AT503297B1

AT503297B1 - Allergen-spezifische antikörper

Info

Publication number: AT503297B1
Application number: AT0086606A
Authority: AT
Inventors: Otto Dr Majdic; Petra Kohl; Rudolf Dr Valenta; Sabine Dr Flicker; Anna Gieras
Original assignee: Biomay Ag
Priority date: 2006-05-18
Filing date: 2006-05-18
Publication date: 2007-09-15
Also published as: WO2007134350A2; CA2649722A1; WO2007134350A3; RU2008149957A; US20100034812A1; EP2032603A2; JP2009537117A; AU2007252263A1; AT503297A4; CN101448855A; WO2007134350A8

Description

2 AT 503 297 B1

Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper und pharmazeutische Formulierungen für die Behandlung und Prävention von Allergen-induzierten Krankheiten.

Beinahe 100 Millionen Allergiker sind gegen das Birken(Betula verrucosa )-Pollen-Hauptaller-gen, Bet v 1, ein 17kDa-Protein, sensibilisiert, welches in den Pollen von Bäumen, die zur Gruppe der Fagales gehören, und welches in Europa, Nordamerika, Russland und Australien weit verbreitet ist (Breiteneder et al., 1989). Die für Bet v 1 codierende cDNA wurde isoliert (Breiteneder et al., 1989), und rekombinantes Bet v 1, welches dem natürlichen Bet v 1 -Wildtyp gleich ist, wurde in Escherichia coli exprimiert (Valenta et al., 1991; Ferreira et al., 1993). Die Erkennung von Bet v 1 durch IgE-Antikörper von Patienten, die gegen Baumwollpollen und Nahrungsmittel allergisch sind, beträgt durchschnittlich 95%, und beinahe 60% davon sind ausschließlich gegen Bet v 1 sensibilisiert (Jarolim et al., 1989), wodurch die Erkennung des Allergens von konformationalen Epitopen abhängt und folglich ein gefaltetes Molekül erfordert. Wegen der früheren umfangreichen Charakterisierung in vitro und in vivo wurde häufig vorgeschlagen, dass das rekombinante Bet v 1-Molekül für diagnostische und therapeutische Zwecke verwendet werden sollte (Valenta et al., 1995, 1996). Kürzlich wurden nicht-anaphylaktische Oberflächen-exponierte Peptide des Birkenpollen-Hauptallergens erzeugt und als Peptide mit einer Größe (25-32 Aminosäuren) charakterisiert, die ausreicht, um Antikörper-Antworten in vivo (eine aktive Immunisierung) zu induzieren. Diesen Peptiden fehlte eine Faltung und die allerge-ne Aktivität. Jedoch induzierte die Peptid-Impfung die Erzeugung von polyklonalem, Bet v 1-spezifischem IgG (Focke et al., 2004).

Die WO 94/10194 offenbart Peptide, die von Allergenen von Bäumen der Ordnung Fagales abgeleitet sind und die Zellepitope aufweisen.

In der EP 1 219 300 A1 wird die Verwendung von Allergenderivaten zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Allergien beschrieben.

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Mittel und Methoden zur Behandlung und Prävention allergischer Reaktionen, die durch das Birkenpollen-Allergen Bet v 1 oder Fragmente davon verursacht sind, vorzusehen.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Antikörpers oder eines Derivats davon zur Herstellung eines Medikaments zur passiven Immunisierung eines Individuums zur Prävention und/oder Behandlung von durch eine Einwirkung eines Birkenpollen-Allergens verursachten allergischen Reaktionen bei diesem Individuum, wobei der Antikörper an ein Bet v 1-Fragment bindet, welches die Aminosäuren 30 bis 59 (SEQ ID Nr. 1) oder die Aminosäuren 75 bis 104 (SEQ ID Nr. 2) umfasst.

Es zeigte sich überraschenderweise, dass Antikörper oder Derivate davon, die an die Bet v 1-Fragmente binden, spezifisch an das Birkenpollen-Allergen-Bet v 1 binden können und dass solche Moleküle verwendet werden könnten, um die Bindung von Bet v 1-spezifischem IgE an die Birkenpollen-Allergene zu blockieren. Die Bindung der Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung an Epitope in den oder nahe den Haupt-lgE-Bindungsstellen von Bet v 1 und/oder die Modifizierung der Konformation des Allergens, so dass die IgE-Epitope oder nur ein Teil davon nicht länger für IgE zugänglich sind, resultieren in einer verringerten oder sogar vollständigen Reduktion der Bindung von IgE an das Allergen. Versuchsdaten zeigen, dass eine Mischung aus zwei Peptid-spezifischen Antikörpern mit unterschiedlicher Epitop-Spezifität keine stärkere Inhibition der IgE-Bindung ergaben als die individuellen Antikörper, was anzeigt, dass ein Antikörper die Konformation des Allergens ändert, was die Bindung eines zweiten Antikörpers (ebenso IgE) an das Allergen inhibiert. Für die Produktion von Antikörpern können verschiedene Wirts-Tiere durch Injektion mit dem Bet v 1-Antigen oder Fragmenten davon immunisiert werden, insbesondere mit Bet v 1-Fragmenten, die aus den Aminosäuren 30 bis 59 (SEQ ID Nr. 1) oder den Aminosäuren 75 bis 3 AT 503 297 B1 104 (SEQ ID Nr. 2) bestehen. Solche Wirts-Tiere können beispielsweise Schweine, Kaninchen, Mäuse, Ziegen und Ratten umfassen. Am meisten bevorzugt werden die polyklonalen Antikörper aus einem menschlichen Individuum isoliert. Die Verwendung solcher Antikörper verringert das Risiko, dass das Immunsystem auf von einem „Fremd“-Antikörper stammende Antigene reagiert. Die Antikörper können aus den Seren dieser Tiere isoliert werden.

Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung können zur intravenösen, intramuskulären, subkutanen und lokalen Verabreichung formuliert werden; Protokolle zum Erhalt solcher Formulierungen sind dem Fachmann bekannt.

Natürlich ist es auch möglich, gegen die Bet v 1-Fragmente gerichtete Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung aus menschlichen Individuen, die dem Bet v 1-Allergen ausgesetzt waren, zu isolieren. Die Isolierung von Bet v 1-spezifischen Antikörpern aus menschlichen Individuen kann mittels auf diesem Gebiet bekannter Methoden erreicht werden.

Wie hierin verwendet, bezieht sich „Antikörper“ auf intakte Immunglobuline oder Fragmente davon, die beispielsweise durch Verdau mit verschiedenen Peptidasen oder rekombinant hergestellt wurden. Natürlich sollen auch Moleküle, die die Antigen-bindende Region von Immunglobulinen, die mit anderen Proteinen oder Fragmenten davon fusioniert sind, umfassen, Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung sein. „Die Antigen-bindende Region“ bezieht sich auf den Teil eines Immunglobulin-Moleküls, der an der Antigen-Bindung beteiligt ist. Die Anti-gen-bindende Region ist durch Aminosäure-Reste der N-terminalen variablen Regionen der schweren und leichten Ketten gebildet. Daher bezieht sich der Ausdruck „Antikörper" - ohne darauf eingeschränkt zu sein - auf Fab's (z.B. durch Pepsin-Verdau eines Antikörpers unter den Disulfid-Bindungen in der Gelenkregion („hinge region“) oder durch rekombinante Methoden erzeugt), Einzelketten-Antikörper (Antikörper, die als einzelne Polypeptid-Kette Vorkommen), mehr bevorzugt, Einzelketten-Fv-Antikörper („Single chain Fv“, scFv), bei welchen eine variable schwere und eine variable leichte Kette (direkt oder durch einen Peptid-Linker) miteinander verbunden sind, um ein kontinuierliches Polypeptid, Chimäre Moleküle, humanisierte Moleküle usw. zu bilden.

Die Antikörper der Erfindung umfassen auch Derivate, die chemisch, durch rekombinante DNA-Technologie, enzymatisch usw. modifiziert sind, was z.B. zu „technisch modifizierten Antikörpern“ führt, wie synthetischen Antikörpern, Chimären oder humanisierten Antikörpern oder Mischungen davon, oder Antikörperfragmenten, welchen die konstante Region teilweise oder vollkommen fehlt, z.B. Fv, Fab, Fab' oder F(ab')2 usw.. Bei diesen technisch modifizierten Antikörpern kann (können) z.B. ein Teil oder Teile der leichten und/oder schweren Kette substituiert sein. Solche Moleküle können beispielsweise Antikörper umfassen, die aus einer humanisierten schweren Kette und einer unmodifizierten leichten Kette (oder Chimären leichten Kette), oder umgekehrt, bestehen. Die Ausdrücke Fv, Fc, Fd, Fab, Fab' oder F(ab')2 werden verwendet, wie sie im Stand der Technik beschrieben sind (Harlow E. und Lane D., in .Antibodies, A Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). „Derivate“ von Antikörpern bezieht sich in diesem Zusammenhang auf proteinhältige Moleküle, die eine oder mehrere funktionelle Aktivitäten aufweisen, die mit einem Antikörper der gesamten Länge gemäß der vorliegenden Erfindung verbunden sind. So sind die Antikörper-Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung fähig, an ein Bet v 1-Fragment zu binden, das die Aminosäuren 30 bis 59 (SEQ ID Nr. 1) oder die Aminosäuren 75 bis 104 (SEQ ID Nr. 2) aufweist. Die Antikörper der Erfindung inkludieren auch Derivate, die modifiziert sind, d.h. durch die kovalente Bindung jeglicher Art von Molekül am Antikörper. Beispielsweise - jedoch nicht als Einschränkung - inkludieren die Antikörper-Derivate Antikörper, die z.B. durch Glykosylierung, Acetylierung, Pegylierung, Phosphorylierung, Amidierung, Derivatisierung mittels bekannter Schutz/Blockierungsgruppen, proteolytische Spaltung, Bindung an einen zellulären Liganden oder ein anderes Protein usw. modifiziert wurden. Jede von zahlreichen chemischen Modifikationen kann mittels bekannter Techniken durchgeführt werden, einschließlich - jedoch ohne Einschränkung darauf - spezifische chemische Spaltung, Acetylierung, Formylierung, Stoffwechselsynthese von Tunicamycin usw.. 4 AT 503 297 B1

Zusätzlich kann das Derivat eine oder mehrere nicht-klassische Aminosäuren enthalten. Die Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung können auch Fragmente umfassen, welche noch immer ein Bet v 1-Fragment binden können, welches die Aminosäuren 30 bis 59 (SEQ ID Nr. 1) oder die Aminosäuren 75 bis 104 (SEQ ID Nr. 2) aufweist (z.B. CDR-Region eines Antikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung).

