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WO2025003074A1 - Fabrication de kits d'amplification en chaine par polymerase optimisant une phase d'hybridation de l'amplification - Google Patents

Fabrication de kits d'amplification en chaine par polymerase optimisant une phase d'hybridation de l'amplification Download PDF

Info

Publication number
WO2025003074A1
WO2025003074A1 PCT/EP2024/067684 EP2024067684W WO2025003074A1 WO 2025003074 A1 WO2025003074 A1 WO 2025003074A1 EP 2024067684 W EP2024067684 W EP 2024067684W WO 2025003074 A1 WO2025003074 A1 WO 2025003074A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
molecules
hybridization
matrix
concentration
simulation
Prior art date
Application number
PCT/EP2024/067684
Other languages
English (en)
Inventor
Laurent Drazek
François PAILLIER
Céline VIDAL
Original Assignee
Biomerieux
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux filed Critical Biomerieux
Publication of WO2025003074A1 publication Critical patent/WO2025003074A1/fr

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B5/00—ICT specially adapted for modelling or simulations in systems biology, e.g. gene-regulatory networks, protein interaction networks or metabolic networks
    • G16B5/30—Dynamic-time models
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G16B25/20—Polymerase chain reaction [PCR]; Primer or probe design; Probe optimisation

Definitions

  • a polymerase chain reaction also called a polymerase chain reaction, and abbreviated "PCR" is a reaction allowing the multiplication of nucleic acid molecules (for example DNA or RNA). At each reaction cycle, each nucleic acid molecule is duplicated.
  • PCR amplification is generally carried out in a PCR kit applying different temperatures in order to trigger the successive steps of the amplification cycles.
  • the PCR kit initially contains primers making it possible to initiate the amplification.
  • PCR kit The success and speed of PCR amplification depend on many parameters of the PCR kit, including the durations and temperatures of the different stages of the reaction, the sequences of the primers initially present in the kit, their concentration, the concentrations of monovalent and divalent salts, oligonucleotides in solution, the length of the expected amplicons (shorter amplicons also allowing shorter cycle times), etc.
  • the designer performs the following steps: a) identifies for each microorganism a list of specific potential targets (i.e.
  • a method for manufacturing a kit for the characterization of microorganisms included in a sample by using a polymerase chain reaction, said kit comprising a plurality of validated primers, method in which the plurality of primers and the concentration vector for said plurality of primers are obtained by a simulation method according to one of the embodiments of the invention.
  • This makes it possible to manufacture a device reproducing the reaction as simulated. The device thus produced will therefore allow the multiplication of targets as previously simulated.
  • the differential equation integrates mass conservation equations of the form:
  • ⁇ ⁇ represents the time elapsed since the start of the hybridization phase
  • the notations ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ respectively denote the concentrations of two nucleic acid molecules in the form of single strands of indices i and j in the vector ⁇ of concentrations of a plurality of nucleic acid molecules
  • the notation ⁇ ⁇ ⁇ denotes the concentration of a duplex formed by the hybridization of the pair of nucleic acid molecules in the form of single strands of indices x and y in the vector ⁇ of concentrations of a plurality of nucleic acid molecules
  • matrix differential equation is of the following form: in which: H is the concentration matrix of the duplexes; T0 is the initial value for the cycle of the concentration vector of the plurality of molecules; Kon is the association matrix; Koff is the dissociation matrix; the operator ⁇ ⁇ , ⁇ represents a two-dimensional matrix comprising i rows and j columns whose elements are all equal to 1; the operator "diag()" denotes a operator taking as parameter a square matrix and extracting from this square matrix a vector having as dimension the number of rows or columns of the square matrix and containing all the elements of the diagonal of the square matrix.
  • the modification of the plurality of primers comprises: the identification of a target to be favored according to the results of the simulation of the polymerase chain reaction; the identification, from the association matrix or the dissociation matrix, of a nucleic acid molecule in the form of a single strand forming a pair with a primer associated with said target; the carrying out at least one modification of the chosen polymerase chain reaction among: a decrease, in the initial concentration vector, of the initial concentration of said nucleic acid molecule in the form of a single strand forming a pair with the primer associated with said target; a modification of the salt concentration; a modification of the hybridization temperature for at least one cycle; a modification of the hybridization duration of at least one cycle.
  • the sample is taken from an inanimate object, said method comprising the choice of an antimicrobial according to the characterization of the microorganisms present in said sample, and the application of said antimicrobial to said inanimate object.
  • a method for numerical simulation of a polymerase chain reaction of at least one target is proposed, said method comprising the simulation of a plurality of successive cycles of the amplification, each cycle comprising, sequentially: a hybridization phase between the at least one target and a plurality of primers; an elongation phase; then a denaturation phase; wherein, for each cycle: the hybridization phase comprises: obtaining an initial value for the cycle of a vector of concentrations of a plurality of single-stranded nucleic acid molecules comprising the at least one target and the plurality of primers; calculating a matrix of concentrations of partial duplexes formed by the hybridization of the plurality of single-stranded nucleic acid molecules, each element of said matrix representing the concentration of the duplexes
  • a kit for polymerase chain reaction manufactured by a method as defined herein.
  • a computer program comprising instructions for implementing all or part of a method as defined herein when this program is executed by a processor.
  • a non-transitory, computer-readable recording medium on which such a program is recorded.
  • At least one duplex results from the pairing between two primers;
  • the elongation phase simulates the concentration of each duplex resulting from the pairing between two primers in a single concentration of elongated duplex resulting from the pairing between two primers;
  • the coefficients of the denaturation tensor are defined so as to distribute each concentration of elongated duplex resulting from the pairing between two primers into nucleic acid molecules in the form of single strands corresponding to an elongation of the duplex resulting from the pairing between the two primers in both directions.
  • the concentrations of elongated duplexes comprise a concentration of an elongated virtual duplex equal to the sum of the concentrations of the elongated duplexes formed by the elongation in each of the two directions of the duplexes formed by the hybridization of the two primers; the coefficients of the denaturation tensor of the elongated duplexes corresponding to the distribution of the concentration of the elongated virtual duplex towards each of the two primers, and each of the two nucleic acids in the form of single strands resulting from the elongation in one of the two directions are all equal to 0.5.
  • concentration of an elongated virtual duplex is meant a concentration of an elongated duplex not corresponding to a real molecule, but to several elongated duplexes resulting from the hybridization of the same primer on the same nucleic acid molecule in single-strand form in several distinct locations, then from the elongation of the duplexes thus formed.
  • concentration of the virtual elongated duplex is then equal to the sum of the concentrations of the real elongated duplexes created by the hybridization reactions of the primer with the nucleic acid molecule in single-strand form in the different positions, then the elongation of the duplexes thus formed.
  • the elongation phase comprises: obtaining the concentrations of the elongated duplexes by multiplying the concentrations of the duplexes by elongation coefficients.
  • the term “elongation coefficient” means the fraction, between 0 and 1, of the molecules of a given duplex that are elongated during an elongation phase. [0077] This makes it possible to take into account each possible difference in the elongation process of the different duplexes.
  • the elongation phase further comprises updating the duplex concentration vector, representing the concentration of the non-elongated duplexes at the end of the elongation phase;
  • the denaturation phase further comprises multiplying said duplex concentration vector by a denaturation tensor of the non-elongated duplexes to update the initial value for the following cycle of the concentration vector of the plurality of nucleic acid molecules in the form of single strands.
  • the method comprises a subsequent step of validating or modifying the plurality of primers and the initial value of the concentration vector for said plurality of primers in the first cycle of the reaction by comparing a value representative of the kinetics of a reaction to a threshold.
  • the sample is taken from an animal or a human being, said method comprising the choice of an antimicrobial according to the characterization of the microorganisms present in said sample, and the administration of said antimicrobial to said animal or human being.
  • the sample is taken from an inanimate object, said method comprising the choice of an antimicrobial according to the characterization of the microorganisms present in said sample, and the application of said antimicrobial to said inanimate object.
  • FIG.7 shows an example of hybridization, elongation and denaturation reactions over 3 successive PCR amplification cycles in a set of embodiments of the invention.
  • Fig.8 [0096] [Fig.8] shows an example of a method according to a set of embodiments of the invention integrating a validation or modification of the PCR amplification parameters.
  • Fig.9 [0097] [Fig.9] shows an example of a method according to a set of embodiments of the invention integrating a validation or modification of the PCR amplification parameters, and a manufacture of a validated PCR amplification kit.
  • Fig. 10 [0098] [Fig.
  • FIG. 10 shows an example of a method for characterizing a microorganism using a PCR amplification kit manufactured according to a set of embodiments of the invention.
  • Fig. 11 [0099] [Fig. 11] shows an example of visualization of the kinetics of several PCR reactions according to a set of embodiments of the invention.
  • Fig. 12 [0100] [Fig. 12] shows an example of visualization of the kinetics of several PCR reactions under two distinct experimental conditions according to a set of embodiments of the invention. Description of the embodiments [0101] Reference is now made to FIG. 1. [0102] FIG.
  • kits 1 represent an example of a K1 kit for polymerase chain reaction for the manufacture of which the invention can be implemented, for example a kit used for the FilmArray and Spotfire platforms manufactured and marketed by the Applicant. Such a kit is for example described in the document US 8,394,608 or US 9932634 incorporated by reference.
  • the kit K1 is part of a test equipment Tst1 intended to test the presence of one or more microorganisms, for example by one or more viruses, bacteria, fungi and antibiotic resistance genes.
  • the test equipment Tst1 comprises a swab Ecv1 allowing a nasal sample to be taken from a patient.
  • the sample can then be provided as input to the K1 kit in order to perform a PCR amplification, in order to amplify one or more nucleic acids representative of the microorganism(s) whose presence is sought, for example as described in the aforementioned documents.
  • a PCR amplification in order to amplify one or more nucleic acids representative of the microorganism(s) whose presence is sought, for example as described in the aforementioned documents.
  • the sampling may be carried out on a human being, an animal or an inanimate object, and may result in the characterization of one or more microorganisms.
  • the characterization of one or more microorganisms may allow the choice of an antimicrobial, with a view to its administration to a human being or an animal, or its application to the inanimate object.
  • the invention applies to the step of PCR amplification of a targeted part of genomes before their complete sequencing, for example an amplification of the r16S portion in the context of microbial metagenomic identification.
  • Figure 2 shows an example of a polymerase chain reaction that can be simulated according to a set of embodiments.
  • the polymerase chain reaction comprises several successive cycles Cyc21, Cyc22, Cyc23...Cyc2n. In order to improve the readability of the figure, only the first cycle Cyc21 will be detailed.
  • the PCR2 reaction is carried out in a PCR kit, for example in the K1 kit.
  • the PCR kit initially contains: - nucleic acids of one or more sequences to be amplified, or “target”, for example the Cib2 target shown in Figure 2.
  • the nucleic acids of the sequences to be amplified may initially come from a sample, for example via the Ecv1 swab; - dNTP2 nucleotides; - PolyM2 polymerase; - AM2 primers.
  • Each PCR amplification cycle comprises: - a denaturation phase, denoted Denat21 for the Cyc21 cycle, during which the nucleic acids in the form of double strands are separated into two nucleic acids in the form of single strands.
  • Denat21 a denaturation phase
  • a target Cib2 is initially present in the form of a double-stranded nucleic acid.
  • the denaturation phase it is separated into two nucleic acids in the form of single strands Nuc21 and Nuc22; - a hybridization phase, denoted Hybr21 for the Cyc21 cycle, during which primers hybridize to the nucleic acids in the form of single strands.
  • the primers AM21 and AM22 respectively hybridize with the nucleic acids in the form of single strands Nuc21 and Nuc22; - an elongation phase, noted Elong21 for cycle 21, during which nucleotides complete the primers to form nucleic acids in the form of double strands identical to the initial target, called amplicons, Amp21 and Amp22 in the case of the Elong21 phase.
  • a single Cib2 target has made it possible to generate two identical amplicons Amp21 and Amp22, which can themselves be duplicated in the following cycle.
  • the amplicons are thus duplicated: a single Cib2 target results in the generation of two amplicons at the end of the 1 e Cyc21 cycle, four amplicons at the end of 2 e Cyc22 cycle, eight amplicons at the end of 3 e Cyc23 cycle, etc.
  • the amplification shown in Figure 2 is provided as a non-limiting example only of an amplification that can be simulated by the invention.
  • Graph Grph3 more precisely represents the evolution of the temperature as a function of time, for an example of two successive PCR amplification cycles Cyc31 and Cyc32. Indeed, the different phases of PCR amplification are activated by temperature variations in the amplification kit. In this example, the temperature profile is identical between the cycles, and will be detailed for the cyc31 cycle. [0121] Generally speaking, the temperature changes as follows during a PCR amplification cycle: - it is initially at a first temperature during the hybridization phase, simultaneous with the elongation phase; - then increases rapidly to reach a second, higher temperature, triggering the denaturation phase, before returning to the level of the first temperature for the hybridization phase of the following cycle.
  • the hybridization and elongation phases Hybr31 are activated by a first temperature of 60° for a duration Thybr; - the denaturation phase Denat31 is activated by a higher temperature, in this example, of 96°.
  • the times and temperatures shown in Figure 3 are provided as a non-limiting example only, and the invention is applicable to PCR amplifications carried out for very different times and temperatures. If in the example of Figure 3 the hybridization and elongation phases are simultaneous, in other PCR amplification reactions, three separate temperatures are used to trigger the hybridization, elongation and denaturation phases respectively. The temperatures and times of the different phases influence the amplification reaction.
  • the amplification reaction(s) are therefore impacted by numerous parameters such as: - the temperatures and times of each phase of the reaction (which may be fixed or vary according to the cycles); - the choice and concentrations of the primers; - the concentrations of monovalent and divalent salts; - the length of the expected amplicons; - etc. [0125] These different factors can also promote unexpected reactions such as for example: - the formation of primer dimers, when two primers hybridize to each other; - multi-hybridization reactions when primers hybridize not only to one end of a nucleic acid in the form of single strands, but also to other locations, for example in the middle of a strand.
  • the amplification parameters can therefore facilitate, or on the contrary slow down a desired amplification, called a specific reaction, or even prevent the proper development of a reaction, when unwanted/unexpected reactions, called non-specific reactions, hinder it.
  • One of the objectives of the simulation of a PCR amplification reaction is therefore to model as accurately as possible the amplification reaction according to the environmental parameters of the reaction, in order to validate, or on the contrary to modify the design of a kit (i.e. the parameter values used to promote a given amplification reaction – e.g.
  • the simulation comprises a plurality of successive amplification cycles, each cycle successively comprising a hybridization phase S41, an elongation phase S42 and a denaturation phase S43.
  • the simulation can be carried out for a limited number of cycles. For example, each cycle can be identified by a cycle index ncyc, incremented during a step S45 between each cycle.
  • a stopping criterion can be verified.
  • the simulation can be carried out for a predefined number of cycles NCyc.
  • the concentrations of the amplicons can be compared between two cycles, and the simulation stopped when a minimum number of cycles is reached, and the difference between the concentrations of the amplicons at the end of two successive cycles is lower than a threshold predefined.
