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On sait qu'on peut introduire des groupes hydroxyles dans des sté- roïdes, notamment en position 17a, à l'aide d'enzymes de surrénales, en particulier avec des homogénéisais ou par passage à travers ces organes ou des tranches de ces organes. Pour aussi intéressante que soit cette fonction des enzymes animales du point de vue théorique, elle ne peut don- ner satisfaction pour l'obtention, spécialement industrielle, de 17a-hydro-
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xystéroides. Avec des méthodes microbiologiques qui peuvent aussi être utilisées en grand, la réaction indiquée n'a pas pu être exécutée jusqu'à présent.
La présente invention est relative à un procédé permettant d'intro- duire de l'oxygène dans des stéroïdes, caractérisé par le fait que, sur des composés de la série du prégnane présentant en position 17 un atome d'hy= drogène, on fait agir des enzymes produites par des cultures aérobies de
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champignons de..
19 ordre des Yo1'dliaIeB ou de l'ordre des Sphériales, puis on isole les stéroïdes hydroxylés en position 17, par exemple en position
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17axa Des substances de départ pour le nouveau procédé sont en général des composés de la série du prégnane ayant un atome d'hydrogène en position 17, parmi lesquels il y a lieu d'entendre les dérivés de n'importe quel genre de substitution et de n'importe quelle configuration, saturés et non-sa-
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turés, du 10,1,3-diméthyl-17-éthyl-cyclopentano.Qilaphn.rènex ainsi que de ses homologues supérieurs et inférieurs, par exemple les A-nor-, D-homo-, 19-nor-, 21-nor-, et 21-homo-composés correspondants. Des doubles liaisons se trouvent, par exemple, en position 1, 4, 5, 6, 7, 9, 14, 15 et/ ou 20.
La configuration des substances de départ est, de préférence, celle du prégnane, du 5a-prégnane, du 17a-prégnane ou de raémates correspondants tels qu'on les obtient par synthèse totale. Comme substituants, on envisa- ge en particulier des groupes hydroxyles, oxo ou carboxyliques libres ou fonctionnellement modifiés, tels des groupes ester, éther, thio-ester, thio- éther, thiol- et thion-ester, acétal, mercaptal, cétal, hydrazone, semi- carbazone et des groupes énoliques, par exemple en position 3, 7, 11, 12, 16, 18, 19, 20 et 21 Des substances de départ spéciales sont, entre autres,
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la cortexone, la 9,11- ou la 11,12-déhydro-cortexone, la 16a-hydroxy-carte- xone, la l8-oxo- et la 18-hydroy-cortexone, la corticostérone, la 11-épi- cortiotërone,
la 11-déhydro-corticostérone, la 18-hydroxy-cortioostérone, le ' -3,11,20-tricéto-21-hydroxy-prégnadiéne, le -3,20-dicéto- 11p,21-dihydroxy-prégnadiêne, la progestérone, la 17oc-progestérone, la 11- céto-progestérone, la 11a ainsi que la 11-hydroxy-progestérone, la 9,11 ou la 11,12-déhydro-progestérone, la 19-oxo-progestérone, la 19-norprogesté-
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rone, la prégnénolone, la 21-hydrox,y=prêgnénolane, J'aldostérone ou leurs dérivés fonctionnels.
Les enzymes utilisées sont de provenance microbiologique et sont
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produites par des cultures #érobiê.s de champignons de#l' ordre des Moniliales et de l'ordre des Sphériales, en particulier par des représentants actifs des familles des Moniliacées, des Dématicaées et des Stilbacées, par exem-
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ple le Monilia, l'Oospora, le Trichothecium ou 1.' $elicotriohum, ou des familles des Phaeophragmiae, par exemple les Leptosphérîa. Pour l'introduc- tion d'oxygène, on incube en général directement les substances de départ avec des cultures immergées des champignons indiqués, croissant dans des conditions aérobies connues.
Ces cultures sont avantageusement remuées, c'est-à-dire secouées ou agitées, et elles renferment du carbone assimila- ble, en particulier des hydrates de carbone, ainsi le cas échéant qae des substances de croissance, par exemple de l'eau de fonflement du mais ou du moût de bière, et des sels inorganiques. On peut ainsi utiliser des solutions nutritives naturelles, synthétiques ou semi-synthétiques. Un procédé prati- quement simple est décrit dans ce qui suit sans que l'invention se trouve pour autant limitée par les indications fournies : On cultive les organis-
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mes dans des appareils et dans des conditions analogues à ceux qui sont connus pour les cultures immergéesdans la fabrication des antibiotiques.
Lorsque les cultures sont bien développées,on ajoute les substances de départ indiquées, à l'état de fine dispersion ou de solution, par exemple dans le méthanol, l'acétone ou l'éthylèneglycol, et poursuit l'incubation.
