AT519072B1 - Verfahren zur potentiometrischen Detektion von Escherichia Coli Bakterien mit Hilfe des elektroaktiven Substrats - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren für den schnellen Nachweis von Mikroorganismen insbesondere von E. coli in einem wässrigen Medium, wobei der Nachweis dadurch erfolgt, dass basierend auf der spezifischen Enzymaktivität der Mikroorganismen ein zugesetztes Substrat 8-Hydroxychinolin ß-D-Glukuronide bzw. 8- Hydroxychinolin ß-D-Glukuronide Natrium-Salz und das gebildete Spaltprodukt 8-Hydroxychinolin oxidiert wird und ein dem Reaktionsprodukt proportionales Signal elektrisch gemessen wird, wobei mittels einer Elektrode eine Potentialdifferenz von 0 mV bis 800 mV zyklisch durchlaufen wird, wobei der über die Elektrode fließende elektrische Strom im Spannungsbereich zwischen 400mV und 600mV zur Auswertung herangezogen wird. Mit diesem Ansatz kann spezifisch eine Koloniebildende Einheit pro ml innerhalb von 10 h erkannt werden. Die Methode erlaubt eine klare und empfindliche Identifizierung von E. coli ohne Störungen durch andere Bakterienstämme.

Description

Beschreibung

VERFAHREN ZUR POTENTIOMETRISCHEN DETEKTION VON ESCHERICHIA COLI BAKTERIEN MIT HILFE ELEKTROAKTIVER SUBSTRATE

[0001] Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für den schnellen Nachweis von Mikroorganismen insbesondere von E. coli in einem wässrigen Medium, wobei der Nachweis dadurch erfolgt, dass basierend auf der spezifischen Enzymaktivität der Mikroorganismen ein zugesetztes Substrat 8-Hydroxychinolin ß-D-Glukuronide bzw. 8-Hydroxychinolin ß-D-Glukuronide Natrium-Salz und das gebildete Spaltprodukt 8-Hydroxychinolin oxidiert wird und ein dem Reaktionsprodukt proportionales Signal elektrisch gemessen wird.

[0002] Die Bestimmung des Gehalts an Mikroorganismen in einer wässrigen Lösung ist insbesondere im Gesundheitsbereich, im Trinkwasser und in der Nahrungsmittelindustrie von großer Bedeutung.

[0003] Heutzutage wird üblicherweise das zu untersuchende Medium beprobt und anschließend der Gehalt an Mikroorganismen durch Kultivierung auf speziellen Medien unter kontrollierten Umgebungsbedingungen dargestellt, indem die gewachsenen Kolonien an Mikroorganismen gezählt werden. Der Größte Nachteil dieser dokumentierten Verfahren liegt in der Verfahrensdauer, die typischerweise mindestens 20-24 Stunden benötigt bis ausgebildete Kolonien gezählt werden können.

[0004] Der Nachweis von E.coli an Hand des Enzyms Glukuronidase mit dem Substraten 8-Hydroxychinolin- Glukuronid wurde bereits in KR 20120049974 A und von Kim und Han, 2013, Journal of Environmental Management, Vol. 130, Seiten 267-275 beschrieben.

[0005] Der Erfindung liegt demnach die Aufgabe zugrunde, die Detektionszeit von Mikroorganismen, im Besonderen Escherichia coli, im Vergleich zur klassischen Kultivierungsmethodik zu verkürzen.

[0006] Dies wird erfindungsgemäß durch die kennzeichnenden Merkmale des Anspruchs 1 erreicht. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen werden gemäß den Unteransprüchen vorgeschlagen.

[0007] Die Erfindung wird anhand eines Ausführungsbeispiels gemäß den Figuren 1-3 näher erläutert, wobei für die Analyse von Wasserproben eine definierte Wassermenge (100 ml) filtriert und die enthaltenen Bakterien auf dem 0,22 pm Filter aufgefangen (1, 2) werden. Durch die Zugabe von 200 μΙ LB-Medium (pH 7) beginnen die Bakterien bei 44,5°C zu wachsen (3). Das enthaltene MetGlu (7,9 mM) induziert die Produktion des Enzyms ß-D-Glukuronidase (GUS) (4). Das ebenfalls im Medium vorhandene Substrat 8-HQG bzw. 8-HQG-Natriumsalz (je 3 mM) wird durch das GUS Enzym in 8-HQ gespalten (Figur 2)(5). Dieses Spaltungsprodukt wird anschließend mittels eines Potentiostats voltametrisch analysiert (Figur 3) (6). Hierbei wurden Probenaliquots auf Siebdruckelektroden (SPE; CE Gegenelektrode, WE Arbeitselektrode, RE Referenzelektrode) transferiert und das enthaltene 8-HQ mittels zyklischer Voltametrie durch Anlegen einer Spannung (0-800 mV) oxidiert. Das erhaltene Stromsignal liefert einen Peak zwischen 400- 600 mV (Figur 3). Die Ergebnisse von reinen Enzymversuchen mit 2,5-250 Units GUS Enzym zeigten im Vergleich zu den Kontrollen (nur LB Medium, LB mit Substrat bzw. LB mit Enzym) ein deutliches Signal im Spannungsbereich 400-600 mV. Angepasst von Lei (2008, 2009).

