a fim de construir um mapa de res trição apropriado da região genõmica em que se encontra localiza do o gene xln A (Figura 5).

Exemplo 3.5

Subclonagem do gene xln A.

Isolou-se o fragmento Sall de 6,9 kb a partir do fago lambda_x4n3 conforme descrito no Exemplo 2.2. Ligou-se es. te fragmento no vector pUC9 digerido com Sall e desfosforilado com fosfatase alcalina preparada como se segue: misturou-se 1yul (1 ^g/ul) de pUC9 com 2 /il de 10 x React 10 (BRL) , 1 71I (1 U/ul) de Sall e 16 ul de ãgua destilada estéril. Digeriu-se o ADN durante uma hora a 37°C, depois do que se adicionaram 0,5 >ul de fosfatase alcalina (1 U/ul) (Pharmacia), efectuando-se em seguida uma nova incubação a 37°C durante mais 30 minutos. Isolou-se o vector linearizado a partir de um gel de agarose a 0,6% confor me descrito no Exemplo 2.2.

Ligou-se o fragmento Sall de 6,9 kb no vector pUC desfosforilado digerido com Sall por meio do seguinte proce dimento: misturaram-se 100 ng do fragmento de pUC com 100 ng do fragmento Sall de 6,9 kb e 4 ^ul do tampão de ligação 5 x (tris. .HCI 500 mM a pH 7,6; MgCl₂ 100 mM; ATP 10 mM; ditiotreitol 10 mM; 25% de PEG-6000) e adicionou-se a esta mistura 1 /il (1,2 U/ /ul) de ligase de ADN (BRL), obtendo-se um volume final de 20 71I Designou-se o plasmídeo resultante por pIMlOO. Após incubação du

rante 16 horas a 14°C, diluiu-se a mistura atê 100 /il com ãgua estéril. Usaram-se 10 /il da mistura diluida para transformar células competentes de E. coli JM101 (Yanisch-Perron et al., 1985 ) preparadas pelo método CMl e CM2 conforme descrito em Pharmacia Manual for the M13 cloning/sequencing system. Uma cultura de E.coli JM101 contendo o plasmídeo pIMlOO foi depositada no Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Países Baixos, em 19 de Julho de 1990, tendo-lhe sido atribuida a designação de CBS 322.90.

Cultivou-se de um dia para o outro uma selecção de seis das colónias resultantes em meio LB (por 1000 ml:

g de peptona de triptiease (BBL); 5 g de extracto de levedura (BBL); 10 g de NaCl; e tris.HCl 0,5 mM a pH 7,5) contendo 100;ug /ml de ampicilina.

Isolou-se o ADN plasmídico das culturas pelo método da lise alcalina conforme descrito por Maniatis et al., (1982, pp 368-369). Usou-se este ADN plasmídico numa análise de restrição, conform deserito no Exemplo 3.4 a fim de seleccionar um clone que contivesse o plasmídeo pretendido. Isolou-se o ADN plasmídico em maior escala a partir de 500 ml de culturas E. coli JM101 contendo o plasmídeo pIMlOO cultivadas em meio LB contendo 100 ;ug/ml de ampicilina (Maniatis et al., 1982, p. 86). Purificou-se o plasmídeo por centrifugação com CsCl, tratou-se com fenol, precipitou-se com etanol e dissolveu-se em 400 ^ul de TE. Obtiveram-se cerca de 500 yig.

Analisou-se ainda o plasmídeo pIMlOO por enzimas de restrição, obtendo-se o mapa de restrição apresentado na Figura 7. A orientação do gene, conforme indicado, foi determina da a partir de experiências de hibridação sob as condições descritas no Exemplo 3.2 usando como sondas os conjuntos de oligonucleétidos AB800 e AB1255.

EXEMPLO 4

Caracterização do gene xln A de Aspergillus tu bigensis.

Exemplo 4.1

Determinação da sequência do gene xln A de As pergillus tubigensis .

Determinou-se a sequência do gene xln A de Aspergillus tubigensis, que compreende a respeetiva região promotora/-reguladora, o gene estrutural e a região de terminação, por subclonagem dos fragmentos de pIMlOO em M13mpl8/mpl9, em com binação com o uso de oligonucleótidos específicos como iniciadores nas: reacções de sequenciação.

Para a analise da sequência dos nucleótidos, isolaram-se fragmentos de restrição conforme se descreve no Exem pio 2.2 e em seguida clonaram-se em vectores de ADN do bacteriõfago M13 mp!8/19 RF (Messing, 1983; Norrander et al., 1983), digeridos com as enzimas de restrição apropriadas. Determinaram-se as sequências nucleõtidas pelo procedimento de terminação de cadeia de didesoxinucleótido (Sanger et al., 1977) usando o conjun to de sequenciação de polimerase de ADN Pharmacia T . A estratégia utilizada para sequenciar o gene xln A é apresentada na Figu ra 6. Efectuou-se uma analise por computador dos dados resultantes usando o programa PC/GENE (Intelligenetics, Inc.; Madison WI) . A sequência determinada é apresentada na Figura 8.

Exemplo 4.2 gene xln A de A. tubigensis.

A sequência obtida contêm 2054 pb, 949 na região 5’ não codificante e 420 pb na região 3’ nao codificante.

Na região 5' a montante, foi encontrada uma caixa TATA presumível (TATAAAT) na posição 848 atê â posição 854, antes do local de inicio de tradução (posição 950). Encontrou-se uma sequência repetida em triplicado (5¹GTCCATTTAGCCA3') na região de 190 a 350 pb a partir do local de início de tradução (posições: 618 a 632; 636 a 650 e 656 a 670).

A secção estrutural do gene xln A tem 681 pb de comprimento e estã interrompida por um único intrão presumível de 48 pb de comprimento. O polipeptídeo derivado da sequên• cia tem 211 AA de comprimento. Na extremidade N-terminal deste . polipeptídeo encontra-se uma sequência de sinal hidrofóbica de

AA de comprimento, a qual é seguida por um propeptxdeo que tem 12 resíduos de comprimento. A proteína madura tem uma dimensão de 184 AA com um peso molecular previsto de 19 kDa e tem um PIE teórico de 3,6.

EXEMPLO 5

Expressão do gene xln A em Aspergillus niger N593 por co-transformação.

Exemplo 5.1

Introdução do gene xln A em Aspergillus niger N593 por co-transformação.

Introduziu-se o plasmídeo pIMlOO, obtido no Exemplo 3.5, em Aspergillus niger por co-transformação de Aspergillus niger N593 (mutante pyr de A.niger N402; Goosen et al.,

1987) usando o gene pyr A de Aspergillus niger como marcador seiectivo no plasmídeo pGW635 (Goosen et al., 1989) e o plasmídeo □IMloo como plasmídeo de co-transformação.

Prepararam-se protoplastos a partir de micãlio cultivando Aspergillus niger N593 em meio mínimo suplementado com ),5% de extracto de levedura, 0,2% de ácidos casamínicos, glucose 50 mM e uridina 10 mM durante 20 horas a 30°C. Efectuou-se a preparação de protoplastos de Aspergillus niger N593 e o procedimen to de transformação conforme descrito por Goosen et al., (1987). Em seguida analisaram-se os transformantes PYR ⁺ para verificarão da expressão do gene xln A.

Exemplo 5.2

Selecção dos transformantes em relação a expre£ são do gene xln A.

Analisaram-se os transformantes obtidos no Exem pio 5.1 para verificação da formação do produto do gene xln A, a proteína XYL A. Seleccionaram-se vinte transformantes que se cultivaram durante 72 horas num meio que continha (por litro):

g de xilano de aveia bastarda (Sigma); 7,5 g de NH^NO^, 0,5g * de KC1, 0,5 g de MgSO^, 15 g de K^PO^ e 0,5 g de extracto de le • vadura (pH 6,0). Após cultura, separou-se o micêlio por filtra37

S53.

&SStQrt>

ção e analisou-se o filtrado da cultura por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida, usando um gel que continha 12% de acrilamida. Detectou-se a proteína XYL A sobre nitrocelulose após depo sição elêctrica e incubação com anticorpos policlonais suscitado s contra a proteina XYL A, que foi purificada conforme descrito no Exemplo 1.1. Detectou-se o anticorpo ligado após incubação co m um anticorpo de coelho anti-cabra conjugado com fosfatase alca lina, de acordo com o manual de instruções da Biorad.

Por este procedimento detectou-se que desassei^ s dos vinte transformantes analisados produziam a proteína XYL A, A proteína era segregada para o meio. Dos transformantes analisa dos, seleccionou-se transformante TrX9 por anãlise de I.E.F. usa ndo um gradiente de pH desde pH 3 atê 7 e subsequente coloração de uma série de diluições dos transformantes TrX2 e TrX9, usando o método descrito por Biely et al., (1985 a e b

A Figura 9 é um zimograma que mostra a proteína XYL A expressa pelos transformantes TrX2 e TrX9.

