UT1_fundamentos de la fermentación alcohólica 2016/2017
Fundamentos de la fermentación alcohólica
1.-Introducción.
2.-Levaduras vínicas: morfología, fisiología, condiciones de desarrollo. Curva de crecimiento
microbiano.
3.-Fermentación alcohólica. Concepto, principios bioquímicos.
4.-Factores que influyen en la fermentación.
5.-Utilización de levaduras secas activas (LSA): selección de levaduras, mejora genética,
fabricación, conservación e hidratación. Preparación de un pie de cuba. Comparación en el uso de
levaduras comerciales y levaduras autóctonas.
6.-Problemas fermentativos: Ralentizaciones y paradas fermentativas. Influencia en la calidad del
vino.
7.-Fermentaciones secundarias. Producción de metabolitos secundarios y su efecto en los productos.
8.-Control de la fermentación
1.-introduccion
La fermentación alcohólica es un proceso biológico de la fermentación en plena ausencia de
aire (oxígeno – O2), originado por la actividad de algunos microorganismos que procesan los
hidratos de carbono( por regla general azucares: como por ejemplo glucosa, fructosa, sacarosa
almidón, etc.) para obtener como producto finales : un alcohol en forma de etanol (CH 3-CH2-OH),
dióxido de carbono (CO2) en forma de gas y unas moléculas de ATP (Adenosin trifosfato) que
consumen los propios microorganismos en su metabolismo celular energético anaeróbico. El etanol
resultante se emplea en la elaboración de algunas bebidas alcohólicas, tales como el vino, la cerveza,
la sidra, el cava, etc. Aunque en la actualidad se empieza a sintetizar también etanol mediante la
fermentación a nivel industrial a gran escala para ser empleado como biocombustible.
La fermentación alcohólica tiene como finalidad biológica proporcionar energía anaeróbica a
los microorganismos unicelulares (levaduras) en ausencia de oxígeno a partir de glucosa. En el
proceso las levaduras obtienen energía disociando las moléculas de glucosa y generan como
desechos alcohol y dióxido de carbono CO2.
Las levaduras y bacterias causantes de este fenómeno son microorganismos muy habituales en
las frutas y cereales y contribuyen en gran medida al sabor de los productos fermentados. Una de las
principales características de estos microorganismos es que viven en ambientes completamente
carentes de oxígeno (O2), máxime durante la reacción química, por esta razón se dice que la
fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico.
2. Levaduras vínicas: morfología, fisiología, condiciones de desarrollo. Curva de crecimiento
microbiano.
Las levaduras son hongos microscópicos unicelulares, en su mayor parte pertenecientes al
grupo de los Ascomicetos. Son importantes en el mundo del vino por su capacidad para realizar la
fermentación de los glúcidos.
Los Ascomicetos o Ascomycota constituyen una división dentro del Reino Fungi. Son hongos
con micelio tabicado que producen ascosporas endógenas. Entre los más sencillos destacan las
levaduras responsables de la fermentación.
Modulo: Procesos bioquímicos 1
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Para obtener el vino, las levaduras vínicas, por medio de la fermentación alcohólica
transforman los azúcares de la uva en etanol, anhídrido carbónico y otros compuestos.
Las levaduras son abundantes y se encuentran en el suelo y sobre la vid, la pruina, una
sustancia cérea que recubre la piel de la uva. Cuando se rompe el grano de uva, pasan al mosto.
Aunque existen muchas especies de levaduras, Saccharomyces Cerevisiae, es la más
importante en la elaboración de vinos de calidad. En la actualidad, y gracias a la tecnología, se
pueden seleccionan las mejores cepas de Saccharomyces Cerevisiae, según sus diversas propiedades.
También es posible mejorar este tipo de levadura por técnicas de ingeniería genética, con la finalidad
de obtener un producto de mejor calidad y más uniforme.
La fermentación con levaduras endémicas se llama fermentación espontánea y son de gran
importancia ya que con ellas consiguen características organolépticas típicas de la zona, que no
estarían presentes si se utilizara un inóculo de cepas foráneas. Sin embargo la calidad del producto
puede ser muy variable.
La actividad metabólica de los diferentes géneros y especies de levaduras presentes en la
superficie de las uvas en el viñedo, y capaces de resistir las condiciones de vinificación, influencian
la calidad sensorial del vino obtenido.
Siendo estas las especies Hanseniaspora uvarum (y su forma anamorfa Kloeckera apiculata)
de 50-75% de la población total de levaduras aisladas, y en menor población se han encontrado
presentes los géneros Candida, Cryptococcus, Hansenula, Kluyveromyces, Metschnikowia,
Pichia y Rhodotorula.