[0008] Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf das oben kurz zusammengefasste Ausführungsbeispiel, welches in den Figuren 1-3 schematisch dargestellt ist, im Folgenden im Detail erläutert.

[0009] Escherichia coli sind Indikatororganismen für fäkale Verunreinigungen und können eine ernste Gefahr für den Menschen darstellen. Das Ziel der Studie war die Entwicklung eines neuen elektrochemischen Verfahrens für einen schnellen und sensitiven Nachweis von E. coli. In diesem neuen Verfahren wird die ß-D-Glukuronidase (GUS) - Enzymproduktion durch Zugabe von 7.9 mM Methyl-ß-D-Glukuronid-Natriumsalz induziert. Durch die GUS-Aktivität wird das beigemengte Substrat 8-Hydroxychinolin ß-D-Glukuronid bzw. 8-Hydroxychinolin ß-D-Glukuro-nid Natrium-Salz (8-HQG bzw. 8-HQG-SS, je 3 mM) zur elektroaktiven Verbindung 8-Hydroxy-chinolin (8- HQ) gespalten. Dieses Spaltungsprodukt kann auf der Arbeitselektrode eines Po-tentiostats oxidiert werden und weist einen Stromanstieg in einem spezifischen Spannungbereich - zwischen 400-600 mV (bei pH 7) - aus.

[0010] Die Lage des Signals ist vom pH-Wert der Lösung abhängig. Das erhaltene Stromsignal gibt Rückschluss auf die in der Probe vorhandenen E. coli Zellen. Eine Schwellwertüberschreitung von 2 μΑ (Mittelwert der Stromausgangssignale zwischen 400-600 mV) gilt als Indiz für die Präsenz von E. coli Bakterien. Das allgemeine Prinzip des Assays wurde zuerst mit verschiedenen Konzentrationen einer reinen Enzymlösung getestet und überprüft, bevor lebendene E. coli-Zellen untersucht wurden. Mit diesem Ansatz konnten wir spezifisch eine Kolonie-bildende Einheit (KBE) pro ml innerhalb von 10 h erkennen. Die entwickelte Methode erlaubt eine klare und empfindliche Identifizierung von E. coli ohne Störungen durch andere Bakterienstämme, die auch untersucht wurden.

[0011] Die Eigenschaft von E. coli die Enzyme ß-D-Galactosidase (GAL) und ß-D-Glukuro-nidase (GUS) zu produzieren sowie deren spezifische Enzymaktivität kann in Assays für den Nachweis dieser Bakterien verwendet werden. Unser Ziel war die Entwicklung eines ampero-metrischen Biosensor-Systems basierend auf der Aktivität von ß-D-Glukuronidase zum Nachweis von Escherichia coli in Wasserproben. Da dieses Enzym in E. coli-Stämme meist reichlich vorhanden ist (etwa 95% besitzen GUS), ist es ein vielversprechender Ansatz, um spezifisch diese Art von Bakterien zu detektieren. Das 8-Hydroxychinolin-ß-D-glucuronid (8-HQG) wurde als "elektroaktives" Substrat für die ß-D-Glucuronidase ausgewählt. Das entsprechende hydrolysierte Produkt, 8-Hydroxychinolin (8-HQ), kann voltametrisch durch Oxidation unter Verwendung eines Potentiostat erfasst werden, was zu einer erhöhten Stromabgabe bei einem bestimmten Spannungsbereich führt (Lei et al., 2010).

[0012] Es wurden im Handel erhältliche ß-D-Glukuronidase Enzym von Escherichia coli (GUS; EC 3.2.1.31), ß-D-Galaktosidase von Escherichia coli (GAL, EC 3.2.1.23), Methyl ß-D-Glukuronide Natriumsalz (MetGlu) und 8-Hydroxychinoline Glukuronide (8-HQG) wurden bei Sigma- Aldrich (Österreich) bestellt. LB-Medium wurde von Carl Roth (Deutschland) erhalten. Für die elektrochemische Analyse, wurden Siebdruck-Elektroden (screen printed electrodes, SPE) von Gwent Electronic Materials Ltd. (Vereinigtes Königreich) erworben. Diese siebgedruckten Elektroden sind besonders für elektrochemische Sensoren und Biosensoren in Verbindung mit Enzymen geeignet. Sie bestehen aus Kohlenstoff/Graphit-Paste für die Arbeits- und Gegenelektrode in Kombination mit Ag/AgCI-Referenzelektroden. Die SPE verwendeten Elektroden sind speziell für Arbeiten mit kleinen Probenvolumina (25 - 100 μΙ) designt. Die Zyklo-voltametrie Messungen wurden mit dem selbstgebauten Potentiostat - "EcoStat" mit der entsprechenden Software "PotCon" - durchgeführt (Ettenauer et al., 2015, 2016; Kellner et al., 2015, 2016). Dieses Gerät wurde zuvor mit drei verschiedenen Instrumenten bewertet und validiert (Kellner et al., 2015).