Die Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise monoklonale Antikörper. Solche Antikörper, welche homogene Populationen von Antikörpern gegen ein bestimmtes Antigen sind, können mittels jeder Technik erhalten werden, welche die Produktion von Antikörper-Molekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur vorsieht. Zu diesen zählen beispielsweise die Hybridom-Technik von Köhler und Milstein (1975, Nature 256:495-497 und U.S. Pat. Nr. 4,376,110), die Human-B-Zell-Hybridom-Technik (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:2026-2030) und die EBV-Hybridom-Technik (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77-96). Solche Antikörper können zu jeder Immunglobulin-Klasse, einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, und jeder Unterklasse derselben gehören. Das die mAk dieser Erfindung erzeugende Hybridom kann in vitro oder in vivo gezüchtet werden. Die Produktion hoher Titer von mAks in vivo macht dies zur derzeit bevorzugten Produktionsmethode. Natürlich ist es auch möglich, monoklonale Antikörper mittels rekombinanter Technologien in eukaryontischen, Hefe-, Insekten und Pflanzen-Zellen und in Pflanzen zu erzeugen. Diese Expressionssysteme sowie die Methoden zur Isolierung dieser Antikörper aus den Zellen sind auf dem Gebiet wohl bekannt. Es war sehr überraschend, dass ein gegen die Bet v 1-Fragmente gerichteter monoklonaler Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung eine Inhibition ähnlich der von polyklonalen Antiseren, die durch Expression des gesamten Bet v 1-Allergens in einem Säuger erzeugt wurden, aufweist (cf. z.B. Focke et al., 2004). Insbesondere unter Berücksichtigung der Tatsache, dass polyklonale Antikörper normalerweise auf mehr als ein Epitop gerichtet sind. Die Produktion monoklonaler Antikörper führt zu einem Produkt, welches homogener und reiner und folglich reproduzierbarer ist als polyklonale Antikörper, die aus Antiseren erhalten wurden.

Die Auswahl geeigneter Peptide für die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern, die zur Behandlung und/oder Prävention einer allergischen Erkrankung verwendet werden können, welche durch Einwirkung von Bet v 1 verursacht wurde, ist nicht trivial. Lebeque et al. (1997) untersuchten beispielsweise die Auswirkungen verschiedener, gegen Bet v 1 gezogener monoklonaler Antikörper auf die Bindung des IgE von Patienten, die gegen dieses Allergen allergisch sind, an Bet v 1. Diese Untersuchungen zeigten - ohne die Spezifität der erzeugten Antikörper für Regionen des Bet v 1-Allergens zu offenbaren - dass bestimmte monoklonale Antikörper die IgE-Bindung an Bet v 1 eher verstärken, anstatt diese Bindung zu verringern. Daher war es überraschend, dass die Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung die IgE-Bindung an Wildtyp-Bet v 1 stark inhibieren.

Der Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung und eine diesen Antikörper umfassende Vakzin-Formulierung können nicht nur zur Behandlung allergischer Reaktionen, die durch das Birkenpollen-Allergen Bet v 1 verursacht sind, verwendet werden, sondern auch zur Prävention solcher Reaktionen, oder zur Sensibilisierung eines Individuums für das Bet v 1-Allergen. Es ist auch möglich, ein Kind oder ein Neugeborenes mit einer Antikörper- oder Vakzin-Formulierung gemäß der vorliegenden Erfindung zu impfen, bevor dieses Kind oder Neugeborene mit Birkenpollen in Kontakt gelangt. Eine solche Vorgangsweise wird die Bildung von Bet v 1-spezifischen IgE-Antikörpern, und somit die Sensibilisierung gegen Bet v 1 in diesen Kind oder Neugeborenen verhindern. Es ist besonders vorteilhaft, die Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung an Kinder im Alter von 1 bis 3 Jahren zu verabreichen, da Kinder in diesem Alter gegen Birkenpollen sensibilisiert werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Antikörper ein IgG-Antikörper, insbesondere ein IgG-Antikörper vom lgG1-oder lgG4-lsotyp. 5 AT 503 297 B1

Selige et al. (Clin. Exp. Allergy (2005) 35:774-781) zeigten, dass IgG-Antikörper, die gegen Bet v 1 gerichtet sind, allergische Reaktionen verstärken, indem sie größere Allergen-Aggregate bilden, die die meisten Zellen oder basophile Zellen aktivieren. Ähnliche Ergebnisse wurden mit den in Laffer et al. (J. Immunol. (1996) 157:4953-4962) und Denepoux et al. (FEBS letters (2000) 456:39-46) geoffenbarten Versuchen erhalten. Die Verwendung von gegen Bet v 1-Fragmente gerichteten IgG-Antikörpern gemäß der vorliegenden Erfindung zeigte jedoch diese Wirkungen nicht. Daher können gemäß der vorliegenden Erfindung IgG-Antikörper verwendet werden.

Mehr bevorzugte Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung sind nicht-Komplement-aktivie-rende Antikörper, wie humanes lgG4 oder murines lgG1.

Der Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein muriner oder humaner Antikörper.

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Antikörper ein chimärer Antikörper.

Techniken, die für die Herstellung von „Chimären Antikörpern“ entwickelt wurden (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei., 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314:452-454) durch Spleißen der Gene eines Maus-Antikörper-Moleküls mit geeigneter Antigen-Spezifität zusammen mit Genen von einem humanen Antikörper-Molekül mit geeigneter biologischer Aktivität, können verwendet werden. Ein chimärer Antikörper ist ein Molekül, bei welchem verschiedene Teile von verschiedenen Tier-Spezies, Immunglobulin-Klassen, Unterklassen (Isotypen), Typen und Subtypen stammen, wie z.B. jene, die eine variable Region haben, die von einem murinen mAk stammt, und eine Human-Immunglobulin-konstante Region. Weiters können Chimäre Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung mehr als eine Spezifität aufweisen (z.B. Diabodies (bispezifische Antikörper) oder Tetrabodies).

Der Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise humanisiert.

Verfahren zum „Humanisieren" von Antikörpern, oder zur Erzeugung weniger immunogener Fragmente von nicht-humanen Antikörpern sind gut bekannt. Ein humanisierter Antikörper ist ein solcher, bei welchem nur die Antigen-erkannten Stellen, oder Komplementaritätsbestimmende hypervariable Regionen (CDRs) nicht-humanen Ursprungs sind, während alle Rahmen-Regionen („framework regions, FR) variabler Domänen Produkte humaner Gene sind.

Nicht-humane Antikörper können mit jedem auf dem Gebiet bekannten Verfahren humanisiert werden. Bei einem Verfahren werden die nicht-humanen CDRs in einen humanen Antikörper oder in eine Consensus-Antikörper-Rahmensequenz insertiert. Weitere Änderungen können dann in den Antikörper-Rahmen eingeführt werden, um die Affinität oder Immunogenität zu modulieren. Es folgen Protokolle zur Verbesserung der monoklonalen Antikörper, die gegen Fragmente des Birkenpollen-Allergens Bet v 1 gerichtet sind, als therapeutische Mittel bei Menschen durch „Humanisieren“ der monoklonalen Antikörper, um ihre Serum-Halbwertszeit zu verbessern und um sie weniger immunogen in humanen Wirten zu machen (d.h. um eine humane Antikörper-Antwort auf nicht-humane Antikörper zu verhindern). Die Prinzipien der Humanisierung sind in der Literatur beschrieben und werden durch die modulare Anordnung von Antikörper-Proteinen erleichtert. Um die Möglichkeit der Bindung von Komplement auf ein Minimum zu reduzieren, wird ein humanisierter Antikörper vom lgG1-lsotyp bevorzugt. Beispielsweise wird ein Grad an Humanisierung erreicht, indem Chimäre Antikörper erzeugt werden, die die variablen Domänen von nicht-humanen Antikörper-Proteinen, an welchen ein Interesse besteht, mit den konstanten Domänen von humanen Antikörper-Molekülen aufweisen (z.B. Morrison et al., Adv. Immunol., 1989, 44, 65-92). Die variablen Domänen von Bet v 1-spezifischen Antikörpern können aus der cDNA kloniert werden, die von mRNA erzeugt wird, 6 AT 503 297 B1 welche aus dem Hybridom, an dem ein Interesse besteht, isoliert wurde. Die Gen-Fragmente der variablen Region sind mit Exons verbunden, die für konstante Domänen des humanen Antikörpers codieren, und das resultierende Konstrukt wird in geeigneten Säuger-Wirtszellen exprimiert (z.B. Myelom- oder CHO-Zellen). Um einen noch größeren Grad der Humanisierung zu erreichen, könnten nur jene Teile der Gen-Fragmente der variablen Region, die für die Antigen-bindenden Komplementaritäts-bestimmenden Regionen („CDR“) der nicht-humanen monoklonalen Antikörper-Gene codieren, in humane Antikörper-Sequenzen kloniert werden (z.B. Jones et al., Nature, 1986, 321, 522-525, Riechmann et al., Nature, 1988, 332, 323-327, Verhoeyen et al., Science, 1988, 239, 1534-36, und Tempest et al., Bio/Technology, 1991, 9, 266-71). Auch das „beta-sheet framework“ („beta-Faltblatt-Rahmen“) des humanen Antikörpers, der die CDR3-Regionen umgibt, kann modifiziert werden, damit er die dreidimensionale Struktur der Antigen-bindenden Domäne des ursprünglichen monoklonalen Antikörpers genauer widerspiegelt (vgl. Kettleborough et al., Protein Engin., 1991, 4, 773-783, und Foote et al., J. Mol. Biol., 1992, 224, 487-499). Bei einer alternativen Vorgangsweise wird die Oberfläche eines nicht-humanen monoklonalen Antikörpers, an dem ein Interesse besteht, humanisiert, indem ausgewählte Oberflächenreste des nicht-humanen Antikörpers z.B. durch stellengerichtete Mutagenese, verändert werden, während das gesamte Innere und kontaktierende Reste des nicht-humanen Antikörpers beibehalten werden (Padlan, Molecular Immunol., 1991, 28, 489-98).

