“AÑO DEL FORTALECIMIENTO DE LA SOBERANÍA NACIONAL”
UNIVERSIDAD NACIONAL DE
PIURA
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA PROFESIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Géneros: Micrococcus y Staphylococcus
INFORME N° 02
CURSO : Microbiología de Alimentos
INTEGRANTES :
Chamba Ordinola Pedro Honorato
Coveñas Pulache, Viviana Lizeth
Gonzales Palomino Luis Miguel
DOCENTE : Blgo. María Dorothy Torres de León. MSc.
SEMESTRE ACADÉMICO : 2022-I
PIURA- PERÚ
2022
INTRODUCCIÓN
Los miembros del género Staphylococcus y Micrococcus son catalasa positivos y
hasta hace poco formaban parte de la familia Micrococacceae junto a los géneros
Planococcus y Stomacoccus. Estudios genéticos han demostrado que Staphylococcus y
Micrococcus no están relacionados. Tentativamente el género Staphylococcus se colocó
dentro de la familia Bacillaceae junto a otros géneros, Bacillus, Gamella, Listeria,
Planococcus, etc. Los estafilococos son cocos Gram positivos, catalasa positivos y el diamino
ácido en el peptidoglicano es la L-lisina. El género Staphylococcus posee alrededor de 30
especies, de las cuales destacaremos S. aureus, S. saprophyticus y S. epidermidis.
(Bannerman- 2003)
Los Staphylococcus son células esféricas grampositivas por lo general dispuestas en
racimos irregulares parecidos a las uvas. Se desarrollan rápidamente en muchos tipos de
medios y tienen actividad metabólica, fermentan carbohidratos y producen pigmentos que
varían desde un color blanco hasta un amarillo intenso. Algunos son miembros de la
microbiota normal de la piel y mucosas del ser humano; otros causan supuración, formación
de abscesos, diversas infecciones piógenas e incluso septicemia letal. (Chapin- 2003)
El género Staphylococcus tiene por lo menos 40 especies. Las cuatro especies
encontradas con mayor frecuencia y las más importantes desde el punto de vista clínico son
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus lugdunensis y
Staphylococcus saprophyticus. S. aureus es coagulasa positivo, lo cual lo distingue de otras
especies. S. aureus es un patógeno importante en el ser humano. Casi todas las personas
presentarán algún tipo de infección por S. aureus durante su vida, la cual fluctúa en gravedad
desde una intoxicación alimentaria o infecciones cutáneas leves hasta infecciones graves que
ponen en riesgo la vida. (Prieto-1996).
El agar manitol salado se usa con frecuencia con este propó- col. sito. Este agar
contiene una concentración elevada de sal (10%), el azúcar manitol y rojo fenol como
indicador de otro pH. En este medio los microorganismos como S. aureus, bien que pueden
crecer en presencia de sal y fermentar el manitol producen colonias rodeadas por un halo
amarillo. Para que se detecte crecimiento en agar manitol salado se requiera una incubación
de al menos 48 a 72 horas. (Bailey-2007).
La prueba de DNasa no puede ser confiable como el único criterio para la
identificación de S. aureus subesp. aureus, pero cuando las cepas dan reacciones de
coagulación dudosas (1+ 02+ en la prueba de coagulasa) un resultado de DNasa positivo
confirma S. aureus subesp. Aureus. Morton y Cohn, establecieron que la coagulasa y la
DNasa pueden ser útiles para identificar S. aureus subesp. aureus, pero estas propiedades no
deben tomarse como indicación de patogenicidad ni como su ausencia, es decir, falta de
patogenicidad. No existe ninguna prueba in vitro confiable para determinar la potencial
patogenicidad de los estafilococos para el hombre. La confianza total en la producción de
DNasa para detectar S. aureus subesp. aureus coagulasa positivo puede dar como resultado
el hecho de pasar por alto algunos estafilococos. (Jean-2000).