[0013] Um den entworfenen Assay zu testen, wurde für alle Experimente der E. coli Stamm ATCC 11303 von der American Type Culture Collection, ATCC (USA) verwendet.

[0014] Als Negativkontrollen und um die Kreuzreaktivität des Verfahrens zu untersuchen wurden die folgenden Stämme von ATCC angewandt: Bacillus atrophaeus (ATCC 9372), Bre-vundimonas diminuta (ATCC 19146), Citrobacter freundii (ATCC 8090), Pseudomonas putida (ATCC 49128) und Pseudomonas stützen (ATCC 17588). Der E. coli Stamm wurde mit 190 Umdrehungen pro Minute (MRC LM- 5902-lnkubator, Vereinigtes Königreich) in flüssigem LB-Medium bei 37°C unter Rühren über Nacht gezüchtet. Alle anderen Stämme wurden gemäß den Anweisungen des Lieferanten in LB-Flüssigmedium bei 30°C oder 37°C inkubiert. Das bakterielle Wachstum der Kulturen wurde mit spektrophotometrischen Messungen der optischen Dichte bei 600 nm (OD600 nm; Ultrospec 3300 pro, GE Healthcare Life Sciences, Österreich) überwacht. Für den Nachweis von sehr niedrigen Zellzahlen wurden die über Nacht

Stammkulturen seriell verdünnt in LB-Medium (10-fach-Schritte). Um die Lebendzellzahl zu bestimmen wurden 100 μΙ bzw. 1 ml der Verdünnungen (10'5 bis 10"9 Verdünnungen der Stammkultur) auf festem LB-Agar-Platten in dreifacher Ausfertigung ausplattiert. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die gewachsenen Kolonien gezählt, um die Kolonie bildenden Einheiten (KBE) pro Milliliter zu berechnen. Diese Daten wurden mit den berechneten Zellzahlen, die aus dem gemessenen OD-Werten der Stammkulturen erhalten wurden, verglichen. Alle verwendeten Medien und Plastikwaren wurden durch Autoklavieren für 21 min bei 121° C sterilisiert. In jeder Reaktion war eine positive und mindestens eine negative Kontrolle enthalten um den Erfolg der Versuche zu überprüfen, sowie die Möglichkeit falsch negativer Ergebnisse und Kontaminationen auszuschließen.

[0015] Die prominentesten Bakterien in unserer normalen Darmflora sind Escherichia coli. Die meisten Stämme sind harmlos und helfen uns unsere tägliche Nahrung zu verdauen. Allerdings können einige Serotypen schwere Krankheiten verursachen und sogar zum Tod führen. Daher ist die Identifizierung und Quantifizierung von Kolibakterien und insbesondere von E. coli als fäkalen Indikatororganismus essentiell (Edberg et al., 2000). Wissenschaftler aus verschiedenen Bereichen konzentrierten ihre Forschung um eine Methode zu finden, die mit der klassischen Kultivierungsmethodik konkurrieren oder sie möglicherweise ersetzen kann. Die heute für die Detektion und Identifizierung der Fäkalbakterien angewandte Kultivierung ist das Standardverfahren und dauert in der Regel etwa 18 bis 72 h (Rompre et al., 2002; Tallon et al., 2005; Köster et al., 2003; American Public Health Association, 1915). Das selektive Wachstum der Mikroorganismen auf speziellen Nährmedien sowie die Produktion von Gasen, Säuren und anderen Stoffwechselprodukten sind die entscheidenden Faktoren für deren Nachweis. Die Eigenschaft von E. coli die Enzyme ß-D-Galaktosidase (GAL) und ß-D-Glukuronidase (GUS) zu produzieren, wurde bereits für die spezifische Detektion in verschiedenen Kultur-basierten Verfahren angewandt. Üblicherweise werden definierte Substrate für diese Enzyme eingesetzt, die anschließend, nach enzymatischer Hydrolyse, als farbige oder fluoreszierende Spaltprodukte nachgewiesen werden können (Berg und Fiksdal, 1988; Feng und Hartman, 1982; Grant, 1997). Diese beiden Enzyme sind die wichtigsten Ziele in enzymatischen-, immunologischen-, Nukleinsäure- und anderen molekular-basierten Techniken (Rompre et al., 2002; Perez et al., 2001). In den letzten Jahrzehnten hat sich eine große Auswahl an verschiedenen Methoden für den E. coli-Nachweis entwickelt. Jedoch hatte jede der entworfenen Techniken einige Nachteile: entweder war die Analysenzeit sehr lang (mehrere Tage), oder die Spezifität für E. coli war nicht hoch genug oder die gesetzlichen Nachweisgrenzen für E. coli Bakterien in Wasserproben konnten nicht erreicht werden.

