AT396938B - Verfahren zur herstellung eines melanom-assoziierten antigens - Google Patents

Description

AT 396 938 B 1. Erfindungsbereich

Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit dem Gebiet der Vakzine-Formulierungen, die eine Immunreaktion zur selektiven Zerstörung von Melanom-Zellen in einem geimpften Individuum hervorrufen können. Demzufolge trachtet man ein mit einem Melanom-assoziierten Antigen verwandtes Peptid oder Protein in großen Mengen durch rekombinante DNA-Verfahren und/oder durch chemische Syntheseverfahren heizustellen. Dieses Peptid oder Protein könnte in einer Vakzine-Formulierung als Immunogen verwendet werden. Warn das mit einem Melanom-assoziierten Antigen verwandte Peptid oder Protein durch ein rekombinantes Virus exprimiert wird, kann das rekominante Virus selbst in einer Vakzine-Formulierung als Immunogen varwendet werden.

Ziel der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung des Melanom-assoziierten Antigen p97, das eine im wesentlichen der Darstellung der angeschlossenen Fig. 3 entsprechende Aminosäuresequenz aufweist, bzw. zur Herstellung eines antigenen Teils desselben.

Bei dem Antigen p97 handelt es sich um ein monomeres Zelloberflächen-Sialoglycoprotein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwas weniger als 97.000 Dalton, das eine Zelloberflächenkomponente von Melanomzellen ist 2. Grundlagen der Erfindung 2.1. Tumor-assoziierte Antigene

Die Arbeit mit Versuchstieren, insbesondere mit Nagetieren, hat gezeigt, daß die meisten durch onkogene Viren hervorgerufenen Tumore Antigene exprimieren, für die das virale Genom codiert, und daß die Immunisierung mit diesen Antigenen zur Abwehr eines darauffolgenden Angriffs von Tumorzellen führen kann, die durch das gleiche Virus induziert sind. Obwohl viele dieser Arbeiten mit Labor-Virusstämmen, wie SV40, Polyom-Virus und Friend-, Moloney- oder Rauscher-Mäuseleukämie-Viren gemacht wurden, wurde horizontale und vertikale Übertragung der onkogenen Viren auch in der Natur gezeigt; tatsächlich ist nun ein Impfstoff gegen virusinduzierte Katzen-Leukämie und -Sarkom im Handel erhältlich.

Im Gegensatz dazu ist eine virale Ursache der meisten humanen Krebsarten nicht belegt. Wichtige Ausnahmen sind das Hepatitis-Virus (Hepatom), das Herpes simplex-Virus (Cervicalcarcinom) und das Epstein-Barr-Virus (nasopharyngales Carcinom). Während der letzten 20 Jahre wurde jedoch festgestellt, daß einige humane Tumorzellen Tumorantigene exprimieren, d. h. Antigene, die die Tumorzellen von ihren normalen zellulären Gegenstücken unterscheiden; manche Patienten zeigen zellständige oder humorale Immunreaktionen gegen diese Antigene (Hellstrom et al. 1968, Nature, 220,1352; Morton et. al., 1968, Science 162,1279 bis 1281; Sniku et. al., 1976, J. Exp. Med. 144,873 - 881). Manche Ziele dieser Immunreaktionen sind orikofötale oder Differenzierungs-Antigene, die von dem humanen Genom codiert werden (Hellstrom et al., 1970, Int J. Cancer, 6,346 - 351).

Bis vor kurzem war die molekulare Natur der Tumoiantigene unbekannt und das Ausmaß der Tumorspezifität der immunologischen Reaktionen war unklar. Versuche, diese Information zur Entwicklung krebsdiagnostischer Prüfungen oder von Krebstherapien zu verwenden, waren weitgehend erfolglos. Da spontane Tumorregressionen äußerst selten sind, kann man auch den Schluß ziehen, daß die in vitro gezeigten Immunreaktionen in vivo ohne Wirkung sein würden; wenn beispielsweise die von einem Krebspatienten erhaltenen Antikörper und Lymphozyten zur Abtötung der Tumorzellen in vitro wirksam sind, hat die Immunreaktion desselben Krebspatienten in vivo keine Wirkung.

Die Einführung des Verfahrens der monoklonalen Antikörper von Köhler und Milstein (1975, Nature, 256, 495 - 497) führte zu intensiveren Forschungen in bezug auf humane Tumorantigene, da es die Mittel zur Defmierung solcher Antigene sowohl im molekularen Bereich als auch im Hinblick auf die Spezifität bietet (Hellstrom und Brown, 1979, "The Antigens", M. Sela, ed., Academic-Press, Vol. V: 1 - 66). Während der letzten Jahre wurde eine große Anzahl tumor-assoziierter Antigene beschrieben, von denen die meisten durch die monoklonalen Maus-Antikörper bestimmt wurden (Reisfeld und Seil, eds., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series, Vol. 27, Alan R. Liss, Inc. New York, 1985, S. 1 - 609). Obwohl sich praktisch alle gut charakterisierten Antigene als orikofötale oder Differenzierungs-Antigene erwiesen haben und sich ihre Spezifität für Tumore eh» quantitativ als qualitativ gezeigt hat, sind mehrere Antigene ausreichend spezifisch fiir neoplastische gegenüber normalen Zellen (meist entsprechend einem Faktor von 10 bis 1000), um als mögliche Ziele zur Identifizierung von Tumorzellen -2-

AT 396 938 B und zur Therapie verwendet zu werden. Humane monoklonale Antikörper für Tumorantigene wurden ebenfalls erhalten (Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. 80: 2026 - 2030). Das unterstützt die vorher genannte Tatsache, daß manche Krebspatienten eine Immumeaktion gegen ihre Tumore entwickeln.

Mehr als die Hälfte der bisher identifizierten tumor-assoziierten Zelloberflächen-Antigene sind Proteine oder Glycoproteine, für die das humane Genom codiert (eher als die endogenen oder exogenen Viren), wobei der Rest aus Glykolipiden besteht, die aus der abnormalen Expression oder Regulierung von Glycosyl-Transferasen resultieren. 2.2. Melanom-assoziiertes p97-Antieen

Das p97-Antigen ist ein tumor-assoziiertes Antigen, das zum ersten Mal in humanen Melanomen durch die Verwendung monoklonaler Antikörper identifiziert wurde (Brown et aL, 1980, J. Biol. Chem. 255:4980 - 4983; Dippold et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 6114 - 6118; Woodbury et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:2183 - 2187). Das p97-Antigen wurde ausführlich im Hinblick auf seine Expression in normalen und neoplastischen Geweben studiert und findet sich in den meisten humanen Melanomen und in bestimmten Fötalgeweben, wird jedoch nur in Spuren in normalen Geweben Erwachsener festgestellt (Brown et al., 1981, J. Immunol. 127: 539 - 546; Brown et. äL, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 539 - 543; Ganigues et al., 1982, Int. J. Cancer 29: 511 - 515). p97 wurde als Ziel für die diagnostische Darstellung von Melanomen bei Klinikuntersuchungen an Menschen verwendet (Larson et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:2101 - 2114). p97 ist ein monomeres Zelloberflächen-Sialoglycoprotein mit einem scheinbaren Molekulargewicht (MG), gemessen durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE), von etwa weniger als 97.000 Dalton. Durch monoklonale Antikörper wurden drei wesentliche antigene Stellen festgestellt, die an einem stabilen tryptischen Fragment mit 40 000 Dalton vorliegen (Brown et al., 1981, J. Immunol. 127: 539 - 546); die komplette Sequenz des p97 wurde jedoch nocht nicht bekannt. Zumindest zwei andere, unabhängig davon charakterisierte humane melanom-assoziierte Antigene, gp95 (Dippold et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:6114 - 6118) und gp87 (Khosravi et al., 1985, Int. J. Cancer 35:73 - 80) scheinen auf Grund der Analyse durch Sequenz-Immunopräzipitation mit dem p97 ident zu sein.

Die N-terminale Aminosäuresequenz des p97 ist mit Transferrin homolog und wie das Transferrin bindet das p97 Eisen (Brown et al., 1982, Nature, London, 296:171 -173). Die Analyse somatischer Zellhybride und die in situ-Hybridisierung haben gezeigt, daß das p97-Gen so wie die Gene für Transferrin und Transferrin-Rezeptor im chromosomalen Bereich 3q21 - 3q29 angeordnet sind (Plowman et al., 1983, Nature, London, 303:70 - 72; Yang et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:2752 - 2756). Diese Beobachtungen deuten daraufhin, daß das p97 eine Rolle beim Eisen-Stoffwechsel spielt 2.3. Krebs-Impfstoffe

Studien an Versuchstieren, üblicherweise an Mäusen, zeigten, daß die Immunisierung mit lebenden oder abgetöteten Krebszellen zur Abwehr eines darauffolgenden Angriffs von lebensfähigen Krebszellen führen kann. Versuche zur Immunisierung mit zellfreiem Material waren im allgemeinen weniger erfolgreich, doch wurden einige positive Berichte darüber veröffentlicht (Als Überblick vergl. Hellstrom und Brown, 1979, in "The Antigens“, M. Sela ed. Academic Press, Bd. V, 1 - 66). In manchen Fällen sind die für die Schutzwirkungen verantwortlichen Zielantigene virus-codiert, in vielen anderen Fällen ist jedoch die Art des Antigens, das eine schützende Immunreaktion hervorruft unbekannt

Studien an Menschen sind wesentlich schwieriger, und die Wirksamkeit von Krebs-Impfstoffen ist trotz mancher Erfolgsmeldungen umstritten. In vielen Fällen bestand die Vakzine-Zubereitung aus bestrahlten Tumorzellen oder Tumorzellen, die durch Einwirkung bestimmter chemischer Mittel abgetötet wurden. Da bisher reine humane tumor-assoziierte Antigene nicht zur Verfügung standen, gibt es auch keine Berichte über ihre Verwendung als Impfstoffe.

Ein theoretischer Hautpeinwand gegen die vorgeschlagene Verwendung von Krebs-Impfstoffen bei Menschen besteht darin, daß Menschen, die beispielsweise mit abgetöteten Krebszellen oder zellfreien Zubereitungen geimpft sind, immunologisch nicht reagieren, da die Tumorantigene, die das Ziel der Immunoreaktion sein können, in manchen normalen Zellen, wenn auch nur in Spurenmengen, Vorkommen und daher vom Immunsystem als "eigene" angesehen werden. Viele, wenn auch nicht alle tumor-assoziierten Antigene, die durch monoklonale Antikörper in humanen Tumoren festgestellt wurden, sind auch in manchen normalen Geweben -3-

AT 396 938 B vorhanden und es bestehen nur wenige Anhaltspunkte dafür, daß Krebspatienten in vivo wirkungsvoll auf sie reagieren. Es gibt Beweise, daß die Suppressorzellen eine Hauptrolle bei der Herunterregulierung der Immunreaktion auf Tumor-Antigene spielen (Nepom et al., 1983, Experientia, 39: 235 - 242). Weiters kann eine durch einen Satz von Tumorantigenen hervorgerufene Suppressorzellen-Reaktion die Induzierung einer wirkungsvollen tumorzerstörenden Reaktion auf einen anderen Satz von Tumorantigenen, die für sich keine Supression hervorrufen würden, verhindern (Hellstrom et al., 1983, in Biomembranes, A. Nowotny ed., Plenum Press. S. 365 - 388). 2.4. Rekomhinante DNA-Verfahren und Vaccinia-Viras

Die Verwendung in rekombinanten DNA-Verfahren zur Herstellung von Untereinheitsvakzinen zum Schutz gegen Infektionen beinhaltet das molekulare Klonen und die Expression von genetischer Information in einem geeigneten Vektor, der für Proteine codiert, die eine Immunreaktion gegen das-Protein in dem Wirtstier auslösen. In letzter Zeit wurden neuere Forschungen beschrieben, die möglicherweise zur Herstellung von Untereinheitsvakzinen einsetzbar sind (Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. 79:7415 - 7419; Mackett et al., 1984, J. ViroL 49: 857 - 864; Panicali, D. und Paoletti, E., 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. 79:4927 - 4931). Bei diesen Arbeiten wird das Vaccinia-Virus als Vektor zur Expression fremder, in sein Genom eingesetzter Gene verwendet. Nach der Einbringung in Wirtstiere exprimiert das rekombinante Vaccinia-Virus das eingesetzte fremde Gen und löst dabei eine Immunreaktion des Wirts gegen diese Gegenprodukte aus. Da lebende rekombinante Vaccinia-Viren als Impfstoffe verwendet werden können, kombiniert diese Arbeitsweise die Vorteile sowohl von Untereinheits- als auch lebenden Vakzinen.

Das Vaccinia-Virus enthält ein lineares doppelsträngiges DNA-Genom von etwa 187 Kilobasenpaaren und repliziert sich innerhalb des Cytoplasmas der infizierten Zelle. Diese Viren enthalten ein komplettes Transkriptions-Enzymsystem (inklusive verkappender, methylierender und polyadenylierender Enzyme) innerhalb des Viruskems, das für die Infektiosität des Virus notwendig ist. Die transkriptioneilen regulatorischen Sequenzen (Promotor) des Vaccinia-Virus erlauben die Initiierung der Transkription durch Vaccinia-RNA-Polymerase, doch nicht durch die RNA-Polymerase der Wirtszelle.

Die Expression fremder DNA in rekombinanten Vaccinia-Viren erfordert die Bindung von Vaccinia-Promotem an protein-codierende DNA-Sequenzen des fremden Gens. Plasmid-Vektoren, die auch Insertionsvektoien genannt werden, wurden zum Einsetzen chimärischer Gene in das Vaccinia-Virus konstruiert. Eine Art von Insertionsvektor besteht aus: a) einem Vaccinia-Virus-Promoter, der die transkriptioneile Initiationsstelle enthält; b) mehreren eindeutigen Restriktionsendonuclease Monierenden Stellen, die zum Einsetzen der fremden DNA-Fiagmente stromabwärts von der Transkriptions-Startstelle lokalisiert sind; c) nichtessentielle Vaccinia-Virus-DNA (wie das TK-Gen) benachbart dem Promoter und den Klonierungsstellen, die den Einbau des chimärischen Gens in die homologe nichtessentielle Region des Virusgenoms leiten; und d) einen bakteriellen Ursprung von Replikation und antibiotischer Widerstandsfähigkeit als Marker für die Replikation und Selektion in E. Coli. Beispiele solch» Vektoren sind von Mackett (Mackett et al., 1984, J. Virol. 49,857 - 864) beschrieben.

Rekombinante Vaccinia-Viren werden durch Transfektion rekombinanter bakterieller Insertionsplasmide, die das fremde Gen enthalten, in Zellen hergestellt, die vorher mit Vaccinia-Virus infiziert worden sind. Bei den infizierten Zellen findet homologe Rekombination statt und führt zur Einsetzung des fremden Gens in das virale Genom. Die infizierten Zellen können durch immunologische Verfahren, DNA Plaque-Hybridisierung oder genetische Selektion rekombinanter Viren, die anschließend isoliert werden können, aussortiert werden. Diese Vaccinia-Rekombinanten bewahren ihre essentiellen Funktionen und ihre Infektiosität und können so konstruiert werden, daß sie etwa 35 Kilobasen fremder DNA akkomodieren.

Fremdgenexpression kann durch enzymatische oder immunologische Prüfungen (beispielsweise bnmunopräzipitation, Radioimmunoassays oder Immunobiotting) festgestellt werden. Natürlich vorkommende Membran-Glycoproteine, die aus mit rekombinanter Vaccinia infizierten Zellen produziert wurden, werden glycosyliert und können zur Zelloberfläche transportiert werden. Hohe Expressionsniveaus können durch Verwendung stark» Promoter oder durch Klonen vielfacher Kopien eines einzigen Gens »halten weiden. 3. Zusammenfassung der Erfindung

Das eifindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des Melanom-assoziierten Antigens p97, das eine im wesentlichen d» Darstellung der angeschlossenen Fig. 3 entsprechende Aminosäinesequenz aufweist, bzw. zur -4-

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Herstellung eines antigenen Teils desselben ist gekennzeichnet durch a) Züchtung einer Zelle, die eine für das Peptid Otter das Protein codierende Nucleotidsequenz enthält, die unter der Kontrolle einer zweiten, die Genexpression regulierenden Nucleotidsequenz steht, sodaß das Peptid oder Protein von der gezüchteten Zelle exprimiert wird, und b) Gewinnung des Peptids oder Proteins aus dar Zellkultur.

Das so hergestellte Peptid oder Protein kann zur Auslösung einer Immunreaktion verwendet werden, die in geimpften Individuen Melanom-Zellen selektiv zerstört. Insbesondere sollen solche Vakzine-Formulierungen eine Immunreaktion hervoirufen, die gegen ein Melanom-assoziiertes Antigen, wie das Melanom-assoziierte p97-Antigen, gerichtet ist Es ist dabei eine Reihe von Vakzine-Formulierungen möglich. Beispielsweise enthält das Immunogen einer "Untereinheitsvakzine" ein mit p97 verwandtes Protein oder Peptid, das mit einem geeigneten Hilfsmittel formuliert werden kann. Diese Peptide oder Proteine enthalten Aminosäuresequenzen, die von der ganzen oder einem Teil der Aminosäuresequenz von p97, im wesentlichen wie in Fig. 3 dargestellt, abgeleitet sind und die geänderte Aminosäuresequenzen enthalten, jedoch nicht auf diese beschränkt sind, in welchen funktionell äquivalente Aminosäurereste für Reste innerhalb der Sequenz substituiert sind. Dadurch entsteht eine stille Änderung und/oder es sind modifizierte oder bearbeitete Aminosäuresequenzen, wie beispielsweise glycosylierte Aminosäuresequenzen, phosphorylierte Aminosäuresequenzen etc. oder chemische modifizierte Aminosäuresequenzen, enthalten. Im folgenden werden die erfindungsgemäß hergestellten Peptide oder Proteine, die mit dem Melanom-assoziierten p97-Antigen verwandt sind, ob dieses nun verändert, unverändert, modifiziert oder unmodifiziert ist, als "mit p97 verwandte Peptide" bezeichnet. Wo das mit p97 verwandte Peptid ein Hapten ist (d. h. antigen, jedoch nicht immunogen) kann das Hapten mit einem Tiägermolekül konjugiert sein, das zur Immunisationskraft beiträgt

Die mit p97 verwandten erfindungsgemäß hergestellten Peptide können unter Verwendung rekombinierender DNA-Verfahren und/oder chemischer Methoden hergestellt werden. Wenn die mit p97 verwandten Peptide chemisch synthetisiert sind, können jene synthetischen mit p97 verwandten Peptide jene Aminosäuresequenzen enthalten, die von Bereichen des p97 stammen, von denen angenommen wird, daß sie antigen sind (Hopp and Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78: 3824 - 3828). Wenn die mit p97 verwandten Peptide der vorliegenden Erfindung durch Verwendung rekombinierender DNA-Verfahren hergestellt werden, wird eine Nucleotidsequenz, die für das ganze oder einen Teil von p97 codiert, in einen rekombinanten Expressionsvektor, wie ein Virus oder ein Plasmid, inseriert, welcher in einem geeigneten Wirt die Expression eines mit p97 verwandten Peptids, das aus dem Kulturmedium isoliert werden kann, veranlassen kann. Die inserierte Nucleotidsequenz stammt aus der ganzen oder aus Teilen der p97-Sequenz, wie im wesentlichen in Fig. 3 dargestellt, und enthält Nucleotidsequenzen, ohne auf diese beschränkt zu sein, in welchen funktionell äquivalente Nucleotid-Codone für Codone innerhalb der Sequenz ersetzt werden, was eine stille Änderung darstellt; mit anderen Worten können verschiedene Codone, die für die gleiche Aminosäure oder deren funktionelle Äquivalente codieren, innerhalb der in Fig. 3 dargestellten Sequenz substituiert werden. Wenn ein Plasmid-Expiessionsvektor verwendet wird, wird ein solcher bevorzugt, der für die Expression in eukaryontischen Zellen geeignet ist, doch kann auch ein prokaryontischer Expressionsvektor verwendet werden.

Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung, wo der Expressionsvektor ein rekombinantes Virus ist, kann ein Impfstoff als virale Vakzine formuliert werden, in welchem Fall das Immunogen das rekombinante Virus enthält, das ein mit p97 verwandtes Peptid exprimiert. Je nach der Art des als Immunogen verwendeten rekombinanten Virus kann entweder eine inaktivierte Virus-Vakzine oder eine Lebendvirus-Väkzine formuliert werden. Geeignete Immunisierung mit den so erhaltenen Vakzine-Formulierungen kann die Auslösung einer Immunreaktion hervorrufen, die zur Zerstörung von Melanomzellen in dem immunisierten Individuum führt.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wird auch ein System, mit welchem die Vakzine-Formulierung getestet werden kann, und die Durchführung des Tests beschrieben. Beispielsweise können die Vakzine-Formulierungen bei Tiermodellen, anfänglich Nagetieren, auf ihre Wirksamkeit geprüft werden, dann mit nicht menschlichen Primaten und schließlich mit Menschen, vorzugsweise mit Patienten, die in Remission sind, jedoch wegen Mikrometastasen eine hohe Rückfallwahrscheinlichkeit haben. -5-

AT 396 938 B 4. Karze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt ein Autoradiogramm des zellfreien Übersetzungsproduktes von p97 mRNA, aufgelöst durch SDS-PAGE.

In Hg. 1A zeigt die Spur 1 die Übersetzungsprodukte von angereicherter p97 mRNA, während die Spur 2 die Übersetzungsprodukte von nicht angereicherter mRNA darstellt, wobei jede Spur von 0,5 μΐ Gesamtübersetzungsprodukten von 5 ng mRNA stammt. In Fig. 1B, Spur 1 sind die Übersetzungsprodukte von angereicherter p97 mRNA dargestellt, während Spur 2 die Übersetzungsprodukte von nicht angereicherter mRNA zeigt, die beide aus 5 μΐ Übersetzungsprodukten von 5 ng mRNA stammen, die mit Anti-p97-Serum immunopräzipitiert wurden.

Fig. 2 ist eine schematische Darstellung der Struktur von p97 mRNA. Die Anordnung der Codierungsregion (von der Signalsequenz bis zur Ankersequenz) und der nichtcodierenden Region (3TJT) ist ebenso wie die verdoppelte Domänenstruktur des p97 Precursors (open bar) angegeben. Der Ort der verschiedenen Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen ist oberhalb der mRNA angegeben. Die relativen Stellungen von vier cDNA-Klonen sind unterhalb der mRNA-Struktur angegeben. Der cDNA-Klon p97 - 3a2fl (3a2fl) wurde aus einer cDNA-Bibliothek isoliert, in da die cDNAs auf oligoOO-varbehandelte (primed) angereicherte p97-mRNAs transkribiert und in pBR322 geklont wurden; dagegen wurden die cDNA-Klone p97 - 2fl (2fl), p97 · ljl (ljl> und p97 - 10a! (lOal) durch Vorbehandlung (priming) der cDNA-Synthese mit Oligonucleotiden, die für p97 Exon-Sequenzen codieren, und Klonen der entstehenden cDNA-Fragmente in Lambda-gtlO isoliert wurden. Fig. 2A ist eine schematische Darstellung der Genom-Klone B15, H17, B6.6 und E7.7, die in Lambda L47.1 geklont wurden.

Fig. 3 stellt die Nucleotidsequenz von humaner p97 Precursor cDNA und seiner abgeleiteten Aminosäuresequenz dar. Die vorher durch Proteinsequenzierung bestimmten N-terminalen Aminosäurereste waren ident mit jenen, die aus der Nucleotidsequenz vorhergesagt waren (Aminosäurereste Nummern 21 - 30). Die möglichen Glycosylierungsstellen an den Aminosäureresten 38,135 und 515 (open bar) und die Membran-Ankerregion an der C-Endstelle (solid bar) sind angegeben. Ein Polyadenylierungssignal (AATAAA angegeben in einer Box) wurde bei Stellung 3847 festgestellt, die sich 50 Basenpaare aufwärts eines polyadenylierten Trakts befindet.

Fig. 4 zeigt einen Vergleich der vorhergesagten Aminosäuresequenzen des p97-Precursors und von humanem Serotransferrin (Yang et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 2752 - 2756; Davis et al., 1985, J. Mol. BioL 181:111 - 121). Haltbare Rückstände wurden in Boxen aufbewahrt. Tyrosin-, Histidin- und Argininreste, die an einer Eisenbindung des Transferrin beteiligt waren (Mertz-Boutique et al., 1984, Eur. J. Biochem. 145: 659 - 676) sind durch Sternchen (*) hervorgehoben.

Fig. 5 ist eine schematische Darstellung eines zweidimensionalen Modells der Struktur von p97 auf der Basis der Anwesenheit von Cystein-Resten, die zwischen Mitgliedern der Transferrin-Oberfamilien aufbewahrt sind. Die drei möglichen Glycosylierungsstellen sind durch Sternchen (*) bezeichnet. Die hydrophobe Membran-Ankerdomäne scheint an der C-Endstelle von p97 (COOH) auf.

Fig. 6 ist eine chematische Darstellung der genetischen Struktur von p97 cDNA-Klonen und Fragment des Genomklons Lambda E7,7, die für den Aufbau des p97 Expressionsvektor verwendet wurden und pSV2p97a-Expressionsvektor. Die folgenden Abkürzungen werden verwendet: E. EcoRI: P, PvuII; Sal, Sali; B. BamHI.

Fig. 7 zeigt die Resultate der Gelelektrophorese bei der Kennzeichnung und Immunopurifikation von rekombinantem p97-Protein. Ein transfizierter CHO-Klon (CH03+) und SK-MEL 28-Humanmelanomzellen wurden mit S-Cystein in Gegenwart (+TM) oder Abwesenheit (-TM) von Tunicamycin (TM) markiert. Die Zellen wurden auf 100 mm^-Platten ausgesät und nahezu zusammenfließen gelassen. Das Medium wurde entfernt und durch 3 ml cysteinfreies Medium mit oder ohne Zusatz von 1 μg/ml Tunicamycin ersetzt Nach 30 min bei 37 eC wurden 250 pCi pro ml L-^S-Cystein (1016 Ci pro mMol; New England Nuclear) für weitere 6 h zugesetzt Die Zellemte, Ausfällung der Zellysate, Immunopräzipitation und SDS-PAGE waren wie oben beschrieben. Die Extrakte wurden mit p97-spezifischen Antikörpern immunopräzipitiert und die Proteine wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) analysiert, a) Coomassie blaugefärbtes SDS-Polyacrylamid-Gel. Spur 1: Proteinmarker; Spur 2: immunogereinigtes p97, abgegeben von transfizierten Mäuse-B16-Zellen; Spur 3: SK-MEL 28-Zellen +TM; Spur 4: SK-MEL 28-Zellen -TM; Spur 5: CH03+ Zellen +TM; Spur 6: CH03+ Zellen -TM; b) Autoradiogramm des gleichen Gels wie in a). -6-

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Fig. 8 zeigt die Ergebnisse der Radioimmunopräzipitation von exprimiertem p97 in transfizierten Zellen oder Vp97aNY-infizierten Zellen. BSC-Zellen wurden über Nacht mit Wildtyp-Vaccinia-Virus oder p97 rekombi- nantem Vaccinia-Virus infiziert. Diese Viren oder die transfizierte Zellinie CHO-p97.A wurden mit S-markiertem Methionin und Cystein mit oder ohne Tunicamycin mit 2 pg/ml (Sigma) inkubiert. Die Zellen wurden 6 h später lysiert, mit monoklonalem Antikörper 96,5 ausgefällt und durch Elektrophorese auf einem 10 % Polyacrylamid-Gel aufgetrennt. Das Gel wurde über Nacht radiographiert. Die mit Tunicamycin behandelte Gruppe ist für auto-jede Gruppe rechts angegeben.

Fig. 9 zeigt die Serum-Antikörper-Titer in mit p97-Vakzinen immunisierten Mäusen. Tp97 zeigt fünf Mäuse, die mit 5 x IO** bestrahlten M2svp97a.A-Zellen (transfizierten syngenen Tumorzellen, die Oberflächen-p97exprimieren) in komplettem Freund-Hilfsmittel immunisiert und mit der gleichen Anzahl Zellen in phosphatgepufferter Salzlösung aufgefrischt wurden. p97 ist eine Gruppe von fünf Mäusen, die mit 100 pg gereinigtem p97-Protein in komplettem Freund-Hilfsmittel immunisiert und mit 50 pg wässerigem Protein aufgefrischt sind. Vp97 ist eine Gruppe von 5 Mäusen, die mit 10^ plaquenbildenden Einheiten von Vp97a-NY durch Schwanzritzen immunisiert und aufgefrischt wurden.

Fig. 10 zeigt den therapeutischen Effekt einer Impfung von Mäusen, die einem Tumorangriff ausgesetzt sind, mit einem rekombinanten p97 Vaccinia-Virus (Vp97a-NY). Die Mäuse wurden dem intravenösen Angriff von 10^ oder 10^ p97-exprimierenden Tumorzellen (M2SVp97a.E) ausgesetzt. Zwei Tage später wurden die Mäuse durch Schwanzritzen entweder mit Vp97a-NY oder Vwt-NY geimpft Die Impfungen durch Schwanzritzen wurden wöchentlich wiederholt und die überlebenden Mäuse gezählt. 5. Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Beobachtung, daß Melanome tumor-assoziierte Zelloberflächen-Antigene, wie das p97-Antigen, haben, die in größeren Mengen in Melanom-Zellen als in normalen Geweben vorhanden sind. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Peptide oder Proteine, die mit dem melanom-assoziierten p97 Antigen verwandt sind (d. h. mit p97 verwandte Peptide) unter Verwendung rekombinierender DNA-Verfahren und/oder chemischer Syntheseverfahren hergestellt. Die mit p97 verwandten Peptide enthalten Aminosäuresequenzen, die aus der ganzen oder aus Teilen der Aminosäuresequenz von p97, wie sie im wesentlichen in Fig. 3 dargestellt ist, stammen. Diese umfassen aus Fig. 3 abgeleitete Aminosäuresequenzen, die durch Substitution eines oder mehrerer Aminosäurereste innerhalb der Sequenz durch eine andere Aminosäure ähnlicher Polarität, die als funktionelles Derivat wirkt, geändert wurden, was somit zu einer stillen Änderung führt. Substituenten für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz können aus anderen Mitgliedern der Klasse ausgewählt werden, zu der die Aminosäure gehört. Beispielsweise umfassen die nichtpolaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Die polaren neutralen Aminosäuren umfassen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren umfassen Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren umfassen Asparaginsäure und Glutaminsäure. Außerdem können die mit p97 verwandten Peptide, ob sie nun durch Substitution von Aminosäureresten verändert wurden oder nicht, weiter durch Glycosylierung, Phosphorylierung etc. oder durch chemische Modifikation verändert werden. Diese mit p97 verwandten Peptide können als Immunogene in Vakzine-Formulierungen verwendet werden, die eine gegen Melanomzellen im geimpften Patienten gerichtete Immunreaktion hervorrufen.

Nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden rekombinante DNA-Vektoren zur Einsetzung von Nucleotidsequenzen, die für das p97-Antigen codieren, in Expressionsvektoren, die die Expression von mit p97 verwandten Peptiden in geeignete Wirtszellen lenken, zur Verfügung gestellt. Die für p97-Antigen codierenden Nucleotidsequenzen umfassen Nucleotidsequenzen, die aus der ganzen oder aus Teilen der p97-Nucleotidsequenz stammen, wie sie in Fig. 3 dargestellt ist. Wegen der Degenerierung des DNA-Codes für Aminosäuren (d. h. die meisten Aminosäuren können durch mehr als ein Codon codiert werden) können funktionell äquivalente Codone (d. h. verschiedene Codone, die für die gleiche Aminosäure oder deren funktionelles Derivat codieren) innerhalb der in Fig. 3 dargestellten p97-Sequenz substituiert werden, sofern die Substitution zu einer stillen Änderung führt. Die Expressionsvektor-Wirtszellen-Systeme, die eine Nucleotid-Sequenz enthalten, die für das ganze oder einen Teil von p97 codiert, können zur Herstellung großer Mengen von reinen mit p97 verwandten Peptiden in vitro verwendet werden, in welchem Fall die Genprodukte aus den Zellen -7-

AT 396 938 B in der Kultur gereinigt und als Immunogene in Untereinheitsvakzine-Formulierungen verwendet weiden können. Die Reinigung des mit p97 verwandten Peptids kann durch Verwendung verschiedener biochemischer Methoden, inklusive der Immunoaffinitäts-Reinigung, unter Verwendung monoklonaler Antikörper erreicht werden. Zusätzlich dazu kann die Reinigung des mit p97 verwandten Peptides durch Modifikation der DNA-Sequenzen, 5 die für die mit p97 verwandten Peptide codieren, erleichtert werden, sodaß die für die Verankerung des Proteins in der Plasmamembran verantwortlichen Sequenzen entfernt werden, wobei die für den Transport des Proteins zur Zellmembran verantwortlichen Sequenzen nicht entfernt werden, sodaß ein verstümmeltes Antigenmolekül durch die Wirtszelle in das Kulturmedium abgesondert wird. Im Fall von durch prokaryontische Zellen produzierten, mit p97 verwandten Peptiden kann ein Mangel an geeigneten posttranslationalen Änderungen zu einem antigen 10 inaktiven Produkt führen, das durch geeignete chemische oder andere Behandlungen aktiviert worden muß.

Bei bestimmten Ausführungsformen, wenn der Expressionsvektor ein Virus ist, kann das Virus selbst als Vakzine formuliert werden. In solchen Fallen können inaktivierte rekombinante Virus-Vakzinen hergestellt werden. Wenn der Expressionsvektor aus infektiösen rekombinanten Viren besteht und im Wirt keine Krankheit verursacht, kann entweder eine inaktivierte virale Vakzine oder eine Lebendvirusvakzine-Zubereitung, die im 15 wesentlichen für Immunität sorgt, formuliert werden. Ein für diesen Zweck besonders wertvoller Expressionsvektor ist ein rekombinantes Vaccinia-Virus, das mit p97 verwandte Peptide exprimieit Zu diesem Zweck kann eine für das gesamte oder Teile des p97-Antigens codierende Nucleotidsequenz in einen Vaccinia-Virusvektor, der imstande ist, die Expression der Sequenz in einem geeigneten Wirt zu leiten, eingesetzt werden. Es ist auch die Verwendung anderer Virus-Expressionsvektoren als Impfstoffe, insbesondere die von Adenoviren, 20 vorgesehen.

Es ist auch möglich, die abgeleitete Aminosäuresequenz von p97 auf Sequenzen mit besonderen Eigenschaften, insbesondere Hydrophilität zu prüfen, die die Anwesenheit derartiger Sequenzen an der Oberfläche des Proteinmoleküls und ihre wahrscheinliche Antigenität und/oder Immunogenität Vorhersagen. Diese mit p97 verwandten Peptide können chemisch synthetisiert und als Immunogene in Vakzine-Formulierungen verwendet 25 werden.

Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von mit p97 verwandten Peptiden, die für andere Zwecke als für die Vakzine-Herstellung verwendet werden können, zur Verfügung. Das mit p97 verwandte Peptid kann zur Immunisierung von Tieren verwendet werden, um Antiseren oder monoklonale Antikörper herzustellen, die für die relevanten Melanom-Zellen spezifisch sind. Diese können als Komponente in einer diagnostischen 30 Prüfung oder zur Affinitätsreinigung von radiomarkierten drogengebundenen oder toxingebundenen Antikörpern, die zur Krebstherapie eingesetzt werden sollen, verwendet werden.

Die Eifindung wird anhand der Beispiele beschrieben. In diesen wird auch die Konstruktion ein»' auf p97 basierenden Vakzine gegen Humanmelanom beschrieben. Die hier beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen beschränken sich jedoch nicht auf den Aufbau von Vakzinen unter Verwendung von p97, sondern 35 können auch für andere tumor-assoziierte Antigene angewendet werden.

Die Erfindung wild im folgenden allein zum Zweck der Erläuterung der Beschreibung dargelegt: a) die Nucleotid- und Aminosäuresequenz von p97; b) mit p97 verwandte Peptide, hergestellt durch chemische Syntheseverfahren; c) mit p97 verwandte Peptide, hergestellt durch Expressionsvektor-Wirt-Systeme; d) immunologische Kennzeichnung der mit p97 verwandten Peptide; und e) Formulierung der Impfstoffe. 40 5.1. Sequenzanalvse dos Melanom-assoziierten p97 Antigens

Die Nucleotidsequenz des für p97 codierenden Gens und die abgeleitete Aminosäuresequenz sind in Fig. 3 dargestellt. Funktionell äquivalente Sequenzen liegen innerhalb des Rahmens der vorliegenden Eifindung.

