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Proteolytisches Enzym-Präparat zur Verbesserung der Zartheit von
Fleisch und Verfahren zu dessen Herstellung
Die Erfindung betrifft ein proteolytisches Enzym-Präparat zur Verbesserung der Zartheit von Fleisch lebender Tiere, um so eine einheitliche Verteilung der Enzyme in den gesamten Fleischgeweben zu er- halten, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines solchen hochaktiven proteolytischen Enzym-Präparates.
In der USA-Patentschrift Nr. 2, 903, 362 wird ein Verfahren zur Behandlung lebender Tiere vorgeschla- gen, von denen Fleisch mit proteolytischen Enzymen erhalten wird, um so nach dem Schlachten Kadaver und Fleischstücke zu erhalten, die nach dem Kochen durch eine verbesserte Zartheit gekennzeichnet sind. Dieses Verfahren wird angewendet, um Fleischprodukte verbesserter Zartheit und zweckmässiger
Struktur zu erhalten. Diese Eigenschaften werden der praktisch einheitlichen Verteilung des proteolytischen Enzyms in den Fleischgeweben zugeschrieben.
Obgleich in dieser Patentschrift ein zufriedenstellendes Verfahren zur Herstellung von Enzymen in geeigneter Form für die Anwendung bei diesem Verfahren offenbart ist, und die nach dieser Verfahrensweise hergestellten Fleischprodukte die gewünschte verbesserte Zartheit und Struktur besitzen, sind bezüglich dieses Verfahrens weitere und zusätzliche Verbesserungen entwickelt worden. Die Verbesserungen ermöglichen die Standardisierung des bei dem Verfahren in Anwendung kommenden Enzyms, sowie Steuerung der Wirkung eines Zartmachens des Fleisches mittels einer Vorbehandlung des Enzyms vor der Einführung in das Tier sowie ebenfalls Einstellen der enzymatischen Wirksamkeit und Steuerung der Menge eines gegebenen Enzyms vorherbestimmter Aktivität, das in das Tier eingeführt wird.
Eine der Enzymarten. die bei der Durchführung des Verfahrens nach der USA-Patentschrift Nr. 2, 903, 362 angewendet wird, sind diejenigen proteolytischen Enzyme, die aus Pflanzenquellen gewonnen werden. Es ist bekannt, dass aus pflanzlichen Materialien gewonnene proteolytische Enzyme unterschiedliche Konstitution aufweisen. Schwankungen in der Konstitution des Enzyms werden ebenfalls bei der Handhabung des Enzyms während der Zubereitung bedingt, so dass der Proteingehalt, proteolytische Aktivität, Farbe, Geruch, Verunreinigung usw. sehr stark schwanken in Abhängigkeit von der Enzymquelle und der Verarbeitung, der dasselbe unterworfen worden ist.
Rohes Papain, Ficin und Bromelain enthalten eine bestimmte Menge enzymatischer Materialien, die bei Temperaturen in dem normalerweise bei dem Kochen von Fleischprodukten auftretenden Temperaturbereich aktiv sind, und dieselben enthalten ebenfalls bestimmte enzymatische Materialien, die bei tieferer Temperatur aktiv sind, und die nachteilig die Körperfunktionen des Tieres beeinflussen können. Ein zufriedenstellendes Zartmachen unter geringstmöglichen nachteiligen physiologischen Reaktionen bei dem Tier ist bei einer Applikation antemortem angezeigt. Das Ausmass des Zartmachens und das Vermeiden physiologischer Reaktionen wird in einem merklichen Ausmass durch die Eigenschaften des in Anwendung gebrachten Enzyms bestimmt.
Erfindungsgemäss wird somit ein Verfahren zur Behandlung roher Enzyme, die jedoch vorher zubereitet worden sind, in Vorschlag gebracht, um ein Enzym-Präparat zu gewinnen, das eine hohe enzymatische Aktivität bei erhöhten Temperaturen und kleinstmögliche enzymatische Aktivität bei den Körpertemperaturen des Tieres aufweist.
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Erfindungsgemäss werden weiterhin Enzym-Präparate für die Fleischbehandlung in Vorschlag gebracht, die erhebliche proteolytische Aktivität auf das Fleisch bei Kochtemperaturen und kleinstmögliche proteo- lytische Aktivität bei Temperaturen unter diesen Kochtemperaturen und etwa bei der Körpertemperatur des Fleischtieres aufweisen.
Allgemein betrifft die Erfindung die Herstellung von Enzym-Zubereitungen mit hoher proteolytischer
Aktivität und verringerter Neigung nachteilig die Tiere zu beeinflussen, in die dieselben eingeführt wer- den. Die Präparate sind speziell für die Anwendung bei dem Zartmachen von Fleisch angepasst, da die- selben ein hohes Mass proteolytischer Aktivität bei normalen Kochtemperaturen zeigen. Zusammen mit der hohen proteolytischen Aktivität in den Temperaturbereich von etwa 60-99 C geht eine sehr geringe proteolytische Aktivität bei Temperaturen unter diesem Temperaturbereich und insbesondere in dem Temperaturbereich etwa bei der normalen Körpertemperatur des Tieres einher.
Zu Enzym-Präparaten, die zu einem erheblichen Zartmachen des Fleisches bei Kochtemperaturen und geringstmöglichen nachteiligen physiologischen Wirkungen bei dem Tier führen, gehören diejenigen, die bestimmte Aktivitätscharakteri- stika besitzen, wie sie z. B. durch den Tyrosyl-Wert und zur Verfügung stehende und gesamte Milchausflockungswerte dargestellt werden, sowie die zu einem Zartmachen des Fleisches führende Aktivität, die durch spezifische Untersuchung des Gewebes gemessen wird.
Das Enzym wird im allgemeinen aus Pflanzenquellen erhalten und besitzt eine proteolytische Aktivität, die als Tyrosyleinheiten pro Gramm ausgedrückt wird von 40 000 bis 200000 Tyrosyleinheiten. In Lösung sollte das Enzym eine Aktivität besitzen, die ausgedrückt in Tyrosyleinheiten pro Milliliter we- nigstens'250 Tyrosyleinheiten beträgt, und ein Verhältnis der Tyrosyleinheiten pro Milliliter zu den gesamten Milchausflockungseinheiten pro Milliliter von 55 bis 100 zeigen, sowie eine zufriedenstellende spezifische Gewebeuntersuchung bei einer Temperatur in dem Bereich von 60 bis 990C ergibt.
Ein weiteres Charakteristikum der Enzymlösungen besteht darin, dass die Aktivität ebenfalls durch ein Verhältnis der Tyrosyleinheiten pro Milliliter zu den zur Verfügung stehenden Milchausflockungseinheiten pro Milliliter von mehr als 200 dargestellt wird. Pflanzenenzyme, die für die Zusammensetzung der Enzym-Präparate mit den gewünschten Charakteristiken am zweckmässigsten sind, sind Papain, Ficin und Bromelain.
Die Aktivität eines proteolytischen Enzyms, wie sie durch Tyrosyleinheiten wiedergegeben ist, ergibt ein Mass des von dem Enzym ausgeübten Effekt zum Zartmachen von Fleisch. Da diese Bestimmung bei erhöhter Temperatur durchgeführt wird, wird hiedurch die bei diesen erhöhten Temperaturen ausgeübte Wirkung des Zartmachens gemessen. Die Milchausflockungseinheiten stellen einen Ausdruck der Aktivität des Enzyms bei 400C dar und sind ein gutes Mass für die Aktivität bei oder in der Nähe der Körpertemperatur des Tieres. Somit stellen diese Einheiten ein gutes Mass für die Wahrscheinlichkeit nachteiliger physiologischer Reaktionen dar, die durch die enzymatische Aktivität bei Körpertemperatur bedingt werden.
Somit sollte die durch die Tyrosyleinheiten bedingte Aktivität gross sein und die durch die Milchausflockungseinheiten, sowohl gesamt als auch verfügbar wiedergegebene Aktivität sollte im Verhältnis zu den Tyrosyleinheiten klein sein. Das Verhältnis der Aktivität ausgedrückt als Tyrosy18inheiten zu der Aktivität ausgedrückt als gesamte Milchausflockungseinheiten und zur Verfügung stehende Milchausflokkungseinheiten führt zu einer Auswertung der durch das Enzym bedingten Aktivität zum Zartmachen von Fleisch, und führt ebenfalls zu einem Mass für die Wahrscheinlichkeit einer nachteiligen Beeinflussung der physiologischen Prozesse des Tieres durch die Enzym-Präparate.
Das proteolytische Enzym-Präparat gemäss vorliegender Erfindung'ist dadurch gekennzeichnet, dass es aus einer enzymhaltige wässerigen Lösung besteht, die eine Enzymaktivität von 250 bis 5 000, vorzugsweise 800 bis 1200 Tyrosyleinheiten pro Milliliter, und ein Verhältnis Tyrosyleinheiten zu gesamten Milchausflockungseinheiten von etwa 55 bis 100 besitzt.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung eines solchen Enzympräparates besteht darin, dass das verwendete rohe Enzym in Wasser unter Ausbilden einer flüssigen Enzymsuspension suspendiert wird, die proteolytische Aktivität der Suspension vorher in Tyrosyleinheiten bestimmt wird, sodann die Suspension einer Reinigung unterworfen, die proteolytische Aktivität der Suspension erneut in Tyrosyleinheiten bestimmt, und die Dosis des zur Behandlung des Fleisches angewendeten Enzyms so eingestellt wird, dass etwa 50 - 1000 und vorzugsweise 100 - 800 Tyrosyleinheiten pro kg Lebendgewicht in das Tier eingeführt werden.
