Tonoplast

Проводилось изучение фосфогидролазной и протеолитической активности белков вакуолей и тонопласта методами электрофореза и зимографии. Установлено, что с вакуолярной мембраной связан целый ряд кислых и щелочных фосфогидролаз, кислая фосфатаза, а также щелочная пирофосфатаза, присутствующая в двух изоформах. Кроме того, с белками тонопласта связана щелочная протеолитическая активность, отличная от кислой протеолитической активности, связанной с белками вакуолярного сока. Щелочная протеолитическая активность проявляется тиоловыми эндопептидазами, часть которых являются металлозависимыми. Выявлена способность этих ферментов к расщеплению собственных мембранных белков, что позволяет сделать предположение о вероятной роли ферментов не только в выполнении литической функции, но и в регуляции обновления белков на границе цитоплазмы и тонопласта, а через это в регуляции физиологических функций тонопласта.

Микроэлектродной техникой и методом крепления участка тонопласта в виде перегородки на отверстии стеклянной микропипетки изучались электрические параметры мембраны изолированной вакуоли клеток корнеплода красной столовой свеклы. Показано, что первый способ не обеспечивает стабильного измерения электрических характеристик из-за обволакивания кончика микроэлектрода мембраной вследствие ее высокой эластичности. Второй способ обеспечивает удовлетворительное снятие параметров при незначительных токах утечки в месте крепления мембраны. Средние значения сопротивления и емкости тонопласта клеток корнеплода красной столовой свеклы составляют 3,0 кОм·см 2 и 1,7 мкФ·см-2 соответственно. Параметры, обычно получаемые при помощи микроэлектродов, обусловлены аномально высокой проводимостью участка мембраны в месте контак-та с кончиком микроэлектрода из-за модификации этого участка до стрессового состояния. Изолированный тонопласт — микроэлектродная техника — крепление участка мембраны на микропипетке.

Influence of polyphenols on the protoplasm movement should  be considered in terms of their ability to undergo oxidation. Discussing the possible mechanism of the effect of quinones on the movement of protoplasm, it can be said that the most likely place of quinones attacks are sulfhydryl groups, in particular, of contractile proteins.
/ Влияние полифенолов на движение протоплазмы необходимо рассматривать с точки зрения их способности подвергаться окислению. Обсуждая возможный механизм влияния хинонов на движение протоплазмы, можно сказать, что наиболее вероятным местом атаки хинонов являются сульфгидрильные группы, в частности, контрактильных белков.

В работе представлены, данные по общему составу белков, липидов и углеводов во фракциях вакуолярных мембран, изолированных из корнеплодов красной столовой свеклы. Изучено относительное количество белков, извлекаемых из мембран различными буферными растворами (pH 8,3 и 7,5), содержащими хелатирующий агент (ЭДТА), нейонный (тритон Х-100) и ионный (додецилсульфат натрия) детергенты. Белок-липидное соотношение в основной и промытой фракциях равно соответственно 0,69 и 0,26. Содержание углеводов и белков в тщательно промытой фракции (подвергнутой замораживанию — оттаиванию для удаления немембранных примесей из полостей вакуолярных везикул) составляло 8 и 21% соответственно. Количества интегральных и периферических белков были 92,5 и 7,5%' от общего содержания белка в промытой фракции. Полученные результаты анализируются в связи с различными методами выделения и очистки мембран из растительных клеток. Обсуждается также роль мембранных компонентов в структуре и функционировании вакуолярной мембраны. Ключевые слова: Изолированная вакуолярная мембрана — белки — липиды — углеводы.

Vacuoles were isolated from leaves of Kalanchoë daigremontiana Hamet et Perrier de la Bathie, and the ionic sensitivity of the vacuolar ATPase was studied in vacuole homogenates desalted on Sephadex G-25. The ATPase activity was dependent on the presence of divalent cations (Mg2+≥ Mn2+≥ Ca2+, Co2+; Zn2+ had no effect). Mg2+-dependent ATPase activity was stimulated by anions (Cl− > malate2+, HCO−3), with maximal stimulation at concentrations above 50 mM. Mg2+-Dependent activity was inhibited by NO−3 above 2 mM, but no saturation was observed up to 100 mM. No stimulation by K+ or Na+ was detected; stimulation by NH+4 was abolished by 0.01% (w/v) Triton X-100, suggesting that the NH+4 effect was due to the permeability of vacuolar membrane vesicles to NH3.Trans-tonoplast electrical potentials (Δψ) and intra-vacuolar pH were measured with glass microelectrodes and antimony covered glass micro-pH-electrodes, respectively. Free vacuofes isolated from Kalanchoë tubiflora (Harv.) Hamet were slightly positive with respect to the suspension medium. This Δψ was insensitive to the protonophore FCCP and depolarized by about 4 mV on addition of 50 mM KCl, still remaining about +5 mV. Upon addition of 7 mM Mg-ATP, vacuoles showed an FCCP-sensitive increase of Δψ from +9.2 ± 2.8 (13) to +17.8 ± 3.7 (12) mV [given as x̄± sd (n)] and an internal acidification from pH 5.4 ± 0.2 (11) to pH 4.3 ± 0.4 (12). Mg-ADP and ATP without Mg2+ had no effect on Δψ.It is concluded that the H4 pumping at the tonoplast is due to the functioning of the anion-sensitive vacuolar ATPase and that this is an essential part of the mechanism of nocturnal acid accumulation in CAM.

The membranes of isolated plant vacuoles and vacuolar membrane vesicles in contact with artificial phospholipid membrane (BLM) can modify an artificial membrane by embedding the tonoplast components, some of which functions as ion channels.
/ Мембраны изолированных растительных вакуолей и везикулы вакуолярных мембран при взаимодействии с б.л.м. способны модифицировать искусственную фосфолипидную мембрану путем встраивания компонентов тонопласта, часть из которых функционирует как ионные каналы.

The yeast Saccharomyces cerevisiae expressing a cDNA library prepared from Stylosanthes hamata was screened for enhanced Mn2+ tolerance. From this screen, we identified four related cDNAs that encode membrane-bound proteins of the cation diffusion facilitator (CDF) family. One of these cDNAs (ShMTP1) was investigated in detail and found to confer Mn2+ tolerance to yeast by internal sequestration rather than by efflux of Mn2+. Expression of ShMTP1 in a range of yeast mutants suggested that it functions as a proton:Mn2+ antiporter on the membrane of an internal organelle. Similarly, when expressed in Arabidopsis, ShMTP1 conferred Mn2+ tolerance through internal sequestration. The ShMTP1 protein fused to green fluorescent protein was localized to the tonoplast of Arabidopsis cells but appeared to localize to the endoplasmic reticulum of yeast. We suggest that the ShMTP1 proteins are members of the CDF family involved in conferring Mn2+ tolerance and that at least one of these proteins (ShMTP1) confers tolerance by sequestering Mn2+ into internal organelles.