[0016] Das Ziel war die Entwicklung eines Nachweisverfahrens für E. coli, das in weiterer Folge in einem automatisierten Biosensorsystem für Umweltwasserüberwachung integriert werden kann. Hierfür muss das neu entstehenden Verfahren mehrere Anforderungen erfüllen: A.) eine hohe Empfindlichkeit des Tests um die gesetzlichen Anforderungen für den Nachweis von Fäkalbakterien zu erreichen (WHO, 2001; EU Council directive, 1998; Bundesgesetzblatt II -TWV, 2013), b) eine kurze Analysezeit (weniger als ein Arbeitstag) um eine kontinuierliche Überwachung der Wasserqualität zu ermöglichen, und c.) ein einfaches Verfahren mit wenigen Arbeitsschritten, dass dadurch eine Inkorporation des Assays in ein automatisiertes Biosensorsystem ermöglicht. Das fertige Stand-alone-Gerät sollte autonom Messungen durchführen mit einer anschließenden Online-Datenübertragung der Ergebnisse an die Verantwortlichen. Dadurch soll die Qualität unseres Wassers gewährleistet und verbessert werden, und es können schnelle Gegenmaßnahmen im Fall von Verunreinigungen getroffen werden.

[0017] Im Vergleich zu anderen Techniken haben sich elektrochemische Methoden als sehr schnell, empfindlich, kostengünstig, und ist sehr benutzerfreundlich (Hayat und Marty, 2014; Dominguez-Renedo et al., 2007; Jang et al., 2000) erwiesen. Da die ß-D-Glukuronidase in E. coli Stämmen nahezu universell vorhanden ist (etwa 95% besitzen GUS), ist es ein vielversprechender Ansatz um spezifisch diesen fäkalen Indikator zu erfassen. Daher entschieden wir uns für die Konstruktion eines elektrochemischen Verfahrens für unser Biosensorsystem, wobei wir uns auf die Aktivität des GUS-Enzyms für den spezifischen Nachweis von Escherichia coli konzentrierten. Hier liegt außerdem der Vorteil, dass lebende Zellen erfasst werden und keine inaktiven Bakterien detektiert werden. In dieser Studie haben wir 8-Hydroxychinolin-ß-D-glukuronid (8-HQG) als Substrat ausgewählt. Die elektroaktiven Eigenschaften des Spaltprodukts 8-Hydroxychinolin (8-HQ) nach GUS-vermittelter Hydrolyse ermöglichen eine elektrochemische Detektion mittels Potentiostat (Figuren 1-3). Das verwendete Substrat für das GUS-Enzym, 8-HQG, wurde bereits in verschiedenen, meist Kultur-basierten Untersuchungen für den spezifischen Nachweis von E. coli angewendet (Reinders et al., 2000; Garcia-Armisen et al., 2005; Togo et al., 2007). In zwei wissenschaftlichen Publikationen wurde 8-HQG für ampero-metrische Analysen zum Nachweis von Gesamtkoliformen und E. coli angewandt. Lei (2008, 2009) trug SWNT (single-walled carbon nanotube) Membranen die auf kommerziellen Filtermembranen auf, um sie als Konzentrator für die Zielbakterien sowie als eine mikrobielle immobilisierte Arbeitselektrode zur amperometrischen Detektion zu verwenden. Kim und Han (2013) wandten das Prinzip der mikrobiellen Brennstoffzelle als Erfassungseinheit für E. coli an. Die in E. coli exprimierten Enzyme-ß-D-Galaktosidase (GAL) und ß-D-Glukuronidase (GUS) - wurden als biologische Erkennungselemente genutzt.

[0018] Nach unserem Wissen, hat niemand bisher das E. coli - vermittelte Spaltungsprodukt 8-HQ durch Oxidation auf der Arbeitselektrode unter Verwendung von Zyklovoltametrie potentio-metrisch analysiert. Die erhöhte Stromabgabe bei einem bestimmten Spannungsbereich (400 bis 600 mV) ist das Ergebnis der GUS-Enzymaktivität der Zellen, die wiederum das Vorhandensein von E. coli Bakterien in der Probe anzeigt. Wir validierten zuerst die GUS-vermittelte Spaltung des Substrats zu 8-HQ und oxidierten das Produkt weiter auf siebgedruckten Elektroden mithilfe eines Potentiostats. Danach wurde der entwickelte Assay mit lebenden Zellen getestet, um die Nachweisgrenzen zu bestimmen. Hierfür wurden verschiedene Konzentrationen von E. coli-Kulturen elektrochemisch über ihre Enzymaktivität nachgewiesen. Mit diesem Ansatz konnten wir einen sehr einfachen Versuchsaufbau realisieren: die GUS-Enzym-Produktion wurde durch Zugabe von Methyl-ß-D-glukuronid-Natriumsalz (Met-Glu) induziert. Zusammen mit MetGlu wurde das Substrat für das GUS-Enzym - 8-HQG - dem LB-Wachstumsmedium zugegeben. Das synthetisierte GUS-Enzym spaltet von diesem Substrat (8-HQG) den Glukuronid Rest (G) ab. Das sich ergebende Spaltungsprodukt 8-HQ wurde dann auf einer Elektrode oxidiert wird, was zu einem erhöhten Stromausgang führte (Lei, 2008, 2009; Kim und Han, 2013). Zum Vergleich der verschiedenen Proben wurde ein repräsentativer Strombereich ausgewählt in dem der Peak des oxidierten Spaltprodukt (8-HQ) (400 bis 600 mV) auftrat. Dann wurden Mittelwerte der Messdaten innerhalb dieses Definitionsbereichs berechnet und anschließend grafisch visualisiert. Zusätzlich wurden mehrere Bakterien untersucht um mögliche Interferenzen mit der Enzymreaktion die zu falsch-positiven Signale führen könnten, abzuklären. Durch Festlegung eines minimalen Grenzwertes konnten wir erfolgreich E. coli-Bakterien in allen getesteten Proben identifizieren.

