Microbiología clínica. UD 3: Medios de cultivo para crecimiento y aislamiento.

UD 3: MEDIOS DE CULTIVO PARA CRECIMIENTO Y AISLAMIENTO

1. Introducción. …………………………………………………………………………………………………….……. 2.

2. Clasificación según su composición de agua. ……………………………………………………………………. 2.

3. Clasificación según su uso. ……………………………………………………………………………………….... 3.

4. Clasificación según su presentación. ………………………………………………………………………….….. 3.

5. Lista de medios más utilizados. ……………………………………………………………………………………. 4.

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Microbiología clínica. UD 3: Medios de cultivo para crecimiento y aislamiento.

1. INTRODUCCIÓN

Los medios de cultivo son preparados para promover el crecimiento bacteriano en condiciones adecuadas de temperatura,
humedad, presión parcial de O2 y pH. Debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y estar exento de
todo MO contaminante.

Constituyentes más utilizados en los medios de cultivo:

- Agar: agente gelificante extraído de las algas que comercialmente se presenta en forma de gránulos o polvo y carece
de valor nutritivo. Su concentración en los medios depende de que se trate de un medio sólido, semisólido o líquido.
- Peptona: Producto de composición variable, rico en péptidos, obtenido mediante hidrólisis ácida o enzimática de
proteína vegetal o animal, a partir de material de hígado, músculo, sangre, leche, etc. La composición dependerá del
material y método de fabricación.
- Extracto de carne: Se obtiene por extracción acuosa mediante maceración de carne de buey. Contiene proteínas,
bases púricas, vitaminas, minerales, etc.
- Extracto de levaduras: Se constituye a partir de levadura e pan o de cerveza y es una fuente rica en aminoácidos y
vitaminas del complejo B como el ácido fólico.
- Sangre: Debe estar libre de agentes antimicrobianos para no inhibir crecimientos. La más utilizada es la de carnero y
caballo aunque también puede usarse la del conejo.
- Suero sanguíneo: Para enriquecimiento.
- Bilis y sales biliares: Inhiben el crecimiento de Gram + (incluso bacilos esporulados) sin afectar al desarrollo de los
bacilos entéricos Gram -.
- Carbohidratos: Se añaden para enriquecer, para promover e crecimiento o la pigmentación y para determinar si los
MO pueden producir ácido y gas a partir de ellos.
- Aditivos: Indicadores de pH, agentes inhibidores como antibióticos, factores de crecimiento, etc.

Condiciones generales para el cultivo de MO:

- Disponibilidad de nutrientes adecuados.

2. CLASIFICACIÓN SEGÚN COMPOSICIÓN DE AGUA

➢ MEDIOS SÓLIDOS:

Proporción de agar SIEMPRE mayor al 15%. Las bacterias y hongos crecen sobre la superficie formando colonias
aisladas. Permiten el aislamiento y la visualización del MO.

➢ CALDOS:

Contienen un 0% de agar. Los MO quedan en suspensión por lo que no hay disponibilidad inmediata de colonias. El
crecimiento es mayor porque el caldo rodea completamente la célula haciendo más fácil la disposición de nutrientes.
Son útiles para enriquecimiento a partir de la muestra, realización de pruebas bioquímicas, recuentos por turbidimetría,
cultivo de levaduras, realización de inóculos y a nivel industrial para otoción de sustancias fabricadas por los MO. Ej:
Caldo tioglicolato y agua de peptona.

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➢ SEMISÓLIDOS:

Contiene menos del 5% de agar. Se utilizan para algunas pruebas bioquímicas, estudios de movilidad bacteriana y
conservación de cepas. Ej: Medio Manitol Movilidad.

3. CLASIFICACIÓN SEGÚN SU USO

➢ USO GENERAL:

Medios ricos que permiten el crecimiento de la gran mayoría de MO. Se emplea en la siembra primaria. Composición:
Fuente de carbono, fuente de nitrógeno, sales y agua. A menudo enriquecidos con sangre, suero, hemoglobina, factor
X y factor V, glutamina u otros factores necesarios para el crecimiento. Ej: Agar sangre, agar Schaedler (agar sangre
para anaerobios), agar Muller – Hinton (para antibiograma), agar nutritivo, agar chocolate (10% de sangre).

➢ ENRIQUECIMIENTO:

Se le añaden elementos como caseína, soja, triptófano, etc. que permiten recuperar bacterias y hongos muy exigentes
en sus requerimientos nutricionales. Ralentizan o suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal presente en
la muestra, potenciando el cultivo y crecimiento deseado. Se utiliza para cepas que no crecen en medios generales
suelen ser líquidos. Ej: Caldo selenito (Salmonelas y Shigellas), caldo tioglicolato, caldo soja – tripticasa, medio con
vitamina K.

