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Formulations libération prolongée de peptides solubles dans l'eau
La présente invention a pour objet des formulations à libération prolongée de médicaments.
En particulier, l'invention concerne des formulations à libération prolongée de peptides hydrosolubles, par exemple la somatostatine ou un analogue de la somatostatine, tel que l'octréotide, dans un véhicule polymère biodégradable et biocompatible, par exemple une matrice ou une enveloppe, par exemple sous forme d'un implant ou de préférence sous forme de microparticules (également connues comme microcapsules ou microsphères).
L'invention concerne également de telles formulations présentant des profils satisfaisants de libération des peptides pendant une période de temps particulière.
Les médicaments peptidiques présentent, après leur administration, que ce soit par voie orale ou par voie parentérale, une faible biodisponibilité dans le sang due, par exemple à leur biodégradabilité élevée dans l'organisme. Lorsqu'on les administre par voie orale ou par voie nasale, ils présentent souvent en plus une faible résorption à travers les membranes de la muqueuse. Il est alors difficile d'obtenir des taux sanguins thérapeutiquement actifs pendant une longue période de temps.
On a proposé d'administrer les médicaments peptidiques par voie parentérale, à savoir sous forme d'une formulation dépôt dans un polymère biodégradable, par exemple sous forme de microparticules ou d'un implant, afin de permettre leur libération prolongée après un temps de présence dans le polymère, ce dernier protégeant le peptide contre les influences enzymatiques et hydrolytiques des fluides biologiques.
Bien que certaines formulations dépôt, destinées à une administration par voie parentérale, de médicaments peptidiques dans un polymère sous forme de
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microparticules ou d'implant soient connues, on n'obtient en pratique une libération satisfaisante des peptides que dans très peu de cas. Des mesures spéciales garantissant une libération constante des peptides doivent donc être prises pour obtenir des taux sériques en médicament qui soient thérapeutiquement actifs et, si nécessaire, pour éviter des concentrations trop élevées de médicament dans le sérum qui provoquent des effets secondaires indésirables.
La libération des peptides est fonction de divers facteurs, notamment du type de peptide, et de sa présentation, par exemple sous forme libre ou sous une autre forme, par exemple sous forme de sel, ce qui peut avoir un effet sur sa solubilité dans l'eau. Un autre facteur important est le choix du polymère parmi la liste étendue des possibilités décrites dans la littérature.
Chaque polymère a sa propre vitesse de biodégradation. Il peut se former des groupes carboxy qui ont une influence sur la valeur du pH dans le polymère et ont également un effet sur la solubilité dans l'eau du peptide et donc sur sa libération.
D'autres facteurs qui peuvent avoir une influence sur la libération des peptides, sont la concentration du peptide dans le véhicule, sa répartition dans le polymère et la forme dans le cas d'un implant et sa dimension.
Jusqu'à présent, aucune composition à base de somatostatine sous une forme à libération prolongée destinée à une administration par voie parentérale, n'a été mise sur le marché, peut être en raison du fait qu'aucune composition présentant des taux sanguins satisfaisants n'a pu être obtenue.
Des compositions pharmaceutiques qui sont à base de polymères, et qui permettent d'obtenir une libération prolongée ou retardée du principe actif,
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sont connues dans la technique.
Le brevet américain nO 3 773 919 décrit des formulations à libération contrôlée de principe actif dans lesquelles le principe actif, par exemple un peptide hydrosoluble, est dispersé dans un polymère linéaire de l'acide lactique ou dans un co-polymère linéaire de l'acide lactique et de l'acide glycolique, biodégradable et biocompatible. Le document, cependant, ne donne aucune donnée sur la libération du médicament et la somatostatine n'y est pas mentionnée. Le brevet américain 4 293 539 décrit des formulations antibactériennes sous forme de microparticules.
Le brevet américain nO 4 675 189 décrit des formulations à libération prolongée de la nafaréline, un décapeptide analogue de la LHRH, et autres analogues de la LHRH dans des copolymères de l'acide lactique et de l'acide glycolique, mais ne donne aucune donnée sur la libération du principe actif.
T. Chang, dans J. Bioneng., vol. 1, pages 25-32,1976, décrit la libération prolongée de produits biologiques, d'enzymes et de vaccins à partir de microparticules.
Les brevets américains nO 3 991 776, 4 076 798 et 4 118 470 décrivent des polymères et copolymères de l'acide lactique et des compositions les contenant destinées à une utilisation chirurgicale et à une libération prolongée par biodégradation du polymère.
La demande de brevet européen nO 0 203 031 décrit une série d'octapeptides analogues de la somatostatine, par exemple le composé RC-160 répondant à la formule
EMI3.1
ayant un pont entre les restes-Cys-. La revendication 18 mentionne la possibilité de présenter les somatos-
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tatines sous forme de microcapsules avec un copolymère de l'acide lactique et de l'acide glycolique, mais ne décrit pas comment obtenir des taux sériques constants qui soient thérapeutiquement actifs.
Le brevet américain nO 4 011 312 indique que l'on peut obtenir une libération continue d'un médicament antimicrobien, par exemple la polymyxine B hydrosoluble, à partir d'une matrice, sous forme d'implant, d'un copolymère de l'acide lactique et de l'acide glycolique à bas poids moléculaire (inférieur à 2000) et à teneur relativement élevée en unités d'acide glycolique, lorsque l'implant est inséré dans le canal mammaire d'une vache. Le principe actif est libéré en un temps très court, en raison de la teneur élevée en unités d'acide glycolique et du bas poids moléculaire du polymère, ce qui favorise une rapide biodégradation du polymère et donc une libération rapide du principe actif. Une teneur relativement élevée en principe actif favorise également une rapide libération de ce dernier.
Ledit brevet ne mentionne cependant aucune somatostatine et ne fournit aucune donnée sur la libération du principe actif.
Le brevet européen nO 58481 mentionne qu'une libération continue d'un peptide hydrosoluble à partir d'un implant d'acide polylactique est stimulée par l'abaissement du poids moléculaire d'au moins une partie des molécules du polymère, par introduction d'unités d'acide glycolique dans la molécule du polymère, par augmentation du caractère séquensé du polymère lorsqu'on utilise un copolymère d'acide lactique et d'acide glycolique, et par augmentation de la teneur en principe actif de la matrice du polymère et de la dimension de l'implant.
Bien que les somatostatines soient mentionnées comme peptides hydrosolubles, le document ne décrit aucun profil de libération d'une somatostatine et on ne donne aucune indication sur la
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manière de combiner tous ces paramètres pour obtenir, par exemple, des taux constants de somatostatine dans le sérum pendant au moins une semaine, par exemple un mois.
Le brevet européen nO 92918 indique qu'on peut obtenir une libération continue de peptides, de préférence de peptides hydrophiles, pendant un temps prolongé, lorsque le peptide est incorporé dans une matrice polymère hydrophobe, par exemple d'acide polylactique, que l'on rend plus accessible à l'eau en introduisant dans sa molécule une unité hydrophile, par exemple de polyéthylèneglycol, d'alcool polyvinylique, de dextrane ou de polyméthacrylamide. Le caractère hydrophile du polymère amphiphile provient des groupes éthylèneoxy dans le cas d'une unité de polyéthylèneglycol, des groupes hydroxy libres dans le cas d'une unité d'alcool polyvinylique ou d'une unité de dextrane, et des groupes amide dans le cas d'une unité de polyméthacrylamide.
En raison de la présence d'une unité hydrophile dans la molécule du polymère, l'implant aura les propriétés d'un hydrogel après absorption de l'eau. La somatostatine est mentionnée comme peptide hydrophile, mais le document ne fournit aucun profil de libération et ne donne aucune indication sur le type de polymère préféré pour ce peptide et sur le poids moléculaire et le nombre de groupes hydrophiles que le polymère devrait avoir.
La demande de brevet britannique 2 145 422 indique qu'on peut obtenir une libération prolongée de médicaments de divers types, par exemple de vitamines, d'enzymes, d'antibiotiques et d'antigènes, lorsque le principe actif est incorporé dans une matrice, par exemple sous forme de microcapsules ou d'implant, constituée par un polymère d'un polyol, par exemple le glucose ou le mannitol, comprenant un ou plusieurs groupes ester avec un acide polylactique, de préférence
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au moins 3. Les restes de l'acide polylactique contiennent de préférence des unités d'acide glycolique. Les peptides, par exemple les somatostatines, ne sont cependant pas mentionnés comme médicaments susceptibles d'être utilisés sous une telle forme à libération prolongée.
L'invention concerne donc des formulations à libération prolongée, par exemple des formulations de microparticules, d'un médicament, spécialement d'une somatostatine ou d'un analogue de la somatostatine, tel que l'octréotide, hydrosoluble et à activité hormonale, qui fournissent des taux plasmatiques satisfaisants en principe actif, par exemple dans un polymère biocompatible et biodégradable, par exemple dans une matrice polymère obtenue par microencapsulation. La matrice polymère peut être un polymère synthétique ou naturel.
Les microparticules de l'invention peuvent être préparées selon l'une quelconque des techniques habituelles, par exemple selon la technique de séparation de phase organique, la technique de séchage par nébulisation (spray drying) ou la technique d'émulsion triple, selon lesquelles on provoque la précipitation du polymère avec le principe actif, et ensuite on durcit le produit résultant lorsqu'on utilise la technique de séparation de phase ou d'émulsion triple.
Si nécessaire, les formulations à libération prolongée peuvent se présenter sous forme d'un implant.
La Demanderesse a trouvé une modification particulièrement utile de la technique de séparation de phase pour préparer des microparticules de n'importe quel principe actif.
L'invention concerne donc également un procédé de préparation de microparticules comprenant un principe actif dans un véhicule biodégradable et biocompatible, procédé selon lequel
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a) on dissout la matière polymère dans un solvant approprié dans lequel le principe actif n'est pas soluble, b) dans la solution de l'étape a), on ajoute et on disperse une solution du principe actif dans un solvant approprié, par exemple un alcool, qui n'est pas un solvant pour le polymère, c) on ajoute un agent inducteur de phase à la dis- persion de l'étape b), pour provoquer la formation de microparticules, d) on ajoute une émulsion huile dans l'eau au mélange de l'étape c) pour durcir les microparticules, et e) on récupère les microparticules.
La Demanderesse a également trouvé une modification particulièrement utile de la technique d'émulsion triple pour la préparation de microparticules de n'importe quel principe actif.
L'invention concerne donc un procédé de préparation de microparticules, procédé selon lequel (i) on mélange intimement une émulsion eau-dans-l'huile formée à partir d'un milieu aqueux et d'un solvant organique non miscible dans l'eau, contenant dans une phase le principe actif et dans l'autre phase un polymère biodégradable et biocompatible, avec un excès d'un milieu aqueux contenant une substance émulsifiante ou un colloïde protecteur, pour former une émulsion eau- dans-l'huile-dans-l'eau, sans ajouter à l'émulsion eau-dans-l'huile de substance retenant le principe actif ou sans appliquer une étape intermédiaire augmentant la viscosité, (ii) on soumet le solvant organique à une désorptionet (iii) on isole et on sèche les microparticules résul- tantes.
L'invention concerne également les microparticules obtenues selon ces procédés.
L'invention concerne également
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a) une formulation à libération prolongée comprenant un peptide dans un ester d'un polyol avec un acide poly (40/60 à 60/40 lactique-co-glycolique), le reste polyol étant choisi parmi les alcools conte- nant une chaîne hydrocarbonée en Cs-Cg et de 3 à 6 groupes hydroxy et les mono-et di-saccharides, et le polyol estérifié ayant au moins 3 chaînes d'acide poly (lactique-co-glycolique), b) une formulation à libération prolongée comprenant un peptide qui est une calcitonine, la lypressine ou une somatostatine, dans un copolymère linéaire
40/60 à 60/40 d'acide lactique et d'acide glycolique ayant un poids moléculaire Mw compris entre 25 000 et 100 000 et une polydispersité Mw/Mn comprise entre 1,2 et 2, en une concentration comprise entre 0,2 et 10%,
de préférence entre 2 et
10% en poids de peptide, c) une formulation à libération prolongée comprenant l'octréotide ou 11 un de ses dérivés, ou un sel du compose, dans un véhicule polymère biodégradable et bio- compatible.
La Demanderesse a trouvé qu'un nouveau sel de l'octréotide, le pamoate, est très stable dans de telles formulations.
L'invention concerne donc (i) le pamoate d'octréotide et (ii) un procédé de préparation du pamoate d'octréotide, procédé selon laquel on fait réagir l'octréotide avec l'acide pamoïque (ou un dérivé réactif de ce composé).
L'invention concerne en outre les formulations indiquées plus haut pour l'utilisation dans le traitement de l'acromégalie ou du cancer du sein.
