Procédé de production et d'isolement
de la L-phénylalanine.
La présente invention concerne un procédé perfectionné de production de la L-phénylalanine. Plus particulièrement, elle concerne un perfectionnement à la production de la L-phénylalanine par réaction de l'acide trans-cinnamique avec les ions ammonium catalysée par la L-phénylalanine ammonia-lyase (PAL).
La L-phénylalanine est un aminoacide essentiel pour l'être humain et est donc un constituant important des formulations nutritives à usage entérique ou parentéral. De plus, cet aminoacide est utile comme matière première pour d'autres produits, comme l'aspartame, qui est un édulcorant artificiel. Différents procédés microbiens pour produire la phénylalanine sont connus. Par exemple, le brevet E.U.A. 3.660.235 décrit la production de la phénylalanine au moyen de souches de Brevibacterium, de Corynebacterium, d'Arthrobacter, de Bacillus et de Candida résistantes aux analogues de la phénylalanine. La production de cet aminoacide par des mutants de certaines souches de Brevibacterium, de Corynebacterium, d'Arthrobacter et d'Escherichia qui ont besoin de tyrosine est également connue. On peut se référer à ce propos aux brevets E.U.A. 3.654.079 et
3.909.353.
Le PAL catalyse la décomposition de la Lphénylalanine en acide trans-cinnamique et en ammoniac. Cette réaction enzymatique est réversible et le brevet anglais 1.489.468 décrit un procédé pour produire la Lphénylalanine qui met en jeu la réaction catalysée par le PAL de l'acide trans-cinnamique avec les ions ammonium produisant la L-phénylalanine. Cette réaction s'est révélée utile pour la production industrielle de la L-phénylalanine et il reste en permanence nécessaire d'adapter le procédé en vue d'optimaliser la fabrication. Sous ce rapport, il est particulièrement nécessaire d'améliorer l'isolement de la L-phénylalanine hors du mélange de bioréaction.
Suivant le brevet anglais précité, la L-phénylalanine est initialement isolée en étant précipitée à son point isoélectrique (pH 5,5), ou en variante en étant absorbée sur une résine échangeuse de cations à un pH bas et dont elle est éluée au moyen d'hydroxyde d'ammonium à un pH élevé. La L-phénylalanine est ensuite débarrassée des ions ammonium par chauffage de la solution. Ce brevet décrit aussi un procédé d'isolement qui revient à convertir la L-phénylalanine en son ester méthylique in situ et à cristalliser celui-ci sous la forme de son chlorhydrate. Les procédés d'isolement décrits dans le brevet anglais 1.489.468 n'ont pas donné parfaite satisfaction pour une fabrication à l'échelle industrielle.
La simple précipitation de la L-phénylalanine à son point isoélectrique conduit à un rendement en produit et à une pureté de celui-ci qui n'atteignent pas l'idéal. Bien que la chromatographie par échange d'ions donne un produit relativement pur, elle est incommode à l'échelle industrielle.
Yamada, S. et al. décrivent dans Applied and Environmental Microbiology, novembre 1981, pages 773-
778, des procédés de laboratoire pour produire la Lphénylalanine par réaction de l'acide trans-cinnamique avec les ions ammonium sous la catalyse par le PAL. Dans le procédé décrit dans cet article, la L-phénylalanine est isolée du mélange de bioréaction contenant les cellules suivant un mode opératoire en plusieurs stades qui comprend la centrifugation séparant les cellules et les solides, l'élimination sous vide de l'ammoniac en excès du liquide surnageant, l'ajustement du pH à 1,8 pour la précipitation de l'acide transcinnamique (qui est ensuite séparé par filtration), la chromatographie par échange de cations permettant d'absorber la L-phénylalanine et l'élution de la L-phénylalanine à l'aide d'une base.
Les auteurs mentionnent un rendement de 69% pour ce procédé. Bien que la L-phénylalanine produite de cette façon soit très pure, comme indiqué précédemment, la chromatographie sur colonne est incommode pour une production à l'échelle industrielle.
Il reste donc intéressant d'améliorer les techniques d'isolement de la L-phénylalanine hors des mélanges de bioréaction dans lesquels elle a été produite sous catalyse par le PAL.
La présente invention a pour objet un procédé perfectionné de production de la L-phénylalanine par réaction de l'acide trans-cinnamique avec les ions ammonium en présence de phénylalanine ammonia-lyase dans les conditions de la production de la L-phénylalanine, et d'isolement de la L-phénylalanine ainsi produite, suivant lequel on utilise le carbonate d'ammonium comme source d'ions ammonium. L'utilisation de ce sel comme source des ions ammonium facilite beaucoup les techniques d'isolement du fait que le cation et aussi l'anion constitutifs du sel peuvent être éliminés du mélange de réaction par volatilisation.