Die Tyrosyleinheiten stellen die erhöhte Menge der in Trichloressigsäure löslichen Verbindungen dar, die mit dem Phenolfarbreagenz eine Farbe ausbilden können, die derjenigen Farbe äquivalent ist, die durch 100 Mikrogramm Tyrosin, erhalten aus 1 g Fleisch, gebildet wird, wenn das Enzym mit dem Fleisch 1 h lang bei einer Temperatur von 800C unter spezifischen Bedingungen inkubiert wird. Somit stellt die Bewertung eines Enzym Präparates in Tyrosyleinheiten ein Mass für die proteolytische Aktivität des Enzyms gegenüber Fleisch bei einer Temperatur von etwa 800C dar.
Obgleich Enzym-Präparate mit
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einem erheblichen Bereich Tyrosyleinheiten pro Milliliter bei den Verfahren angewendet werden können, sind doch sehr verdünnte oder extrem konzentrierte Lösungen im allgemeinen nicht zu empfehlen. Sehr verdünnte Lösungen, die das Enzym in einer ausreichenden Menge enthalten, um eine Aktivität entsprechend mehr als etwa 100 Tyrosyleinheiten pro Milliliter zu ergeben, bedürfen der Einführung übermässig grosser Volumina in das Tier, um eine messbare Wirkung bezüglich des Zartmachens zu erzielen.
Dort, wo sehr konzentrierte Präparate angewendet werden, bei denen die Enzym-Aktivität etwa 10000 Tyrosyleinheiten pro Milliliter beträgt, muss bezüglich des Abmessens der Lösung sorgfältig gearbeitet sowie eine sorgfältig Überwachung der Zeit zwischen dem Abschluss der Injektion und dem Schlachten aufrecht erhalten werden, um so nachteilige Reaktionen in dem Tier zu vermeiden. Derartige konzentrierte Lösungen sollten vorzugsweise vor der Anwendung verdünnt werden. Bei der bevorzugten Ausführungsform sind die zur Erzielung der erfindungsgemässen günstigen Wirkungen angewendeten Lösungen dadurch gekennzeich- net, dass dieselben eine Aktivität, ausgedrückt in Tyrosyleinheiten pro Milliliter von etwa 250 bis etwa 5 000 besitzen.
Die Milchausflockungseinheiten drücken das Mass der Aktivität eines gegebenen Enzyms bei Raumtemperatur aus, und diese Messung ist ein gutes Kriterium für die Aktivität des Enzyms bei oder in der Nähe der Körpertemperatur der Tiere. Somit kann die Milchausflockungsaktivität in Beziehung zu der Wahrscheinlichkeit nachteiliger physiologischer Reaktionen in dem mit einer gegebenen Zusammensetzung behandelten lebenden Tier herangezogen werden. Die Prüfung auf das Milchausflocken bedingt die Bestimmung der gesamten Aktivität (inaktives und aktives Enzym) und der zur Verfügung stehenden Aktivität (aktives Enzym) bei einer Temperatur von etwa 40 C. Die gesamte Enzym-Aktivität schliesst sowohl die zur Verfügung stehende proteolytische Aktivität als auch die proteolytische Aktivität ein die inaktiv ist, die jedoch in den aktiven Zustand regeneriert werden kann.
Hohe proteolytische Aktivität eines gegebenen Enzym-Präparates bei oder in der Nähe der Kochtemperaturen und kleinstmögliche proteolytische Aktivität bei einer Temperatur unterhalb dieses Bereiches können durch Einstellen der Aktivität des Enzyms, insbesondere wie durch die Milchausflockungsaktivität gemessen, erzielt werden. Papain sollte z. B. etwa 500 - 14000 Tyrosyleinheiten pro Milliliter in wässeriger Lösung, und zur Verfügung stehende Milchausflockurgswerte in dem Bereich von etwa 0 bis 42 Einheiten pro Milliliter ergeben.
Innerhalb dieser breiten Bereiche sind Papainlösungen mit den folgenden kennzeichnenden Merkmalen die zweckmässigsten :
EMI3.1
<tb>
<tb> Präparat <SEP> Tyrosyleinheiten <SEP> Gesamte <SEP> Milchaus <SEP> - <SEP> Zur <SEP> Verfügung <SEP> stehenpro <SEP> ml <SEP> flockungseinheiten <SEP> de <SEP> Milchausflockungspro <SEP> ml <SEP> einheiten <SEP> pro <SEP> ml.
<tb>
Enzym <SEP> 1 <SEP> 500 <SEP> 5-10 <SEP> 0-1, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Enzym <SEP> 2 <SEP> 1000 <SEP> 10-20 <SEP> 0-3 <SEP>
<tb> Enzym <SEP> 3 <SEP> 5000 <SEP> 50-100 <SEP> 0-15 <SEP>
<tb> Enzym <SEP> 4 <SEP> 14000 <SEP> 140 <SEP> - <SEP> 280 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> 42 <SEP>
<tb>
Die aktivste Enzymlösung mit 14000 Tyrosyleinheiten pro Milliliter wird gewöhnlich nicht bei dem Verfahren angewendet, da erhebliche Sorgfalt für das Abfüllen und Abmessen der Lösung und ebenfalls zum Sicherstellen einer einheitlichen Verteilung notwendig ist. Diese Lösung kann jedoch verdünnt werden, um so eine Aktivität in dem gewünschten Bereich zu erhalten.
Zur Erzielung bester Ergebnisse ist es zweckmässig, dass das Enzym in Wasser in einer Konzentration suspendiert wird, die ausreichend ist, um eine Aktivität von etwa 1000 Tyrosyleinheiten pro Milliliter zu erhalten. Dies ermöglicht das Einführen der Lösung in das Tier in einer Menge von etwa 0, 22 bis 0, 77 ml/kg Lebendgewicht des Tieres. Für das durchschnittliche Tier mit einem Gewicht von 360 bis 500 kg beträgt das gesamte Volumen der benötigten Enzymlösung sodann etwa 80 - 385 ml, und diese Menge kann in etwa 16 - 77 sec injiziert werden. Verdünntere Lösungen mit nur 500 Tyrosyleinheiten pro Milliliter müssen in einer Menge von etwa 0, 44 bis 1, 55 ml/kg eingeführt werden, und bei einem durchschnittlichen Tier werden hiezu etwa 160 - 770 ml gesamte Injektionsflüssigkeit benötigt.
Konzentriertere Lösungen mit etwa 5000 Tyrosyleinheiten pro Milliliter bedürfen nur der Einführung von 0, 44 bis 0, 155 ml/kg, und die Gesamtmenge beträgt somit nur 16 - 77 ml, die in 3 - 16 sec injiziert werden
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können, obgleich bei diesen konzentrierteren Lösungen eine grössere Präzision bei der Injektion angezeigt ist.
-Die Milchausflockungs- und Tyrosylwerte für ein gegebenes Enzym können in der folgenden Weise bestimmt werden : Milchausflockungs-Test.
A. Gesamtaktivität. Das Enzym, z. B. Papain, wird mit Glyzerin unter Ausbilden einer Paste von 200 g Papainpulver und 200 g chemisch reinem Glyzerin vermischt. Die erhaltene Paste wird in destilliertem Wasser gelöst, und die Lösung auf ein Volumen von 10 1 verdünnt. Der pH-Wert der Lösung wird mit 5, 0 n Natriumhydroxyd auf einen Wert von 7,4 eingestellt und sodann 100 g Natriumchlorid zugesetzt.
Nach Filtrieren der Lösung wird dieses Material für die Milchausflockungs-Tests angewendet. Bei der Bestimmung der Gesamtaktivität werden 10 ml der Enzymlösung mit 10 ml einer wässerigen Lösung aus 0,2 molar Cystein-Hydrochlorid und 0, 01 molar Versen vermischt, die vorher auf einen PH- Wert von 6 eingestellt worden ist. Man lässt das Gemisch 10 min lang stehen und verdünnt sodann mit 100 ml entionisiertem Wasser. Nach 5 min Inkubieren bei einer Temperatur von 400C ist das Enzym-Präparat fertig für die Anwendung.
Durch Vermischen von 80 g eines bei tiefer Temperatur sprühgetrockneten entrahmten Milchpulvers und290 ml entionisiertem Wasser. enthalten50 m10, l molar Cystein-Hydrochlorid und 0, 01 molar Versen (vorher auf einen pH-Wert von 6, 0 eingestellt) und 6 ml 4, 0 Calciumchlorid wird ein Substrat hergestellt. Diese Substratlösung wird sodann 30 min lang bei einer Temperatur von 400C inkubiert. Es werden 5 ml des Substrates aus entrahmter Milch in ein Reagenzglas gebracht und 1 ml der Enzymlösung zugegeben.
Anschliessend wird das Gemisch bis zum Ausflocken der Milch auf eine Temperatur von 400C erwärmt.
Die bis zum Ausflocken benötigte Zeit in Sekunden ist proportional der Enzymaktivität nach der folgenden Gleichung :
EMI4.1
t = Ausflockungszeit in Sekunden
E = Milliliter Enzym.
