WO2026008078A1 - Methods for kallikrein (klkb1) gene editing - Google Patents

Abstract

A method for Kallikrein (KLKB1) gene editing. Specifically, it provides a composition for reducing or eliminating the expression or function of the gene products of KLKB1 gene in a cell, comprising at least one guide RNA. Wherein the guide RNA comprises a spacer sequence.

Description

Methods for Kallikrein (KLKB1) gene editing FIELD OF THE INVENTION

The present disclosure belongs to the field of gene therapy.SEQUENCE LISTING

The present disclosure includes a sequence listing as a part of the disclosure.

BACKGROUND OF THE INVENTION

Hereditary angioedema (HAE) is a rare, potentially life-threatening disorder characterized by attacks of cutaneous and submucosal swelling. Most HAE are caused by the deficiency of C1 inhibitor (C1-INH) , which is coded by SERPING1. Without sufficient levels of functional C1-INH to inactivate plasma kallikrein (pKal) , high-molecular-weight kininogen (HMWK) is cleaved, producing bradykinin, which is the biologic mediator of swelling. pKal is the activated form of its preprotein, which is encoded by the KLKB1 gene, and thus, once kallikrein is abnormally activated, pKal increases levels of bradykinin. The excessive bradykinin in turn leads to fluid leakage through the vessel wall into body tissues. The excessive accumulation of fluid in body tissues eventually leads to swelling and pain in individuals with HAE. When the swelling affects the airways, it’s a life-threatening medical emergency.

In the clinic, the first-line prophylaxis or treatments for HAE acute attacks including plasma-derived or recombinant C1-INH (Berinert, CSL Behring; Ruconest, Pharming; Cinryze, Takeda; HAEGARDA, CSL Behring) , kallikrein inhibitor (Kalbitor, Takeda; Takhzyro, Takeda) and Bradykinin B2 receptor antagonist (Firazyr, Takera) . All the drugs require repeat-dosing. The present disclosure here, which knocks out the kallikrein coding gene KLKB1 by CRISPR/Cas, tries to find a one-time cure for HAE patients.

Gene editing techniques hold great potential for treating human diseases. Not only for genetic disorders, but also for common diseases, gene editing has its unique advantages beyond the reach of traditional approaches. Since its discovery after meganucleases, zinc finger nucleases (ZFN) and transcription activator-like effector nucleases (TALEN) , the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated (Cas) nuclease system (CRISPR/Cas) has rapidly become the most promising genome editing tool due to its simplicity and adaptability.

The native prokaryotic CRISPR-Cas system includes short repeat arrays with variable sequences of constant length (CRISPR) and CRISPR-associated (Cas) proteins.

Transcribed CRISPR RNA is processed by Cas proteins into small guide RNAs, typically with two components. There are six main system types: Class I includes Type I, III, and IV; Class II includes Type II, V, and VI. The Type II CRISPR-Cas9 system was the first engineered for eukaryotic genome editing. The Type V-B CRISPR-Cas12b system was the third reported engineered type. In the Cas12b system, guide RNA (gRNA) comprises CRISPR RNA (crRNA) and trans-acting RNA (tracrRNA) . The gRNA forms a complex with a Cas nuclease, binding target polynucleotides with a protospacer adjacent motif (PAM) and a protospacer. This binding induces target cleavage. The native CRISPR-Cas system acts as a prokaryotic immune system, silencing exogenous genetic elements like plasmids and phages. A single-guide RNA (sgRNA) can replace the crRNA-tracrRNA complex. Factors in gRNA development include efficacy (binding and cleavage efficiency) , specificity (minimizing off-target effects) , and stability. Chemical modifications to gRNA's nucleobase, carbohydrate, and phosphodiester linkage enhance stability and efficacy. Nucleobase modifications like 5-methyl-C and 5-propynyl increase thermal stability. Ribose modifications like 2’-O-methyl improve nuclease resistance. Phosphorothioate linkages enhance nuclease protection and cellular uptake.

Numerous novel CRISPR/Cas systems have been discovered. AaCas12b, a type V-B CRISPR system from Alicyclobacillus acidiphilus, has been adapted for mammalian genome editing and enhanced via protein engineering (AaCas12b^Max) . Its gRNA includes crRNA, tracrRNA, and an engineered scaffold sequence for efficiency.

Optimizing AaCas12b^Max mRNA and sgRNA is crucial for clinical in vivo genome editing for treating HAE.

SUMMARY OF THE INVENTION

The present disclosure provides a guide RNA comprising any one of (a) to (c) :(a) a spacer sequence comprising at least 95%, 90%, or 85%identical to a sequence selected from SEQ ID NOs: 2-160 and 407;(b) a spacer sequence comprising at least 16, 17, 18, 19 or 20 contiguous nucleotides of a sequence selected from SEQ ID NOs: 2-160, or at least 18, 19, 20, 21, 22 or 23 contiguous nucleotides of a sequence of SEQ ID NO: 407; or(c) a spacer sequence selected from SEQ ID NOs: 2-160 and 407.

In some embodiments, said guide RNA comprises a scaffold sequence shown as SEQ ID NO: 1.

In some embodiments, said guide RNA comprises at least one modification.

In some embodiments, said modification comprises at least one 2-O-methyl (2’-O-Me) modified nucleotide.

In some embodiments, said modification comprises at least one phosphorothioate (PS) bond between nucleotides.

In some embodiments, said spacer sequence is modified according to the pattern selected from SEQ ID NOs: 322-337.

In some embodiments, said scaffold sequence is modified according to the pattern of SEQ ID NOs: 321 or 354.

In some embodiments, the full-length sequence of said guide RNA is selected from SEQ ID NOs: 161-319.

In some embodiments, said guide RNA is modified according to the pattern selected from SEQ ID NOs: 338-353 and 355.

In another aspect, the present disclosure provides a composition comprising a guide RNA described herein.

In some embodiments, said composition further comprises a nuclease or nucleic acid encoding a nuclease.

In some embodiments, said nucleic acid encoding a nuclease comprises an mRNA comprising an open reading frame (ORF) encoding a nuclease.

In some embodiments, said nuclease is Cas12b.

In some embodiments, said composition is used for reducing or eliminating the expression or function of the gene products of KLKB1 gene in a cell.

The present disclosure provides a composition for reducing or eliminating the expression or function of the gene products of KLKB1 gene in a cell, comprising: an mRNA and at least one target-specific guide RNA, wherein the mRNA comprises a ribonucleotide sequence that encodes a Cas12b endonuclease.

In some embodiments, said guide RNA is capable of specifically recognizing a target sequence located within or near said KLKB1 gene or the regulatory element of said KLKB1 gene and hybridizing to it.

In some embodiments, said target sequence is located in one or more exonic regions of said KLKB1 gene.

In some embodiments, said target sequence is in exon 2, exon 3, exon 4, exon 5, exon 6, exon7, exon 8, exon 9, exon 10, or exon 11 of human KLKB1 gene.

In some embodiments, said target sequence is in exon 2 of human KLKB1 gene.

In some embodiments, the sequence of said guide RNA comprises a spacer sequence that is complementary or have complementarity to said target sequence in exon 2, exon 3, exon 4, exon 5, exon 6, exon 7, exon 8, exon 9, exon 10, or exon 11 of human KLKB1 gene.

In some embodiments, said spacer sequence is at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, or 90%identical to said target sequence in exon 2, exon 3, exon 4, exon 5, exon 6, exon 7, exon 8, exon 9, exon 10, or exon 11 of human KLKB1 gene.

In some embodiments, said spacer sequence: 1) is selected from SEQ ID NOs: 2-160 and 407, or 2) is at least 95%, 90%, or 85%identical to a sequence selected from SEQ ID NOs: 2-160 and 407, or 3) comprises at least 16, 17, 18, 19 or 20 contiguous nucleotides of a sequence selected from SEQ ID NOs: 2-160, or 4) comprises at least 18, 19, 20, 21, 22 or 23 contiguous nucleotides of a sequence selected from SEQ ID NOs: 407.

In some embodiments, the sequence of said guide RNA further comprises a scaffold sequence selected from SEQ ID NOs: 1.

In some embodiments, said guide RNA comprises at least one modification.

In some embodiments, said guide RNA comprises at least one modification at 1) 5’ terminus, and/or 2) 3’ terminus, and/or hairpin region.

In some embodiments, said modification comprises a 2-O-methyl (2’-O-Me) modified nucleotide.

In some embodiments, said modification comprises a phosphorothioate (PS) bond between nucleotides.

In some embodiments, said spacer sequence is modified according to the pattern selected from SEQ ID NO: 322-337.

In some embodiments, said scaffold sequence is modified according to the pattern of SEQ ID NO: 321 or 354.

In some embodiments, the full-length sequence of said guide RNA is selected from SEQ ID NOs: 161-319.

In some embodiments, said guide RNA is modified according to the pattern selected from SEQ ID NO: 338-353 and 355.

In some embodiments, said Cas12b endonuclease is capable of binding said target sequence via said guide RNA, thereby generating one or more single strand breaks (SSBs) or double strand breaks (DSBs) within or near said KLKB1 gene or said regulatory element of the KLKB1 gene.

In some embodiments, said one or more single strand breaks (SSBs) or double strand breaks (DSBs) are capable of leading to cleavage, deletion, modulation or inactivation of transcriptional control sequence or exonic region of said KLKB1 gene.

In some embodiments, said Cas12b endonuclease is a Cas12b protein from Alicyclobacillus acidiphilus (AaCas12b) .

In some embodiments, said Cas12b endonuclease comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 405.

In some embodiments, said mRNA comprises a ribonucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 320 and 356.

In some embodiments, said mRNA comprises at least one N1-methyl-pseudouridine substitution of its uridines.

In another aspect, the present disclosure provides a therapeutic composition comprising the composition described herein, encapsulated in a lipid nanoparticle (LNP) .

In some embodiments, said therapeutic composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.

In another aspect, the present disclosure provides a method of reducing or eliminating the expression or function of the gene products of KLKB1 gene in vivo or in vitro, comprising providing the composition described herein, or the therapeutic composition described herein.

In another aspect, the present disclosure provides a method of: 1) treating a subject having hereditary angioedema (HAE) , or 2) treating or preventing angioedema associated with HAE, bradykinin production and accumulation, bradykinin-induced swelling, angioedema obstruction of the airway, or asphyxiation, or 3) reducing total plasma kallikrein activity or reducing prekallikrein and/or kallikrein levels in a subject, comprising contacting a cell of the subject with the composition described herein, or the therapeutic composition described herein.