  • this criterion consists in detecting the cycle from which the reaction is considered to be finished; - the simulation can be stopped as soon as the concentration of a given amplicon is greater than a threshold, for example a detectability threshold of the amplicon; - etc.
  • Figure 4 represents an example where the stopping criterion is the achievement of a number of cycles NCyc. However, this example is provided as a non-limiting example only. As indicated above, one or more different criteria can be used to detect the end of the simulation. [0134] In the remainder of the description, several simulation examples will be described, using certain notations introduced below.
  • the concentrations of the molecules of interest will be noted in a vector noted ⁇ represented below: Equation 1 [0136]
  • the elements ⁇ ⁇ ⁇ 1 , ... ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ represent the concentrations of possible amplicons (specific and non-specific) produced during PCR amplification. It should be noted here that, since the targets and amplicons correspond to the same molecule, these values correspond to the sum of the concentrations of the targets and amplicons for a given target.
  • the elements ⁇ ⁇ 1 , ... ⁇ ⁇ ⁇ represent the concentrations of the possible primers.
  • the units of the vector elements can be mol.L -1 .
  • the plurality of molecules whose concentrations are noted in the vector ⁇ can be obtained in different ways, and includes in particular the concentration of the amplicons, and the plurality of primers present in the simulated kit.
  • the plurality of molecules whose concentrations are noted in the vector ⁇ can come from a list of molecules defined by an expert user.
  • the plurality of molecules whose concentration is noted in the vector ⁇ is determined by means of an initial simulation of a limited number of cycles.
  • the initial simulation has the sole purpose of determining the molecules present in the amplification kit at the end of the limited number of cycles, regardless of their concentration.
  • the plurality of molecules can be initialized like the molecules initially present in the polymerase chain reaction (in particular amplicons and primers), then the initial simulation can comprise the simulation of a plurality of successive cycles of the following steps: - obtaining the hybridization reactions of the molecules forming each pair of molecules among said plurality of molecules having an affinity lower than a threshold (or higher in absolute value, the affinities being negative values).
  • this step consists in identifying, from the molecules initially present in the cycle of the initial simulation, the pairs of molecules having an affinity lower than a threshold (or higher in absolute value), that is to say the pairs of molecules which can be considered to react together; - simulation of a hybridization phase implementing said hybridization reactions.
  • This initial simulation hybridization phase consists solely of identifying the duplexes formed by the identified hybridization reactions; - simulation of an elongation phase.
  • This initial simulation hybridization phase consists solely of identifying the elongated duplexes obtained from the duplexes identified in the previous step; - simulation of a denaturation phase.
  • This initial simulation of the denaturation phase consists of identifying the molecules obtained by the denaturation of the duplexes, and elongated duplexes, obtained in the two previous steps; - an addition to said plurality of molecules of the additional molecules obtained at the end of the hybridization, elongation and denaturation phases.
  • This step consists of adding to the plurality of molecules the molecules which are obtained at the end of a cycle and which were not yet present therein. [0142]
  • new molecules resulting from the reactions of the previous cycle can be added to the plurality of molecules already identified, these new molecules themselves being capable of generating new reactions.
  • the number of cycles of the initial simulation can be defined in different ways. For example: - it can be a predefined number of initial simulation cycles; - the number of molecules added at the end of each cycle can be counted, and the initial simulation can be stopped when the number of molecules added at the end of a given cycle is zero or low, for example if the number of molecules added is less than a given threshold. - Etc. [0144] The inventors have found that the number of initial simulation cycles can be between 3 and 7, and for example equal to 5, a sufficient number to obtain a definitive list of molecules having a significant impact on the results of the PCR. [0145] This provides a good compromise between the number of molecules added and their importance.
  • molecules added after the 3 e , 5 e or 7 e cycle can be considered as not likely to give rise to significant reactions.
  • a simulation over a limited number of cycles is sufficient, because the molecules that would only appear after a few cycles would not be likely to generate significant reactions, compared to reactions that have already started for several cycles. Indeed, their very low concentration compared to the molecules already present with which they are in competition in the mixture does not allow them to multiply significantly.
  • FIG. 5 represents an example of a hybridization phase in a set of embodiments of the invention.
  • the hybridization phase S41 for a given cycle comprises a first sub-step S411 of obtaining an initial value ⁇ 0 for the cycle of a vector of concentrations of a plurality of nucleic acid molecules in the form of single strands comprising the plurality of amplicons and the plurality of primers.
  • the vector of concentrations may for example be the vector ⁇ mentioned above.
  • the initial value ⁇ 0 of the vector can for example correspond to: - the initial concentrations of the molecules before the start of the amplification reaction, if the simulated cycle is the first cycle; and 0 for the molecules appearing in the following cycles - the concentrations of the molecules at the end of the previous cycle, if the cycle is not the first cycle.
  • the simulation of the hybridization phase then aims to model the hybridization reactions taking place during the cycle.
  • Hybridization is governed by the following equilibrium relationships between each pair of molecules ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ likely to hybridize: Equation 2 [0153] It should be noted here that such an equation must therefore be established by taking into account for each possible hybridization reaction between a pair of molecules of indices i and j (i and j can be equal), depending on the molecules present in the vector ⁇ .
  • Equation 3 [0155]
  • - the notations ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ respectively denote the concentrations of a pair of nucleic acid molecules in the form of single strands with indices i and j in the vector ⁇ involved in a given hybridization reaction
  • - the notation ⁇ ⁇ ⁇ denotes the concentration of a duplex formed by the hybridization of the pair of nucleic acid molecules in the form of single strands of indices i and j in the vector ⁇
  • - the notations ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ denote respectively the association and dissociation constants of the hybridization reaction of the pair of nucleic acid molecules in the form of single strands of indices i and j in the vector ⁇ .
  • the predefined threshold may be identical for all reactions, or chosen from different thresholds depending on the cases.
  • the threshold value may be chosen from at least two predefined threshold values, the lowest threshold value being reserved for pairs of molecules comprising a matched amplicon and primer.
  • the threshold of variation of free enthalpy above which a hybridization reaction is not taken into account in the simulation is lower (closer to 0) for hybridization reactions between an amplicon and a primer than for the others (and therefore also lower in absolute value, the thresholds of variation of free enthalpy being negative).
  • the differential equations integrate mass conservation equations of the following form: Equation 5 [0162] In which: - ⁇ ⁇ represents the time elapsed since the start of the hybridization phase; - the notations ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ respectively denote the concentrations of two nucleic acid molecules in the form of single strands of indices i and j in the vector ⁇ of concentrations of a plurality of nucleic acid molecules; - the notation ⁇ ⁇ ⁇ denotes the concentration of a duplex formed by the hybridization of the pair of nucleic acid molecules in the form of single strands of indices x
  • Equation 6 In order to solve the system of differential equations, one of the principles of the simulation of the hybridization phase as represented in FIG. 5 is to represent these equations in the form of a matrix differential equation. [0168] For this purpose, in the example of FIG.
  • the simulation of the hybridization phase S41 comprises a sub-second step S412 of initializing a matrix of concentrations ⁇ , or ⁇ of the duplexes formed by the hybridization of the plurality of nucleic acid molecules in the form of single strands.
  • the matrix may be an N x N matrix (N being the length of the vector ⁇ ) formed in the following manner: - each row and each column corresponds to a nucleic acid molecule; - each cell includes the concentration of the duplex formed by the hybridization of the pair of nucleic acid molecules of the row and column to which the cell belongs.
  • the hybridization phase S41 for a given cycle then comprises a third sub-step S413 of calculating, by successive time steps, the evolution of the concentration matrix during the hybridization phase, by applying to the concentration matrix a matrix differential equation representing the kinetics of formation of said duplexes as a function of the concentrations of the plurality of nucleic acid molecules in the form of single strands.
  • the calculation of the evolution of the matrix can for example be carried out in the following manner: - the calculation is carried out for a number of time steps Npdt corresponding to the duration of the hybridization phase.
  • a time step can for example have a duration of between 1 and 10 milliseconds.
  • a time step can for example be chosen to find a compromise between convergence of the calculation, calculation speed and precision of the result; - a time step index npdt is initialized to 1; - at each time step, the sub-step S413 of calculating the evolution of the concentration matrix is performed; - at the end of the calculation, a sub-step S414 verifies that the index of the time step npdt is indeed less than the number of time steps Npdt; - if the index of the time step npdt is less than the number of time steps Npdt, the index of the time step npdt is incremented in sub-step S412, then a new iteration of the sub-step S413 of calculating the evolution of the concentration matrix is performed; - when the index of the time step npdt is equal to the number of time steps Npdt, the simulation of the hybridization phase is finished, and the simulation of the elongation phase S42 is started.
  • the simulation of the hybridization phase can be done by the simulation of Npdt successive time steps of the hybridization reactions, each time step comprising the calculation of the matrix differential equation on the basis of the concentrations of the molecules in the vector ⁇ at the end of the previous time step.
  • This example of a loop of successive calculations is provided as a non-limiting example only of a loop for calculating the hybridization phase. More generally, any calculation loop making it possible to simulate the hybridization phase according to the desired number of time steps can be used within the scope of the invention.
  • the time step index can be initialized to 0 and the exit condition of the loop at step S414 adapted, etc.
  • the matrix differential equation is parameterized by at least one association matrix comprising the association constants associated with each duplex and at least one dissociation matrix comprising the dissociation constants associated with each duplex.
  • the association matrices thus contain all the association coefficients involved in equations 3 and 5.
  • the association and dissociation coefficients can be integrated into the association and dissociation matrices according to the same principle as the concentrations in the matrix ⁇ (e.g.
  • the association and dissociation matrices are square matrices in which each row and each column correspond to molecules, each cell of the association matrix(es) includes the association constant between the molecules of the row and the column towards a partial duplex, and each cell of the dissociation matrix includes the dissociation constant associated with the dissociation reaction of the duplex towards the pair of molecules associated with the row and the column).
  • the association and dissociation matrices can therefore be written respectively: Equation 8 For the association matrix, and: Equation 9 For the dissociation matrix.
  • the units of the association constants can be m 3 .mol -1 .s -1 (or L.mol -1 .s -1 ), while the units of dissociation constants can be s -1 .
  • the association and dissociation constants are therefore only integrated for the reactions considered to be sufficiently important, i.e. the reactions which will have the greatest impact on the simulation.
  • the values of the association and dissociation constants in the matrices will be equal to 0 for less important reactions, for example if the variation of free enthalpy ( ⁇ G) associated with the hybridization reaction of the molecules forming the pair is greater than a given threshold (or lower in absolute value).
  • the threshold for taking into account a hybridization reaction, and therefore integrating the association and dissociation constants into the matrices may be identical for all reactions, or different depending on whether the reaction is an amplicon-primer hybridization reaction or another hybridization reaction (primer-primer for example).
  • the evolution of the duplex concentration matrix can therefore, thanks to the association and dissociation matrices, be written in the form of a matrix differential equation, and sub-step S413 can thus consist of solving the matrix differential equation for a given time step.
  • Equation 10 [0186]
  • - H is the concentration matrix of the duplexes
  • - T0 is the initial value for the cycle of the concentration vector of the plurality of molecules
  • - Kon is the association matrix
  • - Koff is the dissociation matrix
  • - is the identity matrix of size N
  • - diag() represents the diagonal operator converting a square matrix of size N x N into a vector of size N comprising all the elements of the diagonal of the matrix.
  • Figure 6 shows an example of two elongation and denaturation phases in a set of embodiments of the invention.
  • Figure 7 shows an example of a set of hybridization, elongation and denaturation reactions occurring during three successive PCR amplification reaction cycles, the reactions shown in Figure 7 making it possible to better illustrate the steps of the simulations of the elongation and denaturation phases shown in Figure 6.
  • Figure 7 represents a simplified example of a single target amplification reaction.
  • Figure 7 more specifically represents series of hybridization, elongation, denaturation reactions occurring in a given context, with new reactions appearing successively in cycle 2 and then in cycle 3, as new by-products are generated.
  • the simulation initially includes (start of the hybridization phase of cycle 1): - nucleic acids in the form of single strands "sense” and "antisense" of the target, respectively ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ; - a “meaningful” primer ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , and two “antisense” primers ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ and ⁇ 2 ⁇ ⁇ ⁇ ; [0195] During the first cycle the reactions are as follows: - React71 reaction: ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ pairs with the primer ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ in a first position to give the duplex ⁇ ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , which will then be elongated into an elongated duplex ⁇ ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , which will be denatured into two single-stranded nucleic acids ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • the React71 and React72 reactions therefore respectively generate two distinct single-stranded molecules ⁇ ⁇ ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ ⁇ 2 ⁇ ⁇ ⁇ ; - React73 reaction: ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ pairs with the primer ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ to give the duplex ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , which will then be elongated into an elongated duplex ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , which will be denatured into two single-stranded nucleic acids ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ; - React74 reaction: ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ pairs with ⁇ 2 ⁇ ⁇ ⁇ to give the duplex ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , which will then be elongated into an elongated duplex ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , which will be de
  • the React78 and React79 reactions therefore generate two distinct single-stranded molecules respectively ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ and ⁇ 2 ⁇ ⁇ ⁇ ; - React710 reaction: ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ pairs with ⁇ 2 ⁇ ⁇ ⁇ to give the duplex ⁇ ⁇ / ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , which will then be elongated into an elongated duplex ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ / ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , which will be denatured into two single-stranded nucleic acids ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ; - React711 reaction: ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ pairs with ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ to give the duplex ⁇ ⁇ / ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , which will then be elongated into an elongated duplex ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ / ⁇
  • ⁇ ⁇ 1 ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ are considered for the purposes of the simulation as two different molecules associated with two different concentrations, it is in reality the same molecule; - React715 reaction: ⁇ 2 pairs with the primer ⁇ to give the duple 2 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ xe ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , which will then be elongated into an elongated duplex ⁇ ⁇ 2 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , which will be denatured into two single-stranded nucleic acids ⁇ 2 ⁇ ⁇ ⁇ and ⁇ 2 ⁇ ⁇ ⁇ .
  • One of the principles of the simulation of the hybridization and denaturation phases in the exemplary embodiments of the invention shown in Figure 6 and exemplified in Figure 7 is to simulate several multiple hybridization reactions (for example, the React71 and React72 reactions, or the React76 and React77 reactions) as a single reaction generating several reaction products, and then use a denaturation tensor to distribute the concentrations of the products of the multiple hybridization reactions for the next simulation cycle.
  • the concentrations of the duplexes and elongated duplexes corresponding to different pairing positions are therefore represented by a single value.
  • the elongation phase simulates the elongation of such a duplex into a single elongated duplex
  • the coefficients of the denaturation tensor are defined such that the concentration of the single elongated duplex resulting from the pairing of the two primers generates reaction products corresponding to the elongations in both directions.
  • the reactions can therefore be represented by the following equations, in which: - ⁇ ⁇ represents an elongation constant linked to each reaction; - ⁇ ⁇ represents a denaturation constant linked to each reaction; - ⁇ represents the respective weights associated with the molecules resulting from several reactions, when for the purposes of the simulation a concentration of elongated duplex actually represents the concentration of several distinct duplexes; - the three successive arrows for each reaction represent hybridization, elongation and denaturation; - the molecules to the right of the last arrow therefore represent the products of denaturation. In order to improve the readability of the equations, only the new molecules have been indicated.
