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Proteolytisches Enzym-Präparat zur Verbesserung der Zartheit von
Fleisch und Verfahren zu dessen Herstellung
Die Erfindung betrifft ein proteolytisches Enzym-Präparat zur Verbesserung der Zartheit von Fleisch lebender Tiere, um so eine einheitliche Verteilung der Enzyme in den gesamten Fleischgeweben zu er- halten, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines solchen hochaktiven proteolytischen Enzym-Präparates.
In der USA-Patentschrift Nr. 2, 903, 362 wird ein Verfahren zur Behandlung lebender Tiere vorgeschla- gen, von denen Fleisch mit proteolytischen Enzymen erhalten wird, um so nach dem Schlachten Kadaver und Fleischstücke zu erhalten, die nach dem Kochen durch eine verbesserte Zartheit gekennzeichnet sind. Dieses Verfahren wird angewendet, um Fleischprodukte verbesserter Zartheit und zweckmässiger
Struktur zu erhalten. Diese Eigenschaften werden der praktisch einheitlichen Verteilung des proteolytischen Enzyms in den Fleischgeweben zugeschrieben.
Obgleich in dieser Patentschrift ein zufriedenstellendes Verfahren zur Herstellung von Enzymen in geeigneter Form für die Anwendung bei diesem Verfahren offenbart ist, und die nach dieser Verfahrensweise hergestellten Fleischprodukte die gewünschte verbesserte Zartheit und Struktur besitzen, sind bezüglich dieses Verfahrens weitere und zusätzliche Verbesserungen entwickelt worden. Die Verbesserungen ermöglichen die Standardisierung des bei dem Verfahren in Anwendung kommenden Enzyms, sowie Steuerung der Wirkung eines Zartmachens des Fleisches mittels einer Vorbehandlung des Enzyms vor der Einführung in das Tier sowie ebenfalls Einstellen der enzymatischen Wirksamkeit und Steuerung der Menge eines gegebenen Enzyms vorherbestimmter Aktivität, das in das Tier eingeführt wird.
Eine der Enzymarten. die bei der Durchführung des Verfahrens nach der USA-Patentschrift Nr. 2, 903, 362 angewendet wird, sind diejenigen proteolytischen Enzyme, die aus Pflanzenquellen gewonnen werden. Es ist bekannt, dass aus pflanzlichen Materialien gewonnene proteolytische Enzyme unterschiedliche Konstitution aufweisen. Schwankungen in der Konstitution des Enzyms werden ebenfalls bei der Handhabung des Enzyms während der Zubereitung bedingt, so dass der Proteingehalt, proteolytische Aktivität, Farbe, Geruch, Verunreinigung usw. sehr stark schwanken in Abhängigkeit von der Enzymquelle und der Verarbeitung, der dasselbe unterworfen worden ist.
Rohes Papain, Ficin und Bromelain enthalten eine bestimmte Menge enzymatischer Materialien, die bei Temperaturen in dem normalerweise bei dem Kochen von Fleischprodukten auftretenden Temperaturbereich aktiv sind, und dieselben enthalten ebenfalls bestimmte enzymatische Materialien, die bei tieferer Temperatur aktiv sind, und die nachteilig die Körperfunktionen des Tieres beeinflussen können. Ein zufriedenstellendes Zartmachen unter geringstmöglichen nachteiligen physiologischen Reaktionen bei dem Tier ist bei einer Applikation antemortem angezeigt. Das Ausmass des Zartmachens und das Vermeiden physiologischer Reaktionen wird in einem merklichen Ausmass durch die Eigenschaften des in Anwendung gebrachten Enzyms bestimmt.
Erfindungsgemäss wird somit ein Verfahren zur Behandlung roher Enzyme, die jedoch vorher zubereitet worden sind, in Vorschlag gebracht, um ein Enzym-Präparat zu gewinnen, das eine hohe enzymatische Aktivität bei erhöhten Temperaturen und kleinstmögliche enzymatische Aktivität bei den Körpertemperaturen des Tieres aufweist.
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Erfindungsgemäss werden weiterhin Enzym-Präparate für die Fleischbehandlung in Vorschlag gebracht, die erhebliche proteolytische Aktivität auf das Fleisch bei Kochtemperaturen und kleinstmögliche proteo- lytische Aktivität bei Temperaturen unter diesen Kochtemperaturen und etwa bei der Körpertemperatur des Fleischtieres aufweisen.
Allgemein betrifft die Erfindung die Herstellung von Enzym-Zubereitungen mit hoher proteolytischer
Aktivität und verringerter Neigung nachteilig die Tiere zu beeinflussen, in die dieselben eingeführt wer- den. Die Präparate sind speziell für die Anwendung bei dem Zartmachen von Fleisch angepasst, da die- selben ein hohes Mass proteolytischer Aktivität bei normalen Kochtemperaturen zeigen. Zusammen mit der hohen proteolytischen Aktivität in den Temperaturbereich von etwa 60-99 C geht eine sehr geringe proteolytische Aktivität bei Temperaturen unter diesem Temperaturbereich und insbesondere in dem Temperaturbereich etwa bei der normalen Körpertemperatur des Tieres einher.
Zu Enzym-Präparaten, die zu einem erheblichen Zartmachen des Fleisches bei Kochtemperaturen und geringstmöglichen nachteiligen physiologischen Wirkungen bei dem Tier führen, gehören diejenigen, die bestimmte Aktivitätscharakteri- stika besitzen, wie sie z. B. durch den Tyrosyl-Wert und zur Verfügung stehende und gesamte Milchausflockungswerte dargestellt werden, sowie die zu einem Zartmachen des Fleisches führende Aktivität, die durch spezifische Untersuchung des Gewebes gemessen wird.