Additional aspects and advantages of the present disclosure will become readily apparent to those skilled in this art from the following detailed description, wherein only illustrative embodiments of the present disclosure are shown and described. As will be realized, the present disclosure is capable of other and different embodiments, and its several details are capable of modifications in various obvious respects, all without departing from the disclosure. Accordingly, the drawings and description are to be regarded as illustrative in nature, and not as restrictive.INCORPORATION BY REFERENC

All publications, patents, and patent applications mentioned in this specification are herein incorporated by reference to the same extent as if each individual publication, patent, or patent application was specifically and individually indicated to be incorporated by reference.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWING

FIG. 1 illustrates the four identified loci of A-domain to D-domain that were designed to introduce 2’-OMe and phosphorothioate modifications.

FIGs. 2A-2C illustrate the T7E1 and NGS results of gRNAs transfected with AaCas12b mRNA into Hep3B and Huh7.

FIGs. 3A-3L illustrate the T7E1 and NGS results of gRNAs transfected with AaCas12b mRNA into HepG2, Hep3B and Huh7 at the concentrations of 1 pmol and 0.33 pmol.

FIGs. 4A-4F illustrate the T7E1 and NGS results of gRNAs transfected with AaCas12b mRNA into HepG2, Hep3B and Huh7 at the concentration of 0.33 pmol.

FIGs. 5A-5C illustrate 3 modification patterns of gRNAs.

FIGs. 6A-6C illustrate the T7E1 results of LNPs containing AaCas12b mRNA and gRNA targeting human KLKB1 delivered into Hep3B cells, Huh7 cells and primary human hepatocytes (PHH, lot 386549) .

FIGs. 7A-7D illustrate the T7E1 and NGS results of LNPs containing AaCas12b mRNA and gRNA targeting human KLKB1 delivered into PHH (lot 201904001) , PHH (lot 386549) and primary cynomolgus monkey hepatocytes (PCH, lot CCH100CY-V09555) .

FIG. 8 illustrates the editing efficiency of human KLKB1 gRNAs. gRNAs were in vitro transcribed. AaCas12b^Max mRNA and gRNAs were co-transfected into Huh7 cells. 3 days after transfection, T7E1 assay were used to evaluate the editing efficiency.

FIGs. 9A-9D illustrate the editing efficiency of the preferred human KLKB1 gRNAs. Chemically modified gRNAs were commercially customized. AaCas12b^Max mRNA and gRNAs were co-packaged into LNPs. LNPs were inoculated into Huh7 (FIG. 9A) , PHH (lot: 386549) (FIGs. 9B and 9C) and PCH (lot: CCH100CY-V09555) (FIG. 9D) . 3 days after LNP administration, T7E1 assay (FIGs. 9A, 9B and 9D) or next generation sequencing (NGS) (FIG. 9C) was used to evaluate the editing efficiency.

FIGs. 10A-10B illustrate the editing efficiency and prekallikrein 1B level (indicating the expression of KLKB1) in primary hepatocytes mediated by the deeply modified human KLKB1 gRNA 004. FIG. 10A illustrates the correlation between indel frequency and prekallikrein 1B level in PHH. FIG. 10B illustrates the editing efficiency in PCH. Chemically modified gRNAs were commercially customized based on our designed sequences. AaCas12b^Max mRNA and gRNAs were co-packaged into LNPs. LNPs were inoculated into PHH (lot: HUM182641) and PCH (lot: CCH100CY-V09555) . 3 days after LNP administration, NGS were used to evaluate the editing efficiency. ELISA was used to evaluate the prekallikrein 1B level in the supernatant.

FIG. 11 illustrates the off-target pattern obtained by TAG-seq. The 10 batches of study were conducted in HEK293 cells.

FIGs. 12A-12D illustrate the efficacy of human KLKB1 gRNA 004 in huKLKB1 mice. Chemically modified gRNAs were commercially customized. AaCas12b^Max mRNA and gRNAs were co-packaged into LNPs. LNPs were intravenously injected into huKLKB1 mice. FIGs. 12A-12C show the vascular leakage study results in colon, small intestine and hind limbs. The correlation between liver KLKB1 editing efficiency and plasma (sodium citrate) total kallikrein concentration were shown in FIG. 12D.

FIGs. 13A-13D illustrate the efficacy of human KLKB1 gRNA 004 in cynomolgus monkey. Chemically modified gRNAs were commercially customized. AaCas12b^Max mRNA and gRNAs were co-packaged into LNPs. LNPs were intravenously injected into cynomolgus monkey. FIG. 13A shows the liver KLKB1 editing efficiency on day 15 and day 29. FIG. 13B shows the time curves of plasma (sodium citrate) total kallikrein concentration. FIG. 13C shows the time curves of plasma (sodium citrate) kallikrein activity. FIG. 13D shows the editing efficiency of the on-target site and the potential off-target site.

[Rectified under Rule 91, 18.08.2025]
FIG. 14 illustrates the formula of an exemplary single guide RNA.

DETAILED DESCRIPTION

While various embodiments of the invention have been shown and described herein, it will be obvious to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. Numerous variations, changes, and substitutions may occur to those skilled in the art without departing from the invention. It should be understood that various alternatives to the embodiments of the invention described herein may be employed.Definition

As used herein, the term “mRNA (messenger RNA) ” refers to a polynucleotide that encodes at least one peptide, polypeptide or protein. mRNA as used herein encompasses both modified and unmodified RNA. mRNA may contain one or more coding and non-coding regions. mRNA can be purified from natural sources, produced using recombinant expression systems and optionally purified, chemically synthesized, etc. Where appropriate, e.g., in the case of chemically synthesized molecules, mRNA can comprise nucleoside analogs such as analogs having chemically modified bases or sugars, backbone modifications, etc. An mRNA sequence is presented in the 5’ to 3’ direction unless otherwise indicated. In some embodiments, an mRNA is or comprises natural nucleosides (e.g., adenosine, guanosine, cytidine, uridine) ; nucleoside analogs (e.g., 2-aminoadenosine, 2-thiothymidine, inosine, pyrrolo-pyrimidine, 3-methyl adenosine, 5-methylcytidine, C-5 propynyl-cytidine, C-5 propynyl-uridine, 2-aminoadenosine, C5-bromouridine, C5-fluorouridine, C5-iodouridine, C5-propynyl-uridine, C5-propynyl-cytidine, C5-methylcytidine, 2-aminoadenosine, 7-deazaadenosine, 7-deazaguanosine, 8-oxoadenosine, 8-oxoguanosine, O (6) -methylguanine, 2-thiocytidine, pseudouridine, and 5-methylcytidine) ; chemically modified bases; biologically modified bases (e.g., methylated bases) ; intercalated bases; modified sugars (e.g., 2’-fluroribose, ribose, 2’-deoxyribose, arabinose, and hexose) ; and/or modified phosphate groups (e.g., phosphorothioates and 5’-N-phosphoramidite linkages) .

As used herein, the term “Guide RNA” and “gRNA” are used herein interchangeably to refer collectively to either an sgRNA, a trRNA (also known as tracrRNA) , or a crRNA (also known as CRISPR RNA) . The crRNA and trRNA may be linked as one RNA molecule (single guide RNA, also known as sgRNA) or in two separate RNA molecules (dual guide RNA, also known as dgRNA) . “Guide RNA” or “gRNA” refers to each type. The trRNA sequences may be naturally occurring, or the trRNA sequence may include modifications or variations of the naturally-occurring sequences.

As used herein, the terms “target sequence” , “target site” and “target protospacer DNA” are used interchangeably herein, and refer to a nucleic acid sequence present in a target DNA to which a DNA-targeting segment of a subject DNA-targeting RNA will bind, provided sufficient conditions for binding exist. Suitable DNA/RNA binding conditions include physiological conditions normally present in a cell. Other suitable DNA/RNA binding conditions (e.g., conditions in a cell-free system) are known in the art; see, e.g., Sambrook, supra. The strand of the target DNA that is complementary to and hybridizes with the DNA-targeting RNA is referred to as the “complementary strand” and the strand of the target DNA that is complementary to the “complementary strand” (and is therefore not complementary to the DNA-targeting RNA) is referred to as the “noncomplementary strand” or “non-complementary strand” .

As used herein, the term “hybridizing” refers to the reaction of one or more polynucleotides to form a complex that is stabilized by hydrogen bonding between the bases of the nucleotide residues. Hydrogen bonding may occur by Watson-crick base pairing, hopgstein (Hoogstein) bonding, or in any other sequence specific manner. Sequences that are capable of hybridizing to a given sequence are referred to as “complements” of the given sequence.

As used herein, the terms “identical” in the context of two or more nucleic acids or polypeptide sequences, refer to two or more sequences or subsequences that are the same or have a specified percentage of amino acid residues or nucleotides that are the same (i.e., about 60%identity, preferably 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%or higher identity over a specified region when compared and aligned for maximum correspondence over a comparison window or designated region) as measured using a BLAST or BLAST 2.0 sequence comparison algorithms with default parameters described below, or by manual alignment and visual inspection (see, e.g., NCBI web site or the like) . Such sequences are then said to be “substantially identical” . This definition also refers to, or may be applied to, the compliment of a test sequence. The definition also includes sequences that have deletions and/or additions, as well as those that have substitutions.

The terms “endonuclease” , “DNA endonuclease” , “nucleic acid endonuclease” , “nuclease” and “nucleic acid endonuclease” as used herein are interchangeable herein, and refer to an enzyme which possesses catalytic activity for DNA cleavage. By “cleavage” it is meant as the breakage of the covalent backbone of a DNA molecule. Both single-stranded cleavage and double-stranded cleavage are possible, and double-stranded cleavage can occur as a result of two distinct single-stranded cleavage events. DNA cleavage can result in the production of either blunt ends or staggered ends. In certain embodiments, a complex comprising a DNA-targeting RNA and a site-directed modifying polypeptide is used for targeted double-stranded DNA cleavage.

The term “Regions” as used herein describes conserved groups of nucleic acids. Regions may also be referred to as “modules” or “domains. ” Regions of a gRNA may perform specific functions, e.g., in directing endonuclease activity of the RNP, for example as described in Briner A E et al., Molecular Cell 56: 333-339 (2014) . Examples of regions of a gRNA are described in formula (I) or the present disclosure.

