UT 3.

MEDIOS DE CULTIVO Y TÉCNICAS DE SIEMBRA,

INOCULACIÓN Y AISLAMIENTO.
ÍNDICE

3.1. INTRODUCCIÓN.
3.2. COMPOSICIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.
3.3. CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.

3.3.1. Según su estado físico.

3.3.2. Según su composición.

3.3.3. Según su uso.

3.3.4. Según su presentación.

3.4. PRINCIPALES MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS EN MICROBIOLOGÍA.
3.5. ALMACENAMIENTO DE MEDIOS DE CULTIVO.
3.5.1. Deshidratados.
3.5.2. Hidratados.
3.5.3. Recomendaciones.
3.6. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.
3.7. INCUBACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO SEMBRADOS.
3.8. TÉCNICAS DE SIEMBRA/INOCULACIÓN Y AISLAMIENTO.
3.8.1. Material de siembra o inoculación.
3.8.2. Preparación de inóculos.
3.8.3. Métodos de inoculación o siembra:
A) Siembra del inóculo en medio líquido.
B) Siembra del inóculo en medio sólido.
b.1) Siembra del inóculo en placa.
b.2) Siembra del inóculo en tubo.
3.8.4. Métodos de siembra-aislamiento.
3.9. CULTIVO DE CEPAS.

3.10. RECUENTO DE MICROORGANISMOS.

3.10.1. Recuentos directos al microorganismo.
3.10.2. Recuentos en placa.
3.10.3. Recuento de colonias con contadores.
3.10.4. Recuentos en filtros de membrana.
3.10.5. Recuento del número más probable (NMP).

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 3.1. INTRODUCCIÓN.
El propósito de los medios de cultivo es conseguir el desarrollo de los microorganismos para
poder observar una morfología colonial y posteriormente realizar un análisis microscópico más técnico.
Los medios de cultivo se usan para separar y aislar microorganismos, es un paso previo en la
identificación del microorganismo objeto de estudio. Las variaciones en un medio de cultivo pueden
alterar el desarrollo de los microorganismos, para evitarlo la composición de los medios de cultivo debe
cumplir una serie de condiciones:
▪ Adecuada exposición de nutrientes en forma de fuente de energía, de calcio, sodio,
fósforo, azufre, factores de crecimiento e iones metálicos.
▪ Adecuadas condiciones físico-químicas: Temperatura óptima (37ºC +/-) de desarrollo de los
microorganismos, grado de humedad adecuado, presión osmótica (la mayoría de las bacterias
crecen en condiciones de isotonía), pH (la mayoría de las bacterias crecen en un entorno de 6´5
a 7´5), presencia o ausencia de oxígeno.

3.2. COMPOSICIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

La mayoría de los medios de cultivo contienen en primer lugar agar, q u e son extractos de
algas. Es el agente solidificante utilizado en los medios de cultivo. Las concentraciones más utilizadas
son de 13 a 20 g/L para preparar medios sólidos y de 5-7g/L para preparar medios semisólidos.
Se diferencian básicamente cuatro tipos de agar en función del tratamiento que han recibido
para su preparación: agar técnico, agar bacteriológico americano, agar bacteriológico europeo y agar
purificado.
Otro componente son las peptonas / triptonas que son los productos de degradación
proteolítica de proteínas de diversos orígenes, se obtienen por digestión péptica, tríptica... el producto
obtenido es rico en aminoácidos libres y péptidos de pequeño peso molecular. Suele ser utilizado como
fuente de nitrógeno por los microorganismos, los más utilizados son la peptona bacteriológica y triptona
de caseína.
Otros componentes son:
- Extractos: de carne, de levadura…
- Sangre: debe estar libre de agentes antimicrobianos, la más usada es la de ternera y la
de caballo. Sirve para poner de manifiesto la hemólisis (típica de Streptococcus)
- Plasma: los más utilizados son plasma humano o de conejo, sirve para poner de
manifiesto la actividad de la enzima coagulasa en el grupo de los estafilococos.
- Bilis: con todos sus componentes, sales biliares, biliverdina, bilirrubina...
- Gelatina: formada por proteínas procedentes del colágeno presente en los tejidos
animales. A los organismos capaces de hidrolizar la gelatina se las llama gelatinasa
positiva.
- Hidratos de carbono: se utilizan para enriquecer los medios de cultivo y determinar si un
grupo de microorganismos, produce o no ácidos y/o gas como resultado de un proceso de
fermentación.
- Sistemas amortiguadores de pH: para mantener el pH del medio. Fosfatos disódicos y
dipotásicos
- Indicadores de pH: se incorporan en algunos medios de cultivo para visualizar el pH,
suele ir acompañado por un cambio de color en el medio. Los más utilizados, púrpura de
bromocresol, fenolftaleína, anaranjado de metilo y rojo de metilo.
- Otras sustancias como por ejemplo, cloruro sódico para mantener la presión osmótica.