Efeetuou-se uma anãlise de SDS-PAGE usando amostras de 4 ul de sobrenadante de cada transformante e a estirpe de comparação A.niger, ajustando-se primeiro a pH 7 com NaOH 3 N e em seguida a um volume final de 20 ul com tampão 1 x SB, conforme descrito por Laemmli (1970). Após aquecimento durante 5 minutos a 100°c, submeteram-se as misturas totais a uma electroforese em gel de SDS-poliacrilamida a 12,5% e em seguida coraram -se com azul brilhante de Coomassie. Conforme se mostra na Figura 10 B, foi possível detectar uma banda proteica com um peso molecular aparente de 25 kDa (em comparação com xilanase purificada (pista 2) no transformante TrX2 (pista 4) e TrX9 (pista 5), a qual estã ausente no sobrenadante da estirpe de comparação (pista 3). Os marcadores de peso molecular (pista 1) representam 92, 68, 46 e 30 kDa.

Exemplo 5.3

Anãlise de supressão da região do promotor de xln A.

Estudaram-se os elementos de regulação no pro.notor de A. tubigensis xln A por anãlise de supressão do promotor

Preparou-se uma série de cinco construções do gene xln A e clona ram-se estas construções em combinação com o gene pyr A de A.niger . 0 gene pyr A permite a selecção em experiências de transfor mação conforme se descreve no Exemplo 5.1. Para além disso, o ge ne pyr A permite a selecção de transformantes gue possuem uma unica copia do plasmídeo integrado no local pyr A.

Isolou-se o fragmento Sall/Xbalde 4,5 kb (Fig.

7) e ligou-se no vector pEMBLl8 conforme descrito no Exemplo 3.5 obtendo-se o plasmídeo intermédio pIMlOl. Para além do plasmídeo pIMIOl ligaram-se no vector pEMBLl8 os seguintes fragmentos contendo o gene xln A: o fragmento HindIII/Xbal de 3,5 kb (obtendo-se o plasmídeo pIM102), o fragmento PstI de 2,0 kb (obtendo-se o plasmídeo pIMlO3), o fragmento Xhol/Xbol de 1,98 kb (obtendo-se o plasmídeo pIM104) e o fragmento Nsil/Xbal de 1,97 kb (obtendo-se o plasmídeo pIMlO5). Digeriram-se os plasmídeos obtidos usando xbal e ligaram-se a um fragmento Xbal de 3,8 kb que contém o gene pyr A funcional de A. niger, obtendo-se os plasmídeos pIM112, pIM113, pIMH4, pIMllô e pIMll7 (Figura 21).

Os plasmídeos pI_Mll2, pIMll3, pIMll4, pIMH6, e pIMH7 foram usados para transformar A. niger N593 conforme descrito no Exemplo 5.1. Cultivaram-se os transformantes PYR⁺ de cada plasmídeo e isolou-se o ADN conforme descrito no Exemplo 2.1 Digeriu-se o ADN resultante com Hpal e seleccionaram-se as integrações de cópias únicas por analise de Southern usando como son da um fragmento Xbal de 3,8 kb marcado com (a marcação foi efectuada conforme descrito no Exemplo 7.2), o qual continha o gene pyr A. Seleccionaram-se como integrações de cópia única no local pyr A os transformantes que tinham um fragmento Hpal que hibridava (cuja dimensão estava aumentada de uma unidade de comprimento do plasmídeo em comparação com o comprimento do fragmen to Hpal em A. niger N593).

Cultivaram-se os transformantes de cópia única de cada um dos plasmídeos, seleccionados conforme se descreveu anteriormente, durante 36 horas conforme descrito no Exemplo 5.2 Analisou-se a expressão do gene xln A por analise de IEF conforme se descreve no Exemplo 5.2 e por análise de Northern após iso * lamento do ADN total conforme descrito por Graaff et al., (1988) , • usando o fragmento Xhol/BamHI de 900 pb marcado com ^^P g_ene

xln como sonda.

Nos transformantes provenientes dos plasmideos pIM112, pIMmm3 e pIMllâ, verificou-se a ocorrência da expressão do gene xln por detecção por IEF e análise de Northern. No entan to, os transformantes provenientes dos plasmideos pIM116 e pIM 117 não expressaram o gene xln A, uma vez que não se detectou a proteína XYL A nem ARN capaz de hibtidação. A partir destes resultados concluiu-se que o fragmento RstI/Xhol de 158 pb, a dife rença fundamental entre o plasmídeo pIMll4 e o plasmídeo pIMllõ, contêm um elemento necessário para 'a indução do gene xln A em A. niger, que foi cultivado em meio contendo xilano como fonte de carbono.

EXEMPLO 6

Expressão em A. niger do gene xln A fundido ao promotor e/ou à sequência de sinal do gene da amiloglucosidase (AG) de A. niger.

Exemplo 6.1

Vectores de expressão de xilanase.

A fim de obter a expressão da xilanase na estirpe A. niger CBS 513.88, criaram-se blocos integrados (cassettes) de expressão adicionais (pXYL3 e pXYL3AG) nos quais o gene xln A se encontra sob a regulação do promotor de amiloglucosidase (AG) de A. niger em combinação com diferentes sequências de sinal.

No bloco integrado de expressão pXYL3, a sequência do promotor de AG foi fundida com a sequência de codificação de xyl A incluindo o guia de xilanase.

No bloco integrado de expressão pXYL3AG, a sequência do promotor de AG, bem como a sequência guia de 18 ácidos aminados (aa) do gene AG foram fundidas ao fragmento do gene xln A que codifica apenas para a proteína madura.

Exemplo 6.2

Construção dos plasmideos intermédios.

a) Subclonagem do local xlnA.

A fim de reduzir o comprimento do local genómico de xln A, subclonou-se no local PstI do plasmídeo pTZ18R (Promega) o fragmento PstI de 2 kb de pIMlOO (descrito no Exemplo 3.5) contendo todo o gene xln A incluindo as sequências de flanco 5’ e 3’. 0 plasmídeo que continha o gene xln A na orienta ção eorreeta (indicada na Figura 12) foi designado por pXYLl.

b) Vector básico de selecção pAMdSH

A fim de servir de marca de selecção para a transformação de Aspergillus, inseriu-se o fragmento de ADN Ecol /Kpnl do plasmídeo pGW325 (Wernars, K. (1986)), que contêm o gene homólogo de Aspergillus nidulans amdS, nos locais Ecol/Kpnl do plasmídeo pTZl8R (promega). No vector resultante (pAmdS) introduziu-se um local de restrição HindIII adicional por inserção do fragmento sintético:

5' AATTCAAGCTTG 3'

3’ GTTCGAACTTAA 5’ no local EcoRI. 0 plasmídeo obtido deste modo foi designado por pAmdSH. Neste vector básico inserem-se os fragmentos de ADN de fusão AG/xilanase.

c) Isolamento do local genómico AG: construção do plasmídeo pAB6-l.

plasmídeo pAB6-l contêm todo o local AG de A. niger, isolado do banco plasmídico de A. niger que contêm os fragmentos HindIII de 13 a 15 kb, inserido em pUCl9.

Para este isolamento usaram-se os seguintes oligonucleótidos específicos para AG:

AG-1: 5' -GACAATGGCTACACCAGCACCGCAACGGACATTGTTTGGCCC-3'

AG-2: 5' -AAGCAGCCATTGCCCGAAGCCGAT-3', ambos baseados na sequência nucleotídica publicada para A. niger (Boel, et al., (1984a); Boel, et al,, (1984b)). As sondas oligo nucleõtídicas foram derivadas da sequência que rodeia o intrão 2: o oligonucleotido AG-1 está localizado a jusante deste intrão e tem uma polaridade idêntica à de AGmARN; o oligonucleotido AG-2 encontra-se a montante do intrão 2 e ê escolhido antiparalelo em relação a AGmARN. 0 plasmídeo pAB6-l contém todo o local AG num

fragmento HindIII de 14,5 kb (ver figura 13).

d) Plasmídeos intermédios pXYLAG e pXYL2AG.

Efectuou-se a fusão do promotor de AG e da sequência guia AG de 18 aa com o gene xln A que codifica para a proteína madura (a que falta a serina na posição 1) por meio do método da Reacção de Polimerase em Cadeia (Polymerase Chain Reaction = PCR).