The term “Stem loop” as used herein describes a secondary structure of nucleotides that form a base-paired “stem” that ends in a loop of unpaired nucleic acids. A stem may be formed when two regions of the same nucleic acid strand are at least partially complementary in sequence when read in opposite directions. “Loop” as used herein describes a region of nucleotides that do not pair (i.e., are not complementary) and may cap a stem. The “stem” region as used herein describes a secondary structure of nucleotides that forms a base-paired region between specific regions.

The term “2’-O-methyl (modification) ” as used herein describes the substitutions of methyl group on the hydroxyl group (-OH) of nucleotide sugar rings which therefore alter the confirmation of these sugar rings to influence the oligonucleotide binding affinity for complementary strands, duplex formation, and interactions with nucleases. For example, 2’-O-methyl (2’-OMe) modifications can increase binding affinity and nuclease stability of oligonucleotides, though as shown in the Examples, the effects of any modification at a given position in an oligonucleotide need to be empirically determined. In certain embodiments, the terms “mA, ” “mC, ” “mU, ” or “mG” may be used to denote a nucleotide that has been modified with 2’-OMe.

The term “phosphorothioate (PS) bond” as used herein refers to a bond where a sulfur is substituted for one nonbridging phosphate oxygen in a phosphodiester linkage, for example in the bonds between nucleotides bases. When phosphorothioates are used to generate oligonucleotides, the modified oligonucleotides may also be referred to as S-oligos. A “*” may be used to depict a PS modification. In this application, the terms A*, C*, U*, or G*may be used to denote a nucleotide that is linked to the next (e.g., 3’-terminus) nucleotide with a PS bond. In this application, the terms “mA*, ” “mC*, ” “mU*” or “mG*” may be used to denote a nucleotide that has been substituted with 2’-O-Me and that is linked to the next (e.g., 3’-terminus) nucleotide with a PS bond. The terms “*mA, ” “*mC, ” “*mU” or “*mG” may be used to denote a nucleotide that has been substituted with 2’-O-Me and that is linked to the front (e.g., 5’-terminus) nucleotide with a PS bond. Equivalents of a PS linkage or bond are encompassed by embodiments described herein.

As used herein, the term “break” refers to the fracture of the covalent backbone of DNA molecular. The break as described herein can start by several different methods, including but not limited to endonuclease cutting, or enzyme hydrolysis or the chemical hydrolysis of phosphodiester bond. In specific embodiment, the term “single strand breaks (SSBs) ” refers to the phenomenon of a DNA molecule that breaks when one strand is cut. When only one of the two strands of the DNA double helix is defective, the other strand can be used as a template to guide the correction of the damaged strand. On the other hand, the term “double strand break (DSB) ” refers to the phenomenon when two single strands of a double stranded DNA molecule are cut at the same location. While double strand breaks can induce DNA repair, possibly resulting in genetic recombination, cells also have systems that act to cause double strand breaks at other times. Double strand breaks can occur periodically during the normal cellular replication cycle or can be enhanced under certain circumstances, such as ultraviolet light, and inducers of DNA breaks (e.g., various chemical inducers) . Many inducers can cause DSBs to occur indiscriminately in the genome, and DSBs can be regularly induced and repaired in normal cells. During the repair process, the original sequence can be reconstructed with full fidelity, but, in some cases, small insertions or deletions (called “indels” ) are introduced at the DSB site. In some cases, double strand breaks can also be specifically induced at specific sites, which can be used to induce targeted or preferential genetic modifications at selected chromosomal sites. In many cases, the tendency of homologous sequences to recombine easily during DNA repair (and replication) can be exploited, which is the basis for the application of gene editing systems such as CRISPR. This homology-directed repair is used to insert the target sequence in some specific cases, provided through the use of a “donor” polynucleotide, into the desired chromosomal location.

As used herein, the terms “regulatory elements” , “DNA regulatory sequences” and “control elements” are used interchangeably herein, and refer to transcriptional and translational control sequences, such as promoters, enhancers, polyadenylation signals, terminators, protein degradation signals, and the like, that provide for and/or regulate transcription of a non-coding sequence (e.g., DNA-targeting RNA) or a coding sequence (e.g., site-directed modifying polypeptide, or CRISPR/Cas polypeptide) and/or regulate translation of an encoded polypeptide.

As used herein, the term “lipid nanoparticle” or its abbreviation “LNP” used herein refers to a drug carrier in the order of nanometers and composed of one layer of lipids. In the context of the present application, the term “lipid nanoparticle” also contemplates “lipid-polymer hybrid nanoparticle” which includes both lipid portions and hydrophobic polymer portions.

As used herein, the term “in vitro” refers to an artificial environment and to processes or reactions that occur within an artificial environment. In vitro environments exemplified, but are not limited to, test tubes and cell cultures. On the other hand, the term “in vivo” refers to the natural environment (e.g., an animal or a cell) and to processes or reactions that occur within a natural environment, such as embryonic development, cell differentiation, neural tube formation, etc.

As used herein, the term “treating” and the like are used herein to generally mean obtaining a desired pharmacologic and/or physiologic effect. The effect may be prophylactic in terms of completely or partially preventing a disease or symptom thereof and/or may be therapeutic in terms of a partial or complete cure for a disease and/or adverse effect attributable to the disease. “Treating” as used herein covers any treatment of a disease or symptom in a mammal, and includes: 1) preventing the disease or symptom from occurring in a subject which may be predisposed to acquiring the disease or symptom but has not yet been diagnosed as having it; 2) inhibiting the disease or symptom, i.e., arresting its development; or 3) relieving the disease, i.e., causing regression of the disease. The therapeutic agent may be administered before, during or after the onset of disease or injury. The treatment of ongoing disease, where the treatment stabilizes or reduces the undesirable clinical symptoms of the patient, is of particular interest. Such treatment is desirably performed prior to complete loss of function in the affected tissues. The subject therapy will desirably be administered during the symptomatic stage of the disease, and in some cases after the symptomatic stage of the disease.

As use herein, the terms “subject” , “individual” and “patient” are used interchangeably herein for therapeutic purposes and refer to any animal classified as a mammal, including humans, domestic and farm animals, as well as zoos, gyms or pet animals such as dogs, horses, cats, cattle, and the like. In some embodiments, the subject is a human subject.

As used herein, the singular forms “a” , “an” and “the” include plural referents unless the context clearly dictates otherwise. It should also be noted that the claims may be drafted to exclude any optional element. It is thus intended that such statements be regarded as antecedent basis for use of such exclusive terminology as “solely” , “only” and the like, or as limitations upon the use of “no” in connection with the recitation of claim elements.

As used herein, the term “and/or” in words such as “a and/or B” as used herein is intended to include both a and B; a or B; a (alone) ; and B (alone) . Likewise, as used herein, the term “and/or” in words such as “A, b and/or C” is intended to include each of the following embodiments: A, b and C; A, b or C; A or C; A or b; b or C; A and C; A and b; b and C; A (alone) ; b (alone) ; and C (alone) .CRISPR-Cas

In some embodiments, said nuclease could be a CRISPR/Cas protein. A CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) genomic locus can be found in the genomes of many prokaryotes (e.g., bacterium and archaeans) . In prokaryotes, the CRISPR locus encodes products that function as a type of immune system to help defend the prokaryotes against foreign invaders, such as virus and phage. There are three stages of CRISPR locus function: integration of new sequences into the CRISPR locus, expression of CRISPR RNA (crRNA) , and silencing of the foreign invader nucleic acid. Six types of CRISPR systems (e.g., Type I, Type II, Type III, Type IV, Type V and Type VI) have been identified.

A CRISPR locus includes a number of short repeating sequences referred to as “repeats” . When expressed, the repeats can form secondary structures (e.g., hairpins) and/or comprise unstructured single-stranded sequences. The repeats usually occur in clusters and frequently diverge between species. The repeats are regularly interspaced with unique intervening sequences referred to as “spacers, ” resulting in a repeat-spacer-repeat locus architecture. The spacers are identical to or have high homology with known foreign invader sequences. A spacer-repeat unit encodes a crisprRNA (crRNA) , which is processed into a mature form of the spacer-repeat unit. A crRNA comprises a “seed” or spacer sequence that is involved in targeting a target nucleic acid (in the naturally occurring form in prokaryotes, the spacer sequence targets the foreign invader nucleic acid) . A spacer sequence is located at the 5’ or 3’ end of the crRNA. A CRISPR locus also comprises polynucleotide sequences encoding CRISPR Associated (Cas) genes. Cas genes encode endonucleases involved in the biogenesis and the interference stages of crRNA function in prokaryotes. Some Cas genes comprise homologous secondary and/or tertiary structures.

In some embodiments, said CRISPR/Cas protein is Cas12b. “Cas12b” , “Cas12b nuclease” , “Cas12b protein” , “C2C1” , “C2C1 nuclease” and “C2C1 protein” are used interchangeably herein to refer to an RNA-guided sequence-specific nuclease from a microbial CRISPR system. Cas12b is capable of targeting and cleaving a DNA target sequence under the direction of a guide RNA to form a DNA double strand break (DSB) , also known as classical dsDNA cleavage activity or cis dsDNA cleavage activity. Upon recognition and binding of the corresponding target DNA sequence, the complex of Cas12b with the gRNA is also able to activate its trans single-stranded DNA cleavage activity, also referred to as non-classical bypass ssDNA cleavage activity.

In some embodiments, the Cas12b protein is an AaCas12b protein from Alicyclobacillus acidiphilus, an AkCas12b protein from Alicyclobacillus kakegawensis, an AmCas12b protein from Alicyclobacillus macrosporangiidus, a BhCas12b protein from Bacillus hisashii, a BsCas12b protein from Bacillus sp., a Bs3Cas12b protein from Bacillus sp. V3-13 contig_40, a DiCas12b protein from Desulfovibrio inopinatus Cas12b protein, a LsCas12b protein from Laceyella sediminis, a SbCas12b protein from Spirochaetes bacterium, a TcCas12b protein from Tuberibacillus calidus. In some preferred embodiments, the Cas12b protein is a Cas12b protein from Alicyclobacillus acidiphilus (AaCas12b) . The Cas12b proteins described herein can be used for genome editing in mammals, as well as for the nucleic acid detection methods of the invention.

