UNESCO-NIGERIA TECHNICAL &

VOCATIONAL EDUCATION
REVITALISATION PROJECT-PHASE II

NATIONAL DIPLOMA IN
SCIENCE LABORATORY TECHNOLOGY

INTRODUCTORY MICROBIOLOGY
COURSE CODE: STM211

YEAR 2- SE MESTER I

PRACTICAL

Version 1: December 2008

1
 TABLE OF CONTENTS

WEEK 1   MICROSCOPY (BRIGHT FIELD LIGHT MICROSCOPE)……………………………..3 

WEEK 2   EXAMINATION OF POND WATER (Protozoa)……………………………………….8 

WEEK 3   EXAMINATION OF POND WATER (Algae)…………………………………………….11 

WEEK 4   TRANSFER OF BACTERIA USING ASEPTIC TECHNIQUE……………………….…14 

WEEK 5   STAINING TECHNIQUES :( 1) NEGATIVE STAINING……….........................21 

WEEK 6  SMEAR PREPARATION AND SIMPLE STAINING…………………………………….24 

WEEK 7  STAINING TECHNIQUES :( 2) GRAM STAINING……………...........................29 

WEEK 8  BIOCHEMICAL TEST: CATALASE TEST…………………………………………………..34 

WEEK 9   CULTIVATION OF MICROORGANISMS…………………………………………………38 

WEEK 10  THE EFFECTS OF CHEMICAL AGENTS ON BACTERIA I:                         

DISINFECTANTS…………………………………………………...................................43 

WEEK 11  THE EFFECTS OF CHEMICAL AGENTS ON BACTERIA II:  

ANTIMICROBIAL AGENTS (KIRBY‐BAUER METHOD)…………………………….48 

WEEK 12  PREPARATION OF PURE CULTURE FROM MIXED  

CULTURE   Streak Plate Technique……………………………......................54 

WEEK 13  PREPARATION OF PURE CULTURE FROM MIXED 

 CULTURE    Pour Plate Technique……………………………………………………….58 

WEEK 14       CULTIVATION OF ANAEROBIC BACTERIA………………………………………………..62 

WEEK 15  CULTIVATION AND IDENTIFICATION OF FUNGI…………………………………….68 

 
  
 

2
 WEEK 1. EXPERIMENT ONE: MICROSCOPY (BRIGHT‐FIELD LIGHT 
MICROSCOPE) 
Introduction 

Microbiology usually is concerned with organisms so small they cannot be seen distinctly 

with the unaided eye. Because of the nature of this discipline, the microscope is of crucial 

importance. Thus it is important to understand how the microscope works. Microbiologists 

currently employ a variety of light microscopes in their work; bright‐field, dark‐field, phase‐

contrast, and fluorescence microscopes are most commonly used. Modern microscopes are 

all compound microscopes. That is, the magnified image formed by the objective lens is 

further enlarged by one or more additional lenses.A microscope that allows light rays to 

pass directly through to the eye without being deflected by an intervening opaque plate in 

the condenser is called a brightfield microscope. 

Principle 

The bright‐field light microscope is an instrument that magnifies images using two lens 

systems. Initial magnification occurs in the objective lens. Most microscopes have at least 

three objective lenses on a rotating base, and each lens may be rotated into alignment with 

the eyepiece or ocular lens in which the final magnification occurs. The objective lenses are 

identified as the low‐power, high‐dry, and oil immersion objectives. Each objective is also 

designated by other terms. These terms give either the linear magnification or the focal 

length. The latter is about equal to or greater than the working distance between the 

specimens when in focus and the tip of the objective lens. For example, the low‐power 

objective is also called the 10X, objective; the high‐dry is called the 40X, objective; and the 

oil immersion is called the 100X objective. As the magnification increases, the size of the 

lens at the tip of the objective becomes progressively smaller and admits less light. This is 

3
one of the reasons that changes in position of the substage condenser and iris diaphragm 

are required when using different objectives if the specimens viewed are to be seen 

distinctly. The condenser focuses the light on a small area above the stage, and the iris 

diaphragm controls the amount of light that enters the condenser. When the oil immersion 

lens is used, immersion oil fills the space between the objective and the specimen. Because 

immersion oil has the same refractive index as glass, the loss of light is minimized. The 

eyepiece, or ocular, at the top of the tube magnifies the image formed by the objective 

lens. As a result, the total magnification seen by the observer is obtained by multiplying the 

magnification of the objective lens by the magnification of the ocular, or eyepiece. For 

example, when using the 10Xocular and the 43X objective, total magnification is 10 x43 = 

430 times. 

Materials 

‐compound microscope 

‐lens paper and lens cleaner 

‐immersion oil 

‐prepared stained slides of several types of bacteria (rods, cocci,), fungi, algae, and protozoa 

‐glass slides 

‐coverslips 

‐dropper with bulb 

‐newspaper or cut‐out letter m’s 

Method: Procedure for Basic Microscopy: Proper Use of the Microscope 

1. Always carry the microscope with two hands. Place it on the desk with the open part 

away from you. 

4
2. Clean all of the microscope’s lenses only with lens paper and lens cleaner if necessary. Do 

not use paper towels as they can scratch the lenses. Do not remove the oculars or any other 

parts from the body of the microscope. 

Figure 1.1 Preparation of a Wet-mount Slide. (a) Add a drop of water onto the slide. (b) Place the specimen (letter m)
directly in the water. (c) Place the edge of a cover slip on the slide so that it touches the edge of the water. (d) Slowly lower
the cover slip to prevent trapping of air bubbles

3. Cut a lowercase ‘m’ from a newspaper or other printed page. Prepare a wet‐mount as 

illustrated in figure 1.1. Place the glass slide on the stage of the microscope and secure it 

firmly using stage clips. If your microscope has a mechanical stage device, place the slide 

securely in it. Move the slide until the letter m is over the opening in the stage.  

4. With the low‐power objective in position, lower the tube until the tip of the objective is 

within 

5 mm of the slide. Be sure that you lower the tube while looking at the microscope from the 

side. 

5. Look into the microscope and slowly raise the tube by turning the coarse adjustment 

knob counterclockwise until the object comes into view. Once the object is in view, use the 

fine adjustment knob to focus the desired image. 

6. Open and close the diaphragm, and lower and raise the condenser, noting what effect 

these actions have on the appearance of the object being viewed. Usually the microscope is 
5
used with the sub stage condenser in its topmost position. The diaphragm should be open 

and then closed down until just a slight increase in contrast is observed  

7. Use the oil immersion lens to examine the stained bacteria that are provided. The 

directions for using this lens are as follows: First locate the stained area with the low‐power 

objective and then turn the oil immersion lens into the oil and focus with the fine 

adjustment. An alternate procedure is to get the focus very sharp under high power, then 

move the revolving nosepiece until you are halfway between the high‐power and oil 

immersion objectives. Place a small drop of immersion oil in the center of the illuminated 

area on the slide. Continue revolving the nosepiece until the oil immersion objective clicks 

into place. The lens will now be immersed in oil. Sharpen the focus with the fine adjustment 

knob. Draw a few of the bacteria in the spaces provided 

 8. After you are finished with the microscope, place the low‐power objective in line with 

the ocular, lower the tube to its lowest position, clean the oil from the oil immersion lens 

with lens paper and lens cleaner, cover, and return the microscope (see figure 1.2) to its 

proper storage place 

Results 

Draw a large well labeled diagram of the microscope  

1. Identify all the parts of a compound microscope 

2. Know how to correctly use the microscope especially the oil immersion lens 

3. Learn how to make and examine a wet‐mount preparation 

Questions 

What is the magnification stamped on the housing of the oculars on your microscope? 

What are the magnifications of each of the objectives on your microscope? 
6
Why is oil necessary when using the 100X objective? 

Differentiate between the resolving power and magnifying power of a lens. What is meant 

by the term “parfocal”? 

Figure 1.2 The compound microscope

7
  WEEK 2 EXPERIMENT TWO : EXAMINATION OF POND WATER 
Introduction  

Microbiology usually is concerned with organisms so small they cannot be seen distinctly 

with the unaided eye. Because of the nature of this discipline, the microscope is of crucial 

importance. Thus it is important to understand how the microscope works and the way in 

which specimens are prepared for examination. In this experiment we will examine 

microorganisms found in pond water. To study the microorganisms of pond water, it will be 

necessary to make wet mount slides. The procedure for making such slides is  elatively 

simple. All that is necessary is to place a drop of suspended organisms on a microscope slide 

and cover it with a cover glass. A thorough understanding of microscopy, slide techniques, 

and culture methods therefore  provides a substantial foundation for their study. 

Principles 

Certain transparent, colorless living microorganisms and their internal organelles are often 

impossible to see by ordinary bright‐field or dark‐field microscopy because they do not 

absorb, reflect, refract, or diffract sufficient light to contrast with the surrounding 

environment or the rest of the microorganism. Microorganisms and their organelles are only 

visible when they absorb, reflect, refract, or diffract more light than their environment. The 

phase‐contrast microscope permits the observation of otherwise invisible living, unstained 

microorganisms  

Materials 

‐bottles of pond‐water samples 

‐microscope slides and cover glasses 

8
‐rubber‐bulbed pipettes ( Pasteur pipette with pipettor) 

‐pictorial guides of common pond water microorganisms 

‐ forceps 

‐Grease marking pencil 

Method 

1. Clean the slide and cover glass with soap and water, rinse thoroughly, and dry. Do not 

attempt to study a slide that lacks a cover glass. 

2. When using a pipette, insert it into the bottom of the bottle to get a maximum number of 

organisms. Very few organisms will be found swimming around in middepth of the bottle. 

3. To remove filamentous algae from a specimen bottle, use forceps. Avoid putting too 

much material on the slides. 

4. Explore the slide first with the low‐power objective. Reduce the lighting with the iris 

diaphragm. Keep the condenser at its highest point. 

5. When you find an organism of interest, swing the high‐dry objective into position and 

adjust the lighting to get optimum contrast. If your microscope has phase‐contrast 

elements, use them. 

