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WO2025005168A1 - 高度不飽和脂肪酸またはそのエステル誘導体含有組成物およびその製造方法 - Google Patents

高度不飽和脂肪酸またはそのエステル誘導体含有組成物およびその製造方法 Download PDF

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Publication number
WO2025005168A1
WO2025005168A1 PCT/JP2024/023288 JP2024023288W WO2025005168A1 WO 2025005168 A1 WO2025005168 A1 WO 2025005168A1 JP 2024023288 W JP2024023288 W JP 2024023288W WO 2025005168 A1 WO2025005168 A1 WO 2025005168A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
less
fatty acid
container
vol
pufa
Prior art date
Application number
PCT/JP2024/023288
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
孝彰 河野
駿亮 東坂
武 海老
悠祐 立石
克利 林
啓志 松田
誠造 佐藤
清代美 降旗
秀明 山口
Original Assignee
株式会社ニッスイ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社ニッスイ filed Critical 株式会社ニッスイ
Publication of WO2025005168A1 publication Critical patent/WO2025005168A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C1/00—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids
    • C11C1/08—Refining

Definitions

  • This disclosure relates to a fatty acid composition containing highly unsaturated fatty acids (hereinafter also referred to as PUFAs) or their ester derivatives, and a method for producing the same.
  • PUFAs highly unsaturated fatty acids
  • Polyunsaturated fatty acids or their ester derivatives are used as raw materials for pharmaceuticals, health foods, and cosmetics.
  • Methods such as precision distillation, the silver nitrate complex method, and chromatography are known as methods for obtaining highly pure polyunsaturated fatty acids or their ester derivatives for use in pharmaceuticals, health foods, and cosmetics from natural fats and oils (see, for example, Patent Documents 1 to 4).
  • Patent Document 1 describes the provision of a PUFA or its ester derivative composition having a dissolved oxygen amount, peroxide value, acid value, and anisidine value below a certain value in order to solve the problem of preventing and/or delaying the progress of oxidation during the manufacturing process and during the storage period of the product.
  • Patent Document 2 points out the risk that dissolved oxygen in the eluent can lead to denaturation and/or deterioration of PUFAs and the like when separating and purifying PUFAs or their ester derivatives by chromatography using an adsorption resin as a carrier, and describes that in order to prevent this risk, the eluent can be heated and refluxed or nitrogen or carbon dioxide gas can be blown into the eluent.
  • Patent Document 3 describes the use of a channel-type agitator as a reaction vessel in a method for producing an ester derivative of a PUFA using a silver salt solution, and describes carrying out the production method under low-oxygen conditions to suppress deterioration of the silver salt solution.
  • Patent Document 4 is a patent relating to the purification of ester derivatives of PUFAs by chromatography, including simulated moving bed chromatography, and the examples state that "all chromatographic operations are carried out under an inert gas atmosphere and protected from light.”
  • JP 2017-114776 A Japanese Unexamined Patent Publication No. 61-291540 JP 2019-135307 A Special table 2017-502130 publication
  • the inventors have discovered that in the production of a fatty acid composition containing highly unsaturated fatty acids or ester derivatives thereof, unless the dissolved oxygen in the mobile phase is suppressed, the oxygen concentration cannot be sufficiently reduced even when a fraction containing highly unsaturated fatty acids or ester derivatives thereof obtained by chromatography is stored in a container under an inert gas atmosphere, resulting in a problem that the highly unsaturated fatty acids or ester derivatives thereof are denatured during desolvation, particularly the problem of coloration.
  • the present disclosure relates to providing a fatty acid composition containing highly unsaturated fatty acids or their ester derivatives, in which denaturation such as coloring is suppressed, by using an eluent obtained by placing the mixture in an inert gas atmosphere in a container as a mobile phase in chromatography for purifying a fatty acid mixture containing highly unsaturated fatty acids or their ester derivatives.
  • a method for producing a fatty acid composition containing the following highly unsaturated fatty acid or an ester derivative thereof is provided.
  • a fatty acid composition containing the following highly unsaturated fatty acid or an ester derivative thereof is provided.
  • a method for producing a fatty acid composition containing a highly unsaturated fatty acid (hereinafter also referred to as PUFA) or an ester derivative thereof comprising: (1) Charging a solvent into a container A to obtain an eluent in the container A under an inert gas atmosphere; (2) purifying the fatty acid mixture containing the PUFA or its ester derivative by chromatography using the eluent as a mobile phase to obtain a fraction containing the PUFA or its ester derivative; and (3) concentrating the fraction containing the PUFA or its ester derivative to obtain a fatty acid composition containing the PUFA or its ester derivative.
  • a manufacturing method comprising:
  • [1-2] The manufacturing method described in [1-1], wherein concentrating the fraction includes reducing pressure and/or heating an eluent contained in the fraction containing the PUFA or its ester derivative, and recovering the solvent by distillation.
  • [1-3] The method according to [1-1] or [1-2], wherein the solvent comprises a solvent obtained by distillation.
  • [1-4] The method for producing a PUFA or an ester derivative thereof according to any one of [1-1] to [1-3], wherein the solvent comprises a solvent recovered from a fraction containing the PUFA or an ester derivative thereof during concentration of the fraction.
  • [1-5] The manufacturing method according to any one of [1-1] to [1-4], wherein the dissolved oxygen concentration of the eluent in the container A is 20 mg/L or less, 15 mg/L or less, or 11 mg/L or less.
  • [1-6] The manufacturing method according to any one of [1-1] to [1-5], wherein the headspace oxygen concentration of the container A is 10 vol% or less, 5 vol% or less, 4 vol% or less, 3 vol% or less, 2 vol% or less, 1 vol% or less, 0.5 vol% or less, or 0.1 vol% or less.
  • [1-7] The production method according to any one of [1-1] to [1-6], wherein the fraction containing the PUFA or its ester derivative is contained in a container C under an inert gas atmosphere.
  • [1-11] The method for producing a fatty acid composition containing the PUFA or an ester derivative thereof, comprising: storing the fatty acid composition in a container D under an inert gas atmosphere.
  • [1-12] The manufacturing method according to [1-11], wherein the headspace oxygen concentration in the container D is 0.7% by volume or less, 0.5% by volume or less, 0.3% by volume or less, or 0.1% by volume or less.
  • [1-13] The manufacturing method according to any one of [1-1] to [1-12], wherein the inert gas in the container A, the container B, the container C, and the container D is independently nitrogen, argon, carbon dioxide, or a combination thereof.
  • [1-14] The manufacturing method according to any one of [1-1] to [1-13], wherein the inert gas in the container A, the container B, the container C, and the container D is nitrogen.
  • [1-15] The production method according to any one of [1-1] to [1-14], wherein the proportion of PUFA or its ester derivative in all fatty acids or their ester derivatives in the fatty acid composition containing the PUFA or its ester derivative is 97% or more, 96% or more, 90% or more, 80% or more, 70% or more, or 50% or more.
  • [1-16] The production method according to any one of [1-1] to [1-15], wherein the color b value of the fatty acid composition containing the PUFA or an ester derivative thereof is 3.2 or less, 3 or less, 2.8 or less, 2.5 or less, 2 or less, 1.5 or less, 1 or less, or 0.7 or less.
  • [1-17] The method according to any one of [1-1] to [1-16], wherein the anisidine value of the fatty acid composition containing the PUFA or its ester derivative is 15 or less, 10 or less, 5 or less, 1 or less, 0.7 or less, 0.5 or less, 0.3 or less, or 0.25 or less.
  • [1-19] The production method according to any one of [1-1] to [1-18], wherein the heating temperature for concentrating the fraction is a maximum temperature of 190° C. or less, 160° C. or less, 140° C. or less, 135° C. or less, 130° C. or less, 120° C. or less, or 100° C. or less, and/or 40° C. or more, 60° C. or more, 80° C. or more, 100° C. or more, 120° C. or more, 130° C. or more, 135° C. or more, 140° C. or more, or 160° C. or more.
  • [1-20] The production method according to any one of [1-1] to [1-19], wherein the minimum pressure during decompression in concentrating the fraction is 100 Pa or less, 50 Pa or less, 20 Pa or less, 10 Pa or less, 5 Pa or less, 2 Pa or less, or 1 Pa or less, and/or 0.1 Pa or more, 0.2 Pa or more, 0.5 Pa or more, 1 Pa or more, 2 Pa or more, 5 Pa or more, or 10 Pa or more.
  • [1-21] The method according to any one of [1-1] to [1-20], wherein the solvent and eluent are one or a mixture of two or more selected from methanol, ethanol, 2-propanol, acetonitrile, acetone, and hexane, or a mixture of one or more selected from these with water.
  • the solvent and eluent are one or a mixture of two or more selected from methanol, ethanol, 2-propanol, acetonitrile, acetone, and hexane, or a mixture of one or more selected from these with water.
  • the solvent and eluent are one or a mixture of two or more selected from methanol, ethanol, 2-propanol, acetonitrile, acetone, and hexane, or a mixture of one or more selected from these with water.
  • the fatty acid mixture is purified using a silica gel-based adsorbent or a polymer-based a
  • [1-24] The production method according to any one of [1-1] to [1-23], wherein the fraction is concentrated using one or more evaporators, and at least one of the receivers of the evaporators has an internal volume of 10 L or more, 20 L or more, 50 L or more, 100 L or more, 500 L or more, or 1000 L or more, and/or 5000 L or less, 2000 L or less, 1000 L or less, or 500 L or less.
  • [1-25] The method according to any one of [1-1] to [1-24], wherein the fraction is concentrated using one or more evaporators, and an inert gas is blown through at least one of the evaporators during the concentration of the fraction.
  • [1-26] The method according to any one of [1-1] to [1-25], wherein the PUFA is one or a combination of two or more selected from EPA, DHA, n-3 DPA, DGLA, and ARA.
  • [1-27] The method according to any one of [1-1] to [1-26], wherein the PUFA ester derivative is a C 1 -C 6 alkyl ester derivative of PUFA.
  • the PUFA or an ester derivative thereof is EPA ethyl ester, DHA ethyl ester, or a combination thereof.
  • the chromatography is HPLC.
  • [1-30] The manufacturing method according to any one of [1-1] to [1-29], wherein the volume of the container A is 50 L or more, 100 L or more, 200 L or more, 500 L or more, 1000 L or more, 2000 L or more, or 4000 L or more, and/or 20,000 L or less, 10,000 L or less, 4000 L or less, 2000 L or less, or 1000 L or less.
  • a fatty acid composition comprising a PUFA or an ester derivative thereof produced by the production method according to any one of [1-1] to [1-30].
  • [1-32] The method according to any one of [1-1] to [1-30], wherein a single solvent or two or less, three or less, four or less, five or less, or ten or less solvents are used as the at least one solvent.
  • a fatty acid composition comprising a highly unsaturated fatty acid (hereinafter also referred to as PUFA) or an ester derivative thereof, wherein the proportion of PUFA or its ester derivative in the total fatty acids or their ester derivatives in the fatty acid composition is 97% or more, 96% or more, 90% or more, 80% or more, 70% or more, or 50% or more, and the color b value of the fatty acid composition is 3.2 or less, 3 or less, 2.8 or less, 2.5 or less, 2 or less, 1.5 or less, 1 or less, or 0.7 or less.
  • PUFA highly unsaturated fatty acid
  • [2-3] The fatty acid composition according to [2-1] or [2-2], wherein the amount of residual eluate in the fatty acid composition containing the PUFA or its ester derivative is 100 ppm or less, 50 ppm or less, 10 ppm or less, 5 ppm or less, 1 ppm or less, 0.5 ppm or less, or 0.16 ppm or less.
  • [2-4] The fatty acid composition according to any one of [2-1] to [2-3], wherein the PUFA is one or a combination of two or more selected from EPA, DHA, n-3 DPA, DGLA, and ARA.
  • [2-5] The fatty acid composition according to any one of [2-1] to [2-4], wherein the PUFA ester derivative is a C 1 -C 6 alkyl ester derivative of PUFA.
  • [2-6] The fatty acid composition according to any one of [2-1] to [2-5], wherein the PUFA or its ester derivative is an ethyl ester of EPA, an ethyl ester of DHA, or a combination thereof.
  • a fatty acid composition containing highly unsaturated fatty acids or ester derivatives thereof with reduced discoloration. Furthermore, according to the present disclosure, it is possible to suppress dissolved oxygen in a fatty acid composition containing highly unsaturated fatty acids or ester derivatives thereof.
  • FIG. 1 is a process diagram for explaining this embodiment, which shows a process for producing a fatty acid composition containing eicosapentaenoic acid ethyl ester (hereinafter, also referred to as EPA-E).
  • EPA-E eicosapentaenoic acid ethyl ester
  • fatty acid refers to aliphatic carboxylic acids of various chain lengths from about C12 to C22 .
  • the numbers in “ C12 - C22” refer to the total number of carbon atoms in the carboxylic acid chain.
  • the predominant chain length is C16 to C22 .
  • the structure of fatty acids may be represented by a simple notation of "X:Y", where X is the total number of carbon atoms in the particular fatty acid and Y is the number of double bonds.
  • a saturated fatty acid with 20 carbon atoms may be represented as "C20:0”
  • a monounsaturated fatty acid with 18 carbon atoms may be represented as “C18:1”
  • arachidonic acid may be represented as "C20:4,n-6”.
  • n- indicates the position at which the double bond begins, counting from the methyl end of the fatty acid, e.g., "n-6” indicates that the double bond begins at the sixth position counting from the methyl end of the fatty acid.
  • Fatty acids are carboxylic acids with an aliphatic chain, which can be either saturated or unsaturated. Fatty acids are usually produced industrially by hydrolysis of triglycerides or phospholipids from natural sources. Some are produced synthetically. Regardless of the method of production, purification methods are required to obtain a pure product for food, cosmetic or industrial use.
  • highly unsaturated fatty acid refers to a fatty acid having more than one double bond.
  • highly unsaturated fatty acids may also be referred to as PUFAs.
  • Highly unsaturated fatty acids may be, for example, fatty acids having 3 to 6 double bonds.
  • Examples of highly unsaturated fatty acids include ⁇ -linolenic acid “C18:3,n-3”, ⁇ -linolenic acid “C18:3,n-6", dihomo- ⁇ -linolenic acid “C20:3,n-6", arachidonic acid “C20:4,n-6", eicosapentaenoic acid “C20:5,n-3", docosapentaenoic acid “C22:5,n-6", and docosahexaenoic acid “C22:6,n-3”.
  • Ester derivatives of highly unsaturated fatty acids as used herein are typically alkyl esters, for example C 1 -C 6 alkyl esters, or C 1 -C 4 alkyl esters. Examples of esters include ethyl esters.
  • One aspect of the present invention includes a production method including: placing a solvent in container A and obtaining an eluent in container A under an inert gas atmosphere; purifying a fatty acid mixture containing PUFAs or ester derivatives thereof by chromatography using the eluent as the mobile phase to obtain a fraction containing PUFAs or ester derivatives thereof; and concentrating the fraction containing PUFAs or ester derivatives thereof to obtain a fatty acid composition containing PUFAs or ester derivatives thereof.
  • the fatty acid mixture containing PUFA or its ester derivatives can be obtained from a raw material containing highly unsaturated fatty acids as constituent fatty acids.
  • a raw material containing natural oils and fats including plant and animal oils and fats
  • raw materials include fish oils, algae and microalgae oils, and vegetable oils, such as borage oil, scutellaria oil and evening primrose oil.
  • a fatty acid mixture containing PUFAs or ester derivatives thereof is obtained by subjecting a raw material to distillation.
  • the fatty acid mixture containing PUFA or its ester derivative may contain PUFA obtained by decomposing a raw material fat or oil into free fatty acids by hydrolysis using water, or may contain ester derivatives obtained by decomposing a raw material fat or oil into C1- C6 alkyl esters by alcoholysis using a C1 - C6 alkyl alcohol.
  • An example of the C1 - C6 alkyl ester is ethyl ester.
  • One embodiment of the present invention is a production method including storing a fatty acid mixture containing PUFAs or ester derivatives thereof in a container B under an inert gas atmosphere before purifying the fatty acid mixture.
  • container B when storing the fatty acid mixture in container B, container B is placed under an inert gas atmosphere.
  • container B can be placed under an inert gas atmosphere before, after, or simultaneously with storing the fatty acid mixture.
  • it is preferable that the fatty acid mixture is stored in container B after container B is placed under an inert gas atmosphere.
  • the container A is a container for containing and storing an eluent, and may be a tank for containing an eluent.
  • the tank for containing an eluent may be called an eluent tank.
  • the vessel B is a vessel for containing and storing a fatty acid mixture containing PUFA or its ester derivative obtained from a raw material, and may be a tank for containing a fatty acid mixture.
  • the fatty acid mixture containing PUFA or its ester derivative may be a main fraction obtained by continuous rectification.
  • the tank for containing the main fraction may be called a main fraction tank.
  • container C is a container for containing and storing a fraction containing PUFA or its ester derivative obtained by refining a fatty acid mixture, and can be a tank for containing the fraction.
  • the tank for containing the fraction can be called a fraction tank.
  • container D is a container for containing and storing a fatty acid composition containing PUFAs or ester derivatives thereof obtained by concentrating the fraction, and can be a tank for containing the fatty acid composition.
  • the tank for containing the fatty acid composition can be referred to as a product tank.
  • the tank for containing the fatty acid composition can be referred to as a buffer tank.
  • the container is purged with an inert gas, thereby placing the solvent, fraction, fatty acid mixture, or fatty acid composition in the container under an inert gas atmosphere.
  • the inert gas is not particularly limited as long as it is chemically stable and does not easily affect other elements or compounds.
  • examples of inert gases include nitrogen, argon, carbon dioxide, and a mixture of two or more of these gases.
  • the inert gas used for the inert gas atmosphere may be nitrogen, argon, or carbon dioxide.
  • the inert gas atmosphere refers to a state in which oxygen, which is a reactive molecule present in the air, is removed and replaced with nitrogen, argon, or carbon dioxide, which is less reactive.
  • the inert gas atmosphere refers to a state in which a gas containing mainly inert gas and having an oxygen concentration of less than 10% by volume is present.
  • purging with an inert gas is performed before or after the solvent, fraction, fatty acid mixture, or fatty acid composition is placed in the container.
  • the container may be a sealed container, for example, a tank.
  • the container has an inert gas filling device, which is a device for filling the head space with an inert gas. Examples of the inert gas filling device include a gas seal unit and a breather valve.
  • the container has a space containing gas that is not filled with a solvent, eluent, fatty acid mixture, fraction, or fatty acid composition.
  • the space in the container containing gas that is not filled with a solvent, eluent, fatty acid mixture, fraction, or fatty acid composition is called the "head space".
  • the volume of the container is the total volume of the volume of the portion filled with the solvent, eluent, fatty acid mixture, fraction, and/or fatty acid composition and the volume of the head space.
  • the headspace volume of the container may be set to an upper limit and/or a lower limit, and may be allowed to vary within that range.
  • the upper limit of the headspace volume is the headspace volume at the point when the headspace volume is the largest and the volume of the portion filled with the solvent, eluent, fatty acid mixture, fraction and/or fatty acid composition is the smallest when carrying out the production method of the present invention.
  • a container whose headspace volume is the upper limit may be referred to as a container before storage.
  • the container may also be referred to as a container after transfer.
  • a fraction tank whose headspace volume is the upper limit may be referred to as a "fraction tank before storage" or a "fraction tank after transfer", respectively.
  • the lower limit of the headspace volume is the headspace volume at the point when the headspace volume is smallest and the volume of the portion filled with the solvent, eluent, fatty acid mixture, fraction and/or fatty acid composition is largest when carrying out the manufacturing method of the present invention.
  • a container whose headspace volume is at the lower limit may be referred to as a container after storage.
  • the container may also be referred to as a container before transfer.
  • a fraction tank whose headspace volume is at the lower limit may be referred to as a "fraction tank after storage” or a "fraction tank before transfer", respectively.
  • the upper limit of the headspace volume of container A may be 50 vol.% or more, 70 vol.% or more, 80 vol.% or more, 85 vol.% or more, 87 vol.% or more, 89 vol.% or more, 90 vol.% or more, or 95 vol.% or more of the volume of container A, and/or 100 vol.% or less, 99 vol.% or less, 97 vol.% or less, 95 vol.% or less, 90 vol.% or less, 89 vol.% or less, 85 vol.% or less, 80 vol.% or less, or 70 vol.% or less.
  • the lower limit of the headspace volume of container A may be 10% by volume or more, 20% by volume or more, 30% by volume or more, 50% by volume or more, 70% by volume or more, 80% by volume or more, 85% by volume or more, or 87% by volume or more, and/or 95% by volume or less, 90% by volume or less, 89% by volume or less, 87% by volume or less, 85% by volume or less, 80% by volume or less, 70% by volume or less, or 50% by volume or less of the volume of container A.
  • the volume of container A may be 50 L or more, 100 L or more, 200 L or more, 500 L or more, 1000 L or more, 2000 L or more, or 4000 L or more, and/or 20000 L or less, 10000 L or less, 4000 L or less, 2000 L or less, or 1000 L or less.