Además, se pueden añadir agentes reductores como algunos aminoácidos (cisteína, lisina…),
agentes selectivos (antibióticos…)

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 3.3. CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.
Básicamente se siguen cuatro clasificaciones:

3.3.1. Según su estado físico: existen tres medios:

▪ Sólido: Contienen aproximadamente un 30% de agar, las bacterias crecen en ellos con
mayor dificultad porque los nutrientes se agotan con rapidez, pero a cambio nos permiten aplicar
técnicas de aislamiento y observar la morfología colonial.
▪ Semisólido: La proporción de agar es mucho menos que los medios anteriores. Se utilizan
para estudiar reacciones de oxidofermentación.
▪ Líquido: No contienen agente solidificante, se les llama caldos de cultivo. Favorecen el
desarrollo y la multiplicación de las bacterias porque los nutrientes se encuentran repartidos por todo el
medio.

3.3.2. Según su composición:

▪ Naturales: En ellos aparecen sustancias orgánicas e inorgánicas que se presentan de manera
artesanal, por ejemplo, huevo, patata, leche descremada...
▪ Semisintéticos: En ellos hay sustancias químicas definidos y debe aparecer siempre una fuente de
carbono, nitrógeno, minerales y factores de crecimiento.
▪ Sintéticos: Contienen una composición química definida tanto cualitativa como cuantitativamente. Se
utilizan para obtener resultados reproducibles.
▪ Complejos: No tienen una composición exactamente definida, su uso queda restringido para
virología y parasitología.

3.3.3. Según su uso:

▪ Medios para aislamiento: con ellos se obtienen colonias de microorganismos aisladas. Según su
composición se divide en 3 subtipos:
 Medio de enriquecimiento: Contienen un tipo de nutrientes muy específicos que sirven
para que se desarrollen microorganismos muy exigentes.
 Medios selectivos: Contienen componentes que inhiben el desarrollo de ciertos
microorganismos con lo cual, se favorece el aislamiento de una especie o bien se evita la
presencia de agentes contaminantes.
 Medios diferenciales: Contienen sustancias que inhiben el desarrollo de ciertos
microorganismos y además presentan colorantes, azúcares o indicadores de pH para
provocar una respuesta bioquímica conocida, lo que permite aislar una determinada especie.
▪ Medios para el crecimiento general: También llamados medios comunes, son apropiados para el
cultivo de la mayoría de los microorganismos debido a la facilidad de estos para desarrollarse en ellos.
▪ Medios para identificación: Sirven fundamentalmente para clasificar taxonómicamente a un
microorganismo, suelen llevar indicadores de pH y nutrientes.

3.3.4. Según su presentación:

▪ Medios deshidratados o liofilizados se preparan añadiendo la cantidad de agua correspondiente
según instrucciones y manteniendo condiciones asépticas.
▪ Medios de cultivo preparados son los preparados por las casas comerciales siguiendo un control
de calidad.
▪ Medios de cultivo sólidos en tubo.
▪ Medios de cultivo líquidos en tubo.
▪ Medios de cultivo sólidos en placa.
▪ Medios de cultivo de doble fase en frasco (hemocultivo).
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 3.4. PRINCIPALES MEDIOS DE BIOLOGÍA UTILIZADOS EN MICROBIOLOGÍA

• Agua/caldo peptonado: se usa para la prueba del indol debido a su alto contenido en
triptófano. Aparece positivo si hay un anillo rojo en la superficie del medio. La prueba es negativa si el
anillo es amarillo. Se incuba a 37 ºC durante 24-48 horas.

• Agar Levine: Se emplea para la investigación y diferenciación de bacilos entéricos y

microorganismos Coliformes. Con este medio se puede identificar Escherichia coli y Enterobacter.
También permite la identificación de Candida albicans. La eosina y el azul de metileno son productos
que inhiben parcialmente el crecimiento de microorganismos grampositivos, entre ellos los
Estreptococos fecales. Además, la combinación del azul de metileno y la eosina permite diferenciar los
gérmenes lactosa-positivos de los lactosa-negativos.

Los Coliformes dan colonias violetas oscuro, con una zona central más oscura, mientras, que los
lactosa-negativos dan colonias incoloras. Para el cultivo confirmativo de E. coli, las placas se
incubarán a 44,5±1 °C con lecturas a las 24 y 48 h. Las colonias de E. coli en este agar, son planas o
ligeramente cóncavas, con centros oscuros, casi negros. Con luz reflejada, casi siempre se observa un
brillo metálico verdoso. Enterobacter forma colonias más grandes con centro pardo, mientras que
Salmonella y Shigella forma colonias translúcidas, desde incoloras a ámbar. Klebsiella da colonias
mucosas parduzcas. Candida albicans da colonias en forma de telaraña o de pluma.

▪ Medio Chapman o sal-manitol: compuesto por rojo fenol, D-manitol y altas concentraciones de
NaCl. Sirve para aislar especies del género Staphylococcus. El manitol es un azúcar que utilizan
determinados estafilococos produciendo acidez en el medio. Sirve para diferenciar Staphylococus
aureus (grandes con pigmentaciones amarillas y producen virajes del medio rojo a amarillo) de S.
epidermidis (colinas pequeñas y pigmentadas con cierto brillo purpura y además no producen viraje del
medio, ya que se mantiene roja).