Nucleotidsequenzen, die die ganze oder einen Teil der in Fig. 3 dargestellten Nucleotidsequenz enthalten und 45 die durch Substitution verschiedener Codone geändert sind, die für den gleichen oder einen funktionell äquivalenten Aminosäurerest codieren, wodurch eine stille Änderung hervorgerufen wird, sowie Aminosäuresequenzen, die die ganze oder einen Teil da* in Fig. 3 dargestellten Aminosäuresequenz enthalten und die durch die Substitution funktionell äquivalenter Aminosäurereste innerhalb der Sequenz verändert sind, wodurch eine Stille Änderung hervorgerufen wird, sowie Derivate derselben, die beispielsweise durch Glycosylierung, Phosphory-50 lienmg etc. oder durch andere chemische Veränderungen modifiziert oder bearbeitet sind, sind umfaßt; eine Beschiänkung auf dieselben ist jedoch nicht vorgesehen.

Die folgenden Abschnitte beschreiben die Arbeitsweise, die zur Bestimmung der Sequenz von p97, wie sie in -8-

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Fig. 3 dargestellt ist, verwendet wurde, ebenso wie andere Verfahren, die zur Bestimmung der Sequenz von p97 oder anderer Tumorantigene, die zur Formulierung von Impfstoffen dienlich sein können, herangezogen werden können. 5.1.1. Identifizierung und Charakterisierung des Melanom-assozierten Antigens p97.

Die Aktivität und die Aminosäuresequenz des Melanom-assozierten p97-Antigens war nicht bekannt; als Ergebnis wurde die Identifizierung des p97-Antigens durch Verwendung monoklonaler gegen p97 gerichteter Antikörper erreicht. Es gibt eine Anzahl von Verfahren zur Erzeugung monoklonaler für p97 spezifischer Antikörper. Beispielsweise kann die von Köhler und Milstein (1975, Nature 250, 495 - 497) entwickelte Hybridom-Methode in folgender Weise verwendet werden: Mäuse oder Ratten werden mit humanen Melanomzellen immunisiert, und Lymphocyten aus den immunisierten Tieren werden mit Myelomzellen fusioniert; andererseits können Lymphozyten von Melanom-Patienten mit Myelomzellen fusioniert werden (Cote, et al„ 1983, Proc. NatL Acad. Sei. 80:2026; Haspel et al., 1985, Cancer Res. 45:3951) oder es kann das Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper unter Verwendung des Epstein-Barr-Virus (Cole et al., 1985, The EBV-Hybridoma Technique and its Application to Human Lung Cancer, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. S. 77 - 96) zur Herstellung der gegen p97 gerichteten monoklonalen Antikörper eingesetzt werden. Auf jeden Fall werden die resultierenden Hybridome zur Herstellung der Antikörper, die sich an Melanomzellen, nicht jedoch an normale Zellen binden, ausgewählt.

Die gegen p97 gerichteten oben beschriebenen monoklonalen Antikörper kämen auf verschiedenste Weise zur Erleichterung der Identifizierung, Charakterisierung, des Klonens und der Expression von Nucleotidsequenzen, die die Herstellung von mit p97-Antigen verwandten Peptiden und Proteinen erlauben, in großen Mengen verwendet werden. Beispielsweise können die monoklonalen Antikörper zur weiteren Charakterisierung des p97-Antigens verwendet werden, indem alle durch die Tumorzelle hergestellten Proteine radioaktiv markiert werden, das Tumorprotein mit dem zur Identifizierung des p97-Antigens verwendeten monoklonalen Antikörper immunopräzipitiert wird und die immunipräzipitierten Proteine durch Gelelektrophorese fraktioniert werden. Die Proteinantigene werden als deutliche Banden auf dem entstehenden Autoradiogramm (Brown et al., 1980, J. BioL Chem. 255:4980 - 4983) identifiziert. Außerdem können die gegen p97 gerichteten monoklonalen Antikörper zur Erleichterung der Klonierung wie folgt verwendet werden: a) zur Immunoreinigung von Polysomen, um mRNA-Transkripte, die in den für das p97-Antigen codierenden Melanom-Zellen vorliegen, zu identifizieren und zu gewinnen; b) zur Identifizierung von Klonen, die mit dem p97 Antigen verwandte Peptide oder Proteine exprimieren, in einer cDNA-Expressionsbibliothek; c) zur Reinigung des p97 Antigens, um zusätzliche monoklonale Antikörper oder Antiseren zur Verwendung in den beiden vorhergehenden Gebieten herzustellen; oder d) zur Identifizierung von Zellen, in welche das Gen für das p97 Antigen durch Transfektion eingebracht worden war.

Die monoklonalen Antikörper können auch zur Erleichterung der strukturellen und immunochemischen Kennzeichnung des p97 Antigens verwendet werden, um extrazelluläre und antigene Domänen des Moleküls zu identifizieren und das Molekül für die Aminosäuresequenzanalyse zu reinigen (Brown et al., 1981, Proc. NatL Acad. Sei. USA 78: 539 - 543; Brown et al., 1982, Nature, London, 296:171 - 173).

Die weitere Kennzeichnung von p97 erfordert die Bestimmung der zellulären Lokalisierung und die Aufzeichnung antigener Determinanten und funktioneller Domänen. Die subzelluläre Lokalisierung kann durch Immunofluoreszenz-Mikroskopie und durch Zellfraktions-Versuche bestimmt werden. Antigene, wie das p97, die auf der Zelloberfläche vorliegen, sind für den Impfstoff-Aufbau bevorzugt, obwohl auch intrazelluläre Antigene brauchbar sein können. Wenn mannigfache monoklonale Antikörper zur Verfügung stehen, können die antigenen Determinanten durch Kompetitionsversuche aufgezeichnet werden, in welchen jeder Antikörper radiomarkiert ist und mit jedem der anderen Antikörper im Wettbewerb steht. Domänen des Moleküls können durch begrenzte Verdauung mit Proteasen und anschließende SDS-PAGE identifiziert werden. Gemeinsam sollten diese Daten die Identifizierung von Molekülbereichen, die am stärksten immunogen sind, ermöglichen. Wenn die monoklonalen Antikörper durch Immunisierung mit intakten Zellen erhalten wurden, dann kann angenommen werden, daß diese Bereiche des Moleküls höchstwahrscheinlich extrazellulär und für den Impfstoff-Aufbau geeignet sind.

Die Aminosäuresequenzanalyse erlaubt eine eindeutige Identifizierung des Proteins und seinen Vergleich mit anderen Proteinen (Brown etaL, 1982, Nature, London 296,171 -173). Wenn das Protein mehr als 50 Aminosäurereste enthält, kann es zur Bestimmung nur eines Teils der Aminosäuresequenz, meist der N-Endstelle, -9-

AT 396 938 B geeignet sein. Für die Aminosäuresequenzierung kann das Proteinantigen aus den Zellysaten durch Immunoaffinitätschromatographie mit dem monoklonalen Antikörper und anschließende präparative SDS-PAGE gereinigt werden. Die N-endständige Aminosäuresequenz des gereinigten Proteins wird dann durch Verwendung eines automatischen Aminosäuresequenzanalysators, vorzugsweise einer Gasphaseneinrichtung für größte Empfindlichkeit, bestimmt 5.1.2. Identifizierung. Klonierung und Sequenzierung der für das Melanom-assoziierte n97-Antigen

codierenden DNA

Die frühen Klonierungsstudien konzentrierten sich auf reichlich vorhandene Proteine, wie Globin und Ovalbumin, deren mRNAs oft 20 bis 50 % der gesamten mRNA betrugen. Diese mRNAs konnten durch Größenfraktionierung bis zur Homogenität gereinigt werden und reine cDNA-Proben wurden zur Sichtung von Bibliotheken mit einigen Hundert Klonen durch Kolonie-Hybridisierung verwendet Für Proteine, deren mRNAs 1 bis 10 % der gesamten mRNA ausmachen, kann eine Differentialhybridisierung mit zwei cDNA-Proben verwendet werden, in welcher eine der cDNA-Proben die interessierende Sequenz enthält und die andere eine negative Kontrolle darstellt. Boten-RNAs, die für in geringen Mengen vorkommende Proteine, wie tumorassoziierte Antigene, codieren und die so geringe Mengen wie 0,01 % der zellulären mRNA enthalten, sind viel schwieriger zu klonieren, da Zehntausende Klone gesichtet werden müssen und die cDNA-Proben kein spezifisches Hybridisierungssignal geben. Beide Probleme können durch Anreicherung der mRNA mit der interessierenden Sequenz umgangen werden.

Verschiedene Versuche zur Klonierung von DNA, die für humanmelanom-assoziiertes p97-Antigen codiert, werden im folgenden beschrieben. Die erhaltenen Klone wurden zur Identifizierung eines Klons oder von Klonen analysiert, der bzw. die die gesamte Codierungsregion von p97 umfassen. Die p97-Nucleotid-Inserts in den so identifizierten Klonen können dann durch jede dem Fachmann bekannte Art auf ihre Sequenz analysiert werden. Die verschiedenen Versuche sind im folgenden detailliert beschrieben. a') Isolierung von mRNA durch Polvsom-Immunoreinigung

Bei diesem Verfahren werden Polysome (die aus mRNA, Ribosomen und naszierenden Polypeptidketten bestehen) durch Immunoaffinitätschromatographie mit Antikörpern, die die in den naszierenden Ketten vorliegenden antigenen Determinanten erkennen, gereinigt In vielen Fällen erkennen die durch Immunisierung mit intakten Zellen oder Zellextrakten erhaltenen monoklonalen Antikörper die Antigene im Zustand ihrer Entstehung, doch sind sie oft nicht für die Polysom-Immunoreinigung geeignet da es sehr wohl möglich ist daß die erkannten antigenen Determinanten in den naszierenden Ketten nicht vorhanden sind. Da die Übersetzung an der N-Endstelle des Polypeptids beginnt, können Epitope nahe der C-Endstelle an den meisten naszierenden Ketten fehlen. Dieses Problem kann entweder durch Verwendung von Antikörpern, die N-terminale Epitope erkennen, oder durch Herstellung von Polysomen aus mit einem Proteinsynthese-Inhibitor, der die Terminierung blockiert, behandelten Zellen umgangen werden.

Ein ernsteres Problem besteht darin, daß die reifen Proteine sich von den naszierenden Ketten durch posttranslationale Veränderungen unterscheiden. Dieses Poblem ist für Zelloberflächenproteine besonders deutlich, die durch Entfernung der Signalpeptide, Addition von Kohlenhydratseitenketten und Bildung von Disulfidbrücken stärker verändert werden. Wenn ein polyklonales Antiserum zur Polysom-Immunreinigung verwendet wird, können die Unterschiede in der Antigenität zwischen den naszierenden Ketten und dem reifen Protein geringe Folgen haben, da das Kaninchen oder sonstige Tiere während der Immunisierung nicht nur dem nativen Protein sondern auch den teilweise oder gänzlich denaturierten Formen ausgesetzt ist, insbesondere wenn das Hilfsmittel nach Freund dazu verwendet wurde. Selbst wenn diese Antikörper nur einen geringen Anteil der Antikörperpopulation ausmachen, können immer noch genug davon vorliegen, um die naszierenden Ketten zu binden. Unglücklicherweise kann die Herstellung eines polyklonalen Antiserums für ein in geringer Menge vorkommendes Protein äußerst schwierig sein. Obwohl ein monoklonaler Antikörper zur Reinigung des Antigens für die weiteren Immunisierungen verwendet werden kann, erzielt jedes Gramm gezüchteter Zellen oft nur Mikrogramme des Antigens. Das genügt zur Immunisierung einiger Mäuse, reicht jedoch kaum für ein einziges Kaninchen.

Eine andere Lösung des Problems besteht in der Gewinnung eines monoklonalen Antikörpers, der die in naszierenden Ketten vorhandenen antigenen Determinanten erkennt, indem denaturiertes p97 Antigen als -10-

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Immunogen zur Herstellung des monoklonalen Antikörpers verwendet wird. Im Beispiel der vorliegenden Erfindung stand eine Platte monoklonaler Antikörper zur Verfügung, die drei verschiedene Epitope an der N-terminalen Domäne mit dem Molgewicht von 40 000 Dalton des p97-Moleküls »kannte und es wurde ein Vorrat an monoklonalen Antikörpern verwendet, von denen jeder eine andere Spezifität hatte, in der Hoffnung, daß einer oder mehrere von ihnen sich an die naszierenden Ketten binden würde. Die gewählten Antikörper waren für p97 hochspezifisch, wobei jeder von ihnen eine einzige Bande des p97 aus einem radiomarkierten Ganzzellenlysat immunopräzipitierte, und sie hatten hohe Bindungsaffinitäten. Für das Klonierungsvorhaben wurden drei IgG2a Antikörper gewählt, von denen jeweils einer spezifisch für jedes der drei Epitope war. Im allgemeinen kann die Erfolgschance durch Verwendung ein» Anzahl von Antikörpern gegen die verschiedenen Epitope erhöht werden.

Bei der Verwendung monoklonaler Antikörper bleibt die Frage offen, wie man Vorhersagen kann, ob ein gegebener monoklonaler Antikörper oder eine Kombination von Antikörpern die naszierenden Ketten erkennen und somit zur Verwendung bei der Polysom-Immunoreinigung geeignet sein wird. Ein Versuch besteht darin zu bestimmen, ob der monoklonale Antikörper ein Antigen, das in dem Reticulocytlysat-System übersetzt wurde, immunopräzipitiert, wobei man von der Annahme ausgeht, daß das unbehandelte in vitro-Translationsprodukt den naszierenden Ketten ähneln würde. Ein anderer Versuch besteht darin, die Polysom-Immunopräzipitation in kleinem Maßstab vorzunehmen und dann eine in vitro-Übersetzung vorzunehmen, um zu bestimmen, ob die interessierende mRNA-Art angereichert worden ist.

Wenn das Polysom-Immunoreinigungsverfahren verwendet wird, ist es wichtig, die Reinigung durch Messung der mRNA-Aktivität zu überwachen. Das kann durch Übersetzen der mRNA in einem Reticulocytlysat-System und Analyse der Übersetzungsprodukte durch SDS-PAGE erfolgen. Obwohl das tumor-assoziierte Antigen eine zu geringfügige Komponente der Translationsprodukte der nicht angereicherten mRNA unter den Hunderten Produkten der in größerem Überschuß vorhandenen Arten sein kann, sollte es doch in den Übersetzungsprodukten aus den angereicherten RNA-Proben feststellbar sein. Andererseits kann das Xenopus oocyten-Translationssystem verwendet werden, wenn ein empfindlicher Immunoassay zur Feststellung des translatierten tumor-assoziierten Antigens zur Verfügung steht. Für p97 wurde ein hochempfindlicher Doppeldeterminanten-Immunoassay (DDIA) eingesetzt, bei dem zwei monoklonale Antikörper mit Spezifität auf zwei verschiedene Epitope von p97 verwendet werden.

An Sepharose gebundenes Protein A kann für die Polysom-Immunoreinigung verwendet werden. Das Protein A-Adsorbens wird bei diesem Verfahren zweifach verwendet. Erstens zur Reinigung des monoklonalen Antikörpers aus der rohen Ascites-Flüssigkeit, wobei die verunreinigende Ribonuclease-Aktivität entfernt wird. Das Protein A-Adsorbens wird dann in Verbindung mit den gereinigten Antikörpern zur Immunoieinigung der die spezifische naszierende Kette tragenden Polysome eingesetzt. Übersetzung der mRNA in einem Reticulocytlysat-System erlaubt die biochemische Kennzeichnung des Übersetzungsprodukts ebenso wie die Erzielung seiner Reinheit bl Oligonucleotid-Sonden

Ein anderes Verfahren zur Klonierung der für ein tumor-assoziiertes Antigen, wiep97, codierenden cDNA besteht in der teilweisen oder vollständigen Bestimmung der Aminosäuresequenz des Antigens und der Synthese einer Oligonucleotid-Sonde basierend auf der Nucleotid-Sequenz, die von der Aminosäuiesequenz abgeleitet ist Das Oligonucleotid kann dann als Primer für die cDNA-Synthese und als Sonde zur Sichtung der entstehenden cDNA-Bibliothek verwendet werden. Dementsprechend kann das melanom-assoziierte p97-Protein geeigneterweise aus Lysaten von Melanomzellen durch Affinitätschromatographie mit einem spezifischen monoklonalen Antikörper gereinigt werden (Brown, et al., 1982, Nature, London 296: 171 - 173). Eine für. einen Teil der bestimmten Aminosäuresequenz codierende Nucleotidsequenz wird dann synthetisch hergestellt und kann als Primer und/oder als Sonde verwendet werden. Teile der Aminosäuresequenz, die die von einem einzigen Codon oder von zwei Codonen codierten Aminosäurereste enthält, sind für diesen Zweck am besten geeignet. Eine Möglichkeit besteht in der Synthetisierung einer längeren Sequenz, typischerweise von 25 bis 60 Nucleotiden, die die wahrscheinlichste Codierungssequenz basierend auf den bekannten Codon-Gebrauchssequenzen bei Maischen darstellL Die Verwendung von zwei synthetischen Oligonucleotiden basierend auf verschiedenen Teilen der Aminosäuresequenz erleichtert die Sichtung dadurch, daß die Identifizierung unechter positiver Hybridisierungssignale ermöglicht wird. Zusätzlich dazu erleichtert die Verwendung von Hybridisierungs-bedingungen, die die Wirkung des GC-Gehalts auf den Schmelzpunkt von DNA-Hybriden minimieren, die -11-

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Sichtung. Wenn einmal ein teilweiser cDNA-Klon auf diese Weise erhalten wurde, kann er als Sonde zur Gewinnung eines cDNA-Klons mit voller Länge verwendet werden. cl cDNA-Expressionsbibliotheken

Klonierungsvektoren wurden entwickelt, die die Expression von cDNA-Inserts in Bakterien erlauben. Eine Möglichkeit dazu, die zur Gewinnung von cDNA-Klonen für tumor-assoziierte Proteine, wie p97, verwendet werden kann, besteht in der Aufstellung einer cDNA-Bibliothek durch reverse Transkribierung der nach obiger Beschreibung aus Melanomzellen isolierten (angereicherten oder nicht angereicherten) mRNA durch Verwendung von 01igoCI)-Nucleotid-Primem oder oben beschriebenen synthetischen Oligonucleotid-Primem und Sichtung einer solchen Bibliothek mit einem gegen das melanom-assoziierte p97-Protein gerichteten monoklonalen Antikörper. Klone, die die DNA, die für die durch die monoklonalen Antikörper erkannten Epitope codiert, in der richtigen Reihenfolge und im richtigen Leserahmen enthalten, werden mit dem melanomassoziierten p97-Protein verwandte Peptide oder Proteine exprimieren und können durch Übertragung der durch die Klone exprimierten Proteine auf ein Nitrocellulosefilter und Inkubation des Filters mit dem Antikörper mit anschließender Entwicklung mit einem markierten Anti-Immunoglobulin-Reagens identifiziert werden.