Finalement, on sépare le mycélium, extrait le filtrat et/ou la masse de mycélium et isole lesproduits réactionnels de l'extrait, d'une manière en elle-même connue, par exemple par répartition entre solvants ou mélan- ges de solvants non miscibles 1 un avec l'autre, par adsorption, chroma- tographie, cristallisation, transformation en dérivés fonctionnels tels que les composés de Girard ou par d'autres procédés appropriés. Ces mêmes réactions peuvent toutefois aussi être exécutées en séparant d'abord les enzymés actives des cultures aérobies correspondantes de champignons de 1' ordre des Moniliales, puis en les utilisant à l'exclusion des cultures en croissanceo
Les produits du présent procédé peuvent être utilisés comme médicaments ou comme produits intermédiaires pour leur préparation.
D'un grand intérêt pratique sont, par exemple, la cortisone, l'hydrocortisone, la 1,2-déhydro-cortisoné, la 1,2-déhydro-hydrocortisone, la substance S de Reichstein, la 17a-hydroxy-aldostérone ainsi que les dérivés polyoxy- génés se formant par exemple à partir de la progestérone, de la prégné- nolone, et de la 11-céto-progBstérone.
L'invention concerne également,à titre de produits industriels nouveaux, les composés obtenus par la mise en oeuvre du procédé ci-dessus défini.
L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non limi- tatifs qui suiventDans ces exemples, il y a entre chaque partie en poids et chaque partie en volume le même rapport que celui existant entre le gram- me et le centimètre cube. Les températures sont indiquées en degrés centi- grades
Exemple 1.
On ensemence 2000 parties en volume d'une solution nutritive stérilisée de Czapek-Dox avec une culture de Trichothécium roseum et agite pendant 5 jours à 27 A la culture bien développée, on ajoute alors, dans des conditions stériles, une solution de 0,5 parties' en poids de cortexone dans 15 parties en volume d'acétone et continue d'agiter à 27 oAu bout de 4 jours, on essore, lave le résidu à l'eau à plusieurs reprises et ex- trait le filtrat de,culture à trois reprises avec chaque fois 1200 parties en volume d'acétate d'éthyle. On lave les solutions d'acétate d'éthyle avec de l'acide chlorhydrique normal, à l'eau, avec une solution normale de bicarbonate de sodium et à nouveau à l'eau, les sèche et les évapore sous vide à 40-45 On chromatographie le résidu, 0,62 partie en poids,
sur 10 parties en poids de gel de silice, en éluant d'abord avec du chlo- roforme seul, puis avec des mélanges de chloroforme et d'acétone d'une teneur croissante en acétone. A l'aide de chloroforme et d'un mélange de chloroforme et d'acétone 95.5 on élue des¯impuretés renfermant un peu de cortexone. Les premières fractions chloroformiques à 10% d'acétone fournissent par évaporation un résidu qui donne avec de l'acide sulfurique concentré la coloration rouge carmin caractéristique pour la substance S 17a-hydroxy-cortexone En recristallisant ce résidu dans des mélanges d'acétone et d'éther, on obtient la substance S pure, fondant à 202 - 213 , d'un pouvoir rotatoire spécifique @ + 132 (dans l'éthanol).
Pour l'acétylation on laisse reposer 15 heures à 20 , 0,02 partie en poids de la substance pure avec 0,2 partie en volume de pyridine et 0,4 partie en vo-
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lume d'anhydride acétiqueo On ajoute de l'eau au mélange, évapore sous vi- de et recristallise le résidu dans de l'acétone, on obtient l'acétate de la substance S, fondant à 239 - 241 o
Les autres éluats chloroformiques à 10% d'acétone fournissent, par évaporation, un composé un peu plus fortement polaire qui, avec de l'a- cide sulfurique concentré, donne d'abord une coloration rougeâtre, puis jau- ne-brun avèc fluorescence verteo Cette substance cristallise dans l'acé- tone en prismes clairs qui, par chauffage, s'agglutinent à partir de 130 et fondent à 202 - 212 en mélange avec la substance S,
ce produit provoque un fort abaissement du point de fusiono Ces cristaux séchés à 135 , sous un vide poussé, fournissent à l'analyse des valeurs qui concordent bien avec la formule brute C21H30O4 Etant donné que cette substance est absorbante en ultra-violet e qu'elle réduit une solution alcoolique d'argent-diammi- ne, il s'agit ici d'une nouvelle hydroxy-cortexone qui est différente de la substance So
A la place de la solution nutritive de Czapek-Dox utilisée dans l'exemple ci-dessus, on peut également utiliser du moût de bière dilué à l'eau ou non dilué, ou d'autres milieux nutritifs qui, pour 2000 parties en volume d'eau, renferment chaque fois les adjuvants suivants :
Solution A : 20 parties en poids de glucoce, 8 parties en poids de phos- phage secondaire d'ammonium, 10 parties en poids de chlorure de sodium, 4 parties en poids de phosphate secondaire de potassium, 2 parties en poids de sulfate de magnésium cristallisé, 0,8 partie en poids de chlorure de calciium 0,04 partie en poids de sulfate de fer (il) cristallisé, 0,02 partie en poids de sulfate de manganèse (II) cristallisé.