B. Zur Verfügung stehende Milchausflockungs-Aktivität.
Die wie bei dem Gesamtaktivitäts-Test hergestellte Enzym-Losung, die jedoch kein cystein und Versen enthält, wird 5 min lang vor dem Vermischen mit dem Substrat bei einer Temperatur von 40 C inkubiert. Das Substrat besteht aus den folgenden Bestandteilen in den angegebenen Mengen :
EMI4.2
<tb>
<tb> Entrahmtes <SEP> Milchpulver <SEP> 80 <SEP> g
<tb> Entionisiertes <SEP> Wasser <SEP> 360 <SEP> ml
<tb> 4, <SEP> 0 <SEP> molar <SEP> Calciumchlorid <SEP> 6 <SEP> ml.
<tb>
Das Substrat-Präparat wird in aliquoten Anteilen von 5 ml in einem Reagenzrohr angewendet und vor der Verwendung 30 min lang bei einer Temperatur von 400C inkubiert. Wie bei dem Messen der Gesamtaktivität wird wieder 1 ml der Enzymlösung mit 5 ml des Substrates inkubiert und die bis zum Ausflocken benötigte Zeit festgestellt.
Tyrosyleinheiten-Test.
Das Substrat wird durch 6 min Vermischen in einer Waring Blender Mischvorrichtung von 100 g magerem zerkleinerten Rindfleisch und 300 g Wasser hergestellt. Es werden jeweils 20 g Proben dieser Emul sion in 12 Flaschen überführt.
Die Enzymlösung sollte mit Wasser verdünnt sein, so dass dieselbe etwa 10 - 30 g gesamte Milchausflockungseinheiten pro Milliliter enthält.
5 ml dieser verdünnten Lösungen werden weiterhin mit entionisiertem Wasser auf 4 000 ml verdünnt.
Die Lösung wird in Kolben gebracht, die das Substrat in Mengen von 0, 1, 2,3, 4 und 5 ml pro Kolben enthalten. Es werden jeweils 2 Flaschen für jede Enzymmenge angewendet. Die Kolben werden sodann geschwenkt, um deren Inhalte zu vermischen und 1 h lang bei einer Temperatur von 80 C inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wird die Reaktion durch Zugabe von 40 ml einer zuigen wässerigen Trichloressigsäure zu dem Kolben und Umschütteln des Gemisches beendet. E'bildet sich ein Niederschlag, und man lässt den Kolben 30 min lang bei Raumtemperatur stehen, damit die Reaktion zum Abschluss kommt. Der Inhalt der Flaschen wird mit destilliertem Wasser bis auf 200 ml verdünnt, und nach gründlichem Mischen wird die Suspension filtriert.
Es wird ein aliquoter Teil von 2 ml aus jedem Filtrat in jedem Kolben für
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die Farbmessung auf die Tyrosylfarbe angewendet.
Zu jeder 2 ml Filtratprobe wird das folgende zugesetzt :
EMI5.1
<tb>
<tb> Reagenz <SEP> Menge
<tb> 0, <SEP> 25 <SEP> n <SEP> Schwefelsäure <SEP> 8 <SEP> ml
<tb> 201orges <SEP> wässeriges <SEP> Natriumcarbonat <SEP> 5 <SEP> ml <SEP>
<tb> Folin-Ciocalteau <SEP> Phenolreagenz <SEP> 1 <SEP> ml
<tb>
Nach der Zugabe der Reagenz lässt man das Filtrat 30 min lang stehen, und die Lösung wird sodann gegen eine Endprobe aus destilliertem Wasser in einem Spektrophotometer bei 540 jn gemessen.
Die In- tensität der Phenolfarbe wird durch Vergleichen der prozentualen Durchlässigkeit der Probe mit derjenigen ähnlich behandelter Standardproben ermittelt, die 0,40, 60 und 80 Mikrogramm Tyrosin pro Reagenzglas enthalten.
Bei der Herstellung der Enzymlösung wird das getrocknete Enzympulver in der erhaltenen Form mit einer gleichen Menge Glyzerin vermischt, die Mischung in Wasser suspendiert und die Aktivität in Tyrosyl- einheiten, sowie die Aktivität ausgedrückt als gesamte Ausflockungseinheiten und zur Verfügung stehende Milchausflockungseinheiten bestimmt. Der Wert für die zur Verfügung stehenden Milchausflockungseinheiten kann durch reversible Inaktivierung der Enzymlösung oder Fraktionieren des Enzyms mittels eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels verringert werden, indem das Enzym unlöslich ist, wie Aceton, Dioxan oder die niederen Alkylalkohole.
Zu geeigneten Lösungsmitteln gehören Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol, tert.-Butanol, Äthylenglykol, Methylcellosolv und Methyläthylketon. Ein wahlweises Verfahren zur Verringerung der zur Verfügung stehenden Milchausflockungseinheiten stellt die Salzfraktionierung mit Natriumchlorid, Natriumsulfonat, Natriummonohydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Kaliumchlorid, Ammoniumsulfat oder weiteres geeignetes Salz dar. Die Konzentration des Enzyms in der Lösung wird so eingestellt, dass ein geeignetes Lösungsvolumen in das Tier injiziert wird, um so etwa 55 - 1100 Tyrosyleinheiten pro kg Lebendgewicht des Tieres und etwa 2 - 17 gesamte Milchausflockungseinheiten pro kg Lebendgewicht des Tieres zu ergeben.
Obgleich bei der bevorzugten Ausführungsform etwa 820 - 880 Tyrosyleinheiten pro kg in das Tier eingeführt werden, lassen sich sehr zufriedenstellende Ergebnisse erzielen, wenn etwa 110 bis 880 Tyrosyleinheiten Anwendung finden. Es ist möglich, Enzymlösungen herzustellen, die die gewünschten Charakteristika durch Gemische aus Papain, Ficin und Bromelain aufweisen.
Das Enzym ist ebenfalls durch Inaktivierung, Lösungsmittelfraktionieren und Salzfraktionieren gereinigt worden. Lösungsmittel, wie Aceton und die niederen Alkylalkohole werden bei der Lösungsmittelfraktionierung angewendet, während Natriumchlorid, Natriumsulfat, Alkalimetallphosphate, Ammoniumphate und Sulfate bei der Salzfraktionierung Verwendung finden können. Eine Vorkonditionierung durch diese Verfahren stellt sicher, dass das Enzym eine hohe proteolytische Aktivität aufweist und relativ frei von inaktivierenden Materialien und Inhibitoren ist. Weitere inerte Proteine u. a. Substrate, die durch die Eigeneinwirkung des Enzyms bedingt werden, werden hiedurch entfernt. Die Biuret-Protein Probe gibt ein Mass für die vorliegende Proteinmenge in der Zubereitung und misst somit indirekt die vorliegenden Verunreinigungsmengen.
Enzym-Präparate im Rahmen der Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, dass dieselben 50% oder mehr Biuretprotein und eine ausreichende proteolytische Aktivität ausweisen, so dass weniger als 3,0 g des Pulvers suspendiert in 100 ml Wasser benötigt werden, um eine Aktivität von wenigstens 1000 Tyrosyleinheiten pro Milliliter zu erzielen.
Die folgende Tabelle I erläutert einen Vergleich zwischen verschiedenen rohen Enzymen, die nicht zureichende Aktivität zeigen, um erfindungsgemäss arbeiten zu können, und den erfindungsgemäss zubereiteten Enzymen, die zu den erfindungsgemäss günstigen Ergebnissen führen.
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Tabelie1
EMI6.1
<tb>
<tb> Enzym-Pulver <SEP> Biuret-Protein <SEP> Tyrosyleinheiten <SEP> Gesamte <SEP> Milchaus- <SEP> Zur <SEP> Verfügung <SEP> g <SEP> Pulver <SEP> pro <SEP> 100 <SEP> ml
<tb> % <SEP> pro <SEP> g <SEP> Pulver <SEP> flockungseinheiten <SEP> stehende <SEP> Milchaus- <SEP> um <SEP> 1 <SEP> 000 <SEP> Tyro- <SEP>
<tb> pro <SEP> g <SEP> Pulver <SEP> flockungseinheiten <SEP> syleinheiten/ml <SEP> zu
<tb> pro <SEP> g <SEP> Pulver <SEP> erhalten.