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Antikörper oder ein Fragment desselben, der (das) an ein Fragment von Bet v 1 bindet, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment von Bet v 1 aus den Aminosäuren 30 bis 59 (SEQ ID Nr. 1) oder den Aminosäuren 75 bis 104 (SEQ ID Nr. 2) besteht.

Der Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, der von einem Hybridom sezerniert wird, welches unter dem Budapester Vertrag bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland) am 9. Mai 2006 hinterlegt wurde und die Hinterlegungsnummern DSM ACC2782, DSM ACC2783, DSM ACC2785, DSM ACC2784 und DSM ACC2786 erhielt.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Vakzin-Formulierung, welche einen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.

Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können zur Verabreichung an einen Säuger, insbesondere an einen Menschen, in vielerlei Weise formuliert sein. Bei einigen Ausführungsformen sind die Antikörper in einer sterilen wässerigen Lösung oder in biologischen Flüssigkeiten, wie Serum. Wässerige Lösungen können gepuffert oder ungepuffert sein und haben zusätzliche aktive oder inaktive Komponenten. Zu den zusätzlichen Komponenten zählen Salze zur Modulation der lonenstärke, Konservierungsmittel einschließlich - ohne Einschränkung darauf - antimikrobielle Mittel, Antioxidantien, Chelatbildnern u. dgl., und Nährstoffe, einschließlich Glucose, Dextrose, Vitamine und Mineralstoffe. Alternativ können die Antikörper für eine Verabreichung in fester Form zubereitet sein. Die Antikörper können mit einer Reihe inerter Trägermittel oder Exzipienten, einschließlich - ohne Einschränkung darauf - Bindemittel, wie mikrokristalline Cellulose, Tragantgummi oder Gelatine; Exzipienten, wie Stärke oder Lactose; Dispergiermittel, wie Alginsäure, Primogel oder Maisstärke; Lubrikantien, wie Magnesiumstearat; Gleitmittel, wie kolloidales Siliziumdioxid; Süßstoffe, wie Saccharose oder Saccharin; oder Geschmacksstoffe, wie Pfefferminz oder Methylsalicylat kombiniert werden. Antikörper oder ihre Formulierungen können an einen Säuger mit jedem Mittel, das zur Abgabe der Antikörper an das Ziel („target“) wirksam ist, verabreicht werden. Zu solchen Mitteln zählen intravenöse, intramuskuläre, subkutane, orale, intranasale, mukosale oder dermale Dosierungsformen. Eine lokalisierte Verabreichung der Antikörper oder Vakzin-Formulierungen gemäß der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ist ein bevorzugter Träger für injizierbare Formulierungen und für Formulierungen, die intranasal verabreicht werden können. Die Dosierung von Antikörpern zum Erhalt einer pharmazeutisch wirksamen Menge an therapeutischem 7 AT 503 297 B1

Mittel hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab. Beispielsweise haben das Alter, die Sensitivi-tät, Verträglichkeit und andere Charakteristika des Patienten einen Einfluss auf die Dosismengen. Weiters müssen der Plasmaspiegel und die Halbwertszeit der verwendeten Antikörper und die Affinität für ihre Erkennungsstellen und andere ähnliche Faktoren für eine wirksame Dosierung in Betracht gezogen werden. Für die systemische Verabreichung der Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung können Dosen im Bereich von etwa 1 mg/kg Patient/Tag bis etwa 500 mg/kg Patient/Tag, vorzugsweise von etwa 5 mg/kg Patient/Tag bis etwa 250 mg/kg Patient/Tag, mehr bevorzugt von etwa 10 mg/kg Patient/Tag bis etwa 100 mg/kg Patient/Tag verwendet werden, obwohl Dosierungen im unteren Ende des Bereiches einfach deshalb bevorzugt sind, weil sie leicht zu verabreichen und kostengünstig sind. Die Dosierungen können eingestellt werden, beispielsweise um einen bestimmten Plasmaspiegel eines Antikörpers vorzusehen, beispielsweise im Bereich von etwa 0,05 bis 200 pg/ml, mehr bevorzugt von etwa 0,1 bis 100 pg/ml, und um diesen Spiegel beizubehalten, beispielsweise für eine Zeitdauer oder bis zur Erreichung klinischer Ergebnisse. Chimäre und humanisierte Antikörper, von welchen man eine langsamere Clearance annehmen würde, würden geringere Dosierungen zur Aufrechterhaltung eines wirksamen Plasma-Spiegels erfordern. Auch Antikörper mit einer hohen Affinität für Bet v 1-Fragmente werden vorzugsweise weniger häufig oder in geringeren Dosen verabreicht als Antikörper mit geringerer Affinität. Eine therapeutisch wirksame Antikörper-Dosierung kann bestimmt werden, indem im Laufe der Behandlung eine Verringerung allergischer Reaktionen gezeigt wird. Vorzugsweise wird die Vakzin-Formulierung und das Medikament gemäß der vorliegenden Erfindung einem Individuum bis eine oder zwei Wochen vor der Pollen-Saison verabreicht.

Die Vakzin-Formulierung ist vorzugsweise zur intramuskulären, subkutanen, intravenösen Verabreichung oder zur Verabreichung über die Schleimhaut ausgelegt.

Die Formulierung gemäß der vorliegenden Erfindung kann auf verschiedenen Wegen verabreicht werden, wobei die intramuskuläre, subkutane, intravenöse Verabreichung oder die Verabreichung über die Schleimhaut bevorzugt sind. Die Antikörper, die spezifisch an die Bet v 1-Fragmente binden, welche aus den Aminosäuren 30 bis 59 (SEQ ID Nr. 1) oder den Aminosäuren 75 bis 104 (SEQ ID Nr. 2) bestehen, können einem Individuum zur Behandlung oder Prävention von allergischen, durch das Birkenpollen-Allergen Bet v 1 verursachten Reaktionen verabreicht werden. Insbesondere die Verabreichung der Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung über die Schleimhaut hätte eine Reihe von Vorteilen gegenüber traditionellen Immunisierungs-Schemata. Unter diesen sind vor allem eine wirksamere Stimulierung des lokalen mukosalen Immunsystems des Atmungstraktes und die Wahrscheinlichkeit, dass die Vakzin-Aufnahmeraten erhöht würden, weil die mit Injektionen verbundene Angst und Unannehmlichkeiten vermieden würden. Die Verwendung von Antikörpern, die an Allergene gemäß der vorliegenden Erfindung binden, könnte dazu beitragen, die allergischen Reaktionen durch Inhibierung der Bindung von IgE an die Allergene zu bekämpfen. Als Ergebnis dieser Inhibierung könnte die IgE-Produktion, die nach Kontakt mit dem Allergen normalerweise zunehmen würde, verringert werden.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und Figuren weiter veranschaulicht, ohne auf diese eingeschränkt zu sein.

Fig. 1 zeigt einen Versuchsentwurf. Zwei Gruppen von Balb/c-Mäusen (n=4/Gruppe) wurden i.p. mit rBet v 1/AI (OH)3 an den Tagen 1, 14 und 28 sensibilisiert. Blut wurde am Tag 36 entnommen (Ante-Serum). Am selben Tag wurde der Gruppe 1 rBet v 1-spezifisches IgG i.p. injiziert, wogegen die Gruppe 2 IgG für ein irrelevantes Allergen (Phi p 5) erhielt. Vierundzwanzig Stunden später (Tag 37) wurde Blut entnommen (Post-Serum).

Fig. 2 zeigt die Inhibition der ß-Hexosaminidase-Freisetzung durch rPhl p 5-spezifische IgG-Antikörper. Steigende Konzentrationen von rPhl p 5 (0,02 pg/ml-0,5 pg/ml) wurden mit Maus-Ante-Seren bzw. -Post-Seren vorinkubiert, RBL-Zellen ausgesetzt, und die ß-Hexosaminidase- 8 AT 503 297 B1

Freisetzung wurde gemessen. Die ß-Hexosaminidase-Freisetzung ist als Prozentsatz der gesamten ß-Hexosaminidase-Freisetzung ausgedrückt.