Les principes actifs utilisés dans les procédés de l'invention sont de préférence des principes actifs hydrosolubles, par exemple des peptides.
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Les peptides utilisés dans les procédés et les formulations de l'invention peuvent être une calcitonine, telle que la calcitonine de saumon, la lypressine et la somatostatine d'origine naturelle et ses analogues synthétiques.
La somatostatine d'origine naturelle qui est l'un des composés préférés, est un tétradécapeptide répondant à la formule
EMI9.1
Cette hormone est produite par l'hypothalamus ainsi que par d'autres organes, par exemple le tractus gastro-intestinal. La somatostatine intervient au niveau hypophysaire pour inhiber les sécrétions de la hGH (hormone somatotrope) et de la TSH (thyréostimuline). Au niveau digestif, elle inhibe de nombreux processus sécrétoires (dans le pancréas, l'estomac, le duodénum et l'intestin grêle).
Par l'expresion"analogue ou dérivé de la somatostatine", on entend l'un quelconque des polypeptides cycliques ou à chaîne linéaire dérivé de la somatostatine naturelle dans laquelle un ou plusieurs restes d'amino-acides ont été supprimés et/ou substitués par un ou plusieurs autres restes d'amino-acides et/ou dans laquelle un ou plusieurs groupes fonctionnels ont été remplacés par un ou plusieurs autres groupes fonctionnels et/ou dans laquelle un ou plusieurs groupes ont été remplacés par un ou plusieurs autres groupes isostères. En général, le terme englobe tous les dérivés modifiés d'un peptide biologiquement actif qui exercent un effet qualitativement similaire à celui de la somatostatine non modifiée.
Les analogues agonistes de la somatostatine sont donc utiles pour remplacer la somatostatine
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d'origine naturelle dans son action sur la régulation de fonctions physiologiques.
Les somatostatines connues préférées sont les suivantes :
EMI10.1
(uenomination, commune octrêotide)
EMI10.2
où dans chaque composés a) à i) il y a un pont entre les amino-acides marqués d'un astérisque (*) comme indiqué dans la formule ci-dessous.
Les autres somatostatines préférées sont les suivantes :
EMI10.3
[voir Vale et coll., Métabolisme 27, Supp. 1, 139, (1978) 1
EMI10.4
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[voir la demande de brevet européen n 1295]
EMI11.1
[voir Verber et coll., Life Sciences, 34,1371-1378 (1984) et la demande de brevet européen nO 70 021] également connue sous la désignation
EMI11.2
[voir R. F. Nutt et coll., Klin. Wochenschr. (1986) 64 (Suppl. VII)]
EMI11.3
(voir. 1a demande de brevet européen 200 188)
EMI11.4
et
EMI11.5
dans laquelle X signifie une fixation cationique spécialement
EMI11.6
(voir la demande de brevet européen 363589) et dans les formules ci-dessus, un pont étant présent entre les amino-acides marqués d'un astérisque (*).
Le contenu de ces publications est incorporé
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à la présente demande à titre de référence.
L'expression dérivé comprend également les composés correspondants comportant un reste glucidique.
Lorsque les somatostatines comportent un reste glucidique, ce dernier est couplé de préférence à un groupe amino N-terminal et/ou à au moins un groupe amino présent dans la chaîne latérale du peptide, plus préférablement à un groupe amino N-terminal. De tels composés et leur préparation sont décrits par exemple dans la demande internationale WO 88/02756.
L'expression dérivés de l'octréotide comprend les dérivés comprenant un reste
EMI12.1
dans lequel les restes Cys sont reliés par un pont.
Les dérivés particulièrement préférés sont
EMI12.2
le N"- [ < x-glucosyl- (l-4-désoxyfructosyl]-DPhe-Cys-PheDTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol et le N"- [ss-désoxyfructosyl]- DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol, chacun comprenant un pont entre les restes-Cys-, de préférence sous forme d'acétate, et décrits respectivement aux exemples 2 et 1 de la demande mentionnée plus haut.
Les somatostatines peuvent se présenter par exemple sous forme libre, sous forme de sel, ou sous forme de complexes. Les sels d'addition d'acides peuvent être formés par exemple avec des acides organiques, des acides polymères et des acides minéraux. Les sels d'addition d'acides comprennent par exemple le chlorhydrate et l'acétate. Les complexes sont formés par exemple à partir des somatostatines par addition de substances minérales, par exemple de sels minéraux ou d'hydroxydes tels que les sels de Ca et de Zn et/ou par addition de substances organiques polymères.
L'acétate est le sel préféré pour de telles formulations, spécialement pour les microparticules
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provoquant un pic plasmatique réduit. L'invention concerne également le pamoate qui est utile en particulier pour les implants.
On peut obtenir le pamoate selon les méthodes habituelles, par exemple en faisant réagir l'acide embonique (acide pamoïque) avec l'octréotide, par exemple sous forme de base libre. On peut effectuer la réaction dans un solvant polaire, par exemple à température ambiante.
Les somatostatines sont indiquées pour une utilisation dans le traitement des troubles pour lesquels une application à long terme du médicament est envisagée, par exemple pour le traitement de troubles ayant une étiologie comprenant ou associée avec un excès de sécrétion de l'hormone de croissance, par exemple dans le traitement de l'acromégalie, pour une utilisation dans le traitement des troubles gastrointestinaux, par exemple des ulcères peptiques, des fistules entérocutanées et pancréatocutanées, du syndrome du côlon irritable, du syndrome de dumping, des diarrhées aqueuses, de la pancréatite aiguë et des tumeurs gastro-intestinales productrices d'hormones (par exemple le vipome, les tumeurs sécrétant du GRF, le glucagonome, l'insulinome, le gastrinome et tumeurs carcinoïdes) ainsi que des saignements gastro-intestinaux,
du cancer du sein et des complications liées au diabète.
Le véhicule polymère peut être préparé à partir de polymères biocompatibles et biodégradables, tels que les polyesters linéaires, les polyesters ramifiés constitués de chaînes linéaires se développant à partir d'un reste polyol, par exemple le glucose ; les autres esters sont l'acide polylactique, l'acide polyglycolique, l'acide polyhydroxybutyrique, la polycaprolactone, l'oxalate de polyalkylène, les esters d'un polyalkylèneglycol avec des acides du cycle de
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Krebs, par exemple l'acide citrique et autres, et leurs copolymères.
Les polymères préférés de l'invention sont les polyesters linéaires et les polyesters à chaîne ramifiée. Les polyesters linéaires peuvent être préparés par condensation d'acides a-hydroxycarboxyliques, par exemple l'acide lactique et l'acide glycolique, ou par polymérisation de la lactone (dimère de l'acide) (voir par exemple le brevet américain nO 3 773 919).
Les copolymères linéaires de l'acide lactique et de l'acide glycolique préférés pour une utilisation selon l'invention, ont avantageusement un poids moléculaire compris entre 25 000 et 100 000 et une polydispersibilité Mw/Mn comprise par exemple entre 1,2 et 2.
Les polyesters ramifiés préférés pour une utilisation selon l'invention peuvent être préparés en utilisant des composés polyhydroxylés, par exemple les polyols, tels que le glucose et le mannitol, comme initiateurs. Ces esters de polyols sont connus et décrits dans la demande de brevet britannique nO 2 145 422. Le polyol contient au moins 3 groupes hydroxy et peut avoir un un poids moléculaire allant jusqu'à 20 000 et au moins 1, de préférence au moins 2, par exemple en moyenne 3 groupes hydroxy du polyol étant sous forme d'ester avec un acide polylactique ou un acide poly (lactique-co-glycolique). On utilise habituellement 0,2% de glucose pour initier la polymérisation. La structure des polyesters ramifiés est en forme d'étoile.
Les chaînes de polyester dans les composés polymères linéaires et à structure en étoile utilisés de préférence dans les formulations de l'invention, sont de préférence des chaînes de copolymères d'acides a-carboxyliques, l'acide lactique et l'acide glycolique, ou de leurs dimères cycliques (lactones).
Les rapport molaires de l'acide lactique à l'acide
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glycolique sont compris entre environ 75 : 25 et 25 : 75, par exemple entre 60 : 40 et 40 : 60, les rapports compris entre 55 : 45 et 45 : 55, par exemple entre 55 : 45 et 50 : 50 étant particulièrement préférés.
Les polymères à structure en étoile sont obtenus de préférence en faisant réagir un polyol avec le dilactide et de préférence également avec le diglycolide à une température élevée et en présence d'un catalyseur, ce qui rend possible l'ouverture du cycle lactone pour la polymérisation.
Un avantage du polymère à structure en étoile dans les formulations de l'invention est que son poids moléculaire peut être relativement élevé, ce qui confère une stabilité physique, par exemple une certaine dureté, aux implants et aux microparticules et leur évite de s'agglomérer, tout en comportant des chaînes relativement courtes d'acide polylactique ou de copolymère de l'acide lactique ; cela permet une vitesse de biodégradation contrôlable du polymère, allant de quelques semaines à un ou deux'mois et une libération prolongée correspondante du peptide, les formulations obtenues avec ces polymères étant appropriées, par exemple, pour une libération sur un mois.
Les polymères à structure en étoile ont de préférence un poids moléculaire (Mw) compris entre environ 10 000 et 200 000, plus préférablement entre 25 000 et 100 000, spécialement entre 35 000 et 60 000 et une polydispersité comprise par exemple entre 1,7 et 3,0, par exemple entre 2,0 et 2,5. Les viscosités intrinsèques des polymères à structure en étoile de poids moléculaire de 35 000 et de 60 000 sont respectivement de 0,36 et 0,51 dl/g dans le chloroforme. Un polymère à structure en étoile ayant un poids moléculaire de 52 000 possède une viscosité de 0,475 dl/g dans le chloroforme.
Les expressions microsphères, microcapsules
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et microparticules sont des expressions interchangeables selon l'invention et signifient la microencapsulation des peptides par le polymère, le peptide étant réparti de préférence à travers le polymère, lequel devient ensuite une matrice pour le peptide.
Dans ce cas, on utilise de préférence l'expression microsphères ou plus généralement celle de microparticules.
En utilisant la technique de séparation de phase de l'invention, on peut par exemple préparer les formulations de l'invention par dissolution du véhicule polymère dans un solvant qui n'est pas un solvant pour le peptide, et addition et dispersion d'une solution de peptide dans la composition constituée par le polymère et le solvant. On ajoute ensuite un inducteur de phase, par exemple un fluide de silicone pour permettre la micro-encapsulation du peptide par le polymère.
On peut fortement réduire l'effet de pic plasmatique par précipitation in situ de particules ultra fines de principe actif, en ajoutant une solution du principe actif à la solution du polymère, avant la phase de séparation. Dans le procédé décrit dans l'état de la technique, on ajoute les particules sèches directement à la solution du polymère.
La durée de libération du peptide et l'activité thérapeutique du peptide peuvent être augmentées par une étape durcissement/lavage des microparticules avec une émulsion tampon/heptane. Le procédé de l'état de la technique comprend une étape de durcissement non suivie par un lavage ultérieur ou suivie par une étape séparée de lavage aqueux.
On peut utiliser une émulsion du type huile- dans-l'eau pour laver et durcir les microparticules et éliminer le peptide non encapsulé. Le lavage sert à éliminer de la surface des microparticules le peptide non encapsulé. L'élimination de l'excès de peptide des
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microparticules diminue le pic plasmatique initial qui caractérise de nombreuses formulations courantes obtenues par microencapsulation. Ainsi, une libération plus importante du principe actif dans un intervalle de temps donné est rendu possible par les formulations de l'invention.
L'émulsion sert également à éliminer le solvant résiduel du polymère et le fluide de silicone.
L'émulsion peut ainsi être ajoutée au mélange de polymère et de peptide, ou le mélange peut être ajouté à l'émulsion. On préfère cependant la deuxième solution.
L'émulsion huile-dans-l'eau peut être préparée en utilisant un émulsifiant tel que le mono- oléate de sorbitane (Span 80, ICI corp. ) et analogues, afin de former une émulsion stable. On peut tamponner l'émulsion avec un tampon qui ne nuit pas au peptide et à la matrice polymère. Le pH du tampon peut être compris entre 2 et 8, de préférence pH 4. On peut préparer le tampon à partir de tampons acides tels qu'un tampon phosphate, acétate et autres... On peut remplacer le tampon par de l'eau seule. On peut également utiliser de l'heptane, de l'hexane etc... comme phase organique de l'émulsion.
L'émulsion peut contenir des agents de dispersion tels que l'huile de silicone.