Das Enzym wird im allgemeinen aus Pflanzenquellen erhalten und besitzt eine proteolytische Aktivität, die als Tyrosyleinheiten pro Gramm ausgedrückt wird von 40 000 bis 200000 Tyrosyleinheiten. In Lösung sollte das Enzym eine Aktivität besitzen, die ausgedrückt in Tyrosyleinheiten pro Milliliter we- nigstens'250 Tyrosyleinheiten beträgt, und ein Verhältnis der Tyrosyleinheiten pro Milliliter zu den gesamten Milchausflockungseinheiten pro Milliliter von 55 bis 100 zeigen, sowie eine zufriedenstellende spezifische Gewebeuntersuchung bei einer Temperatur in dem Bereich von 60 bis 990C ergibt.
Ein weiteres Charakteristikum der Enzymlösungen besteht darin, dass die Aktivität ebenfalls durch ein Verhältnis der Tyrosyleinheiten pro Milliliter zu den zur Verfügung stehenden Milchausflockungseinheiten pro Milliliter von mehr als 200 dargestellt wird. Pflanzenenzyme, die für die Zusammensetzung der Enzym-Präparate mit den gewünschten Charakteristiken am zweckmässigsten sind, sind Papain, Ficin und Bromelain.
Die Aktivität eines proteolytischen Enzyms, wie sie durch Tyrosyleinheiten wiedergegeben ist, ergibt ein Mass des von dem Enzym ausgeübten Effekt zum Zartmachen von Fleisch. Da diese Bestimmung bei erhöhter Temperatur durchgeführt wird, wird hiedurch die bei diesen erhöhten Temperaturen ausgeübte Wirkung des Zartmachens gemessen. Die Milchausflockungseinheiten stellen einen Ausdruck der Aktivität des Enzyms bei 400C dar und sind ein gutes Mass für die Aktivität bei oder in der Nähe der Körpertemperatur des Tieres. Somit stellen diese Einheiten ein gutes Mass für die Wahrscheinlichkeit nachteiliger physiologischer Reaktionen dar, die durch die enzymatische Aktivität bei Körpertemperatur bedingt werden.
Somit sollte die durch die Tyrosyleinheiten bedingte Aktivität gross sein und die durch die Milchausflockungseinheiten, sowohl gesamt als auch verfügbar wiedergegebene Aktivität sollte im Verhältnis zu den Tyrosyleinheiten klein sein. Das Verhältnis der Aktivität ausgedrückt als Tyrosy18inheiten zu der Aktivität ausgedrückt als gesamte Milchausflockungseinheiten und zur Verfügung stehende Milchausflokkungseinheiten führt zu einer Auswertung der durch das Enzym bedingten Aktivität zum Zartmachen von Fleisch, und führt ebenfalls zu einem Mass für die Wahrscheinlichkeit einer nachteiligen Beeinflussung der physiologischen Prozesse des Tieres durch die Enzym-Präparate.
Das proteolytische Enzym-Präparat gemäss vorliegender Erfindung'ist dadurch gekennzeichnet, dass es aus einer enzymhaltige wässerigen Lösung besteht, die eine Enzymaktivität von 250 bis 5 000, vorzugsweise 800 bis 1200 Tyrosyleinheiten pro Milliliter, und ein Verhältnis Tyrosyleinheiten zu gesamten Milchausflockungseinheiten von etwa 55 bis 100 besitzt.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung eines solchen Enzympräparates besteht darin, dass das verwendete rohe Enzym in Wasser unter Ausbilden einer flüssigen Enzymsuspension suspendiert wird, die proteolytische Aktivität der Suspension vorher in Tyrosyleinheiten bestimmt wird, sodann die Suspension einer Reinigung unterworfen, die proteolytische Aktivität der Suspension erneut in Tyrosyleinheiten bestimmt, und die Dosis des zur Behandlung des Fleisches angewendeten Enzyms so eingestellt wird, dass etwa 50 - 1000 und vorzugsweise 100 - 800 Tyrosyleinheiten pro kg Lebendgewicht in das Tier eingeführt werden.
Die Tyrosyleinheiten stellen die erhöhte Menge der in Trichloressigsäure löslichen Verbindungen dar, die mit dem Phenolfarbreagenz eine Farbe ausbilden können, die derjenigen Farbe äquivalent ist, die durch 100 Mikrogramm Tyrosin, erhalten aus 1 g Fleisch, gebildet wird, wenn das Enzym mit dem Fleisch 1 h lang bei einer Temperatur von 800C unter spezifischen Bedingungen inkubiert wird. Somit stellt die Bewertung eines Enzym Präparates in Tyrosyleinheiten ein Mass für die proteolytische Aktivität des Enzyms gegenüber Fleisch bei einer Temperatur von etwa 800C dar.
Obgleich Enzym-Präparate mit
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einem erheblichen Bereich Tyrosyleinheiten pro Milliliter bei den Verfahren angewendet werden können, sind doch sehr verdünnte oder extrem konzentrierte Lösungen im allgemeinen nicht zu empfehlen. Sehr verdünnte Lösungen, die das Enzym in einer ausreichenden Menge enthalten, um eine Aktivität entsprechend mehr als etwa 100 Tyrosyleinheiten pro Milliliter zu ergeben, bedürfen der Einführung übermässig grosser Volumina in das Tier, um eine messbare Wirkung bezüglich des Zartmachens zu erzielen.