Ein mögliches Problem besteht darin, daß viele monoklonale Antikörper das durch die Bakterien exprimierte Protein nicht erkennen können, weil in vielen Fällen nur ein Teil der cDNA in dem Insert enthalten ist und Bakterien Proteine nicht in der Weise bearbeiten wie es eurokaryontische Zellen tun. Dieses Problem ist bei Tumorzellen-Oberflächenproteinen besonders akut, die durch Entfernung der Signalpeptide, Addition von Kohlenhydrat-Seitenketten und Bildung von Disulfidbriicken stärker modifiziert wurden. Es kann daher nötig sein, monoklonale Antikörper zu entwickeln, von denen es bekannt ist, daß sie denaturiertes Antigen erkennen, oder polyspezifische Antiseren durch Immunisierung mit gereinigtem Antigen herzustellen.

Wenn ein rekombinantes Virus oder Plasmid, von dem angenommen werden kann, daß es ein cDNA-Insert enthält, das von einem melanom-assoziierten p97-Antigen abgeleitet ist, einmal identifiziert ist, dann kann das cDNA-Insert zur Sichtung weiterer Bibliotheken verwendet werden, um entweder Klone voller Länge oder aber eine Gruppe von Klonen, die die volle Länge der für p97 codierenden cDNA umfassen, zu identifizieren. Die Identität der geklonten cDNA kann durch Sequenzanalyse und Vergleich der abgeleiteten N-terminalen Aminosäuresequenz mit der durch direkte Aminosäuresequenzanalyse des p97-Proteins bestimmten Sequenz festgestellt werden. d) Genomklonierung

Das folgende Verfahren erlaubt die Klonierung von DNA unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers der gegen eine antigene Determinante gerichtet ist, die nur in nativem Protein, nicht aber in naszierenden Ketten oder in von Bakterien exprimiertem Protein enthalten ist. Zu diesem Zweck wird von humanen Melanomzellen abgeleitete DNA durch Transfektion in Mäuse-L-Zellen eingebracht. Anschließend werden die das melanom-assoziierte p97-Antigen exprimierenden Mäusezellen entweder durch fluoreszenzaktivierte Zell-Sortierer oder durch immunologische Identifizierung von Kolonien, die mit p97 verwandte Peptide produzieren, isoliert, wobei radioaktiv markierter, monoklonaler, gegen p97 gerichteter Antikörper zur Feststellung verwandter Peptide an Repliken von auf Polyestertuch-Filter übertragenen Kolonien verwendet wird. Mehrere aufeinanderfolgende Transfektionsrunden können erforderlich sein, um nicht verwandte humane DNA-Sequenzen zu entfernen. Dann wird eine Genombibliothek in einem Lambdaphagenvektor errichtet und auf Klone gesichtet, die humane iepetitive Sequenzen enthalten, die in den Introns der meisten Gene auftreten. Sobald ein Genomklon identifiziert ist, kann er als Hybridisiersonde zur Identifizierung von cDNA-Klonen, die die für p97 codierende DNA enthalten, verwendet werden. 5.2, Synthese von antigenen Fragmenten des melanom-assoziierten p97-Antisens und Bewertung der

Immunisationskraft

Synthetische Peptide können als Immunogene zur Auslösung einer Immunreaktion gegen das native Protein verwendet werden, welche Reaktion einen gewissen Schutz gegen eine Anzahl von Pathogenen bildet. Diese Peptidsequenzen werden aus der bekannten Aminosäuresequenz des Proteinantigens ausgewählt, indem Aminosäurebereiche, die voraussichtlich auf der zum externen Medium gerichteten Oberfläche des Proteinmoleküls vorhanden sind, identifiziert werden. Das wird meist durch Computeranalyse der -12-

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Aminosäuresequenz unter Verwendung etablierter Hydropathie-Parameter für die Aminosäuren erreicht. Zusätzliche Kriterien, wie die vorhergesagte Sekundärstruktur oder die Flexibilität können ebenfalls herangezogen werden.

Somit können synthetische Peptide mit 5 bis 50 Aminosäureresten des melanom-assoziierten p97-Proteins an Versuchstieren (meist Mäusen oder Kaninchen) auf ihre Immunisationskraft untersucht werden. Derartige synthetische Peptide umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf die ganze oder einen Teil der Aminosäuresequenz, wie sie. im wesentlichen in Fig. 3 dargestellt ist, inklusive veränderter Sequenzen, in welchen funktionell äquivalente Aminosäurereste für Reste innerhalb der Sequenz substituiert sind, was zu einer stillen Änderung führt, und/oder modifizierter oder bearbeiteter Sequenzen, wie glycosylierter Sequenzen, phosphorylierter Sequenzen etc. oder chemisch modifizierter Sequenzen. Diese mit p97 verwandten Peptide werden entweder allein oder an ein Trägerprotein gekuppelt verwendet, wie z. B. an keyhole limpet hemocyanin (KLH). In jedem Fall ist die Verwendung eines Hilfsmittels möglich, wenn nicht sogar bevorzugt. Die immunisierten Tiere werden geboostert und auf Antikörper untersucht, die gegen das immunisierende Peptid gerichtet sind. Die Tiere mit Antipeptid-Antikörpem werden auf Antikörper untersucht, die sich an natives Protein p97 binden. Im Fall von tumor-assoziierten Antigenen, wie dem p97, ist es auch interessant, auf eine zelluläre Immunreaktion zu untersuchen, beispielsweise durch Prüfung auf Überempfindlichkeit verzögerter Art (delayed-type hypersensitiviiy, DTH), auf eine antigenstimulierte Proliferation in vitro, auf cytolytische T-Zellen oder auf Tumorabweisung in einem geeigneten Modell. Ein geeignetes Modell wäre ein Mäusetumor, der das humane tumor-assoziierte Antigen als Resultat einer Transfektion mit einem geeignet konstruierten cDNA-Expressionsvektor exprimiert.

Das Ziel ist die Identifizierung von Peptiden, die eine heftige Immunreaktion gegen das melanom-assozüerte Antigen p97 auslösen. Sobald sie identifiziert sind, können diese Peptide in großen Mengen durch chemische Syntheseverfahren bekannter Art hergestellt werden. Außerdem können die identifizierten Peptide in großen Mengen in Expressionsvektor-Wirtszell-Systemen durch Expression der Nucleotidsequenzen, die für solche Peptide codieren, hergestellt werden. 5.3. Herstellung von mit n97 verwandten Peptiden durch Expressionsvektor-Wirt-Svsteme

Proteine und Peptide können in großen Mengen durch Einsetzen nucleotidcodierender Sequenzen in einen geeigneten Expressionsvektor hergestellt werden, der seinerseits in geeignete Wirtszellen eingebracht wird, die aus Bakterien, Hefen, Insektenzellen und Säugetierzellen bestehen können, jedoch nicht auf sie beschränkt and. Obwohl Bakterienwirte viele Vorteile haben, werden in ihnen viele eukaryontische Proteine nicht gut bearbeitet und sie sind für die Expression tumor-assoziierter Proteine weniger geeignet als eukaryontische Zellen. Es können jedoch in Bakterien produzierte rekombinante Proteine zur Induktion einer T-Zellen-Reaktion geeignet sein, da derartige Reaktionen offenbar den anfänglichen Abbau des Pioteinantigens erfordern.

Um mit p97 verwandte Peptide in einem Vektor-Wirt-System zu exprimieren, werden Nucleotidsequenzen, die für das melanom-assoziierte p97-Antigen oder einen Teil desselben codieren, in einen geeigneten Expressionsvektor eingebracht. Derartige Nucleotidsequenzen enthalten, sind jedoch nicht beschränkt auf die ganze oder einen Teil der DNA-Sequenz von p97, wie sie im wesentlichen in Fig. 3 dargestellt ist, inklusive geänderter Sequenzen, in welchen ein oder mehrere Codone innerhalb der Sequenz durch ein Codon ersetzt ist (sind), das für den gleichen oder einen funktionell äquivalenten Aminosäurerest codiert, was zu einer neutralen oder stillen Änderung in der Sequenz führt. Der Expressionsvektor enthält die notwendigen Elemente für die Transkription und Translation der eingesetzten protein-codierenden Sequenz. Diese Elemente variieren in ihrer Stärke und Spezifität. Je nach dem verwendeten Wirt-Vektor-System kann irgend eines der geeigneten Transkriptions- und Translationselemente verwendet werden. Beispielsweise können beim Klonieren in Säugetierzellsystemen Promotoren verwendet werden, die aus dem Genom der Säugetierzellen (z. B. der Maus-Metallothionein-promotor) oder aus in diesen Zellen wachsenden Viren (z. B. Vaccinia-Virus 7,5K Promotor) isoliert wurden. Aus rekombinierenden DNA- oder Syntheseverfahren gewonnene Promotoren können verwendet werden, um für die Transkription der eingesetzten Sequenzen zu sorgen.

Spezifische Initiationssignale sind ebenfalls zur wirksamen Translation der eingesetzten proteincodierenden Sequenzen erforderlich. Diese Signale enthalten das ATG Initiationscodon und benachbarte Sequenzen. In Fällen, wo entweder das Gen oder die cDNA-Sequenz in einen geeigneten Expressionsvektor eingesetzt wird, sind zusätzliche Translationskontrollsignale gegebenenfalls nicht erforderlich. In Fällen jedoch, wo nur ein Teil der -13-

AT 396 938 B codierenden Sequenz eingesetzt wird, können exogene Translationskontrollsignale inklusive des ATG-Codons erforderlich sein. Das Initiationscodon muß weiters in bezug auf den Leserahmen der proteincodierenden Sequenzen in Phase sein, um die Übersetzung des gesamten Inserts zu gewährleisten. Diese exogenen Translationskontrollsequenzen und Initiationscodone können verschiedenen, sowohl natürlichen als auch synthetischen Ursprungs sein.

Zur Einsetzung der DNA-Fragmente in einen Vektor können alle bekannten Verfahren zur Herstellung eines Expressionsvektors verwendet werden, der ein chimärisches Gen enthält, das aus geeigneten transkriptioneilen und translationellen Kontrollsignalen und den proteincodierenden Sequenzen besteht Diese Verfahren können auch solche umfassen, die bei rekombinierenden DNA-Verfahren in vitro, Syntheseverfahren und in vivo-Rekombinationsveriähren (genetische Rekombination) verwendet werden.

Expressionsvektoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf die folgenden Vektoren und ihre Derivate: Vaccinia-Virus, Adenoviren, Insektenviren, Hefevektoren, Bakteriophagenvektoien und Plasmid-DNA-Vektoren. Die Klonierung und Expression von Genen in Bakteriensystemen ist in der Fachwelt allgemein bekannt Beispielsweise können beim Klonieren in E. coli dessen Bakteriophagen oder Plasmid-Promotoren, wie der lac-Promotor, trp-Promotor, recA-Promotor, ribosomale RNA-Promotor, die Pr- und PL-Promotoren des Coliphagen Lambda und andere, die den lacuv5, trp-lacuv5 (tac) Hybrid-Promotor, ompF, bla, lpp und dergL umfassen, jedoch nicht auf sie beschränkt sind, zur Erzielung hoher Ausmaße an Transkription des angrenzenden DNA-Segments verwendet werden. Durch die Bearbeitungsunterschiede zwischen prokaryontischen und eukaryontischen Zellen kann es jedoch vorteilhaft sein, die mit p97 verwandten Peptide in eukaryontischen Zellen zu exprimieren. Die am besten ausgearbeiteten Verfahren zur Expression von Proteinen in eukaryontischen Zellen sind a) die Einführung des Gens in die Zelle gemeinsam mit einem Drogen resistenzgen und anschließende Selektion mit der Droge, wobei vorzugsweise eine Amplifizierung wie z. B. mit dem Dihydrofolat-Reduktase-Methotrexat-System erhalten wird; b) Expression der cDNA in einem Plasmidvektor, oft auf der Basis von pBR 322, unter Verwendung eines starken eukaryontischen Promotors und anderer regulativer Sequenzen; c) Expression von cDNA in einem viralen Vektor, der oft von SV40 abgeleitet ist, wobei wieder starke Promotoren, in diesem Fall ein SV40-Promotor, verwendet werden. Rekombinante Plasmid-Vektoren werden oft zur Herstellung von Zellinien verwendet, die das Protein wahrend eines langen Zeitraumes produzieren, wahrend SV40-Vektoren oft verwendet werden, um vorübergehende Expression zu erreichen. Obwohl Säugetierzellen sehr häufig als Wirte verwendet wurden, sind Insektenzell«! und in manchen Fällen Hefezellen ebenso geeignet. Manche davon werden im folgenden detailliert beschrieb«!.

Um ein rekombinantes Vaccinia-Virus, das das Melanom-assoziierte p97 Antigen exprimiert, aufzubauen, kann die cDNA codierende Sequenz an den 7,5K-Promotor des Vaccinia-Virus ligiert werden, um ein chimärisches Gen zu bilden. Dieses chimärische Gen wird von einer zusätzlichen Vaccinia-viralen Sequenz flankiert, die homolog dem viralen Thymidin-Kinase-Gen ist, das von dem Plasmid-DNA-Vektor getragen wird. Beim Aufbau des chimärischen Gens sind sowohl natürliche als auch synthetische Kontrollsignale für Transkription und Translation der tumor-assoziierten Antigen-Sequenz beteiligt. Das chimärische Gen wird dann durch in vivo-Rekombination zwischen der homologen Thymidin-Kinase-Region, die sowohl am Plasmidvektor als auch auf dem Vaccinia-Virus-Genom vorhanden ist, in Vaccinia-Virus-Expressionsvektoren eingebracht Diese das chimärische Gen enthaltenden rekombinanten Viren sind imstande, die Expression von mit p97 verwandten Peptiden in einem infizierten Wirt zu leiten und können als Vakzine-Komponenten verwendet werden.

Im Fall der Verwendung eines Adenovirus als Expressionsvektor wird die relevante DNA-Sequenz an einen Adenovirus-Transkriptions/Translations-Kontrollkomplex ligiert, d. h. den späten Promotor und dreiteilige Führungssequenzen. Dieses chimärische Gen wird dann durch in vitro- oder in vivo-Rekombination in das Adenovirus-Genom eingeführt Die Einführung in eine nichtessentielle Region des viralen Genom (z. B. die Region El oderE3) wird zu einem rekombinanten Virus führen, das lebensfähig und imstande ist, das mitp97 verwandte Peptid in infizierten Wirten zu exprimieren. Derzeit sind zwei Adenovirus-Stämme (Typen 4 und 7) zugelassen und als Vakzine für Militärpersonen in Verwendung. Bevorzugt werden diese Stämme als Vektoren zur Expression der eingesetzten DNA-Sequenz verwendet

Ein anderes Expressionssystem, das zur Expression der mit p97 verwandten Peptide verwendet werden kann, ist ein Insektensystem. Bei einem derartigen System wird Aiitographa califomica Nuclear Polyhedrosis-Virus (AcNPV) als Vektor zur Expression fremder Gene verwendet Das Virus wächst in Spodoptera frugiperda-Zellen. Die interessierende DNA-Sequenz kann in nichtessentielle Regionen (beispielsweise das Polyhedrin-Gen) das -14-

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Virus geklont werden und wird unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors (beispielsweise des Polyhedrin-Promotors) gesetzt Erfolgreicher Einbau der DNA-Sequenz wird zu einer Inaktivierung des Polyhedrin-Gens und zur Produktion von nicht okkludiertem rekombinantem Virus führen (d. h. einem Virus, das keinen von dem Polyhedrin-Gen codierten Proteinmantel hat). Diese rekombinanten Viren werden dann zur Infizierung von Spodoptera frupiperda-Zellen verwendet in welchen das eingesetzte Gen exprimiert wird.

Außerdem können Wirtszellstämme ausgewählt werden, die die Expression der eingesetzten Sequenzen modulieren oder das chimärische Genprodukt in spezieller gewünschter Weise verändern oder bearbeiten. Die Expression von bestimmten Promotoren kann in Gegenwart bestimmter Induktoren (z. B. Zink- und Cadmium-Ionen für Metallothionein-Promotoren) gesteigert werden. Daher kann die Expression des gentechnisch behandelten Proteins kontrolliert werden. Das ist wichtig, wenn das Proteinprodukt des geklonten Gens für die Wirtszellen letal ist Weiters sind Veränderungen (z. B. Glykosylierung, Phosphorylierung etc.) und Bearbeitung (z. B. Spaltung) der Proteinprodukte für die Struktur und Funktion des Proteins von Bedeutung. Verschiedene Wirtszellen haben charakteristische und spezifische Mechanismen für die posttranslationale Bearbeitung und Veränderung von Proteinen. Geeignete Zellinien oder Wirtsysteme können zur Gewährleistung einer korrekten Veränderung und Bearbeitung des exprimierten fremden Proteins ausgewählt werden.