Une émulsion préférée comprend de l'heptane, un tampon phosphate à pH 4, de l'huile de silicone et du mono-oléate de sorbitane. Lorsqu'on désire une libération initiale du principe actif, on peut remplacer l'étape durcissement/lavage par une étape de durcissement avec un solvant organique tel que l'heptane, l'hexane etc...
Comme autre alternative à l'émulsion huile- dans-l'eau pour le durcissement des microparticules, on peut utiliser par exemple un solvant plus un émulsifiant pour durcir les microparticules sans lavage, et
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un solvant plus un émulsifiant pour le durcissement suivi d'une étape séparée de lavage.
L'émulsion huile-dans-l'eau peut être utilisée sans agent de dispersion. Toutefois, l'agent de dispersion évite l'agrégation des particules sèches des microparticules provoquée par l'électricité statique et permet de réduire le taux de solvant résiduel.
Comme exemples de solvants destinés à la matrice polymère, on peut citer le chlorure de méthylène, le chloroforme, le benzène, l'acétate d'éthyle etc... On dissout de préférence le peptide dans un solvant alcoolique, par exemple du méthanol, qui est miscible avec le solvant du polymère.
Les inducteurs de phase (agents de coacervation) sont des solvants miscibles avec le mélange principe actif/polymère et provoquent la formation de microparticules embryonnaires avant le durcissement ; comme inducteurs de phase, on préfère les huiles de silicone.
On peut préparer l'émulsion huile-dans-l'eau selon les méthodes habituelles, en utilisant de l'heptane, de l'hexane etc..., pour la phase organique.
On peut également préparer les microparticules de l'invention selon le procédé connu de séchage par nébulisation. Selon ce procédé, on mélange intimement la somatostatine ou une solution de ce peptide dans un solvant organique, par exemple le méthanol, dans l'eau ou dans un tampon, par exemple de pH 3-8, avec une solution du polymère dans un solvant organique, non miscible avec le premier, par exemple le chlorure de méthylène.
On pulvérise ensuite la solution, la suspension ou l'émulsion formées dans un courant d'air, de préférence d'air chaud. On recueille ensuite les microparticules formées, par exemple dans un cyclone, et, si
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nécessaire, on les lave, par exemple dans une solution tampon de pH compris entre 3,0 et 8,0, de préférence de pH 4,0, ou dans de l'eau distillée, et on les sèche sous vide, par exemple à une température comprise entre 20 et 40 C. On peut appliquer l'étape de lavage lorsque les particules présentent un pic plasmatique in vivo et lorsqu'on ne désire pas que le pic plasmatique ait une importance excessive. Comme tampon, on peut utiliser un tampon acétate.
On peut donc obtenir des microparticules présentant un profil amélioré de libération de somatostatine in vivo.
L'invention concerne donc également les microparticules préparées selon ce procédé. L'invention concerne en outre une formulation à libération prolongée préparée en mélangeant une somatostatine ou une solution de somatostatine dans du méthanol, dans de l'eau ou dans un tampon pH 3-8, avec une solution d'un copolymère des acides lactique et glycolique dans du chlorure de méthylène. On pulvérise ensuite dans un courant d'air chaud la solution, l'émulsion ou la suspension obtenue de somatostatine dans la solution du polymère, on recueille les microparticules et on les lave dans une solution tampon de pH compris entre 3,0 et 8,0 ou dans de l'eau distillée et on les sèche sous vide à une température comprise entre 20 et 40 C.
Comparées aux microparticules préparées selon la technique de séparation de phase, les microparticules ainsi obtenues ne contiennent pas d'huile de silicone, même sous forme de traces, l'huile de silicone n'étant pas utilisée dans la technique de séchage par nébulisation.
Les formulations de l'invention peuvent également être préparées en utilisant le procédé d'émulsion triple. Selon ce procédé, on dissout le peptide, par exemple l'octréotide, dans un solvant
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approprié, par exemple de l'eau, et on l'émulsifie à fond dans une solution du polymère, par exemple du poly (acide D, L-lactique-co-acide glycolique) glucose (50/50) dans un solvant dans lequel le peptide n'est pas soluble, par exemple le chlorure de méthylène.
Comme exemples de solvants appropriés pour la matrice polymère, on peut citer le chlorure de méthylène, le chloroforme, le benzène, l'acétate d'éthyle etc...
L'émulsion eau-dans-l'huile résultante est émulsifiée dans un excès d'eau contenant un émulsifiant, par exemple un surfactif anionique ou non ionique ou la lécithine, ou un colloïde protecteur, par exemple la gélatine, la dextrine, la carboxyméthylcellulose, la polyvinylpyrrolidone ou l'alcool polyvinylique, qui génère en continu une émulsion triple (eau-dans- l'huile-dans-l'eau). Les microparticules sont formées par précipitation spontanée du polymère et sont durcies par évaporation du solvant organique. La gélatine sert à empêcher l'agglomération des microparticules. Après la sédimentation des microparticules, on décante le surnageant et on lave les microparticules avec de l'eau et ensuite avec un tampon acétate. On filtre ensuite et on sèche les microparticules.
On peut également disperser le peptide directement dans la solution polymère et mélanger ensuite la suspension résultante avec la phase aqueuse contenant de la gélatine.
L'émulsion triple est connue d'après le brevet américain nO 4 652 441. Selon ce brevet, on mélange à fond dans une première étape une solution du principe actif (1) dans un solvant, par exemple de la somatostatine dans de l'eau (colonne 2, lignes 31-32), avec un excès d'une solution d'acide poly- (lactique-co-glycolique) (2) dans un autre solvant où le premier solvant est insoluble, par exemple du chlorure de méthylène, ce qui donne une émulsion du
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type eau dans l'huile (3) constituée de fines gouttelettes de la solution (1) dans la solution (2).
Dans la solution (1), on dissout également une substance retenant le principe actif (colonne 1, ligne 31), par exemple de la gélatine, de l'albumine, de la pectine ou de la gélose. Dans une seconde étape, on augmente la viscosité de la phase interne (1) en utilisant des moyens appropriés, par exemple par chauffage, refroidissement, réglage du pH, addition d'ions métalliques ou réticulation par exemple de la gélatine avec un aldéhyde.
Dans une troisième étape, on mélange intimement l'émulsion eau-dans-l'huile (3) avec un excès d'eau (colonne 7, lignes 52-54), ce qui donne une émulsion à trois phases du type eau-dans-l'huile- dans-l'eau. Si nécessaire, un agent dit émulsifiant peut être présent dans l'excès d'eau (colonne 7, ligne 56), choisi par exemple parmi les tensio-actifs anioniques ou non ioniques, la polyvinylpyrrolidone, l'alcool polyvinylique et la gélatine. Dans la quatrième étape, on soumet l'émulsion eau-dans-l'huile- dans-l'eau à un"séchage dans l'eau" (ligne 52). Cela signifie que le solvant organique dans la couche d'huile est désorbé pour donner les microparticules.
La désorption du solvant est effectuée selon les méthodes connues (colonne 8, lignes 3-5), par exemple par diminution de la pression sous agitation (colonne 8, lignes 5-7) ou par barbotage d'azote à travers la couche huileuse (par exemple de chlorure de méthylène) (ligne 19). Les microparticules formées sont récupérées par centrifugation ou par filtration (lignes 26-27) et les composants qui ne se sont pas incorporés dans le polymère sont éliminés par lavage avec de l'eau (ligne 29). Si nécessaire, on chauffe les microparticules sous pression réduite afin de pouvoir mieux éliminer l'eau et le solvant (par exemple le chlorure de méthylène de la paroi des microparticules) (lignes 30-32).
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Bien que le procédé ci-dessus soit satisfaisant pour la préparation des formulations de l'invention, la substance retenant le principe actif mentionnée plus haut, par exemple la gélatine, l'albumine, la pectine ou la gélose, est toujours incluse dans les microparticules résultantes.
La Demanderesse a trouvé qu'en omettant l'addition, dans la solution a), de la substance retenant le principe actif ainsi que l'étape servant à augmenter la viscosité de la phase interne et qu'en maintenant l'addition d'une substance émulsifiante ou d'un colloïde protecteur, comme la gélatine, dans l'excès d'eau de l'émulsion triple eau-dans-l'huile- dans-l'eau, on peut encore obtenir des microparticules satisfaisantes. En outre, les microparticules ne contiennent pas de substance retenant le principe actif et seulement une très faible quantité de chlorure de méthylène.
L'invention concerne donc un procédé de préparation de microparticules, procédé selon lequel on mélange intimement : a) une solution d'un principe actif, de préférence une somatostatine, spécialement l'octréotide, dans un milieu aqueux, de préférence l'eau ou un tampon, de préférence dans un rapport poids/volume de 0,8 à
4,0 g/1 à 120 ml, spécialement de 2,5/10, et dans un tampon à pH 3-8, spécialement un tampon acétate, avec b) une solution d'un polymère, de préférence un acide poly (lactique-co-glycolique) tel que mentionné plus haut, dans un solvant organique non miscible avec le milieu aqueux, par exemple le chlorure de méthy- lène, de préférence dans un rapport poids/volume de
40 g/90 à 400 ml, spécialement 40/100, afin que le rapport pondéral du principe actif au polymère soit de préférence de 1/10 à 50,
spécialement de
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1/16, et le rapport volume/volume du milieu aqueux au solvant organique soit de 1/1,5 à 30, spécialement de 1/10, on mélange intimement l'émulsion eau-dans-l'huile de a) dans b) ainsi obtenue avec c) un excès d'un milieu aqueux, de préférence l'eau ou un tampon, par exemple un tampon acétate ou phosphate, de préférence à pH 3-8, contenant une substance émulsifiante ou un colloïde protecteur, de préférence en une concentration comprise entre
0,01 et 15,0%, en particulier la gélatine, spécialement en une concentration comprise entre
0,1 et 3%, en particulier de 0,5% en poids, le mélange étant effectué de préférence à une vitesse telle que le rapport volume/volume de ab) /c) soit de 1/10 à 100, spécialement de 1/40,
sans ajouter à l'émulsion eau-dans-l'huile de substance retenant le principe actif ou sans effectuer d'étape intermédiaire pour augmenter la viscosité, on durcit les microparticules embryonnaires dans l'émulsion formée eau-dans-l'huile-dans l'eau, par désorption, de préférence par évaporation du solvant organique, de préférence le chlorure de méthylène, et on isole, éventuellement on lave et on sèche les microparticules générées.
L'invention concerne également une variante du procédé, selon laquelle on disperse le principe actif directement dans la solution du polymère, et on mélange ensuite la dispersion résultante avec la phase aqueuse contenant la gélatine.
L'invention concerne également les microparticules préparées selon ces procédés. Tout comme les microparticules préparées selon la technique de séchage par nébulisation, elles ne contiennent pas d'huile de silicone. Comparées aux microparticules préparées selon le procédé connu d'émulsion triple, elles ne
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contiennent pas de colloïde protecteur.
Les formulations à libération prolongée peuvent également être préparées selon d'autres méthodes connues, par exemple lorsque le peptide est suffisamment stable pour la préparation d'un implant, par chauffage des microparticules de peptide, par exemple une somatostatine, dans un acide poly (lactiqueco-glycolique), spécialement tel que décrit plus haut, ou par chauffage d'un mélange du peptide et du polymère, à une température comprise par exemple entre 70 et 100 C, et par extrusion et refroidissement de la masse compacte. Le produit d'extrusion est ensuite coupé et éventuellement lavé et séché.
Les formulations de l'invention sont avantageusement préparées sous des conditions aseptiques.
Les formulations de l'invention peuvent être utilisées sous une forme dépôt, par exemple sous forme de microparticules injectables ou d'implants.
Elles peuvent être administrées selon les méthodes habituelles, par exemple par injection souscutanée ou intramusculaire, par exemple en fonction des indications connues pour le médicament qu'elles contiennent.
Les formulations à libération prolongée contenant l'octréotide peuvent être administrées pour toutes les indications connues de l'octréotide ou de ses dérivés, par exemple celles décrites dans la demande de brevet britannique 2 199 829, ainsi que pour le traitement de l'acromégalie ou du cancer du sein.
Les microparticules de l'invention peuvent avoir un diamètre compris entre environ 1 et 250 microns ; elles ont de préférence un diamètre compris entre 10 et 200, spécialement entre 10 et 130, par exemple entre 10 et 90 microns. Les implants peuvent être par exemple d'environ 1 et 10 mm3. La quantité de
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principe actif, c'est-à-dire du peptide présent dans la formulation, dépend de la dose nécessaire qui doit être libérée par jour et donc de la biodégradation du polymère servant à l'encapsuler. La quantité exacte de peptide peut être déterminée par des essais de biodisponibilité.
Les formulations peuvent contenir le peptide en une quantité d'au moins 0,2, de préférence de 0,5 à 20% en poids par rapport à la matrice polymère, de préférence entre 2,0 et 10, spécialement entre 3,0 et 6% en poids.