Dort, wo sehr konzentrierte Präparate angewendet werden, bei denen die Enzym-Aktivität etwa 10000 Tyrosyleinheiten pro Milliliter beträgt, muss bezüglich des Abmessens der Lösung sorgfältig gearbeitet sowie eine sorgfältig Überwachung der Zeit zwischen dem Abschluss der Injektion und dem Schlachten aufrecht erhalten werden, um so nachteilige Reaktionen in dem Tier zu vermeiden. Derartige konzentrierte Lösungen sollten vorzugsweise vor der Anwendung verdünnt werden. Bei der bevorzugten Ausführungsform sind die zur Erzielung der erfindungsgemässen günstigen Wirkungen angewendeten Lösungen dadurch gekennzeich- net, dass dieselben eine Aktivität, ausgedrückt in Tyrosyleinheiten pro Milliliter von etwa 250 bis etwa 5 000 besitzen.
Die Milchausflockungseinheiten drücken das Mass der Aktivität eines gegebenen Enzyms bei Raumtemperatur aus, und diese Messung ist ein gutes Kriterium für die Aktivität des Enzyms bei oder in der Nähe der Körpertemperatur der Tiere. Somit kann die Milchausflockungsaktivität in Beziehung zu der Wahrscheinlichkeit nachteiliger physiologischer Reaktionen in dem mit einer gegebenen Zusammensetzung behandelten lebenden Tier herangezogen werden. Die Prüfung auf das Milchausflocken bedingt die Bestimmung der gesamten Aktivität (inaktives und aktives Enzym) und der zur Verfügung stehenden Aktivität (aktives Enzym) bei einer Temperatur von etwa 40 C. Die gesamte Enzym-Aktivität schliesst sowohl die zur Verfügung stehende proteolytische Aktivität als auch die proteolytische Aktivität ein die inaktiv ist, die jedoch in den aktiven Zustand regeneriert werden kann.
Hohe proteolytische Aktivität eines gegebenen Enzym-Präparates bei oder in der Nähe der Kochtemperaturen und kleinstmögliche proteolytische Aktivität bei einer Temperatur unterhalb dieses Bereiches können durch Einstellen der Aktivität des Enzyms, insbesondere wie durch die Milchausflockungsaktivität gemessen, erzielt werden. Papain sollte z. B. etwa 500 - 14000 Tyrosyleinheiten pro Milliliter in wässeriger Lösung, und zur Verfügung stehende Milchausflockurgswerte in dem Bereich von etwa 0 bis 42 Einheiten pro Milliliter ergeben.
Innerhalb dieser breiten Bereiche sind Papainlösungen mit den folgenden kennzeichnenden Merkmalen die zweckmässigsten :
EMI3.1
<tb>
<tb> Präparat <SEP> Tyrosyleinheiten <SEP> Gesamte <SEP> Milchaus <SEP> - <SEP> Zur <SEP> Verfügung <SEP> stehenpro <SEP> ml <SEP> flockungseinheiten <SEP> de <SEP> Milchausflockungspro <SEP> ml <SEP> einheiten <SEP> pro <SEP> ml.
<tb>
Enzym <SEP> 1 <SEP> 500 <SEP> 5-10 <SEP> 0-1, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Enzym <SEP> 2 <SEP> 1000 <SEP> 10-20 <SEP> 0-3 <SEP>
<tb> Enzym <SEP> 3 <SEP> 5000 <SEP> 50-100 <SEP> 0-15 <SEP>
<tb> Enzym <SEP> 4 <SEP> 14000 <SEP> 140 <SEP> - <SEP> 280 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> 42 <SEP>
<tb>
Die aktivste Enzymlösung mit 14000 Tyrosyleinheiten pro Milliliter wird gewöhnlich nicht bei dem Verfahren angewendet, da erhebliche Sorgfalt für das Abfüllen und Abmessen der Lösung und ebenfalls zum Sicherstellen einer einheitlichen Verteilung notwendig ist. Diese Lösung kann jedoch verdünnt werden, um so eine Aktivität in dem gewünschten Bereich zu erhalten.
Zur Erzielung bester Ergebnisse ist es zweckmässig, dass das Enzym in Wasser in einer Konzentration suspendiert wird, die ausreichend ist, um eine Aktivität von etwa 1000 Tyrosyleinheiten pro Milliliter zu erhalten. Dies ermöglicht das Einführen der Lösung in das Tier in einer Menge von etwa 0, 22 bis 0, 77 ml/kg Lebendgewicht des Tieres. Für das durchschnittliche Tier mit einem Gewicht von 360 bis 500 kg beträgt das gesamte Volumen der benötigten Enzymlösung sodann etwa 80 - 385 ml, und diese Menge kann in etwa 16 - 77 sec injiziert werden. Verdünntere Lösungen mit nur 500 Tyrosyleinheiten pro Milliliter müssen in einer Menge von etwa 0, 44 bis 1, 55 ml/kg eingeführt werden, und bei einem durchschnittlichen Tier werden hiezu etwa 160 - 770 ml gesamte Injektionsflüssigkeit benötigt.
Konzentriertere Lösungen mit etwa 5000 Tyrosyleinheiten pro Milliliter bedürfen nur der Einführung von 0, 44 bis 0, 155 ml/kg, und die Gesamtmenge beträgt somit nur 16 - 77 ml, die in 3 - 16 sec injiziert werden
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können, obgleich bei diesen konzentrierteren Lösungen eine grössere Präzision bei der Injektion angezeigt ist.
-Die Milchausflockungs- und Tyrosylwerte für ein gegebenes Enzym können in der folgenden Weise bestimmt werden : Milchausflockungs-Test.