Solution B : 40 parties en volume d'eau de gonflement du mais (Cornsteep liquor), 20 parties en poids de glucoce brut, 4 parties en poids de phos- phate secondaire de potassium.
'Solution C 20 parties en poids de peptone, 200 parties en poids de glu- cose, 4 parties en poids de phosphate primaire d'ammonium, 4 parties en poids de nitrate de potassium, 1 partie en poids de sulfate de magnésium cristallisé, 0,2 partie en poids de chlorure de calcium.
Solution D : 20 parties en poids de peptone, 7 parties en poids d'extrait de viande, 80 parties en poids de glucose, 15 parties en poids de chlorure de sodium.
Exemple 2
On ensemence avec du Trichothecium roseum 50 parties en volume d'une solution nutritive stérilisée de Czapek-Dox et l'incube 5 jours à 27 en secouanto A la culture bien développée,on ajoute dans des conditions stériles une solution de 0,01 partie en poids de 11-déhydro-corticostérone 11-céto-cortexone dans 0,5 partie en volume d'acétone et continue d'agi- ter à 27 Au bout de trois jours, on essore et extrait comme décrit dans l'exemple 1 Le résidu d'extraction renferme, d'après un examen chromato graphique sur papier, à côté de peu de matière de départ, essentiellement de la cortisone (11-céto-17a-hydroxycortexone) que l'on peut isoler et pu- rifier selon des méthodes en elles-mêmes connues.
On obtient une transfor- mation analogue après avoir incubé la 11-déthdro-corticostérone pendant 6 jours.
Exemple 3
A une culture de Trichothécium roseum préparée comme dans l'exem- ple 2, on ajoute une solution de 0,01 partie en poids de corticostérone dans 0,5 partie., en volume d'acétone et incube trois jours à 27 , puis traite d'
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une manière analogue aux indications données dans l'exemple 2 L'examen de l'extrait effectué par chromatographie sur papier montre que la substan-
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ce de départ est transformée en majeure partie en substance M (17a-hydroxy- corticostérone)0 Si, à la place de corticostérone, on incube'd'une manière analogue aux indications ci-dessus, de la progestérone, de la 11-céto-progestérone ou de la prégnénolone, en isolant le produit réactionnel,
on obtient éga- lement en majeure partie des composés hautement polaireso
Exemple 4 A une culture de Trichothecium roseum préparée comme dans l'exemple 2, on ajoute une solution de 0,01 partie en poids de,6,' -3,11,20-
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tricéto-21hydroxy-prégnadiéne dans 0,5 partie en volume d'acétone et in- cube trois jours à 27 Pour isoler le produit réactionnel, on opère d'une manière analogue à celle décrite à l'exemple 2 L'examen de l'extrait par chromatographie sur papier montre que la substance de départ a été trans-
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formée en majeure partie en4À ' -3,11,20-tricêto-17a-21-dihyâroxy-prégna- diène (1-àéhyàro-cortisone)o Si à la place de ' 3,11,20-tricéto-21-hydroxy prgradiène, on incube d'une manière analogue aux indications ci-dessus 1 -3,20-dicé- to-llp,21-dîhydro-préfrZdiène, en isolant le produit réactionnel,
on obtient essentiellement du la ' -3,20-dicéto-11a,17c21-trihydroxy-prégnadiène (1-déhydro-hydrocortisone)4 Si dans l'exemple ci-dessus, on utilise à la place de la culture de Trichothecium roseumi une culture de Leptosphaed. a1mculans, l'extrait du filtrat de culture renferme alors également 1e 11 ' '174,11,2o-tricéto-17cx 21-dih;Tdrox prêgnadiène (1-déhydro-coxtisone) ou le -320,d3.céto-11i17ar 2-trihydroxy-prégnadiène (1-déhydro-hydro:eortisone)a Les produits initiaux peuvent être obtenus de la manière suivante: 1' °-3,11, 20-trïcéto-21-b=ydroxy-prégnadiène :
On ensemence 2000 parties en volume de moût de bière stérilisé avec une, culture de Calonectria decora,, ¯puis secoue à 27 Au bout de trois jours on ajoute, dans des conditions stériles,à la culture bien développée, 0,5 partie
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en. poids de 11=f'éhydro=corticostérone (composé .) dans 15 parties en volume d'acétone; on secoue ensuite le mélange encore pendant 3 jours à la même températureoOn filtre le mycélium, puis on extrait le filtrat comme on l'a indiqué à l'exemple 1 Le résidu de l'extraction est chromatographié sur une colonne de 15 parties en poids de gel de silice, en éluant tout d'abord avec du chloroforme puis avec des mélanges de chloroforme et d'acétone d'une teneur croissante en acétone. Chaque fraction (50 parties en volume) est examinée par chromatographie sur papier.