[0019] Als Vorversuch wurde getestet, ob das ß-D-Glukuronidase-Enzym (GUS) das Substrat 8-Hydroxychinolinglukuronid (8-HQG) spezifisch zu 8- Hydroxychinolin (8-HQ) spaltet. Unterschiedliche Enzymkonzentrationen von 2.5, 25 und 125 Enzymeinheiten (U ml'1) wurden getestet. 8-HQG (3 mM) wurde zu den GUS- Enzymlösungen (jeweils 555.5 pl Gesamtvolumen) pipettiert, kurz gevortext und anschließend für 2 h bei 37 C ohne Schütteln inkubiert. Das Substrat wurde auch mit der ß-D-Galaktosidase-Enzym (60 U ml'1) getestet.

[0020] Nach 15, 30, 45 und 120 Minuten wurden 100 μΙ Aliquote jeder Probe wurden unter Verwendung des Potentiostat EcoStat analysiert. Zusätzlich wurden die folgenden Kontrollen in dem Experiment mitgeführt, in dem kein Enzym, kein Substrat, bzw. weder noch (kein Enzym sowie kein Substrat) waren. 8-HQ wurde dann auf der Arbeitselektrode der SPE oxidiert. Für alle Experimente wurde zyklische Voltammetrie (CV) verwendet wobei das angelegte Potential von 0 bis 800 mV verlief, einer Schrittweite von 1 mV und einer Abtastgeschwindigkeit von 50 mV s"1 angewandt wurde. Um die verschiedenen Proben zu vergleichen wurde ein repräsentativer Strombereich - in dem der Peak des oxidierten Spaltprodukt (8-HQ) auftrat - festgelegt. In diesem Bereich, von 400 bis 600 mV (Stevic et al., 2011), wurden Mittelwerte der Messdaten berechnet und grafisch mit MS Excel visualisiert.

[0021] Die 8-HQG Spaltung durch GUS und die weitere Oxidation von 8-HQ auf SPE wurde mit verschiedenen Konzentrationen von Enzym-Substrat-Gemischen getestet. Das allgemeine Voltammogram des oxidierten 8-HQ zeigte eine typische S-Form mit dem Peak beginnend bei 400 mV und weiter ansteigend bis 600 mV; und danach allmählich abflachend. Der maximale Strom wurde bei einem angelegten Potentialbereich von etwa 480 bis 550 mV erhalten. In Figur 4 sind die Ausgabesignale nach den potentiometrischen Messungen des oxidierten Spaltungsprodukts 8-HQ nach 15 Minuten Inkubation dargestellt. Die gemessenen Stromwerte (nA) wurden gegen die angelegte Spannung (mV) aufgetragen. Nach 15 Minuten Inkubation konnte ein starkes Signal von der 125 U-Probe mit einem Peak-Maximum bei etwa 7.2 μΑ erhalten werden. Voltametrische Messungen der 25 U Probe zeigten die gleiche Kurvenform mit einer etwas niedrigeren Spitze (6.0 μΑ). Die Probe mit nur 2.5 U GUS-Enzym lieferte das niedrigste Signal nach 15 Minuten Inkubationszeit mit einer Peak Spitze bei 2.1 pA. In Figur 5 sind die mittleren Ausgangsströme [pA] des oxidierten Spaltprodukts (8-HQ) nach 15, 30, 45 und 120 min dargestellt. Verschiedene ß-D-Glukuronidase-Enzym-Konzentrationen (2.5, 25 und 125 U) sowie die unspezifische Spaltung durch ß-D-Galaktosidase (nach 120 min) wurden ausgetestet. Negativkontrollen, wo kein Enzym, kein Substrat, weder noch (kein Enzym sowie kein Substrat, sondern nur LB-Medium) enthalten war, wurden analysiert. Nach 30 Minuten Inkubation zeigte das voltametrische Signal der 25 und 125 U Probe ein leicht abgesenktes Maximum. Im weiteren Versuchsverlauf stiegen die Signale dieser beiden Proben kurz an (45 min) um anschließend stetig, bis zum Versuchsende nach 2 h, abzufallen. Grund hierfür waren die hohen Enzymkonzentrationen (25 und 125 U) die dazu führten dass das vorhandene Substrat 8-HQG bereits sehr schnell aufgespalten wurde und eine Sättigung eintrat. Die 2.5 U Probe lieferte ein kontinuierlich ansteigendes Signal. Nach 2 h Inkubation konnten sehr ähnliche Kurvenformen für alle getesteten Proben erhalten werden. Die Stromkurve der Probe 2.5 U konvergierte an die Form der höher konzentrierten Proben. Die Mischung aus ß-D-Galaktosidase mit dem Substrat 8-HQG zeigte kein Signal und keinen Peak konnte bei 400-600 mV detektiert werden. Diese Probe ergab ein Grundsignal von etwa 0.7 pA; das vergleichbar dem Signal der negativen Kontrollen war. Die Kontrollen - in dem LB- Medium allein, LB-Medium mit dem Substrat 8-HQG, und LB mit dem GUS-Enzym - zeigten keine Peaks im Messbereich von 400-600 mV (Grundsignal von 0.5-10 pA). Nach diesen positiven Ergebnissen wurden weitere Versuche mit diesem vielversprechenden Ansatz durchgeführt.