A. Gesamtaktivität. Das Enzym, z. B. Papain, wird mit Glyzerin unter Ausbilden einer Paste von 200 g Papainpulver und 200 g chemisch reinem Glyzerin vermischt. Die erhaltene Paste wird in destilliertem Wasser gelöst, und die Lösung auf ein Volumen von 10 1 verdünnt. Der pH-Wert der Lösung wird mit 5, 0 n Natriumhydroxyd auf einen Wert von 7,4 eingestellt und sodann 100 g Natriumchlorid zugesetzt.
Nach Filtrieren der Lösung wird dieses Material für die Milchausflockungs-Tests angewendet. Bei der Bestimmung der Gesamtaktivität werden 10 ml der Enzymlösung mit 10 ml einer wässerigen Lösung aus 0,2 molar Cystein-Hydrochlorid und 0, 01 molar Versen vermischt, die vorher auf einen PH- Wert von 6 eingestellt worden ist. Man lässt das Gemisch 10 min lang stehen und verdünnt sodann mit 100 ml entionisiertem Wasser. Nach 5 min Inkubieren bei einer Temperatur von 400C ist das Enzym-Präparat fertig für die Anwendung.
Durch Vermischen von 80 g eines bei tiefer Temperatur sprühgetrockneten entrahmten Milchpulvers und290 ml entionisiertem Wasser. enthalten50 m10, l molar Cystein-Hydrochlorid und 0, 01 molar Versen (vorher auf einen pH-Wert von 6, 0 eingestellt) und 6 ml 4, 0 Calciumchlorid wird ein Substrat hergestellt. Diese Substratlösung wird sodann 30 min lang bei einer Temperatur von 400C inkubiert. Es werden 5 ml des Substrates aus entrahmter Milch in ein Reagenzglas gebracht und 1 ml der Enzymlösung zugegeben.
Anschliessend wird das Gemisch bis zum Ausflocken der Milch auf eine Temperatur von 400C erwärmt.
Die bis zum Ausflocken benötigte Zeit in Sekunden ist proportional der Enzymaktivität nach der folgenden Gleichung :
EMI4.1
t = Ausflockungszeit in Sekunden
E = Milliliter Enzym.
B. Zur Verfügung stehende Milchausflockungs-Aktivität.
Die wie bei dem Gesamtaktivitäts-Test hergestellte Enzym-Losung, die jedoch kein cystein und Versen enthält, wird 5 min lang vor dem Vermischen mit dem Substrat bei einer Temperatur von 40 C inkubiert. Das Substrat besteht aus den folgenden Bestandteilen in den angegebenen Mengen :
EMI4.2
<tb>
<tb> Entrahmtes <SEP> Milchpulver <SEP> 80 <SEP> g
<tb> Entionisiertes <SEP> Wasser <SEP> 360 <SEP> ml
<tb> 4, <SEP> 0 <SEP> molar <SEP> Calciumchlorid <SEP> 6 <SEP> ml.
<tb>
Das Substrat-Präparat wird in aliquoten Anteilen von 5 ml in einem Reagenzrohr angewendet und vor der Verwendung 30 min lang bei einer Temperatur von 400C inkubiert. Wie bei dem Messen der Gesamtaktivität wird wieder 1 ml der Enzymlösung mit 5 ml des Substrates inkubiert und die bis zum Ausflocken benötigte Zeit festgestellt.
Tyrosyleinheiten-Test.
Das Substrat wird durch 6 min Vermischen in einer Waring Blender Mischvorrichtung von 100 g magerem zerkleinerten Rindfleisch und 300 g Wasser hergestellt. Es werden jeweils 20 g Proben dieser Emul sion in 12 Flaschen überführt.
Die Enzymlösung sollte mit Wasser verdünnt sein, so dass dieselbe etwa 10 - 30 g gesamte Milchausflockungseinheiten pro Milliliter enthält.
5 ml dieser verdünnten Lösungen werden weiterhin mit entionisiertem Wasser auf 4 000 ml verdünnt.
Die Lösung wird in Kolben gebracht, die das Substrat in Mengen von 0, 1, 2,3, 4 und 5 ml pro Kolben enthalten. Es werden jeweils 2 Flaschen für jede Enzymmenge angewendet. Die Kolben werden sodann geschwenkt, um deren Inhalte zu vermischen und 1 h lang bei einer Temperatur von 80 C inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wird die Reaktion durch Zugabe von 40 ml einer zuigen wässerigen Trichloressigsäure zu dem Kolben und Umschütteln des Gemisches beendet. E'bildet sich ein Niederschlag, und man lässt den Kolben 30 min lang bei Raumtemperatur stehen, damit die Reaktion zum Abschluss kommt. Der Inhalt der Flaschen wird mit destilliertem Wasser bis auf 200 ml verdünnt, und nach gründlichem Mischen wird die Suspension filtriert.
Es wird ein aliquoter Teil von 2 ml aus jedem Filtrat in jedem Kolben für
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die Farbmessung auf die Tyrosylfarbe angewendet.
Zu jeder 2 ml Filtratprobe wird das folgende zugesetzt :
EMI5.1
<tb>
<tb> Reagenz <SEP> Menge
<tb> 0, <SEP> 25 <SEP> n <SEP> Schwefelsäure <SEP> 8 <SEP> ml
<tb> 201orges <SEP> wässeriges <SEP> Natriumcarbonat <SEP> 5 <SEP> ml <SEP>
<tb> Folin-Ciocalteau <SEP> Phenolreagenz <SEP> 1 <SEP> ml
<tb>
Nach der Zugabe der Reagenz lässt man das Filtrat 30 min lang stehen, und die Lösung wird sodann gegen eine Endprobe aus destilliertem Wasser in einem Spektrophotometer bei 540 jn gemessen.