  • the upper limit of the headspace volume of container B may be 50 vol.% or more, 70 vol.% or more, 80 vol.% or more, 85 vol.% or more, 90 vol.% or more, or 95 vol.% or more, and/or 100 vol.% or less, 99.9 vol.% or less, 99 vol.% or less, 97 vol.% or less, 95 vol.% or less, 90 vol.% or less, 85 vol.% or less, 80 vol.% or less, or 70 vol.% or less of the volume of container B.
  • the lower limit of the headspace volume of container B may be 0 vol.% or more, 1 vol.% or more, 3 vol.% or more, 5 vol.% or more, 7 vol.% or more, 10 vol.% or more, 15 vol.% or more, 20 vol.% or more, or 30 vol.% or more, and/or 70 vol.% or less, 50 vol.% or less, 30 vol.% or less, 20 vol.% or less, 15 vol.% or less, 10 vol.% or less, 7 vol.% or less, or 5 vol.% or less of the volume of container B.
  • the volume of container B may be 500 L or more, 1000 L or more, 2000 L or more, 5000 L or more, 10000 L or more, 20000 L or more, or 50000 L or more, and/or 200000 L or less, 100000 L or less, 50000 L or less, 20000 L or less, or 10000 L or less.
  • the upper limit of the headspace volume of container C may be 50 vol.% or more, 70 vol.% or more, 80 vol.% or more, 85 vol.% or more, 90 vol.% or more, or 95 vol.% or more of the volume of container C, and/or 100 vol.% or less, 99.9 vol.% or less, 99 vol.% or less, 97 vol.% or less, 95 vol.% or less, 90 vol.% or less, 85 vol.% or less, 80 vol.% or less, or 70 vol.% or less.
  • the lower limit of the head space volume of the container C may be 0 vol% or more, 1 vol% or more, 3 vol% or more, 5 vol% or more, 7 vol% or more, 10 vol% or more, 20 vol% or more, 30 vol% or more, 35 vol% or more, or 40 vol% or more, and/or 70 vol% or less, 60 vol% or less, 50 vol% or less, 40 vol% or less, 35 vol% or less, 30 vol% or less, 20 vol% or less, 15 vol% or less, or 10 vol% or less of the volume of the container C.
  • the volume of the container C may be 50 L or more, 100 L or more, 200 L or more, 500 L or more, 1000 L or more, 2000 L or more, or 4000 L or more, and/or 20000 L or less, 10000 L or less, 4000 L or less, 2000 L or less, or 1000 L or less.
  • the upper limit of the headspace volume of container D may be 50 vol.% or more, 70 vol.% or more, 80 vol.% or more, 85 vol.% or more, 90 vol.% or more, or 95 vol.% or more, and/or 100 vol.% or less, 99.9 vol.% or less, 99 vol.% or less, 97 vol.% or less, 95 vol.% or less, 90 vol.% or less, 85 vol.% or less, 80 vol.% or less, or 70 vol.% or less of the volume of container D.
  • the lower limit of the headspace volume of container D may be 0 vol.% or more, 1 vol.% or more, 3 vol.% or more, 5 vol.% or more, 7 vol.% or more, 10 vol.% or more, 15 vol.% or more, 19 vol.% or more, 20 vol.% or more, or 30 vol.% or more, and/or 70 vol.% or less, 50 vol.% or less, 30 vol.% or less, 20 vol.% or less, 19 vol.% or less, 15 vol.% or less, or 10 vol.% or less of the volume of container D.
  • the volume of container D may be 50 L or more, 100 L or more, 200 L or more, 500 L or more, 1000 L or more, 2000 L or more, or 5000 L or more, and/or 20,000 L or less, 10,000 L or less, 5000 L or less, 2000 L or less, or 1000 L or less.
  • the headspace oxygen concentration of a container is the concentration of oxygen in the gas contained in the headspace of the container.
  • the headspace oxygen concentration of the container A can be 10% by volume or less, 5% by volume or less, 4% by volume or less, 3% by volume or less, 2% by volume or less, 1% by volume or less, 0.5% by volume or less, or 0.1% by volume or less.
  • the headspace oxygen concentration of the container A can be 10% by volume or less, 5% by volume or less, 4% by volume or less, 3% by volume or less, 2% by volume or less, 1% by volume or less, 0.5% by volume or less, or 0.1% by volume or less, and/or 0% by volume or more, 0.01% by volume or more, or 0.05% by volume or more.
  • the headspace oxygen concentration of the container A can be the headspace oxygen concentration after the eluent is accommodated or the headspace oxygen concentration after the eluent is transferred.
  • the headspace oxygen concentration of container B can be 1.5 vol.% or less, 1.0 vol.% or less, 0.7 vol.% or less, 0.5 vol.% or less, 0.3 vol.% or less, or 0.1 vol.% or less. In another embodiment of the present invention, the headspace oxygen concentration of container B can be 1.5 vol.% or less, 1.0 vol.% or less, 0.7 vol.% or less, 0.5 vol.% or less, 0.3 vol.% or less, or 0.1 vol.% or less, and/or 0 vol.% or more, 0.01 vol.% or more, or 0.05 vol.% or more. In one embodiment of the present invention, the headspace oxygen concentration of container B can be the headspace oxygen concentration after the fatty acid mixture is contained or the headspace oxygen concentration after the fatty acid mixture is transferred.
  • the headspace oxygen concentration of container C after receiving the fraction can be 1.5 vol.% or less, 1.0 vol.% or less, 0.7 vol.% or less, 0.5 vol.% or less, 0.3 vol.% or less, or 0.1 vol.% or less. In another embodiment of the invention, the headspace oxygen concentration of container C after receiving the fraction can be 1.5 vol.% or less, 1.0 vol.% or less, 0.7 vol.% or less, 0.5 vol.% or less, 0.3 vol.% or less, or 0.1 vol.% or less, and/or 0 vol.% or more, 0.01 vol.% or more, or 0.05 vol.% or more.
  • the headspace oxygen concentration in container C after fraction transfer can be 0.7 vol.% or less, 0.5 vol.% or less, 0.3 vol.% or less, or 0.1 vol.% or less. In other embodiments of the invention, the headspace oxygen concentration in container C after fraction transfer can be 0.7 vol.% or less, 0.5 vol.% or less, 0.3 vol.% or less, or 0.1 vol.% or less, and/or 0 vol.% or more, 0.01 vol.% or more, or 0.05 vol.% or less.
  • the headspace oxygen concentration of container D can be 0.7 vol.% or less, 0.5 vol.% or less, 0.3 vol.% or less, or 0.1 vol.% or less. In one embodiment of the present invention, the headspace oxygen concentration of container D can be 0.7 vol.% or less, 0.5 vol.% or less, 0.3 vol.% or less, or 0.1 vol.% or less, and/or 0 vol.% or more, 0.01 vol.% or more, or 0.05 vol.% or more. In one embodiment of the present invention, the headspace oxygen concentration of container D can be the headspace oxygen concentration after the fatty acid composition is contained or the headspace oxygen concentration after the fatty acid composition is transferred.
  • the method for measuring the headspace oxygen concentration is not particularly limited.
  • the headspace oxygen concentration can be measured using a residual oxygen meter "Pack Keeper" RO-103KS (manufactured by Iijima Electronics Co., Ltd.) according to the procedure in the instruction manual for the device.
  • a residual oxygen meter "Pack Keeper” RO-103KS (manufactured by Iijima Electronics Co., Ltd.) according to the procedure in the instruction manual for the device.
  • RO-103KS manufactured by Iijima Electronics Co., Ltd.
  • the method for producing a fatty acid composition includes storing a solvent in a container A and obtaining an eluent in the container A under an inert gas atmosphere.
  • One embodiment of the present invention includes an embodiment in which a solvent that can be used as an eluent before being stored in the container A is used.
  • the inside of the container A when storing the solvent in the container A, is placed under an inert gas atmosphere.
  • the inside of the container A can be placed under an inert gas atmosphere before, after, or simultaneously with storing the solvent.
  • the solvent usable as the eluent is a solvent having a dissolved oxygen concentration of 20 mg/L or less, 17.5 mg/L or less, 15 mg/L or less, 14 mg/L or less, 13 mg/L or less, 12 mg/L or less, or 11 mg/L or less.
  • the solvent usable as the eluent is a solvent having a dissolved oxygen concentration of 20 mg/L or less, 17.5 mg/L or less, 15 mg/L or less, 14 mg/L or less, 13 mg/L or less, 12 mg/L or less, or 11 mg/L or less, and/or 0 mg/L or more, 0.01 mg/L or more, 0.03 mg/L or more, or 0.1 mg/L or more.
  • a solvent that can be used as an eluent is a liquid having a dissolved oxygen concentration of 20 mg/L or less, 17.5 mg/L or less, 15 mg/L or less, 14 mg/L or less, 13 mg/L or less, 12 mg/L or less, or 11 mg/L or less, which is one or a mixture of two or more selected from alcohols, ethers, esters, ketones, nitriles, hexanes, and dichloromethane, or a mixture of one or more selected from these with water.
  • the solvent usable as the eluent is a liquid having a dissolved oxygen concentration of 20 mg/L or less, 17.5 mg/L or less, 15 mg/L or less, 14 mg/L or less, 13 mg/L or less, 12 mg/L or less, or 11 mg/L or less, and/or 0 mg/L or more, 0.01 mg/L or more, 0.03 mg/L or more, or 0.1 mg/L or more, selected from alcohol, ether, ester, ketone, nitrile, hexanes, and dichloromethane, or a mixture of two or more selected from these and water.
  • Examples of alcohols include methanol, ethanol, n-propanol, 2-propanol, n-butanol, i-butanol, s-butanol, and t-butanol. In one aspect of the present invention, examples of alcohols include methanol and ethanol. In one embodiment, methanol is used.
  • Examples of ethers include diethyl ether, diisopropyl ether, and methyl t-butyl ether.
  • Examples of esters include methyl acetate and ethyl acetate.
  • Examples of ketones include acetone, methyl ethyl ketone, and methyl isobutyl ketone.
  • Examples of nitriles include acetonitrile.
  • the solvent usable as the eluent is methanol having a dissolved oxygen concentration of 20 mg/L or less, 17.5 mg/L or less, 15 mg/L or less, 14 mg/L or less, 13 mg/L or less, 12 mg/L or less, or 11 mg/L or less.
  • the solvent usable as the eluent is methanol having a dissolved oxygen concentration of 20 mg/L or less, 17.5 mg/L or less, 15 mg/L or less, 14 mg/L or less, 13 mg/L or less, 12 mg/L or less, or 11 mg/L or less, and/or 0 mg/L or more, 0.01 mg/L or more, 0.03 mg/L or more, or 0.1 mg/L or more.
  • One embodiment of the present invention is a manufacturing method in which the solvent contained in container A includes a solvent obtained by distillation.
  • the solvent obtained by distillation can be obtained by recovering the solvent by distillation from a fraction during fraction concentration.
  • the solvent obtained by distillation can be obtained by purchasing a distilled solvent and/or by purchasing a solvent and then distilling it.
  • One aspect of the present invention is a production method in which the solvent contained in container A contains solvent recovered from a fraction by concentrating the fraction.
  • One aspect of the present invention is a production method in which the concentration of the fraction includes reducing pressure and/or heating the eluent contained in the fraction containing PUFAs or their ester derivatives, and recovering the solvent by distillation.
  • a method for producing a fatty acid composition comprises purifying a fatty acid mixture containing PUFAs or ester derivatives thereof by chromatography using an eluent as the mobile phase to obtain a fraction containing PUFAs or ester derivatives thereof.
  • Chromatography means a method of separating or purifying a mixture in the process in which a substance called the mobile phase passes through the surface or interior of a substance called the stationary phase or carrier. Chromatography is used to analyze and separate mixtures of two or more substances. As used herein, chromatography can be column chromatography, and examples of such methods include high turbulence liquid chromatography (high turbulence liquid chromatography), preparative chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), simulated moving bed chromatography, real moving bed chromatography, and supercritical fluid chromatography.
  • high turbulence liquid chromatography high turbulence liquid chromatography
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • simulated moving bed chromatography real moving bed chromatography
  • supercritical fluid chromatography supercritical fluid chromatography
  • chromatographic conditions refers to various parameters that indicate the conditions under which chromatography is performed. Examples include packing pressure, mobile and stationary phase composition, slurry concentration, pumping pressure, column temperature, mobile phase temperature, mobile phase gradient, mobile phase flow rate, column type used, detection instrumentation and parameters used, sample preparation protocol used, settling time of the stationary phase during column preparation and pressure at which settling is performed, settling time and pressure at which settling is performed.
  • the column may be prepared by packing with the stationary phase, or a commercially available column pre-packed with the stationary phase may be used.
  • the chromatography uses a silica gel-based adsorbent or a polymer-based adsorbent as the stationary phase.
  • the stationary phase can be selected from reversed-phase stationary phases, hydrophilic interaction liquid chromatography stationary phases, acrylamide, silica, phenylhexyl stationary phases, polar embedded alkyl, fluorophenylpropyl, or any stationary phase known in the art of chromatography.
  • Reverse-phase stationary phases include, for example, C30 , C22 , C18 , C8 , C5 , C4 , biphenyl, and fluorophenyl stationary phases.
  • a chiral stationary phase is used.
  • stationary phase will be apparent to those skilled in the art and may depend on the components to be purified by chromatography.
  • ODS octadecyl silica
  • More polar components may require normal phase stationary phases such as non-bonded silica, amino phase, or cyano phase.
  • the chromatography uses a reversed-phase adsorbent as the stationary phase.
  • Any adsorbent of the reversed-phase distribution system can be used without any particular specification, for example, polymer beads such as polystyrene reticulated with divinylbenzene, or silica gel bonded with C8 or C18 alkyl groups, particularly octadecylsilyl, which is silica gel bonded with C18 alkyl groups, can be used as an ODS column.
  • the dimensions of the column used are not particularly limited and will depend to some extent on the volume of the fatty acid composition to be purified.
  • the diameter of the column is 1 mm or more, 2 mm or more, 4 mm or more, 8 mm or more, 16 mm or more, 32 mm or more, 64 mm or more, 128 mm or more, 256 mm or more, or 500 mm or more, or 4000 mm or less, 2000 mm or less, 1000 mm or less, 500 mm or less, or 1 to 4000 mm, 2 to 2000 mm, 4 to 1000 mm, 8 to 1000 mm, 16 to 1000 mm, 32 to 500 mm, 30 to 800 mm, or 400 to 800 mm.
  • the length of the column is 5 cm or more, 10 cm or more, 20 cm or more, or 800 cm or less, 400 cm or less, 200 cm or less, 150 cm, 120 cm or less, or 5 to 800 cm, 10 to 400 cm, 20 to 200 cm, 20 to 150 cm, or 20 to 120 cm.
  • the term "eluent” refers to a liquid used as a mobile phase in chromatography, which is a phase that comes into contact with the stationary phase and passes through the gaps or surface of the stationary phase. In chromatography, the eluent is used to develop and elute components such as PUFAs or their ester derivatives that are adsorbed to a column. In this specification, the eluent is sometimes referred to as the mobile phase.
  • the eluent is obtained in a container under an inert gas atmosphere and then placed in a column as a mobile phase to develop and elute the PUFAs or their ester derivatives.
  • the eluent leaving the column is collected as a fraction together with the PUFAs or their ester derivatives.
  • the fraction is also called an eluate and may contain components such as the eluent and the PUFAs or their ester derivatives.
  • the liquid includes a solvent and an eluent.
  • the solvent and/or eluent is one or a mixture of two or more selected from alcohol, ether, ester, ketone, nitrile, hexanes, and dichloromethane, or a mixture of one or more selected from these and water.
  • alcohols include methanol, ethanol, n-propanol, 2-propanol, n-butanol, i-butanol, s-butanol, and t-butanol.
  • examples of alcohols include methanol and ethanol. In one embodiment, methanol is used.
  • ethers include diethyl ether, diisopropyl ether, and methyl t-butyl ether.
  • esters include methyl acetate and ethyl acetate.
  • ketones include acetone, methyl ethyl ketone, and methyl isobutyl ketone.
  • nitriles include acetonitrile.
  • a single liquid is used as the solvent and the eluent.
  • methanol is used as the solvent and the eluent.
  • a single liquid or two or less, three or less, four or less, five or less, or ten or less liquids are used as the solvent and eluent.
  • the eluent may further include additives, including buffers and pH adjusters.
  • the choice of additive may be determined based on the eluent used, the stationary phase used, and the components to be purified.
  • the eluent includes an additive selected from one or more of formic acid, ammonium formate, trimethylamine, ammonia, and ammonium hydroxide.
  • the eluent may be additive-free.
  • a solvent is contained in container A.
  • container A does not contain an eluent, and a solvent is contained therein and used as an eluent.
  • the solvent is contained in container A, which in another embodiment is placed under an inert gas atmosphere and contains an eluent, before the solvent is contained therein.
  • the solvent is contained in container A placed under an inert gas atmosphere.
  • container A is placed under an inert gas atmosphere before the solvent is contained in container A.
  • the solvent is contained in container A that is not under an inert gas atmosphere.
  • container A is placed under an inert gas atmosphere after the solvent is contained therein.
  • the dissolved oxygen concentration of the solvent contained in container A is, for example, 20 mg/L or less, 15 mg/L or less, or 11 mg/L or less. In another aspect of the invention, the dissolved oxygen concentration of the solvent contained in container A is, for example, 20 mg/L or less, 15 mg/L or less, or 11 mg/L or less, and/or 0 mg/L or more, 0.01 mg/L or more, 0.03 mg/L or more, or 0.1 mg/L or more.
  • the dissolved oxygen concentration of the eluent is the concentration of oxygen dissolved in the eluent in the container A, and may be 20 mg/L or less, 17.5 mg/L or less, 15 mg/L or less, 14 mg/L or less, 13 mg/L or less, 12 mg/L or less, or 11 mg/L or less.
  • the dissolved oxygen concentration of the eluent is the concentration of oxygen dissolved in the eluent in the container A, and may be 20 mg/L or less, 17.5 mg/L or less, 15 mg/L or less, 14 mg/L or less, 13 mg/L or less, 12 mg/L or less, or 11 mg/L or less, and/or 0 mg/L or more, 0.01 mg/L or more, 0.03 mg/L or more, or 0.1 mg/L or more.
  • the dissolved oxygen concentration can be measured by a general method using a dissolved oxygen meter.
  • the solvent contained in container A has an oxygen concentration greater than 20 mg/L. In one embodiment, the oxygen concentration of the solvent contained in container A is greater than 25 mg/L. In one embodiment, an eluent is utilized that has a dissolved oxygen concentration of 20 mg/L or less, 17.5 mg/L or less, 15 mg/L or less, 14 mg/L or less, 13 mg/L or less, 12 mg/L or less, or 11 mg/L or less after the solvent is contained.
  • an eluent in another embodiment, is utilized that has a dissolved oxygen concentration of 20 mg/L or less, 17.5 mg/L or less, 15 mg/L or less, 14 mg/L or less, 13 mg/L or less, 12 mg/L or less, or 11 mg/L or less after the solvent is contained, and/or 0 mg/L or more, 0.01 mg/L or more, 0.03 mg/L or more, or 0.1 mg/L or more.
  • the dissolved oxygen concentration of the solvent contained in container A is the concentration of oxygen dissolved in the solvent contained in container A, and may be greater than 20 mg/L, greater than 17.5 mg/L, greater than 15 mg/L, greater than 14 mg/L, greater than 13 mg/L, greater than 12 mg/L, or greater than 11 mg/L.
  • the oxygen concentration dissolved in the solvent contained in container A is 20 mg/L or less, e.g., 17.5 mg/L or less, 15 mg/L or less, 14 mg/L or less, 13 mg/L or less, 12 mg/L or less, or 11 mg/L or less.
  • the oxygen concentration dissolved in the solvent contained in container A is 20 mg/L or less, e.g., 17.5 mg/L or less, 15 mg/L or less, 14 mg/L or less, 13 mg/L or less, 12 mg/L or less, or 11 mg/L or less, and/or 0 mg/L or more, 0.01 mg/L or more, 0.03 mg/L or more, or 0.1 mg/L or more.
  • the eluent in container A is contained in container A at the same temperature as the chromatography or at ⁇ 5°C, ⁇ 2.5°C, ⁇ 2°C or ⁇ 1°C, e.g., room temperature or a temperature higher than room temperature.
  • room temperature is 20°C to 25°C.
  • the temperature higher than room temperature is 25°C or higher, 30°C or higher, or 35°C or higher, and/or 60°C or lower, 50°C or lower, or 45°C or lower, or 25-60°C, 30-50°C, or 35-45°C.
  • container A can be a tank that contains an eluent used in chromatography.
  • a tank that contains an eluent may be referred to as an eluent tank.
  • the mobile phase may include one or more of water, methanol, ethanol, acetonitrile, ethyl acetate, hexanes, dichloromethane, supercritical carbon dioxide, or any other liquid known in the art.
  • the selection of the mobile phase may require consideration of the highly unsaturated fatty acid or its ester derivative to be purified and the stationary phase to be used.
  • a polar mobile phase should be selected that is sufficient to develop and elute the highly unsaturated fatty acids or their ester derivatives of interest, but not so fast that the development and elution approaches the front of the mobile phase.