• Bilis Esculina, Agar Se emplea como medio diferencial para enterococos y se recomienda para
su aislamiento e identificación presuntiva. Rochaix fue el primero que demostró que la hidrólisis de la
esculina por los enterococos era una prueba apta para su identificación. Más tarde Meyer y Schonfeld
demostraron que esta hidrólisis en medio biliar era la mejor prueba diferencial para enterococos. La
formulación del medio corresponde a la dada por Swan.

La presencia de la bilis de buey no inhibe el crecimiento de los enterococos, pero sí el del resto de
las bacterias Grampositivas. Esta característica junto con la capacidad de hidrolizar la esculina son
propiedades constantes de los Enterococos. El producto resultante de la hidrólisis de la esculina es la
esculetina que forma un complejo con el hierro III citrato de un color pardo oscuro.

El medio se puede emplear en placas o en tubos, en este caso solidificándolo en plano inclinado.
Puede añadirse suero de caballo una vez esterilizada, a razón de un 5% en la concentración final. Para
algunos autores esta adición mejora el crecimiento de los enterococos, para otros no es apreciable.
Incubar a 35±2ºC de 18 a 24 horas. Se acepta que el material sembrado no contiene Enterococos, si no
hay oscurecimiento del medio después de 3 días de incubación.

• DNasa, Agar Se emplea para determinar la actividad de la desoxirribonucleasa producida por

microorganismos, principalmente estafilococos. Weckman y Catlin pusieron de manifiesto que el
aumento de la actividad productora de DNAasa guarda una estrecha relación con la producción de
coagulasa.

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 También se demostró que la producción de DNAasa es una indicación fiable en la determinación de
estafilococos patógenos.
Los microorganismos productores de DNAasa depolimerizan el ácido desoxirribonucléico que
contiene el medio, dando lugar a unas zonas de transparencia alrededor de las zonas sembradas,
después de inundar la placa con ácido clorhídrico 1N. La acidificación del medio con ácido clorhídrico
provoca la precipitación del ADN quedando el medio turbio, excepto, alrededor de las colonias DNAasa-
positivas.
Para aumentar la información sobre la caracterización de Estafilococos patógenos, puede
demostrarse el consumo de manitol suplementando el medio con este producto y un indicador de pH
como el azul de bromotimol.
Inocular en superficie por estría. Incubar a 37ºC de 18 a 24 horas. Inundar la placa con ácido
clorhídrico 1N y observar la transparencia alrededor de la estría. Si se ha suplementado el medio con
manitol y azul de bromotimol, el medio es azul, pero las colonias Manitol-positivas son de color amarillo
con halo amarillo alrededor.

• Agar Mc Conkey: Medio de cultivo utilizado en la investigación de organismos coliformes. Este

medio se basa en la fórmula original de MacConkey a base de sales biliares, rojo neutro y lactosa para el
aislamiento de bacilos entéricos Gram-negativos. El medio ha sufrido múltiples variaciones en el
transcurso del tiempo, ya sea por la adición de otros ingredientes o por la modificación de las
proporciones entre ellos.
Por la presencia de las sales biliares y el cristal violeta se inhibe el crecimiento de las bacterias
Gram-positivas. Por la presencia de la lactosa, las bacterias capaces de fermentarla acidifican el medio,
cambiando el color del rojo neutro y formando colonias rojas o rosadas, pudiendo presentar un halo
turbio correspondiente al precipitado biliar.
Las bacterias lactosa-negativas dan colonias incoloras. Pueden verse colonias rojas-rosadas
propias de Escherichia coli; colonias mucosas y rosadas que corresponden a Enterobacter aerogenes
(en general todo lo que crezca rojo o rosado significa que fermenta la lactosa) Shigella, Proteus,
Salmonella…son lactosa negativas.

• Agar Kia/Kliger: Se emplea en la diferenciación de bacilos entéricos Gram- negativos según la

fermentación de dos azúcares (glucosa y lactosa) y la producción de Hidrógeno Sulfuro. Por este
medio se trata de diferenciar los bacilos entéricos Gram-negativos tanto por su capacidad de fermentar
la lactosa y/o la glucosa como por la de producir Hidrógeno Sulfuro.

La acidificación del medio a causa del proceso fermentativo se pone de manifiesto con un cambio
de color del rojo de fenol que pasa de rojizo a amarillo. Los microorganismos que sólo fermentan
glucosa, como Salmonella y Shigella, que se encuentra en una concentración 10 veces inferior a la
lactosa, si bien, producen el viraje al amarillo, éste sólo se mantiene en la columna vertical (base del
tubo) mientras que la superficie inclinada restablece el color rojo por oxidación del ácido. El color
amarillo obtenido en la acidificación del medio, producida por la fermentación de la lactosa si se
produce, es persistente, por lo que la superficie indicada se mantiene amarilla.

Los cultivos que contienen microorganismos capaces de formar Hierro (II) Sulfuro presentan el
característico precipitado negro. La producción de gas se observa por la formación de burbujas e incluso
por la rotura del propio gel. Debe sembrarse tanto por estría en la superficie inclinada como por picadura
en la columna vertical. Se recomienda utilizar tubos con tapones que permitan el acceso del aire o si
son roscados dejarlos flojos ya que si no se dificulta la reoxidación del indicador.