  • the reactions React71 and React72 can be represented by the equation: Equation 11 [0206] Note that, in the case of this multiple hybridization, the two concentrations of duplexes ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ and ⁇ 2 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ are represented by a single concentration ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , the two concentrations of elongated duplexes ⁇ ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ 2 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ are represented by a single concentration ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , and that the applications of the respective weights ⁇ in the denaturation tensor allows to update the concentrations of the two molecules ⁇ ⁇ ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ ⁇ 2 ⁇ ⁇ ⁇ to take into account the respective weights of the reactions from the two pairings.
  • the React73 reaction is represented by the equation: Equation 12
  • the reactions React74 and React75 can be represented by the equation: Equation 13 [0209] It is noted that, in this reaction resulting from the pairing of two primers (primer dimer), the two concentrations of elongated duplexes ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ are represented by a single concentration ⁇ ⁇ ⁇ , the two concentrations of elongated duplexes ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ are represented by a single concentration ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , and that the application of the respective weights ⁇ in the denaturation tensor makes it possible to update the concentrations of the two molecules ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ .
  • an equation representing several reactions such as equation 13 can be associated with several weights, for example stored in the denaturation tensor, representing the relative importance of the different reactions.
  • the reactions React74 and React75 can be associated respectively with a weight ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 74 and ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 75 .
  • the unique concentration ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ is divided into concentrations of the reaction products.
  • the concentration of the molecule ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ would be increased at the end of the cycle by ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 74 * ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • the concentration of the molecule ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ would be increased at the end of the cycle by ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 75 * ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ .
  • the React710 reaction is represented by the equation: Equation 17 [0216]
  • the reaction React711 is represented by the equation: Equation 18 [0217]
  • the reaction React712 is represented by the equation: Equation 19 [0218]
  • the reaction React713 is represented by the equation: Equation 20 [0219]
  • the reaction React714 is represented by the equation: Equation 21 [0220]
  • the reaction React715 is represented by the equation: Equation 22 [0221]
  • - each molecule involved in the simulation is associated with an index in the vector ⁇ ; - the concentrations of the duplexes resulting from the hybridization phase are noted in a square matrix ⁇ where each row and each column represents one of the molecules, in the order of their indices in the vector ⁇ .
  • Equation 23 the matrix ⁇ can for example be written: Equation 23 [0223]
  • the single-stranded molecules linked to each column and row are respectively noted above each column and to the left of each row.
  • a single duplex concentration is noted in the matrix, in fact representing the concentration of several duplexes corresponding to several pairing positions.
  • the cell corresponding to the row " ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ » and the column « ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ » includes concentration ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , actually representing the sum of the concentrations ⁇ ⁇ 1 ⁇ ⁇ 2 ⁇ ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ;
  • obtaining the concentrations of the elongated duplexes during the simulation S42 of the elongation phase is done by multiplying the concentrations of the duplexes by elongation constants.
  • the elongation constants can be listed in an elongation tensor constructed on the same principle as the matrix ⁇ , that is to say that each cell of the elongation tensor ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ contains a duplex elongation coefficient of the corresponding cell of the matrix ⁇ .
  • the elongation tensor would therefore be: Equation 24
  • the numbering of the elongation constants here refers to the indices of the single-stranded nucleic acid molecules in the vector ⁇ .
  • the constant ⁇ ⁇ 11.1 noted at 1 e column and 11 e tensor line ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , represents the elongation coefficient of the duplex formed by the hybridization of the molecules of index 1 and 11 in the vector ⁇ (therefore the molecules ⁇ ⁇ ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ ), that is to say ⁇ ⁇ 1 ⁇ / ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , also noted at 1 e column and 11 e row of the matrix ⁇ .
  • the elongation constants can for example be read in a database, or obtained experimentally.
  • Each elongation coefficient therefore represents the coefficient, between 0 and 1, of the molecules of a given duplex which are elongated during an elongation phase.
  • a coefficient of 0.5 for a given duplex means that half of the molecules of this duplex are elongated during the elongation phase.
  • the concentration of elongated duplexes at the end of the elongation phase will therefore be half the concentration of non-elongated duplexes at the beginning of the elongation phase.
  • the elongation tensor is therefore made up of elongation coefficients between 0 and 1.
  • the simulation phase of the elongation phase can be carried out by a step S421 of multiplication of the concentration matrix of the non-elongated duplexes by the elongation tensor: Equation 25 [0230]
  • - C represents the PCR amplification cycle index
  • - ⁇ ⁇ ⁇ represents the duration of the elongation phase
  • - ⁇ ⁇ represents the concentration matrix of non-elongated duplexes at the C-th PCR amplification cycle
  • - ⁇ ⁇ ⁇ represents the concentration matrix of the duplexes elongated at the C-th cycle of PCR amplification
  • - ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ represents the elongation tensor.
  • the concentration of non-elongated duplexes at the end of the cycle is therefore equal to the concentration of non-elongated duplexes at the beginning of the cycle minus the concentration of elongated duplexes at the end of the phase.
  • ⁇ ⁇ +1 (0) ⁇ ⁇ (0) ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ( ⁇ ⁇ ⁇ ) Equation 26
  • the elongation phase has here been illustrated by means of a Hadamard matrix product. However, this is not the only way to simulate an elongation phase.
  • the elongation phase can be more generally simulated by multiplying the concentration of each unextended duplex at the beginning of the elongation phase by the elongation coefficient of this duplex.
  • the concentrations of the unextended duplexes can be integrated into a concentration vector of the unextended duplexes, and this vector can be multiplied by a vector of elongation coefficients.
  • the denaturation phase may in practice comprise two steps: - a step S431 of multiplying the concentrations of elongated and optionally non-elongated duplexes by one or more denaturation tensors representing the distribution of the duplexes in nucleic acid molecules in the form of single strands; - a step S432 of multiplying the concentrations of the duplexes, or of the product of the concentrations of the duplexes by the denaturation tensor(s) by one or more denaturation coefficients representing the rate of duplexes actually denatured during the denaturation phase.
  • the denaturation phase comprises multiplying the concentrations of elongated duplexes by a denaturation tensor of the elongated duplexes.
  • the denaturation tensor of the elongated duplexes represents in practice the redistribution of the elongated duplexes towards the nucleic acid molecules in the form of single strands during the denaturation phase.
  • This makes it possible to simulate the denaturation of the duplexes which have been elongated, and to integrate the concentrations of elongated and denatured duplexes in the initial conditions of the following cycle.
  • the denaturation phase further comprises the multiplication of the concentrations of non-elongated duplexes by a denaturation tensor of the non-elongated duplexes.
  • the simulation of the denaturation phase takes into account both the denaturation of the elongated duplexes, but also the denaturation of the duplexes which have not been elongated, thus making it possible to obtain a more precise simulation result.
  • a denaturation coefficient can also be applied to the concentrations of elongated/non-elongated duplexes and/or to the concentrations of single-stranded nucleic acids resulting from the multiplication of the concentrations of elongated/non-elongated duplexes by the denaturation tensors.
  • the denaturation coefficients represent the proportion of duplexes of a given type that are actually denatured during the denaturation phase.
  • the denaturation coefficients can for example be read from a database, or obtained experimentally.
  • Each denaturation coefficient therefore represents the coefficient, between 0 and 1, of the molecules of a given duplex that are denatured during a denaturation phase.
  • a coefficient of 0.5 for a given duplex means that half of the molecules of this duplex are denatured during the denaturation phase.
  • - the same denaturation coefficient can be applied to a given elongated duplex, and to the corresponding non-elongated duplex. This allows a good approximation of the denaturation, while simplifying the calculations; - two distinct denaturation coefficients can be applied respectively to a given elongated duplex, and to the corresponding non-elongated duplex.
  • the denaturation coefficients can for example be applied by means of matrix multiplications.
  • the denaturation phase can be simulated by the following equations: Equation 29 [0243] In which: - ° represents the Hadamard product; - ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ is the identity matrix; - ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ is a denaturation matrix comprising denaturation coefficients associated with each duplex; - ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ is the elongation matrix; - ⁇ ⁇ ( ⁇ ⁇ ) is the concentration matrix of non-elongated duplexes at the end of the denaturation phase in cycle C; - is the concentration matrix of elongated duplexes at the beginning of the denaturation phase in cycle C; - ⁇ ⁇ +1 (0) is
  • Equation 28 represents the concentration of elongated and non-denatured duplexes found at the beginning of the amplification cycle following C+1.
  • Equation 29 represents the distribution of nucleic acids in the form of single strands of the denatured duplexes at the beginning of the amplification cycle following C+1.
  • - ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ( ⁇ ⁇ ) represents the distribution of elongated duplexes in single-stranded nucleic acids by application of the denaturation tensor of elongated duplexes
  • - ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ represents the distribution of unelongated duplexes in single-stranded nucleic acids by application of the unelongated duplex denaturation tensor
  • - ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ° represents the application of the denaturation tensor to the distribution of nucleic acids in the form of single strands
  • - the term ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ° [ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ( ⁇ ⁇ ) ] therefore represents the variation of single-stranded nucleic acids during the PCR amplification cycle of index C.
  • each cell of the elongation tensor ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ contains a coefficient of elongation of the duplex of the corresponding cell of the matrix ⁇ .
  • the denaturation tensor would therefore be: Equation 30 [0249]
  • the numbering of the elongation constants here refers to the indices of the single-stranded nucleic acid molecules in the vector ⁇ .
  • the constant ⁇ ⁇ 11.1 noted at 1 e column and 11 e tensor line ⁇ , represents the denaturation coefficient of the duplex formed by the hybridization of the molecules of index 1 and 11 in the vector ⁇ (therefore the molecules ⁇ ⁇ ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ ), that is to say ⁇ ⁇ 1 ⁇ / ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , also noted at 1 e column and 11 e row of the matrix ⁇ .
  • each denaturation coefficient therefore represents the coefficient, between 0 and 1, of the molecules of a given duplex that are denatured during a denaturation phase.
  • a coefficient of 0.5 for a given duplex means that half of the molecules of this duplex are denatured during the elongation phase.
  • the concentration of elongated/non-elongated duplexes at the end of the denaturation phase will therefore be half of the concentration of elongated/non-elongated duplexes at the start of the denaturation phase.
  • the denaturation tensor is therefore made up of denaturation coefficients between 0 and 1.
  • each line includes the reference of a partial duplex, its index in the vector ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , the two nucleic acid molecules in single-strand form whose hybridization has allowed to form the duplex, and which are re-created at the end of the denaturation phase, and the indices of these two molecules:
  • Table 1 The denaturation tensor of non-elongated duplexes ⁇ ⁇ can therefore be written in this example: Equation 31 [0254]
  • the denaturation tensor of non-elongated duplexes ⁇ ⁇ is in this example a tensor of size 12x14: it includes 12 lines corresponding respectively to the 12 duplexes in the vector ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ .
  • the 12 duplexes are noted to the left of each corresponding line, and noted in the order of their indices in the vector ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ . It also includes 14 columns corresponding respectively to the 14 single-stranded nucleic acid molecules in the ⁇ vector. The 14 single-stranded nucleic acid molecules are noted above each corresponding column, and noted in the order of their indices in the ⁇ vector. The value “1” is inscribed in each cell belonging to the row of a duplex, and the column of a nucleic acid in the form of single strands generated by the denaturation of this elongated duplex.
  • the denaturation tensor thus makes it possible to distribute the concentrations of molecules of ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ towards for the next cycle in a single simple algebraic operation.
  • the form of the denaturation tensor also allows us to verify that the reaction is correct by summing each row. Indeed, the sum of the elements of each row must be equal to 2 (since each duplex generates two nucleic acid molecules in the form of single strands during the denaturation phase).
  • the denaturation tensor of the elongated duplexes is also in our example of size 12x14, each row representing an elongated duplex in the order of their indices in the vector ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , and each column representing a single-stranded nucleic acid molecule in the order of their indices in the vector ⁇ .
  • each row representing an elongated duplex in the order of their indices in the vector ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • each column representing a single-stranded nucleic acid molecule in the order of their indices in the vector ⁇ .
  • the denaturation tensor of the elongated duplexes also contains specific coefficients in the case of multiple hybridizations, i.e. hybridization of the same primer at several locations of the same single-stranded nucleic acid, as for example in the case of the React71 and React72 reactions, or the React78 and React79 reactions for example.
  • the denaturation generates not two but at least three nucleic acids in the form of single strands.
  • the denaturation will produce three nucleic acids in the form of single strands because the multiple hybridization has been carried out at two positions, but the same principle can be extended to a greater number of denaturation products in the case of hybridizations at a greater number of positions.
  • the duplex concentrations and the elongated duplex concentrations respectively comprise a concentration of a virtual duplex equal to the sum of the concentrations of the duplexes formed by the multiple hybridization reactions, and a concentration of an elongated virtual duplex equal to the sum of the concentrations of the elongated duplexes formed by the elongation of the duplexes formed by the multiple hybridization reactions.
  • the concentrations of non-elongated duplexes include the concentration of representing the sum of the concentrations
  • - elongated duplex concentrations include the elongated virtual duplex concentration ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ representing the sum of the concentrations ⁇ ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ;
  • the concentrations of non-elongated duplexes include the concentration of virtual duplex ⁇ ⁇ / ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ representing the sum of the concentrations ⁇ ⁇ 1 ⁇ / ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ 2 ⁇ / ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ;
  • the concentrations of elongated duplexes include the concentration of elongated virtual duplex ⁇
  • the coefficients of the denaturation tensor of the elongated duplexes corresponding to the distribution of the concentration of the elongated virtual duplex towards each single-stranded nucleic acid associated with one of the multiple hybridization reactions may be respectively equal to the ratio between the interaction energy of the multiple hybridization reaction divided by the sum of the interaction energies of all the multiple hybridization reactions with said single-stranded nucleic acid.
  • the virtual duplex ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ will be distorted: - on the one hand, towards ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , which was present in both React71 and React72 reactions.
  • the associated coefficient will therefore be 1; - on the other hand, towards ⁇ ⁇ ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ ⁇ 2 ⁇ ⁇ ⁇ , corresponding to the reactions React71 and React72.
  • the coefficients associated with the molecules ⁇ ⁇ ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ ⁇ 2 ⁇ ⁇ ⁇ must therefore correspond to the respective importance of the reactions React71 and React72, that is to say to the respective importance of the hybridization of React71 and the hybridization of React72.
  • these two coefficients can be respectively equal to the interaction energy of the hybridization of React71 divided by the sum of the hybridization energies of React71 and React72, and the interaction energy of the hybridization of React72 divided by the sum of the hybridization energies of React71 and React72.
  • the denaturation tensor of the elongated duplexes also contains specific coefficients in the case of hybridizations between two primers, or "primer dimer". Indeed, in this case, the duplex formed by the hybridization of the two primers can be elongated in both directions, which ultimately generates distinct denaturation products, as for example in the React74 and React75 reactions.
  • the concentrations of elongated duplexes comprise a concentration of a virtual elongated duplex equal to the sum of the concentrations of the elongated duplexes formed by the elongation in each of the two directions of the duplex formed by the hybridization of the two primers.
