(practicas, 2021)Investigación de la Cromatografía en Capa Fina

La cromatografía es una técnica científica que consiste en separar los diferentes componentes en mezclas
complejas, para identificar y determinar las cantidades y cualidades de los elementos que las conforman.

Es un método muy valioso utilizado en química y bioquímica para la separación y análisis de una amplia
variedad mezclas de moleculares. Las TLC’s se pueden utilizar para separar mezclas de iones inorgánicos,
moléculas orgánicas y compuestos biorgánicos tales como pigmentos, lípidos, aminoácidos, nucleótidos y
azúcares.

La placa de la TLC consiste típicamente en una gruesa capa de 0,1 mm de material adsorbente unido a una
capa o soporte de plástico. El adsorbente se compone de muchas placas microscópicas. Estas superficies
proporcionan un área grande para la separación cromatografía. Después se aplica un pequeño volumen de
solución de muestra a la superficie adsorbente y se deja secar, la placa se coloca en un vaso de precipitados
que contiene el disolvente apropiado. Sólo el borde de la placa más cercano a las muestras está en contacto
con el disolvente. El disolvente se introduce en el material adsorbente seco y se desplaza hacia arriba a
través de la placa arrastrando las muestras. La tasa de migración de los componentes de la muestra sobre el
adsorbente depende de su estructura química.

El principio usado en este método químico es el de la retención selectiva, que consiste en observar el
diferente comportamiento de los componentes de una mezcla sobre un soporte, como un papel, un gas, un
líquido o una resina.

Por lo tanto, a partir del análisis de la velocidad de retención que tiene cada componente de la mezcla, se
pueden separar para identificarlos y cuantificarlos. Un elemento clave en esta técnica es la adsorción, por la
que las partículas son retenidas sobre una superficie.

Fases de la cromatografía:

Los componentes que conforman las mezclas que se busca identificar se distribuyen en dos fases; la de
reposo o estacionaria (F.E.) y la fase móvil (F.M.):

Fase estacionaria: en esta fase, los componentes de la muestra están retenidos en el soporte adecuado.
Según el tipo de soporte, líquido o sólido, pueden ser planas o en columna.

Fase móvil: En esta fase, el compuesto químico fluirá hasta arrastrar a la muestra obligándola a atravesar la
fase estacionaria.

Según la tecnología que se use, la naturaleza del soporte (F.E.) y de la sustancia móvil (F.M.), se diferencian
varios tipos de cromatografía: Cromatografía en columna, cromatografía en placa fina, cromatografía de
partición, cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, Cromatografía de exclusión
molecular

La cromatografía en capa fina (TLC) es un método de afinidad que se utiliza para separar los compuestos de
una mezcla. La TLC es un método de separación muy versátil que se utiliza ampliamente para el análisis
cualitativo y cuantitativo de las muestras. La TLC puede utilizarse para analizar prácticamente cualquier clase
de sustancia: plaguicidas, esteroides, alcaloides, lípidos, nucleótidos, glucósidos, carbohidratos y ácidos
grasos. Es un método muy valioso utilizado en química y bioquímica para la separación y análisis de una
amplia variedad mezclas de moleculares. Las TLC’s se pueden utilizar para separar mezclas de iones
inorgánicos, moléculas orgánicas y compuestos biorgánicos tales como pigmentos, lípidos, aminoácidos,
nucleótidos y azúcares.
La placa de la TLC consiste típicamente en una gruesa capa de 0,1 mm de material adsorbente unido a una
capa o soporte de plástico. El adsorbente se compone de muchas placas microscópicas. Estas superficies
proporcionan un área grande para la separación cromatografía. Después se aplica un pequeño volumen de
solución de muestra a la superficie adsorbente y se deja secar, la placa se coloca en un vaso de precipitados
que contiene el disolvente apropiado. Sólo el borde de la placa más cercano a las muestras está en contacto
con el disolvente. El disolvente se introduce en el material adsorbente seco y se desplaza hacia arriba a
través de la placa arrastrando las muestras. La tasa de migración de los componentes de la muestra sobre el
adsorbente depende de su estructura química.