Su crecimiento se limita generalmente a los dos o tres primeros días de fermentación, después
de lo cual mueren. Posteriormente, la fermentación con más fuerza y más especies tolerantes al
etanol de Saccharomyces se hacen cargo de la fermentación Aunque contrario a lo que se pensaba,
las especies fermentativas de Saccharomyces se han aislado en muy baja población sobre uvas sanas
y han sido extrañamente aisladas de granos de uva intactos y de suelos de viñedos.
Antes de la maduración, las uvas están casi libre de S. cerevisiae(~ 0,05%), mientras que el
25% de las uvas maduras albergan tales levaduras. Por lo que esto sugiere que S. cerevisiae no se
encuentre en el aire, y que requiere un vector para moverse, probablemente animales, insectos como
abejas y avispas.
Se ha comprobado que estas especies fermentativas están asociadas con el área de la bodega y
que son incorporadas dentro del mosto durante el tratamiento mecánico de la uva y el proceso de
fermentación. La acción secuencial de estos diferentes géneros y especies de levadura, contribuyen al
aroma y sabor de los vinos, determinando la calidad de estos. El aroma y el sabor están dados por los
compuestos volátiles formados durante la fermentación incluyendo alcoholes, ésteres, ácidos
orgánicos, fenoles, tioles, monoterpenos y norisoprenoides. Entre los compuestos volátiles derivados
del metabolismo de la levadura se encuentran los ésteres, alcoholes y acetatos, que en diferentes
combinaciones afectan la calidad del vino.
Estudios en los que se han investigado cultivos iniciadores y levaduras nativas han
demostrado que existen diferencias significativas en la composición química de los vinos resultantes.
Las levaduras del mosto de uva en el inicio de la fermentación del vino se pueden dividir a grandes
rasgos en dos grupos, es decir, las levaduras Saccharomyces cerevisiae y las levaduras no-
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Saccharomyces. Las levaduras de Saccharomyces se derivan principalmente de los equipos de
bodega y en muy bajo número en la uva. Las levaduras no-Saccharomyces, se encuentra
predominantemente en las uvas, pero también en menor número en el equipo de bodega. Por lo que
en la trituración de la uva, y las condiciones ambientales específicas en el mosto, es decir, la presión
osmótica alta, la presencia de SO2, la temperatura y la higiene bodega, todos juegan un papel en la
determinación de las especies que pueden sobrevivir y crecer en el mosto.
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Saccharomyces cerevisiae
Son poco abundantes en los hollejos de la uva madura, y se piensa, que las fermentaciones
espontáneas proceden de las levaduras que están en la bodega.
Es la responsable de la fermentación de la mayor parte de los azúcares del mosto. Su poder
alcohógeno es elevado (17 % vol) y es bastante resistente al SO2 (250 mg/l).
Pueda metabolizar la glucosa y la fructosa tanto por vía respiratoria como por vía
fermentativa, y de crecer en condiciones aerobias o anaerobias.
Es la especie de levadura más importante en microbiología del vino. Es mejor modelo
industrial conocido por su miembro, la levadura S. cerevisiae, pero comprende además ocho especies
estrechamente relacionadas.
Tiene gran capacidad de crecer en el zumo de uva, que se caracteriza por un alto contenido de
azúcares y bajo contenido de sustancias de nitrógeno. La especie produce altas cantidades de etanol a
la vez que consume el contenido de azúcares y baja el pH que inhiben el crecimiento de cepas no-
Saccharomyces.
Además de poseer el fenómeno killer, que implica la secreción, por parte de ciertas cepas, de
una proteína tóxica de baja masa molecular, llamada toxina killer, a la cual ellas son inmunes, que
mata a células sensibles, las cuales pueden ser del mismo o diferentes géneros. Este tipo de
interacciones pueden determinar la evolución de las distintas poblaciones de levaduras durante la
fermentación. En algunas ocasiones una cepa killer de Saccharomyces cerevisiae predomina al final
del proceso fermentativo, sugiriendo que la expresión de la toxina le permitió conducir parte de la
vinificación. Este fenómeno killer puede ser un método alternativo para el control de levaduras no
deseadas.
Estas levaduras también están presentes en el envejecimiento de vinos formando una película
llamada velo de flor, por lo que se llaman levaduras flor, Su crecimiento en la superficie produce
cambios importantes en las características del vino debido a su metabolismo oxidativo.