Results 

1. Refer to Figure 1 and the text on the page to identify the various organisms that you 

encounter. 

7. Record your observations on the Laboratory Reports n 

Quiz 

1. What advantage does the phase‐contrast microscope have over the bright‐field 

microscope? 

9
Figure 1 Protozoans
1.heteronema; 2.cercomonas; 3.codosiga; 4.protospongia; 5.trickamoeba; 6.amoeba;
7.mayorella; 8.diffugia; 9.paramecium; 10.lacrymaria; 11.linotus; 12.loxodes;
13.blepharisma; 14.coleps; 15.condylostoma; 16.strentor; 17.vorticella; 18.carchesium;
19.zoothamnium; 20.stylonychia; 21.onychodromas; 22.hypotrichidium; 23.euplotes;
24.didinium

10
 WEEK 3. EXPERIMENT THREE  : EXAMINATION OF POND WATER (2) 
 
Introduction: See Week 2

Materials 

‐bottles of pond‐water samples 

‐microscope slides and cover glasses 

‐rubber‐bulbed pipettes ( Pasteur pipette with pipettor) 

‐pictorial guides of common pond water microorganisms 

‐ forceps 

‐Grease marking pencil 

Method 

1. Clean the slide and cover glass with soap and water, rinse thoroughly, and dry. Do not 

attempt to study a slide that lacks a cover glass. 

2. When using a pipette, insert it into the bottom of the bottle to get a maximum number of 

organisms. Very few organisms will be found swimming around in middepth of the bottle. 

3. To remove filamentous algae from a specimen bottle, use forceps. Avoid putting too 

much material on the slides. 

4. Place the slide on the stage of the phase‐contrast microscope so that the specimen is over 

the light hole. 

5. Explore the slide first with the low‐power objective. Reduce the lighting with the iris 

diaphragm. Keep the condenser at its highest point. 

6. When you find an organism of interest, swing the high‐dry objective into position and 

adjust the lighting to get optimum contrast. If your microscope has phase‐contrast 

elements, use them. 

11
 

Results 

1. Refer to Figure 2  and the text on the page to identify the various organisms that you 

encounter. 

7. Record your observations on the Laboratory Reports. 

Question 

1. Enumerate the differences between prokaryotes and eukaryotes 

12
Figure 2 Filamentous algae
1. Rhizoclonium ; 2. Cladophora ; 3. Bulbochaete ; 4. Oedogonium ; 5. Vaucheria ; 6.
Tribonema ; 7. Chara ; 8. Batrachospermum ; 9. Microspora ; 10. Ulothrix ; 11. Ulothrix ;
12. Desmidium ; 13. Mougeotia ; 14. Spirogyra ; 15. Zygnema ; 16. Stigeoclonium ; 17.
Draparnaldia

13
 WEEK 4. EXPERIMENT FOUR: TRANSFER OF BACTERIA USING 
ASEPTIC TECHNIQUE 
Introduction 

In the laboratory bacteria must be cultured to facilitate identification and to examine their 

growth and metabolism. All cultured media are sterilized that is rendered free of life, prior 

to use. Sterilization is usually accompanied using an autoclave. Containers of culture media 

such as Petri dish or test tube should not be opened until you are ready to work with them, 

and even then they should not be left open. Culture media can be prepared in other forms 

depending on the desired use. Broth cultures provide large numbers of bacteria in a small 

space and are easily transported. Agar slants are test tubes containing solid culture media 

that were left at an angle while the agar solidified. Agar slants like Petri plates provide a 

solid growth surface, but slants are easier to store and transport than Petri plates. Agar is 

allowed to solidify in the bottom of a test tube to make an agar deep. Deeps are often used 

to grow bacteria that prefer less oxygen than is present on the surface of the medium. Semi 

solid agar deeps containing 0.5% to 0.7% agar instead of the normal 1.5% agar can be used 

to determine whether bacterium is motile. Motile bacteria will move away from the point of 

inoculation, giving an inverted Christmas tree appearance. A bacterial culture is transferred 

is transferred from one culture medium to another in order to keep it alive and to study its 

growth. Transferring must be done without introducing unwanted microbes called 

contaminants into the media. Transfer techniques that minimize contaminants are called 

aseptic techniques. Microorganisms are aseptically inoculated, por introduced, into various 

forms of the culture media. Transfer and inoculation are usually performed with a sterile, 

heat‐ resistant , non‐corroding nichrome attached to an insulated handle. When the end of 

the wire is bent into a loop, it is called an inoculating loop; when straight, it is an inoculating 

14
needle. For special purposes cultures may also be transferred with sterile cotton swabs, 

pipettes, glass rods, or syringes. 

Principle 

Most commonly used culture media will support the growth of a number of different 

bacteria. It is therefore essential when working in the microbiology laboratory that suitable 

precautions are taken to prevent the growth of unwanted contaminants in our cultures. 

These simple practical measures are termed aseptic technique, and it is essential to master 

them if reliable experimental results are to be obtained. Any glassware and equipment used 

is sterilized before work begins. Containers such as tubes, flasks and plates are kept open 

for the minimum amount of time, and the necks of bottles and tubes are passed through a 

flame to maintain their sterility. The wire loops and needles used to transfer small volumes 

of microbial cultures are sterilized by heating them to redness in a flame. Aseptic 

techniques are laboratory skills imbibed by every microbiologist for the transfer and 

handling of microorganisms and instruments, including  sterilizing and maintaining sterility 

of transfer instruments,  performing aseptic transfer, and obtaining microbial samples. Your 

instructor will normally demonstrate aseptic technique to you. 

Materials 

‐Inoculating loop (Figure [a] below) 

‐Inoculating needle (Figure [b] below) 

‐Bunsen burner 

‐Blow‐out pipette with pipettor ‐to‐deliver pipette 

‐24‐hour tryptic soy broth and tryptic soy agar slant cultures of Staphylococcus aureus, 

Escherichia coli,    Streptococcus pneumonia 

15
‐Streak‐plate cultures 

‐Tryptic soy broth tubes 

‐Tryptic soy agar slants 

‐Tryptic soy agar deeps 

‐Wax pencil 

Figure a Figure b

Method: Procedure for Culture Transfer (Instruments and Techniques) 

Pipetting 

1. Proper pipetting using both to‐deliver and blowout pipettes will be demonstrated in the 

laboratory by the instructor. After the demonstration, practice using both pipettes with 

some distilled water and the bulbs or mechanical devices provided. 

16
Aseptic Technique 

1. Using a wax pencil, label the tube or plate to be inoculated with the date, your name, and 

the name of the test microorganism.  

2. Gently mix the primary culture tube in order to put the bacteria into a uniform 

suspension.The tube can be tapped to create a vortex that will suspend the microorganisms, 

or if a vortex mixer is available, it can be used.  

3. Place the stock culture tube and the tube to be inoculated in the palm of one hand and 

secure with the thumb. The tubes are then separated to form a V in the hand (figure 4c). 

They should be held at an angle so that the open ends are not vertical and directly exposed 

to airborne laboratory contaminants.  

4. Using the other hand, flame the inoculating loop or needle over a Bunsen burner until the 

wire becomes red‐hot . 

5. Using the same hand that is holding the inoculating loop, remove the caps from the two 

tubes, hold them between your fingers, and briefly flame the necks of the tubes over a 

Bunsen burner by passing them through the flame. However, DO NOTALLOW THE TUBES TO 

BECOME RED‐HOT. 

6. Cool the hot loop in the broth culture until it stops “hissing.” With the sterile inoculating 

loop, transfer 1 drop of culture from the stock culture tube into the new broth tube. At this 

point, one could also transfer to a glass slide, streak the surface of a slant, or streak the 

bacteria onto the surface of a petri plate. When picking up bacteria from a slant, cool the 

hot loop or needle by holding it against the top of the slant until it stops “hissing.” 

7. Reflame the neck of the tubes. 

8. Recap the tubes. 

9. Reflame or sterilize the loop or needle. Using aseptic technique, perform the following 

transfers: 
17
  a. With the inoculating loop, transfer the S. aureus tryptic soy broth culture to a tryptic 

soy agar slant. Also, inoculate a tryptic soy broth tube with S.aureus, using the inoculating 

loop. 

b. With the inoculating needle, transfer the S. aureus to a tryptic soy agar deep tube. 

This is done by plunging the inoculating needle of S.aureus into the tube without 

touching the walls of the tube. Penetrate the medium to its depth. The inoculating needle 

is then withdrawn from the tube. 

c. Using the inoculating loop, make a slant‐to‐slant transfer. This is done by gently 

streaking the surface of the slant in the form of a serpentine (wiggly or S‐shaped) line. If 

there is liquid at the base of the slant, the tube may be tilted after inoculation so that 

the liquid runs over the slant surface. This will moisten the surface and spread out the 

bacteria. 

d. Place the tubes in a test‐tube rack or a clean vegetable can and incubate at 35°C for 24  

to 48 hours. Afterwards, examine all of the tubes for the presence of bacterial growth. 

Growth is indicated by turbidity (cloudiness) in the broth culture, and the appearance of 

an orange‐to‐red growth on the slant culture and along the line of inoculation in the agar 

deep tube. Also note if any contamination is present. This is indicated by growth that is 

not red to orange in color. Record your results in the report book. 

18
Figure 4 Aseptic Technique for Bacterial Removal and Subculturing

Results 

Discuss all the difficulties you encountered during the culture transfer  and the aseptic 

technique process. 

Questions 

1. What is the purpose of flaming in the aseptic technique? 

2. What is the purpose of sub culturing? 

3. In sub culturing, when do you use the inoculating loop? 

4. How is it possible to contaminate a subculture? 

19
5. What are some signs of growth in a liquid medium? 

20
 WEEK 5 EXPERIMENT FIVE: STAINING TECHNIQUES ( 1) NEGATIVE 
STAINING 
Introduction 

The difficulty that one encounters in trying to examine cellular organelles is that most 

protoplasmic material is completely transparent and defies differentiation. It is for this 

reason that stained slides are usually used in brightfield cytological studies. Since the 

staining of slides results in cellular death, it is obvious that when we study stained 

microorganisms on a slide, we are observing artifacts rather than living cells. A microscope 

that is able to differentiate transparent protoplasmic structures without staining and killing 

them is the phase‐contrast microscope. The first phase‐contrast microscope was developed 

in 1933 by Frederick Zernike and was originally referred to as the Zernike microscope. It is 

the instrument of choice for studying living protozoans and other types of transparent cells. 