En la TLC, la fase estacionaria es una fina capa de material adsorbente, normalmente gel de sílice u óxido de
aluminio, que recubre una superficie de placa inerte, normalmente vidrio, plástico o aluminio. Se deposita
una pequeña cantidad de la muestra en un extremo de la placa de TLC, que se coloca verticalmente en una
cámara cerrada con un disolvente orgánico (fase móvil). La fase móvil se desplaza hacia arriba por la placa
por capilaridad y los componentes de la muestra migran distancias variables en función de sus afinidades
diferenciales por las fases estacionaria y móvil. Cuando el disolvente llega a la parte superior de la placa, ésta
se retira de la cámara de desarrollo y se seca. Los componentes separados aparecen como puntos en la
placa, y se evalúa el factor de retención (RF) de cada componente.

PROCESO Y PRINCIPIOS DE LA TLC

La TLC se basa en el principio clásico de la cromatografía según el cual, los componentes de una mezcla se
separan entre una fase fija estacionaria y una fase móvil líquida por afinidades diferenciales entre las dos
fases.

FACTOR DE RETENCIÓN DE LA TLC (Rf)

El factor de retención (Rf) se utiliza para medir el movimiento de los compuestos a lo largo de la placa de
TLC. Rf se define como la distancia recorrida por un componente dividido por la distancia total recorrida por
el disolvente. Su valor se encuentra siempre entre cero y uno.

Rf = distancia recorrida por el componente

distancia recorrida por el disolvente

En general, cuanto más fuerte se une un compuesto a la fase estacionaria adsorbente, más despacio migra
hacia arriba en la placa de la TLC. Como los adsorbentes de la TLC son normalmente polares, los compuestos
no polares tienden a subir más deprisa por la placa, lo que produce mayores valores de Rf, mientras que los
compuestos polares tienden a moverse más despacio e y tienen menores valores de Rf.
APLICACIONES DE LA TLC

La TLC se utiliza ampliamente en muchas industrias y campos de investigación, como los farmacéuticos, los
ensayos clínicos, la toxicología medioambiental, los alimentos, los análisis del agua y los plaguicidas
pesticidas, y los cosméticos. Las aplicaciones habituales de la TLC son:

 Análisis de residuos farmacológicos y de antibióticos en muestras alimentarias y medioambientales

- Determinar el grado de pureza de un compuesto. Se puede determinar así, por ejemplo, la efectividad de
una etapa de purificación.

- Comparar muestras. Si dos muestras corren igual en placa podrían ser idénticas. Si, por el contrario, corren
distinto entonces no son la misma sustancia.

- Realizar el seguimiento de una reacción. Es posible estudiar cómo desaparecen los reactivos y cómo
aparecen los productos finales o, lo que es lo mismo, saber cuándo la reacción ha acabado.

-La muestra a analizar se deposita cerca de un extremo de una lámina de plástico o aluminio que
previamente ha sido recubierta de una fina capa de adsorbente (fase estacionaria).

Entonces, la lámina se coloca en una cubeta cerrada que contiene uno o varios disolventes mezclados
(ahuyente o fase móvil). A medida que la mezcla de disolventes asciende por capilaridad a través del
adsorbente, se produce un reparto diferencial de los productos presentes en la muestra entre el disolvente y
el adsorbente.

Adsorbentes y ahuyentes

Los dos adsorbentes (fase estacionaria) más ampliamente utilizados son la gel de sílice (SiO2) y la alúmina
(Al2O3), ambas de carácter polar. La alúmina anhidra es el más activo de los dos, es decir, es el que retiene
con más fuerza a los compuestos; por ello se utiliza para separar compuestos relativamente apolares
(hidrocarburos, haluros de alquilo, éteres, aldehídos y cetonas). El gel de sílice, por el contrario, se utiliza
para separar sustancias más polares (alcoholes, aminas, ácidos carboxílicos). El proceso de adsorción se debe
a interacciones intermoleculares de tipo dipolo-dipolo o enlaces de hidrógeno entre el soluto y el
adsorbente. El adsorbente debe ser inerte con las sustancias a analizar y no actuar como catalizador en
reacciones de descomposición. El adsorbente interacciona con las sustancias mediante interacción dipolo-
dipolo o mediante enlace de hidrógeno si lo presentan.
El orden de elución de un compuesto se incrementa al aumentar la polaridad de la fase móvil o eluyente. El
eluyente puede ser un disolvente único o dos miscibles de distinta polaridad. En el siguiente recuadro se
recoge por orden creciente de fuerza eluyente los disolventes más comúnmente empleados.