[0022] Nach der Überprüfung des allgemeinen Grundprinzips mit Enzymlösungen, wurde diese elektrochemische Methode anhand lebender Bakterien getestet. Hierfür wurden Aliquots (450 pl) von Übernachtkulturen von E. coli und Citrobacter freundii, als Negativkontrolle, mit MetGlu (7,9 mM) versetzt um die GUS-Enzym-Produktion in den Zellen zu induzieren. Zusätzlich wurden die Stock- Kulturen serielle verdünnt (10-fache Schritte) und die 10"5-Verdünnungen von E. coli und C. freundii wurden in den Test miteinbezogen. Das Substrat für das GUS-Enzym, 8-HQG (3 mM) wurde zu allen Proben zugegeben. LB- Medium, ergänzt mit 8-HQG wurde als Negativkontrolle im Versuch mitgeführt. Alle Proben wurden für 4 h bei 37°C und 44.5°C inkubiert. Jede Stunde wurde ein 100 pl Aliquot von den Proben für die voltametrische Messung entnommen. Die CV-Analyse wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Die Datenanalyse und grafische Darstellung der Stromsignale wurde mit Hilfe von MS Excel durchgeführt, indem die Mittelwerte der Messergebnisse für den Bereich von 400 bis 600 mV berechnet wurden.

[0023] In Figur 6 ist die Bakterien-vermittelte Spaltung von 8-HQG dargestellt. Die Ergebnisse der potentiometrischen Messungen für die E. coli und C. freundii Proben (Stammkulturen und IO'5 Verdünnungen) nach 1 Stunde (A) und über den gesamten Messzeitraum von 4 Stunden (B). (A) Nach 1 h wurden die für E. coli Proben typischen s-förmige Voltammograme mit einem Signal ab etwa 400 bis 600 mV erhalten. (B) Die Mittelwerte des Stromsignals [pA] zwischen 400-600 mV sind für alle Proben über den gesamten Messzeitbereich gezeigt (1-4 h). Nach 1 h Inkubation der E. coli Stock Kultur (37°C) konnte ein klares Oxidationssignal (7.2 pA) beginnend bei etwa 400 mV detektiert werden (Figur 6A). Die E. coli-Stammkultur, die bei 44.5°C inkubiert wurde, zeigte ein etwas höheres Signal (etwa 7.8 pA). Die 10'5-Verdünnung vom E. coli Stamm ATCC 11303 - kultiviert bei 44.5°C - zeigte einen Peak nach 1 h Inkubation (Peakspitze bei 3.2 pA), während die Verdünnung bei 37°C kein Signal zu diesem Zeitpunkt lieferte. Die Negativkontrollen (LB bei 37°C und 44.5°C) brachten beide kein nachweisbares Signal und kein Peak konnte beobachtet werden (0.5 μΑ). Von den C. freundii Stammkulturen (37°C und 44.5°C), konnte ein Signal nach 1 h, beginnend bei etwa 550 mV und endend bei 700 mV, mit einem mittleren Maximum bei 1.5 μΑ (Figur 6B), erhalten werden. Es konnte jedoch kein deutlicher Peak, wie bei den E. coli Proben, beobachtet werden (Figur 6A und 6B). Nach 2 und 3 Stunden Inkubation zeigten die unverdünnt E. coli Kulturen hohe Signale (Figur 6B). Die Signale der verdünnten E. coli-Proben stiegen allmählich an. In Figur 6B sind die Ergebnisse für den gesamten Messbereich (1 bis 4 h Inkubation) dargestellt. Die verdünnte E. coli-Kultur (44.5°C) zeigte ein deutlich höheres Signal als die Verdünnung die bei 37°C inkubiert wurde. Die verdünnte 37°C E. coli Probe konvergierte auf den Wert der verdünnten 44.5°C Probe nach 4 h Inkubation. Die LB negative Kontrollen bei 37°C und 44.5°C zeigten kein Signal (Grundsignal bei 0.8 μΑ). Das Signal der C. freundii Proben erhöhte sich leicht nach drei weiteren Stunden Inkubation. Jedoch war die Lage des Peaks die gleiche wie bereits nach 1 h. Die C. freundii Probe bei 37°C lieferte ein höheres Signal als die 44.5°C Probe, da diese Bakterien niedrigere Inkubationstemperaturen bevorzugen. In anderen Studien konnte ebenfalls gezeigt werden, dass 44.5°C die optimale Inkubationstemperatur für E. coli Bakterien ist [21,25], Die Expression des GUS Enzyms ist bei dieser Temperatur um das 2-fache höher als bei 25°C [25, 26], und ist gleichzeitig ein Selektionsfaktor für die Detektion von E. coli. Aufgrund der hohen durch Verwendung von 44,5°C für die Inkubation der Bakterien ergab Signale wurden alle weiteren Experimente mit dieser Temperatur durchgeführt.