Principles: 

The simplest way to make a slide of bacteria is to prepare a wet mount, much in the same 

manner that was used for studying protozoa and algae. Although this method will quickly 

produce a slide, finding the bacteria on the slide may be difficult, especially for a beginner. 

The problem one encounters is that bacteria are quite colorless and transparent. Unless the 

diaphragm is carefully adjusted, the beginner usually has considerable difficulty bringing the 

organisms into focus. A better way to observe bacteria for the first time is to prepare a slide 

by a process called negative, or background, staining. This method consists of mixing the 

microorganisms in a small amount of nigrosine or India ink and spreading the mixture over 

the surface of a slide. (Incidentally, nigrosine is far superior to India ink.) Since these two 

pigments are not really bacterial stains, they do not penetrate the microorganisms. Instead 
21
they obliterate the background, leaving the organisms transparent and visible in a darkened 

field. 

Materials: 

‐microscope slides  

‐nigrosine solution or india ink 

‐slant cultures of S. aureus and S cerevisiae 

‐inoculating straight wire and loop 

‐sterile toothpicks 

‐Bunsen burner 

‐china marking pencil 

‐grease marking pen 

 Method 

1. Swab down your tabletop with disinfectant in preparation for making slides. 

2. Clean two or three microscope slides with ethanol to rid them of all dirt and grease. 

3. By referring to figure 1, place the proper amount of stain on the slide. 

4. Oral Organisms: Remove a small amount of material from between your teeth with a 

sterile straight toothpick or inoculating needle and mix it into the stain on the slide. Be sure 

to break up any clumps of organisms with the wire or toothpick. When using a wire, be sure 

to flame it first to make it sterile. 

5. From Cultures: With a sterile straight wire, transfer a very small amount of bacteria from 

the slant to the center of the stain on the slide.  

6. Spread the mixture over the slide according to the procedure used in figure 5 

22
7. Allow the slide to air‐dry (DO NOT HEAT FIX) and examine with an oil immersion 

objective. 

1. A loopful of nigrosin is placed 2. A sterile inoculating wire is used to transfer

in the centre of a clean microscope slide the organisms to the liquid and mix the
organism into the stain

3.Suspension of bacteria is spread evenly 4. once the preparation has completely

over an area of one to two centimeters it can be examined under oil immersion.
air-dried
No heat should be used to hasten drying

Figure 5

Results  

Draw a few representative types of organisms on laboratory report book 

Question 

1. Describe the microscopic appearance of the two organisms bacteria. 

2. When is negative staining used? 

3. Why do the bacteria remain unstained in the negative staining procedure? 

23
 WEEK 6. EXPERIMENT SIX: SMEAR PREPARATION AND SIMPLE 
STAINING 
Introduction 

While negative staining is a simple enough process to make bacteria more visible with a 

brightfield microscope,  it is of little help when one attempts to observe anatomical 

microstructures such as flagella, granules, and endospores. Only by applying specific 

bacteriological stains to organisms can such organelles be seen. However, success at 

bacterial staining depends first of all on the preparation of a suitable smear of the 

organisms. A properly prepared bacterial smear is one that withstands one or more 

washings during staining without loss of organisms, is not too thick, and does not result in 

excessive distortion due to cell shrinkage. The first step in preparing a bacteriological smear 

differs according to the source of the organisms. If the bacteria are growing in a liquid 

medium (broths, milk, saliva, urine, etc.), one starts by placing one or two loopfuls of the 

liquid medium directly on the slide. From solid media such as nutrient agar, blood agar, or 

some part of the body, one starts by placing one or two loopfuls of water on the slide and 

then uses a straight inoculating wire to disperse the organisms in the water. Bacteria 

growing on solid media tend to cling to each other and must be dispersed sufficiently by 

dilution in water; unless this is done, the smear will be too thick. The most difficult concept 

for students to understand about making slides from solid media is that it takes only a very 

small amount of material to make a good smear. When your instructor demonstrates this 

step, pay very careful attention to the amount of material that is placed on the slide. 

Principle  

 One way of observing the details of bacteria including its morphology and size  involves 

smear preparation and simple staining. A bacterial smear is a dried preparation of bacterial 

cells 

24
on a glass slide. In a bacterial smear that has been properly processed, (1) the bacteria are 

evenly spread out on the slide in such a concentration that they are adequately separated 

from one another, (2) the bacteria are not washed off the slide during staining, and (3) 

bacterial form is not distorted.In making a smear, bacteria from either a broth culture or an 

agar slant or plate may be used. If a slant or plate is used, a small amount of bacterial 

growth is transferred to a drop of water on a glass slide (figure 6a) and mixed. The mixture 

is then spread out evenly over a large area on the slide (figure 6b). One of the most common 

errors in smear preparation from agar cultures is the use of too large an inoculum. This 

invariably results in the occurrence of large aggregates of bacteria piled on top of one 

another. If the medium is liquid, place one or two loops of the medium directly on the slide 

(figure 6c) and spread the bacteria over a large area (figure 6d). Allow the slide to air dry at 

room temperature (figure 6e). After the smear is dry, the next step is to attach the bacteria 

to the slide by heat‐fixing. This is accomplished by gentle heating (figure 6f ), passing the 

slide several times through the hot portion of the flame of a Bunsen burner. Most bacteria 

can be fixed to the slide and killed in this way without serious distortion of cell structure. 

The use of a single stain or dye to create contrast between the bacteria and the background 

is referred to as simple staining. Its chief value lies in its simplicity and ease of use. Simple 

staining is often employed when information about cell shape, size, and arrangement is 

desired. In this procedure, one places the heatfixed slide on a staining rack, covers the 

smear with a small amount of the desired stain for the proper amount of time, washes the 

stain off with water for a few seconds, and, finally, blots it dry. Basic dyes such as crystal 

violet (20 to 30 seconds staining time), carbolfuchsin (5 to 10 seconds staining time), or 

methylene blue (1 minute staining time) are often used. Once bacteria have been properly 

stained, it is usually an easy matter to discern their overall shape. Bacterial morphology is 

usually uncomplicated and limited to one of a few variations. 
25
 Figure 6 Preparation of Bacterial Smear

Materials 

‐24‐ to 48‐hour tryptic soy broth or agar slants of ‐Bacillus subtilis , and Staphylococcus 

aureus 

‐microscope 

‐clean microscope slides 

‐bibulous paper 

‐inoculating loop and needle 

‐sterile distilled water 

‐Bunsen burner 

26
 ‐methylene blue 

‐crystal violet (1% aqueous solution) 

‐Ziehl’s carbolfuchsin 

‐wax pencil 

‐immersion oil 

‐slide holder 

Method 

Smear Preparation 

1. With the wax pencil, mark the name of the bacterial culture in the far left corner on each 

of three slides. 

2. For the broth culture, shake the culture tube and, with an inoculating loop, aseptically 

(see figure 6) transfer 1 to 2 loopfuls of bacteria to the center of the slide. Spread this out to 

about a d‐inch area. When preparing a smear from a slant or plate, place a loopful of water 

in the center of the slide. With the inoculating needle, aseptically pick up a very small 

amount of culture and mix into the drop of water. Spread this out as above. (Two slides 

should be prepared; one each of B. subtilis Staphylococcus aureus.)   

3. Allow the slide to air dry.  

4. Pass the slide through a Bunsen burner flame three times to heat‐fix and kill the bacteria. 

Simple Staining 

1. Place the three fixed smears on a staining loop or rack over a sink or other suitable 

receptacle 

2. Stain one slide with alkaline methylene blue for 1 to 1d minutes; one slide with 

carbolfuchsin for 5 to 10 seconds; and one slide with crystal violet for 20 to 30 seconds. 

3. Wash stain off slide with water for a few seconds 
27
4. Blot slide dry with bibulous paper Be careful not to rub the smear when drying the 

slide because this will remove the stained bacteria. 

5. Examine under the oil immersion lens and  report your observation 

6. You may want to treat smears of the same bacterium with all three stains in order to 

compare them more directly. It is also instructive to cover bacterial smears for varying 

lengths of time with a given stain in order to get a feel for how reactive they are and the 

results of overstaining or understaining a slide preparation.  

Results 

Discuss extensively the smear and staining procedure and enumerate your difficulties 

Question 

1. What are the two purposes of heat fixation? 

2. What is the purpose of simple staining? 

3. Why are basic dyes more successful in staining bacteria than acidic dyes? 

4. Name three basic stains. 

5. Why is time an important factor in simple staining? 

28
 WEEK 7. EXPERIMENT SEVEN: STAINING TECHNIQUES (2) GRAM 
STAINING 
Introduction 

In 1884 the Danish bacteriologist Christian Gram developed a staining technique that 

separates bacteria into two groups: those that are gram‐positive and those that are gram‐

negative. The procedure is based on the ability of microorganisms to retain the purple color 

of crystal violet during decolorization with alcohol. Gram‐negative bacteria are decolorized 

by the alcohol, losing the purple color of crystal violet. Gram‐positive bacteria are not 

decolorized and remain purple. After decolorization, safranin, a red counterstain, is used to 

impart a pink color to the decolorized gram‐negative organisms. Figure 7 illustrates the 

effects of the various reagents on bacterial cells at each stage in the process. Note that 

crystal violet, the primary stain,  causes both gram‐positive and gram‐negative organisms to 

become purple after 20 seconds of staining. When Gram’s iodine, the mordant, is applied to 

the cells for one minute, the color of gram‐positive and gram‐negative bacteria remains the 

same: purple. The function of the mordant here is to combine with crystal violet to form a 

relatively insoluble compound in the gram‐positive bacteria. When the decolorizing agent, 

95% ethanol, is added to the cells for 10–20 seconds, the gram‐negative bacteria are 

leached colorless, but the gram‐positive bacteria remain purple. In the final step a 

counterstain, safranin, adds a pink color to the decolorized gramnegative bacteria without 

affecting the color of the purple gram‐positive bacteria. Of all the staining techniques you 

will use in the identification of unknown bacteria, Gram staining is, undoubtedly, the most 

important tool you will use. Although this technique seems quite simple, performing it with 

a high degree of reliability is a goal that requires some practice and experience. Here are 

two suggestions that can be helpful: first, don’t make your smears too thick, and second, 

29
pay particular attention to the comments in step 4 on the next page that pertain to  

decolorization. 