Die In- tensität der Phenolfarbe wird durch Vergleichen der prozentualen Durchlässigkeit der Probe mit derjenigen ähnlich behandelter Standardproben ermittelt, die 0,40, 60 und 80 Mikrogramm Tyrosin pro Reagenzglas enthalten.
Bei der Herstellung der Enzymlösung wird das getrocknete Enzympulver in der erhaltenen Form mit einer gleichen Menge Glyzerin vermischt, die Mischung in Wasser suspendiert und die Aktivität in Tyrosyl- einheiten, sowie die Aktivität ausgedrückt als gesamte Ausflockungseinheiten und zur Verfügung stehende Milchausflockungseinheiten bestimmt. Der Wert für die zur Verfügung stehenden Milchausflockungseinheiten kann durch reversible Inaktivierung der Enzymlösung oder Fraktionieren des Enzyms mittels eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels verringert werden, indem das Enzym unlöslich ist, wie Aceton, Dioxan oder die niederen Alkylalkohole.
Zu geeigneten Lösungsmitteln gehören Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol, tert.-Butanol, Äthylenglykol, Methylcellosolv und Methyläthylketon. Ein wahlweises Verfahren zur Verringerung der zur Verfügung stehenden Milchausflockungseinheiten stellt die Salzfraktionierung mit Natriumchlorid, Natriumsulfonat, Natriummonohydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Kaliumchlorid, Ammoniumsulfat oder weiteres geeignetes Salz dar. Die Konzentration des Enzyms in der Lösung wird so eingestellt, dass ein geeignetes Lösungsvolumen in das Tier injiziert wird, um so etwa 55 - 1100 Tyrosyleinheiten pro kg Lebendgewicht des Tieres und etwa 2 - 17 gesamte Milchausflockungseinheiten pro kg Lebendgewicht des Tieres zu ergeben.
Obgleich bei der bevorzugten Ausführungsform etwa 820 - 880 Tyrosyleinheiten pro kg in das Tier eingeführt werden, lassen sich sehr zufriedenstellende Ergebnisse erzielen, wenn etwa 110 bis 880 Tyrosyleinheiten Anwendung finden. Es ist möglich, Enzymlösungen herzustellen, die die gewünschten Charakteristika durch Gemische aus Papain, Ficin und Bromelain aufweisen.
Das Enzym ist ebenfalls durch Inaktivierung, Lösungsmittelfraktionieren und Salzfraktionieren gereinigt worden. Lösungsmittel, wie Aceton und die niederen Alkylalkohole werden bei der Lösungsmittelfraktionierung angewendet, während Natriumchlorid, Natriumsulfat, Alkalimetallphosphate, Ammoniumphate und Sulfate bei der Salzfraktionierung Verwendung finden können. Eine Vorkonditionierung durch diese Verfahren stellt sicher, dass das Enzym eine hohe proteolytische Aktivität aufweist und relativ frei von inaktivierenden Materialien und Inhibitoren ist. Weitere inerte Proteine u. a. Substrate, die durch die Eigeneinwirkung des Enzyms bedingt werden, werden hiedurch entfernt. Die Biuret-Protein Probe gibt ein Mass für die vorliegende Proteinmenge in der Zubereitung und misst somit indirekt die vorliegenden Verunreinigungsmengen.
Enzym-Präparate im Rahmen der Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, dass dieselben 50% oder mehr Biuretprotein und eine ausreichende proteolytische Aktivität ausweisen, so dass weniger als 3,0 g des Pulvers suspendiert in 100 ml Wasser benötigt werden, um eine Aktivität von wenigstens 1000 Tyrosyleinheiten pro Milliliter zu erzielen.
Die folgende Tabelle I erläutert einen Vergleich zwischen verschiedenen rohen Enzymen, die nicht zureichende Aktivität zeigen, um erfindungsgemäss arbeiten zu können, und den erfindungsgemäss zubereiteten Enzymen, die zu den erfindungsgemäss günstigen Ergebnissen führen.
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Tabelie1
EMI6.1
<tb>
<tb> Enzym-Pulver <SEP> Biuret-Protein <SEP> Tyrosyleinheiten <SEP> Gesamte <SEP> Milchaus- <SEP> Zur <SEP> Verfügung <SEP> g <SEP> Pulver <SEP> pro <SEP> 100 <SEP> ml
<tb> % <SEP> pro <SEP> g <SEP> Pulver <SEP> flockungseinheiten <SEP> stehende <SEP> Milchaus- <SEP> um <SEP> 1 <SEP> 000 <SEP> Tyro- <SEP>
<tb> pro <SEP> g <SEP> Pulver <SEP> flockungseinheiten <SEP> syleinheiten/ml <SEP> zu
<tb> pro <SEP> g <SEP> Pulver <SEP> erhalten.