In some preferred embodiments, the Cas12b protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 406. In some embodiments, the Cas12b protein comprises an amino acid sequence having at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%sequence identity to SEQ ID NO: 406. In some embodiments, the amino acid sequence of the Cas12b protein has one or more amino acid residue substitutions, deletions, or additions relative to SEQ ID NOs: 406. For example, the Cas12b protein has an amino acid sequence with 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acid residue substitutions, deletions, or additions relative to SEQ ID NOs: 406.

In some preferred embodiments, the engineered Cas12b protein comprises any one of the following substitutions or combinations thereof: 1) D116R; 2) E475R; 3) Q119F and E475R; 4) Q119F, E475R, and E758R; 5) Q119Y; (6) Q119F; 7) Q119W; 8) I757R; 9) E758R; 10) E761R; 11) K768R; 12) I757R and E758R; 13) I757R and E761R; 14) I757R and K768R; 15) E758R and E761R; 16) E758R and K768R; 17) E761R and K768R; 18) I757R, E758R, and E761R; 19) I757R, E758R, and K768R; 20) I757R, E761R and K768R; 21) E758R, E761R, and K768R; 22) I757R, E758R, E761R, and K768R; 23) Q866M; 24) Q869M; 25) Q866M and Q869M; 26) E636R; 27) Q854R; 28) N857K; 29) N865W; 30) N865Y; 31) Q1093W; 32) Q1093Y; and 33) D858R; and wherein the amino acid residue numbering is according to SEQ ID NO: 406. In some embodiments, the engineered Cas12b protein comprises any one of the following substitutions or combinations thereof: 1) Q866M and Q869M; (2) Q119F and E475R; and (3) Q119F, E475R and E758R; and wherein the amino acid residue numbering is according to SEQ ID NO: 406. In some preferred embodiments, the engineered Cas12b protein comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 405, disclosed in International Patent Application No. PCT/CN2021/136761 filed December 9, 2021, the content of which is incorporated herein by reference in its entirety.gRNA

[Rectified under Rule 91, 18.08.2025]
The exemplary single guide RNA is represented by the formula shown in FIG. 14 which contains: a) An optional 5’-overhang region comprising a contiguous sequence of CCAG, or no nucleotides; b) Stem loop 1 region, comprising a contiguous sequence of GUCGUCUAUAGGACGGC (SEQ ID NO: 468) , wherein nucleotide residues comprising a region of reverse complementary sequences to form a double helix that ends in a region of an unpaired loop; c) Junction 1 region, comprising a contiguous sequence of GAGUUUU; d) Stem 1 region, containing 18 nucleotides, among which 9 base pairs are formed, wherein Stem 1-F comprises a contiguous sequence of UCAACGGGU, and Stem 1-R comprises a contiguous sequence of GCCCGUUGA; e) Junction 2 region, comprising a contiguous sequence of AAUG; f) Stem loop 2 region, comprising a contiguous sequence of GCCACUUUCCAGGUGGC (SEQ ID NO: 469) , wherein nucleotide residues comprising a region of reverse complementary sequences to form a double helix that ends in a region of an unpaired loop; g) Junction 3 region, comprising a contiguous sequence of AAA; h) Stem loop 3 region, comprising a contiguous sequence of GCUUCAAAGAAGU (SEQ ID NO: 470) , wherein nucleotide residues comprising a region of reverse complementary sequences to form a double helix that ends in a region of an unpaired loop; i) Stem 2 region, containing 10 nucleotides, among which 5 Watson-Crick pairs are formed, wherein Stem 2-F comprises a contiguous sequence of GUGCC, and Stem 2-R comprises a contiguous sequence of GGCAC; j) Spacer region, ranging from 18 to 35 nucleotides represented by N in formula (I) which could independently be Adenine (A) , Guanine (G) , Cytosine (C) or Uracil (U) ; wherein solid line linked nucleotide residues of formula (I) represent formation of Watson-Crick pairs to form a double helix, dotted line linked nucleotide residues of formula (I) represent formation of non-Watson-Crick interactions to form three-dimensional structures; and nucleotide residues are arranged from 5’-terminus to 3’-terminus following the direction of the arrows shown in formula (I) ; and one or more of the regions selected from a) to d) , f) to h) and j) comprise one or more chemical modifications.

In some embodiments, said chemical modification comprises a 2’-O-methyl (2’-OMe) modified nucleotide and/or a phosphorothioate (PS) bond between nucleotides.

In some embodiments, the first 3 nucleotide residues at 5’-terminus are 2’-OMe modified and/or the first 4 nucleotide residues at 5’-terminus are linked with PS bonds.

In some embodiments, said spacer region comprises a targeting region of 18-35 nucleotide residues.

In some embodiments, the last 2 or 3 nucleotide residues of said targeting region are 2’-OMe modified and/or the last 3 or 4 nucleotide residues of said targeting region are linked with PS bonds.

In some embodiments, at least one of the following domains comprise one or more said chemical modifications: a) A-domain is consisting of the last 3 nucleotides of said Junction 1 and the first 6 nucleotides of said Stem 1-F; b) B-domain is consisting of the first 8 nucleotides of said Stem loop 2; c) C-domain is consisting of the last 3 nucleotides of said Stem loop 2, all nucleotides of said Junction 3, and the first nucleotide of said Stem 1-R; d) D-domain is consisting of the last 6 nucleotides of said Stem 1-R, and all nucleotides except the last three of said Stem loop 3.

In some embodiments, said A-domain comprises one of the following modifications: a) none of the nucleotides of said A-domain is with said chemical modifications; or b) at least one nucleotide is 2’-OMe modified; and/or c) at least one PS bond is formed between nucleotides.

In some embodiments, said B-domain comprises one of the following modifications: a) none of the nucleotides of said B-domain is with said chemical modifications; or b) at least one nucleotide is 2’-OMe modified; and/or c) at least one PS bond is formed between nucleotides.

In some embodiments, said C-domain comprises one of the following modifications: a) none of the nucleotides of said C-domain is with said chemical modifications; or b) at least one nucleotide is 2’-OMe modified; and/or c) at least one PS bond is formed between nucleotides.

In some embodiments, said D-domain comprises one of the following modifications: a) none of the nucleotides of said D-domain is with said chemical modifications; or b) at least one nucleotide is 2’-OMe modified; and/or c) at least one PS bond is formed between nucleotides.

In some embodiments, said A-domain comprises one of the following modifications: a) none of the nucleotides of said A-domain is with said chemical modifications; or b) all nucleotides of said A-domain are 2’-OMe modified; or c) all nucleotides of said A-domain are linked with PS bonds; or d) all nucleotides except the first two and the last two of said A-domain are 2’-OMe modified.

In some embodiments, said B-domain comprises one of the following modifications: a) none of the nucleotides of said B-domain is with said chemical modifications; or b) all nucleotides of said B-domain are 2’-OMe modified; or c) all nucleotides of said B-domain are linked with PS bonds; or d) all nucleotides except the first two and the last two of said B-domain are 2’-OMe modified; or e) all nucleotides except the first two and the last two of said B-domain are linked with PS bonds; or f) all nucleotides of said B-domain are 2’-OMe modified and linked with PS bonds.

In some embodiments, said C-domain comprises one of the following modifications: a) none of the nucleotides of said C-domain is with said chemical modifications; or b) all nucleotides of said C-domain are 2’-OMe modified; or c) all nucleotides of said C-domain are linked with PS bonds; or d) all nucleotides except the first two and the last two of said C-domain are 2’-OMe modified; or e) all nucleotides except the first two and the last two of said C-domain are linked with PS bonds; or f) all nucleotides of said C-domain are 2’-OMe modified and linked with PS bonds.

In some embodiments, said D-domain comprises one of the following modifications: a) none of the nucleotides of said D-domain is with said chemical modifications; or b) all nucleotides of said D-domain are 2’-OMe modified; or c) all nucleotides of said D-domain are linked with PS bonds; or d) all nucleotides except the first two and the last two of said D-domain are 2’-OMe modified; or e) all nucleotides except the first two and the last two of said D-domain are linked with PS bonds; or f) all nucleotides except the first four and the last four of said D-domain are 2’-OMe modified.

In some embodiments, a) said A-domain is anyone of the following:UUUUCAACG, ormUmUmUmUmCmAmAmCmG, orU*U*U*U*C*A*A*C*G, orUUmUmUmCmAmACG; and/orb) said B-domain is anyone of the following:GCCACUUU, ormGmCmCmAmCmUmUmU, orG*C*C*A*C*U*U*U, orGCmCmAmCmUUU, orGCC*A*C*UUU, ormG*mC*mC*mA*mC*mU*mU*mU; and/orc) said C-domain is anyone of the following:GGCAAAG, ormGmGmCmAmAmAmG; orG*G*C*A*A*A*G, orGGmCmAmAAG, orGGC*A*AAG, ormG*mG*mC*mA*mA*mA*mG; and/ord) said D-domain is anyone of the following:CGUUGAGCUUCAAAGA (SEQ ID NO: 472) , orMCmGmUmUmGmAmGmCmUmUmCmAmAmAmGmA (SEQ ID NO: 471) , orC*G*U*U*G*A*G*C*U*U*C*A*A*A*G*A (SEQ ID NO: 473) , orCGmUmUmGmAmGmCmUmUmCmAmAmAGA (SEQ ID NO: 474) , orCGU*U*G*A*G*C*U*U*C*A*A*AGA (SEQ ID NO: 475) , orCGUUmGmAmGmCmUmUmCmAAAGA (SEQ ID NO: 476) ,wherein each m represents the nucleotide residue after it is 2’-OMe modified, and each *represents the nucleotide residue on either side of it is linked with PS bonds.

In some embodiments, the last 2 or 3 nucleotide residues at 3’-terminus of said spacer region are 2’-OMe modified and/or the last 3 or 4 nucleotide residues at 3’-terminus are linked with PS bonds.

In some embodiments, at least one nucleotide residue other than the last 3 at 3’-terminus of said spacer region are 2’-OMe modified and/or at least one nucleotide residue other than the last 4 at 3’-terminus of said spacer region are linked with PS bonds.

In some embodiments, said RNA is capable of forming a ribonucleoprotein complex with a Cas12b protein.

In some embodiments, said RNA is capable of forming a ribonucleoprotein complex with a Cas12b protein, for example a Cas12b protein from Alicyclobacillus acidiphilus (AaCas12b) .

In another aspect, the present disclosure provides a composition comprising the single guide RNA described herein, and further comprising a nuclease or an mRNA which encodes the nuclease.