  • the chromatography comprises a mobile phase gradient.
  • mobile phase gradient refers to a change in mobile phase composition over time while a chromatography run is being performed.
  • a column can contain mobile phases with different mobile phase compositions that increase or decrease in percentage over time while a chromatography run is being performed.
  • the main purpose of the mobile phase gradient is to elute the strongly retained components on the column faster while the weakly retained components elute slower so that the eluted highly unsaturated fatty acids or their ester derivatives produce well-resolved peaks upon detection.
  • non-polar mobile phase such as acetonitrile
  • the mobile phase at the start of the chromatography may contain a high percentage of polar mobile phase A, e.g., water, selected from about 100%, about 90%, about 80%, about 70%, about 60%, about 50%, about 40%, about 30%, about 20%, about 10%, or about 0%.
  • Mobile phase B can be a mobile phase that is less polar than mobile phase A.
  • mobile phase A is water
  • mobile phase B can be methanol. Mobile phase B will make up the remaining percentage of the mobile phase.
  • the gradient will result in a gradual increase in the concentration of mobile phase B over time.
  • a single composition liquid can also be used as the mobile phase.
  • the single composition liquid can be water, methanol, ethanol, acetonitrile, ethyl acetate, hexanes, dichloromethane, supercritical carbon dioxide, or any other liquid known in the art.
  • the rate of increase of B over time can be constant. In some embodiments, there is no gradient and the mobile phase is isocratic during elution. In some embodiments, different rates of increase in the percentage of mobile phase B at different time ranges of the chromatographic conditions can be used. In some embodiments, the mobile phase can be of a specific composition during certain time ranges of the chromatographic conditions and include a gradient during other time ranges.
  • the mobile phase delivery system is a pumping device, such as a commercially available chromatography pump, that provides the mobile phase to the column.
  • a pumping device such as a commercially available chromatography pump
  • Such pumps are generally corrosion and solvent resistant, provide pulse-free flow, flow rates ranging from 0.1 to 100 L/min, precise control of flow rate, and generate high pressures up to 6000 psi.
  • Reciprocating pumps consist of a small chamber in which the mobile phase is pumped by the back and forth movement of a motor-driven piston. Two check valves that alternately open and close control the direction and flow of the mobile phase into and out of the cylinder.
  • Single piston pumps allow very rapid refill times using specially designed cams, creating a more continuous flow. The disadvantage of pulsed flow with reciprocating pumps is often overcome by the use of pulse dampers.
  • linear velocity in a column represents the speed at which the fluid passes through the cross section of the column.
  • Linear velocity is a value that can be calculated using the following formula:
  • Linear velocity "m/hour” flow rate "m 3 /hour” / column cross-sectional area "m 2 "
  • the linear speed can be about 0.2-20.0 m/hr, about 1.0-15.0 m/hr, about 1.0-10.0 m/hr, about 1.5-10.0 m/hr, or about 2.0-9.0 m/hr. In one embodiment, the linear speed is about 4.0-9.0 m/hr.
  • the chromatography is performed at room temperature or at a temperature higher than room temperature. In one embodiment, the chromatography is performed at a temperature higher than room temperature. In one embodiment, the room temperature is between 20°C and 25°C.
  • the temperature higher than room temperature is 25°C or higher, 30°C or higher, or 35°C or higher, and/or 60°C or lower, 50°C or lower, or 45°C or lower, or 25-60°C, 30-50°C, or 35-45°C.
  • fraction refers to a fatty acid mixture containing PUFAs or their ester derivatives that is loaded onto a column and subjected to chromatography, and an eluent that is contained in the column to develop and elute the fatty acid mixture, and the eluent that is eluted from the column is collected in small portions at specific time intervals.
  • the process of obtaining fractions is called fractionation, and in fractionation, the composition of fatty acids may vary over time. Different fractions are collected at different time points based on the unique properties of individual components, such as highly unsaturated fatty acids or their ester derivatives, in the fatty acid mixture, such as differences in their affinity for the stationary phase and/or mobile phase.
  • One aspect of the present invention is a production method including storing a fraction containing a PUFA or an ester derivative thereof in a container C under an inert gas atmosphere.
  • container C when storing the fraction in container C, container C is placed under an inert gas atmosphere.
  • container C can be placed under an inert gas atmosphere before, after, or simultaneously with storing the fraction.
  • it is preferable that the fraction is stored in container C after container C is placed under an inert gas atmosphere.
  • container C can be a tank that contains a fraction obtained by chromatography.
  • a tank that contains a fraction may be referred to as a fraction tank.
  • the method for producing a fatty acid composition comprises concentrating the fraction containing PUFA or an ester derivative thereof obtained by chromatography to obtain a fatty acid composition containing PUFA or an ester derivative thereof.
  • the concentration of the fraction includes reducing pressure and/or heating the fraction containing the PUFA or its ester derivative and an eluent to distill the eluent, and the PUFA or its ester derivative and the eluent are separated during the concentration.
  • the fraction can be subjected to one or more evaporators during the concentration of the fraction.
  • the eluent separated by distillation during the concentration of the fraction can be recovered as a solvent and reused for the production of a fatty acid composition.
  • the solvent separated and recovered during the concentration of the fraction is contained in container A, and the eluent can be obtained in container A under an inert gas atmosphere.
  • the evaporator used in concentrating the fraction may be an eluent evaporator and/or a thin film evaporator.
  • the eluent evaporator include a single-effect evaporator, a multi-chamber evaporator, a natural circulation evaporator, a forced circulation evaporator, a thin film falling evaporator, a thin film ascending evaporator, and combinations thereof.
  • examples of the type of natural circulation evaporator include an external heating type and a calandria type.
  • any type of evaporator can be used to concentrate the fraction, such as a thin film evaporator, a single evaporator, a multiple effect evaporator, a multi-chamber evaporator, a natural circulation evaporator, a forced circulation evaporator, a falling thin film evaporator, an ascending thin film evaporator, or a combination of these.
  • examples of the natural circulation evaporator type include an external heating type and a calandria type.
  • the internal volume of at least one of the receivers of the evaporator used in concentrating the fraction is 10 L or more, 20 L or more, 50 L or more, 100 L or more, 500 L or more, or 1000 L or more, and/or 5000 L or less, 2000 L or less, 1000 L or less, or 500 L or less.
  • At least one of the evaporators used in concentrating the fraction is blown with an inert gas in concentrating the fraction.
  • the inert gas may be nitrogen, argon, carbon dioxide, or a combination thereof. In one embodiment, nitrogen is used.
  • the evaporator into which the inert gas is blown may be an eluent evaporator.
  • inert gas blow means supplying an inert gas to an apparatus or container such as an evaporator for the purpose of replacing the gas. There are no particular limitations on the amount or speed of the inert gas supplied. Nitrogen blow is one form of inert gas blow. Purging means blowing until the gas has been replaced with an inert gas by inert gas blowing.
  • the term "residual amount of eluate” refers to the concentration of the eluate contained in the fatty acid composition containing PUFA or its ester derivative obtained through concentration of the fraction.
  • the fatty acid composition containing PUFA or its ester derivative obtained through concentration of the fraction contains an eluate of 100 ppm or less, 50 ppm or less, 10 ppm or less, 5 ppm or less, 1 ppm or less, 0.5 ppm or less, or 0.16 ppm or less.
  • the fatty acid composition contains an eluate of 100 ppm or less, 50 ppm or less, 10 ppm or less, 5 ppm or less, 1 ppm or less, 0.5 ppm or less, or 0.16 ppm or less, and/or 0.001 ppm or more, 0.003 ppm or more, or 0.01 ppm or more.
  • the fraction can be concentrated at a maximum heating temperature of 190°C or less, 160°C or less, 140°C or less, 135°C or less, 130°C or less, 120°C or less, or 100°C or less, and/or 40°C or more, 60°C or more, 80°C or more, 100°C or more, 120°C or more, 130°C or more, 135°C or more, 140°C or more, or 160°C or more.
  • the concentration of the fraction can be performed with a minimum pressure during decompression of 100 Pa or less, 50 Pa or less, 20 Pa or less, 10 Pa or less, 5 Pa or less, 2 Pa or less, or 1 Pa or less, and/or 0.1 Pa or more, 0.2 Pa or more, 0.5 Pa or more, 1 Pa or more, 2 Pa or more, 5 Pa or more, or 10 Pa or more.
  • the "minimum pressure during decompression” refers to the pressure at the highest degree of vacuum during decompression.
  • One embodiment of the present invention is a manufacturing method including containing a fatty acid composition containing a PUFA or an ester derivative thereof in a container D under an inert gas atmosphere.
  • the inside of the container D is placed under an inert gas atmosphere.
  • the inside of the container D can be placed under an inert gas atmosphere before, after, or simultaneously with containing the fatty acid composition.
  • it is preferable that the fatty acid composition is contained in the container D after the container D is placed under an inert gas atmosphere.
  • vessel D can be a tank that contains a fatty acid composition containing PUFAs or ester derivatives thereof that has been concentrated through concentration of the fraction.
  • the tank that contains the fatty acid composition containing PUFAs or ester derivatives thereof may be referred to as a product tank.
  • the "color b value” means the value of b * in the L * a * b color system.
  • L represents lightness
  • a * and b * represent hue and saturation.
  • b * represents a hue ranging from blue to yellow, and when b* is 0, it is an achromatic color, and the more positive the value, the more yellowish it is, and the more negative the value, the more blueish it is.
  • the L * a * b color system is also called CIE LAB.
  • the color b value can be measured by a general method using a colorimeter. In this specification, the colorimeter is also called a color difference meter.
  • the color b value of the fatty acid composition containing PUFA or its ester derivatives may be 3.2 or less, 3 or less, 2.8 or less, 2.5 or less, 2 or less, 1.5 or less, 1 or less, or 0.7 or less. In other embodiments of the present invention, the color b value of the fatty acid composition may be 3.2 or less, 3 or less, 2.8 or less, 2.5 or less, 2 or less, 1.5 or less, 1 or less, or 0.7 or less, and/or -0.3 or more, -0.1 or more, 0 or more, 0.1 or more, 0.3 or more.
  • the color b value of the fatty acid composition containing PUFA or its ester derivatives may be 0 or more, 0 to 3.2, 0 to 3, 0 to 2.8, 0 to 2.5, 0 to 2, 0 to 1.5, 0 to 1, or 0 to 0.7.
  • anisidine value refers to a value obtained by colorimetrically quantifying carbonyl compounds using p-anisidine for color development.
  • This method measures the yellow color produced by the reaction of aldehydes, which are degradation products of fats and oils, with an anisidine reagent in the presence of acetic acid, at an absorbance of 350 nm, and can be measured by the method described as the official method (2.4,26-81) in the Standard Methods for the Analysis of Fats, Oils, and Related Materials.
  • a UV-visible spectrophotometer can be used for the measurement.
  • the anisidine value of the fatty acid composition comprising the PUFA or ester derivatives thereof may be 15 or less, 10 or less, 5 or less, 1 or less, 0.7 or less, 0.5 or less, 0.3 or less, or 0.25 or less. In other aspects of the invention, the anisidine value of the fatty acid composition may be 15 or less, 10 or less, 5 or less, 1 or less, 0.7 or less, 0.5 or less, 0.3 or less, or 0.25 or less, and/or 0 or more, 0.001 or more, 0.003 or more, or 0.01 or more.
  • the fatty acid composition obtained by the production method in one embodiment of the present invention can contain one highly unsaturated fatty acid or its ester derivative selected from eicosapentaenoic acid (hereinafter also referred to as EPA), n-3 docosapentaenoic acid (hereinafter also referred to as n-3 DPA), docosahexaenoic acid (hereinafter also referred to as DHA), dihomo- ⁇ -linolenic acid (hereinafter also referred to as DGLA), arachidonic acid (hereinafter also referred to as ARA), stearidonic acid, C18:3, C19:4, C20:4, C21:5, or a combination of two or more highly unsaturated fatty acids or their ester derivatives.
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • n-3 DPA docosahexaenoic acid
  • DHA docosahexaenoic acid
  • DGLA dihomo
  • the ester derivative can be a C1 - C6 alkyl ester derivative, such as a methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, or hexyl ester.
  • the fatty acid composition contains EPA ethyl ester, DHA ethyl ester, or a combination thereof. In one embodiment of the present invention, the fatty acid composition contains EPA ethyl ester.
  • the fatty acid composition comprises crotonic acid, myristoleic acid, palmitoleic acid, sapienic acid, oleic acid, elaidic acid, vaccenic acid, gadoleic acid, eicosenoic acid, erucic acid, nervonic acid, linoleic acid, eicosadienoic acid, docosadienoic acid, linolenic acid, pinolenic acid, eleostearic acid, mead acid, dihomo-gamma-linolenic acid, eicosatrienoic acid, stearidonic acid, eicosatetraenoic acid, adrenic acid, bosseopentaenoic acid, ozubondo acid, sardine acid, tetracosapentaenoic acid, herring acid, oleic ...
  • the polyunsaturated fatty acid may include one highly unsaturated fatty acid or an ester derivative thereof selected from the group consisting of tetracontylic acid, hexatriacontylic acid, celloplastic acid, hexatriacont
  • the fatty acid composition contains highly unsaturated fatty acids or their ester derivatives in a proportion of 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.5% or more, 99.8% or more, or 99.9% or more, and/or less than 97%, less than 98%, less than 99.0%, less than 99.95%, or less than 99.99% of the total fatty acid composition.
  • a UV/Vis absorbance detector consisting of a scanning spectrophotometer with grating optics can be used.
  • a deuterium lamp can be used as the light source for the ultraviolet range of 190-360 nm.
  • a tungsten lamp can be used as the light source for the visible range of 360-800 nm. The independent or combined use of a deuterium lamp and/or a tungsten lamp provides a simple means of detecting absorbing species as they emerge from the column.
  • the photodiode array (PDA) detector is an ultraviolet/visible absorbance detector that allows for very rapid collection of data over a selected spectral range. Absorbance spectral data for each chromatographic peak can be collected and stored. The stored data can be compared to spectra of pure standards from a library. Spectra obtained with a PDA detector are useful in identifying components that have overlapping peaks and are difficult to separate, since the characteristic spectra for each of the unresolved components are likely to be different.
  • Fluorescence detectors are useful in detecting compounds that exhibit chemiluminescent properties such as fluorescence or phosphorescence. They are at least an order of magnitude more sensitive than UV absorbance detectors. Fluorescence is observed by detection of the emission radiation, typically at a 90 degree angle to the excitation beam, separated by a grid. The number of fluorescent species can be increased by post-column derivatization of the eluted compounds with special reagents, or by pre-column derivatization of the sample itself.
  • Refractive index detectors respond to almost all solutes. They are also called RI detectors.
  • the difference in the refractive index of the reference mobile phase relative to the column effluent results in the detection of the separated components as peaks on the chromatogram. Due to its extremely high sensitivity to the mobile phase, this detector cannot be used without sufficient pulse attenuation in the LC pump, and it is also not suitable for gradient applications due to the changing mobile phase composition.
  • the detection limit is usually lower than that observed with absorbance detectors.
  • Conductivity detectors provide high sensitivity detection of all chargeable components. They can be used with LC systems for simple and reliable detection of anions, cations, metals, organic acids and surfactants down to ppb levels. Addition of chemical suppressors between the column and conductivity detector serves to reduce the conductivity of the eluent, allowing the use of gradient elution and determination of ppb levels with minimal baseline drift. For typical determination of low levels of anions, the eluent is converted to its weakly ionized low conductivity acid , reducing background noise. For example, Na2CO3 is converted to carbonic acid. At the same time, the anions of the components are converted to their corresponding high conductivity acids, increasing the signal of the components relative to each other. For example, NaCl is converted to HCl.
  • the "area %" which represents the proportion of each fatty acid in a composition is determined by identifying the peaks of each component in a chart obtained by analyzing the composition using gas chromatography with a flame ionization detector (hereinafter also referred to as GC-FID), determining the peak area of each fatty acid using the Agilent ChemStation integration algorithm, and expressing the content ratio of the component of that peak as the ratio of each peak area to the total peak area of the fatty acids.
  • area % is used as almost synonymous with weight %.
  • GC-FID measurement conditions GC: 7890B or 8890 (Agilent Technologies) Detector: FID Column: 30 m x 0.25 mm, 0.25 ⁇ m film (capillary column equivalent to USP PHASE G16) Column temperature: constant temperature around 200°C Detector temperature: constant temperature around 300°C Sample inlet temperature: constant temperature around 300°C Carrier gas: helium Flow rate: adjusted so that the retention time of eicosapentaenoic acid ethyl ester is about 30 minutes Split ratio: 1:100 Make-up gas: Nitrogen 30 mL/min. Area measurement range: Approximately 2.5 times the retention time of eicosapentaenoic acid ethyl ester from the solvent peak Sample injection volume: 1.0 ⁇ L Analysis time: Approximately 75 minutes
  • an internal standard can be used during analysis by gas chromatography.
  • An internal standard can be added to a sample as a reference marker to determine the relative retention time of an analyte with respect to the internal standard, or to aid in the quantification of the analyte.
  • the internal standard can be appropriately selected by the skilled artisan to be a compound that is very similar, but not identical, to the target analyte, for example a deuterated derivative of the target analyte.
  • the internal standard can then be used for calibration by plotting the ratio of the analyte signal to the internal standard signal as a function of the analyte concentration of the standard, where the standard is a sample of known concentration prepared by the skilled artisan to be used as a reference for the unknown analyte sample to be quantified.
  • Headspace oxygen concentration Measured using a residual oxygen meter "Pack Keeper” RO-103KS (manufactured by Iijima Electronics Co., Ltd.) according to the procedures in the instruction manual for the device.
  • Dissolved oxygen concentration in methanol Measurement was performed using a dissolved oxygen meter: FOR-21 (manufactured by Automatic System Research Co., Ltd.) according to the procedure in the instruction manual for the device.
  • Color b value Color and turbidity simultaneous measuring instrument: TZ-6000 (manufactured by Nippon Denshoku Industries Co., Ltd.), C light source, 2 degree visual field, using a 20 mm test tube, according to the procedure in the instruction manual for the instrument.
  • the color b value represents the b * value in the L * a * b * color system/CIE LAB.
  • Anisidine value Measured using an ultraviolet-visible spectrophotometer: V-730 (DS type) (manufactured by JASCO Corporation) according to the procedure described in USP401 Anisidine Value.
  • Acid value Measured using an automatic titrator: 876 Dosimat (Metrohm) according to the procedure described in USP401 Acid Value.
  • Fatty acid composition and isomer analysis Measured using GC-FID. The analytical conditions for gas chromatography are as described separately.
  • ⁇ Remaining amount of methanol The remaining amount of methanol was analyzed using headspace gas chromatography (hereinafter, also referred to as HS-GC), which combines the headspace method and gas chromatography.
  • HS-GC headspace gas chromatography
  • the headspace and GC analysis conditions are as follows:
  • Headspace equipment conditions Headspace sampler: G4557A (Agilent Technologies) Equilibration temperature in vial: constant temperature around 100°C Equilibration time in vial: 20 minutes Injection line temperature: 150°C Carrier gas: Helium Pressurization pressure: 103 kPa Pressurization time: 0.01 min. Sample injection volume: 1.0 mL
  • GC-FID measurement conditions GC: 7890B or 6850A (Agilent Technologies) Detector: FID Column: 30 m x 0.25 mm, 0.50 ⁇ m film (capillary column equivalent to USP PHASE G16) Column temperature: Hold at about 40°C for 5 minutes ⁇ Raise temperature at 30°C/min ⁇ Hold at about 240°C for 5 minutes Sample inlet temperature: Constant temperature around 250°C Detector temperature: Constant temperature around 280°C Carrier gas: Helium Flow rate: Adjust so that the retention time of methanol is about 4.3 minutes Split ratio: 1:10 Make-up gas: Nitrogen 25 mL/min. Vial capacity: 10 mL Vial agitation level: 5 Analysis time: Approximately 16.7 minutes
  • Fish oil was ethyl-esterified by a conventional method to prepare a fish oil ethyl ester having EPA-E of 16 area % or more in the fatty acid ethyl ester.
  • the fish oil ethyl ester was continuously rectified using a multi-stage rectification apparatus under the conditions of a column top pressure of 26.7 Pa or less and a temperature of 190° C. or less, and fractionated into an initial fraction, a main fraction, and a residual fraction to obtain a main fraction.
  • the initial fraction is a fraction having a higher volatility than the main fraction, and is mainly composed of ethyl esters of fatty acids less than C20 .
  • the main fraction is mainly composed of ethyl esters of C20 fatty acids, and has EPA-E of 70 area % or more in the fatty acid ethyl ester.
  • the residual fraction is a fraction having a lower volatility than the main fraction, and is mainly composed of ethyl esters of fatty acids of C21 or more.
  • the preparation of the main fraction can be carried out by referring to the methods described in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 04-041457, 04-128250, and 05-222392.