Se utilizan diversos medios para el aislamiento de Staphylococcus aureus, que
desempeña un papel muy importante en los casos de intoxicación por alimentos e infecciones
clínicas humanas. La fórmula del presente agar Baird-Parker fue publicada en 19621. Es un
medio parcialmente selectivo que utiliza la capacidad de los estafilococos de reducir el
telurito a telurio y detectar la lecitinasa a partir de la lecitina del huevo. (Lancette-2001)
El objetivo de la práctica fue:
• Describir las diferentes pruebas bioquímicas y su aplicación en la determinación de
los géneros Micrococcus y Staphylococcus presentes en los alimentos.
II. MATERIALES Y MÉTODOS:
MATERIALES:
• Tubos con caldo nutritivo
• Tubos con agar nutritivo
• Placas de Petri con agar manitol salado
• Placas de Petri con agar Baird Parker
• Placas de Petri con agar DNAsa
• Placas de Petri con agar gelatina
• Placas de Petri con agar difosfato de fenolftaleina
• Tubos con caldo ICC
• Tubos con agar cisteinado
• Tubos con agar manitol con PBC
• Tubos con agar Hugh Leifson
• Pipetas Pasteur
• Asa de Kolle
REACTIVOS:
• HCl 1 N
• Hg Cl2
• Amoníaco
• Plasma oxalatado de conejo o desecado
• Vaselina
PROCEDIMIENTO:
1. Disponer de cultivos jóvenes de cepas sospechosas de ser cocos para proceder a
su coloración de Gram.
2. Proceder a las siembras de los tubos y placas con medios de cultivo para las
pruebas bioquímicas de identificación.
A. CATALASA
Sobre un portaobjeto limpio se colocó una fracción del crecimiento bacteriano. Dicho
portaobjeto se cubrió con gotas de agua oxigenada.
Culminado el proceso anterior, se realizó la lectura correspondiente.
B. AGAR MANITOL-SALADO
En la superficie del medio de cultivo en placas de Petri con ayuda de un Asa de Kolle
se sembró por agotamiento en estría.
Dichas placas e Petri pasaron a incubación con el medio AMS a una temperatura, la
cual fue de 37°C por un tiempo, el cual fue de 24-48 horas.
Culminado el proceso anterior, se realizó la lectura correspondiente.
C. AGAR BAIRD PARKER
En la superficie del medio de cultivo en placas de Petri con ayuda de un Asa de Kolle
se sembró por agotamiento en estría.
Dichas placas e Petri pasaron a incubación con el medio ABP a una temperatura, la
cual fue de 37°C por un tiempo, el cual fue de 24-48 horas.
Culminado el proceso anterior, se realizó la lectura correspondiente.
D. DNasa
Con asa de Kolle se sembró por agotamiento en estría en la superficie del medio de
cultivo. Luego se incubo las placas de Petri con el medio Agar DNasa a 37oC por 24 hrs.
Se procedió hacer lectura de los medios en la forma siguiente:
Se cubrió la superficie del medio con HCl N/1. Se observó las zonas claras alrededor
del desarrollo microbiano, presencia de desoxirribonucleasa.
E. GELATINASA
Con asa de Kolle se sembró por agotamiento en estría en la superficie del medio de
cultivo, luego se incubo las placas de Petri con el medio Agar Gelatina a 37oC por 24
hrs. Después de haber transcurrido las horas se procedió hacer la lectura de los medios en
la forma siguiente: Se cubrió la superficie del medio con Sol. HgCl2 se eliminó después
de 5’ y se lavó con agua corriente. Reacción positiva: zona clara rodea la estría.
F.- DIFOSFATO DE FENOLFTALEÍNA
Se sembraron las cepas sospechosas por agotamiento en estría en la superficie del
medio de cultivo. Se incubaron las placas de Petri con el medio agar difosfato de
fenolftaleina a 37ºC por 24 hrs. Y se realizó la lectura de los medios, exponiendo las
colonias a los vapores del amoniaco y observando la aparición de una coloración rojo
brillante, que indica colonias fosfatasa (+).
