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Programa de clase • Temario • 31. TECNOLOGÍAS RELACIONADAS CON LA TERAPIA DE GENES I: Concepto, Requisitos para realizar estudios y recibir terapia génica • 32. TECNOLOGÍAS RELACIONADAS CON LA TERAPIA DE GENES II: Estrategias in vivo y ex vivo (virales y no virales), ARN's INTRODUCCION: Definiciones, química de nucleóUdos, química de ácidos nucleicos, síntesis de nucleóUdos en el organismo ESTRUCTURA DEL ADN: Niveles de estructuración y enrollamiento, diferencias 2 entre eucariotes y procariotes REPLICACIÓN I: CaracterísUcas, Principales elementos de la replicación, 3 Diferencias entre replicación eucarióUca y procarióUca REPLICACIÓN II: Reparación del ADN: reversión, remoción, respuesta SOS, 4 respuesta inducible TRANSCRIPCIÓN: CaracterísUcas, Diferencias entre traducción eucarióUca y 5 procarióUca SÍNTESIS DE PROTEÍNAS: CaracterísUcas, Diferencias entre traducción 6 eucarióUca y procarióUca 7CASCADA DE SEÑALIZACIÓN: Ejemplos CONTROL DE LA EXPRESIÓN GÉNICA I: Genes y elementos reguladores, Niveles 8 de regulación génica CONTROL DE LA EXPRESIÓN GÉNICA II: Regulación génica en células 9 bacterianas: operones inducibles y reprimibles CONTROL POSTRANSCRIPCIONAL (EUCARIOTICA): Procesamiento y 10 degradación del ARN, Interferencia del ARN y regulación génica CONTROL POSTRADUCCIONAL (EUCARIOTICA). Regulación génica en el 11 transcurso de la traducción o posterior a ella PRINCIPIOS, TÉCNICAS Y APLICACIONES DE LA TECNOLOGÍA DE 12ADNRECOMBINANTE Y LA MANIPULACIÓN DE LOS GENES: Clonación, enzimas de restricción, vectores, cribado ("screening") 13ANÁLISIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS. Electroforesis en gel y PCR 14MANIPULACIÓN DE GENES EN PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS. 15USOS DE LAS TÉCNICAS DE DNA RECOMBINANTE. ASPECTOS DE SEGURIDAD 1 I. BASES DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR II. REGULACIÓN GENÉTICA. III. MANIPULACIÓN DE GENES IV. DIAGNOSTICO MOLECULAR IMPACTO DE LA BM EN EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES ADQUIRIDAS Y CONGÉNITAS I: Tipos de herencia. Enfermedades monogénicas y 16 mulUfactoriales, Conceptos de locus, loci, homocigota, heterocigota, dominante, recesivo IMPACTO DE LA BM EN EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES ADQUIRIDAS Y 17CONGÉNITAS II: Polimorfismos/Variaciones de secuencia, Pedigrees y Análisis de patrones de herencia IMPACTO DE LA BM EN EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES ADQUIRIDAS Y 18 CONGÉNITAS III: Secuenciación EFECTOS DE LAS MUTACIONES EN LA SÍNTESIS Y FUNCIÓN PROTEICAS I. 19 Importancia, Categorías de las mutaciones EFECTOS DE LAS MUTACIONES EN LA SÍNTESIS Y FUNCIÓN PROTEICAS II. Tipos 20 de mutaciones génicas, Efectos fenompicos TECNOLOGÍA DEL HIBRIDOMA: Historia, Principios, Ventajas, Fases 21(inmunización, fusión, clonación, expansión, screening, subclonación, purificación) ANTICUERPOS DIAGNOSTICOS: Policlonales, Monoclonales, Reacción 22anmgeno anUcuerpo, Serología (precipitación, inmunodifusion, agluUnación y ELISA, inmunoflorescencia y WB). 23RELACIÓN DEL GENOTIPO Y FENOTIPO A NIVEL MOLECULAR PROBLEMAS TEÓRICOS Y PRÁCTICOS DE LOS MÉTODOS MODERNOS EN LA TERAPÉUTICA DE LAS ENFERMEDADES I: Medicina molecular y patogenia PROBLEMAS TEÓRICOS Y PRÁCTICOS DE LOS MÉTODOS MODERNOS EN LA 25 TERAPÉUTICA DE LAS ENFERMEDADES II: DiagnósUco molecular enfermedades heredadas y adquiridas PROBLEMAS TEÓRICOS Y PRÁCTICOS DE LOS MÉTODOS MODERNOS EN LA 26 TERAPÉUTICA DE LAS ENFERMEDADES III: Terapia génica MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES I: El vector, 27 Vectores procariotes, Vectores eucariotes MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES II: 28 Purificación de proteínas, Aplicaciones en medicina FACTORES Q INFLUENCIAN LA ELECCIÓN DE UN ORGANISMO O SISTEMA I: 29 Origen de la proteína, Propiedades de la proteína FACTORES Q INFLUENCIAN LA ELECCIÓN DE UN ORGANISMO O SISTEMA II: 30 Aplicación , Bioproceso TECNOLOGÍAS RELACIONADAS CON LA TERAPIA DE GENES I: Concepto, 31 Requisitos para realizar estudios y recibir terapia génica TECNOLOGÍAS RELACIONADAS CON LA TERAPIA DE GENES II: Estrategias in 32 vivo y ex vivo (virales y no virales), ARN's PRODUCCIÓN Y USO DE ANTICUERPOS MONOCLONALES: Usos: InvesUgación, 33diagnósUco (selección del anmgeno), TerapéuUco (Abs quiméricos y humanizados; Terapia anUtumoral). PAPEL DEL TRANSPLANTE DE ÓRGANOS, NEOFORMACION DE ÓRGANOS Y 34 ANIMALES TRANSGÉNICOS EN LA TERAPÉUTICA: Células madre, clases y usos 35REVISIÓN DE LA LEGISLACIÓN EN MÉXICO 36REVISIÓN DE LA LEGISLACIÓN INTERNACIONAL ASPECTOS BIOÉTICOS ESPECÍFICOS: CLONACIÓN, CÉLULAS MADRE 37 TOTIPOTENCIALES 24 V. TERAPEUTICA MOLECULAR VI. ASPECTOS BIOÉTICOS Y LEGALES Terapia génica 1963. Joshua Lederberg: “The ul>mate applica>on of molecular biology