Le temps de libération du peptide à partir des microparticules peut être compris entre 1 ou 2 semaines à environ 2 mois.
La formulation à libération prolongée est avantageusement une formulation comprenant une somatostatine, par exemple l'octréotide, dans un véhicule polymère biodégradable et biocompatible, laquelle formulation, lorsqu'elle est administrée à un rat par voie sous-cutanée à une dose de 10 mg de somatostatine par kg, donne une concentration plasmatique en somatostatine d'au moins 0,3 ng/ml et de préférence inférieure à 20 ng/ml pendant 30 jours, ou avantageusement pendant 60 jours, ou bien, lorsqu'elle est administrée à un lapin par voie intramusculaire à une dose de 5 mg/kg, donne une concentration plasmatique en somatostatine d'au moins 0,3 ng/ml pendant 50 jours et avantageusement inférieure 20 ng/ml.
D'autres propriétés préférées des formulations dépôt obtenues contenant une somatostatine, par exemple l'octréotide, sont les suivantes, en fonction du procédé de préparation utilisé : Technique de séparation de phase
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Lapin : 5 mg de somatostatine/kg, par voie intra- musculaire Retard (0-42 jours) 76% Taux plasmatique moyen (cp, idéale) (0-42 jours) 4 ng/ml ASC (0-42 jours) 170 ng/ml x jours Technique de séchage par nébulisation Rat : 10 mg de somatostatine/kg, par voie sous-cutanée Retard (0-42 jours) > 75% Taux plasmatique moyen (cp, idéale) (0-42 jours) 4-6 ng/ml ASC (0-42 jours) 170-210 ng/ml x jours Lapin : 5 mg de somatostatine/kg, par voie intra- musculaire Retard (0-43 jours) > 75% Taux plasmatique moyen (cp, idéale) (0-43 jours) 4-6 ng/ml ASC (0-43 jours) 200-240 ng/ml x jours Technique d'émulsion triple .
Rat : 10 mg de somatostatine/kg, par voie sous-cutanée Retard (0-42 jours) > 75% Taux plasmatique moyen (cp, idéale) (0-42 jours) 4-6,5 ng/ml ASC (0-42 jours) 170-230 ng/ml x jours
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Lapin : 5 mg de somatostatine/kg, par voie intra- musculaire Retard (0-42-43 jours) > 74% Taux plasmatique moyen (cp, idéale) (0-42-43 jours) 3,5-
6,5-ng/ml ASC (0-42-43 jours) 160-270 ng/ml x jours
L'invention concerne donc également des formulations comprenant une somatostatine, de préférence l'octréotide ou un analogue de l'octréotide, ayant les propriétés suivantes : 1. Un retard d'au moins 70%, de préférence d'au moins
74%, par exemple d'au moins 75%, 80%, 88% ou d'au moins 89% pendant une période allant de 0 à 42 ou
43 jours et/ou 2.
Une concentration plasmatique moyenne (cp idéale) chez le rat de 2,5-6, 5, de préférence de 4-6,5 ng/ml pendant une période allant de 0 à 42 jours, après administration de 10 mg de somatostatine par voie sous-cutanée et/ou une concentration plasma- tique moyenne chez le lapin de 3,5-6, 5, par exemple de 4-6,5 ng/ml pendant une période allant de 0 à 42 ou 43 jours, après administration de 5 mg de somatostatine par voie intra-musculaire et/ou 3.
Une aire sous la courbe pendant une période allant de 0 à 42 jours d'au moins 160, de préférence comprise entre 160 et 230 ng/ml x jours chez le rat, après administration de 10 mg de somatostatine par voie sous-cutanée et/ou une aire sous la courbe pendant une période allant de 0 à 42 ou 43 jours d'au moins 160, de préférence comprise entre 160 et
275, par exemple entre 200 et 275 ng/ml x jours chez le lapin, après administration de 5 mg de somatostatine par voie intra-musculaire.
Pour caractériser quantitativement les
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formulations à libération prolongée décrites plus haut, on utilise la méthode des écarts de surface (AD = Area Déviation) décrite par F. Nimmerfall et J. Rosenthaler ; Intern. J. Pharmaceut. 32,1-6 (1986).
Cette méthode calcule les écarts de surface du profil plasmatique expérimental par rapport au profil idéal qui est une concentration plasmatique moyenne constante (-cp idéale) obtenue en convertissant en un rectangle de même surface l'aire sous la courbe (ASC) des taux plasmatiques en fonction du temps obtenue expérimentalement. On calcule le retard en % de la manière suivante : % de retard-100 x (1-AD/ASC)
Selon cette méthode, le profil plasmatique total mesuré pendant un temps pré-déterminé est caractérisé par un seul indice numérique.
Dans Proc. Natl. Acad. Soi. USA, 85 (1988) 5688-5692, on décrit à la figure 4 un profil de taux plasmatique chez le rat d'un octapeptide analogue de la somatostatine, répondant à la formule
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Toutefois, une comparaison nette ne peut être établie avec les taux plasmatiques reportés plus haut et obtenus chez le rat avec les compositions de l'invention, attendu que le profil des taux plasmatiques décrit dans ce document est basé sur une autre méthode d'administration, à savoir l'injection par voie intra-musculaire et que, ce qui est beaucoup plus important, on ne trouve aucune indication précise sur la concentration de principe actif dans les microcapsules et sur la dose administrée, le document se bornant à indiquer une concentration de principe actif dans les microcapsules comprise entre 2 et 6% et une dose de 25 à 50 mg de microcapsules pendant 30 jours,
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bien que les évaluations aient porté sur au moins 45 jours. En outre, on ne précise pas le type d'acide poly (DL-lactique-co-glycolique) utilisé. Compte-tenu de l'insuffisance de données, ce document ne peut donc en aucune façon être considéré comme donnant un enseignement quelconque en particulier sur les formulations bien définies de l'invention présentant les avantages déjà mentionnés, spécialement les taux plasmatiques tels que reportés précédemment.
Les exemples suivants illustrent la présente invention sans aucunement en limiter la portée. Dans ces exemples, Mw signifie le poids moléculaire moyen du polymère déterminé par chromatographie d'exclusion (GPC) en utilisant le polystyrène comme substance de référence.
EXEMPLE 1 :
On dissout 1 g d'acide poly (D, L-lactiqueco-glycolique) (50/50 molaire, Mw = 45 000 ; poly- dispersité-environ 1,7) dans 15 ml de chlorure de méthylène sous agitation magnétique et on ajoute 75 mg d'acétate d'octréotide dissous dans 0,5 ml de méthanol.
Au mélange polymère-peptide, on ajoute 15 ml d'huile de silicone (marque Dow 360 Médical Fluid, 1000 cs). On ajoute le mélange résultant à une émulsion sous agitation contenant 400 ml de n-heptane, 100 ml de
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tampon phosphate à pH 4, 40 ml de Dow 360 Medical Fluid, 350 cs et 2 ml de Span 80 (émulsifiant). On agite encore le mélange pendant au moins 10 minutes. On récupère les microparticules résultantes par filtration sous vide et on les sèche pendant la nuit sous vide. Le rendement est d'environ 90% en microparticules d'une dimension comprise entre 10 et 40 microns.
On met les microparticules en suspension dans un véhicule et on les administre par voie intramusculaire à une dose de 4 mg d'octréotide à des lapins (Nouvelle Zélande). Des échantillons de sang prélevés à
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intervalles réguliers indiquent des taux plasmatiques de 0,5 à 1, 0 ng/ml pendant 30 jours (déterminé par la méthode de dosage radioimmunologique).
EXEMPLE 2 :
Dans 25 ml d'acétate d'éthyle sous agitation magnétique, on dissout 1 g de poly (acide D, L-lactiqueco-acide glycolique) -glucose préparé selon le procédé décrit dans la demande de brevet britannique 2 145 422 (Mw = 45 000 ; 55/45 molaire ; polydispersité = environ 1,7 ; préparé à partir de 0,2% de glucose) et on ajoute 75 mg d'acétate d'octréotide dissous dans 3 ml de méthanol. A ce mélange polymère-peptide, on ajoute 25 ml d'huile de silicone (marque Dow 360 Médical Fluid, 1000 cs). On ajoute le mélange résultant à l'émulsion décrite à l'exemple 1. On continue à agiter le mélange pendant encore au moins 10 minutes. On récupère les microparticules résultantes par filtration sous vide et on les sèche pendant la nuit sous vide.
On obtient un rendement de plus de 80% en microparticules d'une dimension comprise entre 10 et 40 microns.
On met les microparticules en suspension dans un véhicule et on les administre par voie intramusculaire à une dose de 4 mg d'octréotide à des lapins (Nouvelle zélande). Des échantillons de sang prélevés à intervalles réguliers indiquent des taux plasmatiques de 0,5 à 2 ng/ml pendant 21 jours (déterminé par la méthode de dosage radioimmunologique).
EXEMPLE 3 :
On ajoute sous agitation une solution de 1,5 g d'acétate d'octréotide dans 20 ml de méthanol à une solution de 18,5 g de poly (acide D, L-lactique-coacide glycolique) glucose (50 : 50 molaire, Mw 45 000) dans 500 ml de chlorure de méthylène. On effectue la séparation de phase en ajoutant 500 ml de Dow 360 Medical Fluid (1000 cs) et 800 ml de Dow 360 Medical Fluid (350 cs) à la suspension du peptide et du poly-
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mère. On ajoute le mélange résultant à une émulsion sous agitation comprenant 1800 ml de n-heptane, 2000 ml d'eau stérile et 40 ml de Span 80. Après agitation pendant 10 minutes, on recueille les microparticules par filtration sous vide.
On sèche la moitié du produit pendant la nuit sous vide à 37OC. Le taux résiduel de chlorure de méthylène est de 1,2%.
Sous agitation, on lave l'autre moitié du produit avec 1000 ml d'éthanol contenant 1 ml de Span 80. Après agitation pendant 1 heure, on décante l'éthanol et on agite les microparticules dans 1000 ml de n-heptane contenant 1 ml de Span 80. Après agitation pendant 1 heure, on recueille les microparticules par filtration sous vide et on les sèche pendant la nuit sous vide à 37 C. Le taux de chlorure de méthylène résiduel des microparticules lavées de cette manière a été réduit de 1,2 à 0,12%.
Le rendement combiné du produit est de 91% (18,2 g) en microparticules contenant 5,6% d'octréotide ; le diamètre moyen est de 24 microns et le taux en heptane résiduel est de 1,5%.
On met les microparticules en suspension dans un véhicule et on les injecte par voie intramusculaire à une dose de 5 mg/kg d'octréotide à des lapins blancs. Des échantillons de sang prélevés à intervalles réguliers indiquent des taux plasmatiques de 0,3 à 7,7 ng/ml pendant 49 jours (déterminé par la méthode de dosage radioimmunologique).
EXEMPLE 4 :
Sous agitation magnétique, on dissout 1 g de poly (acide D, L-lactique-co-acide glycolique) glucose (Mw - 46 000 ; 50/50 molaire, produit selon le procédé décrit dans la demande de brevet britannique 2 145 422 ; polydispersité-environ 1,7 ; préparé à partir de 0,2% de glucose) dans 10 ml de chlorure de méthylène et on
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ajoute 75 mg d'acétate d'octréotide dissous dans 0,133 ml de méthanol. Pendant 1 minute, on mélange intimement, par exemple à l'aide d'un Ultra-Turax, à 20 000 tours/mn, ce qui donne une suspension de cristaux très fins d'octréotide dans la solution de polymère.
On pulvérise la suspension à l'aide d'une turbine à vitesse élevée (Niro Atomizer) et on sèche les fines gouttelettes dans un courant d'air chaud générant les microparticules. On recueille ces dernières au moyen d'un cyclone et on les sèche pendant la nuit à la température ambiante sous vide.
On lave les microparticules avec 1/15 molaire d'un tampon acétate à pH 4,0 pendant 5 minutes et on les sèche à nouveau à la température ambiante sous vide. Au bout de 72 heures, on tamise les microparticules (tamis 0,125 mm) pour obtenir le produit final.
On met les microparticules en suspension dans un véhicule et on les administre par voie intramusculaire à une dose de 5 mg/kg d'octréotide à des lapins blancs (bâtards de chinchilla) et par voie sous-cutanée à une dose de 10 mg/kg à des rats mâles.
Des échantillons de sang prélevés à intervalles réguliers indiquent des taux plasmatiques de 0,3 à 10,0 ng/ml chez les lapins et de 0,5 à 7,0 ng/ml chez les rats pendant 42 jours (déterminé par la méthode de dosage radioimmunologique).