Au moyen de chloroforme et d'un mélange de chloroforme et d'acétone (95: 5) on élue quelques impuretés et un peu de produit initial.Les fractions obtenues avec le mélange de chloro- forme et d'acétone (90:10) contiennent cependant surtout une substance
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que se déplace un peu plus lentement qy94 le produitrihitial sur le chromato- gramme sur papier Ce produit est le/ ' -3,11,20-tricé%o-21-hyàroxy-pré- gnadièneo On le recristallise dans un mélange d'acétone et d'éther; il fond alors à 200 - 215 suivant la rapidité du chauffage- Dans l'ultra-violet, ce composé donne une bande d'absorption avec un maximum à 244 mu et son
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spectre d'absorption dans 1 infra-rouge.présente des bandes à 5,99Z., 6,1°., et 6,23p, caractéristiques pour une '°-3-cétoneo 1'4 3,20-dicéto-11,21-dZhyd.roxy-prégnadiëne :
A 2000 parties en volume d'une culture de Calonectria décora, obtenue comme il a été indiqué ci-dessus, on ajoute, dans des conditions stériles, 0,5
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partie en poids de corticostérone dans 15 parties en volume d'acétone. On effectue ensuite le développement de la culture, l'extraction et la chro- matographie sur gel de silice comme on l'a indiqué ci-dessus. Les fractions éluées avec du chloroforme et un mélange de chloroforme et d'acétone (90:10) contiennent des impuretés et un peu de produit initial le produit principal qui est contenu dans les fractions obtenues avec des mélanges de chlorofor- me et d'acétone (90:10) et (80:20) se déplace plus lentement que le produit initial sur le chromatogramme sur papier.
Ce produit est le -3,20-dicé- to-11ss,21-dihydroxy-prégnadiène qui, recristallisé dans de l'acétone, fond à 216 - 220 (avec décomposition); son pouvoir rotatoire spécifique est de + 158 (éthanol); son spectre d'absorptions dans l'ultraviolet présen- te un maximum à 244 m 8 15300) et son spectre d'absorption dans 1'.infra- rouge, des bandes à 2,76p, 2,86p,5,84p 5,99p ,6,14p, 6,22p, 7,44 8,73p,
9,22 9,38 et 9,63
Exemple 5
On ensemence 50 parties en volume de moût de bière à 70%, stéri- lisé, avec une culture de Leptophaeria maculans et secoue pendant 4 jours à 27 A la culture bien développée, on ajoute une solution de 0,01 par- tie en poids de cortexone dans 0,5 partie en volume d'acétone,
dans des conditions stériles, puis secoue le mélange à 27 . Au bout de trois jours, on filtre le mycélium puis extrait le filtrat comme on l'a indiqué à l'exem- ple 1 Le résidu d'extraction contient, comme l'essai de chromatographie sur papier le montre,à c,ôté d'un peu de produit initial, surtout de la 17a-hydroxy-cortexone (substance. S de Reichstein), que l'on isole et cris- tallise comme on l'a indiqué à l'exemple 1.
Exemple 60
On ensemence 50 parties en volume de moût de bière à 70% stéri- lisé, avec du Cucurbitaria laburni et secoue 5 jours à 27 o A la culture bien développée, on ajoute une solution de 0,01 partie en pbids de cortexo- ne dans 0,5 partie en volume d'acétone, dans des conditions stériles, puis on secoue encore à 27 o Au bout de trois jours, on filtre le mycélium, puis on extrait le filtrat comme on l'a indiqué à l'exemple 1. Le résidu de l'extraction contient;) comme l'essai de chromatographie sur papier le montre, à côté d'un peu de produit initiale surtout de la 17a-hydroxy-cortexone ( substance S de Reichstein), que l'on isole et cristallise comme on l'a in- diqué à l'exemple 1,
1 Exemple 7.
On ensemence 50 parties en volume de moût de bière à 70%, stérili- sé, avec de la Acrospeira levis et secoue 3 jours à 27 A la culture bien développée, on ajoute une solution de 0,01 partie de cortexone dans 0,5 partie en volume d'acétone, dans des conditions stériles, puis on secoue le mélange à 27 o Au bout de trois jours le mycélium est filtré et le fil- trat est extrait comme on l'a indiqué à l'exemple 1.
Le résidu de l'extrac- tion contient, ce que montre l'essai.de chromatographie sur papier, à côté d'un peu de produit initial, surtout de la 17a-hydroxy-cortexone (substance S de Reichstein), qu'on isole et cristallise comme on l'a indiqué à l'exem- ple 1
Exemple.
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On ensemence 50 parties en volume de moût de bière à 70% stéri- lisé, avec du Lophotrichus hartinii et secoue trois jours à 27 A la cul- ture bien doveloppéem on ajoute une solution de 0,01 partie en poids de cortexone, dans 0,5 partie en volume d'acétone, dans des conditions stériles,
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puis on continue de remuer le mélange à 27 Au bout de deux jours, on fil- tre le mycélium, puis on extrait le filtrat comme on !la indiqué à l'exem ple 1 Comme la chromatographie sur papier le montre, le résidu de l'ex- traction contient, à côté d'un peu de produit initial, surtout de la 17a-hy- droxy=cortexone (substance S de Reichstein),
que l'on isole et cristallise comme on l'a indiqué à l'exemple 1
Exemple 9
On ensemence 50 parties en volume de moùt de bière à 70% stérili- sé, avec du Melanospora parasitica et secoue trois jours à 27 A la cultu- re bien développée, on ajoute une solution de 0,01 partie en poids de cor- texone, dans 0,5 partie en volume d'acétone, dans des conditions stériles, et secoue le mélange à 27 oAu bout de deux jours, on filtre le mycélium, puis on extrait le filtrat comme on l'a indiqué à l'exemple 1 Le résidu de l'extraction contient, comme le montre la chrbmatographie sur papier, à côté d'un peu de produit initial, surtout de la 17a-hydroxy-cortexone (substance S de Reichstein) qu'on isole et cristallise comme on l'a indi- qué à l'exemple 1
Exemple 10.