Simple staining depends on the fact that bacteria differ chemically from their surroundings 

and thus can be stained to contrast with their environment. Bacteria also differ from one 

another chemically and physically and may react differently to a given staining procedure. 

This is the principle of differential staining. Differential staining can distinguish between 

types of bacteria. The Gram stain does not always yield clear results. Species will differ from 

one another in regard to the ease with which the crystal violet‐iodine complex is removed 

by ethanol. Gram‐positive cultures may often turn gram negative if they get too old. Thus, it 

is always best to Gram stain young, vigorous cultures rather than older ones. Furthermore, 

some bacterial species are gram variable. That is, some cells in the same culture will be 

gram positive and some, gram negative. Therefore, one should always be certain to run 

Gram stains on several cultures under carefully controlled conditions in order to make 

certain that a given bacterial “strain” is truly gram positive or gram negative. Indistinct 

Gram‐stain results can be confirmed by a simple test using KOH. Place a drop of 10% KOH on 

a clean glass slide and mix with a loopful of bacterial paste. Wait 30 seconds, then pull the 

loop slowly through the suspension and up and away from the slide. A gram‐negative 

organism will produce a mucoid string; a gram‐positive organism remains fluid. 

Principle 

Although several explanations have been given for the Gramstain reaction results, it seems 

likely that the difference between gram‐positive and gram‐negative bacteria is due to the 

physical nature of their cell walls. If the cell wall is removed from grampositive bacteria, 

they become gram negative. The peptidoglycan itself is not stained; instead it seems to act 
30
as a permeability barrier preventing loss of crystal violet. During the procedure the bacteria 

are first stained with crystal violet and next treated with iodine to promote dye retention. 

When gram‐positive bacteria then are decolorized with ethanol, the alcohol is thought to 

shrink the pores of the thick peptidoglycan. Thus the dye‐iodine complex is retained during 

the short decolorization step and the bacteria remain purple. In contrast, gram‐negative 

peptidoglycan is very thin, not as highly cross‐linked, and has larger pores. Alcohol 

treatment also may extract enough lipid from the gramnegative 

wall to increase its porosity further. For these reasons, alcohol more readily removes the 

purple crystal violet‐iodine complex from gram‐negative bacteria. 

 
Figure 7 Color changes that occur at each step during the gram-staining process

31
Materials 

‐18‐ to 24‐hour tryptic soy broth cultures of formalinized (1 ml of concentrated formalin per 

10 ml of culture) Staphylococcus aureus, Escherichia coli , and a mixture of S. aureus and E. 

coli 

‐solutions of crystal violet, Gram’s iodine , 95% ethanol and/or isopropanol‐acetone mixture 

(3:1v/v), and safranin 

‐clean glass slides 

‐inoculating loop 

‐Bunsen burner 

‐bibulous paper 

‐microscope 

‐lens paper and lens cleaner 

‐immersion oil 

‐staining rack 

Method 

1. Prepare heat‐fixed smears of E. coli, S. aureus, and the mixture of E. coli and S. aureus  

2. Place the slides on the staining rack. 

3. Flood the smears with crystal violet and let stand for 30 seconds  

4. Rinse with water for 5 seconds  

5. Cover with Gram’s iodine mordant and let stand for 1 minute  

6. Rinse with water for 5 seconds  

7. Decolorize with 95% ethanol for 15 to 30 seconds. Do not decolorize too long. Add the 

decolorizer drop by drop until the crystal violet fails to wash from the slide . Alternatively, 

32
the smears may be decolorized for 30 to 60 seconds with a mixture of isopropanol‐acetone 

(3:1 v/v). 

8. Rinse with water for 5 seconds  

9. Counterstain with safranin for about 60 to 80 seconds . Safranin preparations vary 

considerably in strength, and different staining times may be required for each batch of 

stain. (If you are color‐blind, use Bismark brown stain rather than safranin.) 

10. Rinse with water for 5 seconds.  

11. Blot dry with bibulous paper and examine under oil immersion. Gram‐positive organisms 

stain blue to purple; gram‐negative organisms stain pink to red. There is no need to place a 

coverslip on the stained smear. 

Results 

Examine the slide under oil immersion and make drawings . Make comments on your 

observations 

Questions 

1. Which step is the most crucial or most likely to cause poor results in the Gram stain? 

Why? 

2. Why must young cultures be used when doing a Gram stain? 

3. What is meant by gram variable? 

4. Distinguish between prokayotes and eukaryotes 

33
 WEEK 8 EXPERIMENT EIGHT: BIOCHEMICAL TESTS (1) CATALASE 
TEST 

Introduction 

After the microscopic and growth characteristics of a pure culture of bacteria are examined, 

specific biochemical tests can be performed. Classic dichotomous keys are coupled with the 

biochemical tests for the identification of bacteria from specimens. Generally, fewer than 20 

tests are required to identify clinical bacterial isolates to the species level. Some of the 

biochemical tests used for bacteria identification include Carbohydrate fermentation, Casein 

hydrolysis,  Catalase , Citrate utilization,  Coagulase, Decarboxylases (arginine, lysine, 

ornithine), Esculin hydrolysis, Beta‐galactosidase (ONPG) test, Gelatin liquefaction , 

Hydrogen sulfide (H2S), IMViC (indole; methyl red; Voges‐Proskauer; citrate), Lipid 

hydrolysis, Nitrate reduction , Oxidase ,  Phenylalanine deaminase , Starch hydrolysis 

,Urease. The list is by no means exhaustible. Physiological characteristics Of bacteria are 

normally determined with a series of biochemical tests. Although correctly identifying the 

unknowns that are given to you is very important, it is just as important that you thoroughly 

understand the chemistry of the tests that you perform on the organisms. Organisms of 

different species not only differ morphologically and physiologically, but they also differ in 

protein makeup. The different proteins of bacterial cells that are able to stimulate antibody 

production when injected into an animal are antigens. The antigenic structure of each 

species of bacteria is unique to that species and, like the fingerprint of an individual, can be 

used to identify the organism. Many closely related microorganisms that are identical 

physiologically can be differentiated only by determining their antigenic nature. The method 

of determining the presence of specific antigens in a microorganism is called serological 

typing (serotyping). It consists of adding a suspension of the organisms to antiserum, which 

34
contains antibodies that are specific for the known antigens. If  the antigens are present, the 

antibodies in the antiserum will combine with the antigens, causing agglutination, or 

clumping, of the bacterial cells. Serotyping is particularly useful in the identification of 

various organisms that cause salmonella and shigella infections. 

Principle 

Some bacteria contain flavoproteins that reduce O2, resulting in the production of hydrogen 

peroxide (H2O2) or superoxide (O2 –). These are extremely toxic because they are powerful 

oxidizing agents and destroy cellular constituents very rapidly. A bacterium must be able to 

protect itself against such O2 products or it will be killed. Many bacteria possess enzymes 

that afford protection against toxic O2 products. Obligate aerobes and facultative anaerobes 

usually contain the enzymes superoxide dismutase, which catalyzes the destruction of 

superoxide, and either catalase or peroxidase, which catalyze the destruction of hydrogen 

peroxide. Most strict anaerobes lack both enzymes and therefore cannot tolerate O2. 

Catalase production and activity can be detected by adding the substrate H2O2 to an 

appropriately incubated (18‐ to 24‐hour) tryptic soy agar slant culture. If catalase was 

produced by the bacteria, the above chemical reaction will liberate free O2 gas. Bubbles of 

O2 represent a positive catalase test; the absence of 

bubble formation is a negative catalase test. Catalase activity is very useful in differentiating 

between groups of bacteria. For example, the morphologically similar Enterococcus  and 

Streptococcus(catalase negative) and Staphylococcus (catalase positive) can be 

differentiated using the catalase test. 

 
35
Materials 

‐18‐ to 24‐hour tryptic soy broth cultures of Staphylococcus aureus  and Streptococcus 

pneumonia 

‐3% hydrogen peroxide (H2O2) 

‐Bunsen burner 

‐inoculating loop 

‐Pasteur pipette with pipettor 

‐incubator set at 35°C 

‐test‐tube rack 

‐wax pencil 

‐clean glass slides 

‐ Nichrome wire loop 

Method 

1. On a clean grease free slide put 2 drops of a 3% solution of H2O2  

2. With the aid of a sterile wire loop, scoop some of the culture inoculum and emulsify it in 

the hydrogen peroxide solution  

3. The appearance of gas bubbles indicates a positive test; the absence of gas bubbles is a 

negative test  

Results 

Based on your observations, determine and record your findings 

Questions 

1. Do anaerobic bacteria require catalase? Explain your answer. 
36
2.  What two groups of bacteria can be differentiated with the catalase test? 