EXEMPLE 5 :
En procédant comme décrit à l'exemple 4, on prépare des microparticules par séchage par nébulisation, la seule différence étant qu'on met en suspension l'acétate d'octréotide directement dans la solution du polymère, sans utiliser de méthanol.
On met les microparticules en suspension dans un véhicule et on les administre par voie sous-
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cutanée à une dose de 10 mg/kg d'octréotide à des rats mâles. Des échantillons de sang prélevés à intervalles réguliers indiquent des taux plasmatiques de 0,5 à 10,0 ng/ml chez les rats pendant 42 jours (déterminé par la méthode de dosage radioimmunologique).
EXEMPLE 6 :
Dans 2,5 ml de chlorure de méthylène, on dissout 1 g de poly (acide D, L,-lactique-co- acide glycolique) glucose (Mw - 46 000 ; 50/50 molaire préparé selon le procédé de la demande de brevet britannique 2 145 422 ; polydispersité-environ 1,7, préparé à partir de 0,2% de glucose), on ajoute 75 mg d'acétate d'octréotide dissous dans 0,125 ml d'eau déminéralisée et on mélange à fond, par exemple à l'aide d'un Ultra-Turax, pendant 1 minute à 20 000 tours/mn (phase interne eau-dans-l'huile).
On dissout 1 g de gélatine A dans 200 ml d'eau déminéralisée à 500C et on refroidit la solution à 200C (phase aqueuse externe). On mélange intimement la phase eau-dans-l'huile et la phase aqueuse. La phase interne eau-dans-l'huile se sépare sous forme de fines gouttelettes que l'on disperse de façon homogène dans la phase aqueuse externe. On agite lentement l'émulsion triple résultante pendant 1 heure. Le chlorure de méthylène s'évapore et les gouttelettes de la phase interne se durcissent sous forme de microparticules.
Après sédimentation des microparticules, on aspire le surnageant, on récupère les microparticules par filtration sous vide et on les rince avec de l'eau pour éliminer la gélatine.
On sèche, on tamise, on lave et on sèche à nouveau les microparticules en procédant comme décrit à l'exemple 4.
On met les microparticules en suspension dans un véhicule et on les administre par voie intramusculaire à une dose de 5 mg/kg d'octréotide à des
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lapins blancs (bâtards de chinchilla) et par voie sous-cutanée à une dose de 10 mg/kg à des rats mâles.
Des échantillons de sang prélevés à intervalles réguliers indiquent des taux plasmatiques de 0,3 à 15,0 ng/ml chez les lapins et de 0,5 à 8,0 ng/ml chez les rats pendant 42 jours (déterminé par la méthode de dosage radioimmunologique).
EXEMPLE 7 :
En procédant comme décrit à l'exemple 6, on prépare des microparticules selon la technique d'émulsion triple, mais en apportant les modifications suivantes : 1. On utilise 0,25 ml de tampon acétate à pH 4,0 à la place de 0,125 ml d'eau, pour préparer la phase interne eau-dans-l'huile.
2. Après avoir recueilli les microparticules, on effectue le rinçage avec 1/45 molaire de tampon acétate à pH 4,0, et non avec de l'eau.
3. On n'effectue pas de lavage ultérieur des micro- particules.
EXEMPLE 8 :
On prépare des microparticules selon la technique d'émulsion triple en procédant comme décrit à l'exemple 7, mais en préparant la phase interne eaudans-l'huile avec de l'eau contenant 0,7% de chlorure de sodium (poids/volume) et non pas avec un tampon acétate.
EXEMPLE 9 :
En procédant comme décrit à l'exemple 6, on prépare des microparticules, mais avec la différence que le principe actif est dispersé directement dans la solution du polymère et qu'on mélange la dispersion résultante avec la phase aqueuse contenant de la gélatine.
EXEMPLE 10 : Pamoate d'octréotide
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Dans 1 litre d'un mélange eau/dioxanne (1 : 1), on dissout 10,19 g d'octréotide base et 3,88 g d'acide embonique (10mM). On filtre le mélange réactionnel et on le lyophilise, ce qui donne une poudre jaune [ < xp D-+ 7, 5 (c = 0, 35, dans du DMF) d'hydrate de pamoate d'octréotide. Facteur = 1,4 (le facteur signifie le poids du lyophilisat par rapport au poids d'octréotide qu'il contient).
On peut utiliser le pamoate d'octréotide à la place de l'acétate dans les microparticules des exemples 1 à 9 ; il se caractérise par une excellente stabilité.
EXEMPLE 11 :
Sous agitation, on ajoute une solution de 1 g d'acide poly (D, L-lactique-co-glycolique) (50/50 molaire, Mu - 36 100) dans 20 ml de chlorure de méthylène à une solution de 100 mg de calcitonine dans 1,5 ml de méthanol. On effectue la séparation de phase par addition de 20 ml de fluide de silicone (Dow 360 Médical Fluid, 1000 cs). On ajoute le mélange résultant à une émulsion sous agitation comprenant 100 ml de tampon phosphate à pH 4,400 ml de n-heptane, 4 ml de Span 80 et 40 ml de fluide de silicone (Dow 360 Médical Fluid, 1000 cs). Après agitation pendant 10 minutes, on recueille les microparticules par filtration sous vide et on les sèche pendant la nuit sous vide à 37OC. On obtient 1,1 g de microparticules contenant 5,9% de calcitonine.
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EXEMPLE 12 :
A 100 mg de lypressine, on ajoute une solution de 9,9 g d'acide poly (D, L-lactique-coglycolique) (50/50 molaire, Mw = 44 300) dans 140 ml de chlorure de méthylène. On agite avec un agitateur magnétique la dispersion pendant 1 heure avant d'ajouter 140 ml de fluide de silicone (Dow 360 Médical Fluid, 1000 cs) et 2,5 ml de Span 80. On ajoute le
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mélange à 2000 ml d'heptane et on agite pendant 10 minutes. On recueille les microparticules par filtration sous vide, on les lave 3 fois avec de l'heptane et on les essore pendant 10 minutes pour les sécher. On lave la moitié de l'échantillon sous agitation dans de l'eau pendant 10 minutes. On ne lave pas l'autre moitié. On sèche ensuite les deux échantillons pendant la nuit à 300C sous vide. On obtient 10,65 g de microparticules.
L'échantillon lavé contient 0,5% de lypressine et l'échantillon non lavé avec de l'eau contient 0,6% de lypressine (déterminé par analyse).
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Extended release formulations of water soluble peptides
The present invention relates to sustained release formulations of medicaments.
In particular, the invention relates to sustained-release formulations of water-soluble peptides, for example somatostatin or a somatostatin analog, such as octreotide, in a biodegradable and biocompatible polymeric vehicle, for example a matrix or an envelope, by example in the form of an implant or preferably in the form of microparticles (also known as microcapsules or microspheres).
The invention also relates to such formulations having satisfactory peptide release profiles over a particular period of time.
Peptide drugs exhibit, after their administration, whether orally or parenterally, a low bioavailability in the blood due, for example to their high biodegradability in the body. When administered orally or nasally, they often also show little absorption through the membranes of the mucosa. It is therefore difficult to obtain therapeutically active blood levels for a long period of time.
It has been proposed to administer the peptide drugs parenterally, namely in the form of a deposition formulation in a biodegradable polymer, for example in the form of microparticles or of an implant, in order to allow their prolonged release after a time of presence. in the polymer, the latter protecting the peptide against the enzymatic and hydrolytic influences of biological fluids.
Although some depot formulations, intended for parenteral administration, of peptide drugs in a polymer in the form of
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microparticles or implant are known, in practice, satisfactory peptide release is only obtained in very few cases. Special measures ensuring constant release of peptides must therefore be taken to obtain serum drug levels which are therapeutically active and, if necessary, to avoid excessively high drug concentrations in serum which cause undesirable side effects.
The release of peptides is a function of various factors, in particular the type of peptide, and its presentation, for example in free form or in another form, for example in the form of salt, which can have an effect on its solubility in 'water. Another important factor is the choice of polymer from the extensive list of possibilities described in the literature.
Each polymer has its own biodegradation rate. Carboxy groups may form which influence the pH value in the polymer and also have an effect on the water solubility of the peptide and therefore on its release.
Other factors which can influence the release of peptides are the concentration of the peptide in the vehicle, its distribution in the polymer and the shape in the case of an implant and its size.
Until now, no somatostatin composition in a sustained release form intended for parenteral administration has been placed on the market, perhaps due to the fact that no composition having satisfactory blood levels n 'could be obtained.
Pharmaceutical compositions which are based on polymers and which make it possible to obtain a prolonged or delayed release of the active principle,
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are known in the art.
US Patent No. 3,773,919 describes controlled release formulations of active ingredient in which the active ingredient, for example a water-soluble peptide, is dispersed in a linear polymer of lactic acid or in a linear co-polymer of acid lactic and glycolic acid, biodegradable and biocompatible. The document, however, does not provide any data on drug release and somatostatin is not mentioned there. US Patent 4,293,539 describes antibacterial formulations in the form of microparticles.
U.S. Patent No. 4,675,189 describes sustained release formulations of nafarelin, an LHRH analog decapeptide, and other LHRH analogs in copolymers of lactic acid and glycolic acid, but gives no data. on the release of the active ingredient.
T. Chang, in J. Bioneng., Vol. 1, pages 25-32.1976, describes the sustained release of biologics, enzymes and vaccines from microparticles.
U.S. Patent Nos. 3,991,776, 4,076,798 and 4,118,470 describe polymers and copolymers of lactic acid and compositions containing them for use in surgery and for sustained release by biodegradation of the polymer.
European patent application No. 0 203 031 describes a series of octapeptides analogous to somatostatin, for example the compound RC-160 corresponding to the formula
EMI3.1
having a bridge between the remains-Cys-. Claim 18 mentions the possibility of presenting the somatos-
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tatines in the form of microcapsules with a copolymer of lactic acid and glycolic acid, but does not describe how to obtain constant serum levels which are therapeutically active.
U.S. Patent No. 4,011,312 indicates that continuous release of an antimicrobial drug, for example water-soluble polymyxin B, can be obtained from a matrix, in the form of an implant, of a copolymer of the lactic acid and glycolic acid with low molecular weight (less than 2000) and a relatively high content of glycolic acid units, when the implant is inserted into the mammary canal of a cow. The active principle is released in a very short time, due to the high content of glycolic acid units and the low molecular weight of the polymer, which promotes rapid biodegradation of the polymer and therefore rapid release of the active principle. A relatively high content of active ingredient also promotes rapid release of the latter.
The said patent does not however mention any somatostatin and does not provide any data on the release of the active principle.
European Patent No. 58481 mentions that a continuous release of a water-soluble peptide from a polylactic acid implant is stimulated by the lowering of the molecular weight of at least part of the molecules of the polymer, by the introduction of glycolic acid units in the polymer molecule, by increasing the sequencing character of the polymer when a copolymer of lactic acid and glycolic acid is used, and by increasing the content of active ingredient in the polymer matrix and the size of the implant.
Although somatostatin is mentioned as water-soluble peptides, the document does not describe any release profile of a somatostatin and no indication is given on the
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how to combine all these parameters to obtain, for example, constant levels of somatostatin in the serum for at least a week, for example a month.
European Patent No. 92918 indicates that it is possible to obtain a continuous release of peptides, preferably hydrophilic peptides, for a long time, when the peptide is incorporated in a hydrophobic polymer matrix, for example polylactic acid, which is makes it more accessible to water by introducing a hydrophilic unit, for example polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, dextran or polymethacrylamide, into its molecule. The hydrophilic nature of the amphiphilic polymer comes from ethyleneoxy groups in the case of a polyethylene glycol unit, from free hydroxy groups in the case of a polyvinyl alcohol unit or of a dextran unit, and from amide groups in the case of a polymethacrylamide unit.
Due to the presence of a hydrophilic unit in the polymer molecule, the implant will have the properties of a hydrogel after absorption of water. Somatostatin is mentioned as a hydrophilic peptide, but the document provides no release profile and gives no indication of the type of polymer preferred for this peptide and the molecular weight and number of hydrophilic groups that the polymer should have.
British Patent Application 2,145,422 indicates that sustained release of drugs of various types, for example vitamins, enzymes, antibiotics and antigens, can be achieved when the active ingredient is incorporated into a matrix, for example in the form of microcapsules or of implant, constituted by a polymer of a polyol, for example glucose or mannitol, comprising one or more ester groups with a polylactic acid, preferably
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at least 3. The remains of the polylactic acid preferably contain units of glycolic acid. Peptides, for example somatostatin, are however not mentioned as medicaments which can be used in such a sustained release form.