  • the concentrations of the elongated duplexes may include a concentration of a virtual elongated duplex ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , representing the sum of the concentrations of ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ .Thus, the concentration of the elongated virtual duplex ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ does not correspond to a concentration of a real duplex, but makes it easier to simulate.
  • the coefficients of the denaturation tensor of the elongated duplexes corresponding to the distribution of the concentration of the elongated virtual duplex towards each of the two primers, and each of the two nucleic acids in the form of single strands resulting from the elongation in one of the two directions can then all be equal to 0.5, to represent the fact that the elongation occurs approximately once out of two in each of the two directions.
  • the denaturation products are the primers ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ and ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , as well as nucleic acids ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ and ⁇ 2 ⁇ ⁇ ⁇ .
  • FIG. 8 shows an example of a method according to a set of embodiments of the invention integrating a validation or modification of the parameters of the PCR amplification.
  • the characteristics of the PCR kit for example the choice of the plurality of primers and the initial value of the concentration vector for said plurality of primers in the first cycle of the reaction, can be validated or modified according to the results of the simulation.
  • the method P8 comprises, in addition to the steps of the method P4: - a step S81 of displaying the results of the simulation.
  • This display may for example include a display of curves of evolution of the concentrations of the molecules, values representative of the kinetics of the reaction, etc.; - a step S82 of comparing a value representative of the kinetics of a reaction to a threshold; - if the comparison is positive, a step S83 of validating the primers and the initial concentrations of the primers; - otherwise, a step S84 of modifying the primers and/or the initial concentrations of the primers. [0280] At the end of step S84, the simulation can be re-executed on the basis of the modified parameters.
  • Step S82 of comparing a value representative of the kinetics of a reaction to a threshold makes it possible in particular to verify that a given amplification reaction will be fast enough to be detected.
  • the threshold considered may be one of the following thresholds: - a threshold cycle (Ct); - a crossover point (Cp); - a final concentration of a nucleic acid molecule amplified by the reaction; - a concentration of amplicons at the end of the reaction.
  • step S82 may consist of verifying that a Ct or Cp for an amplification reaction of a given target is greater than a reference threshold (i.e. that the threshold cycle Ct, or crossover point Cp is too high, which means that the amplification reaction is not fast enough), which means that the reaction will not be fast enough.
  • a reference threshold i.e. that the threshold cycle Ct, or crossover point Cp is too high, which means that the amplification reaction is not fast enough
  • the method P8 comprises a display step S81
  • the display can for example allow an expert user to validate or not the parameters of the simulation, but the comparison in step S82 can also be carried out automatically, without prior display.
  • the implementation of a modification in step S84 can be carried out in different ways. For example, the modification can be carried out manually by an expert user.
  • step S84 can comprise a sub-step S841 of identifying a target to be favored based on the results of the simulation of the polymerase chain reaction.
  • the target to be favored may be a target whose kinetics are not sufficiently fast.
  • Step S84 may then comprise a second substep S842 of identifying, from the association matrix or the dissociation matrix, a nucleic acid molecule in single-strand form forming a pair with a primer associated with said target.
  • Substep S842 therefore consists in identifying a molecule other than the target forming a pair with a primer associated with said target, that is to say a molecule which will compete with the target (and the amplicons resulting from the amplification of the target) to pair with the primer.
  • a molecule can be identified using the association matrix ⁇ ⁇ ⁇ , or the dissociation matrix ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ . Indeed, these matrices contain coefficients for each pair of molecules linked by a sufficiently strong hybridization reaction.
  • the molecule can therefore for example be identified as a molecule having an association constant with the primer, or an association constant greater than a threshold with the primer.
  • Step S84 can then comprise carrying out at least one modification of the polymerase chain reaction.
  • the at least one modification of the polymerase chain reaction may in particular comprise at least one modification chosen from: - a reduction, in the initial concentration vector, of the initial concentration of said nucleic acid molecule in the form of a single strand forming a pair with the primer associated with said target; - a modification of the salt concentration; - a modification of the hybridization temperature for at least one cycle.
  • Figure 9 shows an example of a method according to a set of embodiments of the invention integrating a validation or modification of the parameters of the PCR amplification, and a manufacture of a validated PCR amplification kit.
  • Method P9 is a manufacturing method comprising all the steps of method P8.
  • Method P9 further comprises, at the end of the validation in step S83, a step of manufacturing a kit for the characterization of microorganisms included in a sample by using a polymerase chain reaction, or "PCR kit” such as the kit K1 shown in Figure 1 for example.
  • the kit manufactured by method P9 thus comprises the primers, and concentrations as validated by method P8, that is to say whose simulation has shown that a desired amplification can be carried out with satisfactory kinetics.
  • the method P9 therefore makes it possible to manufacture a kit validated by the simulation, and allowing satisfactory amplification of the desired targets. [0300] Reference is now made to FIG. 10. [0301] FIG.
  • the method P10 comprises a first step S101 of preparing the sample so as to carry out a PCR on the prepared sample, said preparation comprising a step of adding a kit (K1) manufactured in accordance with a method such as the method P9.
  • the sample may have been taken from a human, an animal, or even an inanimate object.
  • the method P10 then comprises a step S102 of implementing the PCR on the sample taken. At the end of this step, the nucleic acid sequences of interest will have been amplified by PCR, and are present in sufficient quantities to be characterized.
  • the method P10 therefore comprises a third step S103 of characterizing the microorganisms according to the results of the PCR.
  • An antimicrobial can be chosen according to the characterization and either administered to the human or the animal if the sample was taken from a living being, or applied to an inanimate object if the sample was taken from an inanimate object.
  • the method P10 thus makes it possible to carry out a PCR on a sample, in order to characterize a microorganism contained in the sample, and if necessary select an antimicrobial adapted to this microorganism.
  • Figure 11 shows a graph Gr11 representing the evolution of the Ct for a simulation of amplification of a nucleic acid from yeast of the fungus (S. cerevisiae) as a function of the duration of the hybridization phase according to a simulation method of the invention.
  • the graph represents more precisely: - on the abscissa axis, the duration of the hybridization phase ⁇ h ⁇ ⁇ ⁇ , in seconds; - on the ordinate axis, the difference ⁇ ⁇ ⁇ between the ⁇ ⁇ corresponding to the maximum time tested for the hybridization phase (here, 10 seconds), and the ⁇ ⁇ for a given duration of the hybridization phase, shorter.
  • the Crv110 curve represents the simulated evolution of ⁇ ⁇ ⁇ as a function of ⁇ h ⁇ ⁇ ⁇ , for a concentration of 0.4 ⁇ M
  • the Crv111 curve represents the simulated evolution of ⁇ ⁇ ⁇ as a function of ⁇ h ⁇ ⁇ ⁇ , for a concentration of 0.8 ⁇ M
  • - the Crv112 curve represents the simulated evolution of ⁇ ⁇ ⁇ as a function of ⁇ h ⁇ ⁇ ⁇ , for a concentration of 2 ⁇ M.
  • Figure 12 shows an example of visualization of the kinetics of several PCR reactions under two distinct experimental conditions according to a set of embodiments of the invention.
  • two simulations according to the invention were executed to reproduce: - the amplification of a target within a first multiplex amplification, with a first set of primers. This first simulation is represented by the points "OPA”, - the amplification of a target within a second multiplex amplification, with a modification of the first set of primers.
  • This first simulation is represented by the points "OPB”.
  • the analysis of the simulation results makes it possible to optimize the choice of amplification parameters, for example the choice of primers, primer concentrations, or phase durations in order to validate the ability of a PCR amplification kit constructed according to the simulated parameters to generate a satisfactory amplification of a given target.
  • the present disclosure is not limited to the examples of method, computer program, kit for polymerase chain reaction above, only by way of example, but it encompasses all the variants that a person skilled in the art may envisage within the framework of the protection sought.
  • Thanks to the invention it is possible to determine whether an initial choice of primers and their concentration leads to an appropriate amplification of the target nucleic acid molecules.
  • the invention also makes it possible to adopt a systematic approach for the design of PCR amplification kits.
  • a grid of initial parameters is determined. For example, for each set of candidate primers for a kit, their concentration range is discretized with a predetermined step. An initial parameter is then this set of primers with concentration values in said ranges.
  • a simulation is launched for each of the parameters and once the entire grid has been covered, the parameter(s) giving the best performance are retained, then one or more corresponding kits are manufactured.
  • the invention also makes it possible to test a set of primers in the context of a multiplex PCR, and in this case to test and compare alternative designs in order to achieve the expected performances.
  • the manufactured kit is then used in a manner known per se. In the context of a clinical application, such as for example the detection of pathogenic microorganisms in a biological sample taken from a patient (or an animal), the clinician (resp. the veterinarian) can then adapt his therapy, for example choosing an antibiotic adapted to the pathogen detected.
  • the parameters ⁇ ⁇ can be obtained according to state-of-the-art methods, for example the so-called “Nearest Neighbors” methods disclosed for example by SantaLucia Jr, J. (1998).
  • state-of-the-art methods for example the so-called “Nearest Neighbors” methods disclosed for example by SantaLucia Jr, J. (1998).
  • the simulation of PCR amplification is implemented by computer, namely by means of hardware circuits comprising computer memories (cache, RAM, ROM, etc.) and one or more microprocessors or processors, organized or not in the form of calculation nodes, necessary for the execution of computer instructions stored in the memories for the implementation of said simulation.
  • computer memories cache, RAM, ROM, etc.
  • microprocessors or processors organized or not in the form of calculation nodes, necessary for the execution of computer instructions stored in the memories for the implementation of said simulation.

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Abstract

Procédé de simulation numérique d'une amplification en chaîne par polymérase d'au moins une cible, comprenant la simulation d'une pluralité de cycles successifs de l'amplification, chaque cycle comprenant,: une phase d'hybridation; une phase d'élongation; puis une phase de dénaturation; dans lequel la phase d'hybridation comprend pour chaque cycle : l'obtention d'une valeur initiale pour le cycle d'un vecteur de concentrations d'une pluralité de molécules d'acide nucléique sous forme de simple brins; l'initialisation d'une matrice de concentrations de duplexes formés par l'hybridation de la pluralité de molécules d'acide nucléique sous forme de simples brins; le calcul, de l'évolution de ladite matrice de concentrations au cours de la phase d'hybridation, par l'application à la matrice de concentrations d'une équation différentielle matricielle représentant la cinétique de formation desdits duplexes en fonction des concentrations de la pluralité de molécules d'acide nucléique.

Description

Description Titre : FABRICATION DE KITS D’AMPLIFICATION EN CHAINE PAR POLYMERASE OPTIMISANT UNE PHASE D’HYBRIDATION DE L’AMPLIFICATION Domaine technique [0001] La présente divulgation relève du domaine de l’amplification en chaîne par polymérase. Plus précisément, la présente divulgation relève du domaine de la simulation et de la fabrication de kits d’amplification en chaîne par polymérase Technique antérieure [0002] Une amplification en chaîne par polymérase (également appelée réaction en chaîne par polymérase, et abréviée « PCR », de l’anglais « Polymerase Chain Reaction » est une réaction permettant la multiplication de molécules d’acide nucléique (par exemple ADN ou ARN). A chaque cycle de réaction, chaque molécule d’acide nucléique est dupliquée. L’amplification PCR permet donc de multiplier les molécules d’acide nucléique de manière exponentielle, la concentration d’acide nucléique pouvant doubler à chaque cycle de réaction. [0003] Ceci permet à l’amplification PCR de parvenir, à partir de quantités d’acides nucléiques mêmes très faibles, à des concentrations relativement importantes, permettant leur détection. Ainsi, l’amplification PCR est utilisée dans de nombreuses applications biomédicales, notamment la détection et la caractérisation d’agents pathogènes, car elle permet de transformer des quantités infimes d’acides nucléiques représentatifs d’un agent pathogène en des quantités détectables. [0004] Une amplification PCR est dite « singleplexe » lorsqu’elle vise à amplifier un seul acide nucléique, ou « multiplexe » lorsqu’elle vise à amplifier une pluralité d’acides nucléiques différents simultanément. Les molécules à amplifier peuvent être appelées « cibles » et les molécules amplifiées « amplicons », étant entendu qu’un amplicon peut lui-même être amplifié à un ou plusieurs cycles ultérieurs. [0005] L’amplification PCR est généralement réalisée dans un kit PCR appliquant différentes températures afin de déclencher les étapes successives des cycles d’amplification. Le kit PCR contient initialement des amorces permettant d’enclencher l’amplification. [0006] Le succès et la rapidité de l’amplification PCR dépendent de nombreux paramètres du kit PCR, notamment les durées et températures des différentes étapes de la réaction, les séquences des amorces initialement présentes dans le kit, leur concentration, les concentrations de sels monovalents et divalents, des oligonucléotides en solution, la longueur des amplicons attendus (des amplicons plus courts permettant des durées de cycles plus courtes également), etc. [0007] De manière générale, lors de la conception d’un kit PCR, le concepteur réalise les étapes suivantes : a) identifie pour chaque microorganisme une liste de cibles potentielles spécifiques (i.e. non partagée avec les autres microorganismes) ; b) choisit en fonction de son expérience, des amorces potentielles dans une liste d’amorces possibles ; c) fait des essais en condition réelle ; d) réitère le processus si les performances de la PCR ne sont pas satisfaisantes. [0008] Cette méthodologie s’avère d’autant plus ardue lorsque plusieurs cibles sont visées. La conception d'un kit est donc longue et complexe et repose sur une expertise métier propre à chaque concepteur. [0009] Une anticipation des réactions sur papier est également impossible, car le concepteur est