Fig. 3 zeigt die Inhibition der ß-Hexosaminidase-Freisetzung durch rBet v 1-spezifische IgG-5 Antikörper. Steigende Konzentrationen von rBet v 1 (0,02 pg/ml-0,5 pg/ml) wurden mit Maus-Ante-Seren bzw. -Post-Seren vorinkubiert, RBL-Zellen ausgesetzt, und die ß-Hexosaminidase-Freisetzung wurde gemessen. Die ß-Hexosaminidase-Freisetzung ist als Prozentsatz der gesamten ß-Hexosaminidase-Freisetzung ausgedrückt. io Beispiele:

Beispiel 1: Erzeugung und Charakterisierung von Hybridomen, die Allergen-spezifische blockierende lgG1-Antikörper sezernieren 15 Beispiel 1.1: Erzeugung von Hybridomen, die Allergen-blockierende lgG1-Antikörper sezernieren

Rekombinantes Birken-Pollen-Allergen Bet v 1 wurde in Escherichia coli exprimiert und wie zuvor beschrieben gereinigt (Hoffmann-Sommergruber et al., 1997). Die Peptide wurden am 20 Applied Biosystems Peptid-Synthesizer Modell 433A (Foster City, CA; USA) synthetisiert, und an jedes der synthetischen Peptide wurde ein Cystein-Rest zusätzlich zur ursprünglichen Sequenz angehängt, um die Kopplung an Träger zu erleichtern (Focke et al., 2004). In Tabelle 1 sind die Merkmale der nicht-anaphylaktischen, von Bet v 1 stammenden synthetischen Peptide zusammengefasst. 25

Tabelle 1. Merkmale nicht-anaphylaktischer, von Bet v 1 stammender Peptide SEQ ID Nr. Position AS Sequenz Anzahl Molekular-derAS gewicht Peptid 2 1 30-59 LFPKVAPQAISSVENIEGNGGPGTIKKISFC 31 3202,7 Peptid 6 2 75-104 CVDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLEKISNEIK 31 3484,9

Die synthetischen Peptide (Peptid 2, Peptid 6) wurden an Schlüsselloch-Napfschnecken-35 Hämocyanin („keyhole limpet haemocyanin“, KLH; MW 4,5 x 105 bis 1,3 x 107; Pierce, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers gekoppelt und unter Verwendung eines Conjugation Kits (Pierce) gereinigt. Balb/c-Mäuse (Charles river, Deutschland) wurden mit dem mit KLH gekoppelten Peptid (30 pg/ml pro Maus), das an AI(OH)3 adsorbiert war (75 pl/Maus) 3 Mal immunisiert (Tabelle 2). Der Allergen-spezifische lgG1 -Titer der Seren wurde mittels ELISA bestimmt. 40

Tabelle 2. Immunisierungsplan

Tag Tätigkeit Adjuvans Stelle 0 Primär-Immunisierung AI(OH)3 s. c. 28 Boost # 1 AI(OH)3 s. c. 46 Boost # 2 AI(OH)3 s. c. 49 Ernten d. Milzzellen u.Fusion AI(OH)3 s. c. so Milzzellen wurden 3 Tage nach der letzten Immunisierung geerntet, und die Hybridome wurden mittels herkömmlicher Hybridom-Technologie (Köhler und Milstein, 1975) mit geringen Modifikationen gezogen, wobei die HAT-sensitive, nicht-sezernierende Myelom-Zelllinie X63Ag8.653 (Kearney et al., 1979) als Fusionspartner verwendet wurde. Myelome wurden im Hybridom-Wachstumsmedium gezüchtet, bestehend aus RPMI 1640, ergänzt mit L-Glutamin (200 mM), 55 10% fötalem Rinderserum, Fungizon (200 E/ml) und Penicillin/Streptomycin (10000 E/ml). Die 9 AT 503 297 B1

Milz von Mäusen wurde, wie erwähnt, entfernt, und die Zellen wurden in serumfreiem Hybridom-Wachstumsmedium suspendiert. Nach dem Zentrifugieren bei 1750 U/min (5 min, 4°C) wurden die roten Blutkörperchen mit Lyse-Puffer (8,3 g/l Ammoniumchlorid, 1,0 g/l Kaliumbicarbonat, 0,037 g/l Tetranatrium-EDTA, pH 7,4; 2 min lang bei Raumtemperatur) lysiert, und die Zellen wurden drei Mal durch Zentrifugieren bei 1750 U/min (5 min, 4°C) gewaschen, wobei jedes Mal das Zell-Pellet sanft mit serumfreiem Hybridom-Wachstumsmedium resuspendiert wurde. Danach wurden lebensfähige Milzzellen und Myelom-Zellen (in log-Wachstumsphase) in einem Verhältnis von 2:1 (Milz:Myelom) zusammen gemischt, und nach dem Zentrifugieren wurden 1,5 ml vorgewärmtes (37°C) 41,3% Gew./Vol. Polyethylenglykol (PEG) 4000 zum aufgerührten Zell-Pellet langsam während 1 Minute zugegeben. Danach wurden die Zellen bei 800 U/min zentrifugiert (5 min, 4°C) und in HAT-Medium, ergänzt mit Feeder-Zellen, suspendiert, in Platten mit 96 Vertiefungen verteilt und bei 37°C in einem C02-lnkubator (5%) inkubiert. Die Zellen wurden etwa 2 Wochen lang wachsen lassen, und danach wurden die Überstände auf Antikörper-Produktion in einem Enzym-Immunoassay gescreent. ELISA-Platten wurden durch Inkubation über Nacht bei 4°C mit rBet v 1 (10 pg/ml), verdünnt in PBS, beschichtet. Nach einstündigem Blockieren bei 37°C mit 0,5% Gew./Vol. Rinderserumalbumin („bovine serum albumin“, BSA) in PBS-T (PBS + 0,05% Tween 20) wurden die Platten mit unverdünntem Hybridom-Überstand inkubiert und 2 Stunden lang bei 37°C reagieren lassen. Für die Detektion wurden die Platten mit einem 1:1000 verdünnten Pimär-Detektions-Antikörper (gereinigtes Ratten-anti-Maus-lgG1) 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert, gefolgt vom 1:2000 verdünnten, Enzym-markierten Sekundär-Antikörper (anti-Ratten-IgG, Horseradish-Peroxidase verbundener Spezies-spezifischer ganzer Antikörper), wobei je 30 min lang bei 37°C und 4°C inkubiert wurde. Zwischen den Inkubationsschritten wurden die Platten wiederholt mit PBS-T gewaschen. Schließlich wurden die Platten mit ABTS (2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthia-zolin-6-sulfonsäure)-diammoniumsalz (Sigma Aldrich) bei Raumtemperatur inkubiert, und die Absorption wurde bei 405 nm gemessen. Hybrid-Zellen, die Bet v 1-spezifische lgG1-Antikörper sezernierten, wurden mittels des limitierenden Verdünnungsverfahrens kloniert, d.h. positive Hybridome wurden expandiert, subkloniert, um die Monoklonalität zu gewährleisten, und kryo-konserviert.

Beispiel 1.2: Charakterisierung von Hybridomen, die Allergen-spezifische blockierende lgG1-Antikörper sezernieren

Zur Charakterisierung detaillierter Bindungs-Spezifitäten der erhaltenen monoklonalen lgG1-Antikörper mittels ELISA wurden Mikrotiter-Platten mit rBet v 1, Peptid 2 (AS 30-59), Peptid 6 (AS 75-104), Bet v 1-Trimer, Bet v 1-Fragment 1 (AS 1-74), Bet v 1-Fragment 2 (AS 75-160), KLH und rPhl p 1 in einer Konzentration von 5 pg/ml, verdünnt in PBS, beschichtet. Die Blockierung erfolgte durch Zugabe von 0,5% Gew./Vol. Rinderserumalbumin (BSA) in PBS-T (PBS + 0,05% Tween 20) während 1,5 Stunden bei 37°C, und danach wurde unverdünnter Hybridom-Überstand 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die spezifische Bindung von mAks wurde mit Primär-Detektions-Antikörper, gefolgt von Enzymmarkiertem Sekundär-Antikörper wie oben beschrieben nachgewiesen.