  • EPA-E was produced from the main fraction according to the process diagram shown in Figure 1. That is, the main fraction in the main fraction tank was purified by HPLC using the eluent in the eluent tank, and the obtained fraction was stored in the fraction tank. The fraction was concentrated using an eluent evaporator to obtain intermediate EPA-E, which was stored in a buffer tank. The intermediate EPA-E was further concentrated using a thin film evaporator to obtain purified EPA-E, which was stored in a product tank. The main fraction contains 70 area % or more of EPA-E in the fatty acid ethyl esters, and the purified EPA-E contains 96 area % or more of EPA-E in the fatty acid ethyl esters.
  • All the equipment in this process diagram was a closed system except for the eluent tank.
  • the main fraction is included in the fatty acid mixture containing PUFA or its ester derivatives
  • the intermediate EPA-E and purified EPA-E are included in the fatty acid composition containing PUFA or its ester derivatives.
  • the eluent tank was kept at a temperature of 38°C to 42°C, and the volume ratio of methanol used as the eluent to the headspace was 11:89 to 13:87. Here, the volume ratio is "eluent:headspace.”
  • the vent pipe (V) of the eluent tank was opened to fill the headspace with air, or nitrogen was blown through the vent pipe (V) to purge the headspace with nitrogen.
  • the temperature of the main fraction tank was 39.5°C to 40.5°C, and the volume ratio of the main fraction to the headspace was 5:95 to 90:10.
  • the volume ratio was "main fraction:headspace.”
  • the main fraction tank was purged with nitrogen, and the gas in the headspace was released when the main fraction was received using the installed gas seal unit and breather valve (G), and nitrogen was blown in when the main fraction was transferred to the HPLC, purging the headspace of the main fraction tank with nitrogen.
  • the main fraction (a) transferred from the main fraction tank was purified at a temperature of 38°C to 42°C using methanol (b) from the eluent tank as the eluent and ODS as the stationary phase, and the fraction (c) containing 96% or more of EPA-E in fatty acid ethyl esters was stored in the fraction tank.
  • the temperature of the fraction tank was not adjusted, but was gradually decreased from approximately 40°C.
  • the volume ratio of fraction to headspace was 5:95 to 65:35. Here, the volume ratio is "fraction:headspace".
  • the fraction tank was purged with nitrogen, and the gas in the headspace was released by the installed gas seal unit and breather valve (G) when a fraction was received from the HPLC, and nitrogen was blown in when a fraction was transferred to the eluent evaporator, purging the headspace of the fraction tank with nitrogen.
  • methanol was removed using an eluent evaporator.
  • Methanol removal in the eluent evaporator was carried out by blowing in a small amount of nitrogen while setting the vacuum to 35.8 kPa to 36.2 kPa at absolute pressure, gradually increasing the temperature from 41°C to 42°C, and finally to 130°C to 133°C, and the intermediate EPA-E (e) with a residual methanol content of approximately 500 ppm was stored in a buffer tank. Meanwhile, methanol (f) liquefied after vacuum distillation was collected in the eluent tank.
  • the buffer tank had an absolute vacuum of 35.8 kPa to 36.2 kPa and a temperature of 130°C to 133°C.
  • the volume ratio of intermediate EPA-E to headspace was 6:94 to 9:91.
  • the volume ratio is "intermediate EPA-E:headspace”.
  • the methanol (h) liquefied after vacuum distillation was collected in the eluent tank.
  • the stored intermediate EPA-E (g) was further de-methanolized using a thin-film evaporator.
  • the further de-methanolization in the thin-film evaporator was carried out at an absolute vacuum of 1-20 Pa and a temperature of 110°C-127°C, until the residual methanol content was 5 ppm or less.
  • DL- ⁇ -tocopherol was added to this to make a total amount of 0.2% relative to the EPA-E, and the product was stored in a product tank as purified EPA-E (i). Meanwhile, a small amount of methanol (j) that was liquefied after reduced pressure distillation was extracted into an eluent receiver as waste solvent.
  • the product tank was kept at a temperature of 20°C to 22°C, and the volume ratio of refined EPA-E to headspace was 0:100 to 81:19.
  • the volume ratio was "refined EPA-E:headspace.”
  • the product tank was purged with nitrogen, and the headspace of the product tank was purged with nitrogen by releasing gas from the headspace when the refined EPA-E was received using the installed gas seal unit and breather valve (G), and by blowing in nitrogen when the refined EPA-E was transported.
  • G gas seal unit and breather valve
  • Example 1 Effect of oxygen concentration in eluent tank on the amount of dissolved oxygen in eluent
  • Example 1a methanol obtained by distillation under reduced pressure and liquefaction was dropped into an eluent tank that had been purged with nitrogen blow to a headspace oxygen concentration of 0.00% by volume, and the headspace oxygen concentration and the amount of dissolved oxygen in the methanol, which was the eluent, were measured.
  • Example 1b the headspace oxygen concentration was set to 12.50% by volume, and the rest of the experiment was carried out in the same manner as in Example 1a.
  • the temperature for measuring the amount of dissolved oxygen in methanol was 23° C.
  • the measurement time from inserting the dissolved oxygen meter sensor into the methanol to starting the measurement until reading the value on the dissolved oxygen meter was 15 minutes.
  • Table 1 The results are shown in Table 1. From this example, it can be seen that lowering the headspace oxygen concentration in the eluent tank by purging the eluent tank with nitrogen led to a reduction in the amount of dissolved oxygen in the eluent.
  • Example 2 Oxygen concentration in fraction tank with and without nitrogen purging of eluent tank
  • Example 2a With nitrogen purging of eluent tank Methanol obtained by vacuum distillation was dropped into the eluent tank purged by blowing nitrogen into the eluent tank and stored as the eluent. The methanol was passed through HPLC and stored in a nitrogen purged fraction tank. The volume ratio of methanol, which is a fraction in the fraction tank before storage, to the headspace was 5:95, and the volume ratio of the fraction tank after storage was 65:35. Thereafter, the methanol, which is a fraction, was transferred while blowing nitrogen to return to the volume ratio of 5:95 before storage. Here, these volume ratios are "fraction:headspace".
  • Example 2b No nitrogen purge of eluent tank Methanol obtained by vacuum distillation was dropped into an eluent tank in which the head space was filled with air without nitrogen blowing, and stored as an eluent. The methanol was passed through an HPLC and stored in a nitrogen-purged fraction tank.
  • the conditions other than the nitrogen purge of the eluent tank were the same as in Example 2a.
  • the results are shown in Table 2. This example shows that the headspace oxygen concentration in the fraction tank can be reduced by purging the eluent tank with nitrogen. It also shows that, without nitrogen purging, oxygen enters the fraction tank together with the methanol during storage, and that the change in oxygen concentration becomes almost constant when the storage and transfer cycle is repeated five or more times.
  • Example 3 Headspace oxygen concentration in eluent tank and color b value of intermediate EPA-E in buffer tank Changes in the color b value of intermediate EPA-E in the buffer tank after HPLC purification and evaporation of the eluent, depending on whether or not the eluent tank was purged with nitrogen, were confirmed.
  • the main fraction stored in the nitrogen-purged main fraction tank was purified by HPLC using methanol stored in the eluent tank as the eluent, and a fraction in which the proportion of eicosapentaenoic acid ethyl ester in the fatty acid composition was 96 area % or more was stored in a nitrogen-purged fraction tank.
  • DL- ⁇ -tocopherol was added to the stored fraction in an amount of 0.05% relative to EPA-E, and the methanol was removed using an eluent evaporator, and the fraction was stored in a tank as intermediate EPA-E with a residual methanol amount of about 500 ppm.
  • the volume ratio of the fraction to the head space was set to 5:95 to 65:35, and the cycle of storage and transfer was repeated in the same manner as in Example 2.
  • the volume ratio was "fraction:head space.”
  • Example 4 Nitrogen purging of the eluent tank and physical properties of purified EPA-E The effects of nitrogen purging of the eluent tank on the color b value, anisidine value, and acid value of purified EPA-E in the product tank after HPLC purification, eluent evaporation, and thin-film evaporation were confirmed.
  • the intermediate EPA-E was stored in a buffer tank using the same procedure as in Example 3. This intermediate EPA-E was further de-methanolized using a thin-film evaporator, and DL- ⁇ -tocopherol was added to adjust the total amount to 0.2% relative to the EPA-E, and the product was stored as purified EPA-E in a nitrogen-purged product tank.

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Abstract

本製造方法は、高度不飽和脂肪酸（以下、ＰＵＦＡと記す）またはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物の製造方法であって、容器Ａに溶媒を収容して容器Ａ内で不活性ガス雰囲気下で溶離液を得ること、当該溶離液を移動相として使用するクロマトグラフィーにより、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸混合物を精製して、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含むフラクションを得ること、および当該ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含むフラクションを濃縮して、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物を得ることを含む製造方法を提供する。

Description

高度不飽和脂肪酸またはそのエステル誘導体含有組成物およびその製造方法
　本開示は、高度不飽和脂肪酸（以下、ＰＵＦＡとも記す）またはそのエステル誘導体を含有する脂肪酸組成物およびその製造方法に関する。
　高度不飽和脂肪酸またはそのエステル誘導体は、医薬品、健康食品、化粧品の原料として使用される。医薬品、健康食品、化粧品に使用される高度不飽和脂肪酸またはそのエステル誘導体を天然油脂から高純度で得る製造方法として精密蒸留、硝酸銀錯体法、クロマトグラフィーなどの方法が知られている（例えば、特許文献１～４を参照）。
　一方、高度不飽和脂肪酸またはそのエステル誘導体を含有する組成物の変性および／または劣化が問題となっている。例えば、特許文献１には、製品化の過程および製品の保存期間中における酸化の進行を妨げるおよび／または遅らせるとの課題を解決するために、溶存酸素量、過酸化物価、酸価およびアニシジン価が一定値以下であるＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体組成物を提供することが記載されている。
　特許文献２には、吸着樹脂を担体とするクロマトグラフィーによるＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体の分離精製の時に、溶離液中の溶存酸素がＰＵＦＡなどの変性および／または劣化に繋がるリスクを指摘して、当該リスクを防ぐために、溶離液を加熱還流したり、溶離液に窒素、炭酸ガスを吹き込んだりして使用できることが記載されている。
　さらに、特許文献３には、銀塩溶液を用いたＰＵＦＡのエステル誘導体の製造方法において反応槽として流路型撹拌機を用いること、銀塩溶液の劣化を抑制するために当該製造方法を低酸素条件下で行うことについて記載がある。
　特許文献４は、疑似移動床クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィーによるＰＵＦＡのエステル誘導体精製に関する特許であり、当該実施例には「すべてのクロマトグラフィー操作は不活性ガス雰囲気のもと、光から保護されて行われる」旨の記載がある。
特開２０１７－１１４７７６号公報 特開昭６１－２９１５４０号公報 特開２０１９－１３５３０７号公報 特表２０１７－５０２１３０号公報
　本発明者らは、高度不飽和脂肪酸またはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物の製造において、移動相の溶存酸素を抑制しないと、クロマトグラフィーで得られた高度不飽和脂肪酸またはそのエステル誘導体を含むフラクションを容器内に不活性ガス雰囲気下で保存しても、酸素濃度を十分に低下できず、脱溶剤時に高度不飽和脂肪酸またはそのエステル誘導体が変性してしまうという課題、とりわけ着色してしまうという課題を見出した。
　本開示は、高度不飽和脂肪酸またはそのエステル誘導体を含有する脂肪酸混合物を精製するクロマトグラフィーにおいて、収容された容器内で不活性ガス雰囲気下に置かれて得られた溶離液を移動相として用いることにより、着色などの変性が抑制された高度不飽和脂肪酸若しくはそのエステル誘導体を含有する脂肪酸組成物を提供することに関する。
　本開示の一つの側面において、以下の高度不飽和脂肪酸またはそのエステル誘導体を含有する脂肪酸組成物を製造する方法を提供する。本開示の一つの側面において、以下の高度不飽和脂肪酸またはそのエステル誘導体を含有する脂肪酸組成物を提供する。