<tb>
Gemahlenes <SEP> handelsübliches <SEP> Enzym <SEP> A <SEP> 38 <SEP> 15700 <SEP> 250 <SEP> 88 <SEP> 6,4
<tb> Gemahlenes <SEP> handelsübliches <SEP> Enzym <SEP> B <SEP> 37 <SEP> 20 <SEP> 600 <SEP> 419 <SEP> 29 <SEP> 4,9
<tb> Gemahlenes <SEP> handelsübliches <SEP> Enzym <SEP> C <SEP> 40 <SEP> 19800 <SEP> 316 <SEP> 128 <SEP> 5, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Gemahlenes <SEP> handelsübliches <SEP> Enzym <SEP> D <SEP> 41 <SEP> 19100 <SEP> 315 <SEP> 112 <SEP> 5, <SEP> 2
<tb> Gereinigt <SEP> A <SEP> 57 <SEP> 44 <SEP> 600 <SEP> 663 <SEP> 430 <SEP> 2,2
<tb> Gereinigt <SEP> B <SEP> 59 <SEP> 41300 <SEP> 557 <SEP> 340 <SEP> 2,4
<tb> Gereinigt <SEP> C <SEP> 61 <SEP> 42 <SEP> 700 <SEP> 724 <SEP> 430 <SEP> 2,3
<tb> Gereinigt <SEP> D <SEP> 55 <SEP> 65 <SEP> 000 <SEP> 980 <SEP> 620 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Gereinigt <SEP> E <SEP> 57 <SEP> 45 <SEP> 300 <SEP> 678 <SEP> 376 <SEP> 2,
2
<tb> Gereinigt <SEP> F <SEP> 61 <SEP> 45800 <SEP> 593 <SEP> 19 <SEP> 2,2
<tb> Gereinigt <SEP> G <SEP> 50 <SEP> 41800 <SEP> 660 <SEP> 328 <SEP> 2,4
<tb> Gereinigt <SEP> H <SEP> 50 <SEP> 52200 <SEP> 915 <SEP> 447 <SEP> 1,9
<tb> Gereinigt <SEP> 1 <SEP> 52 <SEP> 58 <SEP> 300 <SEP> 1120 <SEP> 480 <SEP> 1,7
<tb> Gereinigt <SEP> J <SEP> 67 <SEP> 103500 <SEP> 1620 <SEP> 785 <SEP> 1,0
<tb>
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Die gereinigten Enzyme wurden mit Salzen oder Lösungsmitteln fraktioniert oder durch Oxydation in- aktiviert.
Die Vorkonditionierung des rohen Enzyms, wenn man derartige Enzyme anwenden will, wird an Hand des folgenden Beispieles erläutert, bei dem das gemahlene handelsübliche Enzym D in der Tabelle I mit verschiedenen Mitteln behandelt wird, um ein Enzym zu erhalten, das die Charakteristika der erfindungs- gemässen Enzyme besitzt.
Beispiel l : Rohes Enzym. Das Enzym ist eine rohe getrocknete Latex, die gemahlen worden ist, so dass die Teilchen eine lichte Maschenweite von kleiner als 0, 178 mm aufweisen. 75 g dieses Papain- enzyms werden mit 75 g reinem Glyzerin unter Ausbilden einer Paste vermischt, und diese Paste in
1500 ml destilliertem Wasser suspendiert. Die rohe Lösung wird zentrifugiert und zwecks Klären filtriert.
Nach einer Seitz Filtration wird die Lösung in Mengen äquivalent 0,22, 0,33, 0, 44, 0, 55, 0,66, 0, 77, 1, 54 und 2, 75 ml/kg Lebendgewicht in erwachsene Schafe injiziert. Diese Mengen gelten für eine Lösung, die 1 000 Tyrosyleinheiten pro Milliliter enthält, und alle Abweichungen von einer derartigen Aktivität werdendurchVergrössernoderVerkleinernder in jedemFall angewendeten Menge entsprechend eingestellt.
Belüftetes rohes Enzym. Es werden 75 g rohes Papain mit 75 g Glyzerin vermischt und die Paste in
1200 ml destilliertem Wasser aufgenommen. Der pH-Wert der Lösung wird auf 7, 4 mit 5 n wässeriger
Natriumhydroxydlösung eingestellt und das Endvolumen mit destilliertem Wasser auf 1 500 ml gebracht.
Die Lösung wird durch Zentrifugieren und anschliessendes Filtrieren geklärt. Die filtrierte Lösung wird in einer Waring Blender Mischvorrichtung mehrmals in Abstanden von 4 min zwischen dem Vermischen je- weils 1 min lang homogen vermischt, wobei das gesamte homogene Vermischen innerhalb von 3 h durchgeführt wird. Die homogen vermischte Lösung wird sodann auf das fünffache ihres Volumens verdünnt und mittels Filtrieren durch ein bakterienzurückhaltendes Filterkissen sterilisiert. Diese Lösung wird in er- wachsene Schafe in der gleichen Menge injiziert, wie es weiter oben bezüglich des rohen Enzyms beschrieben ist.
Mit Peroxyd inaktiviertes rohes Enzym. Es werden 100 g rohes gemahlenes Papain und 100 g reines Glyzerin miteinander vermischt, und die so hergestellte Paste wird in 2000 ml einer 3% eigen Wasserstoffperoxydlösung aufgenommen. Innerhalb einer Zeitspanne von 3,5 h wird eine Lösung von Rinderleberkatalase, die 200 Kiel Einheiten pro Milliliter enthält, in einer Menge von 6,65 Kiel Einheiten pro Milli- lite Enzymlösung zugesetzt. Die Lösung wird sodann mittels Filtrieren geklärt, und der pH-Wert mit 5 n wässerigem Natriumhydroxyd auf 7, 4 eingestellt.
Die abschliessend erhaltene lösung wird mittels Filtrieren durch ein bakterienzurückhaltendes Seitz Filterkissen sterilisiert, und diese Lösung zum Injizieren von Schafen in derartigen Mengen angewendet, wie es weiter oben bezüglich des rohen Enzyms angegeben ist.
Mittels Natriumchlorid fraktioniertes rohes Enzym. Das im Handel befindliche rohe gemahlene Papain (150 g) wird unter Ausbilden einer Paste mit reinem Glyzerin (150 g) vermischt, und die Paste in 2 000 ml destilliertem Wasser aufgenommen. Der pH-Wert der Lösung wird mit wässeriger Natriumhydroxydlösung auf 7, 4 eingestellt und 30 min lang bei diesem pH-Wert gehalten. Der pH-Wert der Lösung wird sodann auf 3, 5 gebracht und 685 g Natriumchlorid zugesetzt. Abschliessend wird die Lösung auf eine Temperatur von 100C abgekühlt. Der sich hiebei ausbildende Niederschlag wird vermittels Zentrifugieren abgepresst und bei einem pH-Wert von 7, 4 in 2260 ml destilliertem Wasser aufgenommen. Die Lösung wird mittels Filtrieren durch ein bakterienzurückhaltendes Seitz Filterkissen sterilisiert.
Die sterilisierte Lösung wird in erwachsene Schafe in den oben angegebenen Mengen injiziert.
Mit Alkohol fraktioniertes rohes Enzym. Es werden 60 g im Handel erhältliches gemahlenes Papain und 60 g reines Glyzerin unter Ausbilden einer Paste miteinander vermischt, und die Paste in 1200 ml destilliertem Wasser aufgenommen, sodann auf eine Temperatur von 00C abgekühlt. Der pH-Wert der Lösung wird mittels 5 n wässeriger Natriumhydroxyd auf 7, 4 eingestellt, und die Lösung sodann durch Filtrieren geklärt. Das Enzym wird aus dieser wässerigen Lösung durch Zugabe von 4000 ml Äthanol ausgefällt. Die in Anwendung kommende Äthanolmenge führt zu einer etwa zuigen Äthanollösung. Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt und sodann in 1000 ml destilliertem Wasser bei einem pH-Wert von 7, 4 gelöst.
Es werden 15 g Natriumchlorid zugesetzt, und die Lösung mittels Filtrieren durch ein bakterienzurückhaltendes Seitz-Filterkissen sterilisiert. Die sterilisierte Lösung wird für die Injektion erwachsener Schafe entsprechend den vorangehenden Beispielen angewendet.
Mit Aceton fraktioniertes rohes Enzym. Es werden 60 g im Handel erhältliches gemahlenes Papain und 60 g reines Glyzerin unter Ausbilden einer Paste vermischt, und die Paste in 1 200 ml destilliertem Wasser aufgenommen und sodann auf 100 C abgekühlt. Der pH-Wert der abgekühlten Lösung wird auf 7, 4 eingestellt und die Lösung sodann mittels Filtrieren geklärt. Das Enzym wird aus der wässerigen Lösung
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durch Zugabe von 3000 ml Aceton ausgefällt, das auf eine Temperatur von 100C abgekühlt ist. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt, und der Niederschlag sodann in 1000 ml destilliertem
Wasser mit einem pH-Wert von 7, 4 gelöst. Es werden 10 g Natriumchlorid zugegeben, und die Lösung mittels Filtrieren durch bakterienzurückhaltendes Seitz Filterkissen filtriert.
Die Lösung wird sodann in erwachsene Schafe in den angegebenen Mengen injiziert.
Mit Natriumsulfat fraktioniertes rohes Enzym. Es werden 50 g rohes gemahlenes Papain und 50 g reines Glyzerin unter Ausbilden einer Paste vermischt, und die Paste sodann in 1000 ml destilliertem Wasser aufgenommen. Der pH-Wert der Lösung wird auf 7,4 eingestellt und die Lösung sodann bei diesem pH-Wert 30 min lang gehalten. Sodann wird der pH-Wert auf 5,0 eingestellt. Es werden 400 g Natriumsulfat zugegeben, und die Lösung bis zum Lösen des Salzes gerührt. Es werden 20 g Filtrierhilfsmittel zugesetzt und der so gebildete Niederschlag mittels Filtrieren abgetrennt. Der Niederschlag wird in 1000 ml destilliertem Wasser bei einem pH-Wert von 7, 4 aufgenommen und die Lösung zwecks Klären und Sterilisieren filtriert. Die Lösung wird sodann zum Injizieren in erwachsene Schafe nach den vorangehenden Beispielen angewendet.