Suivant le procédé de l'invention, de la phénylalanine ammonia-lyase produite par voie microbienne est mise en contact avec de l'acide trans-cinnamique et des ions ammonium pour donner de la L-phénylalanine. La phénylalanine ammonia-lyase peut être contenue dans un bouillon aqueux contenant les cellules microbiennes ou dans les cellules qui en ont été séparées ou bien être présente à l'état de l'enzyme isolée. De plus, les cellules entières ou l'enzyme isolée peuvent être immobilisées sur un support solide. Le PAL est produit par culture d'un micro-organisme producteur de PAL dans un milieu nutritif approprié.
Les souches microbiennes qui produisent le PAL et les procédés microbiologiques dans lesquels ces souches sont utilisées sont connus et décrits, par exemple, dans le brevet anglais et l'article précité de Yamada, de même que dans les demandes de brevet E.U.A. n[deg.] 432.182 (ler octobre 1982) et 547.129 (31 octobre 1983).
La réaction enzymatique est généralement conduite par mise en contact du PAL avec une solution de substrat. Antérieurement à la présente invention, la solution de substrat était normalement préparée par dissolution d'acide trans-cinnamique dans une solution concentrée d'hydroxyde d'ammonium. De l'eau et un acide minéral étaient ensuite ajoutés pour ajuster le volume et le pH du substrat, respectivement. En variante, les ions ammonium ont été introduits dans la solution de substrat sous la forme d'un sel d'ammonium tel que le chlorure d'ammonium. La demande de brevet E.U.A.
432.182 précitée mentionne que les ions halogénure ont un effet nuisible sur la L-phénylalanine ammonia-lyase et préconise donc d'utiliser des solutions de substrat sensiblement exemptes d'halogène.
Il y est dès lors indiqué que les sels d'ammonium préférés sont notamment le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le citrate d'ammonium, l'acétate d'ammonium et le phosphate d'ammonium.
La présente invention a pour objet l'utilisation du carbonate d'ammonium comme source d'ions ammonium dans la solution de substrat. De manière générale, la solution de substrat peut être préparée par mélange d'ammoniac, sous forme de gaz ou d'hydroxyde d'ammonium, avec du carbonate d'ammonium pour établir la concentration souhaitée en carbonate d'ammonium. Suivant une variante préférée pour préparer la solution de substrat, l'acide trans-cinnamique est dissous dans une solution aqueuse d'hydroxyde d'ammonium dans laquelle du dioxyde de carbone est ensuite introduit par barbotage jusqu'à ce que la solution ait le pH souhaité. La concentration en ions ammonium dans cette solution de substrat est avantageusement d'environ 0,1 à environ 9,0 moles par litre et de préférence d'environ 5,0 à environ 8,0 moles par litre.
La solu-tion de substrat contient aussi l'acide transcinnamique. La concentration en acide trans-cinnamique de la solution est ajustée de manière que la réaction catalysée par l'enzyme progresse à une vitesse utile, mais sans que la concentration soit élevée au point que le substrat inhibe l'activité enzymatique. En règle générale, la concentration en acide trans-cinnamique s'échelonne d'environ 5 à environ 25 et de préférence environ 10 à environ 20 g par litre. Le pH est ajusté de façon que les conditions de la production de la Lphénylalanine soient maintenues lorsque le catalyseur est amené au contact de la solution de substrat. Ce pH est avantageusement d'environ 9 à 11 et de préférence environ 10,4 à 10,8.
Après que le PAL a été mis en contact avec la 'solution de substrat pendant une durée suffisante pour convertir une fraction sensible de l'acide trans-cinnamique en L-phénylalanine, celle-ci peut être isolée et purifiée. Au pH de la solution de substrat, tant l'acide trans-cinnamique que la L-phénylalanine sont solubles. Par conséquent, les cellules et les autres solides peuvent être séparés par centrifugation ou filtration en laissant subsister une solution clarifiée. Celle-ci peut être dessalée, avantageusement par volatilisation de l'ammoniac et du dioxyde de carbone qui ont été apportés par l'hydroxyde d'ammonium et le carbonate d'ammonium initialement ajoutés à la solution de substrat.