　［１－１］ 高度不飽和脂肪酸（以下、ＰＵＦＡとも記す）またはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物の製造方法であって、
　（１）容器Ａへの溶媒の収容を行って、容器Ａ内で不活性ガス雰囲気下で溶離液を得ること、
　（２）前記溶離液を移動相として使用するクロマトグラフィーにより、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸混合物の精製を行って、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含むフラクションを得ること、および
　（３）当該ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含むフラクションの濃縮を行って、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物を得ること、
を含む製造方法。
　［１－２］前記フラクションの濃縮が、前記ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含むフラクションに含まれる溶離液を、減圧および／または加熱して、蒸留により溶媒として回収することを含む、［１－１］に記載の製造方法。
　［１－３］前記溶媒が、蒸留により得られた溶媒を含む、［１－１］または［１－２］に記載の製造方法。
　［１－４］前記溶媒が、前記フラクションの濃縮でＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含むフラクションから回収した溶媒を含む、［１－１］～［１－３］のいずれかに記載の製造方法。
　［１－５］容器Ａ内の溶離液の溶存酸素濃度が２０ｍｇ／Ｌ以下、１５ｍｇ／Ｌ以下、または１１ｍｇ／Ｌ以下である、［１－１］～［１－４］のいずれかに記載の製造方法。
　［１－６］前記容器Ａのヘッドスペース酸素濃度が１０体積％以下、５体積％以下、４体積％以下、３体積％以下、２体積％以下、１体積％以下、０．５体積％以下、または、０．１体積％以下である、［１－１］～［１－５］のいずれかに記載の製造方法。
　［１－７］前記ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含むフラクションが、容器Ｃ内に不活性ガス雰囲気下で収容される、［１－１］～［１－６］のいずれかに記載の製造方法。
　［１－８］前記フラクション収容後の容器Ｃのヘッドスペース酸素濃度が１．５体積％以下、１．０体積％以下、０．７体積％以下、０．５体積％以下、０．３体積％以下、または、０．１体積％以下である、［１－７］に記載の製造方法。
　［１－９］前記脂肪酸混合物の精製前に、前記ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸混合物が、容器Ｂ内に不活性ガス雰囲気下で収容される、［１－１］～［１－８］のいずれかに記載の製造方法。
　［１－１０］容器Ｂのヘッドスペース酸素濃度が１．５体積％以下、１．０体積％以下、０．７体積％以下、０．５体積％以下、０．３体積％以下、または、０．１体積％以下である、［１－９］に記載の製造方法。
　［１－１１］前記ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物が、容器Ｄ内に不活性ガス雰囲気下で収容される、［１－１］～［１－１０］のいずれかに記載の製造方法。
　［１－１２］前記容器Ｄのヘッドスペース酸素濃度が０．７体積％以下、０．５体積％以下、０．３体積％以下、または０．１体積％以下である、［１－１１］に記載の製造方法。
　［１－１３］前記容器Ａ、容器Ｂ、容器Ｃ、および容器Ｄ内の不活性ガスが、それぞれ独立して、窒素、アルゴン、炭酸ガス、またはその組み合わせである、［１－１］～［１－１２］のいずれかに記載の製造方法。
　［１－１４］前記容器Ａ、容器Ｂ、容器Ｃ、および容器Ｄ内の不活性ガスが、窒素である、［１－１］～［１－１３］のいずれかに記載の製造方法。
　［１－１５］前記ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物中の全脂肪酸またはそのエステル誘導体中におけるＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体の割合が、９７％以上、９６％以上、９０％以上、８０％以上、７０％以上、または５０％以上である、［１－１］～［１－１４］のいずれかに記載の製造方法。
　［１－１６］前記ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物の色ｂ値が、３．２以下、３以下、２．８以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、または０．７以下である、［１－１］～［１－１５］のいずれかに記載の製造方法。
　［１－１７］前記ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物のアニシジン価が、１５以下、１０以下、５以下、１以下、０．７以下、０．５以下、０．３以下、または０．２５以下である、［１－１］～［１－１６］のいずれかに記載の製造方法。
　［１－１８］前記ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物の残存溶離液量が１００ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、１ｐｐｍ以下、０．５ｐｐｍ以下、または０．１６ｐｐｍ以下である、［１－１］～［１－１７］のいずれかに記載の製造方法。
　［１－１９］前記フラクションの濃縮の加熱温度が、最高温度１９０℃以下、１６０℃以下、１４０℃以下、１３５℃以下、１３０℃以下、１２０℃以下、もしくは１００℃以下、および／または、４０℃以上、６０℃以上、８０℃以上、１００℃以上、１２０℃以上、１３０℃以上、１３５℃以上、１４０℃以上、もしくは１６０℃以上である、［１－１］～［１－１８］のいずれかに記載の製造方法。
　［１－２０］前記フラクションの濃縮における減圧時の最低圧力が１００Ｐａ以下、５０Ｐａ以下、２０Ｐａ以下、１０Ｐａ以下、５Ｐａ以下、２Ｐａ以下、もしくは１Ｐａ以下、および／または、０．１Ｐａ以上、０．２Ｐａ以上、０．５Ｐａ以上、１Ｐａ以上、２Ｐａ以上、５Ｐａ以上、もしくは１０Ｐａ以上である、［１－１］～［１－１９］のいずれかに記載の製造方法。
　［１－２１］前記溶媒および溶離液が、メタノール、エタノール、２ープロパノール、アセトニトリル、アセトン、ヘキサンから選択される１種、もしくは２種以上の混合液、または、これらから選択された１種以上と水との混合液である、［１－１］～［１－２０］のいずれかに記載の製造方法。
　［１－２２］前記脂肪酸混合物の精製が、固定相としてシリカゲル系の吸着剤、または、ポリマー系の吸着剤を使用する、［１－１］～［１－２１］のいずれかに記載の製造方法。
　［１－２３］前記脂肪酸混合物の精製が、固定相として逆相系の吸着剤を使用する、［１－１］～［１－２２］のいずれかに記載の製造方法。
　［１－２４］前記フラクションの濃縮が、１つまたは２つ以上のエバポレーターを用いるものであり、当該エバポレーターの受液器の少なくとも１つの内容積が１０Ｌ以上、２０Ｌ以上、５０Ｌ以上、１００Ｌ以上、５００Ｌ以上、もしくは１０００Ｌ以上、および／または、５０００Ｌ以下、２０００Ｌ以下、１０００Ｌ以下、もしくは５００Ｌ以下である、［１－１］～［１－２３］のいずれかに記載の製造方法。
　［１－２５］前記フラクションの濃縮が、１つまたは複数のエバポレーターを用いるものであり、当該フラクションの濃縮時に当該エバポレーターの少なくとも１つを不活性ガスブローしている、［１－１］～［１－２４］のいずれかに記載の製造方法。
　［１－２６］前記ＰＵＦＡがＥＰＡ、ＤＨＡ、ｎ－３　ＤＰＡ、ＤＧＬＡ、および、ＡＲＡから選択される１種、または２種以上のこれらの組み合わせである、［１－１］～［１－２５］のいずれかに記載の製造方法。
　［１－２７］前記ＰＵＦＡのエステル誘導体が、ＰＵＦＡのＣ１～Ｃ６アルキルエステル誘導体である、［１－１］～［１－２６］のいずれかに記載の製造方法。
　［１－２８］前記ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体が、ＥＰＡエチルエステル、ＤＨＡエチルエステル、またはこれらの組み合わせである、［１－１］～［１－２７］のいずれかに記載の製造方法。
　［１－２９］クロマトグラフィーがＨＰＬＣである、［１－１］～［１－２８］のいずれかに記載の製造方法。
　［１－３０］前記容器Ａの容積は５０Ｌ以上、１００Ｌ以上、２００Ｌ以上、５００Ｌ以上、１０００Ｌ以上、２０００Ｌ以上、もしくは４０００Ｌ以上、および／または、２００００Ｌ以下、１００００Ｌ以下、４０００Ｌ以下、２０００Ｌ以下、もしくは１０００Ｌ以下である、［１－１］～［１－２９］のいずれかに記載の製造方法。
　［１－３１］［１－１］～［１－３０］のいずれかに記載の製造方法により製造したＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物。
　［１－３２］少なくとも一種の溶媒として、単一の溶媒、または２種以下、３種以下、４種以下、５種以下、１０種以下の溶媒が使用される、［１－１］～［１－３０］のいずれかに記載の製造方法。
　［２－１］高度不飽和脂肪酸（以下、ＰＵＦＡとも記す）またはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物であって、当該脂肪酸組成物中の全脂肪酸またはそのエステル誘導体中におけるＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体の割合が、９７％以上、９６％以上、９０％以上、８０％以上、７０％以上、または、５０％以上であって、当該脂肪酸組成物の色ｂ値が、３．２以下、３以下、２．８以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、または、０．７以下であるＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物。
　［２－２］前記ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物のアニシジン価が、１５以下、１０以下、５以下、１以下、０．７以下、０．５以下、０．３以下、または、０．２５以下である、［２－１］に記載の脂肪酸組成物。
　［２－３］前記ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物の残存溶離液量が１００ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、１ｐｐｍ以下、０．５ｐｐｍ以下、または、０．１６ｐｐｍ以下である、［２－１］または［２－２］に記載の脂肪酸組成物。
　［２－４］前記ＰＵＦＡがＥＰＡ、ＤＨＡ、ｎ－３　ＤＰＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡから選択される１種、または、２種以上のこれらの組み合わせである、［２－１］～［２－３］のいずれかに記載の脂肪酸組成物。
　［２－５］前記ＰＵＦＡのエステル誘導体が、ＰＵＦＡのＣ１～Ｃ６アルキルエステル誘導体である、［２－１］～［２－４］のいずれかに記載の脂肪酸組成物。
　［２－６］前記ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体が、ＥＰＡのエチルエステル、ＤＨＡのエチルエステル、または、これらの組み合わせである、［２－１］～［２－５］のいずれかに記載の脂肪酸組成物。
　本開示によれば、着色の抑制された高度不飽和脂肪酸またはそのエステル誘導体を含有する脂肪酸組成物を製造できる。また、本開示によれば、高度不飽和脂肪酸またはそのエステル誘導体を含有する脂肪酸組成物中の溶存酸素を抑制することができる。
図１は本実施例を説明する工程図であり、エイコサペンタエン酸エチルエステル（以下、ＥＰＡ－Ｅとも記す）を含有する脂肪酸組成物の製造方法を示す工程図である。
　本明細書において用語「脂肪酸」は、約Ｃ１２～Ｃ２２の様々な鎖長の脂肪族カルボン酸を意味する。ここで「Ｃ１２～Ｃ２２」における数字はカルボン酸の鎖中の炭素原子の総数を意味する。主な鎖長はＣ１６～Ｃ２２である。脂肪酸の構造は「Ｘ：Ｙ」の単純な表記法で表され得る。ここでＸは特定の脂肪酸中の炭素原子の総数であり、Ｙは二重結合の数である。例えば、炭素数２０の飽和脂肪酸は「Ｃ２０：０」と表記され、炭素数１８の一価不飽和脂肪酸は「Ｃ１８：１」と表記され、アラキドン酸は「Ｃ２０：４，ｎ－６」と表記され得る。「ｎ－」は、脂肪酸のメチル末端から数えた二重結合の始まる位置を示し、例えば「ｎ－６」であれば、二重結合の始まる位置が脂肪酸のメチル末端から数えて６番目であることを示す。この方法は当業者には周知であり、この方法に従って表記された脂肪酸については、当業者であれば容易に特定することができる。
　脂肪酸は、脂肪族鎖を有するカルボン酸であり、それは、飽和または不飽和のどちらかである。脂肪酸は、通常は天然源由来のトリグリセリドまたはリン脂質の加水分解により産業的に製造される。一部のものは、合成により製造される。製造の方法にかかわらず、精製法が、食品、化粧品または産業的使用のための純粋な製品を得るために必要とされる。
　本明細書において用語「高度不飽和脂肪酸」は、１つより多くの二重結合を持つ脂肪酸を意味する。本明細書において、高度不飽和脂肪酸は、ＰＵＦＡと呼称されることもある。高度不飽和脂肪酸は、例えば、３～６個の二重結合を持つ脂肪酸であり得る。高度不飽和脂肪酸としては、例えばα－リノレン酸「Ｃ１８：３，ｎ－３」、γ－リノレン酸「Ｃ１８：３，ｎ－６」、ジホモ－γ－リノレン酸「Ｃ２０：３，ｎ－６」、アラキドン酸「Ｃ２０：４，ｎ－６」、エイコサペンタエン酸「Ｃ２０：５，ｎ－３」、ドコサペンタエン酸「Ｃ２２：５，ｎ－６」、およびドコサヘキサエン酸「Ｃ２２：６，ｎ－３」が挙げられる。本明細書における高度不飽和脂肪酸のエステル誘導体は、典型的にはアルキルエステル、例えばＣ１－Ｃ６アルキルエステル、またはＣ１－Ｃ４アルキルエステルである。エステルの例としては、エチルエステルが挙げられる。
　＜脂肪酸組成物の製造方法＞
　本発明の一態様として、容器Ａに溶媒を収容して、容器Ａ内で不活性ガス雰囲気下で溶離液を得ること、溶離液を移動相として使用するクロマトグラフィーにより、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸混合物の精製を行って、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含むフラクションを得ること、およびＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含むフラクションの濃縮を行って、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物を得ることを含む製造方法が挙げられる。
　脂肪酸混合物
　本発明の一態様において、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸混合物は、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸として含む原料から得ることができる。例えば、植物、動物の油および脂肪を含む天然の油脂を含む原料から、並びに遺伝子組み換え植物、動物および酵母を含む微生物から得られる油脂を含む原料から得ることができる。原料の例として、魚油、藻類および微細藻類の油、並びに例えばルリジサ油、シャゼンムラサキ属の油およびマツヨイグサ油といった植物油が挙げられる。
　本発明の一態様において、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸混合物は、原料を蒸留にかけることにより得られる。
　本発明の一態様において、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸混合物は、原料である油脂を、水を用いた加水分解により遊離脂肪酸に分解したＰＵＦＡを含み得、または、原料である油脂を、Ｃ１～Ｃ６アルキルアルコールを用いた加アルコール分解により、Ｃ１～Ｃ６アルキルエステルに分解したエステル誘導体を含み得る。Ｃ１～Ｃ６アルキルエステルの例としては、エチルエステルが挙げられる。
　本発明の一態様として、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸混合物が、脂肪酸混合物の精製前に、容器Ｂ内に不活性ガス雰囲気下で収容されることを含む製造方法が挙げられる。本発明の一態様において、容器Ｂへの脂肪酸混合物の収容を行うとき、容器Ｂ内は不活性ガス雰囲気下に置かれている。本発明の一態様において、容器Ｂ内は、脂肪酸混合物の収容前、収容後または収容と同時に、不活性ガス雰囲気下に置かれることができる。本発明の一態様において、容器Ｂが不活性ガス雰囲気下に置かれた後に、容器Ｂ内に脂肪酸混合物が収容されることが好ましい。
　容器
　本発明の一態様において、容器Ａとは、溶離液を収容し保存するための容器であり、溶離液を収容するタンクであることができる。本明細書において、溶離液を収容するタンクは溶離液タンクと呼ばれることができる。
　本発明の一態様において、容器Ｂとは、原料から得られたＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸混合物を収容し保存するための容器であり、脂肪酸混合物を収容するタンクであることができる。本発明の一態様において、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸混合物は、連続精留により得られた主留であり得る。容器Ｂのうち、主留を収容するタンクは主留タンクと呼ばれることができる。
　本発明の一態様において、容器Ｃとは、脂肪酸混合物の精製により得られたＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含むフラクションを収容し保存するための容器であり、フラクションを収容するタンクであることができる。本明細書において、フラクションを収容するタンクはフラクションタンクと呼ばれることができる。
　本発明の一態様において、容器Ｄとはフラクションの濃縮により得られたＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物を収容し保存するための容器であり、脂肪酸組成物を収容するタンクであることができる。本明細書において、脂肪酸組成物を収容するタンクは製品タンクと呼ばれることができる。本明細書において、脂肪酸組成物を収容するタンクはバッファタンクと呼ばれることができる。
　本発明の一態様において、容器が不活性ガスによりパージされることによって、容器内の溶媒、フラクション、脂肪酸混合物または脂肪酸組成物が不活性ガス雰囲気下に置かれる。本発明の一つの側面において、不活性ガスは、化学的に安定で、他の元素あるいは化合物に容易に影響を与えないガスであれば特に限定されない。不活性ガスとしては、例えば、窒素、アルゴン、炭酸ガス、およびそれらの２種以上のガスの混合ガスが挙げられる。本発明の一態様において、不活性ガス雰囲気のために使用される不活性ガスは、窒素、アルゴン、または、炭酸ガスであり得る。本発明の一態様において、不活性ガス雰囲気下とは、空気中に存在する反応しやすい分子である酸素を除き、反応しにくい窒素、アルゴン、または、炭酸ガスに置換した状態をいう。本発明の一つの態様において、不活性ガス雰囲気下とは、不活性ガスを主に含む酸素濃度が１０体積％未満の気体存在下の状態をいう。本発明の一態様において、不活性ガスによるパージは容器への溶媒、フラクション、脂肪酸混合物または脂肪酸組成物の収容前または後に行われる。
　本発明の一態様において、容器は密閉型の容器、例えばタンクであり得る。本発明の一態様において、容器は、ヘッドスペースに不活性ガスを封入するための装置である不活性ガス封入装置を有する。不活性ガス封入装置としては、例えばガスシールユニットおよびブリザー弁が挙げられる。本発明の一態様における容器は、溶媒、溶離液、脂肪酸混合物、フラクションおよび脂肪酸組成物が充填されていない、気体を含む空間を有する。本明細書において、容器中、溶媒、溶離液、脂肪酸混合物、フラクションおよび脂肪酸組成物が充填されてない、気体を含む空間を「ヘッドスペース」と呼ぶ。本発明の一態様において、容器の容積は、溶媒、溶離液、脂肪酸混合物、フラクションおよび／または脂肪酸組成物が充填された部分の体積とヘッドスペースの体積を合計した体積である。
　本発明の一態様において、容器のヘッドスペース体積は、上限値および／または下限値を設けて、当該値の範囲内で推移させ得る。
　本発明の一態様において、ヘッドスペース体積の上限値とは、本発明に係る製造方法を実施する際に、ヘッドスペース体積が最も大きくなり、溶媒、溶離液、脂肪酸混合物、フラクションおよび／または脂肪酸組成物が充填された部分の体積が最も小さくなる時点のヘッドスペース体積である。本明細書において、ヘッドスペース体積が上限値である容器は、収容前の容器と呼称されることがある。また、当該容器は、移送後の容器と呼称されることもある。例えば、ヘッドスペース体積が上限値であるフラクションタンクであれば、それぞれ「収容前のフラクションタンク」、「移送後のフラクションタンク」と呼称されることがある。
　本発明の一態様において、ヘッドスペース体積の下限値とは、本発明に係る製造方法を実施する際に、ヘッドスペース体積が最も小さくなり、溶媒、溶離液、脂肪酸混合物、フラクションおよび／または脂肪酸組成物が充填された部分の体積が最も大きくなる時点のヘッドスペース体積である。本明細書において、ヘッドスペース体積が下限値である容器は、収容後の容器と呼称されることがある。また、当該容器は、移送前の容器と呼称されることもある。例えば、ヘッドスペース体積が下限値であるフラクションタンクであれば、それぞれ「収容後のフラクションタンク」、「移送前のフラクションタンク」と呼称されることがある。
　本発明の一態様における容器Ａのヘッドスペース体積の上限値は、容器Ａの容積の５０体積％以上、７０体積％以上、８０体積％以上、８５体積％以上、８７体積％以上、８９体積％以上、９０体積％以上、もしくは９５体積％以上、および／または１００体積％以下、９９体積％以下、９７体積％以下、９５体積％以下、９０体積％以下、８９体積％以下、８５体積％以下、８０体積％以下、もしくは７０体積％以下であり得る。本発明の一態様における容器Ａのヘッドスペース体積の下限値は、容器Ａの容積の１０体積％以上、２０体積％以上、３０体積％以上、５０体積％以上、７０体積％以上、８０体積％以上、８５体積％以上、もしくは８７体積％以上、および／または９５体積％以下、９０体積％以下、８９体積％以下、８７体積％以下、８５体積％以下、８０体積％以下、７０体積％以下、もしくは５０体積％以下であり得る。また、本発明の一態様において、容器Ａの容積は５０Ｌ以上、１００Ｌ以上、２００Ｌ以上、５００Ｌ以上、１０００Ｌ以上、２０００Ｌ以上、もしくは４０００Ｌ以上、および／または、２００００Ｌ以下、１００００Ｌ以下、４０００Ｌ以下、２０００Ｌ以下、もしくは１０００Ｌ以下であり得る。
　本発明の一態様における容器Ｂのヘッドスペース体積の上限値は、容器Ｂの容積の５０体積％以上、７０体積％以上、８０体積％以上、８５体積％以上、９０体積％以上、もしくは９５体積％以上、および／または１００体積％以下、９９．９体積％以下、９９体積％以下、９７体積％以下、９５体積％以下、９０体積％以下、８５体積％以下、８０体積％以下、もしくは７０体積％以下であり得る。本発明の一態様における容器Ｂのヘッドスペース体積の下限値は、容器Ｂの容積の０体積%以上、１体積％以上、３体積％以上、５体積％以上、７体積％以上、１０体積％以上、１５体積％以上、２０体積％以上、もしくは３０体積％以上、および／または７０体積％以下、５０体積％以下、３０体積％以下、２０体積％以下、１５体積％以下、１０体積％以下、７体積％以下、もしくは５体積％以下であり得る。また、本発明の一態様において、容器Ｂの容積は５００Ｌ以上、１０００Ｌ以上、２０００Ｌ以上、５０００Ｌ以上、１００００Ｌ以上、２００００Ｌ以上、もしくは５００００Ｌ以上、および／または、２０００００Ｌ以下、１０００００Ｌ以下、５００００Ｌ以下、２００００Ｌ以下、もしくは１００００Ｌ以下であり得る。
　本発明の一態様における容器Ｃのヘッドスペース体積の上限値は、容器Ｃの容積の５０体積％以上、７０体積％以上、８０体積％以上、８５体積％以上、９０体積％以上、もしくは９５体積％以上、および／または１００体積％以下、９９．９体積％以下、９９体積％以下、９７体積％以下、９５体積％以下、９０体積％以下、８５体積％以下、８０体積％以下、もしくは７０体積％以下であり得る。本発明の一態様における容器Ｃのヘッドスペース体積の下限値は、容器Ｃの容積の０体積%以上、１体積％以上、３体積％以上、５体積％以上、７体積％以上、１０体積％以上、２０体積％以上、３０体積％以上、３５体積％以上、もしくは４０体積％以上、および／または７０体積％以下、６０体積％以下、５０体積％以下、４０体積％以下、３５体積％以下、３０体積％以下、２０体積％以下、１５体積％以下、もしくは１０体積％以下であり得る。また、本発明の一態様において、容器Ｃの容積は５０Ｌ以上、１００Ｌ以上、２００Ｌ以上、５００Ｌ以上、１０００Ｌ以上、２０００Ｌ以上、もしくは４０００Ｌ以上、および／または、２００００Ｌ以下、１００００Ｌ以下、４０００Ｌ以下、２０００Ｌ以下、もしくは１０００Ｌ以下であり得る。