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 • Medio base Christensen: Para la prueba de la urea, se trata de un medio salino que se
dispensa como agar inclinado en tubo y se siembra con asa en picadura y en la superficie. Si a las 18
horas y hasta los 6 días las cepas que son ureasa + forman amoniaco y alcalinizan el medio; este pasa
de ambarino a rosa intenso.

• Medio citrato de Simmons: Se usa para la prueba del citrato y es muy usado para la
investigación de bacilos gram-. Se siembra en picadura y superficie. Las bacterias gram- y citrato+
hacen variar el medio de verde a un color azul.

• Medio Cled: Para el estudio de microorganismos de vías urinarias tanto para recuento como
identificación. En este medio se coloca una gota de inóculo y se extiende con ayuda del asa digrasky o
bien se coloca una gota de inoculo en un extremo de la placa y con un asa de siembra se realiza una
siembra primaria y en segundo lugar un aislamiento en zig-zag por toda la placa.
Cuando hay una infección de vías urinarias esta infección no suele estar causada por una sola
especie. Las colonias más frecuentes son las de:
✓ Escherichia coli: amarillas, pequeñas, opacas y con el centro oscuro.
✓ Klebsiella: también son amarillas o azuladas pero muy mucosas.
✓ Proteus: colonias azules y translucidas.
✓ Pseudomonas aeruginosa: color verde con la superficie mate y bordes irregulares.
✓ Streptococcus faecalis: muy pequeñas, puntiformes y de color amarillo
✓ Staphylococcus aureus: pequeñas y amarillas intensas.

• Agar Columbia: Para investigación de microorganismos hemolíticos; en su composición tiene un

5% de sangre de cordero. También se usa para el aislamiento de estreptococos y de pneumococos.
El revelado de la prueba consiste en identificar gérmenes:
✓ Β-hemolíticos: amplias zonas de hemolisis alrededor de las colonias, una zona de transparencia.
✓ α-hemolíticos: zonas difusas alrededor de las colonias.
✓ γ-hemolíticos: no presentan zona de transparencia alrededor de las colonias.

• Medio Base de Hugh y Leiffson: Para pruebas de oxido-fermentación. La siembra se hace por
duplicado en 2 tubos por el método de picadura y uno de los tubos se sella con vaselina (anaerobio).
Se observa en cuál de los tubos se ha producido acido y se observa si hay producción de gas,
mediante las campanas Durham
Según los resultados, los gérmenes identificados serán anaerobios facultativos o anaerobios
estrictos.

• Medio Müeller-Hinton: Este medio se usa para aislar Neisserias y realizar antibiogramas. Para
aislar neisserias añadimos la mezcla VCM (vancomicina, colismicina y nistanina) que sirve para inhibir
el crecimiento de la mayor parte de los microorganismos excepto los meningococos. También se
recomienda cultivar en atmosfera húmeda y un 10% de CO2.

• Agar nutritivo: Es un medio general de crecimiento y se usa para recuentos. Dependiendo del tipo
de microorganismo se observan diferentes morfologías coloniales.

• Medio Sabouraud: Para crecimiento, aislamiento e identificación de hongos filamentosos y

levaduras. Contiene elevadas concentraciones de glucosa que contribuye a disminuir el crecimiento
microbiano además de cloranfenicol y gentamicina que amplía el espectro de acción antimicrobiano. Con
este medio se visualizan colonias de aspecto globoso y algodonoso.

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 3.5. ALMACENAMIENTO DE MEDIOS DE CULTIVO

3.5.1. Deshidratados.
Protegidos del calor, luz y humedad. Los recipientes son opacos, de vidrio o de plástico y con
tapón hermético. No deben abrirse en ambientes húmedos y se deben desechar cuando se apelmazan,
además de controlar periódicamente la fecha de caducidad.

3.5.2. Hidratados.
Tiempo límite de conservación en general las placas petri aproximadamente 2,5 meses. Tubos, viales y
frascos hasta 6 meses.

3.5.3. Recomendaciones.
El problema más frecuente es la deshidratación y existen una serie de recomendaciones.
• Almacenar en el frigo a 4 ºC. No guardarlos por debajo de 0 ºC porque se estropea la
estructura del gel.
• Protegerlos de la luz envolviéndolos con recipientes de papel de aluminio.
• Los tubos de cierre hermético son más recomendables que la torunda de algodón
• Los medios para verter en placa se conservan mejor en el matraz original.
• Si los medios de cultivo los vertemos en placa, hay que proteger contra la
deshidratación, precintando el borde con cinta adhesiva, envolviendo las placas en
bolsas de plástico que deben ser microporosas para evitar la excesiva condensación.
• Mantener invertidas las placas para evitar que el agua condensada caiga al medio y las
contamine.
• Los medios conservados en el frigorífico deben ser atemperados antes de su empleo
bien a temperatura ambiente o en la estufa.
• Si mantenemos los medios de cultivo fundidos no pueden estar así mas de 60 minutos.
Para refundirlos, usaremos al baño maría o el método del vapor fluente durante 30
minutos.