The invention therefore relates to sustained-release formulations, for example formulations of microparticles, of a medicament, especially of a somatostatin or a somatostatin analog, such as water-soluble and hormone-active octreotide, which provide satisfactory plasma levels of active principle, for example in a biocompatible and biodegradable polymer, for example in a polymer matrix obtained by microencapsulation. The polymer matrix can be a synthetic or natural polymer.
The microparticles of the invention can be prepared according to any of the usual techniques, for example according to the organic phase separation technique, the spray drying technique or the triple emulsion technique, according to which causes the polymer to precipitate with the active ingredient, and then the resulting product is hardened when using the phase separation or triple emulsion technique.
If necessary, the prolonged release formulations can be presented in the form of an implant.
The Applicant has found a particularly useful modification of the phase separation technique for preparing microparticles of any active ingredient.
The invention therefore also relates to a method for preparing microparticles comprising an active principle in a biodegradable and biocompatible vehicle, method according to which
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a) the polymeric material is dissolved in a suitable solvent in which the active principle is not soluble, b) in the solution of step a), a solution of the active principle is added and dispersed, by example an alcohol, which is not a solvent for the polymer, c) a phase-inducing agent is added to the dispersion of step b), to cause the formation of microparticles, d) an oil emulsion is added in water with the mixture of step c) to harden the microparticles, and e) the microparticles are recovered.
The Applicant has also found a particularly useful modification of the triple emulsion technique for the preparation of microparticles of any active principle.
The invention therefore relates to a process for the preparation of microparticles, process according to which (i) an water-in-oil emulsion formed is intimately mixed from an aqueous medium and an organic solvent immiscible in water , containing in one phase the active principle and in the other phase a biodegradable and biocompatible polymer, with an excess of an aqueous medium containing an emulsifying substance or a protective colloid, to form a water-in-oil-in emulsion water, without adding any substance retaining the active principle to the water-in-oil emulsion or without applying an intermediate step increasing the viscosity, (ii) the organic solvent is subjected to desorption and (iii) isolated and drying the resulting microparticles.
The invention also relates to the microparticles obtained according to these methods.
The invention also relates to
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a) a sustained-release formulation comprising a peptide in an ester of a polyol with a poly acid (40/60 to 60/40 lactic-co-glycolic), the polyol residue being chosen from alcohols containing a hydrocarbon chain in Cs-Cg and from 3 to 6 hydroxy groups and the mono- and di-saccharides, and the esterified polyol having at least 3 chains of poly (lactic-co-glycolic) acid, b) a sustained-release formulation comprising a peptide which is calcitonin, lypressin or somatostatin, in a linear copolymer
40/60 to 60/40 lactic acid and glycolic acid having a molecular weight Mw between 25,000 and 100,000 and a polydispersity Mw / Mn between 1.2 and 2, in a concentration between 0.2 and 10%,
preferably between 2 and
10% by weight of peptide, c) a sustained-release formulation comprising octreotide or one of its derivatives, or a salt of the compound, in a biodegradable and biocompatible polymeric vehicle.
The Applicant has found that a new salt of octreotide, pamoate, is very stable in such formulations.
The invention therefore relates to (i) octreotide pamoate and (ii) a process for the preparation of octreotide pamoate, a process according to which octreotide is reacted with pamoic acid (or a reactive derivative of this compound) .
The invention further relates to the formulations indicated above for use in the treatment of acromegaly or breast cancer.
The active ingredients used in the methods of the invention are preferably water-soluble active ingredients, for example peptides.
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The peptides used in the methods and formulations of the invention may be a calcitonin, such as salmon calcitonin, lypressin and somatostatin of natural origin and its synthetic analogs.
Somatostatin of natural origin which is one of the preferred compounds, is a tetradecapeptide corresponding to the formula
EMI9.1
This hormone is produced by the hypothalamus as well as by other organs, for example the gastrointestinal tract. Somatostatin intervenes at the pituitary level to inhibit the secretions of hGH (somatotropic hormone) and TSH (thyreostimulin). At the digestive level, it inhibits many secretory processes (in the pancreas, stomach, duodenum and small intestine).
By the expression "analogue or derivative of somatostatin" is meant any of the cyclic or linear chain polypeptides derived from natural somatostatin in which one or more amino acid residues have been deleted and / or substituted by one or more other amino acid residues and / or in which one or more functional groups have been replaced by one or more other functional groups and / or in which one or more groups have been replaced by one or more other isosteric groups. In general, the term encompasses all modified derivatives of a biologically active peptide which exert an effect qualitatively similar to that of unmodified somatostatin.
Somatostatin agonist analogs are therefore useful for replacing somatostatin
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of natural origin in its action on the regulation of physiological functions.
The preferred known somatostatin are:
EMI10.1
(name, common octreotide)
EMI10.2
where in each compound a) to i) there is a bridge between the amino acids marked with an asterisk (*) as indicated in the formula below.
The other preferred somatostatin are:
EMI10.3
[see Vale et al., Metabolism 27, Supp. 1, 139, (1978) 1
EMI10.4
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[see European patent application no 1295]
EMI11.1
[see Verber et al., Life Sciences, 34,1371-1378 (1984) and European patent application No. 70 021] also known as
EMI11.2
[see R. F. Nutt et al., Klin. Wochenschr. (1986) 64 (Suppl. VII)]
EMI11.3
(see. European patent application 200 188)
EMI11.4
and
EMI11.5
in which X signifies a cationic fixation specially
EMI11.6
(see European patent application 363589) and in the formulas above, a bridge being present between the amino acids marked with an asterisk (*).
The content of these publications is incorporated
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to this application for reference.
The expression derivative also includes the corresponding compounds comprising a carbohydrate residue.
When the somatostatin contains a carbohydrate residue, the latter is preferably coupled to an N-terminal amino group and / or to at least one amino group present in the side chain of the peptide, more preferably to an N-terminal amino group. Such compounds and their preparation are described, for example, in international application WO 88/02756.
The term octreotide derivatives includes derivatives comprising a residue
EMI12.1
in which the Cys remains are connected by a bridge.
Particularly preferred derivatives are
EMI12.2
the N "- [ <x-glucosyl- (1-4-deoxyfructosyl] -DPhe-Cys-PheDTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol and N "- [ss-deoxyfructosyl] - DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr -Cys-Thr-ol, each comprising a bridge between the residues-Cys-, preferably in the form of acetate, and described respectively in Examples 2 and 1 of the application mentioned above.
Somatostatin can be present, for example, in free form, in salt form, or in the form of complexes. The acid addition salts can be formed for example with organic acids, polymeric acids and mineral acids. Acid addition salts include, for example, the hydrochloride and acetate. The complexes are formed for example from somatostatin by the addition of mineral substances, for example mineral salts or hydroxides such as the salts of Ca and Zn and / or by the addition of organic polymeric substances.
Acetate is the preferred salt for such formulations, especially for microparticles
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causing a reduced plasma peak. The invention also relates to pamoate which is useful in particular for implants.
Pamoate can be obtained according to the usual methods, for example by reacting embonic acid (pamoic acid) with octreotide, for example in the form of free base. The reaction can be carried out in a polar solvent, for example at room temperature.
Somatostatin is indicated for use in the treatment of disorders for which long-term application of the drug is contemplated, for example for the treatment of disorders having an etiology including or associated with excess secretion of growth hormone, for example example in the treatment of acromegaly, for use in the treatment of gastrointestinal disorders, e.g. peptic ulcers, enterocutaneous and pancreatocutaneous fistulas, irritable bowel syndrome, dumping syndrome, watery diarrhea, acute pancreatitis and hormone producing gastrointestinal tumors (e.g. vipoma, GRF secreting tumors, glucagonoma, insulinoma, gastrinoma and carcinoid tumors) as well as gastrointestinal bleeding,
breast cancer and diabetes complications.
The polymeric vehicle can be prepared from biocompatible and biodegradable polymers, such as linear polyesters, branched polyesters consisting of linear chains developing from a polyol residue, for example glucose; the other esters are polylactic acid, polyglycolic acid, polyhydroxybutyric acid, polycaprolactone, polyalkylene oxalate, esters of a polyalkylene glycol with ring acids
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Krebs, for example citric acid and the like, and their copolymers.
The preferred polymers of the invention are linear polyesters and branched chain polyesters. Linear polyesters can be prepared by condensation of α-hydroxycarboxylic acids, for example lactic acid and glycolic acid, or by polymerization of lactone (acid dimer) (see for example US Patent No. 3,773 919).
The linear copolymers of lactic acid and glycolic acid preferred for use according to the invention advantageously have a molecular weight of between 25,000 and 100,000 and a polydispersibility Mw / Mn of, for example, between 1.2 and 2 .
The branched polyesters preferred for use according to the invention can be prepared using polyhydroxy compounds, for example polyols, such as glucose and mannitol, as initiators. These polyol esters are known and described in British patent application No. 2 145 422. The polyol contains at least 3 hydroxy groups and can have a molecular weight of up to 20,000 and at least 1, preferably at least 2 , for example on average 3 hydroxy groups of the polyol being in the form of an ester with a polylactic acid or a poly (lactic-co-glycolic) acid. Usually 0.2% glucose is used to initiate polymerization. The structure of the branched polyesters is star-shaped.
The polyester chains in the linear and star-shaped polymer compounds preferably used in the formulations of the invention are preferably chains of copolymers of α-carboxylic acids, lactic acid and glycolic acid, or of their cyclic dimers (lactones).
The molar ratios of lactic acid to acid
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glycolic are between about 75: 25 and 25: 75, for example between 60: 40 and 40: 60, the ratios between 55: 45 and 45: 55, for example between 55: 45 and 50: 50 being particularly preferred.
The star-shaped polymers are preferably obtained by reacting a polyol with the dilactide and preferably also with the diglycolide at an elevated temperature and in the presence of a catalyst, which makes it possible to open the lactone ring for polymerization. .
An advantage of the star structure polymer in the formulations of the invention is that its molecular weight can be relatively high, which gives physical stability, for example a certain hardness, to the implants and to the microparticles and prevents them from agglomerating. , while comprising relatively short chains of polylactic acid or of lactic acid copolymer; this allows a controllable biodegradation rate of the polymer, ranging from a few weeks to one or two months and a corresponding prolonged release of the peptide, the formulations obtained with these polymers being suitable, for example, for release over a month.
The polymers with a star structure preferably have a molecular weight (Mw) of between approximately 10,000 and 200,000, more preferably between 25,000 and 100,000, especially between 35,000 and 60,000 and a polydispersity of for example between 1.7 and 3.0, for example between 2.0 and 2.5. The intrinsic viscosities of polymers with a star structure with a molecular weight of 35,000 and 60,000 are respectively 0.36 and 0.51 dl / g in chloroform. A star structure polymer with a molecular weight of 52,000 has a viscosity of 0.475 dl / g in chloroform.
The expressions microspheres, microcapsules
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and microparticles are interchangeable expressions according to the invention and signify the microencapsulation of the peptides by the polymer, the peptide preferably being distributed through the polymer, which then becomes a matrix for the peptide.
In this case, the expression microspheres or more generally that of microparticles is preferably used.
Using the phase separation technique of the invention, it is possible, for example, to prepare the formulations of the invention by dissolving the polymeric vehicle in a solvent which is not a solvent for the peptide, and adding and dispersing a peptide solution in the composition constituted by the polymer and the solvent. A phase inducer is then added, for example a silicone fluid to allow micro-encapsulation of the peptide by the polymer.
The peak plasma effect can be greatly reduced by in situ precipitation of ultra fine particles of active ingredient, by adding a solution of the active ingredient to the polymer solution, before the separation phase. In the process described in the prior art, the dry particles are added directly to the polymer solution.
The release time of the peptide and the therapeutic activity of the peptide can be increased by a step of curing / washing the microparticles with a buffer / heptane emulsion. The prior art method includes a curing step not followed by subsequent washing or followed by a separate aqueous washing step.
An oil-in-water type emulsion can be used to wash and harden the microparticles and remove the unencapsulated peptide. Washing is used to remove the non-encapsulated peptide from the surface of the microparticles. Removal of excess peptide from
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microparticles decreases the initial plasma peak that characterizes many common formulations obtained by microencapsulation. Thus, greater release of the active ingredient in a given time interval is made possible by the formulations of the invention.
The emulsion also serves to remove the residual solvent from the polymer and the silicone fluid.
The emulsion can thus be added to the mixture of polymer and peptide, or the mixture can be added to the emulsion. However, the second solution is preferred.
The oil-in-water emulsion can be prepared using an emulsifier such as sorbitan mono-oleate (Span 80, ICI corp.) And the like, to form a stable emulsion. The emulsion can be buffered with a buffer which does not harm the peptide and the polymer matrix. The pH of the buffer can be between 2 and 8, preferably pH 4. The buffer can be prepared from acid buffers such as a phosphate, acetate buffer and the like ... The buffer can be replaced by water alone. It is also possible to use heptane, hexane, etc., as the organic phase of the emulsion.