La possibilité d'éliminer ces espèces ionogènes de la solution par volatilisation est l'avantage principal de l'utilisation du carbonate d'ammonium comme source d'ions ammonium. Un autre avantage important du procédé de l'invention est que l'ammoniac et le carbonate d'ammonium peuvent être récupérés et réutilisés. La récupération de ces agents chimiques améliore l'économie d'ensemble du procédé et réduit au minimum la pollution par ces agents dans le milieu extérieur. Le dessalement est généralement exécuté par chauffage de la solution clarifiée jusqu'à une température qui facilite la volatilisation du carbonate d'ammonium. Des températures d'environ 10 à 120[deg.]C et de
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régnant dans le réacteur, conviennent à cette fin. L'évaporation sous vide, l'entraînement par l'air ou l'entraînement par la vapeur d'eau permettent d'accélérer efficacement la volatilisation du carbonate d'ammonium en ammoniac et dioxyde de carbone. L'évaporation sous vide à des températures d'environ 40 à 60[deg.]C constitue la technique préférée. Un mode opératoire particulièrement préféré consiste à chauffer la solu-
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absolue d'environ 100 mm Hg et à séparer l'ammoniac et le dioxyde de carbone par évaporation. Initialement, il se dégage de l'ammoniac gazeux, ce dégagement d'ammoniac fait baisser le pH de la solution. Lorsque le pH atteint une certaine valeur, le dioxyde de carbone commence à se dégager à son tour et compense la baisse du pH. Sensiblement la totalité de l'ammoniac et du dioxyde de carbone peut être éliminée efficacement de la solution de cette façon, si la chose est souhaitée, et les gaz peuvent être récupérés par condensation des vapeurs.
L'élimination du sel hors de la solution par volatilisation permet de concentrer davantage la solution exempte de sel résultante pour faire cristalliser la L-phénylalanine avec un rendement élevé.
La cristallisation de la L-phénylalanine est effectuée par évaporation de la solution, par exemple à une température d'environ 10 à environ 120[deg.]C jusqu'à ce que la concentration en L-phénylalanine soit d'environ
75 à environ 300 g par litre et de préférence d'environ 150 à environ 200 g par litre. Un mode opératoire préféré est d'évaporer la solution sous pression réduite à une température d'environ 20 à environ 70[deg.]C, jusqu'à ce que la concentration souhaitée en L-phénylalanine soit atteinte. Pendant cette évaporation, un pH du domaine alcalin est entretenu pour éviter la précipitation de l'acide trans-cinnamique qui reste en solution et pour porter au maximum le rendement en Lphénylalanine. Ce pH est généralement situé entre environ 6 et 9 et de préférence entre environ 7,0 et 8,5.
La dispersion résultante de L-phénylalanine est ensuite refroidie graduellement jusqu'à une température qui provoque la cristallisation sensible de la L-phénylalanine. La solution est refroidie de préférence jusqu'à une température d'environ -5[deg.]C à environ +25[deg.]C. Les cristaux de L-phénylalanine ainsi obtenus peuvent être ensuite isolés, par exemple par filtration ou centrifugation, lavés à l'eau froide et séchés. Une seconde récolte de cristaux peut être obtenue par poursuite de la concentration et du refroidissement de la liqueur mère, si la chose est souhaitée. L'acide trans-cinnamique subsistant éventuellement dans la liqueur mère peut être recueilli par acidification et précipitation et est alors avantageusement recyclé au bioréacteur.
Suivant une variante de l'invention, il est parfois avantageux de séparer et recueillir l'acide trans-cinnamique du mélange de réaction avant de recueillir la L-phénylalanine.
Avant la précipitation de la L-phénylalanine, la solution dessalée est avantageusement acidifiée au moyen d'un acide minéral fort, comme l'acide sulfurique ou chlorhydrique, jusqu'au pH où l'acide trans-cinnamique précipite. Ce pH est généralement d'environ 1,0 à environ 3,0 et de préférence d'environ 1,5 à 2,5. Une précipitation sensiblement quantitative de l'acide trans-cinnamique peut être obtenue par refroidissement de la solution jusqu'à une température d'environ -5[deg.]C à environ +25[deg.]C et de préférence d'environ 0 à 5[deg.]C. L'acide cinnamique précipité peut être recueilli par filtration ou centrifugation et utilisé à nouveau, si la chose est souhaitée.
La solution résultante est alors concentrée, par exemple par évaporation sous vide, jusqu'à ce qu'une concentration relativement en L-phénylalanine soit atteinte. La concentration souhaitée est une concentration telle que lors de la cristallisation ultérieure, la L-phénylalanine précipite sensiblement dans la solution. Il est préférable de réaliser la précipitation sensiblement quantitative de la L-phénylalanine. A cet effet, la concentration en L-phénylalanine s'échelonne d'environ 25 à environ 150 et de préférence environ 50 à 150 g par litre.
La cristallisation de la L-phénylalanine dans sa solution est avantageusement réalisée par ajustement du pH de la solution à peu près au point isoélectrique de la phénylalanine au moyen d' une base. Il est préférable d'utiliser l'ammoniac ou l'hydroxyde d'ammonium pour cet ajustement du pH. Le pH s'échelonne généralement de 3,5 à environ 6,5. Au cours de cet ajustement du pH, il est préféré de chauffer la solution à une température qui maintient la L-phénylalanine en solution pendant l'ajustement du pH. Par exemple, une température d'environ 40 à environ 100[deg.]C convient. Un refroidissement graduel de cette solution provoque la cristallisation de la L-phénylalanine avec une pureté élevée. La précipitation sensiblement quantitative peut être réalisée par refoidissement jusqu'à une température d'environ -5[deg.]C à environ +25[deg.]C.