In some embodiments, said nuclease is a Cas protein.

In some embodiments, said Cas protein is a Cas12b protein, for example a Cas12b protein from Alicyclobacillus acidiphilus (AaCas12b) .

In another aspect, the present disclosure also provides a pharmaceutical formulation comprising the single guide RNA described herein, or the composition described herein and a pharmaceutically acceptable carrier.

In another aspect, the present disclosure also provides a method of modifying a target gene comprising delivering a Cas protein or a nucleic acid encoding said Cas protein, and the single guide RNA described herein in vitro or in vivo.

In some embodiments, said Cas protein is a Cas12b protein, for example a Cas12b protein from Alicyclobacillus acidiphilus (AaCas12b) .

In some embodiments, said method results in a single-or double-stranded cleavage, insertion or deletion of said target gene.

In another aspect, the present disclosure provides use of the single guide RNA described herein in preparing a medicament for treating a disease or disorder associated with a target gene.

The gRNA is capable of specifically recognizing the target sequence. For example, in some embodiments (the target nucleic acid molecule is a double-stranded DNA) , the gRNA comprises a spacer sequence (spacer) that is capable of specifically hybridizing to a complementary sequence of the target sequence. In some embodiments (the target nucleic acid molecule is a single-stranded DNA) , the gRNA comprises a spacer sequence capable of specifically hybridizing to a target sequence. The single molecule guide RNA (sgRNA) in a type V system can comprise a minimal CRISPR repeat and spacer sequence in the 5’ to 3’ direction. In some embodiments, the sgRNA consists of a scaffold sequence at the 5’ end and a spacer sequence at the 3’ end. The spacer sequence may specifically hybridize to the target sequence or to the complement of the target sequence. The spacer sequence is typically 18 to 35 nucleotides in length, preferably 23 nucleotides. As understood by one of ordinary skill in the art, each guide RNA can be designed to include a spacer sequence complementary to its genomic target sequence. For example, each of the spacer sequences in the sequence listing of the present application can be placed into a single RNA chimera or crRNA (and corresponding tracrRNA) . See Jinek et al, Science 337, 816-821 (2012) and Deltcheva et al, Nature 471, 602-607 (2011) .

In some embodiments, the percent complementarity between the spacer sequence and the target nucleic acid is at least about 30%, at least about 40%, at least about 50%, at least about 60%, at least about 65%, at least about 70%, at least about 75%, at least about 80%, at least about 85%, at least about 90%, at least about 95%, at least about 97%, at least about 98%, at least about 99%, or 100%. In some embodiments, the percent complementarity between the spacer sequence and the target nucleic acid is at most about 30%, at most about 40%, at most about 50%, at most about 60%, at most about 65%, at most about 70%, at most about 75%, at most about 80%, at most about 85%, at most about 90%, at most about 95%, at most about 97%, at most about 98%, at most about 99%, or 100%. In some embodiments, the percent complementarity between the spacer sequence and the target nucleic acid is 100%relative to the six consecutive 5’-most nucleotides of the target sequence of the complementary strand of the target nucleic acid. The percent complementarity between the spacer sequence and the target nucleic acid can be at least 60%relative to about 20 consecutive nucleotides. The spacer sequence and the target nucleic acid can differ in length by 1 to 6 nucleotides, which can be considered as one or more bulges (bulges) . The selection of various target regions provided herein for generating double strand breaks (DSBs) is designed to induce cleavage or deletion that result in modulation or inactivation of transcriptional control protein activity, as well as the selection of specific target sequences within such regions designed to minimize off-target events relative to on-target events.

In some embodiments, the gRNA is produced by in vitro transcription. In some embodiments, the gRNA is produced by chemical synthesis. In some embodiments, the gRNA is expressed by plasmids transfected into targeted cells.mRNA

Here we provide an exemplary AaCas12b^Max mRNA (including its motifs, sequences and modifications) that can be delivered using non-viral vectors. The non-viral delivery vectors include cationic lipids, ionizable lipids, lipid-like materials, polymers, dendrimers, and cell-penetrating peptides (CPPs) . The AaCas12b^Max open reading frame (ORF) includes nuclear localization sequences (NLS) and a coding sequence (CDS) . Different aspects of the AaCas12b^Max sequence were optimized to maximize its in vivo editing efficacy when delivered as mRNA by LNP, including 5’ cap, 5’ UTR, NLS, CDS, 3’ UTR, poly A tail and ribonucleotide chemical modifications.

In some embodiments, the mRNA comprising: a) a 5’-cap structure; b) a 5’ untranslated region (UTR) ; c) an open reading frame (ORF) comprising a ribonucleotide sequence that encodes a Cas12b endonuclease; d) a 3’ untranslated region (UTR) ; and e) a poly-A region of least 100 ribonucleotides in length. In preferred embodiments, the Cas12b endonuclease is a Cas12b^Max endonuclease.

In some embodiments, said 5’-cap structure comprises a Cap-1 structure, wherein said Cap-1 refers to m7GpppNm-, where Nm denotes any ribonucleotide with a 2′O methylation.

In some embodiments, said 5’-UTR comprises a Kozak sequence, which is adjacent to the 5’of said ORF.

In some embodiments, said 5’-UTR is derived from HBA1 (hemoglobin subunit alpha 1) .

In some embodiments, said 3’-UTR comprises an alpha-globin 3’-UTR structure.

In some embodiments, said poly-A region has 100-250 ribonucleotides in length.

In some embodiments, said poly-A region has about 100 ribonucleotides in length.

In some embodiments, said ORF further comprises a ribonucleotide sequence that encodes one or more nuclear localization signal (NLS) peptides.

In some embodiments, any one of said one or more NLS peptides is independently selected from a group consisting of nucleoplasmin NLS, SV40 NLS, and c-myc NLS.

In some embodiments, said ORF further comprises a ribonucleotide sequence that encodes a 2×Flag-tag protein.

In some embodiments, one or more said NLS peptides are linked with a peptide linker, preferably a 3×HA tag peptide.

In some embodiments, said Cas12b endonuclease is a Cas12b protein from Alicyclobacillus acidiphilus (AaCas12b) .

In some embodiments, said mRNA sequentially comprises a HBA1-derived 5'UTR, a Kozak sequence, a SV40 NLS, a Cas12b^Max endonuclease coding sequence, a SV40 NLS, a linker sequence, a c-myc NLS sequence, a linker sequence, a nucleoplasmin NLS sequence, a α-globin 3’UTR and a poly-A.

In another aspect, the present disclosure provides a system for editing a target gene in the genome of a cell, comprising: a) the mRNA described herein; and b) at least one guide RNA (gRNA) directed to the target gene, wherein a site-directed endonuclease is provided when the mRNA enters the cell and is translated to a protein.

In some embodiments, said site-directed endonuclease is able to combine with said gRNA to induce a double-stranded DNA break (DSB) at a target site of the target gene.

In some embodiments, said site-directed endonuclease is a Cas12b protein from Alicyclobacillus acidiphilus (AaCas12b) .

In another aspect, the present disclosure provides a therapeutic composition comprising the mRNA described herein or the system described herein encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs) .

In some embodiments, said composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.

In another aspect, the present disclosure provides a method for delivering the mRNA described herein and at least a target specific gRNA to a cell, wherein a site-directed endonuclease is provided when the mRNA enters the cell and is translated to a protein.

In some embodiments, said site-directed endonuclease is able to combine with said gRNA to induce a double-stranded DNA break (DSB) at a target site of the target gene.

The mRNA describe herein has the following improvements: a) higher translation efficiency, b) improved mRNA stability against endonuclease cleavage and degradation to increase mRNA half-life and boost protein yield, c) N1-methyl-pseudouridine substitution of uridines in mRNA increases base pair stability to reduce translational mistakes, d) removed potentially detrimental repeats or palindromic sequences by synonymous mutations.Use

In some embodiments, the present disclosure provides a composition for reducing or eliminating the expression or function of the gene products of KLKB1 gene in a subject. Specifically, the reduction or elimination will occur in a cell, an organ or s tissue in the subject.

In some embodiments, the subject suffers from one or more diseases associated with one or more abnormalities of KLKB1.

In some embodiments, the abnormality of KLKB1 could be the overexpression of KLKB1. In some embodiments, the abnormality of KLKB1 could be the mutation (e.g., insertion, deletion, or substitution) of the product of KLKB1. In some embodiments, the abnormality of KLKB1 could be the variation (e.g., copy number variation, or epigenetic modification) of the product of KLKB1.

In some embodiments, the disease associated with one or more abnormalities of KLKB1 is selected from the group consist of angioedema (e.g., hereditary angioedema) , cardiovascular disease (e.g., hypertension) , kidney disease (e.g., lupus nephritis, or systemic lupus erythematosus) , and tumor (e.g., colorectal cancer) .Examples

The following examples are set forth so as to provide those of ordinary skill in the art with a complete disclosure and description of how to make and use the present invention, and are not intended to limit the scope of what the inventors regard as their invention nor are they intended to represent that the experiments below are all or the only experiments performed. Efforts have been made to ensure accuracy with respect to numbers used (e.g. amounts, temperature, etc. ) but some experimental errors and deviations should be accounted for. Unless indicated otherwise, parts are parts by weight, molecular weight is weight average molecular weight, temperature is in degrees Celsius, and pressure is at or near atmospheric. Standard abbreviations may be used, e.g., bp, base pair (s) ; kb, kilobase (s) ; pl, picoliter (s) ; s or sec, second (s) ; min, minute (s) ; h or hr, hour (s) ; aa, amino acid (s) ; nt, nucleotide (s) ; i.m., intramuscular (ly) ; i.p., intraperitoneal (ly) ; s.c., subcutaneous (ly) ; and the like.Example 1 Materials and methodsGuide RNA (gRNA)

gRNAs without modifications were in vitro transcribed using T7 RNA polymerase (NEB, E2050S) following the user’s guide. Chemically modified gRNAs were commercially purchased.In vitro transcription of the Cas mRNA