On ensemence 50 parties en volume de moût de bière à 70% stéri- lisé, avec du Thielavia terricola, puis on secoue trois jours à 27 o A la culture bien développée, on ajoute une solution de 0,01 partie en poids de cortexone dans 0,5 partie en volume d'acétone, dans des conditions stériles, puis on continue de secouer le mélange à 27 Au bout de trois jours, on filtre le mycélium, puis on extrait le filtrat comme on l'a indi- qué à l'exemple 1 Comme le montre la chromatographie sur papier, le résidu de l'extraction contient, à côté d'un peu de produit initial, surtout de la 17a-hydroxy-cortexone (substance S de Reichstein), que l'on isole et cris- tallise comme cn l'a indiqué à l'exemple 1 REVENDICATIONS.
1 Un procédé permettant d'introduire de l'oxygène dans des stéroïdes, caractérisé par le fait que, sur des composés de la série du prégnane qui renferment en position 17 un atome d'hydrogène, on fait agir des enzymes pro- duites par des cultures aérobies de champignons de l'ordre des Moniliales et on isole les stéroïdes des hydroxylés en position 17
Le présent procédé peut encore être caractérisé par les points suivants :
1) On isole les stéroïdes formés, hydroxylés en position 17
2 Sur des composés de la série du prégnane qui présentent en position 17 un atome d'hydrogène, on fait agir des cultures immergées, croissant dans des conditions aérobies, de champignonsde l'ordre des Mo- niliales.
3 Sur des composés de la série du prégnane qui présente en po- sition 17 un atome d'hydrogène, on fait agir des enzymes séparées de cultu- res aérobies de champignons de l'ordre des Mouillâtes.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.
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It is known that hydroxyl groups can be introduced into steroids, in particular in position 17a, using adrenal enzymes, in particular with homogenis or by passage through these organs or slices of these organs. As interesting as this function of animal enzymes is from a theoretical point of view, it cannot be satisfactory for obtaining, especially industrial, 17a-hydro-
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xysteroids. With microbiological methods which can also be used on a large scale, the indicated reaction could not be carried out so far.
The present invention relates to a process making it possible to introduce oxygen into steroids, characterized in that, on compounds of the pregnane series having in position 17 a hydrogen atom, is made act enzymes produced by aerobic cultures of
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mushrooms.
19 order of Yo1'dliaIeB or of the order of Sphériales, then the hydroxylated steroids are isolated in position 17, for example in position
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17axa Starting substances for the new process are generally compounds of the Pregnane series having a hydrogen atom in position 17, among which it is appropriate to understand the derivatives of any kind of substitution and any configuration, saturated and unsaturated
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turés, 10,1,3-dimethyl-17-ethyl-cyclopentano.Qilaphn.rènex as well as its higher and lower homologs, for example A-nor-, D-homo-, 19-nor-, 21-nor -, and corresponding 21-homo-compounds. Double bonds are found, for example, in position 1, 4, 5, 6, 7, 9, 14, 15 and / or 20.
The configuration of the starting materials is preferably that of pregnan, 5α-pregnan, 17α-pregnan or corresponding raemates as obtained by total synthesis. Suitable substituents are in particular free or functionally modified hydroxyl, oxo or carboxylic groups such as ester, ether, thio-ester, thio-ether, thiol- and thion-ester, acetal, mercaptal, ketal, hydrazone groups. , semi-carbazone and enolic groups, for example in position 3, 7, 11, 12, 16, 18, 19, 20 and 21 Special starting substances are, among others,
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cortexone, 9,11- or 11,12-dehydro-cortexone, 16a-hydroxy-card-xone, 18-oxo- and 18-hydroy-cortexone, corticosterone, 11-epicortioterone,
11-dehydro-corticosterone, 18-hydroxy-cortioosterone, '-3,11,20-triketo-21-hydroxy-pregnadiene, -3,20-diketo-11p, 21-dihydroxy-pregnadiene, progesterone, 17oc-progesterone, 11-keto-progesterone, 11a as well as 11-hydroxy-progesterone, 9,11 or 11,12-dehydro-progesterone, 19-oxo-progesterone, 19-norprogesterone
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rone, pregnenolone, 21-hydroxy, y = pregenolane, aldosterone or their functional derivatives.