[0024] Um sehr niedrige Konzentrationen von E. coli zu detektieren wurden Verdünnungsreihen einer Über-Nacht- Kultur hergestellt. Die Verdünnungen 10"7 - 10"9 wurden für das Experiment verwendet. Jeder verwendeter Verdünnung (in dreifacher Ausführung) wurde der Enzym-Induktor (MetGlu; 7,9 mM) und das Substrat für das GUS-Enzym (8-HQG; 3 mM) hinzugefügt. Um die genaue Zellzahl zu bestimmen, wurden je drei Aliquots jeder Verdünnungsstufe auf LB-Platten ausplattiert und über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurden die gewachsenen Kolonien ausgezählt und die Kolonie-bildenden Einheiten (KBE) berechnet. Nach 7 h Inkubation (44.5°C) wurden die ersten voltammetrischen Messungen durchgeführt, um das Oxidationssignal des Spaltproduktes (8-HQ) in den Proben zu bestimmen. Anschließend wurde jede Stunde -bis insgesamt 10 h Inkubation - eine CV-Analyse durchgeführt. LB-Medium mit MetGlu und 8-HQG wurde als Negativkontrolle eingesetzt. E. coli gemischt mit dem Enzyminduktor repräsentierte eine zweite negative Kontrolle. Außerdem wurde eine E. coli-Stammkultur mit MetGlu und 8-HQG vermischt und diente als Positivkontrolle. Voltammetrische Messungen wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt. Der mittlere Ausgangsstrom (400-600 mV) der getesteten Verdünnungen nach verschiedenen Zeitpunkten wurde mit MS Excel berechnet und graphisch dargestellt. Zusätzlich wurden Mittelwerte für die Triplikate jeder Verdünnung für jeden Messpunkt mit der entsprechenden Standardabweichung berechnet.

[0025] In Figur 7 ist der Nachweis von niedrigen Zellzahlen dargestellt. Die berechneten Mittelwerte (400-600 mV) und Standardabweichungen der gemessenen Stromsignale der Triplikate [μΑ] von verschiedenen E. coli- Konzentrationen nach 7, 8, 9 und 10 h Inkubation in graphisch veranschaulicht. LB-Medium (mit MetGlu und 8- HQG) und E. coli (mit Enzym-Induktor) wurden als negative Kontrollen verwendet. E. coli Stammkultur mit MetGlu und 8-HQG gemischt diente als Positivkontrolle. Die KBE der Verdünnungen 10"7-10"9 entsprachen 313, 10 und 1 KBE pro ml. Nach 7 h Inkubation wurden die ersten voltammetrischen Messungen durchgeführt. Die positive Kontrolle lieferte ein sehr hohes Stromsignal mit einem Peak-Maximum bei 6.1 μΑ (Figur 7). Alle Triplikate der 10"7-Verdünnung von E. coli ATCC 11303 zeigten einen Anstieg des Stroms bei etwa 400 mV, es konnte jedoch noch kein deutlicher Peak nachgewiesen werden. Nach einer weiteren Stunde Inkubation bei 44.5°C wurde ein klarer Stromanstieg mit mittleren Peaks zwischen 2.8 bis 3.1 μΑ beobachtet. Eine Stunde später (9 h Inkubation), stieg das Signal dieser Verdünnungen weiter an. Von den 10 KBE Proben (10 8 Verdünnungen) wurde ein Signal mit Peak Maxima zwischen 2.6 und 3.2 μΑ detektiert. Zusätzlich war ein Stromausgangssignal von einer Probe der niedrigsten verdünnten Kultur (1 KBE) zu erkennen. Schließlich, nach 10 h Inkubation, zeigten alle Triplikaten der E. coli-Probe mit 1 KBE ein deutlich messbares Signal mit Peak Maxima zwischen 1.9 und 2.8 μΑ. Alle Negativkontrollen lieferten über den gesamten Messzeitraum keinen Peak und nur ein Grundsignal bei 0.8 μΑ wurde gemessen.