Dialysiertes rohes Enzym. Es werden 37,25 g im Handel erhältliches gemahlenes Papain und 27,25 g Glyzerin unter Ausbildung einer Paste vermischt, und die Paste sodann in 745 ml destilliertem Wasser bei einem pH-Wert von 7,4 aufgenommen. Die Lösung wird in ein Visking Dialysierrohr eingeführt und gegen destilliertes Wasser 48 h lang dialysiert. Das abschliessend erhaltene Volumen der Lösung beträgt 1195 ml, entsprechend einer Verdünnung von 1, 6. Es werden 24 g Natriumchlorid zugegeben, und die Lösung auf einen pH-Wert von 7, 4 eingestellt. Anschliessend wird durch ein bakterienzurückhaltendes Seitz Filterkissen zwecks Klären und Sterilisieren filtriert. Diese Lösung wird in erwachsene Schafe in den oben angegebenen Mengen injiziert.
Es ist zu beachten, dass das bei allen oben angegebenen Reinigungsverfahren angewendete rohe Enzyme aus dem gleichen Ansatz herstammt, und dass somit die durch die verschiedenen Sterilisierungs- und Reinigungsverfahren erzielten Verbesserungen direkt mit der rohen Probe in Beziehung gesetzt werden können.
Die analytischen Werte für jede der Proben sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt :
EMI8.1
<tb>
<tb> Tyrosylein- <SEP> Milchauslockungseinhei- <SEP> Tyrosyleinheiten <SEP> pro
<tb> Präparat <SEP> heiten <SEP> pro <SEP> ml <SEP> ten <SEP> pro <SEP> ml <SEP> Milchausflockungseinheit
<tb> gesamt <SEP> verfügbar <SEP> gesamt <SEP> verfügbar
<tb> 1. <SEP> Rohes <SEP> Enzym <SEP> 813 <SEP> 16,4 <SEP> 4,6 <SEP> 50 <SEP> 177
<tb> 2. <SEP> Belüftetes <SEP> rohes <SEP> Enzym <SEP> 209 <SEP> 3,5 <SEP> 0,1 <SEP> 60 <SEP> 2090
<tb> 3. <SEP> Mit <SEP> Peroxyd <SEP> inaktiviertes
<tb> rohes <SEP> Enzym <SEP> 465 <SEP> 5,3 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 88 <SEP> 4650
<tb> 4. <SEP> Mit <SEP> Natriumchlorid <SEP> fraktioniertes <SEP> rohes <SEP> Enzym <SEP> 611 <SEP> 9,8 <SEP> 0,2 <SEP> 63 <SEP> 30150
<tb> 5.
<SEP> Mit <SEP> Alkohol <SEP> fraktioniertes
<tb> rohes <SEP> Enzym <SEP> 890 <SEP> 14,8 <SEP> 0,7 <SEP> 60 <SEP> 1271
<tb> 6. <SEP> Mit <SEP> Aceton <SEP> fraktioniertes
<tb> rohes <SEP> Enzym <SEP> 1000 <SEP> 15, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 64 <SEP> 3333
<tb> 7. <SEP> Mit <SEP> Natriumsulfat <SEP> fraktioniertes <SEP> rohes <SEP> Enzym <SEP> 945 <SEP> 11,9 <SEP> 0,2 <SEP> 87 <SEP> 4725
<tb> 8. <SEP> Dialysiertes <SEP> rohes <SEP> Enzym <SEP> 750 <SEP> 9,6 <SEP> 0,2 <SEP> 78 <SEP> 3750
<tb>
Bei der Injizierung in Schafe der behandelten Präparate 2 - 8 bei Dosen bis zu etwa 1, 55 ml/kg werden keine wesentlichen nachteiligen physiologischen Reaktionen induziert und keine wesentlichen Verletzungen bei einer Untersuchung der Kadaver beobachtet.
Steaks und Kotletts, sowie Bratenstücke, die aus diesen Kadavern herstammen, wurden von einer Gruppe Experten bezüglich der Zartheit mit der Wertung 8 oder besser befunden. Die numerische Bewertung verläuft von 1 für nicht zufriedenstellend bis zu
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10, die überragende Qualität anzeigt.
Das rohe Material führte anderseits zu Depressionen und beschleunigtem Atmen bei Anwendung von Mengen von 0,33 ml/kg und darüber. Weiterhin wurde ein Bluten in dem mediastinalen Lymphknoten und den Lebern bei Dosen von 0,33 ml/kg und darüber festgestellt.
Obgleich erfindungsgemäss das Verfahren und Produkt im wesentlichen auf die Verfahrensweise gerichtet sind, bei der lebende Tiere behandelt werden, können die Präparate ebenfalls bei der Behandlung von Fleischstücke Anwendung finden, die in das Enzym eingetaucht oder in anderer Weise hiemit behandelt werden, um so mit dem Enzym einen Oberflächenüberzug auf dem Fleisch aufzubringen.
Es können sehr stark gereinigte Materialien mittels eines verwickelten Trennsystems unter Gewinnen von reinem Papain und reinem Chymopapain mit erheblichen Aktivitäten hergestellt werden. So wurden Papain und Chymopapainfraktionen mit den folgenden kennzeichnenden Eigenschaften aus einer rohen Papainprobe isoliert.
EMI9.1
<tb>
<tb>
Papain <SEP> Aktivität/g <SEP> Aktivität/g <SEP> Aktivität/g
<tb> Biuretprotein <SEP> elektrophoretisches <SEP> Chymopapain <SEP> und
<tb> Protein <SEP> Papain <SEP> Protein
<tb> Tyrosyleinheiten <SEP> 195000 <SEP> 307000 <SEP> 452000 <SEP>
<tb> Gesamte <SEP> Milchausflockungseinheiten <SEP> 3500 <SEP> 5600 <SEP> 8200 <SEP>
<tb> Verfügbare <SEP> Milchausflockungseinheiten <SEP> 1100 <SEP> 1770 <SEP> 2600 <SEP>
<tb> Chymopapain
<tb> Tyrosyleinheiten <SEP> 117500 <SEP> 370000 <SEP> 660000 <SEP>
<tb> gesamte <SEP> Milchausflockungseinheiten <SEP> 1320 <SEP> 4150 <SEP> 7400 <SEP>
<tb> verfügbare <SEP> Milchausflockungseinheiten <SEP> 100 <SEP> 300 <SEP> 540
<tb>
Es lassen sich im Rahmen der Erfindung Abwandlungen und Modifizierungen durchführen, ohne vom Geist und Umfang derselben abzuweichen.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Proteolytisches Enzym-Präparat für die Verbesserung der Zartheit von Fleisch vorzugsweise durch Injektion des Präparates in lebende Tiere, dadurch gekennzeichnet, dass das Präparat aus einer enzymenthaltenden wässerigen Lösung besteht, die eine Enzymaktivität von 250 bis 5 000, vorzugsweise 800 bis 1200 Tyrosyleinheiten pro Milliliter, und ein Verhältnis Tyrosyleinheiten zu gesamten Milchausflockungseinheiten von etwa 55 bis 100 besitzt.
<Desc / Clms Page number 1>
Proteolytic enzyme preparation to improve the tenderness of
Meat and process for its production
The invention relates to a proteolytic enzyme preparation for improving the tenderness of meat of living animals in order to obtain a uniform distribution of the enzymes in the entire meat tissue, as well as a method for producing such a highly active proteolytic enzyme preparation.
US Pat. No. 2, 903, 362 proposes a method for treating living animals from which meat is obtained with proteolytic enzymes in order to obtain carcasses and pieces of meat after slaughter which are improved after cooking Delicacy are characterized. This method is used to make meat products of improved tenderness and convenience
Structure. These properties are attributed to the practically uniform distribution of the proteolytic enzyme in the meat tissues.
While this patent discloses a satisfactory process for preparing enzymes in a suitable form for use in the process, and the meat products prepared by this process have the desired improved tenderness and texture, further and additional improvements have been developed in relation to this process. The improvements allow standardization of the enzyme used in the process, control of the effect of tenderizing the meat by pretreating the enzyme prior to introduction into the animal, as well as adjusting the enzymatic effectiveness and controlling the amount of a given enzyme of predetermined activity is introduced into the animal.
One of the types of enzyme. which is used in carrying out the method according to US Pat. No. 2,903,362 are those proteolytic enzymes which are obtained from plant sources. It is known that proteolytic enzymes obtained from plant materials have different constitution. Variations in the constitution of the enzyme are also caused in the handling of the enzyme during preparation, so that the protein content, proteolytic activity, color, odor, contamination, etc. vary greatly depending on the enzyme source and the processing to which it has been subjected .
Raw papain, ficin and bromelain contain a certain amount of enzymatic materials that are active at temperatures in the temperature range normally encountered when cooking meat products, and they also contain certain enzymatic materials that are active at lower temperatures and which adversely affect the body's functions Can influence the animal. A satisfactory tenderization with the least possible adverse physiological reactions in the animal is indicated in the case of an application antemortem. The extent of the tenderization and the avoidance of physiological reactions is determined to a considerable extent by the properties of the enzyme used.
According to the invention, a method for treating raw enzymes, which, however, have been prepared beforehand, is proposed in order to obtain an enzyme preparation which has a high enzymatic activity at elevated temperatures and the lowest possible enzymatic activity at the body temperature of the animal.