The enzymes used are of microbiological origin and are
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produced by cultures of fungi of the order of Moniliales and of the order of Spherials, in particular by active representatives of the families of Moniliaceae, Dematicaeae and Stilbaceae, for example
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ple Monilia, Oospora, Trichothecium or 1. ' $ elicotriohum, or families of the Phaeophragmiae, for example the Leptosphérîa. For the introduction of oxygen, the starting materials are usually incubated directly with submerged cultures of the indicated fungi growing under known aerobic conditions.
These cultures are advantageously stirred, that is to say shaken or agitated, and they contain assimilable carbon, in particular carbohydrates, as well as, where appropriate, growth substances, for example water of melting corn or beer wort, and inorganic salts. It is thus possible to use natural, synthetic or semi-synthetic nutrient solutions. A practically simple process is described in the following without the invention being limited by the indications given: The organisms are cultivated.
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mes in apparatus and under conditions similar to those known for submerged cultures in the manufacture of antibiotics.
When the cultures are well developed, the starting substances indicated are added in the form of a fine dispersion or solution, for example in methanol, acetone or ethylene glycol, and the incubation continues.
Finally, the mycelium is separated, the filtrate and / or the mass of mycelium are extracted and the reaction products are isolated from the extract, in a manner known per se, for example by partitioning between solvents or mixtures of immiscible solvents. 1 with each other, by adsorption, chromatography, crystallization, transformation into functional derivatives such as Girard's compounds or by other suitable methods. These same reactions can, however, also be carried out by first separating the active enzymes from the corresponding aerobic cultures of fungi of the order Moniliales, and then using them to the exclusion of the growing cultures.
The products of the present process can be used as medicaments or as intermediates for their preparation.
Of great practical interest are, for example, cortisone, hydrocortisone, 1,2-dehydro-cortisone, 1,2-dehydro-hydrocortisone, Reichstein's substance S, 17a-hydroxy-aldosterone as well as polyoxygenic derivatives forming, for example, from progesterone, pregnolone, and 11-keto-progBsterone.
The invention also relates, as new industrial products, to the compounds obtained by carrying out the process defined above.
The invention is described in more detail in the non-limiting examples which follow. In these examples, there is between each part by weight and each part by volume the same ratio as that existing between the gram and the cubic centimeter. Temperatures are given in degrees centi- grads
Example 1.
2000 parts by volume of sterilized Czapek-Dox nutrient solution are inoculated with a culture of Trichothecium roseum and stirred for 5 days at 27. To the well-developed culture, a solution of 0.5 is then added under sterile conditions. parts' by weight of cortexone in 15 parts by volume of acetone and continued to stir at 27 ° C. After 4 days, the mixture is filtered off, the residue washed with water several times and the filtrate is extracted from the culture. three times with 1200 parts by volume of ethyl acetate each time. The ethyl acetate solutions were washed with normal hydrochloric acid, with water, with normal sodium bicarbonate solution and again with water, dried and evaporated in vacuo at 40-45. The residue is chromatographed, 0.62 part by weight,
on 10 parts by weight of silica gel, eluting first with chloroform alone, then with mixtures of chloroform and acetone of increasing acetone content. Using chloroform and a mixture of chloroform and acetone 95.5, impurities containing a little cortexone are eluted. The first 10% acetone chloroform fractions evaporate a residue which gives with concentrated sulfuric acid the characteristic carmine red color for the substance S 17a-hydroxy-cortexone By recrystallizing this residue from mixtures of acetone and d 'ether, pure substance S is obtained, melting at 202-213, with a specific optical rotation @ + 132 (in ethanol).
For acetylation, 0.02 part by weight of the pure substance is left to stand for 15 hours at 20 hours with 0.2 part by volume of pyridine and 0.4 part by volume.
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lume of acetic anhydride o Water is added to the mixture, evaporated under vacuum and the residue recrystallized from acetone, to give the acetate of substance S, melting at 239 - 241 o
The other chloroform eluates at 10% acetone give, on evaporation, a slightly more polar compound which, with concentrated sulfuric acid, gives first a reddish color, then yellow-brown with fluorescence. verteo This substance crystallizes in acetone in clear prisms which, on heating, agglutinate from 130 and melt at 202 - 212 when mixed with substance S,
this product causes a strong lowering of the melting point. These crystals, dried at 135, under a high vacuum, provide for the analysis values which agree well with the crude formula C21H30O4 Since this substance is absorbent in ultra-violet and it reduces an alcoholic solution of silver-diammin, this is a new hydroxy-cortexone which is different from the substance So
Instead of the Czapek-Dox nutrient solution used in the example above, it is also possible to use beer wort diluted with water or undiluted, or other nutrient media which, for 2000 parts by volume of water, each time contain the following adjuvants:
Solution A: 20 parts by weight of glucoce, 8 parts by weight of secondary ammonium phosphate, 10 parts by weight of sodium chloride, 4 parts by weight of secondary potassium phosphate, 2 parts by weight of magnesium sulfate crystallized, 0.8 part by weight of calciium chloride, 0.04 part by weight of crystallized iron (II) sulfate, 0.02 part by weight of crystallized manganese (II) sulfate.