[0026] Um den entworfenen Test auf Kreuz Reaktivität und falsch-positive Ergebnisse zu untersuchen, wurden verschiedene Bakterienstämme (Bacillus atrophaeus, Brevundimonas diminuta, Citrobacter freundii, Pseudomonas putida und Pseudomonas stutzeri) getestet. Frische Übernachtkulturen von jedem Stamm wurden hergestellt und anschließend Verdünnungsreihen hergestellt. Hundert μΙ der 10'7 Verdünnung wurden auf LB-Agarmedium (in dreifacher Ausführung) ausplattiert um am nächsten Tag die genauen Zellzahlen zu bestimmen. Für die Validierung des Assays wurden Aliquots der Stammkulturen (450 μΙ) mit dem Enzym-Induktor (MetGlu; 7,9 mM) sowie dem Substrat für das Enzym (8-HQG; 3 mM) vermischt. Nach 7 h Inkubation bei 44.5°C wurden die ersten voltammetrischen Messungen durchgeführt. Danach wurden stündlich Messungen mit dem Potentiostat durchgeführt bis zu insgesamt 10 h Inkubation. Die gleichen Positiv- und Negativ-Kontrollen wurden verwendet, wie oben erwähnt.

[0027] Die graphisch visualisierten Mittelwerte (400-600 mV) des Ausgangsstromes [μΑ] von E. coli (Positivkontrolle) und nicht E. coli-Stämmen (Bacillus atrophaeus, Brevundimonas diminuta, Citrobacter freundii, Pseudomonas putida und Pseudomonas stutzeri) nach 7, 8, 9 und 10 h Inkubation sieht man in Figur 8. Positiv- und Negativ-Kontrollen wie in Figur 7. Die gemessenen Stromwerte der untersuchten nicht E. coli-Stämme lagen unter dem Signal für 1 KBE pro ml E. coli (1.9 μΑ). Die Ergebnisse der voltammetrischen Analyse zeigte nach 7 h ein starkes Signal für die positive Kontrolle (4.9 μΑ, Figur 8). Ein solch starkes Signal konnte bis zum Ende der Messzeit nach 10 h für die positive Kontrolle erfasst werden (4.7-5.2 μΑ). Keiner der untersuchten Stämme, Bacillus atrophaeus, Brevundimonas diminuta, Citrobacter freundii, Pseudomonas putida und Pseudomonas stutzeri, lieferte eine steigendes Stromsignal, und keine Peaks konnten für die getesteten Stämme in dem 400-600 mV-Potentialbereich beobachtet werden. Der gemessene mittlere Strom betrug zwischen 0.7 bis 1.6 μΑ während des gesamten Zeitrahmens. B. atrophaeus hatte den niedrigsten Stromausgang, der der LB Negativkontrolle ähnlich war (Basissignal bei rund 0.8 μΑ). Alle anderen Stämme zeigten etwas höhere Signale mit Stromsignalen um 1.0 μΑ. B. diminuta war der einzige Stamm der, über den gesamten Zeitrahmen, ein kontinuierlich ansteigendes Signal (1.3 μΑ nach 7 h bis 1.7 μΑ nach 10 h) zeigte. Das gemessene Signal von C. freundii stieg von 8 bis 10 h auf ein Maximum von 1.3 μΑ an. Jedoch waren alle erfassten Stromwerte der untersuchten Stämme unter dem gemessenen Signal für 1 KBE pro ml von E. coli (1.9 μΑ).

Referenzen

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Claims (9)

1. Patentansprüche

   1. Verfahren für den schnellen Nachweis von Mikroorganismen insbesondere von E. coli in einem wässrigen Medium, wobei der Nachweis dadurch erfolgt, dass basierend auf der spezifischen Enzymaktivität der Mikroorganismen ein zugesetztes Substrat 8-Hydroxychi-nolin β-D-Glukuronide bzw. 8-Hydroxychinolin β-D-Glukuronide Natrium-Salz und das gebildete Spaltprodukt 8-Hydroxychinolin oxidiert wird und ein dem Reaktionsprodukt proportionales Signal elektrisch gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, dass mittels einer Elektrode eine Potentialdifferenz von 0 mV bis 800 mV zyklisch durchlaufen wird, wobei der über die Elektrode fließende elektrische Strom im Spannungsbereich zwischen 400mV und 600mV zur Auswertung herangezogen wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Mikroorganismen des Genus Escherichia coli bzw. Organismen die über das Enzym β-D-Glukuronidase verfügen, detek-tiert werden.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen bei einer Inkubationstemperatur zwischen 37°C und 45°C, vorzugsweise von 44,5°C, inkubiert werden.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis bei einem pH Wert von 6 bis 8, vorzugsweise bei einem pH Wert von 7, durchgeführt wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis bei einem maximalen Flüssigkeitsvolumen von 200pl durchgeführt wird.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im Medium eine 1mM bis 5mM, vorteilhafterweise eine 3 mM Konzentration des Substrats verwendet wird.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die nachzuweisenden Mikroorganismen aus einer wässrigen Flüssigkeit, insbesondere einer Wasserprobe, erhalten werden.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die nachzuweisenden Mikroorganismen durch Filtration der wässrigen Flüssigkeit erhalten werden.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass als wässrige Flüssigkeit eine aus der Gruppe bestehend aus Abwasser, Fluss- und Seewasser, technische Prozesswässer, Trinkwasser, Mineralwasser und Wasser, welches zur Trinkwassergewinnung bereitgestellt wird, verwendet wird. Hierzu 9 Blatt Zeichnungen