Hexano < tetraclorometano < cloroformo < diclorometano < acetato de etilo < acetona < 2-propanol <

metanol < agua

En general, estos disolventes se caracterizan por tener bajos puntos de ebullición y viscosidad, lo que les
permite moverse con rapidez. Raramente se emplea un disolvente más polar que el metanol.

Usualmente se emplea una mezcla de dos disolventes en proporción variable; la polaridad de la mezcla será
el valor promediado en función de la cantidad de cada disolvente empleada. El eluyente idóneo para cada
caso ha de encontrarse por "el método del ensayo y del error".

Determinación del Rf

La retención se puede explicar en base a la competencia que se establece entre el soluto a separar y la fase
móvil por adsorberse a los centros activos polares de la fase estacionaria. Así, las moléculas de soluto se
encuentran adsorbidas en la fase estacionaria y a medida que se produce la elución van siendo desplazadas
por la fase móvil. La retención y la selectividad en la separación dependen de los valores respectivos de las
constantes de los diferentes equilibrios químicos que tienen lugar, que están en función de:

- la polaridad del compuesto, determinada por el número y naturaleza de los grupos funcionales presentes.
Los solutos más polares quedarán más retenidos puesto que se adsorben más firmemente a los centros
activos de la fase estacionaria, mientras que los no polares se e luirán con mayor facilidad.

- naturaleza del disolvente. Así, para un mismo compuesto, un aumento en la polaridad del disolvente
facilita su desplazamiento en la placa.

La relación entre las distancias recorridas por el soluto y por el eluyente desde el origen de la placa se
conoce como Rf, y tiene un valor constante para cada compuesto en unas condiciones cromatografías
determinadas (adsorbente, disolvente, tamaño de la cubeta, temperatura, etc.). Debido a que es
prácticamente imposible reproducir exactamente las condiciones experimentales, la comparación de una
muestra con otra debe realizarse eluyendo ambas en la misma placa.

Para calcular el Rf se aplica la siguiente expresión:

Rf = distancia recorrida por el compuesto (X) / distancia recorrida por el eluyente (Y)
La distancia recorrida por el compuesto se mide desde el centro de la mancha. Si ésta es excesivamente
grande se obtendrá un valor erróneo del Rf.

Se recomienda elegir un eluyente en el que los componentes de la mezcla presenten un Rf medio entorno a
0.3-0.5. Para compuestos poco polares, se debe utilizar un disolvente apolar como el hexano.

En el caso de compuestos con polaridad media, se aconseja utilizar mezclas hexano/acetato de etilo en
distintas proporciones. Los productos más polares, requieren disolventes más polares como mezclas de
diclorometano/metanol en distintas proporciones.

Revelado de las placas

La mayor parte de las placas de cromatografía llevan un indicador fluorescente que permite la visualización
de los compuestos activos a la luz ultravioleta (254 nm). El indicador absorbe la luz UV y emite luz visible. La
presencia de un compuesto activo en el UV evita que el indicador absorba la luz en la zona en la que se
encuentra el producto, y el resultado es la visualización de una mancha en la placa que indica la presencia de
un compuesto.

En el caso de compuestos que no absorben luz UV, la visualización (o revelado) del cromatograma requiere
utilizar un agente revelador. Este tiene que reaccionar con los productos adsorbidos proporcionando
compuestos coloreados.