Les cristaux de L-phénylalanine peuvent être ensuite recueillis par filtration ou centrifugation, puis lavés à l'eau froide et séchés.
Le procédé de l'invention s'est révélé particulièrement propre à la production industrielle. Le procédé donne la L-phénylalanine en cristaux de haute pureté et avec un bon rendement.
L'invention est davantage illustrée par les exemples non limitatifs ci-après.
EXEMPLE 1.-
Le présent exemple décrit l'isolement de la Lphénylalanine à partir d'un mélange de bioréaction suivant le procédé de l'invention. Le mélange de bioréaction est obtenu par réaction de l'acide transcinnamique sur l'ammoniac en présence de cellules de Rhodotorula Rubra contenant du PAL. La solution du substrat pour l'enzyme est préparée par dissolution d'acide trans-cinnamique dans une solution aqueuse d'ammoniaque et par ajustement du pH de 10,4 à 10,8 au moyen de dioxyde de carbone. La solution de réaction a un volume final de 1.236 litres et contient au total
51,912 kg de L-phénylalanine (42,0 g par litre).
On refroidit ce mélange de réaction à une température de 10 à 15[deg.]C pour réduire au minimum les pertes d'ammoniaque et inhiber la décomposition de la L-phénylalanine. On centrifuge le mélange et on le filtre sur un filtre-presse à feuille pour séparer les cellules. A ce moment, le filtrat (1.190 litres) a une concentration en phénylalanine de 38,2 g par litre. On chauffe ce filtrat à 40[deg.]C sous vide (635 mm Hg) de façon à le concentrer jusqu'à 485 litres. On chasse ensuite l'ammoniac et le dioxyde de carbone de la solution et on les récupère par condensation des vapeurs. La solution concentrée résultante a un pH d'environ 9,5 et une concentration en L-phénylalanine de 83,1 g par litre.
Une certaine quantité de matière particulaire s'est formée dans la solution pendant la concentration et l'élimination du sel et on l'élimine par filtration au filtre-presse à feuille avant de poursuivre les opérations. On chauffe le concentré clarifié à nouveau à 40[deg.]C sous vide (635 mm Hg) et on l'évapore jusqu'à un volume de 240 litres. On ajuste le pH à 8,7 et on refroidit ce concentré jusqu'à 5[deg.]C. On recueille par centrifugation les cristaux de L-phénylalanine qu'on lave à l'eau froide. On recueille sous forme de cristaux sensiblement purs environ 53% de la L-phénylalanine initialement contenue dans le réacteur. Une autre quantité de 25% de L-phénylalanine est contenue dans la liqueur mère et les liqueurs de lavage et on peut en récupérer une fraction sous la forme d'une seconde récolte de cristaux, si la chose est souhaitée.
EXEMPLE 2.-
On répète le mode opératoire de l'exemple 1 dans tous ses détails essentiels. Le mélange de réaction initial a un volume de 1.245 litres et contient
39 g par litre de phénylalanine. On recueille au total
38,0 kg de L-phénylalanine (78,3%) sous la forme d'un premier lot de cristaux isolés de la solution concentrée dessalée. La liqueur mère de la cristallisation de la L-phénylalanine contient 9,0 kg (18,5%) de L-phénylalanine et on la recycle à une fermentation ultérieure, comme inducteur de PAL. En outre, la liqueur mère contient 16,5 kg d'acide trans-cinnamique qu'on recycle aussi à une bioréaction ultérieure.
EXEMPLE 3.-
Le présent exemple décrit l'isolement de la Lphénylalanine d'un mélange de bioréaction suivant une forme de réalisation de l'invention où l'acide transcinnamique est séparé avant la précipitation de la Lphénylalanine.
On centrifuge et on filtre pour en séparer les cellules, un mélange obtenu par bioréaction de l'acide trans-cinnamique avec l'ammoniac en présence de cellules de R.rubra contenant du PAL. Avant la centrifugation, le mélange a un pH de 10-,52, une température
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contient, par litre, 21,0 g de L-phénylalanine et
15,3 g d'acide trans-cinnamique.