très vite dépassé par le nombre de réactions de sorte qu'il est impossible pour l'esprit humain de simuler sur le papier ce qui se déroulera réellement lors de la PCR. [0010] Par exemple, il est impossible de résoudre a priori un système d’équations différentielles représentant l’hybridation entre l’ensemble des molécules présentes dans un kit PCR, notamment les amplicons, amorces et produits intermédiaires. Les méthodes de l’état de l’art ne permettent pas non plus d’effectuer de simulations numériques d’un tel système dans un temps raisonnable, du fait de la présence de nombreuses équations différentielles liées les unes aux autres. Ceci réduit considérablement les possibilités de conception et donc d’amélioration de kits PCR. [0011] Il y a donc besoin d’une méthode de conception de kits PCR permettant de prévoir le déroulement de phases d’hybridation afin de faciliter la sélection de paramètres facilitant l’amplification d’une ou plusieurs cibles visées. Résumé [0012] La présente divulgation vient améliorer la situation. [0013] Il est proposé un procédé de simulation numérique d’une amplification en chaîne par polymérase d’au moins une cible, ledit procédé comprenant la simulation d’une pluralité de cycles successifs de l’amplification, chaque cycle comprenant, de manière séquentielle : une phase d’hybridation entre l’au moins une cible et une pluralité d’amorces ; une phase d’élongation ; puis une phase de dénaturation ; dans lequel la phase d’hybridation comprend pour chaque cycle : l’obtention d’une valeur initiale pour le cycle d’un vecteur de concentrations d’une pluralité de molécules d’acide nucléique sous forme de simple brins comprenant l’au moins une cible et la pluralité d’amorces ; l’initialisation d’une matrice de concentrations de duplexes formés par l’hybridation de la pluralité de molécules d’acide nucléique sous forme de simples brins; le calcul, par pas de temps successifs, de l’évolution de ladite matrice de concentrations au cours de la phase d’hybridation, par l’application à la matrice de concentrations d’une équation différentielle matricielle représentant la cinétique de formation desdits duplexes en fonction des concentrations de la pluralité de molécules d’acide nucléique, ladite équation différentielle matricielle étant paramétrée par au moins une matrice d’association comprenant les constantes d’associations associées à chaque duplex et une matrice de dissociation comprenant les constantes de dissociation associées à chaque duplex. [0014] On entend par "au moins une cible" au moins un acide nucléique d'une séquence à amplifier. Selon différents modes de réalisation de l’invention, l’amplification peut concerner une unique cible, auquel cas l’amplification est dite « singleplexe », ou une pluralité de cibles, auquel cas l’amplification est dite « multiplexe ». [0015] On entend par "molécule d'acide nucléique sous forme de simples brins" une molécule d'acide nucléique sous forme de simple brins non appariée à une molécule simple brin complémentaire. [0016] On entend par « constante d’association » (également appelée « constante de taux d’association », ou « constante de vitesse d’association », en anglais « association rate constant »), généralement notée kon, une constante de vitesse représentant la vitesse de la réaction d’association de deux molécules d’acide nucléique sous forme de simples brins en un duplexe. [0017] On entend par « constante de dissociation » (également appelée « constante de taux dissociation », ou « constante de vitesse dissociation », en anglais « association rate constant »), généralement notée koff, une constante de vitesse représentant la vitesse de la réaction de dissociation d’un duplexe en deux molécules d’acide nucléique sous forme de simples brins. [0018] Ceci permet de simuler l’ensemble des phases d’hybridations (c’est-à-dire d’équilibre entre réactions d’association et de dissociation) s’effectuant entre les cibles, les amplicons et les amorces. L’ensemble de la dynamique d’une amplification en chaîne par polymérase peut donc être modélisée, intégrant les réactions croisées avec les produits intermédiaires. [0019] Cette modélisation spécifique d’une amplification en chaîne par polymérase permet ainsi de valider le design d’un dispositif d’amplification en chaîne par polymérase, ou au contraire d’identifier des réactions indésirables et de modifier en fonction les paramètres influant la réaction d’amplification (concentration initiale des amorces, des sels, durée et température des phases, etc.). [0020] Par ailleurs, la simulation de la phase d’hybridation selon une unique équation différentielle matricielle permet une résolution de la cinétique du système à l’aide de capacités de calcul conventionnelles. [0021] Selon un autre aspect, il est proposé un procédé de fabrication d’un kit pour la caractérisation de microorganismes compris dans un échantillon par utilisation d’une réaction d’amplification en chaine par polymérase, ledit kit comprenant une pluralité d’amorces validées, procédé dans lequel la pluralité d’amorces et le vecteur de concentrations pour ladite pluralité d’amorces sont obtenus par un procédé de simulation selon l’un des modes de réalisation de l’invention. [0022] Ceci permet de fabriquer un dispositif reproduisant la réaction telle que simulée. Le dispositif ainsi produit permettra donc la multiplication des cibles telle qu’elle a été simulée précédemment. [0023] Selon un autre aspect, il est proposé un kit pour l’’amplification en chaîne par polymérase fabriqué par un procédé de fabrication selon l’un des modes de réalisation de l’invention. [0024] Selon un autre aspect, il est proposé un programme informatique comportant des instructions pour la mise en œuvre de tout ou partie d’un procédé tel que défini dans les présentes lorsque ce programme est exécuté par un processeur. [0025] Selon un autre aspect, il est proposé un support d’enregistrement non transitoire, lisible par un ordinateur, sur lequel est enregistré un tel programme. [0026] Selon un autre aspect, il est proposé un procédé de caractérisation de microorganismes compris dans un échantillon, comprenant : la préparation de l’échantillon de manière à réaliser sur l’échantillon préparé une PCR, ladite préparation comprenant une étape d’ajout d’un kit fabriqué conformément à un procédé de fabrication d’un kit tel que défini dans les présentes; la mise en œuvre de la PCR sur l’échantillon préparé ; la caractérisation des microorganismes en fonction des résultats de la PCR. [0027] Les caractéristiques exposées dans les paragraphes suivants peuvent, optionnellement, être mises en œuvre, indépendamment les unes des autres ou en combinaison les unes avec les autres : [0028] Avantageusement, dans lequel l’équation différentielle intègre des équations de conservation de masse de la forme :
Figure imgf000006_0001
Dans lesquelles : ^^∗ représente le temps écoulé depuis le début de la phase d’hybridation ; les notations ^^ ^^ et ^^ ^^ désignent respectivement les concentrations de deux molécules d’acide nucléique sous forme de simple brins d’indices i et j dans le vecteur ^̅^ de concentrations d’une pluralité de molécules d’acide nucléique ; la notation ^^ ^^ ^^ désigne la concentration d’un duplexe formé par l’hybridation de la paire de molécules d’acide nucléique sous forme de simple brins d’indices x et y dans le vecteur ^̅^ de concentrations d’une pluralité de molécules d’acide nucléique ; les notations ^^ ^^0 et ^^ ^^0 désignent les valeurs de ^^ ^^ et ^^ ^^ à ^^∗ = 0 ; ou toute autre formulation mathématiquement équivalente. [0029] Ceci permet d’obtenir une simulation plus précise de la phase d’hybridation, car la conservation de masse est prise en compte. [0030] Avantageusement, lequel l’équation différentielle matricielle est de la forme suivante :
Figure imgf000006_0002
dans laquelle : H est la matrice de concentration des duplexes ; T0 est la valeur initiale pour le cycle du vecteur de concentration de la pluralité de molécules ; Kon est la matrice d’association ; Koff est la matrice de dissociation ; l’opérateur ^^ ^^, ^^ représente une matrice en deux dimensions comprenant i lignes et j colonnes dont tous les éléments sont égaux à 1 ; l’opérateur « diag() » désigne un opérateur prenant en paramètre une matrice carrée et extrayant à partir de cette matrice carrée un vecteur ayant pour dimension le nombre de lignes ou de colonnes de la matrice carrée et contenant tous les éléments de la diagonale de la matrice carrée. [0031] Par exemple, l’opérateur ^^1, ^^ représente un vecteur horizontal de dimension N ne comprenant que des 1, et l’opérateur ^^ ^^,1 représente un vecteur vertical de dimension N ne comprenant que des 1. [0032] Par exemple, l’opérateur diag(H) transforme une matrice carrée H de dimension NxN en un vecteur de dimension N comprenant tous les éléments de la diagonale de N, dans l’ordre. Par 1 2 3 1 exemple, si ^^ = [ 4 5 6], alors ^^ ^^ ^^ ^^( ^^) = [ 5], 7 8 9 9 [0033] Ceci permet d’intégrer les équations différentielles relatives à toutes les réactions d’hybridation dans une seule équation matricielle, le remplacement de T par T0 dans l’équation permettant d’obtenir des calculs matriciels plus rapides. [0034] Avantageusement, chaque matrice d’association ou de dissociation comporte des éléments, et chaque élément de la matrice d’association, ou chaque élément de la matrice de dissociation associé à une paire de molécules appartenant à ladite pluralité de molécules est : nul, si la variation d’enthalpie libre associée à la réaction d’hybridation des molécules formant la paire est supérieur à un seuil ; respectivement égal à une constante d’association, ou à une constante de dissociation de la réaction d’hybridation de la paire de molécule sinon. [0035] Ceci permet de ne prendre en compte dans la simulation que les réactions d’hybridation dominantes. Ceci permet à la fois d’obtenir une meilleure précision de la cinétique des réactions d’hybridation prises en compte, et de diminuer la complexité de résolution de l’équation différentielle. Ceci permet également de tenir compte des dynamiques différentielles entre les différentes réactions suivant que la valeur d’enthalpie libre est favorable ou défavorable entre deux réactions d’intérêt. [0036] Avantageusement, la valeur dudit seuil est choisie parmi au moins deux valeurs de seuil prédéfinies, la valeur de seuil la plus faible étant réservée aux paires de molécules comprenant un amplicon et une amorce appariés. [0037] Les seuils et variation d’enthalpie libre étant négatifs, la valeur de seuil la plus élevée correspond à une valeur du seuil plus faible. Les réactions d’hybridation entre amorces et amplicons seront donc préférentiellement prises en compte. Par « valeur de seuil plus faible », on entend une valeur plus proche de zéro. Les seuils et variation d’enthalpie libre étant négatifs, cela correspond également à une valeur absolue du seuil plus basse. [0038] Ceci permet de prendre en compte de manière préférentielle dans la simulation les hybridations entre les amorces et les amplicons, par rapport aux réactions d’hybridation entre les amorces et d’autres amorces par exemple, ce qui permet de simuler les premiers cycles d’hybridation amplicon-amorce, au cours desquels la concentration des amplicons est beaucoup plus faible que celle des amorces. [0039] Avantageusement, le procédé comprend une étape préalable de définition de la pluralité de molécules comprenant : une initialisation de la pluralité de molécules d’acide nucléique sous forme de simple brins comme étant les molécules initialement présentes dans l’amplification en chaîne par polymérase; une simulation initiale d’une pluralité de cycles de l’amplification en chaîne par polymérase, chaque cycle de la simulation initiale comprenant: une obtention des réactions d’hybridation des molécules formant chaque paire de molécules parmi ladite pluralité de molécules ayant une affinité inférieure à un seuil ; une simulation d’une phase d’hybridation mettant en œuvre lesdites réactions d’hybridation ; une simulation d’une phase d’élongation ; une simulation d’une phase de dénaturation ; un ajout à ladite pluralité de molécules des molécules additionnelles obtenues à l’issue des phases d’hybridation, d’élongation et de dénaturation. [0040] On entend par "molécules additionnelles" les molécules qui n'étaient pas présentes au début d'un cycle, et qui sont générées à l'issue du cycle d'hybridation, élongation et dénaturation. [0041] Ceci permet de construire un vecteur de concentration, et des matrices d’association et de dissociation, ne prenant en compte que les molécules qui seront effectivement rencontrées avec des affinités significatives lors de l’amplification en chaîne par polymérase. Ceci permet donc une simulation à la fois plus fiable et moins gourmande en ressources de la ou des réactions d’amplification PCR. [0042] Avantageusement, l’étape préalable de définition de la pluralité de molécules comprend l’exécution d’un nombre cycles de la simulation initiale compris entre 3 et 7. [0043] Ceci fournit un bon compromis entre le nombre de molécules ajoutées et leur importance. Par exemple, des molécules ajoutées après le 3e, 5e ou 7e cycle peuvent être considérées comme non susceptibles de donner lieu à des réactions significatives. Un nombre de cycle prédéfini compris entre 3 et 7, et par exemple égal à 5 permet donc de limiter le nombre de molécules pour la simulation, et réduire la complexité de calcul associée, tout en préservant la fiabilité de la simulation. [0044] Avantageusement, le procédé comprend, à l’issue de la simulation de ladite pluralité de cycles, une étape ultérieure d’affichage de l’évolution temporelle de la concentration d’au moins une desdites molécules. [0045] Ceci permet de visualiser l’évolution de la concentration d’au moins une des molécules, par exemple un amplicon, et de valider ou modifier en fonction le design de l’amplification en chaîne par polymérase. [0046] Avantageusement, le procédé comprend une étape ultérieure de validation ou de modification de la pluralité d’amorces et de la valeur initiale du vecteur de concentrations pour ladite pluralité d’amorces au premier cycle de la réaction par comparaison d’une valeur représentative de la cinétique d’une réaction à un seuil. [0047] Ceci permet de valider que les amorces initialement présentes, et concentrations associées, permettent bien la multiplication des cibles désirées avec une cinétique de réaction suffisamment forte, et d’éviter la génération de réactions non souhaitées avec une cinétique forte ou au contraire modifier la liste des amorces et/ou leur concentrations. [0048] Avantageusement, la valeur représentative de la cinétique est une valeur choisie parmi: un cycle seuil ; un point de croisement ; une concentration finale d’une molécule d’acide nucléique amplifiée par la réaction ; une concentration d’amplicons en fin de réaction [0049] On entend par "cycle seuil" (en anglais "cycle threshold" ou "Ct", également appelé "Cycle of quantification", ou "Cq") un nombre de cycles requis pour qu'une concentration d'un amplicon atteigne une concentration de référence. Le seuil peut par exemple correspondre à une concentration à partir de laquelle la molécule est détectable. [0050] On entend par "point de croisement" (en anglais "Crossing Point" ou "Cp, ou encore "Take Off Point" ou "TOP"), le cycle auquel la valeur de la dérivée seconde de la concentration d'un amplicon atteint son point maximum. [0051] On entend par « concentration d’amplicons en fin de réaction » une concentration d’amplicons lorsque la réaction est considérée comme terminée, par exemple lorsqu’un plateau de concentration est atteint. Un tel plateau peut par exemple être détecté grâce à une régression linéaire sur une droite affine. [0052] Avantageusement, la modification de la pluralité d’amorces comprend : l’identification d’une cible à favoriser en fonction des résultats de la simulation de l’amplification en chaîne par polymérase; l’identification, à partir de la matrice d’association ou de la matrice de dissociation, d’une molécule d’acide nucléique sous forme de simple brin formant une paire avec une amorce associée à ladite cible ; la réalisation d’au moins une modification de l’amplification en chaîne par polymérase choisie parmi : une diminution, dans le vecteur de concentration initiale, de la concentration initiale de ladite molécule d’acide nucléique sous forme de simple brin formant une paire avec l’amorce associée à ladite cible ; une modification de la concentration de sels ; une modification de la température