<tb>
Gemahlenes <SEP> handelsübliches <SEP> Enzym <SEP> A <SEP> 38 <SEP> 15700 <SEP> 250 <SEP> 88 <SEP> 6,4
<tb> Gemahlenes <SEP> handelsübliches <SEP> Enzym <SEP> B <SEP> 37 <SEP> 20 <SEP> 600 <SEP> 419 <SEP> 29 <SEP> 4,9
<tb> Gemahlenes <SEP> handelsübliches <SEP> Enzym <SEP> C <SEP> 40 <SEP> 19800 <SEP> 316 <SEP> 128 <SEP> 5, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Gemahlenes <SEP> handelsübliches <SEP> Enzym <SEP> D <SEP> 41 <SEP> 19100 <SEP> 315 <SEP> 112 <SEP> 5, <SEP> 2
<tb> Gereinigt <SEP> A <SEP> 57 <SEP> 44 <SEP> 600 <SEP> 663 <SEP> 430 <SEP> 2,2
<tb> Gereinigt <SEP> B <SEP> 59 <SEP> 41300 <SEP> 557 <SEP> 340 <SEP> 2,4
<tb> Gereinigt <SEP> C <SEP> 61 <SEP> 42 <SEP> 700 <SEP> 724 <SEP> 430 <SEP> 2,3
<tb> Gereinigt <SEP> D <SEP> 55 <SEP> 65 <SEP> 000 <SEP> 980 <SEP> 620 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Gereinigt <SEP> E <SEP> 57 <SEP> 45 <SEP> 300 <SEP> 678 <SEP> 376 <SEP> 2,
2
<tb> Gereinigt <SEP> F <SEP> 61 <SEP> 45800 <SEP> 593 <SEP> 19 <SEP> 2,2
<tb> Gereinigt <SEP> G <SEP> 50 <SEP> 41800 <SEP> 660 <SEP> 328 <SEP> 2,4
<tb> Gereinigt <SEP> H <SEP> 50 <SEP> 52200 <SEP> 915 <SEP> 447 <SEP> 1,9
<tb> Gereinigt <SEP> 1 <SEP> 52 <SEP> 58 <SEP> 300 <SEP> 1120 <SEP> 480 <SEP> 1,7
<tb> Gereinigt <SEP> J <SEP> 67 <SEP> 103500 <SEP> 1620 <SEP> 785 <SEP> 1,0
<tb>
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Die gereinigten Enzyme wurden mit Salzen oder Lösungsmitteln fraktioniert oder durch Oxydation in- aktiviert.
Die Vorkonditionierung des rohen Enzyms, wenn man derartige Enzyme anwenden will, wird an Hand des folgenden Beispieles erläutert, bei dem das gemahlene handelsübliche Enzym D in der Tabelle I mit verschiedenen Mitteln behandelt wird, um ein Enzym zu erhalten, das die Charakteristika der erfindungs- gemässen Enzyme besitzt.
Beispiel l : Rohes Enzym. Das Enzym ist eine rohe getrocknete Latex, die gemahlen worden ist, so dass die Teilchen eine lichte Maschenweite von kleiner als 0, 178 mm aufweisen. 75 g dieses Papain- enzyms werden mit 75 g reinem Glyzerin unter Ausbilden einer Paste vermischt, und diese Paste in
1500 ml destilliertem Wasser suspendiert. Die rohe Lösung wird zentrifugiert und zwecks Klären filtriert.
Nach einer Seitz Filtration wird die Lösung in Mengen äquivalent 0,22, 0,33, 0, 44, 0, 55, 0,66, 0, 77, 1, 54 und 2, 75 ml/kg Lebendgewicht in erwachsene Schafe injiziert. Diese Mengen gelten für eine Lösung, die 1 000 Tyrosyleinheiten pro Milliliter enthält, und alle Abweichungen von einer derartigen Aktivität werdendurchVergrössernoderVerkleinernder in jedemFall angewendeten Menge entsprechend eingestellt.
Belüftetes rohes Enzym. Es werden 75 g rohes Papain mit 75 g Glyzerin vermischt und die Paste in
1200 ml destilliertem Wasser aufgenommen. Der pH-Wert der Lösung wird auf 7, 4 mit 5 n wässeriger
Natriumhydroxydlösung eingestellt und das Endvolumen mit destilliertem Wasser auf 1 500 ml gebracht.
Die Lösung wird durch Zentrifugieren und anschliessendes Filtrieren geklärt. Die filtrierte Lösung wird in einer Waring Blender Mischvorrichtung mehrmals in Abstanden von 4 min zwischen dem Vermischen je- weils 1 min lang homogen vermischt, wobei das gesamte homogene Vermischen innerhalb von 3 h durchgeführt wird. Die homogen vermischte Lösung wird sodann auf das fünffache ihres Volumens verdünnt und mittels Filtrieren durch ein bakterienzurückhaltendes Filterkissen sterilisiert. Diese Lösung wird in er- wachsene Schafe in der gleichen Menge injiziert, wie es weiter oben bezüglich des rohen Enzyms beschrieben ist.
Mit Peroxyd inaktiviertes rohes Enzym. Es werden 100 g rohes gemahlenes Papain und 100 g reines Glyzerin miteinander vermischt, und die so hergestellte Paste wird in 2000 ml einer 3% eigen Wasserstoffperoxydlösung aufgenommen. Innerhalb einer Zeitspanne von 3,5 h wird eine Lösung von Rinderleberkatalase, die 200 Kiel Einheiten pro Milliliter enthält, in einer Menge von 6,65 Kiel Einheiten pro Milli- lite Enzymlösung zugesetzt. Die Lösung wird sodann mittels Filtrieren geklärt, und der pH-Wert mit 5 n wässerigem Natriumhydroxyd auf 7, 4 eingestellt.
Die abschliessend erhaltene lösung wird mittels Filtrieren durch ein bakterienzurückhaltendes Seitz Filterkissen sterilisiert, und diese Lösung zum Injizieren von Schafen in derartigen Mengen angewendet, wie es weiter oben bezüglich des rohen Enzyms angegeben ist.