The coding sequence of the target protein was inserted into the plasmid to form the DNA template which contains sequences of the target protein (e.g. AaCas12b^Max protein) , 5’ a nd 3’ UTRs, and a T7 promoter upstream of the 5’ UTR. PCR products which contain a poly A tail from the above plasmid is used for in vitro transcription (IVT) . T7 RNA polymerase recognizes the T7 promoter of the DNA template and initiates the in vitro mRNA transcription. The 5’ cap structure of the in vitro transcribed mRNA was capped by the addition of cap analogs during IVT and N1-methyl-pseudo-U was used to substitute UTPs. All IVT reactions were performed at 37 ℃ for 2 hours. And DNA template is removed by DNase I at 37 ℃ for 30 minutes, then column-purification performed to obtain full length IVT mRNA.Cell culture

HepG2 was purchased from American Type Culture Collection. Hep3B, Huh7, Neuro2A Hepa1-6 and Huh7 cells were purchased from Wuhan Pricella Biotechnology Co., Ltd.. HEK293 cells were purchased from ATCC. HepG2, Hep3B, Huh7 Hepa1-6 and HEK293 cells were maintained in DMEM + 10%FBS and passaged every 3 days by TrypLE.Aa-Cas12b mRNA and gRNA transfection

24 hours before transfection, HepG2, Hep3B, Huh7, Neuro2A Hepa1-6 and Huh7 cells were inoculated into 96-well plates at the density of 1×10⁴ cells/well. 50 ng AaCas12b^max mRNA and 120 ng gRNA or 100 ng AaCas12b^max mRNA and 114 ng gRNA or otherwise indicated amounts of AaCas12b^max mRNA and gRNA were transfected using Lipofectamine 3000 Transfection Reagent (Invitrogen, L3000008) following the user’s guide. 72 hours after transfection, cells were collected for analysis of the indel frequency.Primary hepatocytes

Primary human hepatocytes (PHH) were recovered and inoculated into 96-well plates at a density of 2×10⁵ cells/well in plating medium. Primary cynomolgus monkey hepatocytes (PCH) were recovered and inoculated into 96-well plates at a density of 1.5×10⁵ cells/well in plating medium. After overnight cell recovery, cell media were changed to the maintenance medium and then replaced with fresh media every 2 days. PHH (lot. HUM182641) was purchased from Lonza. PCH (lot. 20210127) , PHH (lot. 386549) and PHH (lot. 201904001) were purchased from Liver Biotechnology (Shenzhen) Co., Ltd.. PCH (lot. CCH100CY-V09555) was purchased from Milestone Biological Science & Technology Co., Ltd..Lipid nanoparticle formulation for cells and mouse

Lipid Nanoparticles were prepared by mixing the RNA containing aqueous phase which contains Cas mRNA and gRNA with the lipid containing ethanol phase. The two phases were mixed by using a microfluidic mixing process with a standard staggered herringbone mixer.

The ethanol phase was prepared by adding (1) an ionizable cationic lipid, L52715, structure was shown in Table 1, or SM102, (2) a neutral lipid, specifically DSPC, (3) a steroid, specifically cholesterol, and (4) a PEG lipid, specifically DMG-PEG2000 into ethanol (PEG-DMG) . The ratio of the lipid components was 50: 10: 38.5: 1.5 mol%of ionizable cationic lipid: DSPC: cholesterol: PEG-DMG.Table 1. Structure of L52715.

RNA was dissolved in 50 mM sodium citrate buffer (pH = 4.0) at a concentration of 0.1 mg/mL. The weight ratio of the RNA molecules to the ionizable cationic lipid was kept at 1: 10 (the cationic lipid amine to RNA phosphate (N: P) molar ratio is about 4.5) . The ratio of Aa-Cas12b mRNA: sgRNA was approximately 1: 1, by weight of the RNA components, unless indicated otherwise. The LNP concentration was determined by the concentration of total RNA.

The lipid solution (ethanol phase) was injected at 1 mL/min, and aqueous phase was injected at 3 mL/min into the mixer. The volume ratio of the aqueous phase to the ethanol phase was 3: 1. The mixed LNP solution was subjected to dialysis to remove ethanol and achieve buffer exchange. Dialysis was conducted twice against Tris-HCl Solution (20 mM, pH 7.4) at volumes about 2500 times that of the mixed solution using Slide-A-Lyzer cassettes (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, Ill. ) with a molecular weight cutoff of 100 KD at 4℃ overnight. Then the LNPs were concentrated using 100 kDa Amicon spin filter (centrifugation at 4,000 ×g at 4℃. ) to achieve the desired concentration. Finaly, 40%sucrose solution was added to give rise to the final nanoparticle solution with 8%sucrose for storage at -80 ℃.Lipid nanoparticle formulation for non-human primates

Lipid nanoparticles for non-human primates (NHP) were prepared by mixing the RNA containing aqueous phase with the lipid containing ethanol phase using T-Junction mixer.

The ethanol phase was prepared by adding (1) an ionizable cationic lipid, L52715, (2) a neutral lipid, DSPC, (3) a steroid, cholesterol, and (4) a PEG lipid, DMG-PEG2000 into ethanol (PEG-DMG) . The ratio of the lipid components was 40: 47.5: 10: 2.5 mol%of L52715: DSPC: cholesterol: PEG-DMG.

RNA was dissolved in acetic acid buffer (pH = 5.0) at a concentration of 0.2 mg/mL. The cationic lipid amine to RNA phosphate (N: P) molar ratio is about 6. The weight ratio of Aa-Cas12b mRNA: sgRNA was approximately 1: 1.

The volume ratio of the aqueous phase to the ethanol phase was 3: 1. The mixed LNP solution was subjected to Tangential Flow Filtration (TFF) to buffer exchange and concentration. Finally, Tris-HCl Solution (20 mM, pH 7.4) with 40%sucrose was added to make the final nanoparticle formulation to be Tris-HCl Solution (20 mM, pH 7.4) with 8%sucrose. Then LNP was stored at -80 ℃.Lipid nanoparticle (LNP) delivery in vitro

24 hours before transfection, HepG2, Hep3B, Huh7, Neuro2A and Hepa1-6 cells were inoculated into 96-well plates at a density of 1×10⁴ cells/well. On the day of LNP delivery, LNPs were diluted to the desired concentration in DMEM + 10%FBS. Cell media were then replaced with DMEM + 10%FBS plus the above LNP mixture.

48 hours before LNP delivery, PHH or PCH were recovered and inoculated to 96-well plated at the indicated density. On the day of LNP delivery, LNPs were diluted to the desired concentration in the maintenance medium + 6%FBS, then replaced by maintenance medium + 6%FBS plus the LNP mixture described earlier. 6 hours or overnight after LNP delivery, cell medium was aspirated and replaced by the maintenance medium. 72 hours after LNP delivery, cell supernatants and cells were collected for indel frequency analysis and the detection of prekallikrein 1B protein level (Abcam, ab202405, indicating the expression level of KLKB1) .LNP delivery in vivo

C57BL/6J mice, ranging 6-8 weeks of age were used for the studies. Animals were weighed and grouped randomly. LNP were diluted in PBS or normal saline to the desired concentration and intravenously injected via the lateral tail vein in a volume of 100-200 μL/animal. The animals were observed at approximately 6 hours post dose for adverse effects. Animals were euthanized at various time points. Liver tissues were collected for DNA extraction. Plasma (sodium citrate) samples were collected for the ELISA detection of total kallikrein.In vivo study in non-human primates

The management and use of animals during the study followed the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (2011) issued by the US National Research Council, the Regulations on the Administration of Laboratory Animals (revised in 2017) issued by the Science and Technology Commission of China, and the Management Measures for Experimental Animals in Jiangsu Province issued by the Experimental Animal Management Association of Jiangsu in 2008. The animal application and management used in this experiment has been approved by the Animal Management and Use Committee (IACUC) of Shanghai InnoStar Bio-tech Co., Ltd..

Male cynomolgus monkeys aged at 3-5 years old, weighing 3-5 kg were used. On the day before dosing (Day 0) , animals received immunosuppression by intramuscularly injection of 1 mg/kg dexamethasone. On the dosing day (Day 1) , animals received immunosuppression by intramuscularly injection of 1 mg/kg dexamethasone, 0.5 mg/kg famotidine and 5 mg/kg diphenhydramine. One hour after immunosuppressor injection, LNPs at the indicated concentrations were intravenously infused. Plasma (sodium citrate) were collected before dosing and on days 2, 4, 8, 15, 29 for the analysis of total kallikrein concentration and kallikrein activity analysis. Liver biopsy was conducted on days 15 and 29 for the analysis of on-and off-target editing efficiency.Vascular leakage study

The HAE attack has been described as increased vascular permeability which causes angioedema. Evans Blue, an albumin-binding dye, which indicates the vascular permeability, has been used in the studies of edema and vascular leakage. Under normal physiological conditions, albumin cannot cross epithelium. While under pathologic conditions with increased vascular permeability, epithelium is no longer impermeable to albumin. When there is Evans Blue binding, the blue dye can be visible in the nose, ears and feet; after extraction by formamide, Evans Blue inside tissues can be quantified.

An induced model was used to mimic the HAE attack. Bradykinin, a hexapeptide generated from the cleavage of high-molecular-weight kininogen, plays a key role in vasodilation and is a well-known mediator of swelling in HAE. Angiotensin converting enzyme (ACE) mediated the hydrolysis of bradykinin. ACE inhibitor, captopril, inhibit the hydrolysis of bradykinin and therefore increases basal permeability. Dextran sulfate (DSS) is a classically used inducer for mouse colitis. An increase in colonic mucosal permeability has been identified in the DSS-induced murine colitis. In our studies, we used captopril and DSS to increase basal vascular permeability. The lower of Evans Blue inside tissues indicated the effect of KLKB1 editing.