Nas reacções PCR usaram-se dois moldes: pXYLl contendo o gene xln A e pAB6-l contendo todo o local genómico AG

Para iniciadores para as amplificações de ADN por PCR projectaram-se quatro oligonucleótidos sintéticos com as seguintes sequências:

Oligo AB 1771:5' -CTCTGCAGGAATTCAAGCTAG-3¹ (uma sequência específica de AG rodeando o local EcoRI aproximadamente 250 pb a montante do codão de início ATG) .

Oligo AB 1985:5' -GTAGTTGATACCGGCACTTGCCAACCCTGTGCAGAC-3' xilanase madura - guia AG de 18 aa

Oligo AB 1986:5' -GTCTGCACAGGGTTGGCAAGTGCCGGTATCAACTAC-3' guia AG de 18 aa - xilanase madura

Oligo AB 1984:5' -CCGGGATCCGATCATCACACC-3' (uma sequência específica de xln A localizada no local BamHI na posição 1701 conforme se mostra na Figura 8).

Efectuou-se a PCR conforme descrito por Saiki et al., (1988) e de acordo com o fornecedor da polimerase TAQ (Cetus). Levaram-se a cabo 25 ciclos de amplificação (cada ciclo: 2 minutos a 55°C; 3 minutos a 72°C; 1 minuto a 94°C) num amplifi cador de ADN (Perkin-Elmer/Cetus).

A fim de fundir as sequências AG com a sequência de codificação de xln A, efectuaram-se duas reacções em cadeia de polimerase separadas: a primeira reacção com pAB6-l como molde e os oligonucleótidos AB 1771 e AB 1985 como indicadores a fim de amplificar um fragmento de ADN de 300 pb que contém a frac: ção 3' do promotor de AG e a sequência AG de 18 aa, flanqueada na borda 3' pelos primeiros 18 nucleótidos da sequência de codificação de xln A e a segunda reacção com pXYLl como molde e os

oligonucleotidos AB 1986 e 1984 como indicadores a fim de amplificar as sequências de ADN de xln A que codificam para a proteína xilanase madura, flanqueda na extremidade 5' pelos últimos 18 nucleótidos do peptídeo de sinal de AG, Na Figura 14 aprenta-se uma representação esquemática destas amplificações.

Purificaram-se por electroforese em gel de agarose e precipitação com etanol os dois fragmentos de 7DN gerados e em seguida usaram-se como moldes na terceira PCR com os oligonucleótidos AB1771 e 1984 como iniciadores a fim de gerar a fusão AG-xilanase. 0 fragmento de ADN obtido deste modo foi digerido com EcoRI e BamHI e subclonados nos locais apropria dos do plasmídeo pTZ18R. Sequenciou-se a fusão resultante e designou-se por pXYLAG (ver Figuras 14 e 15).

A região restante (3,5 kb) a montante do promo tor de AG foi obtida por digestão dos plasmídeos pAB6-l com Kpnl e parcialmente com EcoRI e foi purificada por electroforese em gel de agarose e precipitada com etanol. Em primeiro lugar ligou -se este fragmento do promotor de ADN de AG de 3,5 kb com o frag mento de fusão AB/xilanase EcoRI/BamHI do plasmídeo pXYLAG e em seguida clonou-se por via molecular em E. coli após ligação no vector pXYLl, que foi digerido com Kpnl/BamHI e de onde se removeu o fragmento Kpnl/BamHI contendo as sequências 5' - e codificação de xln A. 0 plasmídeo pXYL2AG obtido deste modo é apresentado na Figura 15.

e) Plasmídeos intermediários pXYL e pXYL2.

Efectuou-se a fusão da sequência do promotor de AG com o gene xln A incluindo o guia de xilanase conforme se descreve na parte d) anterior. Como iniciadores usaram-se dois novos oligonucleótidos com as seguintes sequências:

Oligo AB 1982; 5' -AGCCGCAGTGACCTTCATTGCTGABGTGTAATGATG-3' gene da xilanase - promotor de AG

Oligo AB 1983: 5’ -CATCATTACACCTCAGCAATGAAGGTCACTGCGGCT-3' promotor de AG - gene da xilanase

A fim de fundir a sequência do promotor de AG com o gene da xilanase (incluindo a sequência de sinal da xilana se), efectuaram-se duas reacções de polimerase em cadeia separa43

das: a primeira reacção com pAB6-l como molde e os oligonucleótidos AB 1771 e AB 1982 como iniciadores a fim de amplificar um fragmento de 282 pb contendo a parte 3’ do promotor de AG flanqueda na extremidade 3' por 18 nucleótidos do guia de xilanase e a segunda reacção com pXYLl como molde e os oligonucleótidos AB 1983 e AB 1984 como iniciadores a fim de amplificar um fragmento de ADN que contêm o gene da xilanase integral (incluindo o guia de xilanase) e flanqueado na extremidade 5' por 18 nucleõtidos do promotor de AG.

Purificaram-se por electroforese em gel de aga rose e precipitação com etanol os dois fragmentos de ADN gerados e em seguida usaram-se como moldes numa terceira PCR com os oligonucleótidos AB 1771 e AB 1984 como iniciadores a fim de gerar a fusão AG-xilanase. Digeriu-se o fragmento de ADN deste modo ob tido com EcoRI e BamHl e subclonou-se nos locais apropriados do plasmídeo pTZl8R. A fusão resultante foi sequenciada e designada por pXYL (ver Figuras 14 e 16).

A região a montante restante (3,5 kb) foi inse rida no plasmídeo pXYLl conforme se descreve na parte d) anterior. 0 plasmídeo deste modo obtido foi designado por pXYL2.

Exemplo 6.3

Construção dos blocos integrados de expressão de xilanase pXYL3AG e pXYL3.

Criaram-se os dois blocos integrados de expres são (cassettes) por inserção das fusões AG/xilanase de pXYL2AG ou de pXYL2 no vector básico pAMdSH de A. niger. Para esta construção final, digeriu-se o plasmídeo pAMdSH com Kpnl e HindIII (parcialmente) e os plasmídeos pXYL2AG e pXYL2 com HindIII e parcialmente com Kpnl. Isolaram-se todos os fragmentos e purificaram-se por electroforese em gel e precipitação com etanol. Adi cionou-se ao fragmento de ADN KnpI/HindIII de 6,8 kb do plasmídeo pAmdsSH o fragmento de ADN KnpI/HindIII de 5,3 kb do plasmídeo pXYL2AG ou pXYL2, ligou-se e em seguida submeteu-se a clonagem molecular por transferência das duas misturas de ligação pa. ra E.coli. Os blocos integrados de expressão deste modo obtidos * foram designados por pXYL3AG (contendo o guia de AG) e pXYL3 (

(contendo o guia de xilanase), como se representa nas Figuras 17 e 18, respectivamente.

Exemplo 6.4

Expressão do gene xln A sob regulação do promotor de AG em A. niger.

a) Transformação de A. niger (CBS 513.88).

Antes de transferir os dois blocos integrados de expressão pXYL3AG e pXYL3 para A, niger, removeram-se as sequências de E. coli por digestão com HindIII, electroforese em gel e precipitação com etanol. Efectuou-se a transformação da e£ tirpe de A. niger (CBS 513.88, depositada em 10 de Outubro de 1988) com 10 jug do fragmento de ADN linearizado por procedimentos como os descritos por Tilburn, J. et al., (1983) e Kelly e Hynes (1985) com as seguintes modificações:

- Deixou-se crescer micélio em meio mínimo de Aspergillus (Cove

D. (1966) suplementado com arginina 10 mM e prolina mM durante 16 horas a 30°C num agitador orbital a 300 rpm.

- Usou-se apenas Novozym 234 e não se usou helicase para a formação dos protoplastos.

Após 90 minutos de formação dos protoplastos, adicionou-se 1 volume de tampão STC (sorbitol 1,2 M, tris.HCl 10 mM a pH 7,5 e CaC^ 50 mM) â suspensão de protoplastos e centrifugou-se a 2500 rpm a 4°c durante 10 minutos num rotor de tubos de incli nação variável. Lavaram-se os protoplastos e ressuspenderam-se em tampão STC a uma concentração de 10 cêlulas/ml. Adicionou-se ADN plasmídico num volume de 10 /il em tampão TE (tris.HCl 10 mM a pH 7,5 e EDTA 0,1 mM) a 100 ;ul da suspensão de protoplastos.