3.6. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Para realizar el control de calidad cogemos 4 placas al azar de 100 unidades y se colocan en la estufa
de incubación de 5-7 días a 37 ºC. En caso de advertir crecimiento microbiano se desecha el lote.
Cuaderno de prácticas: PRÁCTICA 3

3.7. INCUBACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO SEMBRADOS

Se debe incubar lo antes posible a temperatura óptima y tiempo determinado. La temperatura
óptima para la mayoría de los microorganismos capaces de producir enfermedades es 37 ºC, la del
cuerpo humano. Se debe tener en cuenta que hay microorganismos que no toleran esta temperatura
(Mycobacterium lepra).
Las estufas de los laboratorios clínicos están a 35 ºC. Es preferible disponer de 2 estufas a
diferentes temperaturas de incubación. La primera a 35 ºC y la segunda según el tipo de
microorganismo que puede ser 45, 56 o 60 ºC.

3.8. TÉCNICAS DE SIEMBRA/INOCULACIÓN Y AISLAMIENTO. Cuaderno de prácticas: PRÁCTICA 4

Para poder estudiar debidamente los microorganismos, se necesita como requisito previo poder
cultivarlos en condiciones de laboratorio y, por tanto, inicialmente deben ser aislados. Para ello, se
dispone previamente de muestras, que muchas veces suelen presentar los siguientes problemas:

▪ Que no exista la cantidad suficiente del microorganismo que se busca

▪ Que las muestras contengan varios tipos de microorganismos, parte de los cuales son
contaminantes, haciéndose necesario su aislamiento inicial para obtener cultivos puros.
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 Generalmente los procesos infecciosos están creados por un agente causal; sin embargo, es fácil
que puedan proliferar en esas condiciones otros microorganismos oportunistas o incluso contaminantes.
De ahí que una forma de evitar errores sea aislarlos inicialmente y posteriormente identificarlos.

3.8.1. Material de siembra o inoculación.

Existen los siguientes materiales:
▪ Asa de siembra: El asa de siembra es utilizada para la inoculación o siembra por estría en medios
sólidos, por picadura en medios sólidos y semisólidos y para la siembra en medios líquidos. Estas
asas se llaman también de platino porque con este material se fabricaron por primera vez, aunque en
la actualidad no se suelen utilizar. Estas han sido sustituidas por asas de acero inoxidable o cromo-
níquel. Presentan un arco bastante cerrado en su extremo, cuyo diámetro es más o menos específico,
es decir, muchas de las asas son calibradas correspondiendo a un volumen determinado de siembra.
Las más utilizadas son las de 0,01 µL, que se esterilizan por flameado.

▪ Hilos de platino: Son similares a las asas con la diferencia de no presentar el arco en su extremo,
únicamente es un hilo. Se utiliza para la siembra por picadura en medios semisólidos o sólidos en tubo.

▪ Asas de Digrasky: Son asas de vidrio o plástico (estas últimas desechables) con forma de
triángulo más o menos abierto. Se utilizan para extender el inóculo líquido previamente adicionado en
la placa, por ejemplo, a través de pipeta Pasteur. Se esterilizan en estufa Pasteur en autoclave,
aunque generalmente se puede hacer metiéndola en alcohol y prendiéndolo con una llama hasta
agotar el alcohol del asa.

▪ Hisopos: Se utilizan para la toma de muestras e incluso en muchos casos llevan un medio de
transporte incorporado que permite transportar la muestra sin que esta sufra ninguna desecación,
deterioro o contaminación. Sirve para extender la muestra a través del hisopo en el medio de cultivo. Se
suele comercializar ya estéril, listo para utilizar y desechables.

▪ Pipetas: Se pueden disponer de forma individual o en paquetes. Pueden ser de vidrio,

reutilizables por esterilización o de plástico, generalmente desechables. Pueden ser graduadas
(contienen volúmenes específicos), en cuyo caso su aspiración se realizará con aspiradores para
pipetas tipo pera o prepipeta, pipetas Pasteur (no contienen volúmenes graduados), muy utilizadas en
bacteriología y cuya aspiración se realiza con chupetes de goma que no tienen por qué ser
necesariamente estériles, aunque sí la pipeta, también nos encontramos con micropipetas utilizadas
para la siembra de mL y µL en un determinado medio de cultivo.

3.8.2. Preparación de inóculos.

Un inóculo corresponde a una cantidad suficiente y representativa de un solo tipo de
microorganismo problema. Así pues, se debe partir por un lado, de un cultivo puro y, por otro, de una
concentración adecuada de microorganismo problema. Se toman con un asa estéril 2-3 colonias o bien
una porción de la muestra biológica, y se suspende en unos 5 ml de solución diluyente, tras lo cual se
homogeneiza.

Como solución diluyente se puede utilizar:

✓ caldo de cultivo.
✓ solución salina estéril.
✓ agua destilada estéril.

