AR035860A1 - Metodos de deteccion por espectrometria de masa y cuantificacion de proteinas blanco especificas en muestras biologicas complejas - Google Patents

Abstract

Uso de la espectrometría de masa en métodos para detectar, cuantificar y caracterizar proteínas blanco en muestras biológicas complejas. Método de detección de una proteína blanco en una muestra biológica compleja (por ejemplo, un producto de origen biológico), que comprende: (a) extraer proteínas de la muestra biológica, (b) concentrar la proteína blanco de las proteínas extraídas de (a); (c) digerir las proteínas concentradas de (b) para producir fragmentos peptídicos de las proteínas, donde dichos fragmentos incluyen por lo menos un péptido característico específico de la proteína blanco; y (d) analizar los fragmentos peptídicos mediante espectrometría de masa, donde la detección de por lo menos un péptido característico es indicativo de la presencia de la proteína blanco en la muestra. Preferiblemente, dicha digestión se lleva a cabo con una proteasa que es tripsina, endoproteasa-Arg-C, endoproteasa-Aspn-N, endoproteasa-Glu-C o endoproteasa-Lys-C. La concentración de la proteína blanco resulta deseable con el fin de obtener una cantidad apropiada de una proteína blanco específica con la cual efectuar la espectrometría de masa. La concentración ( por ejemplo, enriquecimiento) se puede llevar a cabo usando cualquiera de numerosos métodos y técnicas. Los ejemplos de medios apropiados para el enriquecimiento incluyen el uso de resinas de soporte sólido (por ejemplo intercambiadores iónicos, gel de afinidad y otras resinas que adsorben proteínas). Las resinas pueden incluir perlas (por ejemplo gel de sílice, vidrio de poro controlado, Sephadex/Sepharose, celulosa, agarosa), que se pueden poner en columnas (de cromatografía, tubos capilares), membranas o placas para microtitulación (nitrocelulosa, polivinilidenflouoruro, polietileno, polipropileno) o sobre superficies planas o chips o perlas ubicadas en orificios en las superficies planas tal como discos. Los métodos se pueden aplicar en análisis de diagnóstico agronómicos para detectar la presencia o ausencia de una proteína blanco o de un conjunto de proteínas blanco en diferentes tipos de tejidos (por ejemplo, semillas, hojas, raíces, frutos) o en tipos o líneas celulares específicos. El método es de particular utilidad en la detección de organismos modificados genéticamente (GMO) en los cuales se expresa la proteína, por ejemplo, para lograr resistencia a insectos o herbicidas, una enzima o enzimas expresadas para modificar una vía metabólica y/o proteínas que se expresan en plantas para una producción a pequena y gran escala. Además, el método es adecuado para diagnosticar una enfermedad fitopatogénica o contaminación en plantas, tierras, líquidos, sólidos y otras muestras de fuentes ambientales. Además el método permite monitorear proteínas blanco en los procesos de elaboración de alimentos. El monitoreo de poblaciones microbianas (por ejemplo bacterianas, fúngicas, etc.) en sitios de bioremediación. Los métodos se pueden emplear en diversos análisis clínicos y de diagnóstico para detectar la presencia o ausencia y los niveles de una o varias proteínas, en un fluido biológico (por ejemplo orina, sangre, suero, saliva, etc.) o en tipos celulares o tejidos específicos en seres humanos y animales. Un aspecto adicional es el monitoreo de infecciones (por ejemplo, bacterianas, fúngicas, virales, etc.) y su tratamiento en seres humanos y animales.