3. What are three products that result when flavoproteins reduce O2? 

37
 WEEK 9.EXPERIMENT NINE: CULTIVATION OF MICROORGANISMS 
Introduction 

A microbiological medium (media, plural) is the food that we use for culturing bacteria, 

molds, and other microorganisms. It can exist in three consistencies: liquid, solid, and 

semisolid.  Liquid media include nutrient broth, citrate broth, glucose broth, litmus milk, 

etc. These media are used for the propagation of large numbers of organisms, fermentation 

studies, and various other tests. Solid media are made by adding a solidifying agent, such as 

agar, gelatin, or silica gel, to a liquid medium. A good solidifying agent is one that is not 

utilized by microorganisms, does not inhibit bacterial growth, and does not liquefy at room 

temperature. Agar and silica gel do not liquefy at room temperature and are utilized by very 

few organisms. Gelatin, on the other hand, is hydrolyzed by quite a few organisms and 

liquefies at room temperature. Nutrient agar, blood agar, and Sabouraud’s agar are 

examples of solid media that are used for developing surface colony growth of bacteria and 

molds. As we will see in the next exercise, the development of colonies on the surface of a 

medium is essential when trying to isolate organisms from mixed cultures. Semisolid media 

fall in between liquid and solid media. Although they are similar to solid media in that they 

contain solidifying agents such as agar and gelatin, they are more jellylike due to lower 

percentages of these solidifiers. These media are particularly useful in determining whether 

certain bacteria are motile 

Principle  

Before one can construct a medium that will achieve a desired result in the growth of 

organisms, one must understand their basic needs. Any medium that is to be suitable for a 

specific group of organisms must take into account the following seven factors: water, 

carbon, energy, nitrogen, minerals, growth factors, and pH. Media can be prepared to exact 
38
specifications so that the exact composition is known. These media are generally made from 

chemical compounds that are highly purified and precisely defined. Such media are readily 

reproducible. They are known as synthetic media. Media such as nutrient broth that contain 

ingredients of imprecise composition are called nonsynthetic media. Both the beef extract 

and peptone in nutrient broth are inexact in composition. 

 Materials 

‐24‐ to 48‐hour tryptic soy broth culture of Escherichia coli  

‐autoclave  

‐petri plates 

‐culture tubes 

‐test‐tube rack or wire basket 

‐test‐tube caps 

‐defined culture medium as in Table 1 

‐complex culture medium as in Table 2 

‐2‐liter Erlenmeyer flask 

‐10‐ml pipettes 

‐aluminium foil paper  

‐balance 

‐agar 

‐water bath set at 48° to 50°C 

‐boiling water bath 

‐stirring glass rod  

‐Bunsen burner or hot plate 
39
 

Method 

Table 9a: A Chemically Defined Medium 

Preparing a Chemically Defined Medium 

1. Prepare 500 ml of glucose‐mineral salts broth for the culture of E. coli using the recipe 

outlined in table 9a. To a 1‐liter Erlenmeyer flask add 375 ml of distilled water. Weigh out 

and add each ingredient to the water in the order listed and stir after each addition until the 

ingredient is completely dissolved. Remember to halve the quantity of each ingredient. Add 

the remaining 125 ml of water to wash the inside of the flask.  

2. Adjust the pH to 7.2 to 7.4 by adding just enough HCl or NaOH dropwise . 

3. Dispense 3 to 5 ml of the glucose‐mineral salts broth into each of 10 test tubes using a 10‐

ml pipette and then loosely cap the tubes. Other students can use the remaining 450 ml of 

broth for their tubes. Place your tubes in a test‐tube rackor basket. Place the basket or rack 

in the autoclave. 

. 

Table 9b: A Complex (Undefined) Medium Tryptic Soy Broth

40
  

Preparing a Complex Medium 

1. Prepare 500 ml of tryptic soy broth according to the recipe outlined in table 9b. 

2. Add 375 ml of distilled water to a 1‐liter Erlenmeyer flask and add the ingredients 

individually (use half the amounts given); mix after each addition. 

3. Add the remaining 125 ml of water to rinse the sides of the flask. 

4. Adjust the pH to 7.3 by adding just enough HCl or NaOH dropwise . 

5. Dispense 3 to 5 ml of the broth into each of 10 tubes and loosely cap them. Place the 

tubes in a test‐tube rack or basket, and place in the autoclave. 

6. To the remaining broth (450 ml), add 7.2 g of agar to give an agar concentration of 

approximately 1.6%. Heat the contents of the flask and gradually bring to a boil. Heat the 

agar until it is completely melted. Cover with aluminum foil and place in the autoclave. After 

autoclaving, cool the flask of sterile agar in a 48° to 50°C water bath. Line up the desired 

number of sterile petri plates on the bench top. Remove the aluminum foil cap from the 

flask and briefly flame the flask’s neck. Lift the top of each plate, pour about 15 ml of agar, 

and quickly replace the top (the agar should be approximately 3 to 5 mm deep in the plate). 

Pour all plates without stopping. Alternatively, after dissolving the agar medium, dispense 

15‐ml portions into 18 x150 mm tubes; cap and autoclave the tubes. Cool them in a 48° to 

50°C water bath and pour the agar  

41
Procedure for Autoclaving 

1. Your instructor will demonstrate the use of the autoclave. 

2. Load the autoclave with the freshly prepared culture media. 

3. Close and lock the autoclave door. 

Preparing Agar Plates 

1. As outlined previously and use some of the sterilized tryptic soy agar to prepare 

agar plates. 

2. When the plates are cool (agar solidified), invert them to prevent condensing moisture 

from accumulating on the agar surfaces. 

3. All plates and tubes should be incubated for at least 24 hours to ensure sterility before 

you use them. 

Results 

Describe your experiences in the preparation of both Defined and Undefined media 

Question 

1.After at least 24 hours of incubation, do your prepared plates and broths appear to be 

sterile? Explain your answer. 

2.Why are culture media sterilized before use? 

3. Describe three ways for sterilizing culture media and supplies. 

4.Why are petri plates inverted after they cool? 

5. Why is culture medium cooled to about 48° to 50°C before it is poured into petri plates? 

42
WEEK 10.EXPERIMENT TEN: THE EFFECTS OF CHEMICAL AGENTS ON 
BACTERIA (I) DISINFECTANTS 
Introduction 

Although many microorganisms are beneficial and necessary for human well‐being, 

microbial activities may have undesirable consequences, such as food spoilage and disease. 

Therefore it is essential to be able to kill a wide variety of microorganisms or inhibit their 

growth to minimize their destructive effects. The goal is twofold: (1) to destroy pathogens 

and prevent their transmission, and (2) to reduce or eliminate microorganisms responsible 

for the contamination of water, food, and other substances From the beginning of recorded 

history, people have practiced disinfection and sterilization, even though the existence of 

microorganisms was long unsuspected. The Egyptians used fire to sterilize infectious 

material and disinfectants to embalm bodies, and the Greeks burned sulfur to fumigate 

buildings. Mosaic law commanded the Hebrews to burn any clothing suspected of being 

contaminated with the leprosy bacterium. Today the ability to destroy microorganisms is no 

less important: it makes possible the aseptic techniques used in microbiological research, 

the preservation of food, and the prevention of disease. The techniques are also essential to 

personal safety in both the laboratory and hospital. There are several ways to control 

microbial growth: osmotic activity, pH, temperature, O2, and radiation physical and 

chemical agents in food preservation 

Principle 

Many factors influence the effectiveness of chemical disinfectants and antiseptics. The 

microbicidal (to kill) or microbiostatic (to inhibit) efficiency of a chemical is often 

determined with respect to its ability to deter microbial growth. The first part of this 

exercise will examine this effect of several chemicals. More specifically, the microbicidal 

43
efficiency of a chemical is often determined with respect to phenol and is known as the 

phenol coefficient (PC). The phenol coefficient is calculated by dividing the highest dilution 

of the antimicrobial of interest, which kills all organisms after incubation for 10 minutes but 

not after 5 minutes, by the highest dilution of phenol that has the same characteristics. 

Chemicals that have a phenol coefficient greater than 1 are more effective than phenol, and 

those that have a phenol coefficient less than 1 are less effective than phenol. However, this 

comparison should only be used for phenol‐like compounds that do not exert bacteriostatic 

effects and are not neutralized by the subculture media used. 

Materials 

‐20‐hour tryptic soy broth cultures of 

‐Staphylococcus aureus  

‐Pseudomonas aeruginosa  

‐2 sterile screw‐cap test tubes 

‐1 sterile 5‐ml pipette with pipettor 

‐12 sterile 1‐ml pipettes 

‐48 tryptic soy broth tubes (10 ml per tube) 

‐sterile water in Erlenmeyer flask 

‐12 sterile tubes for making dilutions 

‐bleach 

‐commercial disinfectants such as 3% hydrogen peroxide, 70% isopropyl alcohol, and 

bleach.Dilute with       k normal tap water. The tap water need not be sterilized for 

commercial disinfectants. Note if any of the disinfectants contain triclosan. Why is this 

important? 

‐phenol (carbolic acid) 
44
‐wax pencil 

‐35°C incubator 

‐test‐tube rack 

‐Bunsen burner 

‐inoculating loop 

Method 

First Period 

Growth Inhibition 

1. Each group of students should select one of the disinfectants and, if necessary, dilute it 

according to the specifications on the label (the use dilution).  

2. Place 5 ml of disinfectant into two sterile tubes. Add 0.05 ml of P. aeruginosa to one tube 

and 

0.05 ml of S. aureus to the other. 

3. Using the wax pencil, label the tubes with your name and those of the respective 

bacteria. Mix 

each of the tubes in order to obtain a homogeneous suspension. 

4. At intervals of 1, 2, 5, 10, and 15 minutes, transfer 0.1 ml of the mixture containing the 

bacteria and disinfectant to separate tubes of tryptic soy broth. Do this for both bacteria. 

Also 

inoculate two tubes of broth with 0.1 ml of both bacteria and mark these “controls.” 

5. Incubate all tubes for 48 hours at 35°C. 

Phenol Coefficient  
45
1. Dilute phenol in sterile distilled water 1/80, 1/90, and 1/100; dilute the bleach 1/400, 

1/450, and 1/500 so that the final volume in each tube is 5 ml.  

2. Label 18 tryptic soy broth tubes with the name and dilution of disinfectant, the time 

interval of the subculture (e.g., 5 minutes, phenol 1/80), and your name. Each dilution 

should be tested after 5, 10, and 15 minute incubations. 

3. Place in order in a test‐tube rack, one test tube of each of the different bleach and phenol 

dilutions for each time interval.  

4. Add 0.5 ml of S. aureus to each tube of disinfectant and note the time. Mix each of the 

tubes in order to obtain a homogeneous suspension and allow the disinfectant to come 

into contact with the bacteria. 