d’hybridation pour au moins un cycle ; une modification de la durée d’hybridation d’au moins un cycle. [0053] Ceci permet d’identifier les réactions entre les molécules présentes lors de la réaction PCR qui font concurrence à l’amplification d’une cible donnée, et de réduire la concentration initiale de la ou des molécules qui génèrent ces réactions, ou de modifier en conséquence la séquence de la /des molécule(s) incriminée(s) afin de favoriser l’amplification de de la cible donnée. [0054] Avantageusement, l’échantillon est prélevé sur un animal ou un être humain, ledit procédé comprenant le choix d’un antimicrobien en fonction de la caractérisation des microorganismes présent dans ledit échantillon, et l’administration dudit anti-microbien audit animal ou être humain. [0055] Avantageusement, l’échantillon est prélevé sur un objet inanimé, ledit procédé comprenant le choix d’un antimicrobien en fonction de la caractérisation des microorganismes présent dans ledit échantillon, et l’application dudit anti-microbien audit objet inanimé. [0056] Il est proposé un procédé de simulation numérique d’une amplification en chaîne par polymérase d’au moins une cible, ledit procédé comprenant la simulation d’une pluralité de cycles successifs de l’amplification, chaque cycle comprenant, de manière séquentielle : une phase d’hybridation entre l’au moins une cible et une pluralité d’amorces ; une phase d’élongation ; puis une phase de dénaturation ; dans lequel, pour chaque cycle : la phase d’hybridation comprend : l’obtention d’une valeur initiale pour le cycle d’un vecteur de concentrations d’une pluralité de molécules d’acide nucléique sous forme de simples brins comprenant l’au moins une cible et la pluralité d’amorces ; le calcul d’une matrice de concentrations de duplexes partiels formés par l’hybridation de la pluralité de molécules d’acide nucléique sous forme de simples brins, chaque élément de ladite matrice représentant la concentration des duplexes formés par l’hybridation d’une paire de ladite pluralité de molécules d’acide nucléique sous forme de simples brins, indépendamment de la position d’hybridation de ladite paire ; la phase de dénaturation comprend : la multiplication d’un vecteur de concentration de duplexes élongués, résultant de l’application de la phase d’élongation aux concentrations de duplexes, par un tenseur de dénaturation des duplexes élongués afin d’obtenir une valeur initiale de vecteur de concentrations d’une pluralité de molécules d’acide nucléique sous forme de simples brins pour le cycle suivant. [0057] L’utilisation d’une unique valeur de concentration pour l’ensemble des duplexes entre une paire de molécules d’acide nucléique quelle que soit la position d’appariement permet de réduire le nombre d’équations à résoudre pour le calcul de la dénaturation, et de rendre le problème de la simulation de la dénaturation soluble. [0058] Selon un autre aspect, il est proposé un procédé de fabrication d’un kit pour la caractérisation de microorganismes compris dans un échantillon par utilisation d’une réaction d’amplification en chaine par polymérase, ledit kit comprenant une pluralité d’amorces validées, procédé dans lequel la pluralités d’amorces et le vecteur de concentrations pour ladite pluralité d’amorces sont obtenus par un procédé de simulation tel que défini dans les présentes. [0059] Ceci permet de fabriquer un dispositif reproduisant la réaction telle que simulée. Le dispositif ainsi produit permettra donc la multiplication des cibles telle qu’elle a été simulée précédemment. [0060] Selon un autre aspect, il est proposé un kit pour l’amplification en chaîne par polymérase fabriqué par un procédé tel que défini dans les présentes. [0061] Selon un autre aspect, il est proposé un programme informatique comportant des instructions pour la mise en œuvre de tout ou partie d’un procédé tel que défini dans les présentes lorsque ce programme est exécuté par un processeur. [0062] Selon un autre aspect, il est proposé un support d’enregistrement non transitoire, lisible par un ordinateur, sur lequel est enregistré un tel programme. [0063] Selon un autre aspect, il est proposé un procédé de caractérisation de microorganismes compris dans un échantillon, comprenant : la préparation de l’échantillon de manière à réaliser sur l’échantillon préparé une PCR, ladite préparation comprenant une étape d’ajout d’un kit fabriqué conformément à un procédé tel que défini dans les présentes; la mise en œuvre de la PCR sur l’échantillon préparé ; la caractérisation des microorganismes en fonction des résultats de la PCR. [0064] Les caractéristiques exposées dans les paragraphes suivants peuvent, optionnellement, être mises en œuvre, indépendamment les unes des autres ou en combinaison les unes avec les autres : [0065] Avantageusement, au moins un duplexe résulte de l’appariement entre deux amorces ; la phase d’élongation simule la concentration de chaque duplexe résultant de l’appariement entre deux amorces en une unique concentration de duplexe élongué résultant de l’appariement entre deux amorces ; les coefficients du tenseur de dénaturation sont définis de manière à répartir chaque concentration de duplexe élongué résultant de l’appariement entre deux amorces en molécules d’acide nucléique sous formes de simples brins correspondant à une élongation du duplexe résultant de l’appariement entre les deux amorces dans les deux sens. [0066] Ceci permet de simplifier la simulation des réactions issues de l’appariement entre deux amorces, afin de réduire encore la complexité de calcul de la simulation. [0067] Avantageusement, pour chaque réaction d’hybridation entre deux amorces : les concentrations de duplexes élongués comprennent une concentration d’un duplexe virtuel élongué égale à la somme des concentrations des duplexes élongués formés par l’élongation dans chacun des deux sens du duplexes formés par l’hybridation des deux amorces ; les coefficients du tenseur de dénaturation des duplexes élongués correspondant à la distribution de la concentration du duplexe virtuel élongué vers chacune des deux amorces, et chacun des deux acides nucléiques sous forme de simple brins résultant de l’élongation dans un des deux sens sont tous égaux à 0,5. [0068] Ceci permet de simuler de manière efficace les réactions résultant d’hybridations entre amorces, tout en limitant la complexité de la simulation. [0069] Avantageusement, pour chaque ensemble de réaction d’hybridations multiples d’un acide nucléique à simple brin par une amorce en plusieurs emplacements respectivement : les concentrations de duplexes et les concentrations de duplexes élongués comprennent respectivement une concentration d’un duplexe virtuel égale à la somme des concentrations des duplexes formés par les réactions d’hybridations multiples, et une concentration d’un duplexe virtuel élongé égale à la somme des concentrations des duplexes élongués formés par l’élongation des duplexes formés par les réactions d’hybridations multiples ; les coefficients du tenseur de dénaturation des duplexes élongués correspondant à la distribution de la concentration du duplexe virtuel élongé vers chaque acide nucléique sous forme de simple brin associé à une des réactions d’hybridation multiple sont respectivement égaux au ratio entre l’énergie d’interaction de la réaction d’hybridation multiple divisée par la somme des énergies d’interactions de toutes les réactions d’hybridations multiples avec ledit acide nucléique à simple brin. [0070] Par « concentration d’un duplexe virtuel », on entend une concentration d’un duplexe ne correspondant pas à une molécule réelle, mais à plusieurs duplexes résultant de l’hybridation d’une même amorce sur une même molécule d’acide nucléique sous forme de simple brin en plusieurs emplacements distincts. La concentration du duplexe virtuel est alors égale à la somme des concentrations des duplexes réels créés par les réaction d’hybridation de l’amorce avec la molécule d’acide nucléique sous forme de simple brin dans les différentes positions. [0071] Par « concentration d’un duplexe virtuel élongué », on entend une concentration d’un duplexe élongué ne correspondant pas à une molécule réelle, mais à plusieurs duplexes élongués résultant de l’hybridation d’une même amorce sur une même molécule d’acide nucléique sous forme de simple brin en plusieurs emplacements distincts, puis de l’élongation des duplexes ainsi formés. La concentration du duplexe virtuel élongé est alors égale à la somme des concentrations des duplexes réels élongués créés par les réaction d’hybridation de l’amorce avec la molécule d’acide nucléique sous forme de simple brin dans les différentes positions, puis l’élongation des duplexes ainsi formés. [0072] On entend par « acide nucléique sous forme simple brin associé à une des réactions d’hybridation multiple » l’acide nucléique résultant de la dénaturation d’un duplexe élongué lui-même issu de l’élongation du duplexe formé par une des hybridations multiple, c’est-à-dire une hybridation de l’amorce en un emplacement particulier. [0073] Ceci permet de simuler des hybridations multiples avec un même acide nucléique comme s’il s’agissait d’une réaction unique, tout en obtenant une estimation fiable des concentrations d’acides nucléiques générés par ces hybridations multiples en fin de cycle. [0074] Ceci permet donc de faciliter considérablement, voire de rendre possibles, les calculs de l’évolution des concentrations, tout en conservant une précision satisfaisante de la simulation. [0075] Avantageusement, la phase d’élongation comprend : l’obtention des concentrations des duplexes élongués par multiplication des concentrations des duplexes par des coefficients d’élongation. [0076] On entend par « coefficient d’élongation » la fraction, comprise entre 0 et 1, des molécules d’un duplexe donné qui sont élongués durant une phase d’élongation. [0077] Ceci permet de prendre en compte chaque différence possible du processus d’élongation des différents duplexes. [0078] Avantageusement, la phase d’élongation comprend de plus la mise à jour du vecteur de concentration des duplexes, représentant à l’issue de la phase d’élongation la concentration des duplexes non-élongués ; la phase de dénaturation comprend de plus la multiplication dudit vecteur de concentration des duplexes par un tenseur de dénaturation des duplexes non-élongués pour mettre à jour la valeur initiale pour le cycle suivant du vecteur de concentrations de la pluralité de molécules d’acide nucléique sous forme de simples brins. [0079] Ceci permet de simuler la dénaturation des duplexes qui n’ont pas été élongués, et d’intégrer les concentrations de duplexes non-élongués et dénaturés dans les conditions initiales du cycle suivant. [0080] L’analyse du tenseur permet également de s’assurer que la dénaturation est sous contrôle. [0081] Avantageusement, lors de la phase de dénaturation, un même coefficient de dénaturation est appliqué à un duplexe non-élongé et au duplexe élongé correspondant pour mettre à jour le vecteur de concentrations de la pluralité de molécules d’acide nucléique sous forme de simples brins, et les concentrations de duplexes pour le cycle suivant. [0082] On entend par « coefficient de dénaturation » la fraction, comprise entre 0 et 1, des molécules d’un duplexe donné qui sont dénaturées durant une phase de dénaturation. [0083] Ceci permet de simuler de manière précise la phase de dénaturation. [0084] Avantageusement, le procédé comprend une étape ultérieure de validation ou de modification de la pluralité d’amorces et de la valeur initiale du vecteur de concentrations pour ladite pluralité d’amorces au premier cycle de la réaction par comparaison d’une valeur représentative de la cinétique d’une réaction à un seuil. [0085] Ceci permet de valider que les amorces initialement présentes, et concentrations associées, permettent bien la multiplication des cibles désirées avec une cinétique de réaction suffisamment forte, et d’éviter la génération de réactions non souhaitées avec une cinétique forte ou au contraire modifier la liste des amorces et/ou leur concentrations. [0086] Avantageusement, l’échantillon est prélevé sur un animal ou un être humain, ledit procédé comprenant le choix d’un antimicrobien en fonction de la caractérisation des microorganismes présent dans ledit échantillon, et l’administration dudit anti-microbien audit animal ou être humain. [0087] Avantageusement, l’échantillon est prélevé sur un objet inanimé, ledit procédé comprenant le choix d’un antimicrobien en fonction de la caractérisation des microorganismes présent dans ledit échantillon, et l’application dudit anti-microbien audit objet inanimé. Brève description des dessins [0088] D’autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels : Fig.1 [0089] [Fig. 1] montre des exemples de kit pour l’amplification en chaîne par polymérase pour la fabrication duquel l’invention peut être mise en œuvre. Fig.2 [0090] [Fig.2] montre un exemple de réaction d’amplification en chaîne par polymérase pouvant être simulée selon un ensemble de modes de réalisation. Fig.3 [0091] [Fig.3] montre un exemple de variation de température au cours d’un cycle d’amplification PCR Fig.4 [0092] [Fig.4] montre un exemple d’une méthode selon un ensemble de modes de réalisation de l’invention. Fig.5 [0093] [Fig. 5] montre un exemple d’une phase d’hybridation dans un ensemble de modes de réalisation de l’invention. Fig.6 [0094] [Fig. 6] montre un exemple d’une phase de dénaturation dans un ensemble de modes de réalisation de l’invention. Fig.7 [0095] [Fig.7] montre un exemple de réactions d’hybridation, élongation et dénaturation sur 3 cycles successifs d’amplification PCR dans un ensemble de modes de réalisation de l’invention. Fig.8 [0096] [Fig.8] montre un exemple d’une méthode selon un ensemble de modes de réalisation de l’invention intégrant une validation ou modification des paramètres de l’amplification PCR. Fig.9 [0097] [Fig.9] montre un exemple d’une méthode selon un ensemble de modes de réalisation de l’invention intégrant une validation ou modification des paramètres de l’amplification PCR, et une fabrication d’un kit d’amplification PCR validé. Fig.10 [0098] [Fig.10] montre un exemple d’une méthode de caractérisation d’un microorganisme utilisant un kit d’amplification PCR fabriqué selon un ensemble de modes de réalisation de l’invention. Fig.11 [0099] [Fig.11] montre un exemple de visualisation de la cinétique de plusieurs réaction PCR selon un ensemble de modes de réalisation de l’invention. Fig.12 [0100] [Fig.12] montre un exemple de visualisation de la cinétique de plusieurs réaction PCR dans deux conditions expérimentales distinctes selon un ensemble de modes de réalisation de l’invention. Description des modes de réalisation [0101] Il est maintenant fait référence à la figure 1. [0102] La figure 1 représente un exemple de kit K1 pour l’amplification en chaîne par polymérase pour la fabrication duquel l’invention peut être mise en œuvre, par exemple un kit utilisé pour les plateformes FilmArray et Spotfire fabriquées et commercialisées par la Demanderesse. Un tel kit est par exemple décrit dans le document US 8,394,608 ou US 9932634 incorporé par référence. [0103] Le kit K1 fait partie d’un équipement de test Tst1 ayant pour but de tester la présence d’un ou plusieurs microorganismes, par exemple par un ou plusieurs virus, bactéries, champignons et gènes de résistances à des antibiotiques. [0104] A cet effet, l’équipement de test Tst1 comprend un écouvillon Ecv1 permettant d’effectuer un prélèvement nasal sur un patient. [0105] L’échantillon peut ensuite être fourni en entrée du kit K1 afin d’effectuer une amplification PCR, afin d’amplifier un ou plusieurs acides nucléiques représentatifs du ou des microorganismes dont la présence est recherchée, par exemple telle que décrite dans les documents susvisés . Ainsi, même si la concentration initiale de microorganismes dans l’échantillon prélevée est faible, la quantité d’acide nucléique en sortie de l’amplification PCR sera suffisante pour détecter leur présence, et donc par exemple la présence du ou des microorganismes dans l’échantillon prélevé. [0106] Au fur et à mesure de l’amplification PCR, les amplicons peuvent générer une fluorescence de plus en plus importante, par exemple via l’intégration de fluorophores par la formation d’une séquence double-brin le nombre de séquences double-brin intégrant des fluorophores augmentant avec l’amplification. [0107] Le kit de test Tst1 permet donc de détecter la présence de microorganismes, même si leur concentration dans