On centrifuge le mélange de réaction et on le filtre pour en séparer les cellules, puis on le transfère dans des récipients munis de dispositifs de chauffage et d'agitation. On chauffe la solution
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On récupère l'ammoniac et le carbonate d'ammonium par condensation des vapeurs. On entretient le barbotage d'air jusqu'à ce que le volume soit d'environ 350-
375 litres et que la concentration en L-phénylalanine soit de 70 à 80 g par litre. On transfère le concentré ensuite dans un autre récipient où on ajuste le pH à 2,0-2,1 au moyen d'acide sulfurique à 50%. On refroidit la solution acidifiée jusqu'à 0-10[deg.]C et on la met à reposer pendant 4 heures. On sépare les cristaux résultants d'acide trans-cinnamique de la solution par centrifugation. On transfère la liqueur mère dans un autre récipient, on la conserve à 23-24[deg.]C pendant 1 heure et on ajoute 8 kg d'un auxiliaire de filtration. On sépare l'auxiliaire de filtration et l'acide trans-cinnamique résiduel en filtrant la solution au filtre-presse.
Le filtrat (augmenté des liqueurs de lavage) a un volume de 270 litres et contient, par litre, 1,88 g d'acide trans-cinnamique et 59,5 g de Lphénylalanine. On transfère ce filtrat en parties égales dans deux récipients où on ajuste le pH à 3,53,6 au moyen d'ammoniaque aqueuse à 29%, après quoi on chauffe la solution à 60-70[deg.]C. On fait le vide (175 mm Hg) et on évapore le contenu des récipients jusqu'à ce que la concentration en L-phénylalanine soit de 200 g par litre. On refroidit le mélange concentré à
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le maintient à cette température pendant 4 heures. On sépare par centrifugation les cristaux résultants de Lphénylalanine qu'on lave à l'eau désionisée froide et qu'on sèche. On rassemble la liqueur mère et les liqueurs de lavage avec les solutions correspondantes d'une opération antérieure d'isolement et on en isole une seconde récolte de cristaux par concentration et refroidissement des mélanges de la façon décrite cidessus. Le rendement pour la première récolte de cristaux est d'environ 70%.
REVENDICATIONS
1.- Procédé perfectionné de production de la L-phénylalanine par réaction d'acide trans-cinnamique avec des ions ammonium en présence de phénylalanine ammonia-lyase dans les conditions de la production de la L-phénylalanine, et d'isolement de la L-phénylalanine hors du mélange de bioréaction ainsi obtenu, caractérisé en ce qu'on utilise le carbonate d'ammonium comme source d'ions ammonium.
Production and isolation process
L-phenylalanine.
The present invention relates to an improved process for the production of L-phenylalanine. More particularly, it relates to an improvement in the production of L-phenylalanine by reaction of trans-cinnamic acid with ammonium ions catalyzed by L-phenylalanine ammonia-lyase (PAL).
L-phenylalanine is an essential amino acid for humans and is therefore an important constituent of nutritional formulations for enteric or parenteral use. In addition, this amino acid is useful as a raw material for other products, such as aspartame, which is an artificial sweetener. Various microbial methods for producing phenylalanine are known. For example, the E.U.A. 3,660,235 describes the production of phenylalanine using strains of Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter, Bacillus and Candida resistant to phenylalanine analogs. The production of this amino acid by mutants of certain strains of Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter and Escherichia which need tyrosine is also known. We can refer in this regard to the E.U.A. 3,654,079 and
3,909,353.
PAL catalyzes the breakdown of Lphenylalanine into trans-cinnamic acid and ammonia. This enzymatic reaction is reversible and English patent 1,489,468 describes a process for producing Lphenylalanine which involves the reaction catalyzed by the PAL of trans-cinnamic acid with the ammonium ions producing L-phenylalanine. This reaction has proved to be useful for the industrial production of L-phenylalanine and it remains permanently necessary to adapt the process in order to optimize the manufacture. In this respect, it is particularly necessary to improve the isolation of L-phenylalanine from the bioreaction mixture.
According to the abovementioned English patent, L-phenylalanine is initially isolated by being precipitated at its isoelectric point (pH 5.5), or as a variant by being absorbed on a cation exchange resin at a low pH and from which it is eluted by means ammonium hydroxide at a high pH. The L-phenylalanine is then freed from ammonium ions by heating the solution. This patent also describes an isolation process which amounts to converting L-phenylalanine to its methyl ester in situ and to crystallizing the latter in the form of its hydrochloride. The isolation methods described in English patent 1,489,468 have not been entirely satisfactory for manufacturing on an industrial scale.
The simple precipitation of L-phenylalanine at its isoelectric point leads to a yield of product and to a purity thereof which do not reach the ideal. Although ion exchange chromatography produces a relatively pure product, it is inconvenient on an industrial scale.