Apõs incubação da suspensão a O°C durante 25 minutos, adicionaram-se 200 ^ul de solução de PEG gota a gota (PEG 4000 a 25% (Merck)), tris.HCl 10 mM a pH 7,5, e CaC^ 50 mM). Em seguida adicionou-se lentamente 1 ml de solução de PEG (PEG 4000 a 60% em tris-rHCl 10 mM a pH 7,5, e CaC^ 50 mM) com agi tação intermitente dos tubos. Apos incubação â temperatura ambi* ente, diluiram-se as suspensões com tampão STC, misturou-se por inversão e centrifugQU-ge a 2000 rpm a 4°C durante 10 minu tos. Ressuspenderam-se os protoplastos cuidadosamente em 200 /il de tampão STC e depositaram-se em meio mínimo de As pefgillus com acetamida 10 mM como única fonte de azoto,

CsCl 15 mM e sucrose 1 M, solidificado com agar-agar bacte riolõgico #1 (Oxoid) a 0,75%. A cultura foi efectuada a 33°C durante 6 a 10 dias.

b) Cultura dos transformantes em balões cónicos

Isolaram-se transformantes de A. niger de cada bloco integrado de expressão e inocularam-se com os esporos placas de agar de acetamida selectivas. Colheram-se os esporos de cada transfor mante a partir das células cultivadas durante 3 dias a 37°C em placas de agar de dextrose de batata a 0,4% (Oxoid, Inglaterra). Foram efectuadas experiências de produção de xilanase em balões cónicos nas seguintes condições de cultura:

g

Inocularam-se cerca de 1.10 esporos em 100 ml de meio de pré-cultura contendo (por litro): 1 g de KH^PO^; 30 g de maltose; 5 g de extracto de levedura; 10 g de hidrolisado de caseína;0,5 g de MgSO₄. 7^0 e 3 g de Tween 80. Ajustou-se o pH a 5,5.

Após deixar crescer de um dia para o outro a 34°C num agitador orbital, inocularam-se com 1 ml da cultura em crescimento ]

100 ml da cultura principal contendo (por litro): 2 g de KH^PO^; 70 g de maltose dextrina (Maldex MDO^, Amylum); 12,5 g de extrac to de levedura; 25 g de hidrolisado de caseína; 2 g de I^SO^;

0,5 g de MgSO^.TH^O; 0,03 g de ZnCl^; 0,02 g de CaCl^; 0,05 g de 4nSO^.4 H^O e FeSO^. 0 pG foi ajustado a 5,6. Cultivou-se o mice lio durante pelo menos 140 horas.

?) Análises dos transformantes

Efectuara-se análises da xilanase de cada transformante por neio da medição da actividade de xilanase; por electoforese em gel de SDS-poliacrilamida corada com Azul Brilhante de Coomassie e por um zimograma corado com azul brilhante de xilano-remazol R.

Determinaram-se as actividades de xilanase conforme se descreve em Leathers et al., (1984) com algumas modificações. Aumentou-se a concentração do substrato de 1% para 5% de :ilano de aveia, dissolveu-se em NaAc 100 mM a pH 3,5 e agueceu46

-se até 100°C durante 10 minutos. Para além disso, efectuaram-se as reacções enzimãticas a 39°C e não a 30°C.

Mediram-se no sobrenadante em fermentações de 6 dias em balões cénicos os níveis de produção de xilanase de va rios transformantes seleccionados ao acaso obtidos de cada bloco integrado de expressão. No Quadro 1 apresentam-se os resultados.

Quadro 1

Produção de xilanase de várias estirpes transformadas de A. niger

CBS 513.88 com plasmídeos contendo o gene xln A sob a regulação do promotor de AG de A. niger em combinação com diferentes guias

Bbco integrado de expressão	Transformantes %	Actividade de xilanase (U/ml)
	1,1	2400
pXYL3	1,2	1700
(promotor de AG/	10	3600
guia de xln)	29	3500
PXYL3AG (promotor de AG/	3,1	2400
guia de AG)
A. niger CBS 513.88
(estirpe de controlo)	0	0

Efectuou-se uma análise por SDS-PAGE como se segue: após seis dias de cultura conforme descrito na parte b) anterior, ajustaram-se a pH 7 com NaOH 3 N amostras dos sobrenadantes de cada transformante e levaram-se a um volume final de 20yUl com tampão 1 x SB, conforme descrito por Laemmli (1970). Após aquecer durante 5 minutos a 100°C, submeteram-se misturas totais e electroforese em gel de poliacrilamida a SDS/12,5% e em seguida corou-se com azul brilhante de Coomassie. Como se representa na Figura 10 A, foi possível detectar uma banda proteica com um peso molecular de 25 kDa (comparável com o da xilanase pu- 47 -

rificada (pista 1), nos transformantes 10 (pista 4), 29 (pista

5) e 1,1 (pista 6). Os marcadores de peso molecular (pista 2) representam 94, 67, 43, 30, 20 e 14,5 de kDa

Efectuou-se uma análise de zimografia como se segue:

Aplicaram-se as amostras usadas na análise an terior duas vezes a um gel PAA phast nativo de 8 a 25% (BRL).

Após a electroforese, corou-se o gel A com azul brilhante de Coomasie (ver Figura 11 A) e o gel B com uma camada de azul brilhante de Remazol-xilano (megazyme) a pH 3,5 conforme descrito por Biely et al.,(1985a) (ver Figura 11 B) a fim de visualizar a actividade de xilanase. As amostras fornecidas a esta camada de gel de ABR-xilano continham 5 vezes menos proteina do que as amostras depositadas nos geis, oomo se verifica nas Figuras 10 e 11 A. A identificação das pistas nas Figuras 11 A e 11 B é idêntica â das Figuras 10 A e 10 B.

Estas análises mostram nitidamente a expressão e a secreção de endo-xilanase activa em A. niger CBS 513.88 transformado com um bloco integrado de expressão em que o gene xln A está sob a regulação do promotor de amiloglucosidase de A. niger. Observaram-se também a expressão e a secreção com sequências de sinal de A. niger diferentes. Para além disso, a proteína sem o resíduo de serina na posição 1 manteve mesmo assim a ac tividade de degradação do xilano.

EXEMPLO 7

Selecção de genes relacionados com o gene xln A em trlchoderma reesei QM9414

Exemplo 7.1

Marcação com ³²^ de fragmentos de ADN

Marcaram-se 25 ng de um fragmento Xhol/BamHI de 900 pb isolado a partir do plasmídeo pIMlOO conforme descrito no Exemplo 2.2 por iniciação aleatória usando o conjunto de marcação de oligonucleótidos (Pharmacia) de acordo com as instruções; do fornecedor. A fim de remover o '^³²^-dATP não incorporado da mistura, aumentou-se o volume para 100 jul com tampão TE, depois

do que se removeu o c<^32p-dATP por fraccionomento numa coluna de Sephadex G50. Desnaturaram-se as fracções que continham o ADN marcado radioactivo por incubação durante três minutos a 100°C, e provocou-se a conservação da forma de cadeia simplez por arre fecimento rápido em gelo, antes da adição a um tampão de hibridação contendo 6 x SSC; 5 x solução de Denhardt; 0,1% de pirofosfato de sódio e 100 /ig/ml de ADN de esperma de arenque desna turado pelo calor.

Exemplo 7.2

Hibridação genómica de ADN de T. reesei. Digeriu-se ADN de alto peso molecular isolado a partir de T. reesei conforme descrito no Exemplo 2.1 com Bam HI, BglII, EcoRI e Sall. Separaram-se os fragmentos resultantes por electroforese em gel de agarose e transferiram-se para uma membrana de nitrocelulose conforme descrito por Maniattis et al. , (1982, pp. 383-3S9). Pré-hibridaram-se as membranas de nitrocelulose a 57°C durante duas horas em tampão de hibridação (conforme descrito no Exemplo 7.1 anterior). Após este processo de prê-hibridação, adicionou-se o fragmento marcado pelo isótopo ra dioactivo descrito no Exemplo 7.1 ao tampão de hibridação e continuou-se a hibridação durante 44 horas. Apõs hibridação, lavaram-se os filtros durante 90 minutos a 57°C em 4 x SSC; com 0,1% de SDS e 0,1% de pirofosfato de sódio, efectuou-se em seguida uma lavagem final usando 2 x SSC â mesma temperatura. Após colocar as membranas sobre papel Whatman 3MM e marcar de forma adequada com tinta radioactiva, cobriram-se os filtros com SAran Wrap^e autorradiografaram-se durante 72 horas a -70°C usando película de raios X Kodak XAR-5 e cassetes Kodak X-Omatic com pantalhas de intensificação normais.

Os fragmentos de hibridação encontrados são re feridos no Quadro 2.