Las fermentaciones también son impulsadas en gran medida por inoculaciones de una sola
cepa pura de S. cerevisiae seleccionada por el enólogo, que se añade al mosto de uva, después de la
molienda. Para asegurar un mayor control de la vinificación, se obtienen resultados más predecibles
y disminuye el riesgo de deterioro por otros microorganismos. Las levaduras seleccionadas se han
utilizado con excelentes resultados en muchos países, obteniéndose productos finales de calidad más
uniforme que los que se producían con las fermentaciones espontáneas.
Al seleccionar levaduras comerciales se deben tener en cuenta las propiedades de estas y
las características del vino que se quiere producir, tales como la concentración de metabolitos que
toleran o se precisan para iniciar con éxito la fermentación, o la temperatura óptima de desarrollo:
la mayoría lo hace entre 12 y 36º C; si la temperatura óptima es menor de 30º se denominan criófilas,
si se encuentra entre 25 y 35º son mesófilas, y si la temperatura a la que se desarrolla
preferentemente es mayor de 35º C se denominan termófilas.
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A pesar de esto, es más efectivo el uso de cultivos puros de levaduras que procedan de la zona
vitivinícola donde se van a utilizar, lo que se conoce como levaduras locales seleccionadas, ya que se
cree que las levaduras que se encuentran en una microzona son:
Específicas del área.
Totalmente adaptadas a las condiciones climáticas de la zona.
Totalmente adaptadas a la materia prima, es decir al mosto a fermentar.
Responsables, al menos parcialmente, de las características únicas de los vinos obtenidos.
No- Saccharomyces
Las levaduras no- Saccharomyces en la producción de vino se han considerado
principalmente como organismos de descomposición. Los metabolitos de descomposición más
importantes producidos por estas levaduras son el ácido acético, acetaldehído, acetoína y acetato de
etilo, junto con malos olores, tales como el vinilo y etilfenoles, que están relacionados con el
desarrollo de Brettanomyces / Dekkera spp . Afirmando además, que murieron durante las etapas
iniciales de la fermentación debido a la toxicidad de la concentración de alcohol al aumentar el
metabolismo de Saccharomyces.
Aunque se ha demostrado que algunas sobreviven durante la fermentación, y que además los
metabolitos formados por algunas especies no- Saccharomyces pueden contribuir a la calidad del
vino, por ejemplo la producción de glicerol por Candida stellata y la producción de éster por
Candida pulcherrima que, en algunos vinos pueden tener una influencia positiva en la calidad del
vino. Otras especies, tales como Kloeckera apiculata, se asocian con la producción de ácido acético
que puede ser perjudicial para la calidad del vino.
Algunas especies no-Saccharomyces también poseen actividad ß-Glucosidasa que pueden
hidrolizar los precursores del aroma. Por lo que la actividad inicial de las levaduras no-
Saccharomyces en el mosto de fermentación se considera importante para el perfil final de
compuestos aromáticos de los vinos, debido a que estas levaduras son responsables de diferentes
reacciones enzimáticas en el desarrollo de una amplia gama de los productos finales volátiles y no
volátiles.
La producción de exo y endonucleasas por estas levaduras juega un papel muy importante,
como lo son las pectinasas que tiene algunas aplicaciones de clarificación, filtración y también la
extracción de color del vino. El uso de enzimas pectolíticas para la maceración también puede
aumentar el contenido en jugo de terpenol. Otras enzimas son las esterasas formadoras de
compuestos del aroma del vino y las lipasas que degradan los lípidos procedentes de la uva.
Fermentaciones mixtas
La fermentación mixta se realiza usando cultivos de Saccharomyces cerevisiae y levaduras
no- Saccharomyces y representa una forma viable hacia la mejora de la complejidad y la mejora de
las características particulares y específicas de los vinos.
Las posibles interacciones sinérgicas entre diferentes levaduras pueden proporcionar una
herramienta para la aplicación de las nuevas tecnologías de fermentación.
Por lo tanto, el conocimiento de la interacción de estas levaduras durante la fermentación del
vino necesita ser mejorado. Se ha demostrado que cuando algunas levaduras se desarrollan juntas en
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condiciones de fermentación, no lo hacen pasivamente, sino más bien interactúan. En la siguiente
tabla se muestran algunas interacciones de las levaduras Saccharomyces y no- Saccharomyces.
La importancia de las levaduras es su acción sobre la composición y también ejercen un
efecto sobre el perfil aromático del vino. Es importante considerar también que durante la
fermentación alcohólica, la levadura produce aromas fermentativos, lo mismo que sucede cuando
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puede actuar sobre el color, la textura y el perfil aromático de los vinos. Por lo que su elección en
fermentaciones inoculadas debe ser teniendo en cuenta el perfil de producto que se desea obtener. Y
en el caso de las fermentaciones espontáneas es de suma importancia conocer la diversidad de la
población de levaduras nativas en el entorno para el monitoreo de la fermentación.