Solution B: 40 parts by volume of corn swelling water (Cornsteep liquor), 20 parts by weight of crude glucoce, 4 parts by weight of secondary potassium phosphate.
'Solution C 20 parts by weight of peptone, 200 parts by weight of glucose, 4 parts by weight of primary ammonium phosphate, 4 parts by weight of potassium nitrate, 1 part by weight of crystallized magnesium sulfate, 0 , 2 part by weight of calcium chloride.
Solution D: 20 parts by weight of peptone, 7 parts by weight of meat extract, 80 parts by weight of glucose, 15 parts by weight of sodium chloride.
Example 2
50 parts by volume of a sterilized Czapek-Dox nutrient solution are inoculated with Trichothecium roseum and incubated for 5 days at 27 by shaking. To the well-developed culture, a 0.01 part solution is added under sterile conditions. weight of 11-dehydro-corticosterone 11-keto-cortexone in 0.5 part by volume of acetone and continues to stir at 27. After three days, the mixture is filtered off and extracted as described in Example 1. The residue of extraction contains, according to a chromatographic examination on paper, next to little starting material, essentially cortisone (11-keto-17a-hydroxycortexone) which can be isolated and purified according to methods in themselves known.
A similar transformation is obtained after incubating 11-dehdro-corticosterone for 6 days.
Example 3
To a culture of Trichothecium roseum prepared as in Example 2, a solution of 0.01 part by weight of corticosterone in 0.5 part by volume of acetone is added and incubated for three days at 27, then treated. of
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a manner analogous to the indications given in Example 2 Examination of the extract carried out by chromatography on paper shows that the substance
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this starting point is transformed for the most part into substance M (17a-hydroxy-corticosterone) 0 If, instead of corticosterone, progesterone, 11-keto are incubated in a manner analogous to the above indications -progesterone or pregnenolone, isolating the reaction product,
the majority of highly polar compounds are also obtained.
Example 4 To a culture of Trichothecium roseum prepared as in Example 2, a solution of 0.01 part by weight of, 6, '-3,11,20- is added.
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triketo-21hydroxy-pregnadiene in 0.5 part by volume of acetone and cube three days to 27 To isolate the reaction product, the procedure is analogous to that described in Example 2 Examination of the extracted by chromatography on paper shows that the starting material was trans-
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formed predominantly of 4A '-3,11,20-tricéto-17a-21-dihyâroxy-pregnadiene (1-α-hyarocortisone) o Si instead of' 3,11,20-triketo-21-hydroxy prgradiene , is incubated in a manner analogous to the above indications 1 -3,20-diceto-llp, 21-dîhydro-préfrZdiene, isolating the reaction product,
one obtains essentially '-3,20-diketo-11a, 17c21-trihydroxy-pregnadiene (1-dehydro-hydrocortisone) 4 If in the example above, one uses instead of the culture of Trichothecium roseumi a culture by Leptosphaed. a1mculans, the extract of the culture filtrate then also contains 11 '' 174,11,2o-triketo-17cx 21-dih; Tdrox prêgnadiene (1-dehydro-coxtisone) or -320, d3.ceto-11i17ar 2- trihydroxy-pregnadiene (1-dehydro-hydro: eortisone) a The initial products can be obtained as follows: 1 '° -3,11, 20-triceto-21-b = ydroxy-pregnadiene:
2000 parts by volume of sterilized beer wort are inoculated with a culture of Calonectria decora ,, ¯ then shaken at 27.After three days, 0.5 part is added under sterile conditions to the well-developed culture.
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in. weight of 11 = hydro = corticosterone (comp.) in 15 parts by volume of acetone; the mixture is then shaken for a further 3 days at the same temperature o The mycelium is filtered, then the filtrate is extracted as indicated in Example 1 The residue of the extraction is chromatographed on a column of 15 parts by weight of silica gel, eluting first with chloroform and then with mixtures of chloroform and acetone of increasing acetone content. Each fraction (50 parts by volume) is examined by chromatography on paper.
Using chloroform and a mixture of chloroform and acetone (95: 5), some impurities and a little initial product are eluted. The fractions obtained with the mixture of chloroform and acetone (90:10) however mainly contain a substance
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that the initial product moves a little more slowly on the paper chromatogram This product is / '-3,11,20-tricé% o-21-hydroxy-pregnadiene. It is recrystallized from a mixture of acetone and ether; it then melts at 200 - 215 depending on the speed of heating - In ultra-violet, this compound gives an absorption band with a maximum at 244 mu and its
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absorption spectrum in 1 infrared. shows bands at 5.99Z., 6.1 °., and 6.23p, characteristic for a '° -3-ketoneo 1'4 3.20-diketo-11, 21-dZhyd.roxy-pregnadien:
To 2000 parts by volume of a culture of Calonectria decora, obtained as indicated above, is added, under sterile conditions, 0.5
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part by weight of corticosterone in 15 parts by volume of acetone. Culture development, extraction, and silica gel chromatography are then carried out as indicated above. The fractions eluted with chloroform and a mixture of chloroform and acetone (90:10) contain impurities and some initial product, the main product which is contained in the fractions obtained with mixtures of chloroform and acetone. (90:10) and (80:20) moves slower than the initial product on the paper chromatogram.