Bei der hier speziell für p97 beschriebenen Ausführungsform wurde die p97 cDNA-Sequenz in einen von pBR 322 abgeleiteten Expressionsplasmidvektor, der den Metallothionein-Promotor enthält, ligiert. Die gesamte Codierungssequenz des p97, inklusive des Signalpeptids und des Membranankers, wurde in den Vektor eingesetzt 5.3.1. Identifizierung des rekombinanten Expressionsvektors, der zur Replikation und Steuerung der Exmission der r>97 DNA-Seouenzen imstande ist

Expressionsvektoren, die fremde Gene enthalten, können allgemein durch drei Verfahren identifiziert weiden: a) DNA-DNA-Hybridisierung, b) An- oder Abwesenheit von Markergenfunktionen und c) Expression eingesetzt»: Sequenzen. Beim eisten Verfahren kann die Anwesenheit eines in einen Expressionsvektor eingesetzten fremdem Gens durch DNA-DNA-Hybridisierung festgestellt werden, indem Sonden verwendet weiden, die Sequenzen enthalten, die zu dem Fremdgeninsert homolog sind. Beim zweiten Verfahren kann das System aus rekombinantem Vektor und Wirt auf der Basis der Anwesenheit oder Abwesenheit bestimmter "Maikerf-Genfunktionen identifiziert und ausgewählt werden, die durch die Einsetzung von Genen in den Vektor verursacht werden (z. B. Thymidin-Kinase-Aktivität, Antibiotika-Resistenz, Phänotyptransformation etc.). Wenn beispielsweise das fremde Gen innerhalb der Markergensequenz des Vektors eingesetzt ist, können Rekombinanten, die das DNA-Insert enthalten, durch das Fehlen der Markergenfunktion identifiziert werden. Beim dritten Verfahren können rekombinante Expressionsvektoren durch Prüfung des durch die Rekombinante exprimierten fremden Gens identifiziert werden. Derartige Prüfungen können auf den physikalischen, immunologischen oder funktionellen Eigenschaften des Genprodukts beruhen.

Wenn beispielsweise ein erfindungsgemäßer rekombinenter Vaccinia-Virus-Vektor aufgebaut wird, so wird das chimärische Gen, das die p97 codierenden Sequenzen enthält, in das Thymidin-Kinase-Gen eingesetzt, wodurch das Virus inaktiviert und mit einem TK'-Phänotyp ausgestattet wird. Derartige Rekombinanten werden nach ihrer Fähigkeit ausgewählt, in 5-Brom-deoxyuridin enthaltenden Medien zu wachsen, einer Substanz, die ein

Nucleosid-Analog mit letaler Wirkung auf TK+-, nicht jedoch auf TK'-Zellen ist. Die Rekombinanten werden weiters durch DNA-DNA-Hybridisierung identifiziert, wobei eine für das tumor-assozziierte Protein spezifische cDNA-Sonde verwendet wird. Das TK* rekombinante Virus kann durch Plaquen-Reinigung isoliert werden und aus infizierten gezüchteten Zellen werden Vorräte angelegt. Das rekombinante Virus kann auf seine Fähigkeit, die Synthese der mit p97 verwandten Peptide zu induzieren, getestet werden. Zu diesem Zweck können die infizierten Zellen in Gegenwart von radioaktiv markierten Aminosäuren gezüchtet werden; dann werden Lysate und Unterzellfraktionen der infizierten radioaktiv markierten Zellen durch Immunopräzipitation mit Antikörpern, die gegen natives melanom-assoziiertes p97-Antigen gerichtet sind, getestet. Die Produkte der Immunopräzipitation werden durch SDS-PAGE aufgespalten. Die infizierten Zellen können auch durch Immunofluoreszenz unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers getestet werden.

Zellen, in die ein Plasmidvektor durch Transfektion eingesetzt worden war, können leicht durch FACS-Analyse oder durch Bindungsprüfversuche von Repliken von Zellkolonien auf Polyestertuch identifiziert weiden. Die Menge des vorhandenen mit p97 verwandten Peptids kann durch einen quantitativen Radioimmunoassay und -15-

AT 396 938 B seine subzelluläre Lokalisierung kann durch Zellfraktionierung und durch Immunofluoreszenz-Mikroskopie bestimmt werden. Die Struktur des exprimierten, mit p97 verwandten Peptids kann durch SDS-PAGE und durch Aminosäuresequenzanalyse bestimmt werden. 5.3.2. Isolierung des mit p97 verwandten Peptids aus den Systemen von Expressionsvektor und Wirt

Viele tumor-assoziierte Antigene, wie das p97, sind Zelloberflächen-Glycoproteine und enthalten ein N-terminales Signalpeptid und ein C-terminales Ankerpeptid (Davis et al., 1985, J. Mol. Biol. 181,111 -121). Es wird angenommen, daß das Protein nach der Expression in einem geeigneten Vektor an die Zelloberfläche transloziert wird. Zur Erleichterung der Reinigung des Proteins kann es günstig sein, die für die Membranarikerregion codierende DNA-Sequenz zu streichen, sodaß das reife Protein in das Kulturmedium entlassen wird.

Das mit p97 verwandte Peptid kann aus den Wirtszellen durch Detergens-Lyse mit anschließender Affinitätschromatographie unter Verwendung monoklonaler Antikörper gereinigt werden. Wenn ein verstümmeltes Protein aus dem Kulturmedium isoliert werden soll, wird bevorzugt serumfreies Medium verwendet und dann mit Affinitätschromatographie unter Verwendung monoklonaler Antikörper gearbeitet. Wichtig ist, daß das Antigen aus dem Antikörper-Adsorbens sowohl ohne Reduzierung der Antigenität als auch ohne Denaturierung eluiert werden kann. Das kann durch Anheben oder Absenken des pH-Wertes oder durch Verwendung eines Chaotrops erreicht werden. Es kann notwendig sein, einen monoklonalen Antikörper auszuwählen, der das Antigen unter relativ milden Bedingungen abgibt. Das affinitätsgereinigte Antigen kann weiter durch HPLC gereinigt werden. 5.4. Immunologische Kennzeichnung von mit n97 verwandten Peptiden

Die Fähigkeit des synthetischen oder rekombinanten Antigens zur Auslösung einer Antitumor-Reaktion kann anfänglich in Tierversuchen bewertet werden. Das wird durch Aufbau eines Modellsystems erreicht, in welchem das humanmelanom-assoziierte Protein p97 in Zellen des geeigneten Inzucht-Stammes der Versuchtierrasse exprimiert wird. Dann werden die Tiere mit dem mit p97 verwandten erfindungsgemäßen Peptid nach verschiedenen Regeln immunisiert und sodann auf die Entwicklung von gegen das melanomassozierte p97-Antigen gerichteten Antikörpern, auf zellständige Immunität, wie Überempfindlichkeit verzögerter Art und auf das p97 Antigen, und auf ihre Fähigkeit, einen Angriff lebender, syngener das p97 Antigen exprimierender Tumorzellen abzuweisen, getestet. Außerdem können in vitro-Versuche bezüglich der Zellimmunität vorgenommen werden, um die Proliferierung der Lymphozyten als Reaktion auf das mit p97 verwandte Peptid und die Fähigkeit der Lymphozyten immunisierter Tiere oder von Humanmelanom-Patienten zur Abtötung von p97 Antigen exprimieienden Tumorzellen zu messen. Weiters ist man durch Immunisierung von Mausen mit Mäuse-p97 imstande, das Ausmaß festzustellen, bis zu welchem es möglich ist, eine Immunreaktion auf ein Antigen zu induzieren, das in normalen Geweben in Spurenmengen vorhanden ist

Nichthumane Primaten können verwendet werden, um die Sicherheit der neuen, mit p97 verwandten Peptide zu prüfen. Zu diesem Zweck können die Tiere nach bestimmten Regeln, die vom ethischen Standpunkt aus auch auf menschliche Krebspatienten angewendet werden könnten, immunisiert und dann wie oben beschrieben getestet, mit der Ausnahme, daß Tumortransplantationsversuche nicht machbar sind, da diese die Verwendung von Irizuchtstämmen erfordern würden. Die Sicherheit dieses Immunisierungsverfahrens wird dadurch bestimmt, daß die Wirkung der Immunisierung auf die allgemeine Gesundheit der immunisierten Tiere (Gewichtsänderungen, Fieber, Appetit, Verhalten etc.) festgestellt und bei der Autopsie auf pathologische Veränderungen geachtet wird.

Schließlich kann das mit p97 verwandte Peptid bei menschlichen Krebspatienten getestet werden. Nach der Anfangsphase I der Prüfung an fortgeschrittetenen Krebspatienten, können, um das Fehlen von Toxizität festzustellen, Krebspatienten in Remission, jedoch mit einer hohen Rückfallswahrscheinlichkeit, getestet werden. Ihre Immunreaktion kann, wie oben für nichthumane Primaten beschrieben, bewertet werden, mit der Ausnahme, daß die Wirkung der Behandlung auf die bestehende Krankheit oder auf die Rückfallshäufigkeit geprüft wird. Im Fall des Melanom-Antigens p97 werden auch gutartige Nevi (Muttermale), die das Antigen exprimieren, untersucht. -16-

AT 396 938 B 5.5. Vakzine-Formulierung

Der Aufgabenbereich der Erfindung ist die Herstellung durch synthetische oder rekombinante DNA-Verfahren eines synthetischen Peptids, eines gereinigten Proteins oder eines rekombinanten Virus, die als Immunogen verwendet werden können, und die Herstellung einer Vakzine, mit der Krebspatienten mit hoher 5 Rückfallswahrscheinlichkeit geschützt, die bestehende Krankheit behandelt und schließlich Individuen mit hoher Krankheitswahrscheinlichkeit prophylaktisch geimpft werden können. Tatsächlich kann das synthetische oder rekombinante melanom-assoziierte p97 Antigen in Kombination mit anderen Immunogenen zur Herstellung multivalenter Vakzinen zur Verhinderung von Melanomen und anderen Krebsformen verwendet werden. Beispiele verschiedener Vakzine-Formulierungen werden im Folgenden besprochen. 10 5.5.1. Virale Vakzine-Formulierungen

Wenn das mit p97 verwandte Pepdid durch ein rekombinantes Virus hergestellt wird, so kann sowohl eine Lebend-Rekombinantvirus-Vakzine als auch eine inaktivierte Rekombinantvirus-Vakzine formuliert werden. Die Wahl hängt von der Art des rekombinanten Virus ab, das zur Expression des mit p97 verwandten Peptids 15 verwendet wurde. Wenn das rekombinante Virus für den zu immunisierenden Wirt infektiös ist, jedoch die Krankheit nicht zum Ausbruch bringt, wird eine Lebendvakzine bevorzugt, da eine Vervielfältigung im Wirt zu einer verlängerten Stimulierung ähnlicher Art und Größe führt, wie sie bei natürlichen subklinischen Infektionen auftritt, und daher im wesentlichen eine langanhaltende Immunität verleiht Das infektiöse rekombinante Virus kann nach seiner Einführung in einen Wirt das mit p97 verwandte Peptid von seinem chimärischen Gen 20 exprimieren und dadurch eine Immunreaktion anregen. Das lebende rekombinante Virus kann selbst als vorbeugende Vakzine gegen Melanom verwendet werden. An der Herstellung eines solchen rekombinanten Virus, das in diesen Formulierungen verwendet werden soll, können sowohl in vitro-Systeme (z. B. Gewebskultur-zellen) als auch in vivo-Systeme (z. B. natürliche Wirtstiere, wie Kühe) beteiligt sein. Übliche Verfahren zur Herstellung und Formulierung von Pocken-Vakzinen können für die Formulierung lebender rekombinanter Virus-25 Vakzinen adaptiert werden.

Multivalente Lebendvirusvakzinen können aus einem einzigen oder aus wenigen infektiösen rekombinanten Viren, die verschiedene Antigene unterschiedlicher Tumor- oder Krebszellen exprimieren, hergestellt werden. Beispielsweise kann ein Vaccinia-Virus (das etwa 35 Kilobasen fremder DNA akkomodieren kann) gentechnisch behandelt werden, um für andere Epitope codierende Sequenzen zu enthalten; ein derartiges rekombinantes Virus 30 kann selbst als Immunogen in einer multivalenten Vakzine verwendet werden. Andererseits kann eine Mischung von Vaccinia- und/oder anderen Viren, von denen jedes imstande ist, die Expression eines unterschiedlichen Gens, das für unterschiedliche Epitope codiert, zu leiten, zu einer multivalenten Vakzine formuliert werden.

Unabhängig davon, ob das rekombinante Virus für den zu immunisierenden Wirt infektiös ist oder nicht, können inaktivierte Vakzine-Formulierungen bereitet werden. Inaktivierte Vakzine sind "tot" in dem Sinn, daß 35 ihre Infektiosität zerstört wurde, was normalerweise durch Behandlung mit Formaldehyd geschieht Im Idealfall wird die Infektiosität des Virus ohne Beeinträchtigung der Kapsid- oder Hüllproteine, die die Immunisierungsfähigkeit des Virus beinhalten, zerstört Um die inaktivierten Vakzinen herzustellen, müssen große Mengen des rekombinanten Virus in Kultur gezüchtet werden, um die erforderliche Menge des relevanten Antigens herzustellen. Eine Mischung inaktivierter Viren, die verschiedene Epitope exprimieren, kann zur Formulierung 40 "multivalenter" Vakzinen verwendet werden. In manchen Fällen kann das besser sein als Lebendvakzine-Formulierungen, da dadurch mögliche Schwierigkeiten durch die gegenseitige Wechselwirkung der gemeinsam verabreichten lebenden Viren vermieden werden. In jedem Fall sollte das inaktivierte rekombinante Virus oder die Virenmischung mit einem geeigneten Hilfsmittel formuliert werden, um die immunologische Reaktion auf ihre Antigene zu verstärken. Geeignete Hilfsmittel umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf mineralische Gele, 45 z. B. Aluminiumhydroxid; oberflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin; Pluronic-Polyole; Polyanionen; Peptide und ölige Emulsionen.

Zur Einbringung der oben beschriebenen Vakzine-Formulierungen in den Körper können viele verschiedene Verfahren angewendet werden; diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf die intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subcutane und intranasale Verabreichung. Bei Verwendung einer lebenden 50 rekombinanten Virusvakzine-Formulierung kann diese durch die natürliche Infektionsart des elterlichen Virus-Wildtyps eingebracht werden, die zur Herstellung des rekombinanten Virus in der Vakzine-Formulierung eingesetzt wurde. -17-

AT 396 938 B 5.5.2. Untereinheitsvakzine-Formulierungen

In einer Alternative zu viralen Vakzinen kann das mit p97 verwandte Peptid selbst als Immunogen in Untereinheitsvakzine-Formulierungen verwendet werden. Untereinheitsvakzinen enthalten nur das relevante immunogene Material, das zur Immunogenisierung des Wirts notwendig ist. Dementsprechend kann das mitp97 verwandte Peptid aus Rekombinanten isoliert werden, die das Peptid exprimieren. Derartige Rekombinanten umfassen irgendwelche der vorher beschriebenen virusinfizierten gezüchteten Zellen, Bakterientransfoimanten oder Hefetransformanten. Bei einer anderen Ausführungsform können die mit p97 verwandten Peptide oder Proteine chemisch synthetisiert werden.

Unabhängig davon, ob die mit p97 verwandten Peptide aus Rekombinanten isoliert oder chemisch synthetisiert wurden, kann das Endprodukt auf eine geeignete Konzentration eingestellt und mit jedem geeigneten Vakzine Hilfsmittel formuliert und zum Verbrauch abgepackt werden. Geeignete Hilfsmittel umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: mineralische Gele, z. B. Aluminiumhydroxid; oberflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin; Pluronic-Polyole; Polyanionen; und ölige Emulsionen. Das mit p97 verwandte Peptid kann auch in Liposome eingearbeitet oder an Polysaccharide und/oder andere Polymere konjugiert werden, um in Vakzine-Formulierungen verwendbar zu sein.

In Fällen, wo das mit p97 verwandte Peptid ein Hapten ist, d. h. ein Molekül, das insofern antigen ist, als es selektiv mit artverwandten Antikörpern reagiert, doch nicht immunogen ist, da es keine Immunreaktion auslösen kann, kann das Hapten kovalent an einen Träger oder ein immunogenes Molekül gebunden sein und der Hapten-Träger kann zur Verwendung als Vakzine formuliert werden; beispielsweise kann ein großes Protein wie das Protein Serumalbumin dem an es gekuppelten Hapten Immunisierungskraft verleihen. 6. Beispiel: Melanom-assoziertes P97 Antigen

In dem im Folgenden beschriebenen Beispiel wurden aus verschiedenen Regionen von p97 mRNA abgeleitete cDNA-Klone zusammengefügt und in einen Expressionsvektor eingesetzt, der die Expression eines mit p97 verwandten Peptids lenkt. Die durch das System Expressionsvektor-Wirtszelle produzierten mitp97 verwandten Peptide können als Vakzinen formuliert werden.

6.1. Reinigung von o97-mRNA

Aus SK-MEL28 Melanom-Zellen (Carey et al., 1976, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 73: 3270 - 3282) wurden durch Magnesiumfällung Polysome bereitet. Aus diesen Zubereitungen wurden durch Inkubation mit monoklonalen Antikörpern 3 IgG2a (96,5; 118,1; 133,2), die für unterschiedliche Epitape von p97 spezifisch waren (Brown et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:4980 - 4983; Brown et al., 1981, J. Immunol. 127: 539 - 546; Brown et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 539 - 543; Plowman et al., 1983, Nature, London 303: 70 - 72), und anschließende Affinitätschromatographie an Protein A Sepharose Polysome isoliert, die naszierende p97-Ketten trugen. Die angereicherte p97 mRNA wurde mit EDTA eluiert und durch Affinitätschromatographie an OligoCD-Cellulose (Bethesda Research Labs, Bethesda MD) gereinigt Bei einem typischen Versuch ergaben 150 &2j60 Polysom-Einheiten 260 ng angereicherte p97 mRNA, was 0,23 % der gesamten mRNA bedeutete. Bei der Übersetzung in Xenopus oocytes und der wie oben beschriebenen Prüfung auf p97 (Brown et al. 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 539 - 543; Plowman et al., 1983, Nature, London 303: 70 - 72), ergab die angereicherte p97 mRNA 80 pg p97 pro ng mRNA, während die nicht angereicherte p97 mRNA nur 0,44 pg p97 pro ng mRNA ergab, was zeigt, daß die p97 mRNA-Aktivität um das 180-fache angereichert wurde. Die Ausbeute an p97 mRNA-Aktivität betrug 42 %. Translation im Reticulocytlysat-System (Pelham & Jackson, 1976, Eur. J. Biochem. 67:247 - 256) zeigte, daß die angereicherte p97 mRNA für ein größeres Polypeptid mit scheinbarem Molekulargewicht von 84 000 Dalton bei der SDS-PAGE-Analyse codierte, das in den Translationsprodukten von nicht angereicherter mRNA nicht feststellbar war und durch ein für p97 spezifisches Antiserum immunopräzipitiert wurde (Fig. 1). Es wurde daraus der Schluß gezogen, daß das der nicht glycosylierte Procursor von p97 war. 6.2. Herstellung und Konstruktion von cDNA-Klonen

Zwei im folgenden beschriebene Verfahren wurden zur Konstruktion der cDNA-Klone verwendet, die von den oben isolierten mRNA-Modellen transkribiert worden waren. -18-

AT 396 938 B 6.2.1. Konstmktion von cDNA-Klonen. die mit ΟΙΐροΓΠ gestartet sind.