Quadro 2

Fragmentos de hibridação e seu comprimento (kpb) encontrados em

ADN genómico de T. reesei usando como sonda um fragmento do gene ne xln A de A. tubigensis

BamHI Bgll EcoRI

Sall

4,0 * át £1

18 6,8

9,4 4,2 3,8 (7,3)

4,2 * = Fragmento de hibridação mais forte = Bandas duplas

() = Sinal muito fraco

Exemplo 7.3

Busca no banco genõmico de Trichoderma reesei de genes relacionados com xln A

Para a busca do banco genõmico de Trichoderma reesei de genes relacionados com xln A usando o fragmento Xhol/ /BamHI de 900 pb marcado com _que contém o gene xln A como sonda, conforme descrito nos Exemplos 6.1 e 6.2, seleccionaram-se as seguintes condições de hibridação: pré-hibridação em 6 x SSC 0,1% de SDS, 0,05% de pirofosfato de sódio e 100 jag/ial de ADN de esperma de arenque desnaturado a 60°C durante 3 a 5 horas seguida de hibridação em 6 x SSC com 0,1% de SDS, 0,05% de pirofosfato de sodio e 100 ug/ml de ADN de esperma de arenque desnaturado a 57°C durante 44 horas; seguida de duas lavagens em 5 x x SSC com 0,1% de SDS a 60°C e duas lavagens em 3 x SSC a 60°C. Apõs transferência dos filtros para papel 3 MM e marcação de for ma adequada com tinta radioactiva, cobriram-se os filtros com Sa ran Wrap e efectuou-se a exposição durante 72 horas de película de raios X Kodak XAR-5 a 70°C usando cassetes Kodak X-Omatic com pantalhas de intensificação normais. Nestas condições verificara m-se aproximadamente 50 sinais positivos.

- 50 Exemplo 7.4

Análise de fagos contendo seguências de I .ree sei relacionadas com xln A

Purificaram-se 18 dos clones de bacteriêfagos que hibridaram conforme descrito no Exemplo 3.2, seleccionaram-se nove fagos e isolou-se o ADN destes conforme descrito no Exemplo 3.3. Analisaram-se os fagos por digestão do ADN com Hinc II e Hinfl. Com base nos padrões de hibridação verificados apôs análise de Southern (usando como sonda o fragmento Xhol/BamHI de 900 pb marcado com _f conforme descrito no Exemplo 7.1), divi diram-se estes fagos em duas classes: cinco dos fagos analisados na classe A (fagos l#3,#4,#20 e ^22) e quatro na classe B (fa gos #10, #16,θ #^Χβ) · De cada classe seleccionou-se um fago para análise de restrição: fago#l da classe A e fago #10 da cia sse B.

Submeteu-se o ADN dos fagos #1 e #10 a análise de restrição por digestão com BamHI, BglII, EcoRI, BglII e suas combinações por digestões isoladas com Kpnl, Smal, Xhol, Xbal, SstI, HindIII e PstI. Em seguida levou-se a cabo uma análise de Southern usando como sonda o fragmento Xhol/BamHI de 900 pb. Com base nos padrões obtidos, seleccionaram-se para subclonagem um fragmento BglI/SalI de cerca de 6,5 kb do fago #1 da classe A e um fragmento BamHI/BglI de cerca de 7,5 kb do fago #10 da classe B.

Isolou-se o fragmento BglI/SalI de 6,5 kb e li gou-se conforme descrito no Exemplo 3,5 no vector pEMBL18 digeri do com BglI/SalI, obtendo-se o plasmídeo pIM030. Depositou-se E. coli JM109 contendo o plasmídeo pIMO30 no Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Países Baixos em 11 de Julho de 1991 e atribuiu-se-lhe a designação CBS 420.91.

Isolou-se o fragmento BamHI/BglI de 7,5 kb e ligou-se, digeriu-se com BamHI e inseriu-se no vector desfosforilado pUC9, obtendo-se o plasmídeo pIM041. Depositou-se E.coli JM109 contendo o plasmídeo pIM041 no Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Países Baixos em 11 de Julho de 1991 e atribuiu-se-lhe a designação CBS 421.91.

Submeteram-se os dois plasmideos pIM030 e pIM 041 ainda a uma análise de restrição, obtendo-se os mapas de res

- 51 Π tfhMHIHBM—IDW , ...

trição apresentados nas Figuras 19 e 20, respectivamente.

EXEMPLO 8

Aplicação da proteína XYL A em alimentos compostos para animais.

A eficácia da suplementação com endo-xilanase para uma dieta rica em sub-produtos de trigo na digestibilidade e na eficiência zootécnica ê demonstrada usando o seguinte protocolo experimental.

Conservaram-se em gaiolas com chão de arame pintos fêmeas de um dia de idade e alimentaram-se com uma dieta comercial adequada atê ao início do período experimental). No dia 13 distribuiram-se as aves aleatoriamente em grupos de tratamento equivalente de peso reduzido. Atribuiram-se três dietas experimentais diferentes a 18 grupos de aves com 8 aves por grupo. As misturas das dietas foram granuladas em condições muito suaves e os pintos foram alimentados à vontade durante os dias 13 a 34 (apõs a eclosão do ovo).

Observou-se o consumo de alimento e o crescimento semanalmente para cada gaiola. Mediu-se a digestibilidade por meio de um período de 3 dias de recolha de excrementos. A recolha dos excrementos foi semi-quantitativa. Usando um marcador (cinza insolúvel em HCI) calcularam-se coeficientes individuais de digestibilidade para a proteina, a gordura e a fibra to tal e o extracto isento de azoto. Calculou-se a energia aparente metabolizãvel (EAM) de cada dieta a partir da seguinte equação: EAM (MJ/kg D.M.) = 17,46 a^^ + 38,81 a₂ + 8,0 a₃ + 16,5 a₄ a₁ = proteina total (gramas por kg D.M.) x c.d.^^ a₂ = gordura total (gramas por kg D.M.) x c.d.

a^ = fibra total (gramas por kg D.M.) x c.d.

a^ = Extracto isento de Azoto (gramas por kg D.M.) x c.d.

4)c.d. = coeficiente de digestibilidade

A dieta basal foi baseada em farelo de trigo, amido de milho e sub-produtos animais ricos em proteínas (Quadro 3), Esta dieta foi suplementada com endo-xilanase a dois níveis diferentes, 36 000 U/kg e 174 000 U/kg de endo-xilanase purifica

da (actividade específica 300 000 U/g).

Quadro 3

Composição da dieta basal

Ingrediente	%
farelo de trigo	40
amido de milho	30
milho	4,4
sub-produtos animais (farinha de carne,
farinha de peixe, farinha de penas)	9,7
extracto de soja (81% de pt)	6,0
õleo de soja	6,0
mistura de gorduras	0,7
calcário moído	0,32
fosfato monocãlcico	0,13
prémix (incluido DL-metionina
e lisina.HCl)	1,35
Z ϋ λ marcador de Si0₂ (Diamol ⁷)	1,4
Conteúdo calculado
EAM (MJ/kg)	12,66
proteína total, %	18,0
lisina, %	1,2
metionina + cistina, %	0,9
Conteúdo analisado
proteína total, %	18,2
gordura total, %	9,7
fibra total, %	4,1
marcador - SiO₂, %	1,07
Ca, %	0,8
P, %	0,85
cinza, %	5,9

Os resultados mais importantes estão resumidos no Quadro 4 (dados de eficiência) e no Quadro 5 (dados de digestibilidade). Os dados de eficiência referem-se a todo o período experimental, do dia 13 ao dia 34 (apôs a eclosão do ovo), enquanto que os dados de digestibilidade são valores médios derivados de analises nos excrementos recolhidos durante os dias 21 a 24 e 28 a 31.

Quadro 4

Efeito da adição de endoxilanase na eficiência

em pintos do dia 13 ao dia 34 de idade.
	dieta 1	dieta 2	dieta 3
		36 000 U/kg	174 000 U/kg
Parâmetro	basal	endoxilanase	endoxilanase
-crescimento (g/dia)	50,5	50,8	51,9
-consumo de alimento
(g/pinto.dia)	95,6	89,7	92,6
-alimento: ganho (g:g)	1,89	1,77	1,79
	Quadro	5
Efeito da adição	de endoxilanase sobre o coeficiente

de digestibilidade (c.d.) dos nutrientes orgânicos e valor energético calculado da dieta.

Coeficiente	dieta 1	dieta 2	dieta 3
de			36000	174 000
Digestibilidade		= basal	U/kg XYL A	U/kg XYL A
proteína total *,	%	79	82	82
gordura total, %		85	91	82
fibra total, %		0	11	11
Extracto isento
de azoto, %		73	75	75
EAM (MJ/kg D.M.)		11,81	14,28	14,28
* 0 azoto medido	nos	excrementos	foi corrigido	para o conteúdo
em ãcido urico	da	urina.