The emulsion may contain dispersing agents such as silicone oil.
A preferred emulsion comprises heptane, a phosphate buffer at pH 4, silicone oil and sorbitan mono-oleate. When an initial release of the active principle is desired, the curing / washing step can be replaced by a curing step with an organic solvent such as heptane, hexane, etc.
As another alternative to the oil-in-water emulsion for hardening the microparticles, it is possible for example to use a solvent plus an emulsifier to harden the microparticles without washing, and
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a solvent plus an emulsifier for hardening followed by a separate washing step.
The oil-in-water emulsion can be used without a dispersing agent. However, the dispersing agent avoids the aggregation of dry particles of the microparticles caused by static electricity and makes it possible to reduce the level of residual solvent.
As examples of solvents intended for the polymer matrix, mention may be made of methylene chloride, chloroform, benzene, ethyl acetate, etc. The peptide is preferably dissolved in an alcoholic solvent, for example methanol, which is miscible with the polymer solvent.
The phase inducers (coacervation agents) are solvents miscible with the active principle / polymer mixture and cause the formation of embryonic microparticles before hardening; as phase inductors, silicone oils are preferred.
The oil-in-water emulsion can be prepared according to the usual methods, using heptane, hexane, etc., for the organic phase.
The microparticles of the invention can also be prepared according to the known method of spray drying. According to this process, the somatostatin or a solution of this peptide in an organic solvent, for example methanol, in water or in a buffer, for example of pH 3-8, is intimately mixed with a solution of the polymer in a solvent. organic, immiscible with the first, for example methylene chloride.
The solution, suspension or emulsion formed is then sprayed into a stream of air, preferably hot air. The microparticles formed are then collected, for example in a cyclone, and, if
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necessary, they are washed, for example in a buffer solution of pH between 3.0 and 8.0, preferably pH 4.0, or in distilled water, and they are dried under vacuum, for example at a temperature between 20 and 40 C. The washing step can be applied when the particles have a plasma peak in vivo and when it is not desired that the plasma peak be of excessive importance. As buffer, an acetate buffer can be used.
It is therefore possible to obtain microparticles having an improved somatostatin release profile in vivo.
The invention therefore also relates to the microparticles prepared according to this process. The invention further relates to an extended release formulation prepared by mixing a somatostatin or a solution of somatostatin in methanol, in water or in a pH 3-8 buffer, with a solution of a copolymer of lactic acids and glycolic in methylene chloride. The solution, emulsion or suspension obtained from somatostatin in the polymer solution is then sprayed in a stream of hot air, the microparticles are collected and washed in a buffer solution of pH between 3.0 and 8, 0 or in distilled water and dried under vacuum at a temperature between 20 and 40 C.
Compared to the microparticles prepared according to the phase separation technique, the microparticles thus obtained do not contain silicone oil, even in the form of traces, the silicone oil not being used in the spray drying technique.
The formulations of the invention can also be prepared using the triple emulsion process. According to this process, the peptide, for example octreotide, is dissolved in a solvent
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suitable, for example water, and it is thoroughly emulsified in a solution of the polymer, for example poly (D, L-lactic acid-co-glycolic acid) glucose (50/50) in a solvent in which the peptide is not soluble, for example methylene chloride.
Examples of suitable solvents for the polymer matrix include methylene chloride, chloroform, benzene, ethyl acetate, etc.
The resulting water-in-oil emulsion is emulsified in an excess of water containing an emulsifier, for example an anionic or nonionic surfactant or lecithin, or a protective colloid, for example gelatin, dextrin, carboxymethylcellulose , polyvinylpyrrolidone or polyvinyl alcohol, which continuously generates a triple emulsion (water-in-oil-in-water). The microparticles are formed by spontaneous precipitation of the polymer and are hardened by evaporation of the organic solvent. Gelatin is used to prevent agglomeration of microparticles. After the sedimentation of the microparticles, the supernatant is decanted and the microparticles are washed with water and then with an acetate buffer. It is then filtered and the microparticles are dried.
The peptide can also be dispersed directly in the polymer solution and then the resulting suspension is mixed with the aqueous phase containing gelatin.
The triple emulsion is known from American Patent No. 4,652,441. According to this patent, a solution of the active ingredient (1) is thoroughly mixed in a solvent in a first step, for example somatostatin in water (column 2, lines 31-32), with an excess of a solution of poly (lactic-co-glycolic acid) (2) in another solvent where the first solvent is insoluble, for example methylene chloride , which gives an emulsion of
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water in oil type (3) consisting of fine droplets of the solution (1) in the solution (2).
In the solution (1), a substance retaining the active principle is also dissolved (column 1, line 31), for example gelatin, albumin, pectin or agar. In a second step, the viscosity of the internal phase (1) is increased by using appropriate means, for example by heating, cooling, adjusting the pH, addition of metal ions or crosslinking, for example of gelatin with an aldehyde.
In a third step, the water-in-oil emulsion (3) is intimately mixed with an excess of water (column 7, lines 52-54), which gives a three-phase emulsion of the water-in type. - oil - in - water. If necessary, a so-called emulsifying agent can be present in excess water (column 7, line 56), chosen for example from anionic or nonionic surfactants, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol and gelatin. In the fourth step, the water-in-oil-in-water emulsion is subjected to "drying in water" (line 52). This means that the organic solvent in the oil layer is desorbed to give the microparticles.
Desorption of the solvent is carried out according to known methods (column 8, lines 3-5), for example by reducing the pressure with stirring (column 8, lines 5-7) or by bubbling nitrogen through the oily layer ( for example methylene chloride) (line 19). The microparticles formed are recovered by centrifugation or by filtration (lines 26-27) and the components which have not incorporated into the polymer are removed by washing with water (line 29). If necessary, the microparticles are heated under reduced pressure in order to better remove water and the solvent (for example methylene chloride from the wall of the microparticles) (lines 30-32).
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Although the above process is satisfactory for the preparation of the formulations of the invention, the substance retaining the active ingredient mentioned above, for example gelatin, albumin, pectin or agar, is always included in the microparticles resulting.
The Applicant has found that by omitting the addition, in solution a), of the substance retaining the active principle as well as the step serving to increase the viscosity of the internal phase and that by maintaining the addition of a emulsifying substance or a protective colloid, such as gelatin, in the excess water of the triple water-in-oil-in-water emulsion, satisfactory microparticles can still be obtained. In addition, the microparticles do not contain any substance retaining the active ingredient and only a very small amount of methylene chloride.
The invention therefore relates to a process for the preparation of microparticles, a process according to which a mixture of: a) an active ingredient, preferably a somatostatin, especially octreotide, is mixed in an aqueous medium, preferably water or a tampon, preferably in a weight / volume ratio of 0.8 to
4.0 g / 1 to 120 ml, especially 2.5 / 10, and in a pH 3-8 buffer, especially an acetate buffer, with b) a solution of a polymer, preferably a poly (lactic acid) -co-glycolic) as mentioned above, in an organic solvent immiscible with the aqueous medium, for example methylene chloride, preferably in a weight / volume ratio of
40 g / 90 to 400 ml, especially 40/100, so that the weight ratio of the active principle to the polymer is preferably from 1/10 to 50,
specially from
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1/16, and the volume / volume ratio of the aqueous medium to the organic solvent is from 1 / 1.5 to 30, especially from 1/10, the water-in-oil emulsion from a) is intimately mixed with b) ) thus obtained with c) an excess of an aqueous medium, preferably water or a buffer, for example an acetate or phosphate buffer, preferably at pH 3-8, containing an emulsifying substance or a protective colloid, preferably in a concentration between
0.01 and 15.0%, in particular gelatin, especially in a concentration between
0.1 and 3%, in particular 0.5% by weight, the mixing preferably being carried out at a speed such that the volume / volume ratio of ab) / c) is from 1/10 to 100, especially from 1 / 40,
without adding any substance retaining the active ingredient to the water-in-oil emulsion or without performing an intermediate step to increase the viscosity, the embryonic microparticles are hardened in the water-in-oil-in emulsion formed water, by desorption, preferably by evaporation of the organic solvent, preferably methylene chloride, and the microparticles generated are isolated, optionally washed and dried.
The invention also relates to a variant of the method, according to which the active principle is dispersed directly in the solution of the polymer, and the resulting dispersion is then mixed with the aqueous phase containing the gelatin.
The invention also relates to the microparticles prepared according to these methods. Like the microparticles prepared using the spray drying technique, they do not contain silicone oil. Compared to microparticles prepared according to the known triple emulsion process, they do not
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contain no protective colloid.
The sustained-release formulations can also be prepared according to other known methods, for example when the peptide is sufficiently stable for the preparation of an implant, by heating the microparticles of peptide, for example a somatostatin, in a poly (lactic acid). -glycolic), especially as described above, or by heating a mixture of the peptide and the polymer, at a temperature of for example between 70 and 100 ° C., and by extrusion and cooling of the compact mass. The extrusion product is then cut and optionally washed and dried.
The formulations of the invention are advantageously prepared under aseptic conditions.
The formulations of the invention can be used in a depot form, for example in the form of injectable microparticles or implants.
They can be administered according to the usual methods, for example by subcutaneous or intramuscular injection, for example according to the known indications for the drug which they contain.
The sustained-release formulations containing octreotide can be administered for all known indications of octreotide or its derivatives, for example those described in British patent application 2 199 829, as well as for the treatment of acromegaly or breast cancer.
The microparticles of the invention can have a diameter of between approximately 1 and 250 microns; they preferably have a diameter between 10 and 200, especially between 10 and 130, for example between 10 and 90 microns. The implants can be, for example, around 1 and 10 mm 3. The quantity of
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active ingredient, that is to say the peptide present in the formulation, depends on the necessary dose which must be released per day and therefore on the biodegradation of the polymer used to encapsulate it. The exact amount of peptide can be determined by bioavailability tests.
The formulations can contain the peptide in an amount of at least 0.2, preferably 0.5 to 20% by weight relative to the polymer matrix, preferably between 2.0 and 10, especially between 3.0 and 6% by weight.
The release time of the peptide from the microparticles can be between 1 or 2 weeks to around 2 months.
The sustained-release formulation is advantageously a formulation comprising a somatostatin, for example octreotide, in a biodegradable and biocompatible polymeric vehicle, which formulation, when administered to a rat subcutaneously at a dose of 10 mg of somatostatin per kg, gives a plasma somatostatin concentration of at least 0.3 ng / ml and preferably less than 20 ng / ml for 30 days, or advantageously for 60 days, or else, when administered to a rabbit intramuscularly at a dose of 5 mg / kg, gives a plasma somatostatin concentration of at least 0.3 ng / ml for 50 days and advantageously less than 20 ng / ml.
Other preferred properties of the depot formulations obtained containing a somatostatin, for example octreotide, are the following, depending on the preparation process used: Phase separation technique
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Rabbit: 5 mg somatostatin / kg, intramuscularly Delay (0-42 days) 76% Average plasma level (cp, ideal) (0-42 days) 4 ng / ml AUC (0-42 days) 170 ng / ml x days Spray drying technique Rat: 10 mg somatostatin / kg, subcutaneously Delay (0-42 days)> 75% Average plasma level (cp, ideal) (0-42 days) 4-6 ng / ml AUC (0-42 days) 170-210 ng / ml x days Rabbit: 5 mg somatostatin / kg, intramuscularly Delay (0-43 days)> 75% Average plasma level (cp, ideal) (0-43 days) 4-6 ng / ml AUC (0-43 days) 200-240 ng / ml x days Triple emulsion technique.
Rat: 10 mg somatostatin / kg, subcutaneously Delay (0-42 days)> 75% Average plasma level (cp, ideal) (0-42 days) 4-6.5 ng / ml AUC (0- 42 days) 170-230 ng / ml x days
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Rabbit: 5 mg somatostatin / kg, intramuscularly Delay (0-42-43 days)> 74% Average plasma level (cp, ideal) (0-42-43 days) 3.5-
6.5-ng / ml AUC (0-42-43 days) 160-270 ng / ml x days
The invention therefore also relates to formulations comprising a somatostatin, preferably octreotide or an octreotide analog, having the following properties: 1. A delay of at least 70%, preferably at least
74%, for example at least 75%, 80%, 88% or at least 89% for a period from 0 to 42 or
43 days and / or 2.
An average plasma concentration (ideal cp) in rats of 2.5-6.5, preferably 4-6.5 ng / ml for a period ranging from 0 to 42 days, after administration of 10 mg of somatostatin by route subcutaneous and / or an average plasma concentration in rabbits of 3.5-6.5, for example 4-6.5 ng / ml for a period ranging from 0 to 42 or 43 days, after administration of 5 mg somatostatin intramuscularly and / or 3.