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 Si la muestra no es pura se aplicarían distintos métodos para el aislamiento mediante técnicas
específicas, como es el caso de la siembra por estría en placa o por agotamiento, o la técnica de placa
invertida, que en general va a permitir el crecimiento más o menos separado de los microorganismos.
Es igualmente útil utilizar medios de cultivos enriquecidos específicos y diferenciales que permiten el
crecimiento del tipo de microorganismo concreto que buscamos. De esta forma, una muestra natural
que en principio no es pura puede ser aislada y desarrollada como cultivo puro.
Si el problema está en la cantidad de microorganismo, que no es suficiente, será necesario
preparar un inóculo con el fin de obtener una cantidad microbiana suficiente y representativa para
obtener resultados fiables.

Métodos de preparación de inóculos:

➢ Si la muestra es sólida o semisólida se tomará siempre con asa de siembra estéril.
➢ Si la muestra es líquida se tomará con pipeta graduada o pipeta Pasteur estéril en cantidad
suficiente y, en ambos casos, se homogeneizará posteriormente en el medio específico de cultivo.
➢ Si la muestra tomada con asa de siembra estéril se adiciona a un medio líquido se homogeneizará y
se dejará crecer a la temperatura adecuada, que generalmente para microorganismos patógenos
coincidirá con la temperatura corporal, durante aproximadamente 24 horas.
➢ Si la muestra se toma con asa de siembra estéril y se adiciona en un medio de cultivo sólido se
utilizarán diferentes técnicas de siembra y posteriormente se verifica el cultivo; por ejemplo, siembra por
agotamiento.
➢ Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta Pasteur y se adiciona a un medio de cultivo
líquido, se homogeneizará la mezcla inicial por agitación y se dejará crecer a una temperatura
adecuada (37 ºC) en un tiempo aproximado de 24 horas. Es importante que los inóculos sean siempre
jóvenes y en ocasiones excepcionales, sobre todo, si se necita mucha cantidad de inóculo, se podría
utilizar rotavapor.
➢ Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta Pasteur y esta se añade al medio sólido,
posteriormente se extenderá con el asa de Digrasky. Previamente estéril a través de toda la placa
incubándose a la temperatura adecuada durante aproximadamente 24 horas. Se requerirá también
cultivos jóvenes.

A veces es necesario partir de un inóculo con un número aproximado de microorganismos

problema. En estos casos, nos referimos a la estandarización del inóculo utilizando la técnica de
Kirby–Bauer: esta técnica utiliza escalas con un gradiente de turbidez. Una escala universalmente
aceptada es la escala de Mc-Farland formada por una batería de tubos cada uno de los cuales tiene
distinta turbidez según la concentración de sulfato bárico que se deposita como precipitado visible en el
fondo del tubo. Cada tubo de la escala va numerado y sirve como patrón de referencia, según la cantidad
de microorganismos que se requieran. Cada tubo corresponderá a una determinada concentración de
microorganismos. El inóculo se puede ajustar al patrón de referencia mediante: comparación visual y/o
espectrofotometría.

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 3.8.3. Métodos de inoculación o siembra.
El paso de una muestra microbiana a un medio de cultivo, ya sea líquido o sólido, se denomina
siembra o inoculación.
El paso de una muestra microbiana de un medio de cultivo a otro se denomina resiembra. Toda
siembra, inoculación, o incluso resiembra, se puede realizar de diferentes formas según las
características de la muestra, del medio en el que se van a sembrar o resembrar, del tipo de material que
se utilice, etc. A continuación, se explican los métodos más importantes de siembra o inoculación.

A. Siembra del inóculo en medio líquido

▪ Con asa de siembra: ésta se carga con la muestra problema en condiciones de esterilidad y se
sumerge en el medio líquido agitándola.
▪ Con pipeta Pasteur: se toma un volumen de muestra problema y se vierte al medio de cultivo líquido
agitándose hasta su homogeneización.
▪ Con escobillón o hisopo: el método es igual que con el asa de siembra.

B. Siembra del inóculo en medio sólido

Estas siembras pueden darse en placa o en tubo

B.1. Siembra del inóculo en placa

▪ Técnica de Barry: siembra previa al vertido del medio en la placa. Para ello en el medio de cultivo
previamente fundido (de 20-25 ml de medio a una temperatura de 45-50 ºC) en tubo, se adicionará
la cantidad de inóculo que oscila entre 0,1-0,4 ml y se homogeneiza la muestra en el tubo mediante
vibración. Una vez constituida la muestra, se vierte ésta en la placa Petri estéril y se dejará
solidificar. La mezcla también se podría realizar en la misma placa Petri, aunque la homogeneización en
este caso es más difícil. Esta técnica es utilizada, por ejemplo, para la determinación del CMI de un
antibiótico frente a determinados microorganismos.

▪ Siembra de muestra líquida en placa con asa de Digrasky: consiste en adicionar al medio solido
un inóculo que puede oscilar entre 0,2-1 mL según los casos con pipeta graduada estéril, y
posteriormente se extiende con el asa Digrasky también estéril. Esta técnica se suele utilizar para el
recuento de viables, antibiogramas, etc.

▪ Técnica de Kirby-Bauer: o inoculación sobre la superficie del medio solidificado. Se prepara un

inóculo en un tubo estéril, se introduce un escobillón, también estéril, hasta que quede impregnado. Se
elimina el exceso de inóculo presionando el escobillón contra las paredes del tubo. A continuación, se
siembra la placa empleando la técnica de los tres giros. Dejar secar la placa durante 4-5 minutos en
posición semiabierta e invertida, quedando lista para ser utilizada.