Esta experiência demonstra a eficácia da adição de endoxilanase a alimentos compostos para pintos que contêm uma elevada proporção de farelo de trigo. Tanto o comportamento dos pintos como o valor energético destas dietas foram afectados -de modo positivo.

Tendo em atenção o rendimento da conversão dos alimentos, o parâmetro mais sensível que reflecte a influência da adição de enzima foi a eficiência. Notou-se uma tendência no sentido de uma ligeira redução no consumo de alimento nos grupos com suplemento de enzima em associação com um crescimento semelhante ou maior. Em consequência, a proporção alimento:ganho diminuiu substancialmente.

A melhoria na eficiência pode ser explicada pelos efeitos da adição de enzima sobre os coeficientes de diges tibilidade. Todos os valores de digestibilidade dos nutrientes foram afectados de modo positivo, se bem que o aumento na digestibilidade da gordura fosse mais pronunciado, o que levou a um aumento de 3,5% no valor energético das dietas suplementadas com enzima.

Nao se notou qualquer influência da dose a estes níveis de inclusão de enzima.

EXEMPLO 9

Utilização de endo-xilanase em panificação

Cozeram-se pãezinhos para cachorros a partir de porções de 150 g de massa obtida por mistura de 200 g de farinha de trigo (100%), 106 ml de ãgua (53%) , 1,2 g de levedura de padeiro instantânea (0,6%: Gist-Brocades N.V., Delft, Países Baixos, 4 g de NaCl (2%), 400 mg de CaC^.I^O (0,2%), 10 mg de

-amilase fúngica ^P200 (Gi^st ^Broca<^^es r 2250 SKB/kg de farinha) e um número variável de unidades de actividade de endo-xilanase (xyl A). Apõs mistura durante 6 minutos e 15 segundos a 52 r.p. m. num misturador de pinos, dividiu-se a massa, deixou-se levedar durante 45 minutos a 31°C, praticou-se um golpe, deixou-se levedar durante mais 25 minutos, amassou-se e moldou-se. Apos um período final de repouso para levedar de 70 minutos a 31°C, cozeu-se a masse durante 20 minutos num forno a 250°C. Determinou-se o volume de cada pão pelo método do deslocamento de sementes

- 55 de colza. Os resultados são apresentados em seguida no Quadro 6.

Quadro 6

Caraeterísticas	do pão preparado com várias quantidades
de actividade de endo·	-xilanase (xyl A)
Actividade
de endo-	Volume
-xilanase	do pão	Quebra/	Estruture
(unidades)	(ml)	Esmigalhamento*	do miolo’
0	S46	6	6
32	560	7	6
128	579	7,5	7
320	609	8	6,5
640	621	7,5	6,5
960	624	7,5	7
2560	618	7,5	7,5

* = Pontuação de 1 (qualidade inferior) a 10 (qualidade superior) .

A partir destes resultados, é evidente que uma maior quantidade de endo-xilanase adicionada provoca um aumento do volume do pão e uma melhoria da qualidade da massa em termos de quebra e esmigalhamento e da estrutura do miolo.

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Claims

Processo para a preparação de uma sequência de ADN que codifica para um polipeptideo que possui actividade de xilanase caracterizado por se isolar e purificar a) uma sequência de ADN que codifica para um polipeptideo que possui activida de de xilanase a partir de um fungo; ou b) uma variante genética da sequência da alínea a) ; ou c) uma sequência de ADN com capacidade de hibridação para uma das sequências das alíneas a) ou b).

- 2^a Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência de ADN ter origem num fungo seleccio nado de um dos géneros Aspergillus, Disporotrichum, Penicillium, Neurospora, Fusarium e Trichoderma.

- 3^a Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a sequência de ADN ter origem num fungo de uma espécie seleccionada do grupo constituido por Aspergillus tubigensis , Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus aculeatus, Disporotrichum dimorphosporum e Trichoderma reesei.

- 4^a Processo de acordo com a reivindicação 1 carac terizado por a sequência de ADN obtida ser:

a) a sequência de ADN

Listagem da sequência SEQ ID NO:1

TIPO DE SEQ.UENCIA : Nucleof ido com o polipéptido correspondente COMPRIMENTO DA SEQUENCIA ; 2054- pares de bases TIPO DE CADEIA _; Dupla

TOPOLOGIA; Linear

TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico ORGANISMO ORIGlNALi Aspergillus tubigensis ORIGEM EXPERIMENTAL IMEDIATA ; pIMWO em E. coli

JM 101.. (CBS' 322. 90)

CARACTERI STICAS

PROPRIEDADES

de 848 a 854 p de 95 0 a 1632 de 1179 a 1230 de 950 a 1031 de 103} ' a 163 2 de 594 a 74 8 de 618 a 632

tntraò 1 pre-propeptideo peptídeo maduro região implicada na mducao e de 637 a 651 e de 6S6 a 672 re peticào

J

Gene do endoxila nase A de

Aspergillus niger (xlnA)

AACGTCTGCA GTCCCGTACT GTTTACCAAA GTAATACGTT GCCGGAGTCÃ 'GCCCCTACTC CTACTGGGTA GTAGGCTCCT AGAGTGGGGT GTTTATGCTT GGCTAGGCAG GACCTGGGTA ATTTCCAGCT ATAAGCGAGA TTTGCCATAC GGTTGACCCT GCCTTCATCA CCTACACAAA GAGCTCCAAA GTACCTTCGC GACCTTTGGC AGGCTTGCTA CAATAAATAA AGAGACATAA

GGAACTGTGT TCAGTAGTAG ATCAGTGGGT

AAAACCTTCT GCAGGGAACC GGTGAAGAAA CCCTTTATCC GCCTGCCGTC CATTTAGCCA TTTAGCCAAG TCCAGTGC^TT AGGTTGGTGG CAACTATAGA ACTGTCCCTA GAAATAGGCT

GCAAAATGCA TATGACTGAG TTGCTTCAAC CGCAGAATAT AAATAGAGGT AGAGCGGGCT TTTCCAGTTG CATACATCCA TTCACAGCAT

ATGCCAGGCC ACTGGTGGAT ATACAACTTT ÓO

TCCCACTCCC TAGTTACTTC 120

AAGGGTTTAG CCCCAGTCTT 180

TCCTGCATTC CTACCTGAGT 240

GTCCGGATGG TCCGCGCCGA 300

GCCAACTCCC GGTGGCCTTC 360

CGCAGCGTTT ACTGAGCCTA 420

CATACGTCTT GTATGAGCGA 480

GAACATGACT TCTGAGCCAG 540

CCGCCTCCAC TAACTGCAGC 600

ATTTAGCCAA GTGCGGTCCA 660

AACGGCCATG AATGTAGACA 720

AGAGCGTTTA AGGTGATGCG 780

AAGGGATAAA TAGTCTTTTT 340

TTGACCAGGA CAGGGCTTCT 900

TCAATCATC ATG AAG GTC 958

Het Lys Vai -25

CCTGATGGGT

AAAGTTTGCC

AGTTGATGGC

TCTTCAGCGA

GAACTCCTCG

CAGTGTTTCT

CCTTGCAGTA

ACATAATCAT

CCCCACTTCC

AATGTAGTCC

CTACACAGGA

CGAGGTTGTT

GTGCAGGGGA

CGCAGCAATA

TCAGCTTTCT

ACT GCG GCT TTT GCA GGT CTT TTG GTC ACG GCA TTC GCC GCT CCT GCC Thr Ala Ala Phe Ala Gly Leu Leu Vai Thr Ala Phe Ala Ala Pro Ala -20 -15 -10 CCA GAA CCT GAT CTG GTG TCG CGA AGT GCC GGT ATC AAC TAC GTG CAA Pro Glu Pro Asp Leu Vai Ser Arg Ser Ala Gly Ile Asn Tyr Vai Gin -5 1 5 AAC TAC AAC GGC AAC CTT GGT GAT TTC ACC TAC GAC GAG AGT GCC GGA Asn Tyr Asn Gly Asn Leu Gly Asp Phe Thr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly 10 15 20 ACA TTT TCC ATG TAC TGG GAA GAT GGA GTG AGC TCC GAC TTT GTC GTT Thr Phe Ser Het Tyr Trp Glu Asp Gly Vai Ser Ser Asp Phe Vai Vai 25 30 35 40 GGT CTG GGC TGG ACC ACT GGT TCT TCT AA l GTGAGTGACT GTATTCTTTA Gly Leu Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ser Asn

1054

1102

1150

1006

1199

ACCAAGGTCT AGGATCTAAC GTCTTTCAG C GCT ATC ACC TAC TCT GCC GAA Ala ile Thr Tyr Ser Ala Glu