Yamada, S. et al. describe in Applied and Environmental Microbiology, November 1981, pages 773-
778, laboratory methods for producing Lphenylalanine by reaction of trans-cinnamic acid with ammonium ions under catalysis by PAL. In the process described in this article, L-phenylalanine is isolated from the bioreaction mixture containing the cells in a multi-stage procedure which includes centrifugation separating cells and solids, vacuum removal of excess ammonia supernatant, adjusting the pH to 1.8 for precipitation of transcinnamic acid (which is then separated by filtration), cation exchange chromatography to absorb L-phenylalanine and elution of the L-phenylalanine using a base.
The authors mention a yield of 69% for this process. Although the L-phenylalanine produced in this way is very pure, as previously indicated, column chromatography is inconvenient for production on an industrial scale.
It therefore remains interesting to improve the techniques for isolating L-phenylalanine from the bioreaction mixtures in which it has been produced under catalysis by PAL.
The present invention relates to an improved process for the production of L-phenylalanine by reaction of trans-cinnamic acid with ammonium ions in the presence of phenylalanine ammonia-lyase under the conditions for the production of L-phenylalanine, and d isolation of the L-phenylalanine thus produced, according to which ammonium carbonate is used as a source of ammonium ions. The use of this salt as a source of the ammonium ions greatly facilitates the isolation techniques since the cation and also the anion constituting the salt can be removed from the reaction mixture by volatilization.
According to the process of the invention, phenylalanine ammonia-lyase produced microbially is brought into contact with trans-cinnamic acid and ammonium ions to give L-phenylalanine. Phenylalanine ammonia lyase can be contained in an aqueous broth containing microbial cells or in cells which have been separated therefrom or else be present in the state of the isolated enzyme. In addition, the whole cells or the isolated enzyme can be immobilized on a solid support. PAL is produced by culturing a PAL-producing microorganism in an appropriate nutrient medium.
The microbial strains that produce PAL and the microbiological processes in which these strains are used are known and described, for example, in the English patent and the aforementioned article by Yamada, as well as in the patent applications E.U.A. n [deg.] 432.182 (October 1, 1982) and 547.129 (October 31, 1983).
The enzymatic reaction is generally carried out by bringing the PAL into contact with a substrate solution. Prior to the present invention, the substrate solution was normally prepared by dissolving trans-cinnamic acid in a concentrated solution of ammonium hydroxide. Water and mineral acid were then added to adjust the volume and pH of the substrate, respectively. Alternatively, the ammonium ions were introduced into the substrate solution in the form of an ammonium salt such as ammonium chloride. The E.U.A.
432.182 cited above mentions that the halide ions have a detrimental effect on L-phenylalanine ammonia-lyase and therefore recommends the use of substrate solutions substantially free of halogen.
It is therefore indicated therein that the preferred ammonium salts are in particular ammonium sulphate, ammonium nitrate, ammonium citrate, ammonium acetate and ammonium phosphate.
The present invention relates to the use of ammonium carbonate as a source of ammonium ions in the substrate solution. Generally, the substrate solution can be prepared by mixing ammonia, in the form of gas or ammonium hydroxide, with ammonium carbonate to establish the desired concentration of ammonium carbonate. According to a preferred variant for preparing the substrate solution, the trans-cinnamic acid is dissolved in an aqueous ammonium hydroxide solution in which carbon dioxide is then bubbled in until the solution has the pH wish. The concentration of ammonium ions in this substrate solution is preferably from about 0.1 to about 9.0 moles per liter and preferably from about 5.0 to about 8.0 moles per liter.
The substrate solution also contains transcinnamic acid. The concentration of trans-cinnamic acid in the solution is adjusted so that the reaction catalyzed by the enzyme progresses at a useful speed, but without the concentration being so high that the substrate inhibits the enzymatic activity. Generally, the concentration of trans-cinnamic acid ranges from about 5 to about 25 and preferably about 10 to about 20 g per liter. The pH is adjusted so that the conditions for the production of Lphenylalanine are maintained when the catalyst is brought into contact with the substrate solution. This pH is advantageously around 9 to 11 and preferably around 10.4 to 10.8.
After the PAL has been contacted with the substrate solution for a time sufficient to convert a substantial fraction of the trans-cinnamic acid to L-phenylalanine, the latter can be isolated and purified. At the pH of the substrate solution, both trans-cinnamic acid and L-phenylalanine are soluble. Therefore, cells and other solids can be separated by centrifugation or filtration, leaving a clarified solution. This can be desalted, advantageously by volatilization of the ammonia and carbon dioxide which have been supplied by the ammonium hydroxide and the ammonium carbonate initially added to the substrate solution.