Mittels Natriumchlorid fraktioniertes rohes Enzym. Das im Handel befindliche rohe gemahlene Papain (150 g) wird unter Ausbilden einer Paste mit reinem Glyzerin (150 g) vermischt, und die Paste in 2 000 ml destilliertem Wasser aufgenommen. Der pH-Wert der Lösung wird mit wässeriger Natriumhydroxydlösung auf 7, 4 eingestellt und 30 min lang bei diesem pH-Wert gehalten. Der pH-Wert der Lösung wird sodann auf 3, 5 gebracht und 685 g Natriumchlorid zugesetzt. Abschliessend wird die Lösung auf eine Temperatur von 100C abgekühlt. Der sich hiebei ausbildende Niederschlag wird vermittels Zentrifugieren abgepresst und bei einem pH-Wert von 7, 4 in 2260 ml destilliertem Wasser aufgenommen. Die Lösung wird mittels Filtrieren durch ein bakterienzurückhaltendes Seitz Filterkissen sterilisiert.
Die sterilisierte Lösung wird in erwachsene Schafe in den oben angegebenen Mengen injiziert.
Mit Alkohol fraktioniertes rohes Enzym. Es werden 60 g im Handel erhältliches gemahlenes Papain und 60 g reines Glyzerin unter Ausbilden einer Paste miteinander vermischt, und die Paste in 1200 ml destilliertem Wasser aufgenommen, sodann auf eine Temperatur von 00C abgekühlt. Der pH-Wert der Lösung wird mittels 5 n wässeriger Natriumhydroxyd auf 7, 4 eingestellt, und die Lösung sodann durch Filtrieren geklärt. Das Enzym wird aus dieser wässerigen Lösung durch Zugabe von 4000 ml Äthanol ausgefällt. Die in Anwendung kommende Äthanolmenge führt zu einer etwa zuigen Äthanollösung. Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt und sodann in 1000 ml destilliertem Wasser bei einem pH-Wert von 7, 4 gelöst.
Es werden 15 g Natriumchlorid zugesetzt, und die Lösung mittels Filtrieren durch ein bakterienzurückhaltendes Seitz-Filterkissen sterilisiert. Die sterilisierte Lösung wird für die Injektion erwachsener Schafe entsprechend den vorangehenden Beispielen angewendet.
Mit Aceton fraktioniertes rohes Enzym. Es werden 60 g im Handel erhältliches gemahlenes Papain und 60 g reines Glyzerin unter Ausbilden einer Paste vermischt, und die Paste in 1 200 ml destilliertem Wasser aufgenommen und sodann auf 100 C abgekühlt. Der pH-Wert der abgekühlten Lösung wird auf 7, 4 eingestellt und die Lösung sodann mittels Filtrieren geklärt. Das Enzym wird aus der wässerigen Lösung
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durch Zugabe von 3000 ml Aceton ausgefällt, das auf eine Temperatur von 100C abgekühlt ist. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt, und der Niederschlag sodann in 1000 ml destilliertem
Wasser mit einem pH-Wert von 7, 4 gelöst. Es werden 10 g Natriumchlorid zugegeben, und die Lösung mittels Filtrieren durch bakterienzurückhaltendes Seitz Filterkissen filtriert.
Die Lösung wird sodann in erwachsene Schafe in den angegebenen Mengen injiziert.
Mit Natriumsulfat fraktioniertes rohes Enzym. Es werden 50 g rohes gemahlenes Papain und 50 g reines Glyzerin unter Ausbilden einer Paste vermischt, und die Paste sodann in 1000 ml destilliertem Wasser aufgenommen. Der pH-Wert der Lösung wird auf 7,4 eingestellt und die Lösung sodann bei diesem pH-Wert 30 min lang gehalten. Sodann wird der pH-Wert auf 5,0 eingestellt. Es werden 400 g Natriumsulfat zugegeben, und die Lösung bis zum Lösen des Salzes gerührt. Es werden 20 g Filtrierhilfsmittel zugesetzt und der so gebildete Niederschlag mittels Filtrieren abgetrennt. Der Niederschlag wird in 1000 ml destilliertem Wasser bei einem pH-Wert von 7, 4 aufgenommen und die Lösung zwecks Klären und Sterilisieren filtriert. Die Lösung wird sodann zum Injizieren in erwachsene Schafe nach den vorangehenden Beispielen angewendet.
Dialysiertes rohes Enzym. Es werden 37,25 g im Handel erhältliches gemahlenes Papain und 27,25 g Glyzerin unter Ausbildung einer Paste vermischt, und die Paste sodann in 745 ml destilliertem Wasser bei einem pH-Wert von 7,4 aufgenommen. Die Lösung wird in ein Visking Dialysierrohr eingeführt und gegen destilliertes Wasser 48 h lang dialysiert. Das abschliessend erhaltene Volumen der Lösung beträgt 1195 ml, entsprechend einer Verdünnung von 1, 6. Es werden 24 g Natriumchlorid zugegeben, und die Lösung auf einen pH-Wert von 7, 4 eingestellt. Anschliessend wird durch ein bakterienzurückhaltendes Seitz Filterkissen zwecks Klären und Sterilisieren filtriert. Diese Lösung wird in erwachsene Schafe in den oben angegebenen Mengen injiziert.
Es ist zu beachten, dass das bei allen oben angegebenen Reinigungsverfahren angewendete rohe Enzyme aus dem gleichen Ansatz herstammt, und dass somit die durch die verschiedenen Sterilisierungs- und Reinigungsverfahren erzielten Verbesserungen direkt mit der rohen Probe in Beziehung gesetzt werden können.