5. Using aseptic technique, at intervals of 5, 10, and 15 minutes, transfer one loopful from 

each disinfectant tube into the appropriately labeled tryptic soy broth tube. 

6. Incubate all tubes for 48 hours at 35°C. 

Second Period 

Growth Inhibition 

1. Shake and observe each of the tubes for growth. Record the presence of growth as + and 

the absence of growth as –. Tabulate your results as well as the results of the class in Part 1  

Phenol Coefficient 

1. Shake and observe all tryptic soy broth cultures for the presence (+) or absence (–) of 

growth. 

2. Record your observations  

3. From your data, calculate the phenol coefficient for bleach. For example, assume a 1/20 

dilution of phenol (1 part phenol in a total of 20 parts liquid) kills S. aureus within 10 

minutes. A 1/300 (1 to 300) dilution of bleach also kills S. aureus within 10 minutes. 

PC = 300 or 1/20 
46
20 1/300 

PC = 15 

Thus, bleach is 15 times more effective than phenol in killing S. aureus. 

Results 

Tabulate your results in a presentable manner and comment about them 

Question 

1. List some criteria of a good disinfectant. 

2. What is the phenol coefficient technique? 

3. What physical factors can influence the activity of a disinfectant? 

4. Why do microorganisms differ in their response to disinfectants? 

47
WEEK 11.EXPERIMENT ELEVEN: THE EFFECTS OF CHEMICAL AGENTS 
ON BACTERIA (II): ANTIMICROBIAL AGENTS (KIRBY‐BAUER 
METHOD) 
Introduction 

The term chemotherapy is most closely associated in the minds of most people with 

the treatment of cancer. In fact the term was first used by Paul Ehrlich to describe any 

use of a drug or other chemical substance for the treatment of disease; thus, it has 

much wider terms of reference. In our present discussion, we shall confine ourselves to 

chemotherapy as it relates to the treatment of infectious diseases. It was Ehrlich who, 

100 years ago, observed how certain dyes would stain bacteria but not the surrounding 

tissues, leading him to formulate the idea of selective toxicity, whereby a substance 

would selectively target harmful microorganisms but leave human tissues undamaged. He 

tested hundreds of synthetic compounds in the search for his ‘magic bullet’ before finding, 

in 1910, an arsenic‐containing drug, Salvarsan, which was effective against Treponema 

pallidum, the causative agent of syphilis.The other major breakthrough in the treatment of 

infectious diseases was of course the discovery of naturally occurring antimicrobial agents, 

or antibiotics. These are metabolites produced by certain microorganisms, which inhibit the 

growth of certain other microorganisms. As we shall see, the definition has been extended 

to include semisynthetic derivatives of these naturally occurring molecules. 

Principle 

One method that is used to determine antibiotic susceptibility is the sensitivity disk method 

of Kirby‐Bauer (named after W. Kirby and A. W. Bauer in 1966). In this method, antibiotics 

are impregnated onto paper disks and then placed on a seeded Mueller‐Hinton agar or 

nutrient agar plate using a  mechanical dispenser or sterile forceps. The plate is then 

48
incubated for 16 to 18 hours,and the diameter of the zone of inhibition around the disk is 

measured to the nearest millimeter. The inhibition  zone diameter that is produced will 

indicate the susceptibility or resistance of a bacterium to the antibiotic (figure 11). Antibiotic 

susceptibility patterns are called antibiograms. Antibiograms can be determined by 

comparing the zone diameter obtained with the known zone diameter size for susceptibility. 

Figure 11 A Kirby-Bauer Plate. A Nutrient agar plate inoculated with S. aureus and various antibiotics. The

diameter of zones of inhibition of the antibiotics is indicated

                                           

 For example, a zone of a certain size indicates susceptibility, zones of a smaller diameter or 

no zone at all show that the bacterium is resistant to the antibiotic. Frequently one will see 

colonies within the zone of inhibition when the strain is antibiotic resistant. Many factors 

are involved in sensitivity disk testing and must be carefully controlled. These include size of 

the inoculum, distribution of the inoculum, incubation period, depth of the agar, diffusion 

rate of the antibiotic, concentration of antibiotic in the disk, and growth rate of the 

bacterium. If all of these factors are carefully controlled, this type of testing is highly 

satisfactory for determining the degree of susceptibility of a bacterium to a certain 

antibiotic. The Kirby‐Bauer method is not restricted to antibiotics.  t may also be used to 
49
measure the sensitivity of any microorganism to a variety of antimicrobial agents such as 

sulfonamides and synthetic chemotherapeutics. 

Figures 11 and 12 illustrate the Kirby‐Bauer method. 

Materials 

‐4 Mueller‐Hinton  or Nutrient agar plates 

‐antibiotic disks 

‐4 sterile swabs 

‐4‐ to 6‐hour tryptic soy broth cultures of Staphylococcus aureus ,Escherichia coli , 

Pseudomonas 

aeruginosa , and Klebsiella pneumoniae  

‐35°C incubator 

‐Forceps 

‐Metric rulers 

‐Wax pencil 

‐70% ethyl alcohol and beakers 

‐Bunsen burner 

Method 

First Period 

1. With a wax pencil, mark the lid of each Mueller‐ Hinton agar  or Nutrient agar plate with 

your name, date, and the name of the bacterium to be inoculated. Each group of students 

will inoculate the surface of four Mueller‐Hinton plates with S. aureus, E. coli,P. aeruginosa, 

and K. pneumoniae, respectively.  Use a separate, sterile cotton swab for each bacterium. 
50
The swab is immersed in the culture tube, and the excess culture is squeezed on the inner 

side of the test tube. If there are sufficient  supplies, you may wish to analyze the 

antimicrobial sensitivity of microorganisms from your throat.  

2. The swab is then taken and streaked on the surface of the Mueller‐Hinton plate three 

times, rotating the plate 60° after each streaking. Finally, run the swab around the edge of 

the agar. This procedure ensures that the whole surface has been seeded. Allow the culture 

to dry on the plate for 5 to 10 minutes at room temperature with the top in place. 

51
                             Figure 12 Antibiogram Testing  for Sensitivity 

3. Dispense the antibiotics onto the plate either with the multiple dispenser or individually 

with the single unit dispenser. Make sure that contact is made between the antibiotic disk 

and the culture by gently pressing the disk with alcohol‐flamed forceps. DO NOT PRESS THE 

DISK INTO THE AGAR, AND DO NOT MOVE THE DISK ONCE IT IS PLACED ON THE AGAR. 

4. Incubate the plates for 16 to 18 hours at 35°C. DO NOT INVERT THE PLATES. 

52
Second Period 

Result 

Measure the zones of inhibition to the nearest mm for each of the antibiotics tested. Record 

the results in the lab book. For each antibiotic, determine whether the bacteria are resistant 

or susceptible. 

Question 

1. How can you determine whether the zone of inhibition is due to death or to inhibition of 

a bacterium? 

2. What factors must be carefully controlled in the Kirby–Bauer method? 

3. In which growth phase is a bacterium most sensitive to an antibiotic? 

4. What are some reasons bacteria are becoming more resistant to antibiotics? 

53
 WEEK 12.EXPERIMENT TWELVE: PREPARATION OF PURE CULTURE 
FROM MIXED CULTURE (STREAK‐PLATE TECHNIQUE) 
 

Introduction 

In natural habitats microorganisms usually grow in complex, mixed populations containing 

several species. This presents a problem for the microbiologist because a single type of 

microorganism cannot be studied adequately in a mixed culture. One needs a pure culture, 

a population of cells arising from a single cell, to characterize an individual species. Pure 

cultures are so important that the development of pure culture techniques by the German 

bacteriologist Robert Koch transformed microbiology. Within about 20 years after the 

development of pure culture techniques most pathogens responsible for the major human 

bacterial diseases had been isolated 

Principles 

If a mixture of cells is spread out on an agar surface so that every cell grows into a 

completely separate colony, a macroscopically visible growth or cluster of microorganisms 

on a solid medium, each colony represents a pure culture. Isolated, pure colonies can be 

obtained by the streak‐plate technique. In this technique, the bacterial mixture is 

transferred to the edge of an agar plate with an inoculating loop and then streaked out over 

the surface in one of several patterns. At some point on the streaks, individual cells will be 

removed from the loop as it glides along the agar surface and will give rise to separate 

colonies 

54
Materials 

(Streak‐Plate Technique 1)  

‐24‐ to 48‐hour tryptic soy broth culture mixture containing  Escherichia coli , 

Staphylococcus aureus, and  

 Bacillus subtilis  

‐3 tryptic soy agar pours 

‐boiling water bath 

‐48° to 50°C water bath 

‐Bunsen burner 

‐petri plates 

‐inoculating loop 

‐wax pencil 

Method 

1. Melt three sterile, capped tubes of tryptic soy agar by heating them in a boiling water 

bath until melted 

2. Cool the tubes in a 48° to 50°C water bath for 10–15 minutes. 

3. Remove the cap, flame the lip of the tube, and pour the agar into a petri plate. Be careful 

to keep the lid of the plate covering the bottom and the mouth of the tube while pouring 

the agar. Do the same for the other two plates. 

4. After pouring the plates, allow them to cool for a few minutes on the bench top. With a 

wax pencil, mark on the bottom of the plate the name of the bacterium to be inoculated, 

your name, and date.Also draw four quadrants on the bottom of the plate, as illustrated in 

figure 1, to aid you in keeping track of your streaks  

5. Aseptically remove a loopful of the bacterial mixture  
55
6. Streak out the loopful of bacteria on the agar plate that you have prepared as follows: 

a.( CHECK  FIGURE 12) Carefully lift the top of the petri plate just enough to insert 

your inoculating loop easily. The top should cover the agar surface as completely as 

possible at all times in order to avoid contamination. Insert the inoculating loopful of 

bacteria and spread it over a small area (area 1) at one edge of the plate  in order to 

make effective use of the agar surface. This is accomplished by letting the loop rest 

gently on the surface of the agar and then moving it across the surface each time 

without digging into the agar. 

b. Remove the inoculating loop and kill any remaining bacteria by flaming them. 