Insgesamt wurden 44 Seren von gegen Birkenpollen allergischen Patienten (gesamte IgE-Mengen: 24,1 - >5000 kUA/l; Birkenpollen-spezifisches IgE: 10,7 - >100 kUA/l) wurden gemäß der Anamnese ausgewählt, Serum einer nicht-allergischen Person wurde für Kontrollzwecke inkludiert. Die Gruppe der gegen Birkenpollen allergischen Patienten bestand aus 19 Männern und 25 Frauen mit einem mittleren Alter von 37 Jahren (Bereich von 21 bis 70 Jahre). In Tabelle 3 sind die Merkmale von Seren von ausgewählten, gegen Birkenpollen allergischen Patienten zusammengefasst. 1 0 AT 503 297 B1

Tabelle 3: Charakterisierung von Seren von gegen Birkenpollen allergischen Patienten

Patient Geschlecht Alter Gesamt-lgE (kUA/l) Birke (kUA/l) RAST- Klasse a1 W 26 24,1 11,5 3 a2 M 57 172 34,6 4 a3 W 24 149 20,4 4 a4 W 50 28,1 13,2 3 a5 M 57 36,9 26,1 4 a6 W 34 84,6 16,4 3 a7 W 35 141 22 4 a8 W 30 182 27,1 4 a9 W 23 278 54,5 5 a10 M 36 128 11,8 3 b1 M 28 158 20,5 4 b2 W 34 41,5 21,1 4 b3 W 38 120 42,5 4 b4 M NS >2000 >100 6 b5 W 23 423 63,3 5 b6 W 56 60,6 12,7 3 b7 W 38 273 84,6 5 b8 M 44 26,3 10,7 3 b9 M 60 235 49,6 4 b10 W 32 34,4 12,1 3 b11 M 41 >2000 >100 6 b12 M 26 34,7 18,6 4 b13 W 22 >5000 >100 6 b14 W 22 560 >100 6 b15 M 70 112 28,4 4 b16 M 25 512 94,4 5 b17 M 44 113 26,7 4 b18 M 41 94 19,8 4 b19 M 23 205 >100 6 b20 M NS 28,3 13,3 3 b21 M NS NS 32,1 4 b22 M 29 338 16,5 3 b23 M 57 >100 80,1 5 b24 M 37 95,3 41,6 4 b25 M NS 252 41 4 b26 M 36 50 13,7 3 b27 M 52 125 51,3 5 b28 M 23 122 17,6 4 b29 W 24 49,9 27,4 4 b30 M 53 59,7 14,1 3 b31 W 21 238 21,8 4 b32 W 21 218 28,8 4 b33 M 33 72,1 11,8 3 b34 W 31 60,1 33,1 4 1 1 AT 503 297 B1

Die Individuen sind wie in Tabellen 6-9 nummeriert. Die demographischen Daten geben das Geschlecht und das Alter der für die Inhibierungsversuche verwendeten gegen Birkenpollen allergischen Patienten an. Die serologische Charakterisierung zeigt Gesamt-lgE, Birkenpollenspezifisches IgE und RAST-Klasse. NS=nicht spezifiziert.

Die ELISA-Platten wurden mit rBet v 1 (1 pg/ml) bei 4°C über Nacht beschichtet. Nach dem einstündigen Blockieren bei 37°C mit 0,5% Gew./Vol. Rinderserumalbumin (BSA) in PBS-T (PBS + 0,05% Tween 20) wurden die Platten mit unverdünntem einzelnen (Klon 2 (DSM ACC2782), 4 (DSM ACC2783), 10 (DSM ACC2785), 12 (DSM ACC2784), 13 (DSM ACC2786)) und gemischtem (Klon 2 und Klon 13) lgG1-Antikörper produzierendem Hybridom-Kultur-Überstand über Nacht bei 4°C vorinkubiert. Schließlich wurden die Platten mit 1:5 verdünnten Seren von 44 gegen Birkenpollen allergischen Patienten (4°C über Nacht) inkubiert, und gebundene IgE-Antikörper wurden mit einem 1:1000 verdünnten, mit alkalischer Phosphatase gekoppelten Maus-monoklonalen anti-Human-lgE-Antikörper nachgewiesen. Zwischen den Inkubationsschritten wurden die Platten wiederholt mit PBS-T gewaschen. Der Prozentsatz der Hemmung der IgE-Bindung an rBet v 1 nach der Vorinkubation mit monoklonalem lgG1-Antikörper wurde wie folgt berechnet: % Inhibition = 100 - (ODp x 100/ODnp). ODp und ODnp stellen die Extinktion nach der Vorinkubation mit Hybridom-Kultur-Überstand (ODp) bzw. ohne denselben (ODnp) dar.

Beispiel 1.3: Ergebnisse

Nach dem Ausplattieren und der Inkubation von fusionierten Milzzellen wurden alle Überstände aus Mikrotiter-Vertiefungen mittels ELISA, wie oben beschrieben, analysiert, um immunreaktive Hybridome zu isolieren. Eine weitere Vermehrung positiver Hybridome führte zur Selektion von 14 stabilen, monoklonalen, Peptid-spezifischen Antikörpern. Jeder gehört zum lgG1-lsotyp und exprimiert die leichte kappa-Kette. Die Tabelle 4 führt die erhaltenen Klone an. Die Klone 2, 4, 10, 12 und 13 wurden unter dem Budapester Vertrag an der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM, DSMZ), Braunschweig, Deutschland, unter den Hinterlegungsnummern DSM ACC2782 (Klon 2), DSM ACC2783 (Klon 4), DSM ACC2785 (Klon 10), DSM ACC2784 (Klon 12), DSM ACC2786 (Klon 13) am 9. Mai 2006 hinterlegt.

Tabelle 4. Beschreibung der Klone

Klon Name Isotyp kappaleicht. Kette Immunogen DSM- Hinterleg.Nr. 1 P2/3D3/12/2E7 lgG1 + rBet v 1 AS 30-59-KLH 2 P2/3D3/10/2D7 igGl + rBet v 1 AS 30-59-KLH ACC2782 3 P2/3D3/7/1E6 igGl + rBet v 1 AS 30-59-KLH 4 P2/6D5/36/2F11 IgGl + rBet v 1 AS 30-59-KLH ACC2783 5 P2/6D5/34/2F2 IgGl + rBet v 1 AS 30-59-KLH 6 P2/6D5/33/2E7 IgGl + rBet v 1 AS 30-59-KLH 7 P2/6D5/27/1F7 IgGl + rBet v 1 AS 30-59-KLH 8 P2/7G6/58/5G2 igGl + rBet v 1 AS 30-59-KLH 9 P2/7G6/57/5C3 IgGl + rBet v 1 AS 30-59-KLH 10 P2/7G6/55/4G3 IgGl + rBet v 1 AS 30-59-KLH ACC2785 11 P2/7G6/54/4F3 igGl + rBet v 1 AS 30-59-KLH 12 P6/6F6/150/1G7 IgGl + rBet v 1 AS 75-104-KLH ACC2784 13 P6/7B11/180/2G10 lgG1 + rBet v 1 AS 75-104-KLH ACC2786 14 P6/7B11/178/2G7 IqG1 + rBet v 1 AS 75-104-KLH

Die 14 Peptid-spezifischen Antikörper-produzierenden Klone wurden weiters getestet auf ihre Bindungseigenschaften an rBet v 1, Bet v 1-Peptide und Bet v 1-Derivate, wie das Bet v 1-Trimer, bestehend aus drei kovalent verbundenen Kopien von rBet v 1 (Vrtala et al., 2001) und zwei rBet v 1-Fragmente, welche die AS 1-74 (1) und die AS 75-160 (2) von Bet v 1 umfassen 1 2 AT 503 297 B1 (Vrtala et al., 2000). Weiters wurde die Bindung der monoklonalen Antikörper an die negativen Kontrollen, wie KLH und rPhl p1, bestimmt. In Tabelle 5 sind die Bindungseigenschaften der 14 monoklonalen Antikörper zusammengefasst. Keiner der 14 Peptid-spezifischen Antikörper zeigte irgendeine Reaktivität gegenüber KLH oder rPhl p 1, alle davon wiesen eine starke Reaktivität gegenüber rBet v 1 und dem Bet v 1-Trimer auf. Gemäß dem Immunogen zeigten die Klone Nummer 1-11, die Peptid-2-spezifische (AS 30-59) Antikörper erzeugen, eine Antikörper-Reaktivität gegenüber diesem Peptid (Peptid 2) und reagierten nicht mit dem Peptid 6 (AS 72-104). Peptid-6-spezifische (AS 72-104) Antikörper, die von den Klonen Nummer 12-13 erzeugt wurden, zeigten eine Bindung des Immunogens, hatten jedoch keine Bindung an Peptid 2 (AS 30-59). Eine weitere Untersuchung unter Verwendung von Bet v 1-Fragment 1 (AS 1-74) und Fragment 2 (AS 75-106) bestätigte, dass die Peptid-2-spezifischen Antikörper (Klone 1-11) eine Reaktivität gegenüber Fragment 1 (AS 1-74) zeigten, wogegen die Peptid-6-spezifischen Antikörper (Klone 12-13) eine Reaktivität gegenüber dem Fragment 2 (AS 75-160) aufwiesen.

Tabelle 5. Bindungseigenschaften von monoklonalen lgG1-Antikörpern rBet v 1 Klon rBet v 1 Trimer Fragment 1 AS 1-74 Fragment 2 AS 75-160 Peptid 2 AS 30-59 Peptid 6 AS 75-104 rPhl p 1 KLH 1 + + + - + - - - 2 + + + - + - - - 3 + + + - + - - - 4 + + + - + - - - 5 + + + - + - - - 6 + + + - + - - - 7 + + + - + - - - 8 + + + - + - - - 9 + + + - + - - - 10 + + + - + - - - 11 + + + - + - - - 12 + + - + - + - - 13 + + - + - + - - 14 + + - + - + - -

Tabelle 6 zeigt, dass die monoklonalen Antikörper auch die Bindung des IgE von allergischen Patienten an mit Bet v 1 kreuzreaktiven Allergenen inhibiert, wie dem Hauptallergen der Erlen-Pollen, Aln g 1, oder dem Hauptallergen von Apfel, Mal d 1.