➢ MEDIOS SELECTIVOS O INHIBIDORES:

Contienen sustancias que inhiben el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo el crecimiento de otras.
En la mayoría de los casos se añaden antibióticos o antisépticos el medio. Ej: agar Mc Conkey (violeta de genciana
para Gram - ), agar S – S (Salmonella y Shigella en heces) y caldo Selenito (para Salmonella y Shigella).

➢ MEDIOS DIFERENCIALES / DE IDENTIFICACIÓN:

Ponen en manifiesto peculiaridades fisiológicas distintivas de las colonias. Llevan colorantes asociados a indicadores
de pH para provocar respuestas bioquímicas conocidas. Ej: Medio Levine, medios cromogénicos, agar Mc Conkey.

➢ MEDIO DE TRANSPORTE:

Sin nutrientes, semisólidos, muy reductores que inhiben las reacciones enzimáticas autodestructivas dentro de las
células y evitan los efectos letales de la oxidación. Ralentizan el crecimiento de los MO. Ej: Medio de Stuart: Para la
mayor parte de exudados faríngeos, conjuntivales, nasales y de heridas, y Medio de Cary y Blair para muestras fecales
(Se conserva a temperatura ambiente).

➢ MEDIO DE MANTENIMIENTO DE CEPAS:

Son similares a los medios de transporte, contienen un agar nutritivo o similar para mantener las cepas por meses en
refrigeración.

4. CLASIFICACIÓN SEGÚN SU PRESENTACIÓN

- Deshidratados o liofilizados. - Sólidos en tubo.

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5. LISTA DE MEDIOS MÁS UTILIZADOS

Medios con sangre:

➢ AGAR SANGRE:

Su nombre comercial es “Columbia”. Es el medio más utilizado, de uso general y enriquecido con un 5% de sangre de
carnero o cabello. Su uso principal es observar la hemólisis α / β provocada por los MO que producen hemolisinas.
Las hemolisinas α son débiles, provocan una hemólisis parcial que se observa como un halo verdoso alrededor de las
colonias, las hemolisinas β son fuertes, provocan un hemólisis total que se observa como un halo claro alrededor de
las colonias.

➢ AGAR CHOCOLATE:

Medio de uso general para siembra primaria con MO exigentes como Haemophilus, gonococo y meningococo. Llevan
un 10% se sangre de carnero caballo con factor X y factor V. No permite observar la hemólisis.

➢ AGAR CNA:

Su nombre hace referencia a los antimicrobianos que lleva incorporado para impedir el crecimiento de bacterias Gram
– (ácido nalidíxico y colistina). Contiene sangre de cordero o caballo y permite observar la hemólisis. Se emplea para
aislar cocos Gram + en aquellas muestras en las que presumiblemente puede haber presentes muchas bacterias.

➢ AGAR SKIRROW Y AGAR BUTZLER:

Son medios selectivos para Campylobacter spp. a partir, sobre todo, de muestras de heces ya que se trata de un MO
entérico que constituye el principal causante de diarreas en nuestro medio. Ambos medios están enriquecidos con
sangre que aporta nutrientes y destruye los radicales tóxicos producidos durante la exposición al aire. Contienen
antimicrobianos para inhibir Gram +, numerosos Gram – y, en el caso del medio Butzler, también hongos.

Medios sin sangre:

➢ AGAR CLED:

Medio diferencial para aislamiento, recuento e identificación de MO en orina. Contiene lactosa y un indicados
denominado azul de bromotimol. Inhibe el Swarming de Proteus spp.
- Colonias verdes/amarillas: Lactosa +
- Colonias transparentes o verdes azuladas por el color del medio: Lactosa -

➢ AGAR MC CONKEY:

Medio selectivo y diferencial para aislamiento y diferenciación de bacilos Gram – no exigentes, fermentadores o no
fermentadores de lactosa, como enterobacterias, pseudomonas – BNF y otros.
- Colonias rojas: Lactosa + (Se produce una caída del pH debida a los desechos alcalinos producidos en el
metabolismo de la lactosa y la absorción del colorante rojo neutro).
- Colonias transparentes: Lactosa – (Se debe esperar 24 – 48h para determinar si realmente son lactosa – o si son
fermentadores lentos).
Existe también el agar Mc Conkey – Sorbitol, un medio clásico de Mc Conkey en el que se ha sustituido la lactosa por
el sorbitol. La mayoría de colonias de E.coli fermentan el sorbitol, salvo las O157:H7 que no lo hacen.