Then insert the loop under the lid and cool it at the edge of the agar near area 1. 

c. Rotate the plate while carefully keeping in mind where the initial streaks ended 

(use the marked quadrants as a guide) and cross over the streaks in area 1. Streak 

out any bacteria picked up as shown in area 2. 

d. Remove the loop, flame it, cool in the agar as before, and repeat the streaking 

process ( area 3). 

e. If necessary, you can repeat this sequence once more to make a fourth set of 

streaks (area 4). Use fewer cross‐streaks here than in the previous quadrant. 

f. Repeat the above procedure (a–e) for the other two bacteria on two new petri 

plates. 

56
  
Figure 12 Streaking of Plate. The arrows indicate motion of the loop. In b, flame and cool the loop between 1

and 2, 2 and 3, and 3 and the end of the streak. The aim is to thin the numbers of bacteria growing in each

successive area of the plate as it is rotated and streaked so that well isolated colonies will appear in quadrant 3.

7. Incubate the plates at 30° to 37°C for 24 to 48  hours in an inverted position. 

Result 

Afterwards, examine each of the agar plates to determine the distribution and amount of 

growth in the three or four streaked areas and record your results 

Question 

1.Which area of a streak plate will contain the greatest amount of growth? The least 

amount of growth? Explain your answers. 

2. How can a streaked plate become contaminated? 
57
 WEEK 13. EXPERIMENT THIRTEEN: PREPARATION OF PURE 
CULTURE FROM MIXED CULTURE (POUR PLATE TECHNIQUE) 
Principles 

The pour‐plate technique also will yield isolated colonies and has been extensively used 

with bacteria and fungi. The original sample is diluted several times to reduce the microbial 

population sufficiently to obtain separate colonies upon plating (figure 1). The small 

volumes of several diluted samples are added to sterile petri plates and mixed with liquid 

tryptic soy agar that has been cooled to about 48° to 50°C. Most bacteria and fungi will not 

be killed by the brief exposure to the warm agar. After the agar has hardened, each cell is 

fixed in place and will form an individual colony if the sample is dilute enough. Assuming no 

chaining or cell clusters, the total number of colonies are equivalent to the number of viable 

microorganisms in the diluted sample. To prepare pure cultures, colonies growing on the 

surface or subsurface can be inoculated into fresh medium. 

Materials 

‐24‐ to 48‐hour mixed tryptic soy broth culture mixture containing  Escherichia coli , 

Staphylococcus aureus, and   Bacillus subtilis  

‐3 tryptic soy agar pour tubes 

‐3 9‐ml sterile 0.9% NaCl (saline) blanks 

‐48° to 50°C water bath 

‐boiling water bath 

‐wax pencil 

‐3 petri plates 

‐inoculating loop 

‐Bunsen burner 

58
‐3 sterile 1‐ml pipettes with pipettor 

Method 

1. With a wax pencil, label three sterile saline blanks 1 to 3. 

2. Melt the tryptic soy agar deeps in a boiling water bath and cool in a 48° to 50°C bath for 

at least 10 to 15 minutes  

3. With a wax pencil, label the bottoms of three Petri  plates 1 to 3, and add your name and 

date. 

4. Inoculate saline tube 1 with 1 ml of the MIXED bacterial culture using aseptic technique 

and MIX thoroughly. This represents a 10–1 dilution. 

5. Using aseptic technique, immediately inoculate tube 2 with 1 ml from tube 1; a 10–2 

dilution. 

6. Using aseptic technique, mix the contents of tube 2 and use it to inoculate tube 3 with 1 

ml; a 10–3      dilution.  

7. After tube 3 has been inoculated, mix its contents, remove the cap, flame the top, and 

aseptically transfer 1 ml into petri plate 3. Then inoculate plates 1 and 2 in the same way, 

using 1 ml from tubes 1 and 2, respectively.  

8. Add the contents of the melted tryptic soy agar pours to the petri plates. Gently mix each 

agar plate with a circular motion while keeping the plate flat on the bench top. Do not allow 

any agar splash over the side of the plate! Set the plate aside to cool and harden. 

9. Incubate the plates at 30° to 37°C for 24 to 48 hours in an inverted position. 

59
  
Figure 13 The Pour-Plate Technique. The original inoculum is diluted several times to thin out or dilute the

population sufficiently. 1 ml of each dilution is then dispensed into a sterilea petri plate. Plate count Agar pours

are then added to each plate. Isolated cells grow into colonies and can be used to establish pure cultures. .

Result 

Afterwards, examine each of the pour plates on the distribution and amount of growth and 

record your results. Comment on your results. 

 
60
Question 

1. Which area of a streak plate will contain the greatest amount of growth? The least  

amount of growth? Explain your answers. 

2. How can a streak plate become contaminated? 

61
 WEEK 14.EXPERIMENT FOURTEEN :CULTIVATION OF ANAEROBIC 
BACTERIA 

Introduction 

One of the environmental factors to which bacteria and other microorganisms are quite 

sensitive is the presence of O2. For example, some microorganisms will grow only in the 

presence of O2 and are called obligate aerobes. Facultative anaerobes will grow either 

aerobically or in the absence of O2, but better in its presence. Strict obligate anaerobes will 

grow only in the absence of O2 and are actually harmed by its presence. Aerotolerant 

anaerobes are microorganisms that cannot use O2 but are not harmed by it either. Finally, 

microorganisms that require a small amount of O2 for normal growth but are inhibited by 

O2 at normal atmospheric tension are called microaerophiles. These variations in O2 

requirements can be easily seen by inoculating a tube of molten agar with the bacterium in 

question, mixing the agar thoroughly without aerating it, and allowing it to solidify. The 

bacteria will grow in the part of the agar deep culture that contains the proper O2 

concentration The damaging effects of O2 on anaerobic bacteria create difficult culturing 

problems. Ideally, one should not only provide an O2‐free environment, but one that has an 

adequate amount of moisture for bacterial growth. It is also necessary to have CO2 present 

for the growth of many anaerobic bacteria. There are a number of ways in which anaerobic 

bacteria may be cultured. For those bacteria that are not really fastidious anaerobes, growth 

can occur on nutrient agar slants if anaerobic conditions are created. This setup is called a 

Wright’s tube (named after James H. Wright, American physician, 1901–1978) (figure 14.1).  

The anaerobic condition is created using pyrogallol and NaOH. In the presence of NaOH, 

pyrogallol is oxidized and removes O2 very effectively in the process. After the anaerobic 

bacterium has been streaked out on the surface of the agar slant, the cotton plug is 

trimmed and then pushed into the culture tube until it rests just above the top of the slant. 
62
The space between the top of the cotton plug and the open end of the culture tube is then 

filled with pyrogallol crystals, and 1 ml of 10% NaOH is added. The tube is closed with a 

rubber stopper and is immediately inverted. It is incubated upside down. Anaerobic bacteria 

may also be grown in special anaerobic  jar system called GasPak Anaerobic System. In the 

GasPak System (figure 14.2), hydrogen and CO2 are generated by a GasPak envelope after 

the addition of water. A palladium catalyst (pellets) in the chamber lid catalyzes the 

formation of water from hydrogen and O2, thereby removing O2 from the sealed chamber. 

Figure 14.1 Preparation of an Anaerobic Wright’s Tube. Pyrogallol is a reducing agent that is activated by

NaOH to remove oxygen from the tube and create anaerobic conditions.

   

Figure 14.2 The GasPak System.

63
 

Principles 

One of the most convenient approaches to create anaerobiosis is is to employ a specially 

designed commercial anaerobic broth. Two of the most useful are cooked meat medium 

and thioglycollate broth. Thioglycollate medium can be purchased with methylene blue or 

resazurin as an oxidationreduction indicator. When this medium begins to turn bluish or 

reddish, it is becoming too aerobic for the culture of anaerobic bacteria. 

Materials 

‐24‐ to 48‐hour broth cultures of Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli  and ‐Clostridium 

sporogenes 

‐boiling water bath 

‐48° to 50°C water bath 

‐4 thioglycollate broth tubes 

‐inoculating loop 

‐2 tryptic soy agar plates 

‐sterilized Brewer’s anaerobic covers 

64
 ‐GasPak Anaerobic System  

‐4 tryptic soy agar slants 

‐scissors 

‐cotton plugs 

‐pyrogallol crystals (poisonous) 

‐10% NaOH (caustic) 

‐test tubes 

‐rubber stoppers 

‐test‐tube rack 

‐wax pencil 

‐disposable gloves 

‐spatula for handling pyrogallol crystals and soil 

‐1‐ml pipette with pipettor 

‐garden soil 

Method 

The Relationship of O2 to Bacterial Growth 

1. Melt three  tryptic  agar deeps and heat them in a boiling water bath for a few minutes in 

order to drive off any O2. 

2. Cool the deeps in a water bath 48° to 50°C. 

 3. With a wax pencil, label each tube with the name of the bacterium to be inoculated, your 

name, and date. 

4. Using aseptic technique inoculate each cooled deep with 1 or 2 loopsful of one of each of 

the three different bacteria (P. aeruginosa, C. sporogenes, and E. coli). 

65
5. Mix the bacteria throughout the agar without aerating it by rolling each tube between the 

palms of your hands. 

6. Allow the agar to harden and incubate the three tubes for 24 to 48 hours at 35°C. 

Broth Culture of Anaerobic Bacteria 

1. With a wax pencil, label three freshly steamed thioglycollate broth tubes with P. 

aeruginosa, C. sporogenes, and E. coli, as well as your name and date. 

2. Using aseptic procedures, inoculate the three broth tubes. Do not shake these tubes to 

avoid oxidizing the medium! Methylene blue or resazurin is present in the medium as an 

oxidation‐re duction indicator. If more than 1/3  the broth is bluish or reddish in color, the 

tube should be reheated in a water bath in order todrive off the O2 before use.  