G.- COAGULASA
Se sembraron las colonias en estudio en el caldo ICC (Infusión Cerebro Corazón) y
se incubó a 37ºC por 18 hrs. A partir de ese cultivo se efectuó la prueba coagulasa:
mezclando 0.5 ml del cultivo con 0.5 ml del plasma oxalatado de conejos o plasma
desecado, controlado previamente; y se incubó la mezcla a 37ºC x 1hrs.- 2 hrs. - 24 hrs.
La lectura se realizó mediante la observación de perdida de fluidos del plasma o coagulo
más o menos grande.
DIFERENCIACIÓN DE MICROCOCCUS Y STAPHYLOCOCCUS
A.- AGAR CISTEINADO
Se inició regenerando el medio de cultivo antes de la siembra (10/ B.M. hirviente), y
se conservó a 50°C. Posteriormente se sembró por picadura profunda con pipeta Pasteur,
una traza de suspensión espesa emulsionando en la totalidad del tubo. Se dejó enfriar en
agua helada en posición vertical.
Culminado este tiempo, se incubó a 37°C por 48 hrs, se procedió a realizar las
observaciones.
B.- AGAR MANITOL CON PBC (púrpura de bromocresol)
Se regeneró el medio de cultivo antes de la siembra (10/ B.M. hirviente), conservado
a 50°C, se sembró por picadura profunda con pipeta Pasteur, realizando una traza de
suspensión espesa emulsionando en la totalidad del tubo, se dejó enfriar en agua helada
en posición vertical el tubo.
Posteriormente se incubó a 37°C por 2-4 días, y se realizó las observaciones
correspondientes.
C.- HUGH LEIFSON U OXIDO-FERMENTACIÓN
Se realizó una siembra por puntura profunda en dos tubos con agar en columna del
medio Hugh Leifson. Posteriormente uno de los tubos se cubrió con una capa de vaselina.
Se dejaron incubar a 37°C por 48 hrs, realizando las observaciones respectivas.
III. RESULTADOS
A. CATALASA
Se añade 2 o 3 gotas de
Peróxido de hidrógeno
Bacillus subtilis
Staphylococcus sp
Escherichia coli
B. AGAR MANITOL-SALADO
Se observó un ligero cambio de color a
amarillo en el medio originalmente
rosado, por la presencia de indicadores
de pH. Siendo Manitol Negativo.
La alta concentración de cloruro de sodio resulta en una inhibición total o parcial de
microorganismos no pertenecientes al género Staphylococcus. La fermentación del
manitol es evidenciada por un cambio del indicador rojo fenol, lo que permite la
diferenciación de las especies de este género.
C. AGAR BAIRD PARKER
Se observan colonias negras en el
medio. Deduciéndose presencia de
Staphylococcus.
D. DNasa
Zonas claras rodeando la colonia Si no se produce DNasa, el área que rodea a
indican presencia de DNasa las colonias contiene el ADN precipitado
E. GELATINASA
F.- DIFOSFATO DE FENOLFTALEÍNA
CROMÓGE
F.- COAGULASA
activa
DIFERENCIACIÓN ENTRE MICROCOCCUS Y STAPHYLOCOCCUS
A.- AGAR CISTEINADO
a. b. Medio Agar cisteinado
Sustrato Cisteina
Prueba positiva para Desarrollo en la totalidad del
Staphylococcus tubo
Prueba positiva para Desarrollo en la parte
Micrococcus superficial del tubo,
formando un disco
a.- Reacción (+): Género Staphylococcus se desarrolla en todo el tubo, extendiéndose
de la zona de picadura.
b.- Reacción (+): Género Micrococcus se desarrolla en la superficie del tubo
El agar cisteinado es un medio diferencial, que permite determinar que
microorganismos pueden sobrevivir bajo sus condiciones.
B. AGAR MANITOL CON PBC
a. b.
Medio Agar sal manitol con PBC
(púrpura de bromocresol)
Enzima Lactasa
Sustrato Lactosa
Producto Ácidos, alcohol y gases
Indicador de pH Púrpura de bromocresol
Prueba positiva Producen ácido tanto en
para anaerobiosis (fermentación)
Staphylococcus
Prueba positiva Produce ácido sólo en
para Micrococcus aerobiosis (oxidación)
Por la fermentación del manitol y formación de ácidos genera el viraje de color,
por la presencia de púrpura de bromocresol como indicador de pH.