Morfología y fisiología de las levaduras
Las dimensiones de las levaduras se sitúan entre unos límites que son bastantes amplios,
desde 1 a 5 μm de anchura, por 1 a 28 μm de longitud, estimándose en un mosto en fermentación que
desarrollan una superficie del orden de 10 a 15 m2 por litro de mosto.
En cuanto a su forma, suele permanecer constante para cada especie, tomando un aspecto
característico y bien definido, dependiendo también del tipo de reproducción:
Subesférico o elíptico para la S. cerevisae.
Alargado para la S. pastorianus.
Limoniforme para la Kloeckera apiculata.
Bacilar para la Schizosaccharomyzes.
Cilíndrico para la Candida mycoderma.
Redondeado para Torulopsis.
Las células de estas levaduras están rodeadas por una pared celular rígida que les permite resistir
los importantes cambios de presión osmótica que pueden tener lugar en el medio extracelular. En el
interior de la célula nos encontramos con el espacio periplásmico, que es donde se secretan las
diversas proteínas, y la membrana plasmática, que rodea el citoplasma y presenta diversos
mecanismos que determinan su papel como la principal barrera y control de la permeabilidad.
Las levaduras contienen diversos orgánulos subcelulares característicos de las células eucariotas.
Así nos encontramos con un núcleo rodeado por membrana, retículo endoplásmico liso y rugoso,
aparato de Golgi, mitocondrias y vacuola, entre otros.
Existen numerosos enzimas situados en el citoplasma que están muy vinculados con aspectos
metabólicos que se estudiarán más adelante. También las mitocondrias tienen un papel fundamental,
aunque pueden existir Saccharomyces sin mitocondrias.
A continuación se observan algunos tipos de las levaduras más comunes.
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Reproducción de las levaduras Las levaduras verdaderas pueden reproducirse por esporulación,
gemación o fisión.
Gemación. Proceso asexual, en el cual la célula progenitora reparte sus constituyentes
celulares con una célula hija (sin división del núcleo); las dos células son iguales en su
madurez.
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Esporulación. Proceso de reproducción sexual; en el ciclo sexual, una célula diploide normal
(una célula con dos conjuntos de cromosomas y por consiguiente con dos dotaciones de
genes) da lugar por meiosis a dos ascas o células esporogéneas, que contienen cuatro
ascosporas haploides (más fácil: células con una sola dotación cromosómica y de genes). Las
ascosporas son de dos tipos sexuales: a y alpha. Cada tipo puede desarrollar células haploides
por gemación. La unión de una célula haploide “a” con otra “alpha” da lugar a una célula
normal diploide a/alpha. Las células haploides del mismo sexo pueden también unirse
ocasionalmente, formando células diploides anormales (a/a o alpha/alpha) que sólo pueden
reproducirse asexualmente por gemación.
Fisión. Reproducción vegetativa o asexual, semejante al proceso reproductor de las bacterias.
Las células aumentan de tamaño y se alargan, el núcleo se divide y se originan dos células
semejantes.
Condiciones de desarrollo de las levaduras
Como todos los seres vivos, las levaduras tienen necesidades precisas en cuanto al medio en que
viven y a su nutrición. Son muy sensibles a la temperatura, necesitan oxígeno, una alimentación
apropiada en azúcares, en elementos minerales, en sustancias nitrogenadas y en factores de
crecimiento.
Temperatura. La temperatura afecta la capacidad de desdoblar los azucares, la reproducción
y el crecimiento celular.
o T. mínimas de 0.3 y 0.5°C T.
o máximas entre 34 y 47ºC.
PH. Cambios en el pH son causantes de la desnaturalización de enzimas y de problemas en el
intercambio de iones en la membrana celular. En la fermentación de levaduras los valores de
pH entre 3 y 6 generalmente favorecen el crecimiento y la actividad fermentativa.
Aireación. Las levaduras requieren O2 para su multiplicación ya que interviene en la síntesis
de ácidos grasos y esteroles, constituyentes de la membrana celular y responsables de su
permeabilidad.
La parte más importante de la levadura es la membrana, a través de la cual se producen los
intercambios de manera activa. Las levaduras sintetizan dos sustancias: esteroles (ergosterol) y
ácidos grasos insaturados, son los llamados factores de supervivencia. Para ello es esencial la
permeabilidad de la membrana y la integridad celular, pudiendo morir por un mal funcionamiento.