l’échantillon initial est très faible. [0108] Le kit de test Tst1 est fourni à titre d’exemple non-limitatif uniquement, et l’invention pourra être appliquée à différents types de kit de tests, associés à différents moyens de prélèvement. Par exemple, le prélèvement pourra s’effectuer sur un être humain, un animal ou encore un objet inanimé, et pourra aboutir à la caractérisation d’un ou plusieurs microorganismes. La caractérisation d’un ou des microorganismes pourra permettre le choix d’un antimicrobien, en vue de son administration à un être humain ou un animal, ou son application à l’objet inanimé. De manière similaire l'invention s'applique à l'étape d'amplification par PCR d'une partie ciblée de génomes avant leur séquençage complet, par exemple une amplification de portion r16S dans le cadre d'une identification métagénomique microbienne. [0109] La figure 2 montre un exemple de réaction d’amplification en chaîne par polymérase pouvant être simulée selon un ensemble de modes de réalisation. [0110] La réaction d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) comprend plusieurs cycles successifs Cyc21, Cyc22, Cyc23…Cyc2n. Afin d’améliorer la lisibilité de la figure, seul le premier cycle Cyc21 sera détaillé. [0111] La réaction PCR2 s’effectue dans un kit PCR, par exemple au sein du kit K1. Le kit PCR contient initialement : - des acides nucléiques d’une ou plusieurs séquences à amplifier, ou « cible », par exemple la cible Cib2 représentée en figure 2. Les acides nucléiques des séquences à amplifier peuvent être initialement issus d’un prélèvement, par exemple via l’écouvillon Ecv1 ; - des nucléotides dNTP2 ; - de la polymérase PolyM2 ; - des amorces (en anglais « primers ») AM2. [0112] La réaction PCR représentée ici est une réaction dite « singleplexe » visant à amplifier une unique cible Cib2. Cependant, l’invention n’est pas restreinte à cet exemple, et peut également s’appliquer à des réactions dites « multiplexes » visant à amplifier simultanément plusieurs cibles distinctes. [0113] Chaque cycle d’amplification PCR comprend : - une phase de dénaturation, notée Denat21 pour le cycle Cyc21, au cours de laquelle les acides nucléiques sous forme de doubles brins sont séparés en deux acides nucléiques sous forme de simples brins. Dans l’exemple du cycle Cyc21, une cible Cib2 est initialement présente sous forme d’acide nucléique à doubles brins. Lors de la phase de dénaturation, elle est séparée en deux acides nucléiques sous forme de simple brins Nuc21 et Nuc22 ; - une phase d’hybridation, notée Hybr21 pour le cycle Cyc21, au cours de laquelle des amorces viennent s’hybrider aux acides nucléiques sous forme de simple brins. Dans l’exemple de la phase Hybr21, les amorces AM21 et AM22 viennent respectivement s’hybrider avec les acides nucléiques sous forme de simples brins Nuc21 et Nuc22 ; - une phase d’élongation, notée Elong21 pour le cycle 21, au cours de laquelle des nucléotides viennent compléter les amorces pour former des acides nucléiques sous forme de doubles brins identiques à la cible initiale, nommés amplicons, Amp21 et Amp22 dans le cas de la phase Elong21. [0114] Ainsi, à l’issue d’un cycle d’amplification PCR, une unique cible Cib2 a permis de générer deux amplicons identiques Amp21 et Amp22, qui pourront eux-mêmes être dupliqués au cycle suivant. A chaque cycle d’amplification, les amplicons sont ainsi dupliqués : une unique cible Cib2 entraîne la génération de deux amplicons à l’issue du 1e cycle Cyc21, quatre amplicons à l’issue du 2e cycle Cyc22, huit amplicons à l’issue du 3e cycle Cyc23, etc. [0115] Il convient de noter que l’amplification représentée en figure 2 est fournie à titre d’exemple non-limitatif uniquement d’une amplification pouvant être simulée par l’invention. [0116] D’autres amplifications peuvent être simulées, comme par exemple une amplification multiplexe multipliant différents types de cibles. Il a été décrit l'application de l'invention à une PCR particulière. L'invention s'applique à une séquence d'un nombre quelconque de PCRS, l'entrée d'une PCR consistant en la sortie de la PCR précédente. [0117] L’ordre des phases peut également être différent. Par exemple, la simulation peut démarrer pour chaque cycle avec la phase d’hybridation plutôt que la phase de dénaturation. Dans ce cas, un cycle sera représenté par une phase d’hybridation, suivie d’une phase d’élongation et enfin une phase de dénaturation. [0118] Il est maintenant fait référence à la figure 3. [0119] La figure 3 représente un exemple de variation de température au cours d’un cycle d’amplification PCR. [0120] Le graphe Grph3 représente plus précisément l’évolution de la température en fonction du temps, pour un exemple de deux cycles successifs Cyc31 et Cyc32 d’amplification PCR. En effet, les différentes phases de l’amplification PCR sont activées par des variations de températures dans le kit d’amplification. Dans cet exemple, le profil de température est identique entre les cycles, et sera détaillé pour le cycle cyc31. [0121] De manière générale, la température évolue de la manière suivante lors d’un cycle d’amplification PCR : - elle est initialement à une première température lors de la phase d’hybridation, simultanée avec la phase d’élongation ; - puis augmente rapidement pour atteindre une deuxième température, plus élevée, déclenchant la phase de dénaturation, avant de redescendre au niveau de la première température pour la phase d’hybridation du cycle suivant. [0122] Dans l’exemple du cycle Cyc31 : - les phases d’hybridation et d’élongations Hybr31 sont activées par une première température de 60° pendant une durée Thybr ; - la phase de dénaturation Denat31 est activée par une température plus élevée, dans cet exemple, de 96°. [0123] Les durées et températures représentées dans la figure 3 sont fournies à titre d’exemple non limitatif uniquement, et l’invention est applicable à des amplifications PCR réalisées pour des durées et températures très différentes. Si dans l’exemple de la figure 3 les phases d’hybridation et d’élongations sont simultanées, dans d’autres réactions d’amplification PCR, trois températures distinctes sont utilisées pour déclencher respectivement les phases d’hybridation, d’élongation et de dénaturation. Les températures et durées des différentes phases influent sur la réaction d’amplification. [0124] La ou les réactions d’amplification sont donc impactées par de nombreux paramètres tels que : - les températures et durée de chaque phase de la réaction (pouvant être fixes ou varier selon les cycles) ; - le choix et les concentrations des amorces ; - les concentrations de sels monovalents et divalents ; - la longueur des amplicons attendus ; - etc ; [0125] Ces différents facteurs peuvent également favoriser des réactions inattendues telles que par exemple : - la formation de dimères d’amorces, lorsque deux amorces s’hybrident mutuellement ; - des réactions de multi-hybridation lorsque des amorces s’hybrident non seulement à une extrémité d’un acide nucléique sous forme de simple brins, mais également à d’autres emplacements, par exemple au milieu d’un brin. Dans ce cas l’élongation s’effectuera sur une partie seulement du brin, et donnera lieu à la création d'un nouvel amplicon.. [0126] Les paramètres de l’amplification peuvent donc faciliter, ou au contraire ralentir une amplification souhaitée, dite réaction spécifique, voire empêcher le bon développement d’une réaction, lorsque des réactions non souhaitées / inattendues, dites réactions non spécifiques, lui font obstacle. L’un des objectifs de la simulation d’une réaction d’amplification PCR est donc de modéliser de manière aussi précise que possible la réaction d’amplification en fonction des paramètres environnementaux de la réaction, afin de valider, ou au contraire de modifier le design d’un kit (c’est- à-dire les valeurs de paramètres utilisés pour favoriser une réaction d’amplification donnée – e.g choix et concentration des amorces, température et durée des phases de réaction, concentration des sels, etc.). [0127] Cependant, la complexité de la cinétique des réactions d’amplification PCR, et notamment l’interaction entre de nombreux produits et sous-produits de réaction, rend une telle simulation difficile en pratique. L’un des objectifs de la divulgation est donc de fournir une méthode de simulation d’une réaction d’amplification PCR pouvant être mise en œuvre en pratique pour simuler une réaction PCR selon des paramètres donnés, et valider ou modifier en fonction les paramètres de la réaction. [0128] La figure 4 montre un exemple d’une méthode selon un ensemble de modes de réalisation de l’invention. [0129] Le procédé P4 est un procédé de simulation numérique d’une amplification en chaîne par polymérase d’au moins une cible. Selon différents modes de réalisation de l’invention, il peut s’agir d’une amplification d’une cible unique, ou amplification « singleplexe », ou d’une amplification d’une pluralité de cibles, ou amplification « multiplexe ». [0130] La simulation comprend une pluralité de cycles successifs d’amplification, chaque cycle comprenant successivement une phase d’hybridation S41, une phase d’élongation S42 et une phase de dénaturation S43. [0131] La simulation peut être effectuée pour un nombre limité de cycles. Par exemple, chaque cycle peut être identifié par un index de cycle ncyc, incrémenté lors d’une étape S45 entre chaque cycle. [0132] A l’issue de chaque cycle, un critère d’arrêt peut être vérifié. Par exemple : - la simulation peut être effectuée pendant un nombre de cycle prédéfini NCyc. Dans ce cas, à l’issue de chaque cycle, l’index du cycle ncyc peut être comparé au nombre de cycle prédéfini NCyc, et le critère validé si ncyc >= NCyc (ou au contraire, un nouveau cycle enclenché si ncyc < NCyc) ; - les concentration des amplicons peuvent être comparées entre deux cycles, et la simulation stoppée lorsqu’un nombre de cycle minimal est atteint, et que la différence entre les concentrations des amplicons à l’issue de deux cycles successifs est inférieure à un seuil prédéfinie. Autrement dit, ce critère consiste à détecter le cycle à partir duquel la réaction est considérée comme terminée ; - la simulation peut être arrêtée dès que la concentration d’un amplicon donné est supérieure à un seuil, par exemple un seuil de détectabilité de l’amplicon ; - etc. [0133] La figure 4 représente un exemple où le critère d’arrêt est l’atteinte d’un nombre de cycles NCyc. Cependant, cet exemple est fourni à titre d’exemple non limitatif uniquement. Comme indiqué ci-dessus, un ou plusieurs critères différents peuvent être utilisés pour détecter la fin de la simulation. [0134] Dans la suite de la description, plusieurs exemples de simulation seront décrits, en utilisant certaines notations introduites ci-dessous. [0135] Les concentrations des molécules d’intérêt seront notées dans un vecteur noté ^̅^ représenté ci-dessous :
Figure imgf000019_0001
Équation 1 [0136] Dans le vecteur ci-dessus, les éléments ^^ ^^ ^^1, … ^^ ^^ ^^ ^^ représentent les concentrations des amplicons possibles (spécifiques et non spécifiques) produits durant l’amplification PCR. Il est à noter ici que, les cibles et amplicons correspondant à la même molécule, ces valeurs correspondent à la sommes des concentrations des cibles et amplicons pour une cible donnée. Les éléments ^^ ^^1, … ^^ ^^ ^^ représentent quant à eux les concentrations des amorces possibles. Les unités des éléments du vecteur peuvent être des mol.L-1. [0137] La pluralité de molécules dont les concentrations sont notées dans le vecteur ^̅^ peuvent être obtenues de différentes manières, et inclut notamment la concentration des amplicons, et de la pluralité d’amorces présente dans le kit simulé. [0138] Par exemple, la pluralité de molécules dont les concentrations sont notées dans le vecteur ^̅^ peut être issue d’une liste de molécules définie par un utilisateur expert. [0139] Cependant, il peut être difficile d’estimer a priori l’ensemble des molécules se formant lors d’une réaction PCR, compte tenu de l’ensemble des réactions possibles, par exemple entre sous- produits de réactions. [0140] A cet effet, la pluralité de molécules dont la concentration est notée dans le vecteur ^̅^ est déterminée par le biais d’une simulation initiale d’un nombre limité de cycles. Cette simulation initiale a pour unique but de déterminer les molécules présentes dans le kit d’amplification au bout du nombre limité de cycles, indépendamment de leur concentration. [0141] A cet effet, la pluralité de molécules peut être initialisée comme les molécules initialement présentes dans l’amplification en chaîne par polymérase (notamment amplicons et amorces), puis la simulation initiale peut comprendre la simulation d’une pluralité de cycle successifs des étapes suivantes: - obtention des réactions d’hybridation des molécules formant chaque paire de molécules parmi ladite pluralité de molécules ayant une affinité inférieure à un seuil (ou supérieure en valeur absolue, les affinités étant des valeurs négatives). Dit autrement, cette étape consiste à identifier, à partir des molécules initialement présentes dans le cycle de la simulation initiale, les paires de molécules ayant une affinité inférieur à un seuil (ou supérieure en valeur absolue), c’est-à-dire les paires de molécules dont on peut considérer qu’elles vont réagir ensemble ; - simulation d’une phase d’hybridation mettant en œuvre lesdites réactions d’hybridation. Cette phase d’hybridation de simulation initiale consiste uniquement à identifier les duplexes formés par les réactions d’hybridation identifiées ; - simulation d’une phase d’élongation. Cette phase d’hybridation de simulation initiale consiste uniquement à identifier les duplexes élongués obtenus à partir des duplexes identifiés à l’étape précédente; - simulation d’une phase de dénaturation. Cette simulation initiale de la phase de dénaturation consiste à identifier les molécules obtenues par la dénaturation des duplexes, et duplexes élongués, obtenus aux deux étapes précédentes ; - un ajout à ladite pluralité de molécules des molécules additionnelles obtenues à l’issue des phases d’hybridation, d’élongation et de dénaturation. Cette étape consiste à ajouter à la pluralité de molécules les molécules qui sont obtenues à l’issue d’un cycle et qui n’y étaient pas encore présentes. [0142] Ainsi, à chaque cycle, de nouvelles molécules issues des réactions du cycle précédent peuvent être ajoutées à la pluralité de molécules déjà identifiées, ces nouvelles molécules étant elles-mêmes susceptibles de générer de nouvelles réactions. Ainsi, il est possible au bout d’un nombre limité de cycles de simulation initial de connaître l’ensemble des molécules qui pourront jouer un rôle significatif dans la simulation. [0143] Le nombre de cycles de la simulation initiale peut être défini de différentes manières. Par exemple : - il peut s’agir d’un nombre de cycles prédéfini de simulation initiale ; - le nombre de molécules ajoutées à l’issue de chaque cycle peut être compté, et la simulation initiale peut être stoppée lorsque le nombre de molécules ajoutées à l’issue d’un cycle donné est nul ou faible, par exemple si le nombre de molécules ajoutées est inférieur à un seuil donné. - Etc. [0144] Les inventeurs ont constaté que le nombre de cycles de simulation initiale peut être compris entre 3 et 7, et par exemple égale à 5, nombre suffisant pour obtenir une liste définitive de molécules ayant un impact significatif sur les résultats de la PCR. [0145] Ceci fournit un bon compromis entre le nombre de molécules ajoutées et leur importance. Par exemple, des molécules ajoutées après le 3e, 5e ou 7e cycle peuvent être considérées comme non susceptibles de donner lieu à des réactions significatives. Un nombre de cycle prédéfini compris entre 3 et 7, et par exemple égale à 5 permet donc de limiter le nombre de molécules pour la simulation, et réduire la complexité de calcul associée, tout en préservant la fiabilité de la simulation. [0146] Par ailleurs, une simulation sur un nombre limité de cycles est suffisante, car les molécules qui n’apparaîtraient qu’au bout de quelques cycles ne seraient pas susceptibles de générer des réactions significatives, par rapport à des réactions ayant déjà démarré depuis plusieurs cycles. En effet, leur concentration très faible comparativement aux molécules déjà présentes avec lesquelles elles sont en compétition dans le mélange ne leur permet pas de se multiplier de manière significative. [0147] Cette simulation initiale permet donc de ne prendre en compte que les molécules qui seront effectivement rencontrées en nombre significatif lors de la réaction d’amplification. Ceci permet donc une simulation à la fois plus fiable et moins gourmande en ressources de la réaction. [0148] Il est maintenant fait référence à la figure 5. [0149] La figure 5 représente un exemple d’une phase d’hybridation dans un ensemble de modes de réalisation de l’invention. [0150] Dans l’exemple de la figure 5, la phase d’hybridation S41 pour un cycle donné comprend une première sous-étape S411 d’obtention d’une valeur initiale ^̅^0 pour le cycle d’un vecteur de concentrations d’une pluralité de molécules d’acide nucléique sous forme de simples brins comprenant la pluralité d’amplicons et la pluralité d’amorces. [0151] Le vecteur de concentrations peut par exemple être le vecteur ^̅^ mentionné plus haut. La valeur initiale ^̅^0 du vecteur peut par exemple correspondre : - aux concentrations initiales des molécules avant le démarrage de la réaction d’amplification, si le cycle simulé est le premier cycle ; et 0 pour les molécules apparaissant aux cyles suivants - aux concentrations des molécules à l’issue du cycle précédent, si le cycle n’est pas le premier cycle. [0152] La simulation de la phase d’hybridation a alors pour but de modéliser les réactions d’hybridation ayant lieu au cours du cycle. L’hybridation est régie par des relations d’équilibre suivantes entre chaque paire de molécules ^^ ^^ et ^^ ^^ susceptibles de s’hybrider : Équation 2 [0153] Il convient ici de noter qu’une telle équation doit donc être établie en tenant compte pour chaque réaction d’hybridation possible entre une paire de molécules d’indices i et j (i et j pouvant être égaux), en fonction des molécules présentes dans le vecteur ^̅^. [0154] Ces équations d’équilibre peuvent être ré-écrites sous la forme des équations différentielles suivantes :