C.- HUGH LEIFSON
Capa de
vaselina
a. b. c. d.
a.- Reacción Inerte: No se presenta cambio de coloración en el medio de ninguno de
los tubos.
b.- Reacción Fermentación: Viraje de color amarillo en ambos tubos.
c.- Reacción Oxidante: Viraje al amarillo en la superficie del medio que no presenta
vaselina.
b.- Reacción Alcalinizantes: El medio que posee capa de vaselina presenta una
coloración azul en su superficie.
Medio Medio de Hugh Leifson
Sustrato Glucosa
Producto Ácidos
Reactivo revelador Kovacs
IV. DISCUSIÓN
A. CATALASA
MacFaddin (2004) afirma que H2O2 es un producto final oxidativo de la degradación
aerobia de los azucares. Nos dice que las catalasas, las peróxidasas y la superóxido
dismutasa (SOD) eliminan en forma catalítica los intermediarios de la reducción del
oxígeno. La SOD elimina de manera catalítica el anión superóxido (O2-); la catalasa, el
H2O2. Ambas enzimas son esenciales en la defensa biológica contra la toxicidad del
oxígeno. La catalasa se diferencia de la peroxidasa por los reactivos y productos en la
reacción catalítica del peróxido; lo que caracteriza a la catalasa, y lo que se utiliza como
prueba en el análisis experimental es la liberación de O2(g), a través de un burbujeo
perfectamente visible en las placas con agar nutritivo.
B. AGAR MANITOL-SALADO
Según Bannerman (2003) el agar sal manitol en una fórmula diseñada por Chapman
para la diferenciación de estafilococos positivos a la coagulasa (por ejemplo,
Staphylococcus aureus) de los estafilococos negativos a la coagulasa. Este agar se utiliza
para el aislamiento de estafilococos a partir de muestras clínicas, de cosméticos y de
pruebas de límite microbiano.
El agar sal manitol contiene peptonas y extractos de carne bovina, que suministran
los nutrientes esenciales. Una concentración de cloruro sódico de 7,5% tiene como
resultado una inhibición parcial o completa de los organismos bacterianos diferentes de
los estafilococos. La fermentación de manitol, indicada por el cambio del indicador de
rojo fenol, facilita la diferenciación de la especie de estafilococos. Los estafilococos
positivos a la coagulasa (por ejemplo, Staphylococcus aureus) producen colonias de color
amarillo y un medio circundante de color amarillo, mientras que los estafilococos
negativos a la coagulasa producen colonias de color rojo y no producen cambio de color
en el indicador de rojo fenol.
C. AGAR BAIRD PARKER
Según Flowers et al. (1993) se utilizan diversos medios para el aislamiento de
Staphylococcus aureus, que desempeña un papel muy importante en los casos de
intoxicación por alimentos e infecciones clínicas humanas. La fórmula del presente agar
Baird-Parker es un medio parcialmente selectivo que utiliza la capacidad de los
estafilococos de reducir el telurito a telurio y detectar la lecitinasa a partir de la lecitina
del huevo. El agar Baird-Parker se utiliza ampliamente y se incluye en numerosos
procedimientos estándar para el análisis de alimentos, cosméticos o agua de piscinas con
el fin de detectar la presencia de Staphylococcus aureus
Además, BD Baird-Parker Agar contiene las fuentes de carbono y nitrógeno
necesarias para el crecimiento. La glicina, el cloruro de litio y el telurito potásico actúan
como agentes selectivos. La yema de huevo constituye el sustrato para determinar la
producción de lecitinasa y, además, la actividad de lipasa. Los estafilococos producen
colonias de color de gris oscuro a negro debido a la reducción del telurito; los
estafilococos que producen lecitinasa descomponen la yema de huevo y crean zonas
transparentes alrededor de las colonias correspondientes. Es posible que se forme una
zona de precipitación debido a la actividad de lipasa. El medio no debe utilizarse para el
aislamiento de estafilococos diferentes de S. aureus.