The vascular leakage study was described as below. At first, 2.5 mg/kg captopril was intraperitoneal injected to mice. 15 minutes later, a mixture of Evans Blue (30 mg/kg) and DSS (0.3 mg/kg) was intravenously injected via the lateral tail vein. Another 15 minutes later, mice were euthanized, the colon, small intestine and both hind feet were removed and extracted by 1 mL formamide at 55℃. After overnight extraction, the supernatants were measured at 600 nm for quantification.Detection of plasma total kallikrein concentration

1 μg/mL mouse anti-KLKB1 antibody (Sino Biological, STY28 MM10) in 1× PBS (pH 7.4) was coated onto a 96-well microplate (CORNING) overnight at 4℃. After washing three times with wash buffer (PBST, PBS with 0.05%Tween 20, pH7.4) , the plate was blocked with a blocking solution (5%bovine serum albumin (BSA) in 1× PBS) for 2 hours at room temperature. Plasma samples and standards (Arco, KL1-H52H9) were applied diluted in a 1%BSA-PBST solution and incubated for 2 hours at room temperature. After washing, Biotin-labeled anti-KLKB1 antibody was used as the detector antibody (Vitalgen, Biotin-STY28 MM07) at a 1: 2000 dilution in a 1%BSA-PBST solution and incubated for 1 hour at room temperature. Next, a 1: 200 dilution of streptavidin-HRP (R&D Systems, DY998) was added, and the plates were incubated for 30 minutes at room temperature. TMB Single-Component Substrate solution (Solarbio, PR1200) was then added and allowed to develop for 15 minutes before ELISA stop solution (Solarbio, C1058) was added to stop the reaction. The absorbance at 450 nm (with a reference wavelength of 630 nm) was analyzed using a SpectraMax ix3 microplate reader (Molecular Devices) .Detection of plasma kallikrein activity

Plasma samples were diluted 90-fold with assay buffer (20 mmol/l of Tris-HCl [pH 7.5] ; 150 mmol/L of NaCl, 1 mmol/L of EDTA, 0.1%polyethylene glycol 8000, and 0.1%Triton X-100) . Subsequently, 90 μL of the diluted samples were added to a 96-well microplate. After 10 minutes of adding of 10 μL of 0.1 mmol/L fluorogenic substrate H-Pro-Phe-Arg-AMC (Sigma-Aldrich, P9273) , fluorescence values were then measured in a SpectraMax i3x plate reader (Molecular Devices) , with excitation and emission wavelengths at 380 and 460 nm, respectively. The activity of KLKB1 was evaluated based on fluorescence signal values, with the enzyme activity in the pre-dose plasma sample set at 100%. The percentage of activity after administration was calculated using the following formula: KLKB1 activity (%) = (postdose fluorescence values /predose fluorescence values) × 100.DNA editing efficiency analysis

For cell samples, cells were lysed and genomic DNAs were extracted using One Step Mouse Genotyping Kit (Vazyme, PD101-01) . For liver tissue samples, tissues were homogenized and genomic DNA were extracted using FastPure Cell/Tissue DNA Isolation Mini Kit (Vazyme, DC102-01) .

To qualitatively determine the frequency of insertions and deletions (indels) at the target site, T7E1 assay was utilized. PCR primers around the target sites were designed and the genomic areas of interest were amplified. Primer sequences were listed below in Table 2. The PCR reactions were performed and products were annealed and later digested by T7 Endonuclease I (NEB, M0302L) to reveal fragments with indels by agarose gel electrophoresis.Table 2 Primer sequences for T7E1 assay

To quantitatively determine the frequency of insertions and deletions (indels) at the target site, next generation sequencing (NGS) was utilized. PCR primers around the target sites were designed and the genomic areas of interest were amplified. Primer sequences were listed below in Table 3. A second round of PCR was performed to add the needed DNA motifs for Illumina sequencing (VAHTS Dual UMI UDI Adapters Set 1-4 for Illumina, N351-N354) . The amplicons were sequenced on Novaseq S4 (Illumina) . The reads were analyzed on Cas-Analyzer and the indel frequencies were calculated.Table 3 Primer sequences for NGSOff-target editing analysis

TAG-seq experiments were performed according to Huang H et al. (Commun Biol, 2021, 4: 830) .Example 2. In vitro and in vivo evaluation of the modified gRNAs

Four loci without AaCas12b protein binding were identified [1, 2] (A-domain to D-domain as described herein, FIG. 1) . 2’-OMe and phosphorothioate were introduced to the four loci and the spacer. gRNAs with single locus modification or with combined modifications were designed as listed in Table 4. gRNAs were chemically customized by commercial vendors.Table 4. gRNAs for optimization of modifications

gRNAs (SEQ ID NOs: 408-445, shown as 1-38) were transfected together with the AaCas12b mRNA into Hep3B and Huh7 cells. T7E1 and NGS were used to determine the indel frequencies. As shown in FIGs. 2A-2C, compared to the unmodified control (SEQ ID NO: 408) , some of the modified gRNAs enhanced the editing efficiency while some others decreased the editing efficiency.

In another experiment, gRNAs (SEQ ID NOs: 408-410, 413, 415, 416, 421, 431, 433, 437, 441-443, 446-451, shown as 1-3, 6, 8, 9, 14, 24, 26, 30, 34-36, 39-44) were transfected together with the AaCas12b mRNA into HepG2, Hep3B and Huh7 cells at the concentrations of 1 and 0.33 pmol. The T7E1 results and indel frequencies based on NGS were shown in FIGs. 3A-3L.

In another experiment, gRNAs (SEQ ID NOs: 408-410, 413, 415, 416, 421, 431, 433, 437, 441-443, 445-461, shown as 1-3, 6, 8, 9, 14, 24, 26, 30, 34-36, 38-54) were transfected together with the AaCas12b mRNA into HepG2, Hep3B and Huh7 cells at the concentration of 0.33 pmol. The T7E1 results and indel frequencies based on NGS were shown in FIGs. 4A-4F.

We observed that 2’-OMe on D-domain (FIG. 5A) , 2’-OMe on A-domain and D-domain (FIG. 5B) , and 2’-OMe on A-domain to C-domain with short 2’-OMe on D-domain (FIG. 5C) steadily enhanced editing efficiency. To further evaluate the above 3 modification patterns, more gRNAs were synthesized. In SEQ ID NOs: 408-461, spacers of 20 nt was included, with 3 additional nucleotides added to the 3’ (UUU) end of the gRNAs. Results from a parallel study revealed that replacing the 20 nt length spacer and the 3 additional nucleotides on the 3’ end (UUU) with a 23 nt length spacer enhanced the editing efficiency. Hence, in SEQ ID NOs: 462-467, spacers of 23 nt were used to replace the 20 nt spacers and the UUU.

LNPs containing AaCas12b mRNA and gRNA were generated. LNPs carrying gRNAs targeting the human KLKB1 (SEQ ID NOs: 462-464, shown as 55-57) were delivered into Hep3B cells, Huh7 cells and PHH (lot 386549) . The T7E1 results were shown in FIGs. 6A-6C.

LNPs carrying gRNAs targeting the human KLKB1 (SEQ ID NOs: 465-467, shown as 58-60) were delivered into PHH (lot 201904001) , PHH (lot 386549) and PCH (lot CCH100CY-V09555) . The T7E1 results and indel frequencies based on NGS were shown in FIGs. 7A-7D.

The in vitro and in vivo results on the targets evaluated revealed that 2’-OMe on D-domain (FIG. 5A) , 2’-OMe on A-domain and D-domain (FIG. 5B) , and 2’-OMe on A-domain to C-domain with short 2’-OMe on D-domain (FIG. 5C) all mediated robust gene editing. Among the various modifications, 2’-OMe on A-domain and D-domain mediated the most robust and consistent activity. As the spacer sequence may have effects on the gRNA structure, it would be prudent to evaluate and identify the best modification pattern for each different spacer.Example 3. In vitro screening of human KLKB1 gRNAs

Guide RNAs targeting human KLKB1 protein coding sequence were designed based on the sequence of NC_000004 within exons 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 and 11. Spacers were listed in Table 5. gRNAs (SEQ ID NO: 161-319) were in vitro transcribed (IVT) and transfected into Huh7 together with Aa-Cas12b^Max mRNA (SEQ ID NO: 320) delivered by Lipofectamine 3000 Transfection Reagent (Invitrogen, L3000008) following the user’s guide. Editing efficiency were analyzed by T7E1 assay. T7E1 assays for gRNAs targeting the individual exons used corresponding primer pairs as listed in Table 2. The T7E1 results were shown in FIG. 8.Table 5 Spacer list

Chemically modified human KLKB1 gRNAs 002 (SEQ ID NO: 338) , 004 (SEQ ID NO: 339) , 007 (SEQ ID NO: 340) , 023 (SEQ ID NO: 341) , 075 (SEQ ID NO: 342) , 076 (SEQ ID NO: 343) , 102 (SEQ ID NO: 344) , 105 (SEQ ID NO: 345) , 107 (SEQ ID NO: 346) , 111 (SEQ ID NO: 347) , 121 (SEQ ID NO: 348) , 135 (SEQ ID NO: 349) , 146 (SEQ ID NO: 350) , 153 (SEQ ID NO: 351) , 154 (SEQ ID NO: 352) and 158 (SEQ ID NO: 353) were commercially synthesized and packaged into LNPs together with Aa-Cas12b^Max mRNA (SEQ ID NO: 320) for further evaluation. The sequences of these chemically modified gRNAs were listed in Table 6. LNPs were inoculated into Huh7 at the concentrations of 300 and 1000 ng/mL, T7E1 results were shown in FIG. 9A.Table 6 Chemically modified gRNAs targeting human KLKB1

LNPs carrying gRNAs 002 (SEQ ID NO: 338) , 004 (SEQ ID NO: 339) , 075 (SEQ ID NO: 342) , 076 (SEQ ID NO: 343) , 105 (SEQ ID NO: 345) , 111 (SEQ ID NO: 347) , 135 (SEQ ID NO: 349) and 153 (SEQ ID NO: 351) showed higher editing efficiency, these LNPs were evaluated in PHH (lot: 386549) at the concentrations of 300 and 1000 ng/mL, T7E1 results were shown in FIG. 9B.

LNPs carrying gRNAs 002 (SEQ ID NO: 338) , 004 (SEQ ID NO: 339) , 007 (SEQ ID NO: 340) , 105 (SEQ ID NO: 345) and 135 (SEQ ID NO: 349) were evaluated in PHHs (lot: 386549 and 201904001) at the concentrations of 10, 31.6, 100 and 316 ng/mL for the determination of dose curves, indel frequency from NGS were shown in FIG. 9C as dose-response curves. Primers used for NGS were listed in Table 3.

Spacers of human KLKB1 gRNAs 002 (SEQ ID NO: 322) , 004 (SEQ ID NO: 323) , 007 (SEQ ID NO: 324) , 075 (SEQ ID NO: 326) , 076 (SEQ ID NO: 327) , 102 (SEQ ID NO: 328) , 105 (SEQ ID NO: 329) , 121 (SEQ ID NO: 332) , 135 (SEQ ID NO: 333) , 146 (SEQ ID NO: 334) , 153 (SEQ ID NO: 335) and 158 (SEQ ID NO: 337) were homologous to cynomolgus monkey. LNPs carrying these chemically modified gRNAs (SEQ ID NOs: 338, 339, 340, 342, 343, 344, 345, 348, 349, 350, 351 and 353) were evaluated in PCH (lot: CCH100CY-V09555) at the concentrations of 300 and 1000 ng/mL. T7E1 assays for gRNAs targeting the individual exons used corresponding primer pairs as listed in Table 2. T7E1 results were shown in FIG. 9D.