Die oben bereitete angereicherte p97 mRNA wurde als Modell für die mit OligoCI) gestartete cDNA-Synthese verwendet. Die cDNA wurde wie folgt in pBR322 geklont für die Synthese des ersten cDNA-Stranges wurden die angereicherte p97 mRNA, die vier dNTPs und 01igo(T) (Collaborative Research, Walthma, MA) mitreverser Transkriptase (Molekular Genetics Resources) inkubiert Der zweite Strang wurde durch Inkubation mit dem großen Fragment von E. coli-DNA-Polymerase (Bethesda Research Labs., Bethesda MD) synthetisiert und die doppelsträngige cDNA wurde mit Sl-Nuclease (einem Geschenk von D. Dumam des Fred Hutchinsen Cancer Research Centers, Seattle, WA) verdaut Die cDNA wurde dann mit terminaler Deoxynucleotidyl-Transferase (Bethesda Research Labs. Bethesda, MD) mit einem dC-Schwanz versehen (tailed), vergütet mit Pst I-verdauten, dG-geschwänztem pBR322 (Bethesda Research Labs. Bethesda, MD) (Villa-Komaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:3727-3731) und zur Transformierung von CaCl2-behandelter E. coli-RRl verwendet DNA aus Kolonien transformierter Bakterien wurde an Papier gebunden (Taub & Thompson, 1982, Anal. Biochem. 126:222-230) und durch Differentialhydbridisierung mit cDNA-Sonden, die an Modellen angereicherter p97 mRNA und nicht angereicherter mRNA synthetisiert worden waren, gesichtet

Ein Klon von 243 Basenpaaren (bp), p97-3a2fl, wurde identifiziert, der zu angereicherter p97 cDNA, aber nicht merkbar zu nicht angereicherter cDNA hybridisierte und ebenso in hybrid-selektierten Translationsexperimenten p97 mRNA selektierte. Ein Polyadenylierungssignal (AATAA) und ein Poly(A)Trakt waren am 3'-Ende der cDNA vorhanden (vgl. Fig. 2). Nick-translatiertes p97-3a2fl hybridisierte 100 mal stärker zu angereicherter p97 mRNA als zu nicht angereicherter Melanom-mRNA und nicht merkbar zu Fibroblast mRNA. Nördliche Blot-Analyse mit der geklonten cDNA als Sonde ergab eine mRNA von etwa 4 Kilobasen (kb), die in SK-MEL 28 Melanomzellen vorlag und in Fibroblasten nicht 6.2.2. Genom-Klonierung von p97 und Verwendung des synthetischen Oligonucleotids zum Starten der cDNA-Svnthese

Versuche zur Gewinnung von cDNA-Klonen mit mehr als 1 kb von der Polyadenylierungsstelle aus waren nicht erfolgreich, möglicherweise wegen eines Bereichs mit hohem GC-Gehalt (größer als 80 %) mit ausgeprägter Sekundärstruktur. Zur Umgehung dieses Problems wurde die Genom-Klonierung eingesetzt Vier überlappende Genom-Klone wurden aus den Bibliotheken von Lamda L47.1. isoliert die die größenfraktionierte SK-MEL 28-DNA, angereichert mit einem spezifischen p97- Restriktions-Fragment enthielt Diese vier Genom-Klone umfassen 28 kb und enthalten die gesamte Codierungsregion von p97, inklusive der Regulationsregion des Gens. Aufeinanderfolgend von 5' nach 3' sind die Genom-Klone folgendermaßen angeordnet: Lambda B15, Lamda H17, Lambda B6,6 und Lambda E7,7. Die Nomenklatur besteht aus einem Buchstaben, der sich auf das zur Herstellung des Fragments verwendete Restriktionsenzym bezieht und die Zahl bedeutet die Kilobasen-Größe des Fragments, das in Lamda L47,l kloniert wurde. So enthält beginnend vom S'-Ende, der Lambda-Klon B15 ein 15 kb BamHI p97 Fragment der Lambda Klon H17 ein 17 kb HindlH p97 Fragment der Lambda-Klon B6,6 ein 6,6 kb BamHI p97 Fragment und der Lambda-Klon E7,7 ein 7,7 kb EcoRI p97 Fragment (vgl. Fig. 2A). Restriktionsfragmente der Klone, die zu der 4 kb p97 mRNA auf Nördlichen Blots hybridisierten, wurden sequenzanalysiert und p97-Exons wurden durch computer-assistierte Homologieversuche zwischen den vorhergesagten Codierungssequenzen und der Aminosäuresequenz von humanem und Höhner-Transferrin identifiziert (Yang et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 2752 - 2756; Mc Gillivray et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sei, USA 79:2504 - 2508; Jetsch & Chambon, 1982, Eur. J. Biochem. 122:291 - 295).

Drei syntehtische Oligonucleotide, deren Sequenzen auf den genomischen Exonsequenzen von p97 basieren, wurden zur Anregung der cDNA-Synthese auf SK-MEL 28 mRNA verwendet und die resultierende cDNA wurde wie folgt in Lambda-gt 10 geklont die p97 cDNA wurde dG-geschwänzt und mit einem Brücken-Oligonucleotid (AATTCCCCCCCCCCCC) und Lambda gtlO ligiert, das mit EcoRI restringiert worden war. Das Briicken-Oligonucleotid gestattete die Einsetzung und Ligierung der dG-geschwänzten cDNA-Sequenz in die EcoRI-Stelle von Lambda gtlO. Der Lambdaphage wurde abgepackt (Grosveld et al., 1981, Gene 13: 227 · 237) und auf E. coli C600 rK’ mK+hfl aufplattiert. Die cDNA-Bibliotheken in Lambda gtlO wurden durch Plaquen-Hybridisierung (Benton & Davis, 1977, Science 196: 180) auf das p97-Insert geprüft, wobei genomische Exonfragmente als Sonden verwendet wurden. Die Sonden wurden mit 32p-TTP (New England Nuclear, 3200 Ci/mMol) durch nick-Translation auf eine spezifische Aktivität von 5 - 10 x 10** cpm/)ig radioaktiv -19-

AT 396 938 B markiert. Drei überlappende cDNA-Klone (lOal, ljl, 2fl), die 2.368 Nucleotide der p97 mRNA überspannen und die die gesamte Codierungsregion enthalten, wurden durch Verwendung von p97 exonspezifischen Fragmenten als Sonden identifiziert (Fig. 2). 6.3. DNA-Seauenzanalvse von p97 cDNA-Inserts wurden herausgeschnitten und in den Plasmidvektor pEMBL18+ (Dente et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11: 1645 * 1655) in E. coli zur anschließenden Propagierungs- und Restriktionsaufzeichnung subkloniert Auch die cDNA wurde in den Phagenklonisierungsvektor M13mpl8 subkloniert (Yanish-Perrone et al., 1985, Gene 33:103 - 119) und unter Verwendung der Dideoxy-Methode von Sänger (Sänger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 5463 - 5467) sequenziert. Ml3-Klone, die große Inserte enthalten, wurden sequenziert, indem Deletionen erzeugt wurden, was durch Verwendung von DNAse I (Hong, 1982, J. Mol. Biol. 158:559 - 549) oder Exonuclease ΙΠ (Henikoff, 1984, Gene 28:351 - 359) und durch Verwendung synthetischer 21-facher Oligonucleotid-Primer geschah.

Die Sequenz von p97 cDNA ist in Fig. 3 dargestellt. Ein offener Leserahmen von 2.214 Nucleotiden erstreckt sich vom ersten ATG, der Sequenz rundum folgend, die der von Kozak, 1980 Nucleic Acids Res. 8:127 · 142, bestimmten übereinstimmenden Initiationssequenz entspricht, zum TGA in Stellung 2.215. Der meiste 5'-cDNA-Klon enthält zusätzliche 60 Nucleotide stromaufwärts vom initiierenden ATG. Die nichtcodierende 3-Region der p97 mRNA, die nicht als cDNA-Klon erhalten wurde, wurde als einzelnes genomischen Exon mit einem Gehalt von 1.667 Nucleotiden identifiziert Die Reste 20 - 32 der vorhergesagten Aminosäuresequenz sind mit der bekannten N-terminalen Aminosäuresequenz von p97 ident (Brown et al., 1982. Nature, London 296: 171 - 173), wodurch die Identität der geklonten cDNA erwiesen ist. Weiters liegt das vorhergesagte Molekulargewicht des Precursors bei 80.196 Dalton, was in guter Übereinstimmung mit dem beobachteten Molekulargewicht des in vitro-Translationsprodukts ist. 6.4. Konstruktion eines rekombinanten Expressionsplasmids, das diep97 Codierungssequenz enthält

Die bedeutende Größe des p97-Gens erforderte ein Zusammensetzen der durch spezifisches Primen der Melanom-mRNA mit reverser Transkriptase erhaltenen cDNA-Klone. Die drei cDNA Lambda gtlO Klone (lOal, ljl und IS, vgl. Fig. 2), die die Codierungsregion von Signalpeptid über die Membranankersequenz überstreichen, wurden verwendet. Das p97-Insert von Klon lOal wurde durch Verdauung mit EcoRI herausgeschnitten und die 01igo(dG)Sequenz am 5’-Ende der cDNA lOal wurde durch Verdauung mit Exonuclease HI entfernt, wodurch dar Klon lOalb mit einer HindHI-Stelle 30 bp stromaufwärts von dem initiierenden Methionin des p97 Preproteins geschaffen wurde. Die p97-Inserte der drei cDNA-Klone lOalb, ljl, und 2fl und der Genom-Klon E7,7, wurden an den Restrictionsenzymstellen PvuIL Sstl und EcoRI zusammen ligiert und in die Hindlll-EcoRI-S teilen des Plasmidvektors pEMBL18+ (Dente, et al., 1983, Nuc. Acid Res. 11: 1645 - 1655) eingesetzt, wie in Fig. 2 dargestellt ist Das endgültige Konstrukt p97b enthält das 4,4 kb p97-Insert im Plasmidvektor pRMVL18+, das zur Transformierung von E. coli HB101 verwendet wurde. Das Insert in p97b enthält 30 bp der 5’ unübersetzten Region der p97 mRNA, die gesamte Codierungssequenz und die 3' unübersetzte Region, gebunden durch eine 5' Hindin-Stelle und eine 3' EcoRI-S teile.

Das 4,4 kb p97 Insert wurde mit Hindlll und EcoRI aus p97b herausgeschnitten und die Enden wurden unter Verwendung des Klenow-Fragments von E. coli DNA Polymerase eingefüllt. Das stumpfendige Fragment wurde in die einzige Smal-Stelle im eukaryontischen cDNA Expressionsvektor 1995,12 pUC13, einem Derivat des Vektors mThGH-112 (Palmiter et al., 1983, Science 222: 809 - 14), der von Dr. Richard Palmiter (Universität von Washington, Seattle, Washington) zur Verfügung gestellt worden war, eingesetzt. Dieser Vektor verwendet den Mäuse-MetaUothionein-Promotor zur Expression von Fremdgenen in eukaryontischen Zellen. Das Konstrukt mit dem p97-Insert wurde in der richtigen Orientierung durch Restriktionsanalyse identifiziert und mit pMTp97b bezeichnet. Das rekombinante Plasmid wurde durch Transfektion in LMTK'-Zellen übertragen, und die Transfektanten wurden durch Züchtung in HAT-Medium selektiert. Die aus der Transfektionsschale entnommenen Klone wurden auf 96-Mulden-Mikrotestplatten ausgebreitet und das verbrauchte Kulturmedium und die Zellysate aus den Replikatplatten wurden durch immunoradiometrische Prüfung an zwei Stellen auf p97 geprüft Subklone wurden ausgebreitet und neuerlich getestet. Der Klon TKMp97-12, der etwa 4 000 000 Moleküle p97 pro Zelle exprimierte, wurde weiter gezüchtet mit Cadmium induziert und als Ausgangsmaterial von p97 für die Immunisierung verwendet -20-

AT 396 938 B 6.5. Immunisierung von Mausen mit p97 verwandten Peptiden

Die TKMp97-12-Zellen wurden gezüchtet, mit Cadmium induziert und (14,4 g) durch 10 min Inkubation mit 70 ml TNEN (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 % NP-40) auf Eis lysiert Das Lysat wurde bei 200 000 x g während 45 min bei 4 °C ultrazentrifugiert und die Hälfte des Lysats wurde über eine für p97 spezifische 1 ml Immunoaffmitätssäule, (Fab-Fragment des Antikörpers 96,5, gekuppelt mit Sephaiose) laufen gelassen.

Das Immunoadsorbens wurde sorgfältig gewaschen, zuerst mit ΊΝΕΝ und schließlich mit 20 mM Tris-HCl, pH 6,8.

Zur Immunisierung wurden 0,5 ml der nach obiger Beschreibung hergestellten adsorbierten Immuno-affinitätssäule mit 0,5 ml 20 mM Tris-HCl, pH 6,8 gemischt und mit 1 ml komplettem Freund-Hilfsmittel emulgiert. Vier B ALB/c-Mäuse erhielten jede intraperitoneal 0,4 ml der Emulsion. Drei Wochen später wurden die Mäuse mit einem Viertel dieser Antigenmenge in unvollständigem Freund-Hilfsmittel aufgefrischt. Vergleichsmäuse wurden mit einer Immunoaffmitätssäule eines nicht mit p97 verwandten Antikörpers, die sonst ident behandelt worden war, immunisiert. Vier der mit p97 immunisierten Mäuse und zwei Vergleichsmäuse wurden eine Woche nach der Auffrischung ausbluten gelassen. Die Seren wurden durch Immunopräzipitation aus radiojodinierten SK-MEL Melanomzellen und anschließende SDS-PAGE auf Antikörper gegen p97 getestet Die Ergebnisse zeigten, daß die aus den vier mit p97 immunisierten Mäusen erhaltenen Seren p97 immuno-präzipitierten, während die Kontrollseren negativ waren. Die Seien wurden auch mit Hilfe eines ELISA-Assays auf Glutaraldehyd-fixierten SK-MEL 28 Melanomzellen auf die Anwesenheit von gegen p97 gerichteten Antikörpern untersucht (20 000 Zellen pro Mikrotest-Vertiefung). Die fixierten Zellen wurden mit 0,5 ml 1/10 000 verdünntem Serum 1 h bei Raumtemperatur inkubiert, gewaschen und dann 1 h bei Raumtemperatur mit 0,05 ml Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Anti-Maus IgG (Southern Biotech) inkubiert Die optischen Dichten (abgelesen bei 490 nm) der Seren der mit p97 immunisierten Mäuse waren 0,350,0,243,0,343,0,200, während die optischen Dichten der Kontrollseren 0,036 und 0,057 betrugen. 6.6. Kennzeichnung des p97 6.6.1. Struktur des d97

Die Struktur des p97 wurde aus der Aminosäuresequenz des p97-Precursors bestimmt, die vier Struktur-Domänen umfaßt Da der Rest 20 der Precursor-Sequenz der N-Endstelle der reifen p97 entspricht, stellen die Aminosäurereste 1-19 wahrscheinlich ein Signalpeptid dar, ein Schluß, der durch Länge und hydrophobe Natur desselben unterstützt wird. Die Aminosäuren 20 - 361 und 362 - 713 umfassen zwei homologe Domänen von 342 und 352 Aminosäuren. Potentielle N-gebundene Glycosylierungsstellen treten an den Positionen 38 und 135 in der N-terminalen Domäne und an Position 515 in der C-terminalen Domäne auf. Schließlich wird angenommen, daß die Aminosäuren 714 - 738, ein Bereich vorwiegend ungeladener und hydrophober Reste, das p97 in der Zellmembran verankern (Davis et al., 1985, J. Mol, Biol. 181: 111 -121) und sich in das Cytoplasmaerstrecken.

Die Domänenstruktur des p97 wird durch die Protease-Verdauungsversuche unterstützt Die Verdauung von p97 mit Trypsin, Papain (Brown et al., 1981, J. Immunol. 127: 539 - 546) oder Thrombin ergab ein glycosyliertes antigenes Fragment mit einem Molekulargewicht von etwa 40 000 Dalton. Das Fragment wurde ans dem Thrombin-Digest von p97, das metabolisch mit ^^S-Methionin oder ^^S-Cystein gekennzeichnet worden war, isoliert und wie beschrieben sequenziert (Brown et al., 1982, Nature, London 296:171 - 173). Die Cystein-Reste wurden an den Positionen 7 und 17 und die Methioninreste an den Positionen 2 und 20 identifiziert Idente Resultate wurden auch mit intaktem p97 erhalten und sind in völliger Übereinstimmung mit der N-terminalen Sequenz von p97, die aus der cDNA-Sequenz vorhergesagt worden war. Es wird geschlossen, daß das proteaseresistente Fragment mit dem Molekulargewicht von 40 000 Dalton der N-terminalen Domäne von p97 entspricht Es war unmöglich, die C-terminale Domäne von p97, möglicherweise weil sie proteaseempfindlich ist, zu isolieren. 6.6.2. Homologie von p97 mit Transferrin

Eine Recherche in der Aminosäuiesequenz-Bibliothek von Protein Identification Resource (Abgabe 5,0; Dayhoff et al., 1981, Nature, London, 290: 8) zeigte, daß p97 überraschend homolog zu drei Mitgliedern der Transferrin-Oberfamilie ist zu humanem Serum-Transferrin, humanem Lactotransferrin und Hühner-Transferrin -21-

AT 396 938 B (37 - 39 % Homologie, vgl. Fig. 4). Da humanes und Hühner-Transferrin zueinander eine Homologie von 50 % zeigen, muß das p97 vor mehr als 300 Millionen Jahren von Serum-Transferrin divergiert sein. p97 hat 14 Cystein-Reste in homologen Stellen in jeder Domäne lokalisiert. Humanes Transferrin enthält alle diese Cysteine in homologen Positionen in beiden Domänen, während humanes Lactotransferrin und Hühner-Transferrin nur zwei dieser Cysteimeste nicht aufweisen (in ihren C-terminalen Domänen). Zum Unterschied von p97 enthalten diese Proteine 4-7 zusätzliche Cysteine in ihren C-terminalen Domänen, die kein korrespondierendes Glied in der N-terminalen Domäne haben. Humanes Transferrin enthält auch 2 Extra-Cysteine, die für seine N-terminale Domäne unique sind. Die Positionen der meisten Disulfide in humanem Serum-Transferrin, Lactotransferrin und Hühner-Transferrin wurden direkt bestimmt (Mc Gillivray et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79: 2504 - 2508; Metz-Boutique et al., 1984, Eur. J. Biochem 145: 659 - 676; Mazurier et al., 1983, Experientia (Basel) 39:135 -141; Mac Gillivray et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:3543 -3553; Williams et al. 1982, Eur. J. Biochem. 122: 297 - 303; Williams, 1974, Biochem J. 141: 745 - 752). Auf diese Weise kann man die Anwesenheit von 7 Disulfidbindungen in jeder Domäne von p97 Vorhersagen (vgl. Fig. 5).