Parte experimental

Material por taquilla Reactivos

-Cámara cromatografía - Disoluciones de 0,5 g en 500 mL de acetato de etilo:

-Probeta de 10 mL (B) - Disolución de ácido benzoico

-2x Erlenmeyer de 25 mL (A) - Disolución de 4-aminobenzoato de etilo

-Regla de 10 cm (F) - Disolución de 9-fluorenona

-6x Placas de cromatografía - Hexano

-2x Micro pipeta - Acetato de etilo

-4x viales de 5 mL - Acetona

-1x pipeta
-1x chupete para pipeta-

Procedimiento

En esta práctica se llevará a cabo la cromatografía en placa fina de tres compuestos orgánicos, ácido
benzoico (B, benzoico), 4-aminobenzoato de etilo (A, amina) y 9-fluorenona (F, fluorenona).

En un vial poner con una pipeta una pequeña cantidad de una muestra disuelta en acetato de etilo (que
cubra el fondo del vial y un poco más). En otros dos viales diferentes poner otra muestra en cada uno de la
misma forma. Las tres disoluciones de las muestras en acetato de etilo estarán ya preparadas.

En una placa de TLC nueva se traza con lápiz una línea a 7-10 mm del borde inferior y se señalan sobre ella
tres puntos equidistantes y no demasiado cerca del borde (como en la figura a, pero con 3 puntos en lugar
de 2).

Con ayuda de un micro pipeta de vidrio se toma una muestra de un vial. Se introduce el micro pipeta y el
líquido sube por ella por capilaridad. Al tocar brevemente la placa con el micro pipeta el líquido se absorbe
en la placa también por capilaridad. Se pincha brevemente tres veces en el punto para conseguir una
mancha de pequeño tamaño que da mejor resolución. Después de poner una mancha se lava la micro pipeta
introduciendo la punta en acetona en un vial, se deja que se llene hasta la mitad y se pincha sobre papel de
filtro para que absorba la acetona. Repetir el lavado tres veces. La pipeta se reutiliza para la siguiente
muestra, repitiendo el proceso de poner la muestra en la placa y el lavado.
La placa de TLC se deposita dentro de una cubeta de cromatografía, a la que previamente se ha añadido una
pequeña cantidad del eluyente deseado. Hay que tener cuidado de que el nivel de eluyente esté por debajo
del punto donde ha sido "pinchado" el producto (Figura c).

Se tapa la cubeta y se deja que el eluyente ascienda por capilaridad.

Antes de que el frente del disolvente llegue al otro extremo de la placa, ésta se saca de la cubeta con unas
pinzas y con un lápiz se hace una señal indicando hasta dónde ha llegado el eluyente (Figura d).

Tras dejar evaporar el disolvente de la placa, revelar la placa mirando en el visor de UV.

Se hacen placas diferentes con distintos eluyentes tal como se indica en el esquema siguiente, estudiando
las muestras de: F (fluorenona), A (amina) y B (benzoico). Se dibujan las placas en el esquema de la cuestión
2 y se anotan los valores de Rf de las placas centrales, que se miden sobre las placas.

Una vez que se ha encontrado el eluyente adecuado para ver las muestras separadas, se estudia una
muestra problema (MP) para averiguar los componentes que tiene, que pueden ser uno o varios de los
compuestos F, A, B utilizados en la práctica, siguiendo el esquema a continuación. Se dibuja la placa y se
ponen los resultados en la cuestión 5.

Referencias
Bioted, E. d. (10 de 02 de 2020). Bioted. Obtenido de Bioted :
https://www.bioted.es/wp-content/uploads/2020/02/PRINCIPIOS-CROMATOGRAFIA-EN-CAPA-FINA-
1.pdf

practicas. (23 de agosto de 2021). uam.es. Obtenido de uma.es: http://www.qfa.uam.es/qb/practicas/P6-

Producción., I. D. (17 de Febrero de 2023). Merk. Obtenido de

Salud, E. i. (2 de marzo de 2022). Dietetica Nutricional y Salud. Obtenido de Dietetica Nutricional y Salud:
https://inensal.com/cromatografia/ - :~:text=La%20cromatograf%C3%ADa%20es%20una%20t
%C3%A9cnica,los%20elementos%20que%20las%20conforman.

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