　本発明の一態様における容器Ｄのヘッドスペース体積の上限値は、容器Ｄの容積の５０体積％以上、７０体積％以上、８０体積％以上、８５体積％以上、９０体積％以上、もしくは９５体積％以上、および／または１００体積％以下、９９．９体積％以下、９９体積％以下、９７体積％以下、９５体積％以下、９０体積％以下、８５体積％以下、８０体積％以下、もしくは７０体積％以下であり得る。本発明の一態様における容器Ｄのヘッドスペース体積の下限値は、容器Ｄの容積の０体積%以上、１体積％以上、３体積％以上、５体積％以上、７体積％以上、１０体積％以上、１５体積％以上、１９体積％以上、２０体積％以上、もしくは３０体積％以上、および／または７０体積％以下、５０体積％以下、３０体積％以下、２０体積％以下、１９体積％以下、１５体積％以下、もしくは１０体積％以下であり得る。また、本発明の一態様において、容器Ｄの容積は５０Ｌ以上、１００Ｌ以上、２００Ｌ以上、５００Ｌ以上、１０００Ｌ以上、２０００Ｌ以上、もしくは５０００Ｌ以上、および／または、２００００Ｌ以下、１００００Ｌ以下、５０００Ｌ以下、２０００Ｌ以下、もしくは１０００Ｌ以下であり得る。
　本発明の一態様において、容器のヘッドスペース酸素濃度とは、容器のヘッドスペースに含まれる気体中の酸素の濃度である。
　本発明の一態様において、容器Ａのヘッドスペース酸素濃度は、１０体積％以下、５体積％以下、４体積％以下、３体積％以下、２体積％以下、１体積％以下、０．５体積％以下、または０．１体積％以下であることができる。本発明の他の態様において、容器Ａのヘッドスペース酸素濃度は、１０体積％以下、５体積％以下、４体積％以下、３体積％以下、２体積％以下、１体積％以下、０．５体積％以下、もしくは０．１体積％以下、および／または０体積％以上、０．０１体積％以上、もしくは０．０５体積％以上であることができる。本発明の一態様において、容器Ａのヘッドスペース酸素濃度は溶離液収容後のヘッドスペース酸素濃度または溶離液移送後のヘッドスペース酸素濃度であることができる。
　本発明の一態様において、容器Ｂのヘッドスペース酸素濃度は、１．５体積％以下、１．０体積％以下、０．７体積％以下、０．５体積％以下、０．３体積％以下、または、０．１体積％以下であることができる。本発明の他の態様において、容器Ｂのヘッドスペース酸素濃度は、１．５体積％以下、１．０体積％以下、０．７体積％以下、０．５体積％以下、０．３体積％以下、もしくは０．１体積％以下、および／または０体積％以上、０．０１体積％以上、もしくは０．０５体積％以上であることができる。本発明の一態様において、容器Ｂのヘッドスペース酸素濃度は脂肪酸混合物収容後のヘッドスペース酸素濃度または脂肪酸混合物移送後のヘッドスペース酸素濃度であることができる。
　本発明の一態様において、フラクション収容後の容器Ｃのヘッドスペース酸素濃度は、１．５体積％以下、１．０体積％以下、０．７体積％以下、０．５体積％以下、０．３体積％以下、または、０．１体積％以下であることができる。本発明の他の態様において、フラクション収容後の容器Ｃのヘッドスペース酸素濃度は、１．５体積％以下、１．０体積％以下、０．７体積％以下、０．５体積％以下、０．３体積％以下、もしくは０．１体積％以下、および／または０体積％以上、０．０１体積％以上、もしくは０．０５体積％以上であることができる。
　本発明の一態様において、フラクション移送後の容器Ｃのヘッドスペース酸素濃度は、０．７体積％以下、０．５体積％以下、０．３体積％以下、または、０．１体積％以下であることができる。本発明の他の態様において、フラクション移送後の容器Ｃのヘッドスペース酸素濃度は、０．７体積％以下、０．５体積％以下、０．３体積％以下、もしくは０．１体積％以下、および／または０体積％以上、０．０１体積％以上、もしくは０．０５体積％であることができる。
　本発明の一態様において、容器Ｄのヘッドスペース酸素濃度は、０．７体積％以下、０．５体積％以下、０．３体積％以下、または、０．１体積％以下であることができる。本発明の一態様において、容器Ｄのヘッドスペース酸素濃度は、０．７体積％以下、０．５体積％以下、０．３体積％以下、もしくは０．１体積％以下、および／または０体積％以上、０．０１体積％以上、もしくは０．０５体積％であることができる。本発明の一態様において、容器Ｄのヘッドスペース酸素濃度は脂肪酸組成物収容後のヘッドスペース酸素濃度または脂肪酸組成物移送後のヘッドスペース酸素濃度であることができる。
　ヘッドスペース酸素濃度の測定方法は特に限定されないが、例えば、残存酸素計「パックキーパー」ＲＯ－１０３ＫＳ（飯島電子工業株式会社製）を用いて、当該機器の説明書の手順に従って測定することができる。
　本明細書において、容器Ａ、容器Ｂ、容器Ｃ、容器Ｄと特定されない容器に関する上記の記載は、容器Ａ、容器Ｂ、容器Ｃ、および容器Ｄにおいて適用される。
　溶離液
　本発明の一態様において、脂肪酸組成物の製造方法は、容器Ａに溶媒を収容して、容器Ａ内で不活性ガス雰囲気下で溶離液を得ることを含む。本発明の一態様として、容器Ａに収容する前から溶離液として利用可能な溶媒を使用する態様を含む。本発明の一態様において、容器Ａへの溶媒の収容を行うとき、容器Ａ内は不活性ガス雰囲気下に置かれている。本発明の一態様において、容器Ａ内は、溶媒の収容前、収容後または収容と同時に、不活性ガス雰囲気下に置かれることができる。本発明の一態様において、容器Ａ内が不活性ガス雰囲気下に置かれた後に、容器Ａ内に溶媒が収容されることが好ましい。
　本発明の一態様において、溶離液として利用可能な溶媒は、溶存酸素濃度が２０ｍｇ／Ｌ以下、１７．５ｍｇ／Ｌ以下、１５ｍｇ／Ｌ以下、１４ｍｇ／Ｌ以下、１３ｍｇ／Ｌ以下、１２ｍｇ／Ｌ以下または１１ｍｇ／Ｌ以下の溶媒である。本発明の他の態様において、溶離液として利用可能な溶媒は、溶存酸素濃度が２０ｍｇ／Ｌ以下、１７．５ｍｇ／Ｌ以下、１５ｍｇ／Ｌ以下、１４ｍｇ／Ｌ以下、１３ｍｇ／Ｌ以下、１２ｍｇ／Ｌ以下もしくは１１ｍｇ／Ｌ以下、および／または０ｍｇ／Ｌ以上、０．０１ｍｇ／Ｌ以上、０．０３ｍｇ／Ｌ以上、もしくは０．１ｍｇ／Ｌ以上の溶媒である。本発明の一態様において、溶離液として利用可能な溶媒は、溶存酸素濃度が２０ｍｇ／Ｌ以下、１７．５ｍｇ／Ｌ以下、１５ｍｇ／Ｌ以下、１４ｍｇ／Ｌ以下、１３ｍｇ／Ｌ以下、１２ｍｇ／Ｌ以下または１１ｍｇ／Ｌ以下のアルコール、エーテル、エステル、ケトン、ニトリル、ヘキサン類およびジクロロメタンから選択される１種、もしくは、２種以上の混合液、または、これらから選択された１種以上と水との混合液である液体である。本発明の他の態様において、溶離液として利用可能な溶媒は、溶存酸素濃度が２０ｍｇ／Ｌ以下、１７．５ｍｇ／Ｌ以下、１５ｍｇ／Ｌ以下、１４ｍｇ／Ｌ以下、１３ｍｇ／Ｌ以下、１２ｍｇ／Ｌ以下もしくは１１ｍｇ／Ｌ以下、および／または０ｍｇ／Ｌ以上、０．０１ｍｇ／Ｌ以上、０．０３ｍｇ／Ｌ以上、もしくは０．１ｍｇ／Ｌ以上のアルコール、エーテル、エステル、ケトン、ニトリル、ヘキサン類およびジクロロメタンから選択される１種、もしくは、２種以上の混合液、または、これらから選択された１種以上と水との混合液である液体である。アルコールの例として、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、２－プロパノール、ｎ－ブタノール、ｉ－ブタノール、ｓ－ブタノールおよびｔ－ブタノールが挙げられる。本発明の一側面において、アルコールの例として、メタノールおよびエタノールが挙げられる。一態様において、メタノールが挙げられる。エーテルの例として、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、およびメチルｔ－ブチルエーテルが挙げられる。エステルの例として、酢酸メチルエステルおよび酢酸エチルエステルが挙げられる。ケトンの例として、アセトン、メチルエチルケトンおよびメチルイソブチルケトンが挙げられる。ニトリルの例として、アセトニトリルが挙げられる。本発明の一態様において、溶離液として利用可能な溶媒は、溶存酸素濃度が２０ｍｇ／Ｌ以下、１７．５ｍｇ／Ｌ以下、１５ｍｇ／Ｌ以下、１４ｍｇ／Ｌ以下、１３ｍｇ／Ｌ以下、１２ｍｇ／Ｌ以下または１１ｍｇ／Ｌ以下のメタノールである。本発明の他の態様において、溶離液として利用可能な溶媒は、溶存酸素濃度が２０ｍｇ／Ｌ以下、１７．５ｍｇ／Ｌ以下、１５ｍｇ／Ｌ以下、１４ｍｇ／Ｌ以下、１３ｍｇ／Ｌ以下、１２ｍｇ／Ｌ以下もしくは１１ｍｇ／Ｌ以下、および／または０ｍｇ／Ｌ以上、０．０１ｍｇ／Ｌ以上、０．０３ｍｇ／Ｌ以上、もしくは０．１ｍｇ／Ｌ以上のメタノールである。
　本発明の一態様として、容器Ａに収容される溶媒が蒸留により得られた溶媒を含む製造方法が挙げられる。本発明の一つの側面として、蒸留により得られた溶媒は、フラクションの濃縮でフラクションから蒸留により回収して得ることができる。本発明の一つの側面として、蒸留により得られた溶媒は、蒸留した溶媒を購入して得ること、および／または、溶媒を購入した後に蒸留して得ることができる。
　本発明の一態様として、容器Ａに収容される溶媒が、フラクションの濃縮でフラクションから回収した溶媒を含む製造方法が挙げられる。
　本発明の一態様として、フラクションの濃縮が、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含むフラクションに含まれる溶離液を、減圧および／または加熱して、蒸留により溶媒として回収することを含む製造方法が挙げられる。
　クロマトグラフィーによる脂肪酸混合物の精製
　本発明の一態様における脂肪酸組成物の製造方法は、溶離液を移動相として使用するクロマトグラフィーにより、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸混合物の精製を行ってＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含むフラクションを得ることを含む。
　本明細書において「クロマトグラフィー」とは、固定相または担体と呼ばれる物質の表面あるいは内部を、移動相と呼ばれる物質が通過する過程で、混合物の分離または精製を行う方法を意味する。クロマトグラフィーは、２種類以上の物質の混合物の分析および分離に使用される。本明細書においてクロマトグラフィーとして、カラムクロマトグラフィーを行うことができ、例えば、高乱流液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ　ｔｕｒｂｕｌｅｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、分取クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＨＰＬＣ）、疑似移動床クロマトグラフィー、実移動床クロマトフラフィーおよび超臨界流体クロマトグラフィーを行うことができる。
　本明細書において「クロマトグラフィー条件」とは、クロマトグラフィーの実施条件を示す各種のパラメーターを意味する。例として、パッキング圧、移動相および固定相の組成、スラリー濃度、送液圧力、カラム温度、移動相温度、移動相勾配、移動相流速、使用されるカラムタイプ、使用される検出計装およびパラメーター、使用される試料調製プロトコル、カラム調製時の固定相の沈降時間および沈降が実施される圧力、静置時間および静置が実施される圧力を含む。カラムは、固定相を充填することによって調製したもの、または、固定相があらかじめ充填された市販のものを用いることができる。
　本発明の一態様において、クロマトグラフィーは、固定相としてシリカゲル系の吸着剤、または、ポリマー系の吸着剤を使用する。固定相は、逆相系の固定相、親水性相互作用液体クロマトグラフィー用固定相、アクリルアミド、シリカ、フェニルヘキシル固定相、極性包理アルキル、フルオロフェニルプロピルまたはクロマトグラフィーの技術分野で知られているあらゆる固定相から選択されることができる。逆相系の固定相としては、例えば、Ｃ３０、Ｃ２２、Ｃ１８、Ｃ８、Ｃ５、Ｃ４、ビフェニル、フルオロフェニルの固定相が挙げられる。ある態様において、キラル固定相が、使用される。固定相の選択は、当業者には明らかであり、クロマトグラフィーにより精製されるべき成分に依存し得る。完全にエンドキャップされたもの、部分的にエンドキャップされたものおよび塩基不活性化されたものを含め、様々な異なる種類のオクタデシルシリカ（以下、ＯＤＳとも記す）が、使用されることができる。より極性の高い成分は、非結合シリカ、アミノ相またはシアノ相のような順相の固定相を必要とし得る。
　本発明の一態様において、クロマトグラフィーは、固定相として逆相系の吸着剤を使用する。逆相分配系の吸着剤であれば特に指定なく用いることができ、例えば、ジビニルベンゼンと網状化したポリスチレンなどのポリマービーズ、またはＣ８またはＣ１８のアルキル基が結合したシリカゲル、特にＣ１８のアルキル基が結合したシリカゲルであるオクタデシルシリルを用いたＯＤＳカラムを用いることができる。
　本発明の一態様において、用いられるカラムの寸法は、特に限定されず、精製されることになる脂肪酸組成物の体積にある程度依存するであろう。カラムの直径は、１ｍｍ以上、２ｍｍ以上、４ｍｍ以上、８ｍｍ以上、１６ｍｍ以上、３２ｍｍ以上、６４ｍｍ以上、１２８ｍｍ以上、２５６ｍｍ以上もしくは５００ｍｍ以上、または４０００ｍｍ以下、２０００ｍｍ以下、１０００ｍｍ以下、５００ｍｍ以下、または１～４０００ｍｍ、２～２０００ｍｍ、４～１０００ｍｍ、８～１０００ｍｍ、１６～１０００ｍｍ、３２～５００ｍｍ、３０～８００ｍｍ、又は４００～８００ｍｍである。
　本発明の一態様において、カラムの長さは、５ｃｍ以上、１０ｃｍ以上、２０ｃｍ以上、または８００ｃｍ以下、４００ｃｍ以下、２００ｃｍ以下、１５０ｃｍ、１２０ｃｍ以下、または５～８００ｃｍ、１０～４００ｃｍ、２０～２００ｃｍ、２０～１５０ｃｍ、もしくは２０～１２０ｃｍである。
　本明細書において、「溶離液」とは、クロマトグラフィーにおいて、固定相と接しながらその間隙または表面を通り抜ける相である移動相として用いられる液体を意味する。溶離液は、クロマトグラフィーにおいて、カラムに吸着しているＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体などの成分を展開、溶離するために用いられる。本明細書において、溶離液は移動相と呼称されることがある。
　本発明の一態様において、溶離液は、容器内で不活性ガス雰囲気下で得られた後に移動相としてカラムに収容されてＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を展開および溶離する。カラムから出た溶離液はＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体とともにフラクションとして回収される。フラクションは溶出液とも呼ばれ、溶離液およびＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体などの成分を含み得る。
　本発明の一態様において、液体は、溶媒および溶離液を含む。溶媒および／または溶離液は、アルコール、エーテル、エステル、ケトン、ニトリル、ヘキサン類およびジクロロメタンから選択される１種、もしくは、２種以上の混合液、または、これらから選択された１種以上と水との混合液である。アルコールの例として、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、２－プロパノール、ｎ－ブタノール、ｉ－ブタノール、ｓ－ブタノールおよびｔ－ブタノールが挙げられる。本発明の一側面において、アルコールの例として、メタノールおよびエタノールが挙げられる。一態様において、メタノールが挙げられる。エーテルの例として、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、およびメチルｔ－ブチルエーテルが挙げられる。エステルの例として、酢酸メチルエステルおよび酢酸エチルエステルが挙げられる。ケトンの例として、アセトン、メチルエチルケトンおよびメチルイソブチルケトンが挙げられる。ニトリルの例として、アセトニトリルが挙げられる。本発明の一つの態様において、溶媒および溶離液としては単一の液体が使用される。本発明の一つの態様において、溶媒および溶離液としてはメタノールが使用される。本発明の一つの態様において、溶媒および溶離液として、単一の液体、または２種以下、３種以下、４種以下、５種以下、１０種以下の液体が使用される。
　溶離液は、さらに、緩衝剤およびｐＨ調整剤を含む添加剤を含むことができる。添加剤の選択は、使用される溶離液、使用される固定相および精製されるべき成分に基づいて決定され得る。一部の態様において、溶離液は、ギ酸、ギ酸アンモニウム、トリメチルアミン、アンモニアおよび水酸化アンモニウムの１以上から選択される添加剤を含む。一部の態様において、溶離液は添加剤を含まなくても良い。
　本発明の一つの側面において、容器Ａに溶媒を収容する。一つの態様において、容器Ａは溶離液を含まず、そこに溶媒を収容して溶離液として使用する。一つの態様において、溶媒が収容される前の別の態様において、容器Ａ内が不活性ガス雰囲気下に置かれ、溶離液を含む状態であるところに溶媒を収容する。一つの態様において、溶媒は、不活性ガス雰囲気下に置かれた容器Ａ内に収容される。一つの態様において、容器Ａへの溶媒の収容前に、容器Ａ内が不活性ガス雰囲気下に置かれる。一つの態様において、溶媒は、不活性ガス雰囲気下にない容器Ａに収容される。一つの態様において、容器Ａ内は溶媒が収容された後に不活性ガス雰囲気下に置かれる。
　本発明の一つの側面において、容器Ａに収容する溶媒の溶存酸素濃度は、例えば２０ｍｇ／Ｌ以下、１５ｍｇ／Ｌ以下、または１１ｍｇ／Ｌ以下である。本発明の他の側面において、容器Ａに収容する溶媒の溶存酸素濃度は、例えば２０ｍｇ／Ｌ以下、１５ｍｇ／Ｌ以下、もしくは１１ｍｇ／Ｌ以下、および／または０ｍｇ／Ｌ以上、０．０１ｍｇ／Ｌ以上、０．０３ｍｇ／Ｌ以上、もしくは０．１ｍｇ／Ｌ以上である。
　本発明の一態様において、溶離液の溶存酸素濃度とは、容器Ａ内の溶離液に溶存する酸素の濃度であり、２０ｍｇ／Ｌ以下、１７．５ｍｇ／Ｌ以下、１５ｍｇ／Ｌ以下、１４ｍｇ／Ｌ以下、１３ｍｇ／Ｌ以下、１２ｍｇ／Ｌ以下または１１ｍｇ／Ｌ以下であり得る。本発明の一態様において、溶離液の溶存酸素濃度とは、容器Ａ内の溶離液に溶存する酸素の濃度であり、２０ｍｇ／Ｌ以下、１７．５ｍｇ／Ｌ以下、１５ｍｇ／Ｌ以下、１４ｍｇ／Ｌ以下、１３ｍｇ／Ｌ以下、１２ｍｇ／Ｌ以下もしくは１１ｍｇ／Ｌ以下、および／または０ｍｇ／Ｌ以上、０．０１ｍｇ／Ｌ以上、０．０３ｍｇ／Ｌ以上、もしくは０．１ｍｇ／Ｌ以上であり得る。溶存酸素濃度は、溶存酸素計を用いて、一般的な方法により測定することができる。
　本発明の一つの側面において、容器Ａに収容される溶媒は酸素濃度が２０ｍｇ／Ｌを上回る。一つの態様において、容器Ａに収容される溶媒の酸素濃度は２５ｍｇ／Ｌを上回る。一つの態様において、溶媒収容後に溶存酸素濃度が２０ｍｇ／Ｌ以下、１７．５ｍｇ／Ｌ以下、１５ｍｇ／Ｌ以下、１４ｍｇ／Ｌ以下、１３ｍｇ／Ｌ以下、１２ｍｇ／Ｌ以下または１１ｍｇ／Ｌ以下となった溶離液を利用する。他の態様において、溶媒収容後に溶存酸素濃度が２０ｍｇ／Ｌ以下、１７．５ｍｇ／Ｌ以下、１５ｍｇ／Ｌ以下、１４ｍｇ／Ｌ以下、１３ｍｇ／Ｌ以下、１２ｍｇ／Ｌ以下もしくは１１ｍｇ／Ｌ以下、および／または０ｍｇ／Ｌ以上、０．０１ｍｇ／Ｌ以上、０．０３ｍｇ／Ｌ以上、もしくは０．１ｍｇ／Ｌ以上となった溶離液を利用する。本発明の一つの側面において、容器Ａに収容される溶媒の溶存酸素濃度とは、容器Ａに収容される溶媒に溶存する酸素の濃度であり、２０ｍｇ／Ｌ超、１７．５ｍｇ／Ｌ超、１５ｍｇ／Ｌ超、１４ｍｇ／Ｌ超、１３ｍｇ／Ｌ超、１２ｍｇ／Ｌ超または１１ｍｇ／Ｌ超であり得る。
　本発明の一つの側面において、容器Ａに収容される溶媒に溶存する酸素濃度は、２０ｍｇ／Ｌ以下であり、例えば１７．５ｍｇ／Ｌ以下、１５ｍｇ／Ｌ以下、１４ｍｇ／Ｌ以下、１３ｍｇ／Ｌ以下、１２ｍｇ／Ｌ以下または１１ｍｇ／Ｌ以下である。本発明の他の側面において、容器Ａに収容される溶媒に溶存する酸素濃度は、２０ｍｇ／Ｌ以下であり、例えば１７．５ｍｇ／Ｌ以下、１５ｍｇ／Ｌ以下、１４ｍｇ／Ｌ以下、１３ｍｇ／Ｌ以下、１２ｍｇ／Ｌ以下もしくは１１ｍｇ／Ｌ以下、および／または０ｍｇ／Ｌ以上、０．０１ｍｇ／Ｌ以上、０．０３ｍｇ／Ｌ以上、もしくは０．１ｍｇ／Ｌ以上である。
　本発明の一つの側面において、容器Ａ内の溶離液は、クロマトグラフィーと同一または±５℃、±２．５℃、±２℃もしくは±１℃の温度、例えば室温、または室温より高い温度で容器Ａ内に収容される。一態様において、室温は２０℃～２５℃である。室温より高い温度は、２５℃以上、３０℃以上、もしくは３５℃以上、および／または６０℃以下、５０℃以下、もしくは４５℃以下、または２５～６０℃、３０～５０℃、もしくは３５～４５℃である。
　本発明の一態様において、容器Ａとはクロマトグラフィーに使用する溶離液を収容するタンクであることができる。本明細書において、溶離液を収容するタンクは溶離液タンクと呼称されることがある。
　移動相は、水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、酢酸エチル、ヘキサン類、ジクロロメタン、超臨界二酸化炭素または当該技術で既知のあらゆる他の液体の１以上を含むことができる。移動相の選択は、精製されるべき高度不飽和脂肪酸またはそのエステル誘導体および使用される固定相の考慮を必要とし得る。高度不飽和脂肪酸またはそのエステル誘導体に対する逆相固定相において、対象の高度不飽和脂肪酸またはそのエステル誘導体を展開、溶離するには十分であるが、展開、溶離が移動相の先端に近づくほど速すぎないような極性移動相が、選択されるべきである。
　本発明の一態様において、クロマトグラフィーは、移動相勾配を含む。
　本明細書において、「移動相勾配」は、クロマトグラフィーが実施される間の時間の経過に伴う移動相組成における変化を意味する。クロマトグラフィーが実施される間に経時的に漸増または漸減する百分率で異なる移動相組成の移動相をカラムに収容することができる。
　移動相勾配の主な目的は、溶出した高度不飽和脂肪酸またはそのエステル誘導体が検出時に十分に分離したピークを生成するように、カラムに強く保持されている成分をより速く溶出する一方で弱く保持されている成分をよりゆっくりと溶出させることである。例えば、逆相クロマトグラフィーでは、移動相中の非極性移動相を低い含有量で開始することは、弱く保持された成分が分離されることを可能にする。強く保持された成分は、カラムのトップの吸着剤表面上に残るか、または非常にゆっくりと移動するであろう。移動相中のアセトニトリルなどの非極性移動相の量を増やすことは、非極性移動相による固定相の吸着部位に対する競合の着実な増大のため、強く保持された成分がより速く移動することを可能にする。
　従って、高度不飽和脂肪酸またはそのエステル誘導体に対して用いられる逆相クロマトグラフィーでは、クロマトグラフィーの開始時の移動相は、約１００％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％または約０％から選択される高い百分率の極性移動相Ａ、例えば水を含み得る。移動相Ｂは、移動相Ａよりも非極性の移動相、であることができる。例えば、移動相Ａが水である場合、移動相Ｂはメタノールであることができる。移動相Ｂは、移動相の残りの百分率を構成するであろう。クロマトグラフィーが実施され、移動相がカラムを通して溶出される際に、勾配は、結果として時間の経過に伴う移動相Ｂの濃度における漸増をもたらすであろう。一部の態様において、単一組成の液体が移動相として使用されることもできる。一部の態様において、単一組成の液体は、水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、酢酸エチル、ヘキサン類、ジクロロメタン、超臨界二酸化炭素または当該技術で既知のあらゆる他の液体であり得る。
　ある態様において、経時的なＢの増加率は、一定であることができる。ある態様において、勾配は存在せず、移動相は、溶出の間定組成である。ある態様において、クロマトグラフィー条件の内の異なる時間範囲における移動相Ｂの百分率の異なる増加率が、使用されることができる。ある態様において、移動相は、クロマトグラフィー条件の特定の時間範囲の間、特定組成であることができ、他の時間範囲では、勾配を含む。
　移動相の送達システムは、ポンプデバイス、例えば商業的に入手可能なクロマトグラフィー用ポンプであり、それは、移動相をカラムに提供する。そのようなポンプは、一般に耐腐食性かつ耐溶剤性であり、パルスフリーな流れ、０．１～１００Ｌ／分の範囲の流速、流速の正確な制御、６０００ｐｓｉまでの高圧の生成を提供する。往復ポンプは、小さいチャンバーからなり、その中で移動相がモーター駆動ピストンの前後運動によりポンプ収容される。交互に開閉する２つの逆止弁が、シリンダを出入りする移動相の方向および流れを制御する。シングルピストンポンプは、特別に設計されたカムを使用して非常に迅速な補充時間を可能にし、より連続的な流れを生み出す。往復ポンプによるパルス化された流れの欠点は、パルスダンパーを用いることによりしばしば克服される。互いに位相を異にして動くピストンで作動するデュアルピストンポンプの使用は、パルスフリーの流体送達のための合理的な解決策を与える。カラムにおける線速度は流体がカラム断面を通過する速度を表す。線速度は、次の式で計算できる値である。
　線速度「ｍ／時間」＝流量「ｍ３／時間」／カラム断面積「ｍ２」