Die Aminosäurehomologie zwischen den Domänen von p97 (46 % erreicht durch Einsetzen von 7 Lücken, 9 Reste) ist deutlicher als die bei Humantransferrin (43 % - 16 Lücken, 45 Reste) oder Hühner-Transfeirin (35 % - 12 Lücken, 49 Reste). Bei gegebener deutlicher Sequenzhomologie zwischen p97 und Transferrin und offensichtlich ähnlichen Faltungsmustem, basierend auf der Bewahrung da- Cysteine, wird angenommen, daß es möglich sein könnte, die dreidimensionale Struktur des p97 abzuleiten, wenn die derzeitige schwach auflösende Röntgenstruktur des Transferrin (Gorinsky et al., 1979, Nature, London 281:157 -158) verfeinert werden kann. 6.6.3. Funktion des n97

Seine Mitgliedschaft zur Transferrin-Oberfamilie, seine Fähigkeit, Eisen zu binden (Brown et al., 1982, Nature London 296: 171 - 173) und seine mit Transferrin und dem Transferrin-Rezeptor gemeinsame chromosomale Lokalisierung (Plowman et al., 1983, Nature, London, 303: 70 - 72; Yang et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:2752 - 2756) unterstützten die Annahme, daß p97 eine Rolle im Eisentransport spielt Man nimmt an, daß die Eisenbindungstasche des Transferrin 2-3 Tyrosine, 1-2 Histidine und ein einziges Bikarbonat bindendes Arginin enthält (Metz-Boutique et al., 1984, Eur. J. Biochem. 145: 659 - 676). Die Beibehaltung dieser Aminosäuren in p97 bestätigt seine vorgeschlagene Rolle im Eisenstoffwechsel (vgl. Fig. 4). Da p97 ein membrangebundenes transferrinartiges Molekül ist und keine Homologie mit dem Transferrin-Rezeptor hat (Schneider et al., 1984, Nature, London, 311: 675 · 678) kann sich seine Rolle im zellulären Eisenstoffwechsel von der unterscheiden, die durch die Zirkulierung von Serum-Transferrin und dem zellularen Rezeptor für Transferrin geschaffen wird. Die Expression der geklonten p97 cDNA in eukaryontischen Zellen wird eine experimentelle Prüfung seiner funktionellen Eigenschaften erlauben. 6.6.4. Schlußfolgerungen

Basierend auf diesen Daten ist es klar, daß cDNA-Konstrukte für melanom-assoziiertes p97 erhalten wurden und daß diese in Säugetierzellen ergiebig exprimiert werden können, um große Mengen des antigenen p97 zu produzieren. 7. Expression von geklontem p97 und Vakzine-Untersuchung

Die hier im Detail beschriebenen Versuche zeigen die Expression von geklontem Protein p97 und die Untersuchungen der daraus hergestellten Vakzinen. Die Expression von p97-Protein in ausgeschiedener Form (vom transfizierten Mauszellklon B16svp97a.l4) ermöglichte die Reinigung von Milligramm-Mengen des in voller Länge vorliegenden p97-Proteins. ln gereinigter Form wurde das Protein zur in vitro-Untersuchung der Induktion der Zellimmunität und zur Untersuchung seiner Möglichkeiten als Untereinheitsvakzine verwendet Das p97-Genprodukt wurde auch an der Zelloberfläche von metastatischen Mausmelanomzellen exprimiert, was ein Modell zur Untersuchung der Wirksamkeit von Vakzinen zur Verhinderung des Tumorwachstums in einem syngenen System schafft

Das p97-Gen wurde in ein lebendes rekombinantes Vaccinia-Virus eingesetzt um als Vakzine-Formulierung verwendet zu werden, die imstande ist, eine wirksame zelluläre Immunität zu schaffen. Das rekombinante Vaccinia-Virus Vp97a-NY wurde auf seine Fähigkeit zur Immunisierung von Mäusen geprüft wobei eine -22-

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Vielzahl von Prüfungen zur Demonstrierung von humoraler und zellulärer Immunität vorgenommen wurde. Bei Einsatz des oben beschriebenen syngenen Maustumor-Modells wurde gezeigt, daß die rekombinante Vp97a-NY-Virusvakzine einen Schutzeffekt bei Tumorzellen-Angriffen bewirkte. Die Vakzine bewirkt auch einen therapeutischen Effekt bei Mäusen mit bestehenden wachsenden Lungenmetastasen, eine Eigenschaft, die analog der vorgeschlagenen Verwendung der Vakzinen zur Schaffung einer immunotherapeutischen anti-Tumor-Reaktion bei humanen Melanompatienten mit bestehendem Tumor ist.

Zusätzlich zu den Mausstudien, wo nur 91 % Homologie zwischen humanem p97 und dem homologen Mäuseprotein ist (über die bisher untersuchten Regionen), wurde die Vp97a-NY-Vakzine auch bei nicht-humanen Primaten untersucht. Es besteht eine viel deutlichere Homologie zwischen humanem p97 und der Affenform des Proteins (wie durch Kreuzreaktivität im Bereich der monoklonalen Antikörper erwiesen ist). Wegen der möglichen Schwierigkeit bei der Hervorrufung einer Immunreaktion gegen ein "eigenes" Protein wurde der nahe verwandte Makaken-Affe zur Untersuchung der Immunisierungskraft der Vp97-NY-Vakzine verwendet Die rekombinante Vaccinia-Vakzine wurde an Affen getestet und ergab, daß eine gegen das p97-Protein gerichtete humorale Immunität induziert wurde. Bisher haben die Affen während eines Zeitraums von 6 Wochen keine merkbaren Symptome nachteiliger Nebeneffekte durch die Vakzine gezeigt, nachdem sie zwei Impfungen des lebenden rekombinanten Vaccinia-Virus erhalten hatten. 7.1. Plasmidexpression

Das durch den frühen SV-40-Promotor sv2 angetriebene Expressionsplasmid wurde aus dem cDNA-Plasmidklon p97a aufgebaut, der ähnlich dem Plasmid p97b ist, mit der Ausnahme, daß die gesamte 3TJT-Region verwendet wurde (Fig. 6). Alle cDNA-Klone wurden ursprünglich aus Lambda gtlO-Bibliotheken nach der obigen Vorschrift mit synthetischen EcoRI-dG(9 - 17)-Linkem isoliert Die Inserte wurden durch EcoRI herausgeschnitten und in pEMBL18+ zur anschließenden Propagierung und Kennzeichnung subgeklont Klon lOal wurde in M13mpl8 subgeklont und eine RF-Form wurde mit BamHI und SphI verdaut kurz mit Exonuclease III behandelt mit Sl-Nuclease stumpfendig gemacht, mit Klenow behandelt und neuerlich ligiert Mehrere Plaquen wurden isoliert und sequenziert, von denen eine das dG-Ende abgetrennt hatte und 33 bpderp97 5' unübersetzten Region, in die Hindin-Stelle von M13mpl8 eingesetzt behielt Ein RF dieses Subklons (lOala) wurde durch Schaffung der intakten p97 cDNA verwendet andernfalls wurden alle Fragmente aus den Plasmid-Subklonen isoliert. Das 550 bp Hindlll-PvuII-Fragment von lOala und das 735 bp PvuII-Sall-Fragment von ljl wurden aus LMP Agarose-Gelen isoliert und an den Sali- und Hindlll-Stellen in pEMBL18+ ligiert, wodurch p5'p97 entsteht. Der Genom-Klon E 7,7 in pEMPL18+ wurde mit EcoRI vollständig und mit Sstl teilweise verdaut und das 4,5 bp Fragment durch Fraktionierung über 0,8 % LMP Agarose abgetrennt Dieses 4,5 kb 3'-Fragment wurde mit dem 404 bp Sstl-Fragment von 2fl und dem 535 bp BamHI-Sstl-Fragment von ljl an den Sali- und EcoRI-Steilen in pEMBL18+ einligiert, um p3'p97 zu schaffen. Das 1285 bp Hindm-Sall-Fragment von p5'p97 wurde dann in p3'p97 einligiert, um pp97a zu schaffen. Das EcoRI partielle Hindlll-Fragment dieses Klons wurde an den Hindill- und EcoRI-Stellen in pSV2neo eingesetzt (Southern, et al., 1982, J. Mol. App. Genet 1:327 - 341), wobei die Neomycin-codierende Region und die SV40 Spleiß/PolyA-Sequenzen eliminiert und der frühe SV40 Pomotor und 72 bp Verstärker, 33 bp p97 5OTR, die ganze p97 Codierungsregion, 3TJTR und 1,4 bp 3'-flankierende DNA behalten wurden. Das entstehende Plasmid wurde pSVp97a benannt

Das sv2-getriebene Plasmid wurde durch Calciumphosphat-Fallung in eine Vielzahl eukaryontischer Zellinien transfiziert und die exprimierenden Zellen wurden geklont und unter Co-Transfeküon eines dominanten selektierbaren Markers selektiert. Um dies zu erreichen wurden Zellen von Ovarien chinesischer Hamster (CHO) in Hank's Fl-Medium mit einem Gehalt an 15 % fötalem Kalbsserum (FCS), 4 mM L-Glutamin, 13 mM Prolin und Antibiotika gezüchtet B16-Zellen wurden in RPMl-Medium mit einem Gehalt an 0,15 % Bicarbonat und 1735 Zellen in DMEM Medium (Gibco) gezüchtet, die beide mit 15 % FCS und Antibiotika ergänzt waren. Die Zellen wurden durch eine modifizierte Calciumphosphat-Technik (Wigler M., et al„ 1978, Cell 14: 725 - 731) mit 20 pg pro Platte pSV2p97a Plasmid DNA und 0,5 pg von entweder pSV2DHFR bzw. pSV2neo transfiziert. Alle Plasmide wurden an der EcoRI-Stelle linearisiert Stabile Transfektanten wurden unter Verwendung von Hypoxanthin-negativem (HAT-)-Medium für CHO-Zellen oder von 0,5 pg/ml Geneticin (G418, Gibco) für die B16 und 1735 Zellen selektiert Überlebende Zellen begannen 7 Tage nach der Transfektion, sichtbare Kolonien zu bilden und wurden mit sterilen Polyesterfiltem belegt die mit Glasperlen an Ort und Stelle gehalten wurden. Die Filter blieben 5 Tage an ihrer Stelle und erlaubten den Zellen, in die -23-

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Polyestermairix hineinzuwachsen, wodurch eine Replik der Kolonien auf der Platte entstand. Die Filter wurden dann entfernt und für einen Lebendzellen-Bindungsversuch mit jodinierten anti-p97-monoklonalen Antikörpern verwendet. 10 Mikrogramme gekennzeichneter monoklonaler Antikörper wurden mit bis zu 20 Filtern in 10 ml FCS bei 4 °C während 1 h inkubiert. Die Filter wurden sorgfältig in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, getrocknet und über Nacht bei -70 °C gegen einen XAR-5-Film exponiert. Dann wurden die Filter mit 7 % Methylenblau gefärbt, um die Zellkolonien sichtbar zu machen. In allen verwendeten Zellinien mit Ausnahme der Mauslinie B16 enthielten die exprimierenden Zellen anügenes p97-Protein an ihrer Zellöberfläche.

Bei den transfizierten B16 Zellen wurde p97 in das Medium abgegeben, was eine für diesen Zelltyp einzigartige Tatsache ist Die Abscheidung von p97 ermöglichte die Reinigung des in voller Länge vorliegenden p97-Proteins aus dem Medium der Zellen. Der Klon B16SVp97a.l4 exprimierte etwa 4 pg/ml p97 in das verbrauchte Medium. Die Rekombinante p97 wurde aus dem verbrauchten Medium des transfizierten Klons B16SVp97a.l4 isoliert, der große Mengen p97-Antigen in das Medium abgab. Die Zellen wurden in 850 cm^ Rollflaschen durch kontinuierliche Zugabe geringer Mengen frischen Mediums fast zusammenfließen gelassen (10^ Zellen). Sie gaben fortwährend wochenlang Antigen ab, ohne sich abzulösen, und erlaubten eine kontinuierliche Ernte und ein Abkühlen des verbrauchten Mediums. Die Reinigung von p97 wurde durch Immunoaffinitätschromatographie erreicht, wobei Sepharose, gebunden an Fab-Fragmente des monoklonalen Antikörpers 96,5 verwendet wurde. Zu diesem Zweck wurden 3 L verbrauchtes Medium über eine Reihe von 3 30 ml-Säulen laufen gelassen. Die erste enthielt 15 ml g-25 superfeines Sephadex (Pharmacia), die zweite enthielt 20 ml Sepharose 4b (Pharmacia) und die dritte enthielt 8 ml mit Bromcyan aktivierte Sepharose (Sigma), konjugiert an Fab-Fragmente des monoklonalen Antikörpers 96,5 (10 mg Protein/ml Sepharose). Anschließend wurde die Affinitätssäule gründlich mit kaltem PBS gewaschen und das Antigen wurde mit 30 ml 0,1 M Citrat mit pH 5 und 30 ml 0,1 M Citrat mit pH 4 eluiert. Diese Bedingungen zeigten sich als ohne Einfluß auf die Immunoaktivität des Antigens, während die vollständige Eluierung des Antigens von dem monoklonalen Antikörper 96,5 erreicht wurde. Die beiden Eluate wurden mit 3,0 ml bzw. 4,5 ml 2 M Tris, pH 8 neutralisiert. Das gereinigte Eluat wurde in einem Amicon-Apparat mit einem PM10-Filter eingeengt und mit 2 mal 10 ml PBS gewaschen, wobei eine endgültige Ausbeute von 4,95 mg von 4,5 ml, bestimmt durch den Bradford-Assey (Biorad) zuriickblieb. 15 pg des Produkts wurden durch eine SDS-PAGE laufen gelassen (Fig. 7) und sowohl durch Coomassie-Blau als auch durch Silberfärbung sichtbar gemacht. Ein Doppeldeterminanten-Immunoassay (DDIA) (Brown, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. 78: 539) lieferte eine davon unabhängige Bestätigung der Molmenge des gereinigten Proteins. Vergleichszubereitungen wurden parallel dazu mit verbrauchtem Medium aus der Parenteral-Zellinie B16 hergestellt und zeigten kein feststellbares Protein. In ein«: folgenden Zubereitung wurden 30 mg 95 % reinen p97-Proteins aus 300 mg monoklonalem Antikörper 96,5 Fab-Fragmenten, konjugiert an Sepharose, isoliert Das gereinigte p97 Protein war immunogen und rief eine starke Antikörper-Reaktion in mit dem Protein geimpften Mäusen hervor, wie in dem spät«- folgenden Abschnitt 7.3 beschrieben wird. 7.2. Konstruktion und Expression des rekombinanten p97 Vaccinia-Virus

Die Codierungsregion von p97 wurde eingesetzt indem p97a mit Hindin geschnitten, an den Enden stumpf gemacht und in den Vaccinia-Insertionsvektor pGS-20 (Mackett et al., 1984, J. Virol. 49:857 - 864), der an der Smal-Stelle geöffnet worden war, ligiert wurde. Der PGS-20 Vektor verwendet den 7,5 K Promotor und enthält flankierende Sequenzen vom Vaccinia-Thymidin-Kinase (TK)-Gen. Ein rekombinantes Virus wurde durch das oben genannte Verfahren von Mackett et al. hergestellt und es wurde Vp97a-NY isoliert das infizierte Zellen zur Expression von p97-Protein richtiger Größe und Glykosylierung (Fig. 8) veranlaßt Oberflächenexpression von p97 wurde auch in den mit dem folgenden rekombinanten p97 Virus infizierten Zellen bestätigt -24-

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Tabelle I p97 Oberflächenexpression von transfizierten Mänsezellen und Zellen, die mit rekomhinantem VacciniaVinis infiziert sind 11

Zellart zur Infektion der Zelle verwendetes Virus Moleküle p97 pro Zelle exprimiert M2SVp97a.A keines 3,210.000 M2svp97a.E/F2 keines 434.000 M2 Eltern keines 2.000- BSC keines 5.590 BSC Vwt-NY Vaccinia 5.220 BSC Vp97a-NY Vaccinia 1,140.000 1) Die Zellen wurden kurz trypsinisiert, gewaschen und in Röhrchen mit 10^ bis 10^ oder 10^ Zellen in aliquote Anteile aufgeteilt. Nichtexprimierende Trägerzellen wurden zu Röhrchen mit niedrigeren Zellzahlen zugesetzt, sodaß pro Röhrchen eine Gesamtzahl von 10^ Zellen verwendet wurde. 1 x 10^ cpm jodinierter monoklonaler Antikörper 96,5 (123 ng) wurden in einem Gesamtvolumen von 50 pl 60 min auf Eis mit den Zellen inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und 4 mal in PBS + 10 % FCS geschleudert, dann neuerlich suspendiert und in einem Micromedic 4/600 plus Gammazähler ausgezählt. (-) bedeutet weniger als. 7.3. Rekombinantes p97 Vaccinia-virus ist in Mäusen immunogen

Die Immunisierung von Mäusen mit Vp97a-NY erzeugte eine starke humorale Antikörperreaktion. Die Mäuse wurden einmal immunisiert, nach vier Wochen einmal aufgefrischt und dann nach fünf Wochen ausbluten gelassen. Die Gehalte wurden durch ELISA bestimmt, wobei Antigen-überzogene Platten und ein mit Meerrettich-Peroxidase konjugiertes Protein A als Feststellungsreagens verwendet wurde. Die Daten wurden durch Vergleich mit einer Standardkurve für ELISA in Äquivalente monoklonaler Antikörper umgewandelt, wobei eine Bindung unter Verwendung von anti-p97 monoklonalem Antikörper 133.2 hervorgerufen wurde (Fig. 9). Zelluläre Immunität wurde unter Verwendung eines in vitro-Proliferationsassays mit gereinigtem p97 Protein als Stimulierantigen verwendet (Tabelle Π). -25-

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Tabelle!!