B.2. Siembra del inóculo en tubo

▪ Siembra por estría en tubos con medio sólido inclinado: se toma con asa de siembra
previamente esterilizada por flameado una cantidad de muestra adecuada. Se añade al tubo desde el
fondo de la superficie “del pico de flauta”, realizando movimientos ascendentes en zig-zag hasta
completar toda la superficie del medio. Este método es utilizado para conservar cepas durante largos
periodos, así como para la realización de ciertas pruebas bioquímicas, como, por ejemplo, la prueba de
la ureasa.

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 ▪ Siembra por picadura: se suele tomar con hilo se siembra, aunque en algunas ocasiones también
puede hacerse con asa de siembra. Consiste en introducir el asa cargado con la muestra en el medio de
cultivo, que se encuentra en el tubo, hasta el fondo de éste y en posición central. Esta técnica se utiliza
para la siembra de medios de cultivos semisólidos como, por ejemplo, el medio de oxidación
fermentación de Hugh- Leiffson.

▪ Siembra por picadura y estría: consiste en la utilización de las dos técnicas anteriormente
descritas. Este método se lleva a cabo cuando el medio es sólido y está inclinado. Primero se realiza la
siembra por picadura y posteriormente la siembra por estría; son ejemplos de este tipo de siembra la
prueba en medio KIA y la prueba en medio citrato, entre otras. Se suele realizar con hilo de siembra,
aunque también se puede hacer con el asa de siembra.

3.8.4. Métodos de siembra–aislamiento.

Se realizan siempre en placa y su finalidad es la obtención de cepas puras.

▪ Siembra por agotamiento o aislamiento en estría o en zig-zag: se tomará con el asa de siembra
(previamente esterilizado por flameado) una cantidad adecuada de muestra problema depositando el
inóculo en uno de los extremos superiores de la placa; a partir de aquí se realizará movimientos en zig-
zag de un extremo a otro de la placa, no tomándose en ningún momento nuevo inóculo y no
levantándose el asa hasta concluir la siembra de toda la placa.

▪ Siembra por agotamiento o aislamiento en estría múltiple : se tomará muestra problema con
asa de siembra previamente estéril y dicho inóculo se depositará en el extremo superior de la placa,
extendiéndose de un extremo a otro de ésta, solo en la parte superior. Flameamos el asa de platino y
giramos ligeramente dicha placa repitiendo el proceso anterior que nos permitirá arrastrar la muestra
desde uno de los bordes donde quedo la muestra hasta el otro extremo superior de la placa. Se vuelve
de nuevo a flamear el asa de platino, sin coger muestra como en el caso anterior y siguiendo la misma
dirección, se repite la operación hasta un total de 4-5 veces, que son las que tienen cabida
aproximadamente en una placa, teniendo en cuenta que el último tramo se efectuará hacia el interior de
la misma. El resultado son colonias cada vez más separadas como consecuencia de que cada vez se va
arrastrando y separando más la muestra. Es importante que para separar estas colonias se realice en
cada estría un flameado previo del asa de siembra.

▪ Técnica de los 4 cuadrantes: en la base de la placa (reverso), con un rotulador permanente, se

dibujan dos líneas perpendiculares que deberán cruzarse en el centro de la palca de tal forma que
ésta quede dividida en 4 cuadrantes iguales. Se tomará con el asa de siembra estéril una cantidad de
inóculo y se adicionará en el extremo superior de uno de los cuadrantes extendiéndose por todo ese
cuadrante en forma de zig-zag. Realizaremos la misma operación sin flamear en todos los demás
cuadrantes siguiendo un orden de tal forma que iremos arrastrando el microorganismo problema,
observándose en el último cuadrante las colonias más aisladas o separadas.

▪ Técnica de los 3 giros: Se toma inóculo con el asa de platino y se siembra por estría la mitad
superior de la placa. Sin flamear el asa de platino giraremos la placa unos 90º y volveremos a
sembrar una segunda vez. Así, sucesivamente hasta completar toda la siembra (girando de nuevo la
placa 90º). Esta técnica no es muy utilizada porque no permite buenos aislamientos.

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 ▪ Técnica de siembra por dilución: se dispondrá de una batería de tubos con medio de cultivo
específico o agua estéril según los casos. Se adicionará una cantidad de muestra sólida o liquida en los
tubos sabiendo la cantidad de muestra o inóculo que se añade en el tubo inicial. Se agitará hasta su
homogeneización. Con pipeta estéril se tomará una cantidad específica y se adicionará al segundo
tubo, que se homogeneíza. Repetimos la operación anterior con el tercer tubo y así sucesivamente
-3 -4
hasta obtener la dilución deseada. Con la dilución esperada, por ejemplo 10 y 10 , inocular en
placas de cultivo una cantidad de inoculo exacto y extender con asa Digrasky previamente estéril. Incubar
a temperatura precisa durante 24 horas y posteriormente recontar. Existen muchas variaciones de este
método. Una de ellas es hacerlo en medio de cultivo con agar, donde se mezcla en los tubos muestra
y se diluyen hasta obtener la dilución deseada; posteriormente son vertidos en placa y se deja
solidificar.