D. DNasa
Algunas bacterias excretan nucleasas que despolimerizan el DNA. Se hace una estría
gruesa una placa conteniendo DNA. Se revela después de incubar con HCL 0,1 N que
precipita el DNA no hidrolizado.
Después de la aplicación y penetración del ácido clorhídrico en el medio, los
organismos positivos a la DNasa, tal como Staphylococcus aureus o Serratia marcescens
estarán rodeados de zonas transparentes de ADN despolimerizado, mientras que el medio
más alejado de la banda de inoculación tendrá un aspecto opaco y blancuzco debido al
ADN polimerizado. Las colonias de organismos con resultado negativo a la DNasa no
presentarán zonas transparentes alrededor de las colonias.
Morton y Cohn, establecieron que la coagulasa y la DNasa pueden ser útiles para
identificar S. aureus subesp. aureus. La confianza total en la producción de DNasa para
detectar S. aureus subesp. aureus coagulasa positivo puede dar como resultado el hecho
de pasar por alto algunos estafilococos. (Jean-2000).
E. GELATINASA
La mayoría de los polímeros son demasiado grandes para ser transportados dentro de
las células. Las bacterias excretan enzimas extracelulares que hidrolizan esos polímeros
transportando al interior de la célula en monómeros que les sirven para crecer.
La producción de proteasas es evaluada por incorporación de una proteína (gelatina
o caseína) en un medio sólido en placa. La placa se inunda con ácido que precipita la
proteína no hidrolizada.
Un precipitado blanco indica presencia de gelatina no hidrolizada; la ausencia del
precipitado en la región de crecimiento bacteriano indica hidrólisis de la gelatina.
F.- DIFOSFATO DE FENOLFTALEÍNA
La producción de fosfatasa se determina por la liberación de fenolftaleína, indicada
por un cambio de color en el medio. La fenolftaleína reacciona con u alcalí para dar un
color rosa a rojo brillante. (MacFaddin, 2004)
La ftaleína es un compuesto del anhídrido ftálico como un fenol o derivado fenólico
que contiene un anillo lactona de cinco lados. EL anhídrido ftálico combinado con dos
moléculas de fenol forma el compuesto fenolftaleína. (MacFaddin, 2004)
Cuando la fenolftaleína es neutralizada, el alcalí se une al grupo C=O, se rompe el
anillo de lactona y se forma un quinoide e uno de los anillos bencénicos. (MacFaddin,
2004)
Ciertos radicales fundamentales conocidos como cromóforos so responsables del
color producido por ciertos compuestos: C=C, C=O, C=S, C=N, N=N, N=O y NO2.
Cuantos más de estos grupos se presentan en el mismo compuesto, más intenso es el color
producido. (MacFaddin, 2004)
En los compuestos de benceno, los radicales cromóforos se denominan cromógenos,
compuestos coloreados, pero no colorantes, ya que ellos no tienen afinidad por los tejidos
o las fibras. En la fenolftaleína, el cromógeno tiene una estructura quinoide (quinona),
que contiene dos grupos C=O. La estructura quinoide otorga al compuesto un color rosa-
rojo; sin embargo, este color desaparece si la solución es acidificada de nuevo, debido a
la pérdida de la estructura quinoide y al restablecimiento de la forma fenólica.