This product is -3,20-diceto-11ss, 21-dihydroxy-pregnadiene which, recrystallized from acetone, melts at 216-220 (with decomposition); its specific optical rotation is + 158 (ethanol); its absorption spectrum in the ultraviolet has a maximum at 244 m 8 15300) and its absorption spectrum in the infrared, bands at 2.76p, 2.86p, 5.84p 5, 99p, 6.14p, 6.22p, 7.44 8.73p,
9.22 9.38 and 9.63
Example 5
50 parts by volume of 70% sterilized beer wort are inoculated with a culture of Leptophaeria maculans and shaken for 4 days at 27. To the well-developed culture a solution of 0.01 part by weight is added. cortexone in 0.5 part by volume of acetone,
under sterile conditions, then shake the mixture at 27. After three days, the mycelium is filtered and then the filtrate is extracted as indicated in Example 1 The extraction residue contains, as the paper chromatography test shows, at c, removed from a little initial product, especially 17α-hydroxy-cortexone (Reichstein's substance S), which is isolated and crystallized as indicated in Example 1.
Example 60
50 parts by volume of 70% sterilized beer wort are inoculated with Cucurbitaria laburni and shaken for 5 days at 27 ° C. To the well-developed culture a solution of 0.01 part by weight of cortexone is added. 0.5 part by volume of acetone, under sterile conditions, then shaken again at 27 ° C. After three days, the mycelium is filtered, then the filtrate is extracted as indicated in Example 1. The residue of the extraction contains;) as the paper chromatography test shows, next to a little initial product especially 17a-hydroxy-cortexone (Reichstein's substance S), which is isolated and crystallizes as indicated in Example 1,
1 Example 7.
50 parts by volume of 70% beer wort, sterilized, are inoculated with Acrospeira levis and shaken 3 days to 27. To the well-developed culture, a solution of 0.01 part of cortexone in 0.5 is added. part by volume of acetone, under sterile conditions, then the mixture is shaken at 27 ° C. After three days the mycelium is filtered and the filtrate is extracted as indicated in Example 1.
The residue of the extraction contains, as shown by the paper chromatography test, alongside some initial product, especially 17α-hydroxy-cortexone (Reichstein's substance S), which isolates and crystallizes as indicated in example 1
Example.
80
50 parts by volume of 70% sterilized beer wort are inoculated with Lophotrichus hartinii and shaken for three days at 27. To the well-developed culture a solution of 0.01 part by weight of cortexone is added in 0 , 5 part by volume of acetone, under sterile conditions,
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then the mixture is continued to stir at 27. After two days, the mycelium is filtered, then the filtrate is extracted as indicated in Example 1 As the paper chromatography shows, the residue of 1 'the extraction contains, next to a little initial product, above all 17a-hy- droxy = cortexone (Reichstein's substance S),
which is isolated and crystallized as indicated in Example 1
Example 9
50 parts by volume of 70% sterilized beer wort are inoculated with Melanospora parasitica and shaken for three days at 27. To the well-developed culture, a solution of 0.01 part by weight of cortexone is added. , in 0.5 part by volume of acetone, under sterile conditions, and shake the mixture at 27 o After two days, the mycelium is filtered, then the filtrate is extracted as indicated in Example 1 The residue of the extraction contains, as shown by the chrbmatography on paper, next to a little initial product, especially 17a-hydroxy-cortexone (Reichstein's substance S) which is isolated and crystallized as it is. indicated in example 1
Example 10.
50 parts by volume of 70% sterilized beer wort are inoculated with Thielavia terricola, then shaken for three days at 27 ° C. To the well-developed culture, a solution of 0.01 part by weight of cortexone is added in 0.5 part by volume of acetone, under sterile conditions, then the mixture is continued to be shaken at 27. After three days, the mycelium is filtered, then the filtrate is extracted as indicated in 1. Example 1 As shown by chromatography on paper, the residue of the extraction contains, besides a little initial product, especially 17α-hydroxy-cortexone (substance S of Reichstein), which is isolated and crystallizes as indicated in Example 1 CLAIMS.
1 A process for introducing oxygen into steroids, characterized in that, on compounds of the pregnane series which contain a hydrogen atom in position 17, enzymes produced by aerobic cultures of fungi of the order Moniliales and the steroids are isolated from the hydroxylated in position 17
The present process can be further characterized by the following points:
1) The steroids formed, hydroxylated in position 17 are isolated
2 On compounds of the Pregnane series which have a hydrogen atom in position 17, submerged cultures, growing under aerobic conditions, of fungi of the order of the Moniliales are allowed to act.
3 On compounds of the pregnane series, which has a hydrogen atom in position 17, enzymes separated from aerobic cultures of fungi of the order Mouillates are made to act.
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