　線速度は、約０．２～２０．０ｍ／時間、約１．０～１５．０ｍ／時間、約１．０～１０．０ｍ／時間、約１．５～１０．０ｍ／時間または約２．０～９．０ｍ／時間であることができる。一態様において、線速度は約４．０～９．０ｍ／時間である。
　本発明の一態様において、クロマトグラフィーは室温、または室温より高い温度で実施される。一態様において、クロマトグラフィーは室温より高い温度で実施される。一態様において、室温は２０℃～２５℃である。
　本発明の一態様において、室温より高い温度は、２５℃以上、３０℃以上、もしくは３５℃以上、および／または６０℃以下、５０℃以下、もしくは４５℃以下、または２５～６０℃、３０～５０℃、もしくは３５～４５℃である。
　本明細書において「フラクション」とは、カラムに負荷されてクロマトグラフィーに付されたＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸混合物およびその脂肪酸混合物を展開および溶離するためにカラムに収容された溶離液のうち、カラムから溶出した溶出液を特定の時間ごとに小さい量に分けて収集したものを意味する。フラクションを得るプロセスを分画と呼び、分画において、脂肪酸の組成は、時間変化に従って変動し得る。異なるフラクションが、異なる時点で、脂肪酸混合物内の高度不飽和脂肪酸またはそのエステル誘導体などの個々の成分の特有の性質、例えば固定相および／または移動相に関するその親和性における差に基づいて収集される。
　本発明の一つの側面として、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含むフラクションが、容器Ｃ内に不活性ガス雰囲気下で収容されることを含む製造方法が挙げられる。本発明の一態様において、容器Ｃへのフラクションの収容を行うとき、容器Ｃ内は不活性ガス雰囲気下に置かれている。本発明の一態様において、容器Ｃ内は、フラクションの収容前、収容後または収容と同時、不活性ガス雰囲気下に置かれることができる。本発明の一態様において、容器Ｃが不活性ガス雰囲気下に置かれた後に、容器Ｃ内にフラクションが収容されることが好ましい。
　本発明の一態様において、容器Ｃとはクロマトグラフィーで得られたフラクションを収容するタンクであることができる。本明細書において、フラクションを収容するタンクは、フラクションタンクと呼称されることがある。
　フラクションの濃縮
　本発明の一態様における脂肪酸組成物の製造方法は、クロマトグラフィーで得られたＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含むフラクションの濃縮を行って、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物を得ることを含む。
　フラクションの濃縮は、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体と溶離液とを含むフラクションを減圧および／または加熱して溶離液を蒸留することを含み、濃縮において、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体と溶離液とが分離される。本発明の一態様において、フラクションの濃縮においてフラクションを１つまたは複数のエバポレーターにかけることができる。本発明の一態様において、フラクションの濃縮で蒸留により分離された溶離液は、溶媒として回収して再度脂肪酸組成物の製造に使用されることができる。フラクションの濃縮で分離、回収した溶媒は、容器Ａに収容され、容器Ａ内で不活性ガス雰囲気下で溶離液を得ることができる。
　本発明の一態様において、フラクションの濃縮で用いられるエバポレーターとしては、溶離液蒸発器および／または薄膜蒸発器が挙げられる。溶離液蒸発器としては、例えば、単一蒸発装置、多重効用蒸発装置、多室蒸発装置、自然循環型エバポレーター、強制循環型エバポレーター、薄膜流下型エバポレーター、薄膜上昇型エバポレーター、および、これらの組合せが挙げられる。本発明の一側面において、自然循環型エバポレーターの方式としては、例えば、外部加熱方式、カランドリア方式が挙げられる。
　本発明の一態様において、フラクションの濃縮で任意のタイプのエバポレーターを用いることができるが、例えば、薄膜蒸発器、単一蒸発装置、多重効用蒸発装置、多室蒸発装置、自然循環型エバポレーター、強制循環型エバポレーター、薄膜流下型エバポレーター、薄膜上昇型エバポレーター、および、これらの組合せを用いることができる。本発明の一側面において、自然循環型エバポレーターの方式としては、例えば、外部加熱方式、カランドリア方式が挙げられる。
　本発明の一態様において、フラクションの濃縮で用いられるエバポレーターの受液器の少なくとも１つの内容積が１０Ｌ以上、２０Ｌ以上、５０Ｌ以上、１００Ｌ以上、５００Ｌ以上、もしくは１０００Ｌ以上、および／または、５０００Ｌ以下、２０００Ｌ以下、１０００Ｌ以下、もしくは５００Ｌ以下である。
　本発明の一態様において、フラクションの濃縮で用いられるエバポレーターの少なくとも１つがフラクションの濃縮で不活性ガスブローされている。不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、炭酸ガスまたはその組み合わせが挙げられる。一態様において、窒素が挙げられる。本発明の一態様において、不活性ガスブローされるエバポレーターとしては、溶離液蒸発器が挙げられる。
　本明細書において「不活性ガスブロー」とは気体の入れ替えを目的としてエバポレーターなどの装置または容器に不活性ガスを供給することを意味する。不活性ガスの供給量や供給速度は、特に限定されない。窒素ブローは不活性ガスブローの一形態である。なお、パージとは不活性ガスブローにより、不活性ガスに入れ替えられた状態までブローすることを意味する。
　本明細書において、「残存溶離液量」とはフラクションの濃縮を経て得られたＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物に含まれる溶離液の濃度を意味する。本発明の一態様において、フラクションの濃縮を経て得られたＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物は、１００ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、１ｐｐｍ以下、０．５ｐｐｍ以下、または、０．１６ｐｐｍ以下の溶離液を含む。本発明の他の態様において、脂肪酸組成物は、１００ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、１ｐｐｍ以下、０．５ｐｐｍ以下、もしくは０．１６ｐｐｍ以下、および／または０．００１ｐｐｍ以上、０．００３ｐｐｍ以上、もしくは０．０１ｐｐｍ以上の溶離液を含む。
　本発明の一態様において、フラクションの濃縮は、その加熱温度が最高温度１９０℃以下、１６０℃以下、１４０℃以下、１３５℃以下、１３０℃以下、１２０℃以下、もしくは１００℃以下、および／または、４０℃以上、６０℃以上、８０℃以上、１００℃以上、１２０℃以上、１３０℃以上、１３５℃以上、１４０℃以上、もしくは１６０℃以上で行われることができる。
　本発明の一態様において、フラクションの濃縮は、減圧時の最低圧力が１００Ｐａ以下、５０Ｐａ以下、２０Ｐａ以下、１０Ｐａ以下、５Ｐａ以下、２Ｐａ以下、もしくは１Ｐａ以下、および／または、０．１Ｐａ以上、０．２Ｐａ以上、０．５Ｐａ以上、１Ｐａ以上、２Ｐａ以上、５Ｐａ以上、もしくは１０Ｐａ以上で行われることができる。本明細書において、「減圧時の最低圧力」とは、減圧時の最も高い真空度における圧力のことである。
　本発明の一態様として、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物が、容器Ｄ内に不活性ガス雰囲気下で収容されることを含む製造方法が挙げられる。本発明の一態様において、容器Ｄへの脂肪酸組成物の収容を行うとき、容器Ｄ内は不活性ガス雰囲気下に置かれている。本発明の一態様において、容器Ｄ内は、脂肪酸組成物の収容前、収容後または収容と同時に、不活性ガス雰囲気下に置かれることができる。本発明の一態様において、容器Ｄが不活性ガス雰囲気下に置かれた後に、容器Ｄ内に脂肪酸組成物が収容されることが好ましい。
　本発明の一態様において、容器Ｄとはフラクションの濃縮を経て濃縮されたＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物を収容するタンクであることができる。本発明の一態様において、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物を収容するタンクは、製品タンクと呼称されることがある。
　＜脂肪酸組成物＞
　本明細書において「色ｂ値」とは、Ｌ＊ａ＊ｂ表色系におけるｂ＊の値を意味する。Ｌ＊ａ＊ｂ表色系中、Ｌは明度を表し、ａ＊およびｂ＊は色相と彩度を表す。そのうちｂ＊は青から黄色にかけての色相を表し、ｂ＊が０の場合は無彩色であり、プラスの方向になるほど黄みが強くなり、マイナスの方向になるほど青みが強くなる。Ｌ＊ａ＊ｂ表色系は、ＣＩＥ　ＬＡＢとも呼ばれる。色ｂ値は色彩計を用いて一般的な方法で測定することができる。本明細書において、色彩計は、色差計とも呼ばれる。
　本発明の一態様において、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物の色ｂ値は、３．２以下、３以下、２．８以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、または、０．７以下であり得る。本発明の他の態様において、脂肪酸組成物の色ｂ値は、３．２以下、３以下、２．８以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、もしくは０．７以下、および／または、－０．３以上、－０．１以上、０以上、０．１以上、０．３以上であり得る。本発明の一態様において、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物の色ｂ値は、０以上であり得、０～３．２、０～３、０～２．８、０～２．５、０～２、０～１．５、０～１、または、０～０．７であり得る。
　本明細書において「アニジン価」とは、発色にｐ－アニシジンを用いてカルボニル化合物を比色定量する数値を意味する。油脂の劣化生成物であるアルデヒドが酢酸存在下でアニシジン試薬と反応して生ずる黄色色調を３５０ｎｍの吸光度で測定する方法で、基準油脂分析試験法に公定法（２・４，２６－８１）として記載された方法により測定することができる。測定には、例えば、紫外線可視光分光光度計を用いることができる。
　本発明の一態様において、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物のアニシジン価は、１５以下、１０以下、５以下、１以下、０．７以下、０．５以下、０．３以下、または、０．２５以下であり得る。本発明の他の態様において、脂肪酸組成物のアニシジン価は、１５以下、１０以下、５以下、１以下、０．７以下、０．５以下、０．３以下、もしくは０．２５以下、および／または０以上、０．００１以上、０．００３以上、もしくは０．０１以上であり得る。
　本発明の一態様における製造方法により得られた脂肪酸組成物は、エイコサペンタエン酸（以下、ＥＰＡとも記す）、ｎ－３ドコサペンタエン酸（以下、ｎ－３　ＤＰＡとも記す）、ドコサヘキサエン酸（以下、ＤＨＡとも記す）、ジホモ－γ－リノレン酸（以下、ＤＧＬＡとも記す）、アラキドン酸（以下、ＡＲＡとも記す）、ステアリドン酸、Ｃ１８：３、Ｃ１９：４、Ｃ２０：４、Ｃ２１：５から選択される１種の高度不飽和脂肪酸もしくはそのエステル誘導体または２種以上の高度不飽和脂肪酸もしくはそのエステル誘導体の組み合わせを含むことができる。また、そのエステル誘導体は、Ｃ１～Ｃ６アルキルエステル誘導体、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルまたはヘキシルエステルであり得る。本発明の一態様において、脂肪酸組成物は、ＥＰＡエチルエステル、ＤＨＡエチルエステルまたはこれらの組み合わせを含む。本発明の一態様において、脂肪酸組成物は、ＥＰＡエチルエステルを含む。本発明の一態様において、脂肪酸組成物は、クロトン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エイコセン酸、エルカ酸、ネルボン酸、リノール酸、エイコサジエン酸、ドコサジエン酸、リノレン酸、ピノレン酸、エレオステアリン酸、ミード酸、ジホモ－γ－リノレン酸、エイコサトリエン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、アドレン酸、ボセオペンタエン酸、オズボンド酸（ｏｚｕｂｏｎｄｏ　ａｃｉｄ）、イワシ酸（ｓａｒｄｉｎｅ　ａｃｉｄ）、テトラコサペンタエン酸（ｔｅｔｒａｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）、ニシン酸（ｈｅｒｒｉｎｇ　ａｃｉｄ）、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデシル酸、アラキジン酸、ヘンイコシル酸、ベヘン酸、トリコシル酸、リグノセリン酸、ペンタコシル酸、セロチン酸、カルボセリン酸（ｃａｒｂｏｃｅｒｉｃａｃｉｄ）、モンタン酸、ノナコシル酸（ｎｏｎａｃｏｓｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）、メリシン酸、ヘントリアコンチル酸、ラッセル酸（ｌａｃｃｅｒｏｉｃ　ａｃｉｄ）、シリル酸（ｐｓｙｌｌｉｃ　ａｃｉｄ）、ゲディック酸（ｇｅｄｄｉｃ　ａｃｉｄ）、セロプラスチック酸、ヘキサトリアコンチル酸、ヘプタトリアコンチル酸（ｈｅｐｔａｔｒｉａｃｏｎｔｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）、オクタトリアコンチル酸（ｏｃｔａｔｒｉａｃｏｎｔｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）、ノナトリアコンチル酸（ｎｏｎａｔｒｉａｃｏｎｔｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）およびテトラコンチル酸（ｔｅｔｒａｃｏｎｔｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）から選択される１種の高度不飽和脂肪酸もしくはそのエステル誘導体または２種以上の高度不飽和脂肪酸もしくはそのエステル誘導体の組み合わせを含むことができる。
　本発明の一態様において、脂肪酸組成物は、脂肪酸組成物全体に対して５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．８％以上、もしくは９９．９％以上、および／または９７％未満、９８％未満、９９．０％未満、９９．９５％未満、もしくは９９．９９％未満の割合で高度不飽和脂肪酸またはそのエステル誘導体を含有する。
　特定の範囲が、本明細書において、用語「約」により先行されている数値により与えられている。用語「約」は、それが先行する正確な数ならびにその用語が先行する数に近いかまたはおおよそその数である数に関する文言上の支持を提供するために本明細書で使用される。ある数が具体的に記載された数に近いかまたはおおよそその数であるかどうかの決定において、記載された数に近いかまたはそれに接近する記載されていない数は、それが与えられている文脈において具体的に記載された数の実質的な均等量を提供する数であることができる。ある態様において、約は、それが言及する数の±５％、±２．５％、±２％または±１％を指し得る。
　別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者により一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書において記載された方法および材料と類似した、または均等なあらゆる方法および材料も、本発明の実施または試験において使用されることができ、代表的な例示的方法および材料が、ここで記載される。
　値の範囲が提供されている場合、その範囲の上限～下限の間にあるそれぞれの値およびその記載された範囲中のあらゆる他の記載された値または間にある値は、本発明の範囲内に包含されることは、理解されている。文脈が明確にそうではないことを指示しない限り、その範囲の上限～下限の間にあるそれぞれの値の単位の１０分の１まで、本発明の範囲内に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲に含まれることができ、それも本発明の範囲内に包含されあらゆる具体的に除外された限界の対象となる方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のどちらかまたは両方を除外する範囲も、本発明に含まれる。
　本明細書において、特記しない場合、「％」は「重量％」を意味する。
　本明細書に記載された特定の態様は当然変動しうるため、本発明は、そのような特定の態様に限定されない。本発明の範囲は添付された特許請求の範囲のみにより限定されると考えられるため、本明細書で用いられる用語法は特定の態様を記載する目的のためだけものであり、限定することは意図されていないことも、理解されるべきである。
　本明細書において、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形も含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」等）は、特に言及しない限り、その複数形も含むことが理解されるべきである。
　格子光学系を有する走査型分光光度計からなるＵＶ／Ｖｉｓ吸光度検出器を、使用することができる。１９０～３６０ｎｍの紫外線範囲の光源として重水素ランプを使用することができる。３６０～８００ｎｍの可視光範囲の光源としてタングステンランプを使用することができる。重水素ランプおよび／またはタングステンランプの独立した、または組み合わせられた使用は、吸光種がカラムから出てきた時にその検出をする簡単な手段を提供する。
　フォトダイオードアレイ（以下、ＰＤＡとも記す）検出器は、選択されたスペクトル範囲にわたるデータの非常に迅速な収集を可能にする紫外／可視吸光度検出器である。各クロマトグラムのピークに関する吸光度スペクトルデータが、収集および保存されることができる。保存されたデータは、ライブラリーからの純粋な標準のスペクトルと比較され得る。ＰＤＡ検出器で得られるスペクトルは、分離されない成分のそれぞれに関する特徴的なスペクトルが異なる可能性が高いため、ピークが重複して分離するのが困難である成分の同定において有用である。
　蛍光検出器は、蛍光または燐光のような化学発光特性を示す成分の検出において有用である。それらは、ＵＶ吸光度検出器よりも少なくとも１桁感度が高い。蛍光は、典型的には励起ビームに対して９０度の角度の、格子で分離された放射輻射（ｅｍｉｓｓｉｏｎ　ｒａｄｉａｔｉｏｎ）の検出により観察される。蛍光種の数は、特別な試薬を用いる溶出された化合物のポストカラム誘導体化反応、または試料自体のプレカラム誘導体化反応により増強されることができる。
　屈折率検出器は、ほとんど全ての溶質に応答する。屈折率検出器は、ＲＩ検出器とも呼ばれる。カラム流出液に対する参照移動相の屈折率における差は、結果としてクロマトグラム上のピークとしての分離された成分の検出をもたらす。移動相に対するその極めて高い感度のため、この検出器は、ＬＣポンプ内での十分なパルス減衰なしでは使用できず、それは、変化する移動相組成のため、勾配適用にも適していない。検出限界は、通常は吸光度検出器で観察される検出限界よりも低い。
　伝導率検出器は、全ての荷電し得る成分の高感度検出を提供する。この検出器は、陰イオン、陽イオン、金属、有機酸および界面活性剤のｐｐｂレベルに至るまでの簡単かつ信頼できる検出のためにＬＣシステムと共に用いられることができる。カラムおよび伝導率検出器の間の化学的抑制剤の添加は、溶出液の伝導率を低下させる役目を果たし、勾配溶出の使用および最小限のベースラインドリフトでのｐｐｂレベルの決定を可能にする。低レベルの陰イオンの典型的な決定のために、溶出液は、その弱くイオン化された低伝導率の酸に変換され、バックグラウンドノイズを低減する。例えばＮａ２ＣＯ３から炭酸に変換される。同時に、成分の陰イオンは、それらの対応する高伝導率の酸に変換され、相対的に成分の信号を増大させる。例えばＮａＣｌからＨＣｌに変換される。
　本明細書中、組成物中の各脂肪酸の割合を表す「面積％」とは、水素炎イオン化検出器付きのガスクロマトグラフィー（以下、ＧＣ－ＦＩＤとも記す）を用いて組成物を分析したチャートにおいて、それぞれの成分のピークを同定し、Agilent ChemStation積分アルゴリズムを用いて、各脂肪酸のピーク面積を求め、脂肪酸のピーク面積の総和に対する各ピーク面積の割合で、そのピークの成分の含有比率を示すものである。油化学分野では面積％は、重量％とほぼ同義のものとして用いられている。日本油化学会（ＪＯＣＳとも記す）制定　基準油脂分析試験法　２０１３版　２．４．２．１－２０１３　脂肪酸組成（ＦＩＤ恒温ガスクロマトグラフ法)および同２．４．２．２－２０１３　脂肪酸組成（ＦＩＤ昇温ガスクロマトグラフ法）を参照のこと。ガスクロマトグラフィー（以下、ＧＣとも記す）の分析条件は以下のとおりである。
　GC-FID測定条件
　　GC：7890Bまたは8890(Agilent Technologies)
　　検出器：FID
　　カラム：30 m x 0.25 mm, 0.25 μｍ film（USP PHASE G16相当のキャピラリーカラム）
　　カラム温度：200℃付近の一定温度
　　検出器温度：300℃付近の一定温度
　　試料導入部温度：300℃付近の一定温度
　　キャリアガス：ヘリウム
　　流量：エイコサペンタエン酸エチルエステルの保持時間が約30分になるように調整
　　スプリット比：1:100
　　メイクアップガス:窒素30 mL/min.
　　面積測定範囲：溶媒のピーク後からエイコサペンタエン酸エチルエステルの保持時間の約2.5倍の範囲
　　検体注入量：1.0 μＬ
　　分析時間：約75分
　本発明の一態様において、ガスクロマトグラフィーでの分析時に内部標準を使用することができる。内部標準は、内部標準に対する分析種の相対的保持時間を決定するために、または分析種の定量化を助けるために、参照マーカーとして試料に添加され得る。内部標準は、標的分析種と非常に類似しているが同一ではない化合物、例えば標的分析種の重水素化誘導体であるように、当業者により適切に選択され得る。定量化目的のために使用される場合、内部標準は、次いで分析種の信号の内部標準の信号に対する比を標準の分析種濃度の関数としてプロットすることにより較正のために使用されることができ、ここで、標準は、定量化される未知の分析種試料に対する参照として使用するために当業者により調製される既知の濃度の試料である。
　以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお下記実施例において、特記しない場合、「％」は「重量％」を意味する。
　本願の実施例において、測定機器はそれぞれ以下の機器を用いた。
・ヘッドスペース酸素濃度：残存酸素計「パックキーパー」RO-103KS（飯島電子工業株式会社製）を用いて、当該機器の説明書の手順に従って測定した。
・メタノール中の溶存酸素濃度：溶存酸素計：FOR-21（株式会社オートマチックシステムリサーチ製）を用いて、当該機器の説明書の手順に従って測定した。
・色b値：色彩・濁度同時測定器：TZ-6000（日本電色工業株式会社製）、C光源、2度視野で、20 mm試験管を用いて、当該機器の説明書の手順に従って測定した。本明細書において、色ｂ値は、L*a*b*表色系／CIE LABにおけるb*の値を表す。
・アニシジン価：紫外線可視光分光光度計： V-730（DSタイプ）（日本分光株式会社製）を用いて、USP401 Anisidine Value記載の手順に従って測定した。
・酸価：自動滴定装置：876ドジマット（メトローム社製）を用いて、USP401 Acid Value記載の手順に従って測定した。
・脂肪酸組成、異性体分析：GC-FIDを用いて測定した。ガスクロマトグラフィーの分析条件は、別途記載のとおりである。
・メタノール残存量：
　メタノール残存量は、ヘッドスペース法とガスクロマトグラフを組合せたヘッドスペースガスクロマトグラフィー（以下、HS-GCとも記す）を用いて分析した。ヘッドスペース、GCの分析条件は以下のとおりである。
　ヘッドスペース装置条件
　　ヘッドスペースサンプラー：G4557A (Agilent Technologies)
　　バイアル内平衡温度：100℃付近の一定温度
　　バイアル内平衡時間：20分間
　　注入ライン温度：150℃
　　キャリアガス：ヘリウム
　　加圧圧力：103 kPa
　　加圧時間：0.01分
　　試料注入量：1.0 mL
　GC-FID測定条件
　　GC：7890Bまたは6850A (Agilent Technologies)
　　検出器：FID
　　カラム：30 m x 0.25 mm, 0.50 μｍ film（USP PHASE G16相当のキャピラリーカラム）
　　カラム温度：約40℃で5分間保持→30℃/分にて昇温→約240℃で5分間保持
　　試料導入部温度：250℃付近の一定温度
　　検出器温度：280℃付近の一定温度
　　キャリアガス：ヘリウム
　　流量：メタノールの保持時間が約4.3分になるように調整
　　スプリット比：1:10
　　メイクアップガス:窒素25 mL/min.