* No confundir la existencia de colonias lactosa – con el agotamiento de esta en zonas sobrepobladas de la placa.

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➢ AGAR EMB / LEVINE:

Medio selectivo y diferencial para aislamiento, cultivo y diferenciación de bacilos entéricos Gram -, fermentadores o no
de lactosa. Inhibe el crecimiento de Gram + excepto Enterococos.
- Colonias negras/verde brillante metálico: Lactosa + rápidas con producción de ácido. Ej: E.coli.
- Colonias violetas: Dependiendo del tiempo que tarden, entre 24 – 48h serán lactosa + lentas.
- Colonias transparentes: Lactosa – y pueden ser sacarosa + o -.
- Violeta/negro: Lactosa + y sacarosa +.

➢ AGAR ENTÉRICO HEKTOEN:

Es un medio selectivo y diferencial para aislamiento e identificación de patógenos entéricos Gram – (Salmonella y
Shigella). Se utiliza para detección de enterobacterias en cultivos de heces. Lleva fucsina ácida para detectar la
fermentación de los tres azúcares que contiene.
- Colonias naranja/salmón: Lactosa + pero moderadamente inhibidas.
- Colonias azul verdosas con punto negro: El punto negro se corresponde con un precipitado de sal ferrosa por
producción de SH2. Se trata de Salmonella o Proteus (en orina).
- Colonias verdes: Shigella spp.

➢ AGAR SALMONELLA – SHIGELLA:

Comúnmente denominado agar S – S, es un medio diferencial y selectivo que inhibe el crecimiento de cocos. Contiene
sales biliares, citrato, lactosa, rojo neutro y tiosulfato para SH2 gas. Permite utilizar inóculos abundantes.
- Colonias rojas: Lactosa +.
- Colonias amarillas/incoloras con punto negro: Salmonella spp.
- Amarillas/incoloras: Shigella spp.

* Los medios Hektoen y S – S son específicos para Salmonella y Shigella, ya que, sobre todo la Salmonella crece muy mal
porque tiene una dosis infectiva extremadamente baja y as muestras traen poca cantidad del MO. Para solucionar esto se
cultiva primero en un caldo Selenito. Ambos medios contienen sulfato férrico para poder observar el precipitado de SH2.

➢ AGAR TAYER – MARTIN:

Medio selectivo utilizado para el aislamiento de Neisseria sp. De muestras que contienen una gran flora acompañante.
Este medio es un agar chocolate con factores X y V al que se le añaden varios antibióticos a los que son resistentes
la mayoría de los aislados clínicos de Neisseria.

➢ AGAR NAVY – MCNEAL – NICOLLE:

Medio bifásico que consta de agar sangre muy nutritivo que permite el crecimiento de los protozoos flagelados
(Leishmania spp. y Trypanosoma spp.) y una solución líquida. Las muestras de sangre y médula son inoculadas e
incubadas en la fase líquida del medio. Favorece el crecimiento del parásito en su forma extracelular / promastigote
(como si estuviera dentro de su correspondiente vector).

Medios especiales:

➢ MEDIOS CROMOGÉNICOS:

Son medios selectivos y diferenciales preparados empleando cromógenos que se liberan por acción de enzimas
bacterianos, adquiriendo un color inteso tanto la colonia como el medio a su alrededor, poniendo en manifiesto la
presencia del enzima. Al detectar enzimas específicos del género se permite su identificación. Mejoran la capacidad
diferencial de los medios clásicos. Ej: Medios cromogénicos para infecciones urinarias, CPS E (E. coli, Proteus,
Enterococcus spp. y Klebsiellla spp.), ESBL (Enterobacterias productoras de β – lactamasa) y MRSA (Cepas
multirresistentes de S. aureus).

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➢ AGAR SABOURAUD:

Medio diferencial recomendado para el cultivo y crecimiento de hongos. Se puede añadir cloranfenicol o cicloheximido
para hacerlo selectivo.

➢ CALDO TIOGLICOLATO:

Medio general para cultivo de cualquier tipo de MO así como ara comprobar la esterilidad de antibióticos, alimentos y
otros productos. La banda de resazurina (amarilla violácea en la parte superior) indica el estado de oxidación o
anaerobiosis.

➢ CALDO COMÚN:

De uso general, se puede hacer selectivo para distintos grupos de MO.