3.9. CULTIVOS DE CEPAS

Aunque todo lo referente a cultivos se ha estudiado en el tema correspondiente a cultivos,

señalaremos aquí que tras la preparación de un inóculo y posterior inoculación en el adecuado medio de
cultivo se requerirán una serie de condiciones para que la siembra pueda desarrollarse y realizar
posteriormente los oportunos estudios cualitativos y cuantitativos del microorganismo problema. Así
pues, de acuerdo con lo dicho, todo cultivo de cepas para poder crecer como tal, requerirá de una serie
de condiciones adecuadas, que serán las siguientes:

▪ Temperatura adecuada: en general muchas de las bacterias, especialmente las patógenas, suelen
crecer a temperaturas de 35-37 ºC. Estas temperaturas se podrán establecer de modo continuo en la
siembra deseada gracias a las estufas de cultivo o incubadoras, que controlan de forma constante una
determinada temperatura, al tiempo que protegen el ambiente.

▪ Condiciones de esterilidad: para evitar el crecimiento de otros microorganismos que pudieran

interferir cualquier tipo de determinación en el germen problema es necesario trabajar en condiciones
de esterilidad. De ahí que se requiera de medios cerrados, tales como los tubos con tapones de cierre
hermético o algodón graso o también las palcas Petri diseñadas para mantenerse completamente
cerradas y mantener la esterilidad a la que se somete. Incluso matraces o botellas con cierres
herméticos.

▪ Cantidad suficiente de oxígeno si el microorganismo problema es aerobio proporcionar la cantidad

suficiente de O2 o crear ambientes microaerófilos si el microorganismo es anaerobio facultativo, y crear
una atmósfera ausente de oxígeno si la bacteria es anaerobia. Estas condiciones serán en cada caso
variables según el tipo de metabolismo oxidativo (característico de bacterias aerobias) y/o metabolismo
fermentativo (característico de bacterias anaerobias facultativas) del microorganismo problema. Para
mantener estas condiciones en los medios de cultivo que permitan un normal y adecuado crecimiento
será además importante tener en cuenta como medida de trabajo:

1. ▪ Evitar la apertura de los medios de cultivo, sobre todo, en el periodo de incubación. Se

abrirán solo cuando sea estrictamente necesario.
2. ▪ Controlar la temperatura de las estufas de cultivo, ya que cualquier variación de éstas impedirá
el crecimiento de la siembra.
3. ▪ Verificar las condiciones adecuadas de oxígeno y/o CO 2, según los casos
4. ▪ Rotular adecuadamente los medios, el día y hora en que se efectuó la siembra para
evitar errores y garantizar un análisis fiable.

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 3.10. RECUENTO DE MICROORGANISMOS.

Para el recuento de microorganismos presentes en una muestra de agua, suelo, aire, alimento,
cultivos, entre otros, existen diferentes métodos o ténicas: Algunas técnicas son directa y permiten un
recuento de todas las células tanto las vivas como las muertas. Las medidas directas incluyen los
recuentos directos al microscopio o recuento electrónico, el recuento en placa o el cálculo del número
más probable (NMP).
Otras medidas indirectas y miden una propiedad de la masa de las células como son la turbidez, el
peso seco, etc.

3.10.1. Recuentos directos al microscopio.

Se basa en colocar un volumen determinado de células y realizar el conteo utilizando un
microscopio. Para ello, se utiliza la cámara de recuento de Petroff-Hauser o de Neubauer: Consistente
2
en un portaobjetos con una excavación de 0,02 mm de profundidad en un área de 1 mm , con una rejilla
dividida en 25 cuadros grandes los cuales a su vez se subdividen en 16 cuadros de 4 x 4 o sea que la
muestra se distribuye en 400 celdillas. El recuento celular se calcula así: n x 25 x 50 x 1000=
concentración de células /ml.

3.10.2. Recuentos en placa.

Generalmente la muestra original se diluye para que el número de colonias no exceda las 300
unidades. Cuando la muestra se diluye el cálculo del resultado se realiza contando las colonias en
aquellas placas que tengan entre 30 y 300, se promedia y se multiplica por el factor de dilución. Los
resultados se expresan en unidades formadoras de colonias (UFC), el valor de UFC es un valor que
3
expresa el nº relativo de microorganismos de un taxón determinado en un volumen de un m de muestra.

3.10.3. Recuentos de colonias con contadores.

Para el recuento de colonias se emplean contadores que consisten en una pantalla iluminada la
cual posee una gran lente de aumento. La placa de Petri se ajusta en una plataforma y se ilumina por
debajo y al mismo tiempo la lente aumenta 1,5 veces el tamaño del objeto.

3.10.4. Recuentos en filtros de membrana.

Utilizados cuando el número de bacterias es bajo. Son filtros con un poro de 0,45 mm que
retienen las bacterias. Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre una placa del medio de
cultivo apropiado.

3.10.5. Recuento del número más probable (NMP).

Basado en un método estadístico. Dependiendo del número de microorganismos que
sospechamos que puede tener la muestra, existen distintas tablas de trabajo de números más
probables.

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