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According to the invention, enzyme preparations for meat treatment are also proposed which have considerable proteolytic activity on the meat at cooking temperatures and the lowest possible proteolytic activity at temperatures below these cooking temperatures and approximately at the body temperature of the meat animal.
In general, the invention relates to the production of enzyme preparations with high proteolytic
Activity and decreased propensity to adversely affect the animals into which they are introduced. The preparations are specially adapted for use in tenderizing meat, as they show a high degree of proteolytic activity at normal cooking temperatures. Together with the high proteolytic activity in the temperature range of about 60-99 C, a very low proteolytic activity is associated with temperatures below this temperature range and in particular in the temperature range approximately at the normal body temperature of the animal.
Enzyme preparations which lead to a considerable tenderization of the meat at cooking temperatures and the least possible adverse physiological effects on the animal include those which have certain activity characteristics, such as those found in e.g. Represented by the tyrosyl value and available and total milk flocculation values, as well as the meat tenderizing activity, which is measured by specific examination of the tissue.
The enzyme is generally obtained from plant sources and has a proteolytic activity, expressed as tyrosyl units per gram, of 40,000 to 200,000 tyrosyl units. In solution, the enzyme should have an activity which, expressed in tyrosyl units per milliliter, is at least 250 tyrosyl units, and a ratio of tyrosyl units per milliliter to total milk flocculation units per milliliter of 55 to 100, as well as satisfactory specific tissue examination at one temperature in the range of 60 to 990C.
Another characteristic of the enzyme solutions is that the activity is also represented by a ratio of the tyrosyl units per milliliter to the available milk flocculation units per milliliter of more than 200. Plant enzymes which are most suitable for the composition of the enzyme preparations with the desired characteristics are papain, ficin and bromelain.
The activity of a proteolytic enzyme, as represented by tyrosyl units, provides a measure of the meat tenderizing effect exerted by the enzyme. Since this determination is carried out at an elevated temperature, it is used to measure the tenderizing effect exerted at these elevated temperatures. The milk flocculation units are an expression of the activity of the enzyme at 40 ° C and are a good measure of the activity at or near the animal's body temperature. These units thus represent a good measure of the likelihood of adverse physiological reactions that are caused by the enzymatic activity at body temperature.
Thus, the activity due to the tyrosyl units should be high and the activity represented by the milk flocculation units, both total and available, should be small in relation to the tyrosyl units. The ratio of the activity expressed as tyrosyl units to the activity expressed as total milk flocculation units and available milk flocculation units leads to an evaluation of the activity caused by the enzyme for tenderizing meat, and also leads to a measure of the likelihood of an adverse effect on the physiological processes of the Animal by the enzyme preparations.
The proteolytic enzyme preparation according to the present invention is characterized in that it consists of an enzyme-containing aqueous solution which has an enzyme activity of 250 to 5,000, preferably 800 to 1200 tyrosyl units per milliliter, and a ratio of tyrosyl units to total milk flocculation units of about 55 to 100 owns.
The inventive method for producing such an enzyme preparation consists in that the crude enzyme used is suspended in water to form a liquid enzyme suspension, the proteolytic activity of the suspension is previously determined in tyrosyl units, then the suspension is subjected to a purification, the proteolytic activity of the suspension again determined in tyrosyl units, and the dose of the enzyme used to treat the meat is adjusted so that about 50-1000 and preferably 100-800 tyrosyl units per kg of live weight are introduced into the animal.
The tyrosyl units represent the increased amount of compounds soluble in trichloroacetic acid that can develop a color with the phenol color reagent that is equivalent to the color that is formed by 100 micrograms of tyrosine obtained from 1 g of meat when the enzyme is mixed with the meat 1 h is incubated at a temperature of 800C under specific conditions. Thus, the evaluation of an enzyme preparation in tyrosyl units is a measure of the proteolytic activity of the enzyme on meat at a temperature of around 800C.
Although with enzyme preparations
<Desc / Clms Page number 3>
A substantial range of tyrosyl units per milliliter can be used in the process, but very dilute or extremely concentrated solutions are generally not recommended. Very dilute solutions which contain the enzyme in a sufficient amount to give an activity corresponding to more than about 100 tyrosyl units per milliliter require the introduction of excessively large volumes into the animal in order to achieve a measurable tenderizing effect.
Wherever very concentrated preparations are used, in which the enzyme activity is about 10,000 tyrosyl units per milliliter, careful attention must be paid to the measurement of the solution and careful monitoring of the time between the completion of the injection and slaughter avoid adverse reactions in the animal. Such concentrated solutions should preferably be diluted before use. In the preferred embodiment, the solutions used to achieve the beneficial effects according to the invention are characterized in that they have an activity, expressed in tyrosyl units per milliliter, of about 250 to about 5,000.
The milk flocculation units express the level of activity of a given enzyme at room temperature, and this measurement is a good criterion for the activity of the enzyme at or near the animals' body temperature. Thus, milk flocculation activity can be related to the likelihood of adverse physiological reactions in the live animal treated with a given composition. The test for milk flocculation requires the determination of the total activity (inactive and active enzyme) and the available activity (active enzyme) at a temperature of about 40 C. The total enzyme activity includes both the available proteolytic activity and the the proteolytic activity which is inactive but which can be regenerated to the active state.
High proteolytic activity of a given enzyme preparation at or near the cooking temperatures and the lowest possible proteolytic activity at a temperature below this range can be achieved by adjusting the activity of the enzyme, in particular as measured by the milk flocculation activity. Papain should e.g. B. about 500-14000 tyrosyl units per milliliter in aqueous solution, and available milk flocculation values in the range of about 0 to 42 units per milliliter.
Within these broad areas, papain solutions with the following distinguishing features are the most appropriate:
EMI3.1
<tb>
<tb> preparation <SEP> tyrosyl units <SEP> total <SEP> milk from <SEP> - <SEP> for <SEP> available <SEP> per <SEP> ml <SEP> flocculation units <SEP> de <SEP> milk flocculation pro <SEP > ml <SEP> units <SEP> per <SEP> ml.
<tb>
Enzyme <SEP> 1 <SEP> 500 <SEP> 5-10 <SEP> 0-1, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> 2 <SEP> 1000 <SEP> 10-20 <SEP> 0-3 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> 3 <SEP> 5000 <SEP> 50-100 <SEP> 0-15 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> 4 <SEP> 14000 <SEP> 140 <SEP> - <SEP> 280 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> 42 <SEP>
<tb>
The most active enzyme solution with 14,000 tyrosyl units per milliliter is usually not used in the process because considerable care is required in filling and measuring the solution and also in ensuring uniform distribution. However, this solution can be diluted so as to obtain activity in the desired range.
To achieve the best results, it is expedient that the enzyme is suspended in water in a concentration which is sufficient to obtain an activity of about 1000 tyrosyl units per milliliter. This allows the solution to be introduced into the animal in an amount of about 0.22 to 0.77 ml / kg live weight of the animal. For the average animal weighing 360 to 500 kg, the total volume of enzyme solution required is then about 80-385 ml, and this amount can be injected in about 16-77 seconds. More dilute solutions with only 500 tyrosyl units per milliliter must be introduced in an amount of about 0.44 to 1.55 ml / kg, and for an average animal about 160-770 ml of total injection fluid are required for this.
More concentrated solutions with about 5000 tyrosyl units per milliliter only require the introduction of 0.44 to 0.155 ml / kg, and the total amount is thus only 16-77 ml, which are injected in 3-16 seconds
<Desc / Clms Page number 4>
although greater precision in injection is indicated with these more concentrated solutions.
-The milk flocculation and tyrosyl values for a given enzyme can be determined in the following way: Milk Flocculation Test.
A. Total activity. The enzyme, e.g. B. papain is mixed with glycerine to form a paste of 200 g papain powder and 200 g chemically pure glycerine. The paste obtained is dissolved in distilled water and the solution is diluted to a volume of 10 liters. The pH of the solution is adjusted to a value of 7.4 with 5.0 N sodium hydroxide, and 100 g of sodium chloride are then added.
After filtering the solution, this material is used for the milk flocculation tests. When determining the total activity, 10 ml of the enzyme solution are mixed with 10 ml of an aqueous solution of 0.2 molar cysteine hydrochloride and 0.01 molar Versen, which has been previously adjusted to a pH of 6. The mixture is allowed to stand for 10 minutes and then diluted with 100 ml of deionized water. After incubating for 5 min at a temperature of 40 ° C., the enzyme preparation is ready for use.
By mixing 80 g of a low temperature, spray-dried skimmed milk powder and 290 ml of deionized water. contain 50 m10.1 molar cysteine hydrochloride and 0.01 molar verses (previously adjusted to a pH of 6.0) and 6 ml 4.0 calcium chloride, a substrate is made. This substrate solution is then incubated for 30 minutes at a temperature of 40.degree. 5 ml of the substrate made of skimmed milk are placed in a test tube and 1 ml of the enzyme solution is added.
The mixture is then heated to a temperature of 40 ° C until the milk flocculates.
The time in seconds required to flocculate is proportional to the enzyme activity according to the following equation:
EMI4.1
t = flocculation time in seconds
E = milliliters of enzyme.