would be the direct control of nucleo>de sequences in human chromosomes, coupled with recogni>on, selec>on, and integra>on of the desired genes” Lederberg , J. In: Wolstenholme, G., ed. Man and His Future , 1963 5 6 Adaptado de: hBp://www.engage‐science.com/gene‐therapy‐the‐future‐of‐medicine/ 1970. Stanfield Rogers realizó el primer experimento de ingeniería gené>ca humana. Defecto gené>co: Arg↑ Virus Shope (papiloma de conejo) Arg↓ Rogers S, New ScienLst, 1970 7 • El experimento del virus Shope en humanos.....falló…¿por qué? • Leer: Stanfield Rogers: Insights into Virus Vectors and Failure of an Early Gene Therapy Model 8 Dos puntos importantes que llevaron a la concepción del ADN recombinante y la incipiente idea de terapia génica Caracterización de las endonucleasas de restricción Si>os específicos de acción de las nucleasas 9 Tratamientos Temas recurrentes en el diseño, aplicación y seguimiento de la terapia génica Vectores Sistemas de liberación 10 Terapia génica: ¿Cómo saber cuándo un desorden es un buen candidato para una terapia génica? 1. ¿La condición resultó de mutaciones en uno o más genes? ‐ Si 2. ¿Cuáles genes están involucrados? ‐ Conocer la secuencia, contar con una copia en el laboratorio. Los mejores candidatos son las en>dades monogénicas 3. ¿Qué se conoce sobre la biología de la enfermedad? ‐ Tejido afectado, papel de la proteína codificada por el gen mutado, las funciones de la proteína que son afectadas por el gen en cues>ón Terapia génica: ¿Cómo saber cuándo un desorden es un buen candidato para una terapia génica? 4. ¿Integrar una copia normal del gen, resolverá el problema? SÍ ‐ Depende, hay que descartar el problema del dominante nega>vo. ¿Por qué? 5. ¿Se puede “llevar” a las células los genes del tejido afectado? SÍ ‐ Accesibilidad del tejido, modo de distribución Terapia génica: Integración del gen ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ Consideraciones: Reconocimiento de las células correctas Ac>vación del gen Integración del gen en las células Minimizar efectos secundarios Retrovirus, adenovirus, virus adeno‐asociado, virus Herpes simple, liposoma, ADN desnudo ADN desnudo Adeno‐asociado Liposoma Retrovirus Herpes simple Adenovirus hbp://learn.gene>cs.utah.edu/content/genetherapy/gbools/ Vectores virales y no virales • • • • Ventajas de los vectores virales: Alta eficiencia para penetrar en las células Algunos son específicos para ciertos >pos de células Pueden ser modificados de modo que no se repliquen de forma patológica y destruyan a la célula que infectan • Desventajas de los vectores virales • El material gené>co que transportan es limitado • Pueden causar respuestas inmunológicas en los pacientes: – Pueden llevar un riesgo de enfermedad. – El sistema inmune puede bloquear al virus y la liberación del gen no se realiza o puede matar a las células una vez que el gen ha sido liberado Vectores virales y no virales • Plásmidos y liposomas • Ventajas: Podrían ser manipulados para liberar secuencias grandes, sin despertar una respuesta inmune • Desventajas: Menos eficientes que los virus para alcanzar sus blancos. • Se han desarrollado vectores sinté>cos llamados virosomas, los cuales son esencialmente liposomas con proteínas virales. Poseen la capacidad transportadora de los plásmidos con la eficiencia y especificidad de los virus. Las proteínas virales interactúan con las proteínas de superficie de la célula blanco, ocasionando que el virosoma se fusione con la membrana celular y deposite sus componentes en la célula In vivo, Ex vivo • Los genes pueden ser liberados de dos formas: in vivo o ex vivo • In vivo: El vector es inyectado directamente en el paciente. Puede generar respuestas inmunes • Ex vivo: Se libera el gen a las células que han sido removidas del cuerpo y se cul>van en el laboratorio. Cuando el gen es liberado, la integración y la ac>vación son confirmadas, las células son devueltas al paciente. Es menos probable que genere una respuesta inmune Tratamientos 18 Adaptado de: hBp://stemcells.nih.gov/info/scireport/pages/chapter11.aspx Tratamientos Micro ARN’s: Marcadores o blancos terapéuUcos 19 Tratamientos Estadís>cas Enero 2015, 2142 ensayos clínicos, con aspectos de terapia génica, se completaron, se encontraban en proceso, o habían sido aprobados para ser realizados. J Gene Med, Enero 2015 20 Tratamientos 21 22 23 Tratamientos Padecimientos investigados 24 Tratamientos 25 Tratamientos 26 Tratamientos 27 “The field of cancer gene therapy experienced an ‘awkward adolescence’. Although this field has certainly not yet reached maturity, it s>ll holds the poten>al of allevia>ng the suffering of many individuals with cancer”. Gillete, JP S.In: Gene Therapy of Cancer. Methods and Protocols, 20009 28 29 hbp://cbm.msoe.edu/stupro/so/module2012/volkerStory.html • hbp://www.youtube.com/watch? v=Ez560GnkSrE