1250

TAC AGC GCT TCT GGC TCC GCT TCC TAC CTC GCT GTG TAC GGC TGG GTC 1298 Tyr Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Tyr Leu Ala Vai Tyr Gly Trp Vai 60 65 70 AAC TAT CCT CAA GCT GAG TAC TAC ATC GTC GAG GAT TAC GGT GAT TAT 1346 Asn Tyr Pro Gin Ala Glu Tyr Tyr I le Vai Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr 75 80 85 AAC CCT TGC AGT TCG GCC ACA AGC CTT GGT ACC GTG TAC TCT GAT GGA 1395 Asn Pro Cys Ser Ser Ala Thr Ser Leu Gly Thr Vai Tyr Ser Asp Gly 90 95 100 105 AGC ACC TAC CAA GTC TGC ACC GAC ACT CGA ACA AAC GAA CCG TCC -ATC 1442 Ser Thr Tyr Gin Vai Cys Thr Asp Thr Arg Thr Asn Glu Pro Ser Ile

110

120

115

ACG Thr GGA AGA AGC ACG TTC Phe ACG CAG TAC TTC TCC GTT CGA GAG AGC ACG 1490 Gly Thr Ser Thr 125 Thr Gin Tyr 130 Phe Ser Vai Arg Glu 135 Ser Thr GCG ACA TCT GGA ACG GTG ACT GTT GCC AAC CAT TTC AAC TTC TGG GCG 1538 Arg Thr Ser Gly Thr Vai Thr Vai Ala Asn His Phe Asn Phe Trp Ala 140 145 150 CAG CAT GGG TTC GGC AAT ACG GAC TTC AAT TAT CAG GTC GTG GCG GTG 1586 His His Gly Phe Gly Asn Ser Asp Phe Asn Tyr Gin Vai Vai Ala Vai 155 160 165 GAA GCA TGG AGC GGT GCT GGC AGC GCT AGT GTC ACA ATC TCT TCT TGA 1634 Glu Ala Trp Ser Gly Ala Gly Ser Ala Ser Vai Thr I le Ser Ser

170 175 180

GAGATTAGTG CCCTAGTAGT CGGAAGATAT CAACGCGGCA GTTTGCTCTC AGGTGGTGTG 1694 ATGATCGGAT CCGGTCTCTG GGGTTACATT GAGGCTGTAT AAGTTGTTGT GGGGCCGAGC 1754 TGTCAGCGGC TGCGTTTTCA GCTTGCACAG ATAATCAACT CTCGTTTTCT ATCTCTTGCG 1814 TTTCCTCGCT GCTTATCCTA TCCATAGATA ATTATTTTGC CCACTACCAC AACTTGTTCG 1874 GTCGCAGTAG TCACTCCGAG CAAGGCATTG GGAAATGGGG GATGCGGGGT GCTGCGTACC 1934 CTCTAACCTA GGGCATTTTA AAGGATATTT ACCCTCCAGA TATTCTATAG ATACAGACTT 1994 CTTAGGACTG CGGGTAATAT AGAGAGCGAA ATTTCTACAG TTCGATGCAG TTCAATGCGA 2054

b) uma variante genética da sequência da alínea a);

c) uma sequência de ADN com capacidade de hibridação para uma das sequências das alíneas a) ou b).

- 5^a Processo para a preparação de uma construção de ADN caracterizado por se incorporar uma sequência de ADN preparada de acordo com a reivindicação 1 e as regiões de regulação ligadas de modo operável com capacidade para dirigir a sobre-expressão de um polipeptídeo dotado de actividade de xilanase num hospedeiro de expressão adequado.

- 6^a Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o gene que codifica para a xilanase ser originário de um fungo seleccionado de um dos gêneros Aspergillus, Dis- 62 - porotrichum Penicillium, Neurospora, Fusarium e Trichoderma.

- 7^a Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o gene que codifica para a xilanase fúngica ser originário de um fungo de uma espécie seleccionado do grupo cons tituido por Aspergillus tubigensis, Aspergillus nlger, Aspergi1lus awamori, Aspergillus aculeatus, Disporotrichum e dimorphospo rum e Trichoderma reesei.

- 8^a Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a região de regulação incluir um promotor seleccionado do grupo constituído pelo promotor proveniente de um gene de aminoglucosidade e o promotor nativo de um gene da xilanase.

- 9^a Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a região de regulação incluir uma sequência guia de secreção seleccionada do grupo constituido pela sequência gui a de secreção proveniente de um gene de amiloglucosidade e a sequência guia de secreção nativa de um gene da xilanase.

Processo para transformar um hospedeiro microbiano capaz de sobre-expressão de uma xilanase fúngica caracterí zado por se introduzir no hospedeiro microbiano uma construção de expressão preparada de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 9.

- 11^a Processo de acordo com a reivindicação 10 caracterizado por o hospedeiro microbiano ser seleccionado de um los géneros Aspergillus, Kluyveromyces, Trichoderma, Saccharomyçes ou Bacillus.

Processo de acordo com a reivindicação 10 caracterizado por o hospedeiro microbiano ser seleccionado das espécies Aspergillus, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus aculeatus, Aspergillus aryzae, Trichoderma reesei, Bac illus subtilis, Bacillus licheniformis, Kluyveromyces lactis e Saccharomyces cerevisae.

- 13^a Processo para a preparação de um polipêptídeo dotado de actividade de xilanase por sobre-expressão caracteriza do pelas fases de:

a) cultivar um hospedeiro microbiano obtido de acordo com a reivindicação 10 sob condições adequadas para a expressão do gene que codifica para o polipeptídeo dotado de actividade de xilanase; e

b) recuperar o polipeptídeo dotado de actividade de xilanase.

- 14^a Processo para a degradação de um substracto que contêm xilano caracterizado por se fazer actuar um polipeptí deo dotado de actividade de xilanase obtido de acordo com a reivindicação 13,

- 15^a Processo para a preparação de um alimento para animais caracterizado por se fazer actuar um polipeptídeo dotado de actividade de xilanase obtido de acordo com a reivindicação 13.

- 16^a Processo para a preparação de um alimento composto para animais caracterizado por se incorporar um polipeptídeo dotado de actividade de xilanase de acordo com a reivindicação 13.

- 17^a Processo para a preparação de massa de panificação para a preparação de pão caracterizado por se incorporar um polipeptídeo de actividade de xilanase obtido de acordo com a reivindicação 13.

- 18^a Processo para a preparação de lenhinas de pasta de celulose Kraft na preparação de papel caracterizado por se utilizar um poli peptídeo dotado de actividade de xilanase preparado de acordo com a reivindicação 13.

A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente europeu, apresentado em 24 de Julho de 1990, sob o N9 90 20 20 20.5.

Lisboa, 23 de Julho de 1991

RESUMO

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE SEQUÊNCIAS DE ADN QUE CODIFICAM PARA XILANASES, DE CONSTRUÇÕES DE ADN QUE CONTÊM ESSAS SEQUÊNCIAS, PARA A TRANSFORMAÇÃO DE HOSPEDEIROS MICROBIANOS COM ESSAS CONSTRUÇÕES, PARA A PREPARAÇÃO DE XILANASES POR EXPRESSÃO NESSES HOSPEDEIROS E PARA A DEGRADAÇÃO DE XILANO POR ACÇÃO DESSAS XILANASES .

A invenção refere-se a um processo para a preparação de uma sequência de ADN que codifica para um polipeptídeo que possui actividade de xilanase que compreende isolar-se e purificar a) uma sequência de ADN que codifica para um polipep tídeo que possui actividade de xilanase a partir de um fungo; ou b) uma variante genética da sequência da alínea a); ou c) uma se quência de ADN com capacidade de hibridação para uma das sequências das alíneas a) ou b).

2) ij tu υ

X, tu ΐ

Fl G. 1 tu ui

O tu hj U Q£

K (J £

tu

-J

Ul

K o

tt

0.

ííl ϊιΟί B ini ¹ ώ

<N

FI G.

('DTI ) D3l)do apDpiSUSQ

Tempo de eluiçao ( min.)