Estos factores de supervivencia lo tienen de manera limitada, disminuyendo a medida que
aumenta la población. Las levaduras son capaces de fabricarlo pero para ello es imprescindible el
oxígeno Las levaduras pueden ser:
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Aerobias ,levaduras que se desarrollan en presencia de oxigeno libre.
Anaerobias, levaduras que se desarrollan en ausencia de oxígeno libre.
Anaerobias facultativas, levaduras que se desarrollan tanto en ausencia como en presencia de
oxigeno libre.
Nutrición. Las levaduras fermentativas necesitan los azúcares para su catabolismo, es decir
para obtener la energía necesaria para sus procesos vitales, pero además necesitan otros
substratos para su anabolismo como son nitrógeno, fósforo, carbono, azufre, potasio,
magnesio, calcio y vitaminas, especialmente tiamina (vitamina B1). Por ello es de vital
importancia que el medio disponga de una base nutricional adecuada para poder llevar a cabo
la fermentación alcohólica en la producción de vinos.
o Nitrógeno: Las estructuras de las células están compuestas de proteínas y estas, a su
vez, por aminoácidos. Todos los aminoácidos llevan nitrógeno, imprescindible para
formar estructuras, y por lo tanto por la multiplicación de levaduras. Uno de los
análisis básicos en el mosto es el NFA (Nitrógeno fácilmente asimilable). Es
necesario que el mosto contenga inicialmente nitrógeno amoniacal y en forma de
aminoácidos por encima de 150 mg/l.
Una consecuencia de escasez de nitrógeno, es el crecimiento de la población de
levaduras limitado, que puede llevar consigo una fermentación lenta o incluso una
parada de fermentación, por lo que se debe controlar el aporte de Nitrógeno.
Fuentes de nitrógeno:
-Nitrógeno inorgánico (amoniacal NH4+), generalmente de sales de amonio como el
sulfato amónico, fosfato diamónico. El amonio es rápida y completamente utilizado
en pocas horas después de la adición, pero produciéndose de nuevo deficiencias, que
se deberán corregir lo antes posible.
-Nitrógeno orgánico (aminoácidos). Son absorbidos más lentamente pero después no
hay deficiencias, lo cual es de vital importancia en la fermentación.
Las uvas muy maduras tienen poco nitrógeno y las levaduras tecnológicas últimas
son muy exigentes en las necesidades de nitrógeno, la dosis de N.F.A. depende del
tipo de levaduras que añadamos, ya que cada una tiene distintas necesidades.
o Nutrientes complejos (micronutrientes). La parada fermentativa puede venir dada
por una escasez de nutrientes, de ahí que se analice el NFA. Los enólogos quieren un
final rápido de fermentación y ausencia de defectos organolépticos (aromas raros).
Así pues, para evitar problemas de cinética y sensoriales, además de añadir nitrógeno
también se usan vitaminas minerales. Existen nutrientes en forma de oligoelementos
que están prohibidos adicionarlos al vino o mosto. Por ello se utilizan levaduras
inactivas (muertas) que previamente han estado multiplicándose en medios ricos en
oligoelementos, que sí están autorizadas, nunca se deben adicionar productos no
autorizados .
-La tiamina es la única vitamina que está autorizada. Al adicionarla al mosto hay que
tener cuidado ya que puede ser captada por las levaduras indígenas.
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Curva de crecimiento microbiano
El concepto asociado al crecimiento microbiano, corresponde al aumento poblacional de una
especie microbiana en un medio de cultivo provisto de todas las necesidades del microorganismo
(Cantidad de Nutrientes, Temperatura, Grado de Humedad, Gases y pH).
Las curvas de crecimiento microbiano constan de 4 etapas bien definidas, aunque el tiempo de
duración de cada una de estas etapas, puede variar según el tipo de levadura y la familia a la cual este
pertenece, entre otras características. ·
Fase de Latencia. Corresponde a un período de transición para los microorganismos cuando
son transferidos a una nueva condición. En esta fase no hay incremento en el número de
células, aunque sí una gran actividad en el metabolismo.
Fase de Crecimiento Exponencial: Período en que el crecimiento del microorganismo ocurre
de forma exponencial, es decir, cada vez que pasa un determinado tiempo la población se
duplica.
Fase Estacionaria: Período en que ocurren las limitaciones del crecimiento, ya sea por
agotamiento de algún nutriente esencial, por acumulación de productos tóxicos o por una
combinación de las causas anteriores.
Fase de Muerte: Luego que culmine la fase estacionaria, comienza una progresiva
disminución en el número de células viables, cuando esto ocurre se dice que la población ha
entrado en fase de muerte.
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