(MacFaddin, 2004)
G.- COAGULASA
La estafilocoagulasa (coagulasa), la enzima producida por S. aureus, es relativamente
estable al calor y resiste temperaturas de hasta 60°C durante 30 min. Esta proteína es
excretada al medio extracelular por las cepas humanas S. aureus y se inactiva con
facilidad por las enzimas proteolíticas (proteasas). (MacFaddin, 2004)
Se desconoce la estructura química de la estafilocoagulasa; sin embargo, existen
muchas hipótesis sobre el mecanismo de acción de la coagulasa. Esta enzima actúa sobre
algunos constituyentes del suero para producir un coágulo o trombo. In vitro la coagulasa
aumenta la velocidad de coagulación del plasma, lo que produce la formación de un
coágulo de fibrina. (MacFaddin, 2004)
Oginsky y Umbreit (1971) establecieron que la evidencia sugiere que la coagulasa
puede inducir un mecanismo de activación alternado, como una enzima o como un
activador de un componente del plasma, para convertir el fibrinógeno a fibrina. Smith et
al. (1968) sugieren que la coagulasa es una sustancia símil protrombina que reacciona
con los factores del plasma normales para formar una sustancia similar a la trombina, que
a su vez activa el fibrinógeno para formar fibrina. (MacFaddin, 2004)
DIFERENCIACIÓN DE MICROCOCCUS Y STAPHYLOCOCCUS
A.- AGAR CISTEINADO
Esta prueba ayuda a considerar que la distribución del género Staphylococcus por ser
anaerobio facultativo puede distribuirse por todo el medio, produciendo ácido a partir de
glucosa tanto de manera aeróbica como anaeróbicamente. En cambio, Micrococccus
fermenta glucosa en condiciones aerobias estrictas produciendo ácido (Madigan et al.,
2009).
B.- AGAR MANITOL CON PBC
El agar manitol es un medio selectivo que se emplea comúnmente para el aislamiento
de estafilococos patógenos, como es el caso de Staphylococcus aureus, además se usa en
estudios de resistencia antimicrobiana (Durán et al., 2004)
El género Staphylococcus pueden fermentar el manitol de manera aeróbica y
anaeróbica, presentando una coloración amarillo intensa en parte inferior y superficial
del tubo de ensayo debido al indicador de pH que vira de púrpura en amarillo. En el caso
del género Micrococcus también puede fermentar el manitol, produciendo ácidos, pero la
coloración que se presentará es a nivel superficial del tubo, debido a que son
microorganismos aerobios, necesitando del oxígeno para sobrevivir.
C.- HUGH LEIFSON
Con respecto a este medio, es esencial considerar la importancia de los
microorganismos como fermentadores u oxidadores (respiradores), en el caso de este
último se presentó en los tubos que no presentan parafina.
IV. CONCLUSIONES
En esta práctica se realizó la descripción de pruebas bioquímicas que ayudan en la
determinación y diferenciación de los géneros Micrococcus y Staphylococcus presentes
en los alimentos, las cuales fueron: prueba de la catalasa, de agar manitol-salado, de Baird
Parker, de DNasa, de la gelatinasa, de la fosfatasa, de la coagulasa, para la determinación;
y agar Cisteinado, agar Manitol con PBC y Hugh Leifson. Para la diferenciación.
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Bailey y Scott. (2007). “Diagnostico Microbiologico”. 12ava Edición. Editorial Médica
Panamericana. Madrid-España.
Bannerman, T.L. (2003). #Staphylococcus, Micrococcus y otros cocos catalasa positivos que crecen
aeróbicamente”. En: Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller y R.H. Yolken
(ed.). Manual de microbiología clínica, 8ª ed. Sociedad Americana de Microbiología,
Washington DC.
Chapin, K.C. y T.-L. Lauderdale. (2003). “Reactivos, tinciones y medios: bacteriología”. En: Murray,
P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller y R. H. Yolken (ed.). Manual de microbiología
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Durán, A., Zhurbenko, R. y Viera, D. (2004) Propuesta de una modificación en la formulación del
medio agar manitol salado utilizado en el aislamiento de estafilococos de importancia clínica.
Flowers, R., Andrews, W., Donelly, C. y Koenig, E. (1993). Pathogens in milk and milk products, p.
103-212. In: R.T. Marshall (ed.). Standard methods for the examination of dairy products,
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Jean F. MacFaddin. (2000). “Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia
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alimentos, 4ª edición. Asociación Estadounidense de Salud Pública (APHA). Washington,
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MacFaddin, J. (2004) Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica.
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Madigan, M., Martinko, J, Dunlap, P. y Clark, D. (2009) Brock, Biología de los microorganismos.
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Smith, D., Conant, N. y Willett, H. (1968). Zinsser’s Microbiology (14° ed.). New York: Appleton-
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