Sequências de ácidos aminados N terminai s da proteína XYL A de Aspergillus tubigensis

FI Θ. 3

15 10

Ala-Gly-Ile-Asn-Tyr-Val-Gln-Asn-Tyr-Asn (Formula 1)

Os ohgonucleót-idos soo. derivados desde o resíduo 4-(Asn) até ao resíduo 10 (Asn) de modo complemenFar ao ARNm correspondent-e:

AB801

AB802

AB803

AB804

AB805

AB806

G A T G

5’ TT TA TT TGAAC TAATT 3’ A G C A

G A T G

5' TT TA TT TGGAC TAATT 3' A G C A

G A T G

5’ TT TA TT TGCAC TAATT 3’ A G C A

G A T G

5' TT TA TT TGAAC TAGTT 3' A G C A

G A T G

5’ TT TA TT TGGAC TAGTT 3' A G C A

G A T G

5' TT TA TT TGCAC TAGTT 3’ A G C A

Sequencia do ácidos: aminados N-terminal do um fragmento interno do 79 kDa da proteína XYL A do

Aspergillus tubigensis digerido com a endopeptidase

V8 de 5, aureus :

FI G. 4 ¹ 5 10 14

Tyr-Tyr-Ile-Val-Glu-Asp-Tyr-Gly- X -Tyr-Asn-Pro-Cys-(Ser)

L (Formula 2)

J- 5 10 14

Tyr-Tyr-Ile-Val-Glu-Asp-Tyr-Gly-(Ser) -Tyr-Asn-Pro-cys- (Ser) (Formula 3)

Os oligonucleótidos sao derivados desde o resíduo 2 (Tyr) até ao resíduo 7 (Tyr) de modo complementar ao ARNm correspondente

AB1255

AT AAA

5’ TA TC TCNACGAT TA TA 3’ G C T G G

250 500 1000 12501500 175020002250

Fl G. 6

e

JQ

OÓ

Ll

FI Θ.8

Listagem da sequencia

SEQ ID NO:1

TIPO DE SEQUENCIA : Nucleóf-ido com O pohpephdo correspondente COMPRIMENTO DA SEQUENCIA ; 20S4 pares de bases TIPO DE CADEIA _; Dupla

TOPOLOGIA _: Lmear TIPO DE MOLÉCULA ; ADN genómico ORGANISMO ORIGINAL / Aspergillus tubigensis ORIGEM EXPERIMENTAL IMEDIATA ; plMIOO em E.coli

JM 101 (CBS' 322.90)

CARACTERISTICAS ' de 646 a 654 pb sinal TATA potenc ta l de 950 a 1632 sequencia de c od ι f icoçob de 1179 a 1230 mtrddl de 950 o 1031 pré-propeptideo de 1031 a 1632 peptídeo ma duro de 594 a 746 região implicada na inducaò de 616 a 632 e de 637 a 651 e de 656 o 672 re peticao

PROPRIEDADES ; Gene da endoxilanase A de As-pergillus ntger (xln A)

AACGTCTGCA GTCCCGTACT GTTTACCAAA ATGCCAGGCC ACTGGTGGAT ATACAACTTT 60 GTAATACGTT GCCGGAGTCÃ 'GCCCCTACTC CCTGATGGGT TCCCACTCCC TAGTTAETTC 120 CTACTGGGTA GTAGGCTCCT AGAGTGGGGT AAAGTTTGCC AAGGGTTTAG CCCCAGTCTT 180 GTTTATGCTT GGCTAGGCAG GACCTGGGTA AGTTGATGGC TCCTGCATTC CTACCTGAGT 240 ATTTCCAGCT ATAAGCGAGA TTTGCCATAC TCTTCAGCGA GTCCGGATGG TCCGCGCCGA 300 GGTTGACCCT GCCTTCATCA CCTACACAAA GAACTCCTCG GCCAACTCCC GGTGGCCTTC 360 GAGCTCCAAA GTACCTTCGC GACCTTTGGC CAGTGTTTCT CGCAGCGTTT ACTGAGCCTA 420 AGGCTTGCTA CAATAAATAA AGAGACATAA CCTTGCAGTA CATACGTCTT GTATGAGCGA 480 GGAACTGTGT TCAGTAGTAG ATCAGTGGGT ACATAATCAT GAACATGACT TCTGAGCCAG 540 AAAACCTTCT GCAGGGAACC GGTGAAGAAA CCCCACTTCC CCGCCTCCAC TAACTGCAGC 600 CCCTTTATCC GCCTGCCGTC CATTTAGCCA AATGTAGTCC ATTTAGCCAA GTGCGGTCCA 660 TTTAGCCAAG TCCAGTGCTT AGGTTGGTGG CTACACAGGA AACGGCCATG AATGTAGACA 720 CAACTATAGA ACTGTCCCTA GAAATAGGCT CGAGGTTGTT AGAGCGTTTA AGGTGATGCG 780 GCAAAATGCA TATGACTGAG TTGCTTCAAC GTGCAGGGGA AAGGGATAAA TAGTCTTTTT 840 CGCAGAATAT AAATAGAGGT AGAGCGGGCT CGCAGCAATA TTGACCAGGA CAGGGCTTCT 900 TTTCCAGTTG CATACATCCA TTCACAGCAT TCAGCTTTCT TCAATCATC ATG AAG GTC 958 Met Lys Vai -25

Fl G.Ô ( FOLHA 2 d<? 3 J

1006

ACT Thr GCG GCT TTT GCA Ala -20 GGT CTT TTG GTC ACG GCA TTC GCC GCT CCT GCC Ala Ala Ala Phe Gly Leu Leu Vai Thr Ala -15 Phe Ala Ala Pro -10 CCA GAA CCT GAT CTG GTG TCG CGA AGT GCC GGT ATC AAC TAC GTG CAA Pro Glu Pro Asp Leu Vai Ser Arg Ser Ala Gly Ile Asn Tyr Vai Gin -5 1 5 AAC TAC AAC GGC AAC CTT GGT GAT TTC ACC TAC GAC GAG AGT GCC GGA Asn Tyr Asn Gly Asn Leu Gly Asp Phe Thr Tyr Asp Glu Ser Ala Gly 10 15 20 ACA TTT TCC ATG TAC TGG GAA GAT GGA GTG AGC TCC GAC TTT GTC GTT Thr Phe Ser Het Tyr Trp Glu Asp Gly Vai Ser Ser Asp Phe Vai Vai 25 30 35 40 GGT CTG GGC TGG ACC ACT GGT TCT TCT AA ι GTGAGTGACT GTATTCTTTA Gly Leu Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ser Asn

45 50

1054

1102

1150

1199

1250

55 TAC AGC GCT TCT GGC TCC GCT TCC TAC CTC GCT GTG TAC GGC TGG GTC Tyr Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Tyr Leu Ala Vai Tyr Gly Trp Vai 60 65 70 AAC TAT CCT CAA GCT GAG TAC TAC ATC GTC GAG GAT TAC GGT GAT TAT Asn Tyr Pro Gin Ala Glu Tyr Tyr Ile Vai Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr

75 80 85

1298

1346

AAC CCT TGC AGT TCG GCC ACA AGC CTT GGT ACC GTG TAC TCT GAT GGA

Asn Pro Cys Ser Ser Ala Thr Ser Leu Gly Thr Vai Tyr Ser Asp Gly

90 95 100 105

AGC ACC TAC CAA GTC TGC ACC GAC ACT CGA ACA AAC GAA CCG TCC ATC

Ser Thr Tyr Gin Vai Cys Thr Asp Thr Arg Thr Asn Glu Pro Ser Ile

110 115 120

1395

1442

F I G. 8 (FOLHA 3 de 3 )

ACG Thr GGA AGA AGC ACG TTC Phe ACG CAG TAC TTC TCC GTT CGA GAG AGC ACG 1490 Gly Thr Ser Thr 125. Thr Gin Tyr 130 Phe Ser Vai Arg Glu 135 Ser Thr GCG ACA TCT GGA ACG GTG ACT GTT GCC AAC CAT TTC AAC TTC TGG GCG 1538 Arg Thr Ser Gly Thr Vai Thr Vai Ala Asn His Phe Asn Phe Trp Ala 140 145 150 CAG CAT GGG TTC GGC AAT ACG GAC TTC AAT TAT CAG GTC GTG GCG GTG 1586 His His Gly Phe Gly Asn Ser Asp Phe Asn Tyr Gin Vai Vai Ala Vai 155 160 165 GAA GCA TGG AGC GGT GCT GGC AGC GCT AGT GTC ACA ATC TCT TCT TGA 1634 Glu Ala Trp Ser Gly Ala Gly Ser Ala Ser Vai Thr I le Ser Ser

170 175 180

1 234 5 6 7 8 9 1011121314 +

Fl G 9

PISTAS 7 e 4 í Xí/onos<? A puri Ficada (XY L A)

PISTAS 2 c 13; Estirpe A.niger DS16613 nâà transformada

PISTAS 3 a 7 : Filtrado da cultura do transformaste TrX2 de A. niger DS16813 diluído do modo segumFe : nao diluídOj 1:1 1:4 _f 1:16_} 1:32 respecFivamenFe*

PISTAS 8 o.12; Filtrado da cultura da Fransformante TrXQde A.niger DS16613 diluído do modo segum te : não diluído 7«7^ 1:4- _y 1:16 ,1:32 respecFi vamenFe