Tabelle 6: Monoklonale lgG1-Antikörper inhibieren Serum-lgE-Bindung gegen Birkenpollen allergischer Patienten an Bet v 1-Homologe____ % Inhibition % Inhibition Aln g 1 Aln g 1 Aln g 1 Maid 1 Maid 1 Maid 1 Patient Klon 2 Klon 4 Klon 10 Klon 2 Klon 4 Klon 10 a1 40,95 28,25 30,79 20,56 11,85 14,63 b3 69,13 52,22 62,37 30,67 5,14 7,51 b16 52,82 28,32 44,70 41,22 19,35 28,32 b9 74,63 48,34 63,88 36,16 14,37 18,08 b15 45,14 29,81 39,05 29,91 15,33 24,30 b14 47,92 20,37 41,42 35,58 22,79 17,22 b20 61,73 39,42 54,23 31,45 20,16 22,98 b19 44,72 25,04 35,59 32,29 20,38 18,18 b26 9,40 6,04 11,41 9,32 6,21 8,07 b33 1,06 2,13 0,00 41,22 24,90 29,80 Mittel 44,8 28,0 38,3 30,8 16,0 18,9 13 AT 503 297 B1

Die mit den lgG1 mAks (Klon 2, 4, 10) erhaltenen Prozent Inhibierung der IgE-Bindung an vollständiges rBet v 1 ist für Seren von 10 gegen Birkenpollen allergischen Patienten gezeigt. Die Mittelwerte der Prozent Inhibition sind unten in der Tabelle gezeigt.

Die Kapazität Peptid-spezifischer Antikörper, die Bindung des IgE allergischer Patienten an vollständiges rBet v 1 zu inhibieren, wurde mit ELISA-Kompetitionsversuchen bestimmt (Tabellen 7-9), wobei Seren von 44 gegen Birkenpollen allergischen Patienten verwendet wurden. Fünf von insgesamt 14 Klonen wurden für eine Vorinkubation mit rBet v 1 ausgewählt, bevor sie dem Patienten-lgE ausgesetzt wurden. Die stärkste Hemmung der IgE-Bindung wurde nach Vorinkubation mit Peptid 6-spezifischen (AS 75-104) Antikörpern (Klon 12: 60,4% - 74,8% durchschnittliche Inhibition; Klon 13: 58,5% bis 72,6% durchschnittliche Inhibition) beobachtet, wogegen die Peptid 2-spezifischen (AS 30-59) Antikörper (Klon 2: 46,2% bis 62,7% durchschnittliche Inhibition; Klon 4: 44,3% und 58,7% durchschnittliche Inhibition und Klon 10: 41,0% und 52,4% durchschnittliche Inhibition) auch die Bindung von Patienten-lgE an rBet v 1 inhibierten, wenn auch in geringerem Ausmaß. Interessanterweise wies eine Mischung aus einem Peptid 2-spezifischen monoklonalen Antikörper (Klon 2) und einem Peptid 6-spezifischen monoklonalen Antikörper keine stärkere Inhibition der IgE-Bindung auf als die einzelnen monoklonalen Antikörper alleine (Tabellen 7-9).

Tabelle 7. Monoklonale lgG1 -Antikörper inhibieren Serum-lgE-Bindung von Birkenpollen-Aller· gikern an rBet v 1 OD ohne mAk OD mit mA k % Inhibition Patient Klon 2 Klon 4 Klon 10 Klon 12 Klon 13 Klon 2 Klon 4 Klon 10 Klon 12 Klon 13 a1 0,45 0,34 0,34 0,37 0,36 0,36 23 25 17 20 19 a2 0,74 0,34 0,36 0,40 0,21 0,20 54 51 46 72 73 a3 0,93 0,49 0,52 0,58 0,61 0,66 47 45 38 34 29 a4 0,61 0,23 0,23 0,26 0,15 0,13 62 62 57 76 78 a5 1,19 0,81 0,87 0,86 0,43 0,58 32 27 28 64 52 a6 0,41 0,20 0,22 0,24 0,12 0,13 51 47 42 71 69 a7 0,62 0,33 0,35 0,38 0,19 0,22 48 44 38 70 65 a8 0,63 0,31 0,32 0,33 0,17 0,20 50 49 47 73 69 ad 0,42 0,19 0,19 0,19 0,10 0,09 55 54 54 76 78 a10 0,38 0,23 0,23 0,22 0,19 0,18 40 39 43 49 54 Kontrolle 0,06 0,09 0,09 0,09 0,14 0,15 0 0 0 0 0 Mittel 46,2 44,3 41,0 60,4 58,5

Die mit den lgG1 mAks (Klon 2, 4, 10, 12, 13) erhaltenen Prozent Hemmung der IgE-Bindung an vollständiges rBet v 1 sind für Seren von 10 gegen Birkenpollen allergischen Patienten (a1-a10) gezeigt, Serum einer nicht-allergischen Person dient als Kontrolle. Die Mittelwerte der Prozent Inhibition sind unten in der Tabelle gezeigt.

Tabelle 8. Monoklonale lgG1-Antikörper inhibieren Serum-lgE-Bindung von Birkenpollen-Aller-gikern an rBet v 1_ OD ohne mAk _ OD mit mAk % Inhibition

Patient Klon 2 Klon 4 Klon 10 Klon 12 Klon 13 Klon 2 Klon 4 Klon 10 Klon 12 Klon 13 b1 0,35 0,09 0,10 0,13 0,06 0,06 75 72 63 84 84 b2 0,29 0,09 0,11 0,13 0,07 0,07 70 64 56 77 75 b3 0,52 0,13 0,18 0,23 0,08 0,12 74 66 55 85 77 b4 1,05 0,25 0,24 0,36 0,10 0,12 76 77 66 90 89 b5 0,70 0,26 0,31 0,37 0,09 0,12 62 55 46 87 82 b6 0,12 0,04 0,06 0,06 0,04 0,04 70 51 45 70 67 b7 0,73 0,29 0,29 0,38 0,13 0,18 61 60 47 82 75 b8 0,13 0,06 0,06 0,07 0,05 0,05 57 56 49 63 65 b9 0,33 0,09 0,10 0,13 0,06 0,06 73 71 61 83 82 b10 0,11 0,06 0,07 0,07 0,06 0,06 47 39 37 47 47 b11 1,24 0,28 0,30 0,40 0,08 0,12 78 76 68 94 91 b12 0,17 0,04 0,06 0,06 0,03 0,04 75 66 63 79 78 b13 0,88 0,16 0,16 0,22 0,08 0,08 82 81 75 91 90 b14 1,61 0,76 0,77 0,95 0,29 0,46 53 52 41 82 72 14 AT 503 297 B1

Tabelle 8. Monoklonale lgG1-Antikörper inhibieren Serum-lgE-Bindung von Birkenpollen-Aller- gikern an rBet v 1 OD ohne mAk OD mit mAk % Inhibition Patient Klon 2 Klon 4 Klon 10 Klon 12 Klon 13 Klon 2 Klon 4 Klon 10 Klon 12 Klon 13 b15 0,30 0,15 0,16 0,18 0,12 0,12 51 48 40 61 60 b16 1,52 0,80 0,85 0,89 0,35 0,56 48 44 42 77 63 b17 0,25 0,08 0,09 0,11 0,04 0,06 67 63 56 82 75 b18 0,16 0,09 0,09 0,11 0,07 0,08 45 43 34 59 54 b19 0,51 0,13 0,14 0,17 0,06 0,06 75 72 66 89 88 b20 0,11 0,07 0,08 0,08 0,06 0,06 33 30 29 42 42 b21 0,54 0,17 0,21 0,24 0,06 0,09 68 62 54 89 83 b22 0,21 0,12 0,12 0,12 0,09 0,09 42 44 40 56 57 b23 0,52 0,13 0,14 0,17 0,06 0,06 75 73 67 89 89 b24 0,30 0,08 0,09 0,10 0,04 0,04 73 70 65 86 86 b25 0,40 0,15 0,15 0,18 0,10 0,11 63 61 55 74 73 b26 0,16 0,09 0,09 0,09 0,08 0,07 46 44 42 50 55 b27 0,42 0,14 0,15 0,17 0,07 0,07 68 65 59 84 84 b28 0,16 0,06 0,07 0,08 0,05 0,05 61 57 53 70 71 b29 0,31 0,13 0,14 0,17 0,07 0,09 59 55 47 76 71 b30 0,12 0,05 0,07 0,07 0,05 0,06 53 38 37 55 52 b31 0,35 0,15 0,16 0,18 0,11 0,12 55 53 49 68 66 b32 0,25 0,07 0,08 0,09 0,06 0,05 73 70 65 75 79 b33 0,11 0,05 0,05 0,06 0,04 0,04 55 52 48 65 65 b34 0,39 0,12 0,13 0,16 0,06 0,06 69 67 60 84 85 Kontrolle 0,03 0,03 0.04 0,03 0,04 0,08 4 0 0 0 0 Mittel 62,7 58,7 52,4 74.8 72,6

Die mit den lgG1 mAks (Klon 2, 4,10,12,13) erhaltenen Prozent Inhibition der IgE-Bindung an vollständiges rBet v 1 sind für Seren von 34 gegen Birkenpollen allergischen Patienten (b1-b34) gezeigt, Serum einer nicht allergischen Person dient als Kontrolle. Die Mittelwerte der Prozent Inhibition sind unten in der Tabelle gezeigt.

Tabelle 9. Inhibition der Serum-lgE-Bindung von Birkenpollen-Allergikern an rBet v 1.Vergleich der Inhibitionsfähigkeit von zwei einzelnen monoklonalen Antikörpern und einer Mischung von diesen_

Patient OD ohne mAk OD mit mAk % Inhibition Klon 2 Klon 13 Klon 2/13 Mix Klon 2 Klon 13 I Klon 2/13 Mix a1 0,30 0,13 0,07 0,07 56 75 75 a2 0,29 0,11 0,07 0,07 61 76 74 a3 0,19 0,07 0,05 0,04 63 76 78 a4 0,17 0,08 0,05 0,05 56 72 70 a5 0,03 0,03 0,03 0,05 15 6 0 a6 0,14 0,09 0,07 0,09 36 48 37 a7 0,25 0,09 0,06 0,06 64 75 75 a8 0,24 0,10 0,08 0,07 60 68 72 a9 0,18 0,06 0,04 0,04 65 76 77 a10 0,30 0,16 0,11 0,09 47 64 70 Mittel 52,4 63,6 62,9

Die mit den einzelnen lgG1 mAks (Klon 2, Klon 13) erhaltenen Prozent Inhibition der IgE-Bindung an vollständiges rBet v 1 im Vergleich zur Inhibition durch eine Mischung von lgG1 mAks (Klon 2/13 Mischung). Die Inhibition ist für Seren von 10 gegen Birkenpollen allergischen Patienten (a1-a10) gezeigt. Die Mittelwerte der Prozent Inhibition sind unten in der Tabelle gezeigt.