　　バイアル容量：10 mL
　　バイアル撹拌レベル：５
　　分析時間：約16.7分
　＜主留の調製方法＞
　魚油を常法によりエチルエステル化して脂肪酸エチルエステル中のＥＰＡ－Ｅが１６面積％以上である魚油エチルエステルを調整した。当該魚油エチルエステルを、多段式精留装置を用いて、塔頂の圧力２６．７Ｐａ以下、温度１９０℃以下の条件にて連続精留を行い、初留(initial fraction)、主留(main fraction) 、残留(residual fraction)に分画して、主留を得た。ここで、初留は、揮発性が主留より高い画分であり、C20未満の脂肪酸のエチルエステルを主成分とする。主留は、C20脂肪酸のエチルエステルを主成分とし、脂肪酸エチルエステル中のＥＰＡ－Ｅが７０面積％以上である。残留は、揮発性が主留より低い画分であり、C21以上の脂肪酸のエチルエステルを主成分とする。
　主留の調製は、例えば、特開平04-041457、特開平04-128250、特開平05-222392に記載の方法などを参照して行うことができる。
　＜HPLC精製方法＞
　図１に示す工程図に従って、主留から精製ＥＰＡ－Ｅを製造した。すなわち、溶離液タンクの溶離液を用いて、主留タンクの主留をＨＰＬＣにより精製して得られたフラクションをフラクションタンクに収容した。フラクションを溶離液蒸発器により濃縮して得られた中間体ＥＰＡ－Ｅをバッファタンクに収容した。中間体ＥＰＡ－Ｅを薄膜蒸発器によりさらに濃縮して得られた精製ＥＰＡ－Ｅを製品タンクに収容した。主留は、脂肪酸エチルエステル中のＥＰＡ－Ｅが７０面積％以上であり、精製ＥＰＡ－Ｅは、脂肪酸エチルエステル中のＥＰＡ－Ｅが９６面積％以上である。
　本工程図における装置は、溶離液タンクを除き、全て密閉系とした。減圧された溶離液蒸発器、バッファタンク、および薄膜蒸発器以外の主留タンク、フラクションタンク、および製品タンクは、ガスシールユニットおよびブリザー弁で、ヘッドスペースを窒素パージした。
　本明細書において、主留は、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸混合物に含まれる。中間体ＥＰＡ－Ｅおよび精製ＥＰＡ－Ｅは、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物に含まれる。
　溶離液タンクは、温度３８℃～４２℃として、溶離液として用いたメタノールとヘッドスペースの容積比は１１：８９～１３：８７とした。ここで、容積比は「溶離液：ヘッドスペース」である。溶離液タンクは、ベント管（Ｖ）を開放してヘッドスペースを大気で満たすか、または、ベント管（Ｖ）から窒素ブローしてヘッドスペースを窒素パージするかした。
　主留タンクは、温度39.5℃～40.5℃として、主留とヘッドスペースの容積比は5：95～90：10とした。ここで、容積比は「主留：ヘッドスペース」である。主留タンクは窒素パージされており、備え付けたガスシールユニットおよびブリザー弁（Ｇ）により、主留の受入れ時はヘッドスペースの気体を放出し、HPLCへの主留の移送時は窒素ブローして、主留タンクのヘッドスペースを窒素パージした。
　HPLCでは、温度38℃～42℃で、溶離液に溶離液タンクのメタノール（ｂ）を用いて、固定相にODSを用いて、主留タンクから移送された主留（ａ）を精製して、脂肪酸エチルエステル中にＥＰＡ－Ｅ９６面積％以上含むフラクション（ｃ）をフラクションタンクに保存した。
　フラクションタンクは、温度調節せずに温度約40℃から徐々に温度低下した。フラクションとヘッドスペースの容積比は５：９５～６５：３５とした。ここで、容積比は「フラクション：ヘッドスペース」である。フラクションタンクは、窒素パージされており、備え付けたガスシールユニットおよびブリザー弁（Ｇ）により、HPLCからのフラクションの受入れ時はヘッドスペースの気体を放出し、溶離液蒸発器へのフラクションの移送時は窒素ブローして、フラクションタンクのヘッドスペースを窒素パージした。
　保存したフラクション（ｄ）にＤＬ－α－トコフェロールをEPA-Eに対して0.05%量を添加した後に、溶離液蒸発器で、脱メタノールを実施した。溶離液蒸発器での脱メタノールは、微量の窒素ブローしながら絶対圧で真空度を３５．８ｋＰａ～３６．２ｋＰａとして、温度４１℃～４２℃から段階的に上昇して、最終的に温度１３０℃～１３３℃で実施し、残存メタノール量約500ppmの中間体EPA-E（ｅ）としてバッファタンクに保存した。一方、減圧蒸留した後に液化したメタノール（ｆ）は、溶離液タンクに回収した。
　バッファタンクは、絶対圧で真空度を３５．８ｋＰａ～３６．２ｋＰａとして、温度１３０℃～１３３℃とした。中間体EPA-Eとヘッドスペースの容積比は６：９４～９：９１とした。ここで、容積比は「中間体ＥＰＡ－Ｅ：ヘッドスペース」である。一方、減圧蒸留した後に液化したメタノール（ｈ）は、溶離液タンクに回収した。
　保存した中間体ＥＰＡ－Ｅ（ｇ）の更なる脱メタノールを薄膜蒸発器で実施した。薄膜蒸発器での更なる脱メタノールは、絶対圧で真空度を1～20Paとして、温度110℃～127℃で実施し、残存メタノール量5ppm以下とした。これにＤＬ－α－トコフェロールを、ＥＰＡ－Ｅに対して総量０．２％量となるように添加して、精製ＥＰＡ－Ｅ（ｉ）として製品タンクに保存した。一方、減圧蒸留した後に液化した少量のメタノール（ｊ）は、溶離液受器に廃溶剤として抜き出した。
　製品タンクは、温度20℃～22℃として、精製EPA-Eとヘッドスペースの容積比は0：100～81：19とした。ここで、容積比は「精製EPA-E：ヘッドスペース」である。製品タンクは窒素パージされており、備え付けたガスシールユニットおよびブリザー弁（Ｇ）により、精製EPA-Eの受入れ時はヘッドスペースの気体を放出し、精製EPA-Eの移送時は窒素ブローして、製品タンクのヘッドスペースを窒素パージした。
　実施例１　溶離液タンクの酸素濃度による溶離液の溶存酸素量への影響
　実施例１ａでは、窒素ブローによりパージしてヘッドスペース酸素濃度0.00体積％とした溶離液タンクに、減圧蒸留した後に液化して得られたメタノールを滴下し、その時のヘッドスペース酸素濃度と溶離液であるメタノール中の溶存酸素量を測定した。実施例１ｂでは、ヘッドスペース酸素濃度12.50体積％として、その他は実施例１ａと同様にして実施した。
　本実施例において、メタノール中の溶存酸素量の計測温度は２３℃として、溶存酸素計のセンサーをメタノールに入れて測定を開始してから溶存酸素計の数値を読み取るまでの計測時間は15分とした。結果を表1に示す。
　本実施例から、溶離液タンクの窒素パージにより溶離液タンクのヘッドスペース酸素濃度を下げたことが、溶離液中の溶存酸素量の低減に繋がったことが分かる。
 
　実施例２　溶離液タンクの窒素パージの有無による、フラクションタンクの酸素濃度
　実施例２ａ　溶離液タンクの窒素パージあり
　溶離液タンクへの窒素ブローによりパージされた溶離液タンクに、減圧蒸留して得られたメタノールを滴下して溶離液として保存した。当該メタノールをHPLCに通液し、窒素パージしたフラクションタンクに収容した。収容前のフラクションタンクのフラクションであるメタノールとヘッドスペースの容積比は５：９５として、収容後のフラクションタンクの容積比は６５：３５とした。その後、窒素ブローしながらフラクションであるメタノールを移送して収容前の容積比５：９５に戻した。ここで、これらの容積比は「フラクション：ヘッドスペース」である。
　このフラクションの収容と窒素ブローしながら移送するサイクルを１０回繰り返した際のフラクションタンクの酸素濃度推移を測定した。結果を表２に示す。
　実施例２ｂ　溶離液タンクの窒素パージなし
　窒素ブローせずに大気によりヘッドスペースを満たされた溶離液タンクに、減圧蒸留して得られたメタノールを滴下して溶離液として保存した。当該メタノールをHPLCに通液し、窒素パージしたフラクションタンクに収容した。本実施例において、溶離液タンクの窒素パージ以外の条件は実施例２ａと同様にした。結果を表２に示す。
　本実施例から、溶離液タンクの窒素パージによりフラクションタンクのヘッドスペース酸素濃度が低減できることが分かる。窒素パージしない場合、収容の際にメタノールと一緒に酸素が入り込むこと、収容と移送のサイクルを５回以上繰り返すと酸素濃度の推移がほぼ一定になることが分かる。
　実施例３　溶離液タンクのヘッドスペース酸素濃度とバッファタンクの中間体EPA-E色b値
　溶離液タンクの窒素パージの有無による、HPLC精製および溶離液蒸発したバッファタンクにおける中間体EPA-Eの色b値の変化を確認した。
　窒素パージした主留タンクに保存した主留を、溶離液として溶離液タンクに保存したメタノールを用いてHPLCで精製し、脂肪酸組成におけるエイコサペンタエン酸エチルエステルの割合が96面積％以上となるフラクションを窒素パージしたフラクションタンクに保存した。保存したフラクションにＤＬ－α－トコフェロールをEPA-Eに対して0.05%量添加した後に、溶離液蒸発器で脱メタノールしてタンクに、残存メタノール量約500ppmの中間体EPA-Eとして保存した。
　本実施例において、フラクションとヘッドスペースの容積比は５：９５～６５：３５として、実施例２と同様に収容と移送のサイクルを繰り返した。ここで、容積比は「フラクション：ヘッドスペース」である。
　フラクションタンクの収容と移送のサイクルを５回以上繰り返した後の、溶離液タンクのヘッドスペース酸素濃度およびバッファタンクの中間体EPA-Eの色b値を測定した。結果を表３に示す。
　本実施例から、窒素パージした溶離液タンクの溶離液を用いることで、中間体EPA-Eの色差（色ｂ値）が低減できることが分かる。
　実施例４　溶離液タンクの窒素パージと、精製EPA-Eの物性値
　溶離液タンクの窒素パージの有無による、HPLC精製、溶離液蒸発および薄膜蒸発した製品タンクにおける精製EPA-Eの色b値、アニシジン価、酸価への影響を確認した。
　実施例３と同様の手順でバッファタンクに中間体EPA-Eを保存した。この中間体EPA-Eを薄膜蒸発器で更なる脱メタノールした後に、ＤＬ－α－トコフェロールを添加して、EPA-Eに対して総量０．２％量となるように調整して、窒素パージした製品タンクに、精製EPA-Eとして保存した。
　溶離液タンクの窒素パージの有無による精製EPA-Eの物性値や脂肪酸組成を測定した結果を表４に示す。
　本実施例から、窒素パージした溶離液を用いることで、精製EPA-Eの色ｂ値、アニシジン価が低減できることが分かる。一方、酸価、メタノール残存量や異性体の割合は、ほとんど差がなかった。
 
Ｖ：　ベント管
　Ｇ：　ガスシールユニットおよびブリザー弁
　ａ：　主留
　ｂ：　溶離液（メタノール）
　ｃ：　フラクション
　ｄ：　保存したフラクション
　ｅ：　中間体ＥＰＡ－Ｅ
　ｆ：　減圧蒸留した後に液化したメタノール
　ｇ：　保存した中間体ＥＰＡ－Ｅ
　ｈ：　減圧蒸留した後に液化したメタノール
　ｉ：　精製ＥＰＡ－Ｅ
　ｊ：　減圧蒸留した後に液化した少量のメタノール

Claims (35)

  1. 　高度不飽和脂肪酸（以下、ＰＵＦＡと記す）またはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物の製造方法であって、
    （１）容器Ａへの溶媒の収容を行って、容器Ａ内で不活性ガス雰囲気下で溶離液を得ること、
    （２）当該溶離液を移動相として使用するクロマトグラフィーにより、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸混合物の精製を行って、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含むフラクションを得ること、および
    （３）当該ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含むフラクションの濃縮を行って、ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物を得ること
    を含む製造方法。
  2. 　前記フラクションの濃縮が、前記ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含むフラクションに含まれる溶離液を、減圧および／または加熱して、蒸留により溶媒として回収することを含む、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記溶媒が、蒸留により得られた溶媒を含む、請求項１または２に記載の製造方法。
  4. 　前記溶媒が、前記フラクションの濃縮でＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含むフラクションから回収した溶媒を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
  5. 　前記容器Ａ内の溶離液の溶存酸素濃度が２０ｍｇ／Ｌ以下、１５ｍｇ／Ｌ以下、または１１ｍｇ／Ｌ以下である、請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
  6. 　前記容器Ａのヘッドスペース酸素濃度が１０体積％以下、５体積％以下、４体積％以下、３体積％以下、２体積％以下、１体積％以下、０．５体積％以下、または、０．１％以下である、請求項１～５のいずれか１項に記載の製造方法。
  7. 　前記ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含むフラクションが、容器Ｃ内に不活性ガス雰囲気下で収容される、請求項１～６のいずれか１項に記載の製造方法。
  8. 　前記ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含むフラクションが、容器Ｃ内に不活性ガス雰囲気下で収容され、前記フラクション収容後の容器Ｃのヘッドスペースの酸素濃度が１．５体積％以下、１．０体積％以下、０．７体積％以下、０．５体積％以下、０．３体積％以下、または、０．１体積％以下である、請求項１～７のいずれか１項に記載の製造方法。
  9. 　前記脂肪酸混合物の精製の前に、前記ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸混合物が、容器Ｂ内に不活性ガス雰囲気下で収容される、請求項１～８のいずれか１項に記載の製造方法。
  10. 　前記容器Ｂのヘッドスペース酸素濃度が１．５体積％以下、１．０体積％以下、０．７体積％以下、０．５体積％以下、０．３体積％以下、または、０．１体積％以下である、請求項９に記載の製造方法。
  11. 　前記ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物が、容器Ｄ内に不活性ガス雰囲気下で収容される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の製造方法。
  12. 　前記容器Ｄのヘッドスペース酸素濃度が０．７体積％以下、０．５体積％以下、０．３体積％以下、または０．１体積％以下である、請求項１１に記載の製造方法。
  13. 　前記容器Ａ、容器Ｂ、容器Ｃ、および容器Ｄ内の不活性ガスが、それぞれ独立して、窒素、アルゴン、または炭酸ガスである、請求項１～１２のいずれか１項に記載の製造方法。
  14. 　前記容器Ａ、容器Ｂ、容器Ｃ、および容器Ｄ内の不活性ガスが、窒素である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の製造方法。
  15. 　前記ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物中の全脂肪酸またはそのエステル誘導体中におけるＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体の割合が、９７％以上、９６％以上、９０％以上、８０％以上、７０％以上、または、５０％以上である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の製造方法。
  16. 　前記ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物の色ｂ値が、３．２以下、３以下、２．８以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、または、０．７以下である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の製造方法。
  17. 　前記ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物のアニシジン価が、１５以下、１０以下、５以下、１以下、０．７以下、０．５以下、０．３以下、または、０．２５以下である、請求項１～１６のいずれかに記載の製造方法。
  18. 　前記ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物の残存溶離液量が１００ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、１ｐｐｍ以下、０．５ｐｐｍ以下、または、０．１６ｐｐｍ以下である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の製造方法。
  19. 　前記フラクションの濃縮の加熱温度が、最高温度１９０℃以下、１６０℃以下、１４０℃以下、１３５℃以下、１３０℃以下、１２０℃以下、もしくは１００℃以下、および／または、４０℃以上、６０℃以上、８０℃以上、１００℃以上、１２０℃以上、１３０℃以上、１３５℃以上、１４０℃以上、もしくは１６０℃以上である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の製造方法。
  20. 　前記フラクションの濃縮における減圧時の最低圧力が１００Ｐａ以下、５０Ｐａ以下、２０Ｐａ以下、１０Ｐａ以下、５Ｐａ以下、２Ｐａ以下、もしくは１Ｐａ以下、および／または、０．１Ｐａ以上、０．２Ｐａ以上、０．５Ｐａ以上、１Ｐａ以上、２Ｐａ以上、５Ｐａ以上、もしくは１０Ｐａ以上である、請求項１から１９のいずれか１項に記載の製造方法。
  21. 　前記溶媒および溶離液が、メタノール、エタノール、２ープロパノール、アセトニトリル、アセトン、ヘキサンから選択される１種、もしくは、２種以上の混合液、または、これらから選択された１種以上と水との混合液である、請求項１～２０のいずれか１項に記載の製造方法。
  22. 　前記脂肪酸混合物の精製が、固定相としてシリカゲル系の吸着剤、またはポリマー系の吸着剤を使用する、請求項１～２１のいずれか１項に記載の製造方法。
  23. 　前記脂肪酸混合物の精製が、固定相として逆相系の吸着剤を使用する、請求項１～２２のいずれか１項に記載の製造方法。
  24. 　前記フラクションの濃縮が、１つまたは複数のエバポレーターを用いるものであり、当該エバポレーターの受液器の少なくとも１つの内容積が１０Ｌ以上、２０Ｌ以上、５０Ｌ以上、１００Ｌ以上、５００Ｌ以上、もしくは１０００Ｌ以上、および／または、５０００Ｌ以下、２０００Ｌ以下、１０００Ｌ以下、もしくは５００Ｌ以下である、請求項１～２３のいずれか１項に記載の製造方法。
  25. 　前記フラクションの濃縮が、１つまたは複数のエバポレーターを用いるものであり、当該フラクションの濃縮時に当該エバポレーターの少なくとも１つを不活性ガスブローしている、請求項１～２４のいずれか１項に記載の製造方法。
  26. 　前記ＰＵＦＡがＥＰＡ、ＤＨＡ、ｎ－３　ＤＰＡ、ＤＧＬＡ、および、ＡＲＡから選択される１種、または、２種以上のこれらの組み合わせである、請求項１～２５のいずれか１項に記載の製造方法。
  27. 　前記ＰＵＦＡのエステル誘導体が、ＰＵＦＡのＣ１～Ｃ６アルキルエステル誘導体である、請求項１～２６のいずれか１項に記載の製造方法。
  28. 　前記ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体が、ＥＰＡエチルエステル、ＤＨＡエチルエステル、またはこれらの組み合わせである、請求項１～２７のいずれか１項に記載の製造方法。
  29. 　請求項１～２８のいずれか１項に記載の製造方法により製造したＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物。
  30. 　高度不飽和脂肪酸（以下、ＰＵＦＡと記す）またはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物であって、当該脂肪酸組成物中の全脂肪酸またはそのエステル誘導体中におけるＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体の割合が、９７％以上、９６％以上、９０％以上、８０％以上、７０％以上、または、５０％以上であって、当該脂肪酸組成物の色ｂ値が、３．２以下、３以下、２．８以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、または、０．７以下であるＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物。
  31. 　前記ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物のアニシジン価が、１５以下、１０以下、５以下、１以下、０．７以下、０．５以下、０．３以下、または、０．２５以下である、請求項３０に記載の脂肪酸組成物。
  32. 　前記ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体を含む脂肪酸組成物の残存溶離液量が１００ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下、５ｐｐｍ以下、１ｐｐｍ以下、０．５ｐｐｍ以下、または、０．１６ｐｐｍ以下である、請求項３０または３１に記載の脂肪酸組成物。
  33. 　前記ＰＵＦＡがＥＰＡ、ＤＨＡ、ｎ－３　ＤＰＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡから選択される１種、または、２種以上のこれらの組み合わせである、請求項３０～３２のいずれか１項に記載の脂肪酸組成物。
  34. 　前記ＰＵＦＡのエステル誘導体が、ＰＵＦＡのＣ１～Ｃ６アルキルエステル誘導体である、請求項３０～３３のいずれか１項に記載の脂肪酸組成物。
  35. 　前記ＰＵＦＡまたはそのエステル誘導体が、ＥＰＡのエチルエステル、または、ＤＨＡのエチルエステルである、請求項３０～３４のいずれか１項に記載の脂肪酸組成物。 
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