Die analytischen Werte für jede der Proben sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt :
EMI8.1
<tb>
<tb> Tyrosylein- <SEP> Milchauslockungseinhei- <SEP> Tyrosyleinheiten <SEP> pro
<tb> Präparat <SEP> heiten <SEP> pro <SEP> ml <SEP> ten <SEP> pro <SEP> ml <SEP> Milchausflockungseinheit
<tb> gesamt <SEP> verfügbar <SEP> gesamt <SEP> verfügbar
<tb> 1. <SEP> Rohes <SEP> Enzym <SEP> 813 <SEP> 16,4 <SEP> 4,6 <SEP> 50 <SEP> 177
<tb> 2. <SEP> Belüftetes <SEP> rohes <SEP> Enzym <SEP> 209 <SEP> 3,5 <SEP> 0,1 <SEP> 60 <SEP> 2090
<tb> 3. <SEP> Mit <SEP> Peroxyd <SEP> inaktiviertes
<tb> rohes <SEP> Enzym <SEP> 465 <SEP> 5,3 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 88 <SEP> 4650
<tb> 4. <SEP> Mit <SEP> Natriumchlorid <SEP> fraktioniertes <SEP> rohes <SEP> Enzym <SEP> 611 <SEP> 9,8 <SEP> 0,2 <SEP> 63 <SEP> 30150
<tb> 5.
<SEP> Mit <SEP> Alkohol <SEP> fraktioniertes
<tb> rohes <SEP> Enzym <SEP> 890 <SEP> 14,8 <SEP> 0,7 <SEP> 60 <SEP> 1271
<tb> 6. <SEP> Mit <SEP> Aceton <SEP> fraktioniertes
<tb> rohes <SEP> Enzym <SEP> 1000 <SEP> 15, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 64 <SEP> 3333
<tb> 7. <SEP> Mit <SEP> Natriumsulfat <SEP> fraktioniertes <SEP> rohes <SEP> Enzym <SEP> 945 <SEP> 11,9 <SEP> 0,2 <SEP> 87 <SEP> 4725
<tb> 8. <SEP> Dialysiertes <SEP> rohes <SEP> Enzym <SEP> 750 <SEP> 9,6 <SEP> 0,2 <SEP> 78 <SEP> 3750
<tb>
Bei der Injizierung in Schafe der behandelten Präparate 2 - 8 bei Dosen bis zu etwa 1, 55 ml/kg werden keine wesentlichen nachteiligen physiologischen Reaktionen induziert und keine wesentlichen Verletzungen bei einer Untersuchung der Kadaver beobachtet.
Steaks und Kotletts, sowie Bratenstücke, die aus diesen Kadavern herstammen, wurden von einer Gruppe Experten bezüglich der Zartheit mit der Wertung 8 oder besser befunden. Die numerische Bewertung verläuft von 1 für nicht zufriedenstellend bis zu
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10, die überragende Qualität anzeigt.
Das rohe Material führte anderseits zu Depressionen und beschleunigtem Atmen bei Anwendung von Mengen von 0,33 ml/kg und darüber. Weiterhin wurde ein Bluten in dem mediastinalen Lymphknoten und den Lebern bei Dosen von 0,33 ml/kg und darüber festgestellt.
Obgleich erfindungsgemäss das Verfahren und Produkt im wesentlichen auf die Verfahrensweise gerichtet sind, bei der lebende Tiere behandelt werden, können die Präparate ebenfalls bei der Behandlung von Fleischstücke Anwendung finden, die in das Enzym eingetaucht oder in anderer Weise hiemit behandelt werden, um so mit dem Enzym einen Oberflächenüberzug auf dem Fleisch aufzubringen.
Es können sehr stark gereinigte Materialien mittels eines verwickelten Trennsystems unter Gewinnen von reinem Papain und reinem Chymopapain mit erheblichen Aktivitäten hergestellt werden. So wurden Papain und Chymopapainfraktionen mit den folgenden kennzeichnenden Eigenschaften aus einer rohen Papainprobe isoliert.
EMI9.1
<tb>
<tb>
Papain <SEP> Aktivität/g <SEP> Aktivität/g <SEP> Aktivität/g
<tb> Biuretprotein <SEP> elektrophoretisches <SEP> Chymopapain <SEP> und
<tb> Protein <SEP> Papain <SEP> Protein
<tb> Tyrosyleinheiten <SEP> 195000 <SEP> 307000 <SEP> 452000 <SEP>
<tb> Gesamte <SEP> Milchausflockungseinheiten <SEP> 3500 <SEP> 5600 <SEP> 8200 <SEP>
<tb> Verfügbare <SEP> Milchausflockungseinheiten <SEP> 1100 <SEP> 1770 <SEP> 2600 <SEP>
<tb> Chymopapain
<tb> Tyrosyleinheiten <SEP> 117500 <SEP> 370000 <SEP> 660000 <SEP>
<tb> gesamte <SEP> Milchausflockungseinheiten <SEP> 1320 <SEP> 4150 <SEP> 7400 <SEP>
<tb> verfügbare <SEP> Milchausflockungseinheiten <SEP> 100 <SEP> 300 <SEP> 540
<tb>
Es lassen sich im Rahmen der Erfindung Abwandlungen und Modifizierungen durchführen, ohne vom Geist und Umfang derselben abzuweichen.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Proteolytisches Enzym-Präparat für die Verbesserung der Zartheit von Fleisch vorzugsweise durch Injektion des Präparates in lebende Tiere, dadurch gekennzeichnet, dass das Präparat aus einer enzymenthaltenden wässerigen Lösung besteht, die eine Enzymaktivität von 250 bis 5 000, vorzugsweise 800 bis 1200 Tyrosyleinheiten pro Milliliter, und ein Verhältnis Tyrosyleinheiten zu gesamten Milchausflockungseinheiten von etwa 55 bis 100 besitzt.