B. Available milk flocculating activity.
The enzyme solution prepared as in the total activity test, but containing no cysteine and verses, is incubated for 5 minutes at a temperature of 40 ° C. prior to mixing with the substrate. The substrate consists of the following components in the specified quantities:
EMI4.2
<tb>
<tb> Skimmed <SEP> milk powder <SEP> 80 <SEP> g
<tb> Deionized <SEP> water <SEP> 360 <SEP> ml
<tb> 4, <SEP> 0 <SEP> molar <SEP> calcium chloride <SEP> 6 <SEP> ml.
<tb>
The substrate preparation is applied in aliquots of 5 ml in a reagent tube and incubated for 30 minutes at a temperature of 40 ° C. before use. As with the measurement of the total activity, 1 ml of the enzyme solution is again incubated with 5 ml of the substrate and the time required for flocculation is determined.
Tyrosyl Unit Test.
The substrate is prepared by blending 100 grams of lean ground beef and 300 grams of water in a Waring Blender for 6 minutes. In each case 20 g samples of this emulsion are transferred into 12 bottles.
The enzyme solution should be diluted with water so that it contains about 10-30 g total milk flocculation units per milliliter.
5 ml of these diluted solutions are further diluted to 4,000 ml with deionized water.
The solution is placed in flasks containing the substrate in quantities of 0, 1, 2, 3, 4 and 5 ml per flask. Two bottles are used for each amount of enzyme. The flasks are then swirled to mix their contents and incubated for 1 hour at a temperature of 80 ° C. At this point, the reaction is stopped by adding 40 ml of an adequate aqueous trichloroacetic acid to the flask and shaking the mixture. A precipitate forms and the flask is allowed to stand at room temperature for 30 minutes for the reaction to complete. The contents of the bottles are diluted to 200 ml with distilled water and, after thorough mixing, the suspension is filtered.
Make a 2 ml aliquot from each filtrate in each flask for
<Desc / Clms Page number 5>
the color measurement applied to the tyrosyl color.
The following is added to each 2 ml filtrate sample:
EMI5.1
<tb>
<tb> Reagent <SEP> amount
<tb> 0, <SEP> 25 <SEP> n <SEP> sulfuric acid <SEP> 8 <SEP> ml
<tb> 201orges <SEP> aqueous <SEP> sodium carbonate <SEP> 5 <SEP> ml <SEP>
<tb> Folin-Ciocalteau <SEP> Phenol reagent <SEP> 1 <SEP> ml
<tb>
After the addition of the reagent, the filtrate is allowed to stand for 30 minutes and the solution is then measured against a final sample of distilled water in a spectrophotometer at 540 nm.
The intensity of the phenolic color is determined by comparing the percent transmission of the sample with that of similarly treated standard samples containing 0.40, 60 and 80 micrograms of tyrosine per test tube.
When preparing the enzyme solution, the dried enzyme powder in the form obtained is mixed with an equal amount of glycerine, the mixture is suspended in water and the activity in tyrosyl units and the activity expressed as total flocculation units and available milk flocculation units are determined. The value for the available milk flocculation units can be reduced by reversibly inactivating the enzyme solution or fractionating the enzyme using a water-miscible solvent in which the enzyme is insoluble, such as acetone, dioxane or the lower alkyl alcohols.
Suitable solvents include methanol, ethanol, propanol, isopropanol, tert-butanol, ethylene glycol, methyl cellosolve, and methyl ethyl ketone. An optional method for reducing the available milk flocculation units is the salt fractionation with sodium chloride, sodium sulfonate, sodium monohydrogen phosphate, potassium monohydrogen phosphate, potassium chloride, ammonium sulfate or other suitable salt. The concentration of the enzyme in the solution is adjusted so that a suitable volume of solution is injected into the animal so as to give about 55-1100 tyrosyl units per kg live weight of the animal and about 2-17 total milk flocculation units per kg live weight of the animal.
Although in the preferred embodiment about 820-880 tyrosyl units per kg are introduced into the animal, very satisfactory results can be obtained when about 110 to 880 tyrosyl units are used. It is possible to prepare enzyme solutions that have the desired characteristics by using mixtures of papain, ficin and bromelain.
The enzyme has also been purified by inactivation, solvent fractionation and salt fractionation. Solvents such as acetone and the lower alkyl alcohols are used in solvent fractionation, while sodium chloride, sodium sulfate, alkali metal phosphates, ammoniumates and sulfates can be used in salt fractionation. Preconditioning by this method ensures that the enzyme has a high proteolytic activity and is relatively free of inactivating materials and inhibitors. Other inert proteins u. a. This removes substrates caused by the enzyme's own action. The biuret protein sample provides a measure of the amount of protein present in the preparation and thus indirectly measures the amount of contamination present.
Enzyme preparations within the scope of the invention are characterized in that they have 50% or more biuret protein and sufficient proteolytic activity, so that less than 3.0 g of the powder suspended in 100 ml of water are required to achieve an activity of at least 1000 tyrosyl units to achieve per milliliter.
The following table I explains a comparison between various crude enzymes which do not show sufficient activity to be able to work according to the invention and the enzymes prepared according to the invention which lead to the favorable results according to the invention.
<Desc / Clms Page number 6>
Tabelie1
EMI6.1
<tb>
<tb> Enzyme powder <SEP> Biuret protein <SEP> Tyrosyl units <SEP> Total <SEP> milk output <SEP> Available <SEP> g <SEP> powder <SEP> per <SEP> 100 < SEP> ml
<tb>% <SEP> per <SEP> g <SEP> powder <SEP> flocculation units <SEP> standing <SEP> milk output <SEP> at <SEP> 1 <SEP> 000 <SEP> Tyro- <SEP>
<tb> per <SEP> g <SEP> powder <SEP> flocculation units <SEP> syl units / ml <SEP>
<tb> received per <SEP> g <SEP> powder <SEP>.
<tb>
Milled <SEP> commercially available <SEP> enzyme <SEP> A <SEP> 38 <SEP> 15700 <SEP> 250 <SEP> 88 <SEP> 6.4
<tb> Ground <SEP> commercially available <SEP> enzyme <SEP> B <SEP> 37 <SEP> 20 <SEP> 600 <SEP> 419 <SEP> 29 <SEP> 4.9
<tb> Ground <SEP> Commercially available <SEP> enzyme <SEP> C <SEP> 40 <SEP> 19800 <SEP> 316 <SEP> 128 <SEP> 5, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Ground <SEP> Commercially available <SEP> enzyme <SEP> D <SEP> 41 <SEP> 19100 <SEP> 315 <SEP> 112 <SEP> 5, <SEP> 2
<tb> Cleaned <SEP> A <SEP> 57 <SEP> 44 <SEP> 600 <SEP> 663 <SEP> 430 <SEP> 2.2
<tb> cleaned <SEP> B <SEP> 59 <SEP> 41300 <SEP> 557 <SEP> 340 <SEP> 2,4
<tb> Cleaned <SEP> C <SEP> 61 <SEP> 42 <SEP> 700 <SEP> 724 <SEP> 430 <SEP> 2,3
<tb> Cleaned <SEP> D <SEP> 55 <SEP> 65 <SEP> 000 <SEP> 980 <SEP> 620 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP>
<tb> cleaned <SEP> E <SEP> 57 <SEP> 45 <SEP> 300 <SEP> 678 <SEP> 376 <SEP> 2,
2
<tb> Cleaned <SEP> F <SEP> 61 <SEP> 45800 <SEP> 593 <SEP> 19 <SEP> 2.2
<tb> cleaned <SEP> G <SEP> 50 <SEP> 41800 <SEP> 660 <SEP> 328 <SEP> 2,4
<tb> cleaned <SEP> H <SEP> 50 <SEP> 52200 <SEP> 915 <SEP> 447 <SEP> 1.9
<tb> Cleaned <SEP> 1 <SEP> 52 <SEP> 58 <SEP> 300 <SEP> 1120 <SEP> 480 <SEP> 1.7
<tb> cleaned <SEP> J <SEP> 67 <SEP> 103500 <SEP> 1620 <SEP> 785 <SEP> 1.0
<tb>
<Desc / Clms Page number 7>
The purified enzymes were fractionated with salts or solvents or inactivated by oxidation.
The preconditioning of the crude enzyme, if one wants to use such enzymes, is illustrated with reference to the following example, in which the milled commercial enzyme D in Table I is treated with various agents in order to obtain an enzyme which has the characteristics of the invention appropriate enzymes.
Example 1: Crude Enzyme. The enzyme is a raw, dried latex that has been ground so that the particles have a mesh size of less than 0.178 mm. 75 g of this papain enzyme are mixed with 75 g of pure glycerine to form a paste, and this paste in
Suspended 1500 ml of distilled water. The crude solution is centrifuged and filtered to clarify.
After a Seitz filtration, the solution is injected into adult sheep in amounts equivalent to 0.22, 0.33, 0, 44, 0, 55, 0.66, 0, 77, 1, 54 and 2.75 ml / kg live weight. These amounts apply to a solution containing 1,000 tyrosyl units per milliliter and any deviations from such activity are adjusted accordingly by increasing or decreasing the amount used in each case.
Aerated raw enzyme. 75 g of raw papain are mixed with 75 g of glycerine and the paste in
1200 ml of distilled water was added. The pH of the solution is increased to 7.4 with 5N aqueous
Adjusted sodium hydroxide solution and brought the final volume to 1,500 ml with distilled water.