The above results revealed that Human KLKB1 gRNA 004 showed high and consistent editing efficiency not only in human hepatocellular carcinoma cell lines and PHH, but also in PCH.Example 4. In vitro efficacy study in PHH

Deeply modified gRNA 004 with 23 nt spacer was designed and synthesized, of which the sequence was listed in Table 7. gRNA (SEQ ID NO: 355) together with Cas12b^Max mRNA (SEQ ID NO: 320) were packaged into LNP for evaluating efficacy in PHH and PCH. KLKB1 encodes a preproprotein, pre-kallikrein 1B, which was cleaved upon activation. Indel frequency and supernatant pre-kallikrein 1B level were analyzed (FIGs. 10A-10B) . The results suggested dose-dependent indel increase and total kallikrein reduction.Table 7 Chemically modified gRNA with 23 nt spacerExample 5. Off-target evaluation of human KLKB1 004

Off-target editing of human KLKB1 gRNA 004 was evaluated by TAG-seq. 1 off-target site was detected in 2 of 10 batches of repeat study on HEK293 (FIG. 11) . The potential off-target site locates at the intron of PCDH7 where the closest exon nearby is 5 kilobases away.Example 6. In vivo efficacy study in huKLKB1 mice

To evaluate human KLKB1 gRNA 004 in vivo, we constructed a KLKB1 humanized (huKLKB1) C57BL/6J mouse with an in situ substitution of the exons 2-3 by the human counterpart. LNP carrying Aa-Cas12b^Max mRNA (SEQ ID NO: 356) and chemically modified human KLKB1 gRNA 004 (SEQ ID NO: 355) was intravenously injected into male huKLKB1 mice (n = 3) via the lateral tail vein at the concentrations of 0.1, 0.3 and 1 mg/kg. At 2 weeks after LNP administration, vascular leakage study, plasma total kallikrein level detection and liver KLKB1 editing efficiency analysis were conducted (FIGs. 12A-12D) as described in Example 1. The results revealed a dose-dependent reduction of Evans Blue in colon, small intestine and hind limbs, suggesting a functional reduction of vascular permeability (FIGs. 12A-12C) . What’s more, dose-dependent increase of liver KLKB1 editing efficiency and reduction of plasma total kallikrein level were observed (FIG. 12D) .Example 7. In vivo study in non-human primates

Since human KLKB1 gRNA 004 is homologous to cynomolgus monkey, in vivo editing study in cynomolgus monkey was conducted. LNP carrying Aa-Cas12b^Max mRNA (SEQ ID NO: 356) and chemically modified human KLKB1 gRNA 004 (SEQ ID NO: 355) was intravenously injected into cynomolgus monkey at the concentrations of 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg and 6 mg/kg. Liver biopsy was conducted at the day 15 and 29 after LNP administration. Indel frequency increases in a dose-dependent manner (FIG. 13A) . The highest indel frequency was detected as 64.3%which was observed on the liver sample of the 3 mg/kg group at day 29 (FIG. 13A) . What’s more, plasma total kallikrein level decreases dose-dependently (FIG. 13B) . One week after LNP administration, the 3 mg/kg and 6 mg/kg group reached a therapeutically meaningful level of 60%plasma kallikrein activity reduction (FIG. 13C) . The off-target site detected in example 4 was analyzed in the liver sample. The indel frequency was analyzed using NGS as below 0.0001% (FIG. 13D) .

While preferred embodiments of the present invention have been shown and described herein, it will be obvious to those skilled in the art that such embodiments are provided by way of example only. It is not intended that the invention be limited by the specific examples provided within the specification. While the invention has been described with reference to the aforementioned specification, the descriptions and illustrations of the embodiments herein are not meant to be construed in a limiting sense. Numerous variations, changes, and substitutions will now occur to those skilled in the art without departing from the invention. Furthermore, it shall be understood that all aspects of the invention are not limited to the specific depictions, configurations or relative proportions set forth herein which depend upon a variety of conditions and variables. It should be understood that various alternatives to the embodiments of the invention described herein may be employed in practicing the invention. It is therefore contemplated that the invention shall also cover any such alternatives, modifications, variations or equivalents. It is intended that the following claims define the scope of the invention and that methods and structures within the scope of these claims and their equivalents be covered thereby.

Claims (33)

1. A guide RNA comprising any one of (a) to (c) :

   (a) a spacer sequence comprising at least 95%, 90%, or 85%identical to a sequence selected from SEQ ID NOs: 2-160 and 407;

   (b) a spacer sequence comprising at least 16, 17, 18, 19 or 20 contiguous nucleotides of a sequence selected from SEQ ID NOs: 2-160, or at least 18, 19, 20, 21, 22 or 23 contiguous nucleotides of a sequence of SEQ ID NO: 407; or

   (c) a spacer sequence selected from SEQ ID NOs: 2-160 and 407.
2. The guide RNA according to claim 1, wherein said guide RNA comprises a scaffold sequence shown as SEQ ID NO: 1.
3. The guide RNA according to claim 1 or 2, wherein said guide RNA comprises at least one modification.
4. The guide RNA according to claim 3, wherein said modification comprises at least one 2-O-methyl (2’-O-Me) modified nucleotide.
5. The guide RNA according to any one of claims 3-4, wherein said modification comprises at least one phosphorothioate (PS) bond between nucleotides.
6. The guide RNA according to any one of claims 1-5, wherein said spacer sequence is modified according to the pattern selected from SEQ ID NOs: 322-337.
7. The guide RNA according to any one of claims 2-6, wherein said scaffold sequence is modified according to the pattern of SEQ ID NOs: 321 or 354.
8. The guide RNA according to any one of claims 1-7, wherein the full-length sequence of said guide RNA is selected from SEQ ID NOs: 161-319.
9. The guide RNA according to any one of claims 1-8, wherein said guide RNA is modified according to the pattern selected from SEQ ID NOs: 338-353 and 355.
10. A composition comprising a guide RNA of any one of claims 1-9.
11. The composition according to claim 10, further comprising a nuclease or nucleic acid encoding a nuclease.
12. The composition according to claim 11, wherein said nucleic acid encoding a nuclease comprises an mRNA comprising an open reading frame (ORF) encoding a nuclease.
13. The composition according to any one of claims 11-12, wherein said nuclease is Cas12b.
14. The composition according to any one of claims 10-13, wherein said composition is used for reducing or eliminating the expression or function of the gene products of KLKB1 gene in a cell.
15. A composition for reducing or eliminating the expression or function of the gene products of KLKB1 gene in a cell, comprising: an mRNA and at least one target-specific guide RNA, wherein the mRNA comprises a ribonucleotide sequence that encodes a Cas12b endonuclease.
16. The composition according to claim 15, wherein said guide RNA is capable of specifically recognizing a target sequence located within or near said KLKB1 gene or the regulatory element of said KLKB1 gene and hybridizing to it.
17. The composition according to claim 16, wherein said target sequence is located in one or more exonic regions of said KLKB1 gene.
18. The composition according to claim 16 or 17, wherein said target sequence is in exon 2, exon 3, exon 4, exon 5, exon 6, exon 7, exon 8, exon 9, exon 10, or exon 11 of human KLKB1 gene.
19. The composition according to any one of claims 16-18, wherein said target sequence is in exon 2 of human KLKB1 gene.
20. The composition according to any one of claims 16-19, wherein the sequence of said guide RNA comprises a spacer sequence that is complementary or have complementarity to said target sequence in exon 2, exon 3, exon 4, exon 5, exon 6, exon 7, exon 8, exon 9, exon 10, or exon 11 of human KLKB1 gene.
21. The composition according to claim 20, wherein said spacer sequence is at least 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, or 90%identical to said target sequence in exon 2, exon 3, exon 4, exon 5, exon 6, exon 7, exon 8, exon 9, exon 10, or exon 11 of human KLKB1 gene.
22. The composition according to claim 20 or 21, wherein said target-specific guide RNA is the guide RNA of any one of claims 1-9.
23. The composition according to any one of claims 15-22, wherein the sequence of said guide RNA further comprises a scaffold sequence shown as SEQ ID NO: 1.
24. The composition according to any one of claims 13-23, wherein said Cas12b endonuclease is capable of binding said target sequence via said guide RNA, thereby generating one or more single strand breaks (SSBs) or double strand breaks (DSBs) within or near said KLKB1 gene or said regulatory element of the KLKB1 gene.
25. The composition according to claim 24, wherein said one or more single strand breaks (SSBs) or double strand breaks (DSBs) are capable of leading to cleavage, deletion, modulation or inactivation of transcriptional control sequence or exonic region of said KLKB1 gene.
26. The composition according to any one of claims 13-25, wherein said Cas12b endonuclease is a Cas12b protein from Alicyclobacillus acidiphilus (AaCas12b) .
27. The composition according to any one of claims 13-26, wherein said Cas12b endonuclease comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 405.
28. The composition according to any one of claims 12-27, wherein said mRNA comprises a ribonucleotide sequence selected from SEQ ID NOs: 320 and 356.
29. The composition according to claim 28, wherein said mRNA comprises at least one N1-methyl-pseudouridine substitution of its uridines.
30. A therapeutic composition comprising the composition of any one of claims 10-29, encapsulated in a lipid nanoparticle (LNP) .
31. The therapeutic composition according to claim 30, further comprising a pharmaceutically acceptable excipient.
32. A method of reducing or eliminating the expression or function of the gene products of KLKB1 gene in vivo or in vitro, comprising providing the composition of any one of claims 10-29, or the therapeutic composition of any one of claims 30-31.
33. A method of:

    1) treating a subject having hereditary angioedema (HAE) , or

    2) treating or preventing angioedema associated with HAE, bradykinin production and accumulation, bradykinin-induced swelling, angioedema obstruction of the airway, or asphyxiation, or

    3) reducing total plasma kallikrein activity or reducing prekallikrein and/or kallikrein levels in a subject,

    comprising contacting a cell of the subject with the composition of any one of claims 10-29, or the therapeutic composition of any one of claims 30-31.