3. Incubate the tubes at 35°C for 24 to 48 hours.. 

Slant Culture of Anaerobic Bacteria in a Wright’s Tube 

1. With a wax pencil, label four tryptic soy agar slants—two with P. aeruginosa and two with 

C. sporogenes, and your name and date. 

2. Using aseptic technique, inoculate each slant with the respective bacterium. 

3. Incubate two slants (one of each bacterium) aerobically at 35°C for 24 to 48 hours. 

4. With the other two slants, cut off the cotton plug  with a pair of scissors (figure 1), and 

with the m butt of the inoculating loop, push it into the tube until it almost touches the top 

of the slant. While  wearing gloves, fill the space above the cotton with pyrogallol crystals 

and add 1 ml of 10% NaOH. Quickly stopper the tube with a rubber stopper and invert the 

tube. 

5. Place in a test‐tube rack and incubate inverted at 35°C for 24 to 48 hours. 

Isolation of Anaerobes from the Soil 

1. Place a spatula of soil in a thioglycollate broth tube. 
66
2. Incubate at either 30° or 37°C for one day  

3. Observe culture tubes for growth in the form of turbidity and the production of 

fermentation gases. 

Result 

Record your growth results 

Question 

1. Explain how an anaerobic atmosphere can be created in a jar. 

2. Explain what happens in a Wright’s tube. 

3. Differentiate between the following: 

a. an obligate anaerobe 

b. an obligate aerobe 

c. a facultative anaerobe 

d. an aerotolerant anaerobe 

e. a microaerophile 

67
 WEEK 15. EXPERIMENT FIFTEEN: CULTIVATION AND 
IDENTIFICATION OF FUNGI 
 

Introduction 

The fungi comprise a large group of eukaryotic nonphotosynthetic organisms that include 

such diverse forms as slime molds,  mushrooms, puffballs, yeasts, and molds. Fungi may be 

saprophytic or parasitic and unicellular or filamentous. Fungi are of great importance 

economically and socially, and may have beneficial or detrimental effects. Many fungi, 

particularly yeasts, are involved in industrial fermentation processes.Yeasts are unicellular, 

do not have flagella and reproduce asexually by budding or transverse fission, or sexually by 

spore formation. Multicellular forms such as moulds have long, branched, threadlike 

filaments called hyphae, which aggregate together to form a tangled mycelium  In some 

fungi the hyphae have crosswalls or septa (sing: septum) separating cells, which may 

nevertheless be joined by one or more pores, which permit cytoplasmic streaming, a form 

of internal transport. Such hyphae are said to be septate; others have no crosswalls and are 

therefore coenocytic. Most molds and yeasts occupy slightly acidic environments in the pH 

range of 4 to 6 

Principle 

Yeasts are unicellular fungi that are spherical, ellipsoidal,or oval in shape, and usually (with 

the exception of the dimorphic yeasts such as Candida) do not form hyphae (fungal 

filaments). They are about 5 to 10 times larger than bacteria. Yeasts commonly reproduce 

asexually by budding, a process in which a new  cell (called a daughter cell) is formed by the 

parent cell from a protuberance called a bud. When yeasts reproduce sexually, they 

produce several types of sexual spores (e.g., ascospores). The type of spore produced is 

68
very useful in classifying yeasts. Metabolic activities are also used to identify and classify 

yeasts. For example, the yeast Saccharomyces cerevisiae will ferment glucose but not 

sucrose. In the laboratory, Sabouraud dextrose agar is commonly used to isolate yeasts. It is 

a selective medium containing glucose and peptone, and has a low pH, which inhibits the 

growth of most other  microorganisms. 

Molds are multicellular, filamentous fungi. The techniques of culturing and observing fungi 

differ from the methods used to study bacteria. Fungi grow at comparatively slow rates, 

often requiring several days to weeks to form macroscopically visible colonies. Usually, the 

growth will spread over the entire culture plate. Molds produce spores on brightly colored 

aerial hyphae. Most molds grow best at room temperature (25°C) rather than at 35°C. The 

basic medium for the culture of many molds is Sabouraud dextrose agar. The high sugar 

concentration and low pH (5.6) of this medium make it unsuitable for the growth of most 

bacteria, thus guarding against contamination. Mold colonies may be examined directly in 

culture with a dissecting microscope. However, it is better to tease away a portion of the 

growth and place it on a slide with a drop of water or stain (a wet mount). An alternative 

method is a slide culture. 

Materials: 

‐7‐ to 10‐day Sabouraud dextrose plate culture of Saccharomyces cerevisiae,Rhodotorula 

species , Penicillium notatum and Aspergillus niger 

‐ commercial baker’s yeast 

‐2 Durham tubes 

‐iodine solution (3 ml water to 1 ml Gram’s iodine) 

‐methylene blue solution 

‐Bunsen burner 
69
‐inoculating loop 

‐clean glass slides 

‐coverslips 

‐wax pencil 

‐2 Sabouraud dextrose agar plates 

‐1 Sabouraud dextrose agar deep 

‐2 potato dextrose agar deeps 

‐35°C incubator 

‐1 glucose fermentation tube with Durham tube (0.5%peptone + 1% yeast extract + 1% 

glucose) 

‐1 sucrose fermentation tube with Durham tube (0.5%peptone + 1% yeast extract + 1% 

sucrose)  

‐sterile cotton swabs 

‐48° to 50°C water bath 

‐3 sterile petri plates 

‐22  40‐mm coverslips 

Method 

YEAST (FIRST PERIOD) 

1. With a wax pencil, draw two circles on a clean glass slide. Place several drops of the 

water‐iodine solution into one circle and several drops of the methylene blue solution into 

the other circle. 

2. Suspend a loopful of yeast culture into each circle. Place a coverslip over each. 

70
3. Examine both yeast cell preparations under low and high power. Note the shape and 

relative size and the presence or absence of budding . Look for the small nucleus and larger 

vacuole. 

4. Suspend a pinch of commercial baker’s yeast in 2 to 3 ml of warm water. With the 

inoculating loop, streak onto d of a Sabouraud dextrose agar plate. Using the inoculating 

loop, remove some S.cerevisiae from the stock plate. Streak the other half of the plate. 

Label the plate with your name, date, and yeast. Incubate the plate at 35°C until growth is 

seen. 

6. Inoculate about 1 ml of the commercial baker’s yeast suspension into a glucose 

fermentation tube and a sucrose fermentation tube. Incubate these tubes at 35°C and 

observe daily until growth is seen. Look for fermentation (gas bubbles in the Durham tubes) 

and growth as indicated by turbidity. 

7. Try to isolate S. albicans by swabbing the surface of your tongue. Streak a Sabouraud 

dextrose agar plate. Incubate the plate at 35°C until growth has occurred. 

Second Period 

1. Smell the Sabouraud dextrose agar plate. Observe the appearance of the yeast colonies. 

Record your results  

2. Examine the glucose and sucrose fermentation tubes. Record your results  

3. Examine the Sabouraud dextrose agar plate prepared by swabbing your tongue. Smell the 

plate. Stain several of the colonies with the methylene blue as in step 1 of the first period 

procedure. Record your results . 

 
71
MOLD  

Preparation and Observation of Colonies 

1. Melt one tube of Sabouraud dextrose agar and one of potato dextrose agar. 

2. Cool to 48° to 50°C in a water bath. 

3. Pour into two petri plates respectively and allow to harden. 

4. Using the wax pencil, label the Sabouraud dextrose agar plate Aspergillus and the potato 

dextrose agar plate Penicillium. Add your name and date to each plate. 

5. Using aseptic technique, inoculate the plates as labeled with a single loopful of the mold 

suspension. Place the loopful of mold inoculum in the center of the plate. Do not spread the 

inoculum. Handle plates carefully so that they are not jostled. 

6. Do not invert the petri plates. Incubate them at room temperature for 2 to 7 days. 

Preparation of Slides for Microscopic Examination of Molds 

1. Obtain two clean glass slides and coverslips.  

2. Flame the surface of the slides and coverslips in order to sterilize them. Use tweezers to 

hold the slides and coverslips. 

3. Use the wooden sticks (or a heated syringe) to transfer sufficient melted paraffin or 

silicone caulk to each slide to support the coverslip about 1 mm over the surface of the 

slide. Let the paraffin or silicone harden. Each slide should appear as in figure 15a. 

4. Heat the coverslips sufficiently so that they will form a seal when you set them over the 

hardened paraffin or silicone. Each slide should look like figure 15b. 

5. Melt and cool to 48° to 50°C a tube of Sabouraud dextrose agar (for Aspergillus) and a 

tube of potato dextrose agar (for Penicillium). Label the tubes accordingly. 

6. Using a sterile pipette, transfer and mix 0.5 ml of the proper mold suspension with the 

proper agar tube. 

72
7. For each mold, use a sterile Pasteur pipette and quickly let sufficient inoculated agar run 

under the coverslip of the prepared slide to half fill the chamber. Each slide should now 

appear as shown in figure15c. This procedure must be completed before the agar hardens. 

8. Moisten two circles of paper towel that just fit the bottom of the petri plates, and place 

one in each plate. Each slide should then be placed in its own petri plate. Label the plates 

accordingly. The slide should be supported above the moist paper by two wooden sticks or a 

piece of a V‐shaped glass rod (figure 15d). Place the lid on the petri plate and incubate at 

room temperature for 2 to 4 days. 

9. After incubation, observe the slides with a microscope, using the low‐power objective. 

Add a few drops of methylene blue in methanol to stain the various structures. (The alcohol 

is necessary to soften the cell wall and allow the stain to enter) . 

Figure 15 Mold Culture Slide 

73
 

Results 

1.Draw the representative yeast cells 

2. After the colonies have developed properly (figure 15d), sketch and describe the 

macroscopic appearance (e.g., color, texture) of each . Examine the hyphae and conidia 

under the microscopes and draw the conidia. 

Questions 

1.Can bacteriological media be used for the cultivation of molds? Explain your answer. 

2.Are Rhizopus hyphae coenocytic or septate? 

3.How would you describe the fruiting bodies of Aspergillus and  Penicillium? 

4.Why are stains not required for yeast identification? 

5.Why is Sabouraud dextrose agar used to cultivate yeasts? 

6.Why are yeast colonies larger than bacterial colonies? 

74