Das Schlüsselereignis der allergischen Reaktion ist die Vernetzung von Effektor-Zellen gebundenen IgE-Antikörpern durch mehrwertige Allergene. Dies führt zu einer Granula-Exocytose und einer Freisetzung von biologischem Mediator (d.h. Histamin, Leukotriene), was dann eine aller- 1 5 AT 503 297 B1 gische Entzündung vom Soforttyp und somit eine allergische Rhinitis, Konjuktivitis und Asthma, bewirkt. In dieser Hinsicht ist die Allergen-lgE-Antikörper-Wechselwirkung ein mögliches Ziel für eine Allergen-spezifische passive Immuntherapie mit dem Ziel, die Wechselwirkung zwischen den Allergenen und den IgE-Antikörpern zu inhibieren (Valenta et al., 1998). Aus diesem Grund ist die Definition der IgE-Epitope eine wichtige Voraussetzung für die Entwicklung spezifischer Therapieformen. Im Falle der Hauptallergene, wie Phi p 1, mit kontinuierlichen IgE-Epitopen, ist es möglich, Allergene in IgE-bindende Haptene zu teilen, welche Effektor-Zell-gebundenes IgE vor der Einwirkung von Allergen sättigen und dadurch eine Vernetzung und eine Effektor-Zellaktivierung verhindern (Ball et al., 1994) (vgl. auch Kapitel 1: das Hapten-Prinzip). Im Gegensatz dazu gehören die IgE-Epitope des Birkenpollen-Hauptallergens, Bet v 1, vor allem zum konformationellen (diskontinuierlichen) Typ. In diesem Fall kann die Allergen-lgE-Antikörper-Wechselwirkung blockiert werden mit therapeutischen Allergen-spezifischen Antikörpern, welche mit dem Patienten-lgE um die Bindungsstellen am Allergen konkurrieren und dadurch eine Aktivierung von Effektor-Zellen verhindern. Ein solcher therapeutischer Ansatz ist vernünftig, insbesondere wenn Patienten nur gegen einige Hauptallergene sensibilisiert sind.

Im vorliegenden Beispiel wurden 14 monoklonale Bet v 1-Peptid-spezifische Antikörper, die alle zur lgG1-Unterklasse gehören, hinsichtlich ihrer Epitop-spezifischen Bindungseigenschaften sowie hinsichtlich ihrer Kapazität, die Bindung des IgE von Allergikern an das Bet v 1-Allergen zu stören, charakterisiert.

Gemäß ihrer Bindungs-Spezifitäten können die monoklonalen Antikörper in zwei Gruppen unterteilt werden: monoklonale Antikörper der Gruppe I (Klone 1-11) erkannten Peptid 2 (AS 30-59) sehr stark, wogegen monoklonale Antikörper der Gruppe II (Klone 12-13) gebundenes Peptid 6 stark erkannten (AS 75-104). Alle monoklonalen Antikörper banden stark an rBet v 1 und rBet v 1-Trimer und zeigten eine Spezifität, weil sie nicht verwandte Kontroll-Proteine, wie KLH und rPhl p 1, nicht erkannten.

Beim Testen auf eine Störung der Bindung von Patienten-lgE an Bet v 1 inhibierte jeder der monoklonalen Antikörper die IgE-Bindung in wesentlichem Ausmaß, einige bei bestimmten Patienten bis zu 94%. Interessantenweise zeigten diese Ergebnisse, dass ein einziger monoklonaler Antikörper ausreicht, um mit der polyklonalen IgE-Bindung bei Patienten zu konkurrieren. Peptid 6-spezifische monoklonale Antikörper zeigten im Vergleich zu Peptid 2-spezifischen monoklonalen Antikörpern eine stärkere Inhibition.

Beim Vergleich der Inhibitionsstärke einzelner monoklonaler IgG-Antikörper mit verschiedenen Epitop-Spezifitäten (Klon 2: Peptid 2-spezifisch; Klon 13: Peptid 6-spezifisch) mit einer Mischung von zwei Antikörpern mit verschiedenen Spezifitäten wurde bei der Antikörper-Mischung keine stärkere Inhibition der Bindung von Patienten-lgE beobachtet.

Prinzipiell kommen zwei Erklärungen für die Blockierungsaktivität der Peptid-spezifischen lgG1-Antikörper in Betracht. Erstens kann die Inhibition dadurch erklärt werden, dass die erhaltenen monoklonalen Antikörper Epitope in den oder nahe den Haupt-lgE-Bindungsstellen von Bet v 1 erkennen. Zweitens kann die Blockierungsaktivität durch die Modifizierung der Konformation des Allergens bewirkt sein, so dass die IgE-Epitope oder auch nur ein Teil davon nicht mehr für IgE zugänglich sind. Die letztere Erklärung würde auf die Ergebnisse aus dem Inhibitionsver-such passen, der zeigt, dass eine Mischung von zwei Peptid-spezifischen monoklonalen Antikörpern mit verschiedener Epitop-Spezifität keine stärkere Inhibition der IgE-Bindung ergab als die einzelnen monoklonalen Antikörper. Diese Theorie kann durch Strukturanalysen des Aller-gen-Antikörper-Komplexes bestätigt werden.

Es wurden bereits mehrere monoklonale Human- und Maus-Antikörper mit therapeutischem Potential mittels klassischer Gewebekultur- und kombinatorischer Klonier-Technik unter Verwendung von B-Zellen von allergischen Patienten oder immunisierten Mäusen als Quelle isoliert (Sun et al., 1995; Visco et al., 1996; Lebeque et al., 1997; Flicker et al., 2002). Diese Antikörper 16 AT 503 297 B1 konnten die Allergen-lgE-Wechselwirkung inhibieren und eine Allergen-induzierte Degranulation basophiler Zellen verhindern.

Auch Bet v 1-spezifische humane blockierende Antikörper wurden bereits hergestellt durch Erzeugung von Hybridom-Zelllinien von Patienten, die mittels Immuntherapie behandelt wurden (Visco et al., 1996). Bet v 1-spezifische monoklonale Maus-Antikörper wurden mittels der klassischen Hybridom-Technologie isoliert (Lebeque et al., 1997). Im Vergleich zu den bereits früher erhaltenen Bet v 1-spezifischen monoklonalen Antikörpern wurden die in diesem Beispiel beschriebenen Antikörper aus Mäusen isoliert, die mit von Bet v 1 stammenden Peptiden, welche eine bestimmte Aminosäuresequenz hatten, immunisiert wurden, wodurch das spezifische Epitop schon zu Beginn des Vorgangs bestimmt war.

Blockierende Antikörper, wie oben beschrieben, können auch humanisiert oder als rekombinan-te Antikörper-Fragmente erzeugt werden, um ihre Immunogenität zu verringern. Therapeutische Allergen-spezifische Antikörper können lokal in die Zielorgane der Allergie verabreicht werden (z.B. über die Nase oder über die Bronchien-Schleimhaut, Bindehaut), um eine stabile Verteidigungslinie gegen eindringende Allergene aufzubauen, oder systemisch, wie als passive Vakzine (Valenta et al., 1997).

Schließlich können die monoklonalen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung durch eine lokale Therapie oder eine passive Impfung auch zur Verhinderung einer Allergen-induzierten Mediator-Freisetzung in den Zielorganen der Allergie verwendet werden.

Beispiel 2:

Ein Maus-Modell zur Untersuchung der Auswirkungen einer passiven Impfung mit Allergenspezifischen IgG-Antikörpern in vivo wurde etabliert (Fig. 1). Mäuse (Charles River, Deutschland) wurden intraperitoneal (i.p.) mit 5 pg rBet v 1 (Biomay, Österreich), dem Birkenpollen-Hauptallergen, das an AI(OH)3 (Alu-Gel-S; Serva, Deutschland) adsorbiert war, am Tag 1, 14 und 28 sensibilisiert. Blutproben (Ante-Serum) wurden aus den Schwanzvenen der sensibilisierten Mäuse am Tag 36 entnommen. Die allergische Sensibilisierung gegen Bet v 1 wurde durch Messung von Bet v 1-spezifischen IgE-Antikörpern in diesen Seren bestätigt (Vrtala et al., 1998). Die Bet v 1-spezifischen IgE-Mengen aller acht Seren waren vergleichbar (Tabelle 10, Ante-Serum).