The solution is clarified by centrifugation and subsequent filtration. The filtered solution is mixed homogeneously several times in a Waring Blender mixer at intervals of 4 minutes between mixing, each time for 1 minute, the entire homogeneous mixing being carried out within 3 hours. The homogeneously mixed solution is then diluted to five times its volume and sterilized by filtering through a bacteria-retaining filter pad. This solution is injected into adult sheep in the same amount as described above for the crude enzyme.
Crude enzyme inactivated with peroxide. 100 g of raw, ground papain and 100 g of pure glycerine are mixed with one another, and the paste produced in this way is taken up in 2000 ml of a 3% hydrogen peroxide solution. A solution of bovine liver catalase containing 200 keel units per milliliter is added in an amount of 6.65 keel units per milliliter of enzyme solution over a period of 3.5 hours. The solution is then clarified by filtering and the pH is adjusted to 7.4 with 5N aqueous sodium hydroxide.
The solution finally obtained is sterilized by filtering it through a Seitz filter pad that retains bacteria, and this solution is used for injecting sheep in amounts as indicated above with regard to the crude enzyme.
Crude enzyme fractionated using sodium chloride. The commercially available raw ground papain (150 g) is mixed with pure glycerine (150 g) to form a paste, and the paste is taken up in 2,000 ml of distilled water. The pH of the solution is adjusted to 7.4 with aqueous sodium hydroxide solution and kept at this pH for 30 minutes. The pH of the solution is then brought to 3.5 and 685 g of sodium chloride are added. The solution is then cooled to a temperature of 100C. The precipitate that forms is squeezed out by centrifugation and taken up in 2260 ml of distilled water at a pH of 7.4. The solution is sterilized by filtering it through a Seitz filter pad that retains bacteria.
The sterilized solution is injected into adult sheep in the amounts indicated above.
Crude enzyme fractionated with alcohol. 60 g of commercially available ground papain and 60 g of pure glycerine are mixed together to form a paste, and the paste is taken up in 1200 ml of distilled water, then cooled to a temperature of 00C. The pH of the solution is adjusted to 7.4 using 5N aqueous sodium hydroxide, and the solution is then clarified by filtration. The enzyme is precipitated from this aqueous solution by adding 4000 ml of ethanol. The amount of ethanol used leads to an excess of ethanol solution. The precipitate formed is separated off by centrifugation and then dissolved in 1000 ml of distilled water at a pH of 7.4.
15 g of sodium chloride are added and the solution is sterilized by filtering it through a Seitz filter pad that retains bacteria. The sterilized solution is used for the injection of adult sheep according to the previous examples.
Crude enzyme fractionated with acetone. 60 g of commercially available ground papain and 60 g of pure glycerine are mixed to form a paste, and the paste is taken up in 1,200 ml of distilled water and then cooled to 100.degree. The pH of the cooled solution is adjusted to 7.4 and the solution is then clarified by means of filtration. The enzyme is made from the aqueous solution
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precipitated by adding 3000 ml of acetone, which has cooled to a temperature of 100C. The precipitate is separated by centrifugation, and the precipitate is then distilled in 1000 ml
Dissolved water with a pH value of 7.4. 10 g of sodium chloride are added and the solution is filtered through a Seitz filter pad that retains bacteria.
The solution is then injected into adult sheep in the amounts indicated.
Crude enzyme fractionated with sodium sulfate. 50 g of raw ground papain and 50 g of pure glycerin are mixed to form a paste, and the paste is then taken up in 1000 ml of distilled water. The pH of the solution is adjusted to 7.4 and the solution is then held at this pH for 30 minutes. The pH is then adjusted to 5.0. 400 g of sodium sulfate are added and the solution is stirred until the salt has dissolved. 20 g of filter aid are added and the precipitate thus formed is separated off by means of filtration. The precipitate is taken up in 1000 ml of distilled water at a pH of 7.4 and the solution is filtered for clarification and sterilization. The solution is then used for injection into adult sheep according to the previous examples.
Dialyzed crude enzyme. 37.25 g of commercially available ground papain and 27.25 g of glycerine are mixed to form a paste, and the paste is then taken up in 745 ml of distilled water at a pH of 7.4. The solution is introduced into a Visking dialysis tube and dialyzed against distilled water for 48 hours. The volume of the solution finally obtained is 1195 ml, corresponding to a dilution of 1.6. 24 g of sodium chloride are added and the solution is adjusted to a pH of 7.4. It is then filtered through a Seitz filter cushion that retains bacteria for the purpose of clarification and sterilization. This solution is injected into adult sheep in the amounts given above.
It should be noted that the raw enzyme used in all of the above purification methods comes from the same formulation, and thus the improvements achieved by the various sterilization and purification methods can be directly related to the raw sample.
The analytical values for each of the samples are summarized in Table II below:
EMI8.1
<tb>
<tb> tyrosyl units <SEP> milk loosening unit- <SEP> tyrosyl units <SEP> pro
<tb> Preparation <SEP> means <SEP> per <SEP> ml <SEP> th <SEP> per <SEP> ml <SEP> milk flocculation unit
<tb> total <SEP> available <SEP> total <SEP> available
<tb> 1. <SEP> Raw <SEP> Enzyme <SEP> 813 <SEP> 16.4 <SEP> 4.6 <SEP> 50 <SEP> 177
<tb> 2. <SEP> Aerated <SEP> raw <SEP> enzyme <SEP> 209 <SEP> 3.5 <SEP> 0.1 <SEP> 60 <SEP> 2090
<tb> 3. <SEP> Inactivated with <SEP> Peroxide <SEP>
<tb> raw <SEP> enzyme <SEP> 465 <SEP> 5,3 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 88 <SEP> 4650
<tb> 4. <SEP> <SEP> raw <SEP> enzyme <SEP> 611 <SEP> 9.8 <SEP> 0.2 <SEP> 63 <SEP> 30150 fractionated with <SEP> sodium chloride <SEP>
<tb> 5.
<SEP> Fractionated with <SEP> alcohol <SEP>
<tb> raw <SEP> enzyme <SEP> 890 <SEP> 14.8 <SEP> 0.7 <SEP> 60 <SEP> 1271
<tb> 6. <SEP> Fractionated with <SEP> acetone <SEP>
<tb> raw <SEP> enzyme <SEP> 1000 <SEP> 15, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 64 <SEP> 3333
<tb> 7. <SEP> <SEP> raw <SEP> enzyme <SEP> 945 <SEP> 11.9 <SEP> 0.2 <SEP> 87 <SEP> 4725 fractionated with <SEP> sodium sulfate <SEP>
<tb> 8. <SEP> Dialyzed <SEP> raw <SEP> enzyme <SEP> 750 <SEP> 9.6 <SEP> 0.2 <SEP> 78 <SEP> 3750
<tb>
When the treated preparations 2-8 are injected into sheep at doses of up to about 1.55 ml / kg, no significant adverse physiological reactions are induced and no significant injuries are observed when the carcasses are examined.
Steaks and chops, as well as roasts, which come from these carcasses, were given a rating of 8 or better for tenderness by a group of experts. The numerical evaluation runs from 1 for unsatisfactory to
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10, which indicates superior quality.
The raw material, on the other hand, led to depression and accelerated breathing when used in amounts of 0.33 ml / kg and above. Furthermore, bleeding was found in the mediastinal lymph nodes and livers at doses of 0.33 ml / kg and above.
Although the method and product according to the invention are essentially directed to the procedure in which live animals are treated, the preparations can also be used in the treatment of pieces of meat which are immersed in the enzyme or otherwise treated with it, in order to do so with the Enzyme to apply a surface coating to the meat.
Very highly purified materials can be produced using an intricate separation system to recover pure papain and pure chymopapain with significant activities. Thus papain and chymopapain fractions with the following characteristic properties were isolated from a raw papain sample.
EMI9.1
<tb>
<tb>
Papain <SEP> activity / g <SEP> activity / g <SEP> activity / g
<tb> biuret protein <SEP> electrophoretic <SEP> chymopapain <SEP> and
<tb> protein <SEP> papain <SEP> protein
<tb> Tyrosyl units <SEP> 195000 <SEP> 307000 <SEP> 452000 <SEP>
<tb> Total <SEP> milk flocculation units <SEP> 3500 <SEP> 5600 <SEP> 8200 <SEP>
<tb> Available <SEP> milk flocculation units <SEP> 1100 <SEP> 1770 <SEP> 2600 <SEP>
<tb> Chymopapain
<tb> Tyrosyl units <SEP> 117500 <SEP> 370000 <SEP> 660000 <SEP>
<tb> entire <SEP> milk flocculation units <SEP> 1320 <SEP> 4150 <SEP> 7400 <SEP>
<tb> available <SEP> milk flocculation units <SEP> 100 <SEP> 300 <SEP> 540
<tb>
Variations and modifications can be made within the scope of the invention without departing from the spirit and scope thereof.
PATENT CLAIMS:
1. Proteolytic enzyme preparation for improving the tenderness of meat preferably by injecting the preparation into living animals, characterized in that the preparation consists of an enzyme-containing aqueous solution which has an enzyme activity of 250 to 5,000, preferably 800 to 1200 per tyrosyl units Milliliters, and a ratio of tyrosyl units to total milk flocculation units of about 55 to 100.