Pmliferationsassav von Mänsemilzzellen 11

Stimulierendes Antigen Proliferationsindex von vp97 rekombinanten immunen Milzzell»] Proliferationsindex von Vergleichsmilzzellen Con A (10pg/ml) 71 50 p97 Protein (3 pg/ml) 27 2 (10 pg/ml) 43 2 (20 pg/ml) 56 2 (50 microgr/ml) 44 3 UV-inaktiviertes Vaccinia-Virus (10 pfu/ml) 91 2 p97-transfizierte bestrahlte syngene Tumorzellen (10^) 86 2 Betrahlte Parenteral-Tumorzellen (10^) 3 1 1) Milzzellen wurden aus Mäusen isoliert, die durch Schwanzritzen mit 10^ pfu Vp97a-NY rekombinantes Virus geimpft, einen Monat später mit der gleichen Dosis aufgefrischt und eine Woche danach getötet worden waren. Zum Vergleich wurden natürliche Milzzellen bei diesem Versuch verwendet 10^ Zellen wurden pro Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen mit rundem Boden in 0,22 ml RPMI, ergänzt mit 0,5 % normalem Mausserum, Penicillin/Streptomycin, Glutamin, Bicarbonat und 2,5 x 10^ M 2-Mer-captoethanol gezüchtet. Am vierten Tag wurden die Kulturen 6 h mit 25 (lCi/Vertiefung tritiiertem Thymidin (New England Nuclear) puls-markiert, mit dem PHD-Zellerntegerät geerntet und unter Verwendung von Optifluor in einem Beckman LS 3801 Zähler gezählt

Die Proliferationsindices wurden durch Dividieren der cpm-Mittel vierfacher Vertiefungen, die mit jedem Antigen stimuliert worden waren, durch die mittleren cpm-Mittel des Vergleichs (Medien) berechnet

Die in Tabelle Π angegebenen Resultate zeigen, daß die T-Zellen als Reaktion auf das p97 Protein-Antigen proliferieren.

Um festzustellen, ob die Helfeizellen auch durch das rekombinante Virus in den Milzzellen der geimpften Mäuse stimuliert werden, wurden die Zellen in vitro stimuliert und die Oberstände auf Produktion von -26-

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Interleukin-2 (IL-2), einen Helfer-T-Zellfaktor, untersucht. Die Milzzellen wurden aus Mäusen gezüchtet, die vorher zwei mal mit rekombinantem Vp97a-NY-Vaccinia- oder Parenteral-Vaccinia geimpft worden waren. 10^ Zellen wurden 48 h in 0,2 ml Medium, das ident mit dem für die Proliferationsversuche verwendeten war, in 96-Mulden-Platten mit runden Böden in Gegenwart oder Abwesenheit von Stimulationsantigen inkubiert. Die Überstände wurden gesammelt, von vier Mulden vereinigt und vor dem IL-2-Versuch eingefroren. Beim EL-2-Versuch wurden 104 vorher mit IL-2 ausgehungerte Zellen der Maus-T-Zellinie CTLL verwendet, die in jeder Mulde mit verschiedenen Verdünnungen von Versuchsüberständen mit Qick's Medium in dreifacher Ausführung inkubiert worden waren. Eine Standardkurve wurde mit der Rekombinante IL-2, die von Genentech, CA, erhalten worden war, aufgestellt. Die CTLL-Zellen wurden in den letzten 6 Stunden der 24-stündigen Inkubation nach der üblichen Proliferationsassay-Methode mit Thymidin pulsmarkiert, dann geerntet und wie für die Proliferationsassay-Methoden beschrieben, ausgezählt. Die in Tabelle m angegebenen Resultate zeigen, daß die IL-2-Produktion von Milzzellen von Mäusen, die mit rekombinantem p97 Vaccinia-Virus immunisiert wurden, in vitro durch p97 stimuliert wird.

Tabellen!

Stimulierung der IL-2-Produktion durch p97 immune Milzzellen

Immunogen in vitro-Stimulus Produzierte IL-2-Einheiten Vp97a-Ny p97 Protein 4,4 (20 pg/ml) Vp97a-Ny Medium 0,25 Vwt-Ny p97 Protein 0,25 (20μβΛη1) Vwt-Ny Medium 0,25

Zusätzlich dazu wurde die Überempfindlichkeitsreaktion verzögerter Art durch den Fußballen-Schwellversuch an mit Vp97a-NY geimpften Mäusen gemessen. 5 Mäuse pro Gruppe (C3H/hen-Stamm) wurden durch Schwanzritzen mit rekombinantem oder Parenteralstamm-Vaccinia-Virus geimpft 6 Tage später wurden die Mäuse an den Hinterpfoten einem Angriff durch Impfen mit 20 μΐ PBS oder 20 μΐ Zellen in PBS (5 x 10* Zellen pro Maus) ausgesetzt. Die Fußballen wurden 24 h später unter Verwendung eines Fowler-Mikrometers in einem Doppelblindversuch gemessen. Die Dicke des mit PBS injizierten Fußballens wurde von der gemessenen Dicke der Versuchpfote bei jeder Maus abgezogen und Mittelwerte sowie Standardabweichungen der Schwellungszunahme des Fußballens wurden berechnet. Die in Tabelle IV gezeigten Resultate zeigen die Induktion einer p97 spezifischen Überempfindlichkeitsreaktion verzögerter Art bei Mäusen, die mit rekombinantem p97 Vaccinia-Virus immunisiert worden waren. -27-

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TahellelV

Antigen-spezifische Fußballen-Schwellung bei p97 immunen Mäusen

Immunogen Angreifendes Antigen Fußballenschwellung (mm x 10"2) Vp97a-NY p97-transfizierte syngene Tumorzellen 40,3(+/-6,8) Vp97a-NY parenterale syngene Tumorzellen 3,0(+/-2,8) Vwt-NY p97-transfizierte syngene Tumorzellen 1,5(+/-2,3) Vwt-NY parenterale syngene Tumorzellen 5,5(+/-5,0) 7.4. Schutz und Therapie mit p97-Vaccinia-Virus in einem Maus-Tumor-Modell

Um die Impfwirkung zu bestimmen, wurden die Mäuse nach verschiedenen Regeln unter Verwendung des erßndungsgemäßen rekombinanten p97 Vaccinia-Virus geimpft und dann einem Angriff mit einer p97-transfizierten syngenen Tumorzelle (M2SVp97a.2E) ausgesetzt. Zu diesem Zweck wurden Mäuse durch Schwanzritzen mitrekombinantem lebendem Vp97a-NY Vaccinia-Virus oder dem Parenteralstamm (Vwt-NY) geimpft; oder mit 100 pg gereinigtem Protein p97 oder 5 x 10 bestrahlten M2-K1735 Tumorzellen intraperitoneal in komplettem Freund-Hilfsmittel versetzt Ein intravenöser Tumorzellenangriff wurde zwei Wochen nach der letzten Impfung durch Injektion von M2SVp97a.2E verabreicht, einem metastatischen Tumorldon, hergestellt aus M2K1735 (einem Mäuse-Melanom-Modell) durch Transfektion der humanen p97 codierenden Sequenz, die in einem durch den frühen SV40 Promotor angetriebenen Expressionsplasmid enthalten ist Eine Vielzahl exprimierender Klone wurde selektiert und der eine, der für den Tumorangriff verwendet wurde, der Klon M2SVp97a.2E exprimiert einen mittleren Gehalt an p97, etwa 400.000 Moleküle pro Zelle oder ein Äquivalent zur Humanmelanom-p97-Antigendichte. Zwei Dosen des intravenösen Tumorangriffs wurden verwendet 5 x 10^ oder 1 x 10^ Zellen, die in die Schwanzvene syngener C3H/Hen-Mäuse injiziert wurden. Die Mäuse wurden 16 Tage nach dem Tumorangriff getötet und die Lungen entfernt Eine Maus wurde als positiv bezeichnet wenn Tumore für das bloße Auge sichtbar in den mit Inida-Tinte gefärbten Lungen waren. Die Ergebnisse sind in Tabelle V gezeigt

TaheiieV

Angriff mit svngenen p97 transfiäerten Melanom-Zellen auf geimpfte Mäuse

Vakzine Anzahl der Impfungen Zellmenge des Angriffs Anzahl der Mäuse mit sichtbaren Lungenmetastasen Vp97a-NY 2 SxlO5 1/5 1« 1 2/4 -28-

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Tabelle V {Fortsetzung)

Angriff mit svngenen p97 transfizierten Melanom-Zellen auf geimpfte Mäuse

Vakzine Anzahl der Impfungen Zellmenge des Angriffs Anzahl der Mäuse mit sichtbaren Lungenmetastasen bestrahlte synogene Melanomzellen 2 « 0/4 Vwt-NY 2 tt 9/10 p97 Protein 2 n 3/3 Vp97a-NY 2 lxlO5 0/1 1» 1 11 0/4 natürlich 0 tt 5/6

Die in Tabelle V gezeigten Ergebnisse demonstrieren den beträchtlichen Schutzeffekt von zwei Impfungen mit Vp97a-NY, obwohl kein Schutzeffekt mit der gereinigten p97 Protein-Vakzine beobachtet wird (trotz der extrem hohen ausgelösten Antikörper-Titer). Die Fähigkeit des rekombinanten Virus, Zellimmunität hervorzurufen, kann für seine Tumor-Schutzimmunität verantwortlich sein.

Bei einem Therapieversuch wurden Mäuse mit einer niedrigen Dosis von p97 exprimierenden Tumorzellen und dann zwei Tage später mit der rekombinanten Vaccinia-Vakzine geimpft. Die Mäuse erfuhren einen intravenösen Angriff mit 10^ oder 10^ p97 exprimierenden Tumorzellen (M2SVp97a.E). Zwei Tage später wurden die Mäuse durch Schwanzritzen entweder mit Vp97a-NY oder Vwtx-NY geimpft. Wöchentliche Impfungen durch Schwanzritzen wurden wiederholt und die überlebenden Mäuse bestimmt Die Ergebnisse in Fig. 10 zeigen den therapeutischen Effekt der Impfung mit rekombinantem p97 Vaccinia-Virus bei Mäusen mit bestehenden Lungenmetastasen. 7.5. Das rekombinante p97 Vaccinia-Virus wirkt bei Makaken-Affen als Immunogen

Zwei Macaca fasicularis-(Makaken)-Affen wurden durch Ritzen entweder mit 2 x 10^ plattenformenden Einheiten (pfu) von rekombinanter Vp97a-NY Vaccinia oder der gleichen Dosis des Parenteralstamms der Vaccinia geimpft Zwei Wochen später wurden die Seren durch ELISA auf die Gehalte von Vaccinia und p97 untersucht Die Ergebnisse sind in Tabelle VI dargestellt und zeigen, daß die humoralen Antikörper gegen p97 zwei Wochen nach einer einzigen Impfung mit Vp97-NY feststellbar sind. -29-

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Tabelle VI

Serum-Antikörper-Titer in mit Vaccinia geimpften Affen

Immunogen/Woche Anti-Vaccinia-Titer (Serumverdünnung mit doppeltem Hintergrund) Anti-p97-Titer (pg/ml monoklonale Antikörper-Äquivalente) Vp97a-NY/Woche 0 1/20 0,54 Vp97a-NY/Woche 2 1/2000 6,54 Vwt-NY/Woche 0 1/20 0,50 Vwt-NY/Woche 2 1/2000 0,34 8. Hinterlegnng der Mikroorganismen

Der folgende Stamm von E. coli, der das genannte Plasmid enthält, wurde bei ATCC, Rockville, MD, hinterlegt und erhielt die folgende Hinterlegungsnummer: E.coli Stämme Plasmid Hinterlegungsnummer E.coliHBlOl p97b 53 403

Das folgende rekombinante Vaccinia-Virus wurde bei ATCC, Rockville, MD hinterlegt und erhielt die folgende Hinterlegungsnummer:

Virus Hinterlegungsnummer

Vp97a-NY VR 2159

Die folgenden Zellinien, die die angegebenen Plasmide enthalten, wurden bei ATCC, Rockville, MD hinterlegt und haben die folgenden Hinterlegungsnummem:

Zellinie Plasmid Hinterlegungsnummer TKMp97-12 PMTp97b CRL 8985 (Mauszelle) B16SVp97a.l4 pSVp97a CRL9304 (Mäusemelanomzelle)

Die vorliegende Erfindung ist in ihrem Rahmen nicht durch die hinterlegten Mikroorganismen und Zellen beschränkt, da die hinterlegte Ausfiihrungsfoim nur eine einzige Illustration eines Aspekts der Erfindung ist und jeder Mikroorganismus und jede Zelle, die funktionell äquivalent sind, innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung liegen. Tatsächlich sind durch die vorangehende Beschreibung und die angeschlossenen Zeichnungen für den Fachmann zahlreiche Abänderungen der Erfindung zusätzlich zu den gezeigten Ausführungsformen möglich. Derartige Abänderungen liegen innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung und der angeschlossenen Ansprüche. -30-

Claims (27)

1. AT 396 938 B Es versteht sich auch, daß alle für die Nucleotide angegebenere Basenpaar-Größen angenähert sind und zum Zweck der Erläuterung dienen. PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung des Melanom-assoziierten Antigens p97, das eine im wesentlichen der Darstellung der angeschlossenen Fig. 3 entsprechende Aminosäuresequenz aufweist, bzw. zur Herstellung eines antigenen Teils desselben, gekennzeichnet durch a) Züchtung einer Zelle, die eine für das Peptid oder das Protein codierende Nucleotidsequenz enthält, die unter der Kontrolle einer zweiten, die Genexpression regulierenden Nucleotidsequenz steht, sodaß das Peptid oder Protein von der gezüchteten Zelle exprimiert wird, und b) Gewinnung des Peptids oder Proteins aus der Zellkultur.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mikroorganismenzelle gezüchtet wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Bakterienzelle gezüchtet wird.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Hefezelle gezüchtet wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle einer Tierzell-Linie gezüchtet wird.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle einer Insektenzell-Linie gezüchtet wird.
7. 7. Rekombinantes Virus, dessen Genom eine für ein antigen wirkendes, mit dem Melanom-assoziierten Antigen p97 verwandtes Peptid oder Protein oder einen antigen wirkenden Teil desselben codierende Nucleotidsequenz enthält, die unter der Kontrolle einer zweiten, die Genexpression regulierenden Nucleotidsequenz steht, sodaß ein mit dem Melanom-assoziierten p97-Antigen verwandtes Peptid oder Protein in einem mit dem Virus infizierten Wut exprimiert wird.
8. 8. Rekombinantes Virus nach Anspruch 7, bei welchem die für das mit dem Melanom-assoziierten Antigen p97 verwandte Peptid oder Protein codierende Nucleotidsequenz im wesentlichen die in Fig. 3 dargestellte Nucleotidsequenz oder irgendeinen Teil derselben, der für ein antigen wirkendes Peptid oder Protein codiert, enthält.
9. 9. Virus nach Anspruch 7 oder 8, das ein eingehülltes Virus enthält.
10. 10. Virus nach Anspruch 9, das ein Vaccinia-Virus enthält
11. 11. Virus nach Anspruch 7 oder 8, das ein nacktes Virus enthält.
12. 12. Virus nach Anspruch 11, das ein Adenovirus enthält.
13. 13. Virus nach Anspruch 7 oder 8, das ein Nuclear-Polyhedrosis-Virus enthält
14. 14. Virus nach Anspruch 13, das ein Baculovirus enthält.
15. 15. Virus nach Anspruch 7 oder 8, das einen Bacteriophagen enthält -31- AT 396 938 B
16. 16. Virus nach Anspruch 15, das einen Lambda-Phagen enthält
17. 17. Rekombinanter DNA-Vektor, derp97b enthält
18. 18. Einzelliger Organismus, der den rekombinanten DNA-Vektor nach Anspruch 17 enthält
19. 19. Bakterium, das den rekombinanten DNA-Vektor nach Anspruch 17 enthält
20. 20. Bakterium nach Anspruch 19, das Eschericha coli, hinterlegt bei ATCC unter der Nummer 53403, oder eine Mutante, Rekombinante oder ein gentechnisch verändertes Derivat davon enthält
21. 21. Rekombinanter DNA-Vektor, enthaltend pMTp97b.
22. 22. Zellinie, die den rekombinanten DNA-Vektor nach Anspruch 21 enthält
23. 23. Zellinie nach Anspruch 22, die TKMp97-12, hinterlegt bei ATCC unter der Nummer CRL 8985, oder eine Mutante, Rekombinante oder ein gentechnisch verändertes Derivat davon enthält.
24. 24. Rekombinanter DNA-Vektor, der pSVp97a enthält
25. 25. Zellinie, die den rekombinanten Vektor von Anspruch 24 enthält
26. 26. Zellinie nach Anspruch 25, die B16SVp97a.l4, hinterlegt bei ATCC unter der Nummer CRL 9304, oder eine Mutante, Rekombinante oder ein gentechnisch verändertes Derivat davon enthälL
27. 27. Virus nach Anspruch 10, das das Virus Vp97a-NY, hinterlegt bei ATCC unter der Nummer VR 2159, oder eine Mutante, Rekombinante oder ein gentechnisch verändertes Derivat davon enthält Hiezu 12 Blatt Zeichnungen -32-