Die Mäuse wurden dann in zwei Gruppen geteilt: Die Gruppe 1 wurde i.p. mit 0,5 ml Bet v 1-spezifischem IgG behandelt. Der Gruppe 2 (Kontrollgruppe) wurden 0,5 ml IgG, das gegen ein nicht verwandtes Allergen, Phi p 5, gerichtet war, injiziert. Am Tag 37 wurde Blut aus den Schwanzvenen (Post-Serum) von Mäusen von beiden Gruppen entnommen, und die IgE-Reaktivität auf rBet v 1 wurde mit jener der Ante-Seren verglichen. Zu diesem Zweck wurden 5 pg/ml rBet v 1 über Nacht auf ELISA-Platten beschichtet, die Platten wurden mit 3% BSA/TBST (50 mM Tris, 150 mM NaCI, 0,5% Gew./Vol. BSA, 0,05% Vol./Vol. Tween) blockiert. Die Maus-Seren wurden 1:10 in TBST verdünnt, über Nacht inkubiert, und gebundenes IgE wurde mit einem monoklonalen Ratten-anti-Maus-lgE-Antikörper (BD Pharmingen; USA) bzw. mit einem mit HRP markierten Ziegen-anti-Ratten-Antiserum (Amersham, U.K.) nachgewiesen. Die Tabelle 9 zeigt die Ergebnisse, die Mittelwerte von Duplikat-Bestimmungen darstellten, wobei die Variationen weniger als 10% betrugen. Die Kolonnen 1 und 2 zeigen die IgE-Bindung von Mäusen an rBet v 1 vor (Ante-Serum) und nach (Post-Serum) der Behandlung mit IgG. Die Prozent Inhibition der IgE-Bindung an rBet v 1 in Post-Seren (dritte Kolonne) wurden wie folgt berechnet: Prozent Inhibition = 100-ODPost.Serum x 100/ODAnte-serum· Die Inhibitionsrate lag im Bereich zwischen 23,4 und 54,6% (Tabelle 10).

Die Tabelle 10 zeigt die Inhibition der Maus-lgE-Bindung an rBet v 1 durch rBet v 1-spezifische IgG-Antikörper. Die IgE-Bindung an rBet v 1 ist vor (Ante-Serum; erste Kolonne) und nach 1 7 AT 503 297 B1 (Post-Serum; zweite Kolonne) Behandlung mit rBet v 1-spezifischem IgG oder mit Phi p 5-spezifischem IgG gezeigt. Die Prozent Hemmung der IgE-Bindung der Post-Seren ist in der dritten Kolonne gezeigt.

Tabelle 10. Inhibition der Maus-lgE-Bindung an rBet v 1.

Individuum OD^snm % Inhibition der IgE-Bindung an rBet v 1

IgE-Bindung an rBet v 1

Ante-Serum Post-Serum

Gruppe 1 1 1,110 0,850 23,4 2 0,738 0,335 54,6 3 0,417 0,220 47,2 4 Gruppe 2 0,362 0,197 45,6 5 1,884 1,784 5,3 6 0,508 0,503 1,0 7 0,200 0,175 12,5 8 0,468 0,497 +6,2

Beinahe keine Inhibition der IgE-Bindung an rBet v 1 wurde bei Mäusen der Gruppe 2 beobachtet, die IgG mit einer Spezifität für Phi p 5 erhalten hatten. Bei einem ähnlichen Versuch, der an gegen Phi p 5 allergischen Mäusen durchgeführt wurde, lagen die Prozent Inhibition der IgE-Bindung, die durch Behandlung mit Phi p 5-spezifischem IgG erreicht wurde, im Bereich von 7,7-58% (Tabelle 11).

Die Tabelle 11 zeigt die Inhibition der Maus-lgE-Bindung an rPhl p 5 durch rPhl p 5-spezifische IgG-Antikörper. Die IgE-Bindung (OD-Mengen) an rPhl p 5 ist vor (Ante-Serum; erste Kolonne) und nach (Post-Serum; zweite Kolonne) Behandlung mit rPhl p 5-spezifischem IgG oder rBet v 1-spezifischem IgG gezeigt. Die Prozent Hemmung der IgE-Bindung der Post-Seren sind in der dritten Kolonne gezeigt.

Tabelle 11. Inhibition der IgE-Bindung an rPhl p 5. Individuum OD^s™ % Inhibition der IgE-Bindung an rPhl p 5

IgE-Bindung an rPhl p 5

Ante-Serum Post-Serum

Gruppe 1 1 0,701 0,647 7,7 2 0,680 0,387 43,1 3 0,802 0,416 48,1 4 0,669 0,281 58,0 Gruppe 2 5 0,687 0,711 +3,5 6 0,828 0,773 6,7 7 0,944 0,809 14,4 8 0,828 0,756 8,7

Ob Allergen-spezifische IgG Antikörper Allergen-induzierte allergische Reaktionen des unmittel- 18 AT 503 297 B1 baren Typs inhibieren können, wurde analysiert, indem der ß-Hexosaminidase-Freisetzungs-Test aus basophilen Leukämiezellen der Ratte („rat basophil leukemia“, RBL) verwendet wurden, RBL-2H3-Zellen (Eccleston et al., 1973) wurden in Gewebekultur-Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert (4 x 104/Vertiefung) und 24 Stunden lang bei 37°C in 5% C02 gezüchtet. Die Zellen wurden zweimal in Tyrode's Buffer (Sigma-Aldrich, Österreich) (137 mM NaCI, 2,7 mM KCl, 0,5 mM Mg-Cl2, 1,8 mM CaCI2, 0,4 mM NaH2P04, 5,6 mM D-Glucose, 12 mM NaHC03, 10 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES) und 0,1% Gew./Vol. Rinderserumalbumin, pH 7,2) gewaschen. Unterschiedliche Allergen-Konzentrationen (0,5 pg/ml; 0,1 pg/ml; 0,02 pg/ml) wurden mit Maus-Ante- bzw. -Post-Seren (1:10 in Tyrode’s Buffer verdünnt) inkubiert. Die Allergen/lgE- und Allergen/lgG-Komplexe wurden den RBL-Zellen ausgesetzt und 2 Stunden lang in einer angefeuchteten Atmosphäre bei 37°C inkubiert. Die Menge der ß-Hexosaminidase-Freisetzung wurde mittels Fluoreszenz-Spektroskopie (CYTO FLUOR™ 2350, Millipore, USA) gemessen. Die Ergebnisse sind als Prozent der gesamten ß-Hexosaminidase-Freisetzung ausgedrückt, die durch Zugabe von 1% Vol./Vol. Triton X-100 erreicht wurde. Fig. 2 und 3 zeigen, dass die ß-Hexosaminidase-Freisetzung von RBL-Zellen im Vergleich zu Allergen plus Ante-Serum niedriger ist, wenn die Zellen mit Allergen plus Post-Serum inkubiert werden.

Literaturstellen:

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Sequence listing

<110> BiomayAG <120> Allergen-spezifische Antikörper <130> R46295 <140> ATA 866/2006 <141 > 2006-05-18 <160> 2

Claims

19 AT 503 297 B1 <170> Patentin version 3.3 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Bet v 1-Fragment <400> 1 Val Ala Pro Gin Ala Ile Ser Ser Val Glu Asn Ile 5 10 15 Gly Pro Gly Thr Ile Lys Lys Ile Ser Phe Cys 25 30 Leu Phe Pro Lys 1 Glu Gly Asn Gly 20 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Bet v 1-Fragment <400> 2 Cys Val Asp His Thr Asn Phe Lys Tyr Asn Tyr Ser Val Ile Glu Gly 15 10 15 Gly Pro Ile Gly Asp Thr Leu Glu Lys Ile Ser Asn Glu Ile Lys 20 25 30 Patentansprüche: 1. Verwendung eines Antikörpers oder eines Derivats davon zur Herstellung eines Medikaments für die passive Immunisierung eines Individuums zur Prävention und/oder Behandlung von durch Einwirkung eines Birkenpollen-Allergens verursachten allergischen Reaktionen bei diesem Individuum, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper an ein Bet v 1-Fragment bindet, das die Aminosäuren 30 bis 59 (SEQ ID Nr. 1) oder die Aminosäuren 75 bis 104 (SEQ ID Nr. 2) umfasst.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein IgG-Antikörper, insbesondere ein IgG-Antikörper vom Isotyp lgG1 oder lgG4 ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein muriner Antikörper ist.

4. Verwendung nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein chimärer Antikörper ist.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper humanisiert ist. 20 AT 503 297 B1

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist, der durch ein Hybridom sezemiert ist, das unter dem Budapester Vertrag bei der DSMZ am 9. Mai 2006 hinterlegt wurde und dem die Hinterlegungsnummern DSM ACC2782, DSM ACC2783, DSM ACC2785, DSM ACC2784 und DSM ACC2786 zugeteilt wurden.

8. Antikörper oder Derivat davon, der (das) an ein Fragment von Bet v 1 bindet, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment von Bet v 1 aus den Aminosäuren 30 bis 59 (SEQ ID Nr. 1) oder den Aminosäuren 75 bis 104 (SEQ ID Nr. 2) besteht.

9. Antikörper oder Derivat davon nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein IgG-Antikörper, insbesondere ein IgG-Antikörper vom Isotyp lgG1 oder lgG4, ist.

10. Antikörper oder Derivat davon nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein muriner Antikörper ist.

11. Antikörper oder Derivat davon nach Anspruch 8 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein chimärer Antikörper ist.

12. Antikörper oder Derivat davon nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper humanisiert ist.

13. Antikörper oder Derivat davon nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

14. Antikörper oder Derivat davon nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist, der durch ein Hybridom sezerniert ist, das unter dem Budapester Vertrag bei der DSMZ am 9. Mai 2006 hinterlegt wurde und dem die Hinterlegungsnummern DSM ACC2782, DSM ACC2783, DSM ACC2785, DSM ACC2784 und DSM ACC2786 zugeteilt wurden.

15. Vakzin-Formulierung, umfassend einen Antikörper nach einem der Ansprüche 8 bis 14.

16. Vakzin-Formulierung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Formulierung zur intramuskulären, subkutanen, intravenösen oder mucosalen Verabreichung ausgelegt ist. Hiezu 3 Blatt Zeichnungen