An area under the curve for a period ranging from 0 to 42 days of at least 160, preferably between 160 and 230 ng / ml x days in the rat, after administration of 10 mg of somatostatin subcutaneously and / or an area under the curve for a period ranging from 0 to 42 or 43 days of at least 160, preferably between 160 and
275, for example between 200 and 275 ng / ml x day in rabbits, after administration of 5 mg of somatostatin by the intramuscular route.
To quantitatively characterize
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sustained release formulations described above, using the area deviation method (AD = Area Deviation) described by F. Nimmerfall and J. Rosenthaler; Intern. J. Pharmaceut. 32,1-6 (1986).
This method calculates the surface deviations of the experimental plasma profile from the ideal profile which is a constant mean plasma concentration (ideal -cp) obtained by converting the area under the curve (AUC) of plasma levels into a rectangle of the same surface. function of time obtained experimentally. The delay is calculated in% as follows:% delay-100 x (1-AD / ASC)
According to this method, the total plasma profile measured during a predetermined time is characterized by a single numerical index.
In Proc. Natl. Acad. Self. USA, 85 (1988) 5688-5692, FIG. 4 describes a plasma level profile in the rat of an octapeptide analog of somatostatin, corresponding to the formula
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However, a clear comparison cannot be established with the plasma levels reported above and obtained in the rat with the compositions of the invention, since the profile of the plasma levels described in this document is based on another method of administration, namely the intramuscular injection and that, what is much more important, there is no precise indication on the concentration of active ingredient in the microcapsules and on the administered dose, the document confining itself to indicating a concentration of active ingredient in the microcapsules between 2 and 6% and a dose of 25 to 50 mg of microcapsules for 30 days,
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although the assessments covered at least 45 days. In addition, the type of poly (DL-lactic-co-glycolic acid) used is not specified. Given the insufficiency of data, this document can therefore in no way be considered to give any teaching in particular on the well-defined formulations of the invention having the advantages already mentioned, especially the plasma levels as reported previously. .
The following examples illustrate the present invention without in any way limiting its scope. In these examples, Mw signifies the average molecular weight of the polymer determined by exclusion chromatography (GPC) using polystyrene as a reference substance.
EXAMPLE 1:
1 g of poly (D, L-lactic eco-glycolic acid) (50/50 molar, Mw = 45,000; poly-dispersity-about 1.7) is dissolved in 15 ml of methylene chloride with magnetic stirring and added 75 mg of octreotide acetate dissolved in 0.5 ml of methanol.
15 ml of silicone oil (Dow 360 Medical Fluid brand, 1000 cs) are added to the polymer-peptide mixture. The resulting mixture is added to a stirred emulsion containing 400 ml of n-heptane, 100 ml of
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phosphate buffer at pH 4, 40 ml of Dow 360 Medical Fluid, 350 cs and 2 ml of Span 80 (emulsifier). The mixture is further stirred for at least 10 minutes. The resulting microparticles are recovered by vacuum filtration and dried overnight under vacuum. The yield is approximately 90% in microparticles with a size between 10 and 40 microns.
The microparticles are suspended in a vehicle and administered intramuscularly at a dose of 4 mg octreotide to rabbits (New Zealand). Blood samples taken from
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regular intervals indicate plasma levels of 0.5 to 1.0 ng / ml for 30 days (determined by the radioimmunoassay method).
EXAMPLE 2:
In 25 ml of ethyl acetate with magnetic stirring, 1 g of poly (D, L-lactic acid-glycolic acid) -glucose is dissolved, prepared according to the method described in British patent application 2,145,422 (Mw = 45 000; 55/45 molar; polydispersity = about 1.7; prepared from 0.2% glucose) and 75 mg of octreotide acetate dissolved in 3 ml of methanol are added. To this polymer-peptide mixture, 25 ml of silicone oil (Dow 360 Medical Fluid brand, 1000 cs) are added. The resulting mixture is added to the emulsion described in Example 1. The mixture is further stirred for at least another 10 minutes. The resulting microparticles are recovered by vacuum filtration and dried overnight under vacuum.
A yield of more than 80% is obtained in microparticles with a size between 10 and 40 microns.
The microparticles are suspended in a vehicle and administered intramuscularly at a dose of 4 mg octreotide to rabbits (New Zealand). Blood samples taken at regular intervals indicate plasma levels of 0.5-2 ng / ml for 21 days (determined by the radioimmunoassay method).
EXAMPLE 3:
A solution of 1.5 g of octreotide acetate in 20 ml of methanol is added with stirring to a solution of 18.5 g of poly (D, L-lactic-glycolic coacid acid) glucose (50: 50 molar, Mw 45,000) in 500 ml of methylene chloride. The phase separation is carried out by adding 500 ml of Dow 360 Medical Fluid (1000 cs) and 800 ml of Dow 360 Medical Fluid (350 cs) to the suspension of the peptide and the poly-
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mother. The resulting mixture is added to an emulsion with stirring comprising 1800 ml of n-heptane, 2000 ml of sterile water and 40 ml of Span 80. After stirring for 10 minutes, the microparticles are collected by vacuum filtration.
Half of the product is dried overnight under vacuum at 37 ° C. The residual level of methylene chloride is 1.2%.
With stirring, the other half of the product is washed with 1000 ml of ethanol containing 1 ml of Span 80. After stirring for 1 hour, the ethanol is decanted and the microparticles are stirred in 1000 ml of n-heptane containing 1 ml of Span 80. After stirring for 1 hour, the microparticles are collected by vacuum filtration and they are dried overnight under vacuum at 37 C. The residual methylene chloride level of the microparticles washed in this way has been reduced by 1, 2 to 0.12%.
The combined yield of the product is 91% (18.2 g) in microparticles containing 5.6% octreotide; the average diameter is 24 microns and the residual heptane level is 1.5%.
The microparticles are suspended in a vehicle and injected intramuscularly at a dose of 5 mg / kg of octreotide to white rabbits. Blood samples taken at regular intervals indicate plasma levels of 0.3 to 7.7 ng / ml for 49 days (determined by the radioimmunoassay method).
EXAMPLE 4:
With magnetic stirring, 1 g of poly (D, L-lactic-co-glycolic acid) glucose (Mw - 46,000; 50/50 molar), dissolved according to the method described in British patent application 2 145 422, is dissolved; polydispersity-about 1.7; prepared from 0.2% glucose) in 10 ml of methylene chloride and
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add 75 mg of octreotide acetate dissolved in 0.133 ml of methanol. For 1 minute, intimately mixing, for example using an Ultra-Turax, at 20,000 rpm, which gives a suspension of very fine octreotide crystals in the polymer solution.
The suspension is sprayed using a high speed turbine (Niro Atomizer) and the fine droplets are dried in a stream of hot air generating the microparticles. These are collected using a cyclone and dried overnight at room temperature in vacuo.
The microparticles are washed with 1/15 molar of an acetate buffer at pH 4.0 for 5 minutes and again dried at room temperature under vacuum. After 72 hours, the microparticles are sieved (0.125 mm sieve) to obtain the final product.
The microparticles are suspended in a vehicle and administered intramuscularly at a dose of 5 mg / kg of octreotide to white rabbits (chinchilla bastards) and subcutaneously at a dose of 10 mg / kg to male rats.
Blood samples taken at regular intervals indicate plasma levels of 0.3 to 10.0 ng / ml in rabbits and 0.5 to 7.0 ng / ml in rats for 42 days (determined by the method of radioimmunoassay).
EXAMPLE 5:
By proceeding as described in Example 4, microparticles are prepared by spray drying, the only difference being that the octreotide acetate is suspended directly in the polymer solution, without using methanol.
The microparticles are suspended in a vehicle and administered by sub-route
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cutaneous at a dose of 10 mg / kg of octreotide to male rats. Blood samples taken at regular intervals indicate plasma levels of 0.5-10.0 ng / ml in rats for 42 days (determined by the radioimmunoassay method).
EXAMPLE 6
In 2.5 ml of methylene chloride, 1 g of poly (D, L, -lactic-co-glycolic acid) glucose (Mw - 46,000; 50/50 molar, prepared according to the process of the patent application) is dissolved. British 2,145,422; polydispersity-about 1.7, prepared from 0.2% glucose), 75 mg of octreotide acetate dissolved in 0.125 ml of demineralized water are added and mixed thoroughly, for example using an Ultra-Turax, for 1 minute at 20,000 rpm (internal water-in-oil phase).
1 g of gelatin A is dissolved in 200 ml of demineralized water at 500C and the solution is cooled to 200C (external aqueous phase). The water-in-oil phase and the aqueous phase are intimately mixed. The internal water-in-oil phase separates in the form of fine droplets which are uniformly dispersed in the external aqueous phase. The resulting triple emulsion is slowly stirred for 1 hour. The methylene chloride evaporates and the droplets in the internal phase harden in the form of microparticles.
After sedimentation of the microparticles, the supernatant is aspirated, the microparticles are collected by vacuum filtration and rinsed with water to remove the gelatin.
The microparticles are dried, sieved, washed and dried again, as described in Example 4.
The microparticles are suspended in a vehicle and administered intramuscularly at a dose of 5 mg / kg of octreotide at
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white rabbits (chinchilla bastards) and subcutaneously at a dose of 10 mg / kg to male rats.
Blood samples taken at regular intervals indicate plasma levels of 0.3 to 15.0 ng / ml in rabbits and 0.5 to 8.0 ng / ml in rats for 42 days (determined by the method of radioimmunoassay).
EXAMPLE 7:
By proceeding as described in Example 6, microparticles are prepared according to the triple emulsion technique, but with the following modifications: 1. 0.25 ml of acetate buffer at pH 4.0 is used instead of 0.125 ml of water, to prepare the internal water-in-oil phase.
2. After collecting the microparticles, the rinsing is carried out with 1/45 molar of acetate buffer at pH 4.0, and not with water.
3. No subsequent washing of the microparticles is carried out.
EXAMPLE 8:
Microparticles are prepared according to the triple emulsion technique by proceeding as described in Example 7, but by preparing the internal phase in water with oil containing water containing 0.7% of sodium chloride (weight / volume ) and not with an acetate pad.
EXAMPLE 9:
By proceeding as described in Example 6, microparticles are prepared, but with the difference that the active principle is dispersed directly in the polymer solution and that the resulting dispersion is mixed with the aqueous phase containing gelatin.
EXAMPLE 10 Octreotide pamoate
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In 1 liter of a water / dioxane mixture (1: 1), 10.19 g of octreotide base and 3.88 g of embonic acid (10 mM) are dissolved. The reaction mixture is filtered and lyophilized, which gives a yellow powder [ <xp D- + 7.5 (c = 0.35, in DMF) of octreotide pamoate hydrate. Factor = 1.4 (the factor means the weight of the lyophilisate in relation to the weight of octreotide it contains).
Octreotide pamoate can be used in place of acetate in the microparticles of Examples 1 to 9; it is characterized by excellent stability.
EXAMPLE 11:
With stirring, a solution of 1 g of poly (D, L-lactic-co-glycolic acid) (50/50 molar, Mu - 36,100) in 20 ml of methylene chloride is added to a solution of 100 mg of calcitonin in 1.5 ml of methanol. The phase separation is carried out by adding 20 ml of silicone fluid (Dow 360 Medical Fluid, 1000 cs). The resulting mixture is added to an emulsion with stirring comprising 100 ml of phosphate buffer at pH 4.400 ml of n-heptane, 4 ml of Span 80 and 40 ml of silicone fluid (Dow 360 Medical Fluid, 1000 cs). After stirring for 10 minutes, the microparticles are collected by vacuum filtration and dried overnight under vacuum at 37 ° C. 1.1 g of microparticles containing 5.9% calcitonin are obtained.
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EXAMPLE 12:
To 100 mg of lypressin, a solution of 9.9 g of poly (D, L-lactic-coglycolic acid) (50/50 molar, Mw = 44,300) in 140 ml of methylene chloride is added. The dispersion is stirred with a magnetic stirrer for 1 hour before adding 140 ml of silicone fluid (Dow 360 Medical Fluid, 1000 cs) and 2.5 ml of Span 80. The
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mixture with 2000 ml of heptane and the mixture is stirred for 10 minutes. The microparticles are collected by vacuum filtration, washed 3 times with heptane and drained for 10 minutes to dry them. Half of the sample is washed with stirring in water for 10 minutes. We don't wash the other half. The two samples are then dried overnight at 300C under vacuum. 10.65 g of microparticles are obtained.
The washed sample contains 0.5% lypressin and the sample not washed with water contains 0.6% lypressin (determined by analysis).