The possibility of eliminating these ionogenic species from the solution by volatilization is the main advantage of using ammonium carbonate as a source of ammonium ions. Another important advantage of the process of the invention is that the ammonia and the ammonium carbonate can be recovered and reused. The recovery of these chemical agents improves the overall economy of the process and minimizes pollution by these agents in the outside environment. Desalination is generally carried out by heating the clarified solution to a temperature which facilitates the volatilization of the ammonium carbonate. Temperatures of about 10 to 120 [deg.] C and
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prevailing in the reactor, are suitable for this purpose. Evaporation under vacuum, entrainment by air or entrainment by water vapor make it possible to effectively accelerate the volatilization of ammonium carbonate into ammonia and carbon dioxide. Evaporation in vacuo at temperatures of about 40 to 60 [deg.] C is the preferred technique. A particularly preferred procedure is to heat the solution.
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absolute about 100 mm Hg and to separate ammonia and carbon dioxide by evaporation. Initially, it gives off gaseous ammonia, this release of ammonia lowers the pH of the solution. When the pH reaches a certain value, carbon dioxide begins to release in turn and compensates for the drop in pH. Substantially all of the ammonia and carbon dioxide can be effectively removed from the solution this way, if desired, and the gases can be recovered by condensation of the vapors.
Removal of the salt from the solution by volatilization allows the resulting salt-free solution to be further concentrated to crystallize L-phenylalanine in high yield.
The crystallization of L-phenylalanine is carried out by evaporation of the solution, for example at a temperature of approximately 10 to approximately 120 [deg.] C until the concentration of L-phenylalanine is approximately
75 to about 300 g per liter and preferably about 150 to about 200 g per liter. A preferred procedure is to evaporate the solution under reduced pressure at a temperature of about 20 to about 70 [deg.] C, until the desired concentration of L-phenylalanine is reached. During this evaporation, a pH of the alkaline domain is maintained to avoid the precipitation of trans-cinnamic acid which remains in solution and to bring the yield of Lphenylalanine to the maximum. This pH is generally between approximately 6 and 9 and preferably between approximately 7.0 and 8.5.
The resulting dispersion of L-phenylalanine is then gradually cooled to a temperature which causes substantial crystallization of L-phenylalanine. The solution is preferably cooled to a temperature of about -5 [deg.] C to about +25 [deg.] C. The L-phenylalanine crystals thus obtained can then be isolated, for example by filtration or centrifugation, washed with cold water and dried. A second crop of crystals can be obtained by further concentrating and cooling the mother liquor, if desired. The trans-cinnamic acid possibly remaining in the mother liquor can be collected by acidification and precipitation and is then advantageously recycled to the bioreactor.
According to a variant of the invention, it is sometimes advantageous to separate and collect the trans-cinnamic acid from the reaction mixture before collecting the L-phenylalanine.
Before the precipitation of L-phenylalanine, the desalted solution is advantageously acidified by means of a strong mineral acid, such as sulfuric or hydrochloric acid, up to the pH where the trans-cinnamic acid precipitates. This pH is generally from about 1.0 to about 3.0 and preferably from about 1.5 to 2.5. A substantially quantitative precipitation of the trans-cinnamic acid can be obtained by cooling the solution to a temperature of about -5 [deg.] C to about +25 [deg.] C and preferably about 0 at 5 [deg.] C. The precipitated cinnamic acid can be collected by filtration or centrifugation and used again, if desired.
The resulting solution is then concentrated, for example by evaporation under vacuum, until a relatively concentration of L-phenylalanine is reached. The desired concentration is a concentration such that during the subsequent crystallization, L-phenylalanine precipitates substantially in the solution. It is preferable to carry out the substantially quantitative precipitation of L-phenylalanine. For this purpose, the concentration of L-phenylalanine ranges from about 25 to about 150 and preferably about 50 to 150 g per liter.
The crystallization of L-phenylalanine in its solution is advantageously carried out by adjusting the pH of the solution approximately at the isoelectric point of phenylalanine by means of a base. It is preferable to use ammonia or ammonium hydroxide for this pH adjustment. The pH generally ranges from 3.5 to about 6.5. During this pH adjustment, it is preferred to heat the solution to a temperature which keeps L-phenylalanine in solution during the pH adjustment. For example, a temperature of about 40 to about 100 [deg.] C is suitable. Gradual cooling of this solution causes crystallization of L-phenylalanine with high purity. The substantially quantitative precipitation can be carried out by cooling down to a temperature of about -5 [deg.] C to about +25 [deg.] C.
The L-phenylalanine crystals can then be collected by filtration or centrifugation, then washed with cold water and dried.
The process of the invention has proved to be particularly suitable for industrial production. The process gives L-phenylalanine in crystals of high purity and with good yield.
The invention is further illustrated by the following nonlimiting examples.
EXAMPLE 1.-
The present example describes the isolation of Lphenylalanine from a bioreaction mixture according to the method of the invention. The bioreaction mixture is obtained by reaction of transcinnamic acid with ammonia in the presence of Rhodotorula Rubra cells containing PAL. The substrate solution for the enzyme is prepared by dissolving trans-cinnamic acid in an aqueous ammonia solution and adjusting the pH from 10.4 to 10.8 using carbon dioxide. The reaction solution has a final volume of 1,236 liters and contains in total
51.912 kg of L-phenylalanine (42.0 g per liter).
This reaction mixture is cooled to a temperature of 10 to 15 [deg.] C to minimize ammonia loss and inhibit the decomposition of L-phenylalanine. The mixture is centrifuged and filtered through a leaf filter press to separate the cells. At this time, the filtrate (1,190 liters) has a phenylalanine concentration of 38.2 g per liter. This filtrate is heated to 40 [deg.] C under vacuum (635 mm Hg) so as to concentrate it up to 485 liters. The ammonia and carbon dioxide are then removed from the solution and recovered by condensation of the vapors. The resulting concentrated solution has a pH of about 9.5 and an L-phenylalanine concentration of 83.1 g per liter.
A certain amount of particulate matter has formed in the solution during the concentration and removal of the salt and is removed by filtration through a leaf filter press before continuing operations. The clarified concentrate is again heated to 40 [deg.] C under vacuum (635 mm Hg) and evaporated to a volume of 240 liters. The pH is adjusted to 8.7 and this concentrate is cooled to 5 [deg.] C. The crystals of L-phenylalanine are collected by centrifugation which are washed with cold water. About 53% of the L-phenylalanine initially contained in the reactor is collected in the form of substantially pure crystals. Another 25% L-phenylalanine is contained in the mother liquor and wash liquors and a fraction can be recovered as a second crop of crystals, if desired.
EXAMPLE 2.-
The procedure of Example 1 is repeated in all its essential details. The initial reaction mixture has a volume of 1.245 liters and contains
39 g per liter of phenylalanine. We collect in total
38.0 kg of L-phenylalanine (78.3%) in the form of a first batch of crystals isolated from the concentrated desalted solution. The mother liquor for the crystallization of L-phenylalanine contains 9.0 kg (18.5%) of L-phenylalanine and is recycled to a subsequent fermentation as an inducer of PAL. In addition, the mother liquor contains 16.5 kg of trans-cinnamic acid which is also recycled for subsequent bioreaction.
EXAMPLE 3.-
The present example describes the isolation of Lphenylalanine from a bioreaction mixture according to an embodiment of the invention in which transcinnamic acid is separated before the precipitation of Lphenylalanine.
Centrifuge and filter to separate the cells, a mixture obtained by bioreaction of trans-cinnamic acid with ammonia in the presence of R.rubra cells containing PAL. Before centrifugation, the mixture has a pH of 10.52, a temperature
<EMI ID = 3.1>
contains 21.0 g of L-phenylalanine per liter and
15.3 g of trans-cinnamic acid.
The reaction mixture is centrifuged and filtered to separate cells, then transferred to containers with heating and stirring devices. We heat the solution
<EMI ID = 4.1>
The ammonia and the ammonium carbonate are recovered by condensation of the vapors. Air bubbling is maintained until the volume is approximately 350-
375 liters and that the concentration of L-phenylalanine is 70 to 80 g per liter. The concentrate is then transferred to another container where the pH is adjusted to 2.0-2.1 using 50% sulfuric acid. The acidified solution is cooled to 0-10 [deg.] C and allowed to stand for 4 hours. The resulting crystals of trans-cinnamic acid are separated from the solution by centrifugation. The mother liquor is transferred to another container, stored at 23-24 [deg.] C for 1 hour and 8 kg of a filter aid are added. The filter aid and the residual trans-cinnamic acid are separated by filtering the solution using a filter press.
The filtrate (plus washing liquors) has a volume of 270 liters and contains, per liter, 1.88 g of trans-cinnamic acid and 59.5 g of Lphenylalanine. This filtrate is transferred in equal parts to two containers where the pH is adjusted to 3.53.6 using 29% aqueous ammonia, after which the solution is heated to 60-70 [deg.] C. Vacuum (175 mm Hg) and evaporate the contents of the containers until the concentration of L-phenylalanine is 200 g per liter. The concentrated mixture is cooled to
<EMI ID = 5.1>
maintains it at this temperature for 4 hours. The resulting crystals of phenylalanine are separated by centrifugation, which is washed with cold deionized water and dried. The mother liquor and the washing liquors are combined with the corresponding solutions of a previous isolation operation and a second crop of crystals is isolated therefrom by concentration and cooling of the mixtures as described above. The yield for the first crop of crystals is around 70%.
CLAIMS
1.- Improved process for the production of L-phenylalanine by reaction of trans-cinnamic acid with ammonium ions in the presence of phenylalanine ammonia-lyase under the conditions for the production of L-phenylalanine, and isolation of L -phenylalanine out of the bioreaction mixture thus obtained, characterized in that ammonium carbonate is used as the source of ammonium ions.