Figure imgf000022_0001
Équation 3 [0155] Dans les équations ci-dessus : - les notations ^^ ^^ et ^^ ^^ désignent respectivement les concentrations d’une paire de molécules d’acide nucléique sous forme de simple brins d’indices i et j dans le vecteur ^̅^ intervenant dans une réaction d’hybridation donnée; - la notation ^^ ^^ ^^ désigne la concentration d’un duplexe formés par l’hybridation de la paire de molécules d’acide nucléique sous forme de simple brins d’indices i et j dans le vecteur ^̅^ ; - les notations ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ et ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ désignent respectivement les constantes d’association et de dissociation de la réaction d’hybridation de la paire de molécules d’acide nucléique sous forme de simples brins d’indices i et j dans le vecteur ^̅^ . [0156] Les équations différentielles notées ci-dessus s’appliquent à chaque réaction entre une paire de molécules du vecteur ^̅^ dont on considère qu’elles produisent une réaction d’hybridation. Le nombre d’équations différentielles peut donc dans certains cas s’avérer très élevé. [0157] Ces paires de molécules dont on considère qu’elles produisent une réaction d’hybridation peuvent par exemple être celles dont la réaction d’hybridation est associée à une variation d’enthalpie libre ΔG inférieure à un seuil prédéfini (ou supérieure en valeur absolue, la variation d’enthalpie libre étant négative). [0158] Ainsi, seules les réactions d’hybridation dominantes seront prises en compte dans la simulation. Ceci permet à la fois d’obtenir une meilleure précision de la cinétique des réactions d’hybridation, et de diminuer la complexité de résolution du système d’équations différentielles. Ceci permet également de tenir compte des dynamiques différentielles entre les différentes réactions suivant que la valeur d’enthalpie libre est plus ou moins favorable entre deux réactions d’intérêt. [0159] Le seuil prédéfini peut être identique pour toutes les réactions, ou choisi parmi différents seuils en fonction des cas. Par exemple, la valeur du seuil peut être choisie parmi au moins deux valeurs de seuil prédéfinies, la valeur de seuil la plus faible étant réservée aux paires de molécules comprenant un amplicon et une amorce appariés. [0160] Dit autrement, le seuil de variation d’enthalpie libre au-dessus duquel une réaction d’hybridation n’est pas prise en compte dans la simulation est plus faible (plus proche de 0) pour les réactions d’hybridation entre un amplicon et une amorce que pour les autres (et donc également plus faible en valeur absolue, les seuils de variation d’enthalpie libre étant négatifs). Ceci permet de prendre en compte de manière préférentielle dans la simulation les hybridations entre les amorces et les amplicons d’une part, et les amorces et d’autres amorces d’autre part, ce qui permet de simuler les premiers cycles d’hybridation amplicon-amorce, au cours desquels la concentration des amplicons est beaucoup plus faible que celle des amorces [0161] Dans un ensemble de modes de réalisation de l’invention, les équations différentielles intègrent des équations de conservation de masse de la forme suivante :
Figure imgf000023_0001
Équation 5 [0162] Dans lesquelles : - ^^∗ représente le temps écoulé depuis le début de la phase d’hybridation ; - les notations ^^ ^^ et ^^ ^^ désignent respectivement les concentrations de deux molécules d’acide nucléique sous forme de simple brins d’indices i et j dans le vecteur ^̅^ de concentrations d’une pluralité de molécules d’acide nucléique ; - la notation ^^ ^^ ^^ désigne la concentration d’un duplexe formé par l’hybridation de la paire de molécules d’acide nucléique sous forme de simple brins d’indices x et y dans le vecteur ^̅^ de concentrations d’une pluralité de molécules d’acide nucléique ; - les notations ^^ ^^0 et ^^ ^^0 désignent les valeurs de ^^ ^^ et ^^ ^^ à ^^∗ = 0. [0163] Les équations ci-dessus lient les concentrations de chaque molécule d’acide nucléique sous forme de simple brins aux concentrations de l’ensemble des duplexes à la formation desquels elles contribuent via des réactions d’hybridation, pour mettre en évidence qu’une réaction d’hybridation ne modifie pas le nombre total de simples brins de chaque type. Une équation de conservation de la masse de ce type peut être établie pour chaque molécule d’acide nucléique sous forme de simple brin présente dans le vecteur ^̅^. [0164] Il convient de noter que les équations de conservation de la masse notées ci-dessus sont fournies à titre d’exemple non-limitatif uniquement. Selon différents modes de réalisation de l’invention, des formulations équivalentes d’équations de conservation de la masse, c’est-à-dire d’autres équations traduisant que l’évolution des concentrations des molécules d’acide nucléique sous forme de simples brins et de duplexes ne modifie pas le nombre total de simples brins de chaque type, peuvent être utilisées. [0165] L’intégration des équations de conservation de masse dans les équations différentielles permet de compléter les équations permettant la simulation plus précise de la phase d’hybridation, afin d’obtenir autant d’équations que d’inconnues. [0166] L’injection, dans une équation différentielle d’une réaction d’hybridation entre une paire de molécules d’acide nucléique sous forme de simple brin telle que l’équation 3, des deux équations de conservations de la masse des deux molécules de la paire permet de réécrire l’équation sous la forme suivante :
Figure imgf000024_0001
Équation 6 [0167] Afin de résoudre le système d’équations différentielles, l’un des principes de la simulation de la phase d’hybridation telle que représentée en figure 5 est de représenter ces équations sous forme d’une équation différentielle matricielle. [0168] A cet effet, dans l’exemple de la figure 5 la simulation de la phase d’hybridation S41 comprend une sous deuxième étape S412 d’initialisation d’une matrice de concentrations ^^ , ou ^^ des duplexes formés par l’hybridation de la pluralité de molécules d’acide nucléique sous forme de simples brins. [0169] La matrice peut-être une matrice N x N (N étant la longueur du vecteur ^̅^ ) formée de la manière suivante : - chaque ligne et chaque colonne correspond à une molécule d’acide nucléique ; - chaque cellule comprend la concentration du duplexe formé par l’hybridation de la paire de molécules d’acides nucléiques de la ligne et de la colonne auxquelles la cellule appartient. Une forme triangulaire peut être adoptée pour ne compter qu’une seule fois la concentration d’un duplexe donné, qui serait sinon compté à la fois dans une cellule de coordonnées i,j et j,i. [0170] La matrice ^^ peut donc s’écrire:
Figure imgf000025_0001
Équation 7 [0171] Dans l’exemple de la figure 5, la phase d’hybridation S41 pour un cycle donné comprend ensuite une troisième sous-étape S413 de calcul, par pas de temps successifs, de l’évolution de la matrice de concentrations au cours de la phase d’hybridation, par l’application à la matrice de concentrations d’une équation différentielle matricielle représentant la cinétique de formation desdits duplexes en fonction des concentrations de la pluralité de molécules d’acide nucléique sous forme de simples brins. [0172] Le calcul de l’évolution de la matrice peut par exemple s’effectuer de la manière suivante : - le calcul est effectué pour un nombre de pas de temps Npdt correspondant à la durée de la phase d’hybridation. Un pas de temps peut par exemple avoir une durée comprise entre 1 et 10 millisecondes. Un pas de temps pourra par exemple être choisi pour trouver un compromis entre convergence du calcul, vitesse de calcul et précision du résultat ; - un indice de pas de temps npdt est initialisé à 1 ; - à chaque pas de temps, la sous-étape S413 de calcul de l’évolution de la matrice de concentrations est effectuée ; - à l’issue du calcul, une sous-étape S414 vérifie que l’indice du pas de temps npdt est bien inférieur au nombre de pas de temps Npdt ; - si l’indice du pas de temps npdt est inférieur au nombre de pas de temps Npdt, l’indice du pas de temps npdt est incrémenté à la sous-étape S412, puis une nouvelle itération de la sous-étape S413 de calcul l’évolution de la matrice de concentrations est effectuée ; - lorsque l’indice du pas de temps npdt est égal au nombre de pas de temps Npdt, la simulation de la phase d’hybridation est terminée, et la simulation de la phase d’élongation S42 est enclenchée. [0173] Ainsi, la simulation de la phase d’hybridation peut se faire par la simulation de Npdt pas de temps successifs des réactions d’hybridation, chaque pas de temps comprenant le calcul de l’équation différentielle matricielle sur la base des concentrations des molécules dans le vecteur ^̅^ à l’issue du pas de temps précédent. [0174] Cet exemple de boucle de calculs successifs est fourni à titre d’exemple non-limitatif uniquement d’une boucle de calcul de la phase d’hybridation. De manière plus générale, toute boucle de calcul permettant de simuler la phase d’hybridation selon le nombre de pas de temps souhaité peut être utilisé dans le cadre de l’invention. Par exemple, l’indice de pas de temps peut être initialisé à 0 et la condition de sortie de la boucle à l’étape S414 adaptée, etc. [0175] L’équation différentielle matricielle est paramétrée par au moins une matrice d’association comprenant les constantes d’associations associées à chaque duplexe et au moins une matrice de dissociation comprenant les constantes de dissociation associées à chaque duplexe. [0176] Les matrices d’association contiennent ainsi tous les coefficients d’association intervenant dans les équations 3 et 5. Les coefficients d’association et de dissociation peuvent être intégrés dans les matrices d’association et de dissociation selon le même principe que les concentrations dans la matrice ^^ (e.g les matrices d’association et de dissociations sont des matrices carrées dans lesquelles chaque ligne et chaque colonne correspondent à des molécules, chaque cellule de la ou des matrice(s) d’association comprend la constante d’association entre les molécules de la ligne et de la colonne vers un duplexe partiel, et chaque cellule de la matrice de dissociation comprend la constante de dissociation associée à la réaction de dissociation du duplexe vers la paire de molécules associées à la ligne et la colonne). [0177] Les matrices d’association et de dissociation peuvent donc s’écrire respectivement :
Figure imgf000026_0001
Équation 8 Pour la matrice d’association, et :
Figure imgf000026_0002
Équation 9 Pour la matrice de dissociation. [0178] Les unités des constantes d’association peuvent être des m3.mol-1.s-1 (ou L.mol-1.s-1), alors que les unités des constantes de dissociation peuvent être des s-1. [0179] Comme indiqué ci-dessus, dans un ensemble de modes de réalisation de l’invention, seules certaines réactions d’hybridation sont prises en compte. Dans ce cas, les constantes d’association et de dissociation ne sont donc intégrées que pour les réactions considérées comme suffisamment importantes, c’est-à-dire les réactions qui auront le plus d’impact sur la simulation. Ceci peut par exemple se faire en définissant chaque élément de la matrice d’association, ou chaque élément de la matrice de dissociation associé à une paire de molécules appartenant comme étant : - nul, si la variation d’enthalpie libre (ΔG) associé à la réaction d’hybridation des molécules formant la paire est supérieure à un seuil (ou inférieure en valeur absolue) ; - respectivement égal à une constante d’association, ou à une constante de dissociation de la réaction d’hybridation de la paire de molécule sinon. [0180] Dit autrement, les valeurs des constantes d’association et de dissociation dans les matrices seront égales à 0 pour les réactions moins importantes, par exemple si la variation d’enthalpie libre (ΔG) associé à la réaction d’hybridation des molécules formant la paire est supérieure à un seuil donné (ou inférieure en valeur absolue) . [0181] Ainsi, seules les réactions dominantes seront prises en compte, ce qui permet de réduire la complexité de la simulation, tout en bénéficiant d’une bonne précision de la simulation. [0182] Comme indiqué ci-dessus, le seuil pour prendre en compte une réaction d’hybridation, et donc intégrer les constantes d’association et de dissociation dans les matrices, peut être identique pour toutes les réactions, ou différent selon que la réaction est une réaction d’hybridation amplicon- amorce ou une autre réaction d’hybridation (amorce-amorce par exemple). [0183] L’évolution de la matrice de concentration des duplexes peut donc, grâce aux matrices d’association et de dissociation, être écrite sous forme d’équation différentielle matricielle, et la sous- étape S413 peut ainsi consister en la résolution de l’équation différentielle matricielle pour un pas de temps donné. [0184] La résolution de l’équation différentielle matricielle permet ainsi de modéliser l’ensemble de la dynamique de l’amplification en chaîne, y compris les réactions croisées avec les produits intermédiaires. La résolution d’une unique équation différentielle matricielle permet également la résolution de la cinétique du système à l’aide de capacité de calcul conventionnelles. [0185] La possibilité de simuler de manière complète l’amplification, et notamment les réactions d’hybridation qui n’étaient pas simulées de manière satisfaisante dans les solutions de l’état de l’art, permet ainsi une validation ou au contraire une modification des paramètres influant la réaction d’amplification (concentration initiale des amorces, des sels, durée et température des phases, etc.). [0186] Lorsque les équations de conservation de la masse sont prises en compte, l’équation différentielle matricielle peut s’écrire, en intégrant les équations différentielles telles que l’équation 6 pour chaque réaction :
Figure imgf000027_0001
Équation 10 [0187] Dans laquelle : - H est la matrice de concentration des duplexes ; - T0 est la valeur initiale pour le cycle du vecteur de concentration de la pluralité de molécules ; - Kon est la matrice d’association ; - Koff est la matrice de dissociation ; -
Figure imgf000028_0001
est la matrice identité de taille N - est le produit de Hadamard ; - diag() représente l’opérateur diagonal convertissant une matrice carrée de taille N x N en un vecteur de taille N comprenant tous les éléments de la diagonale de la matrice. Ainsi,
Figure imgf000028_0002
[0188] On peut noter que T a été remplacée par T0 dans l’équation différentielle, ce qui permet d’obtenir des calculs matriciels plus rapides. [0189] Il est maintenant fait référence aux figures 6 et 7. [0190] La figure 6 montre un exemple de deux phases d’élongation et de dénaturation dans un ensemble de modes de réalisation de l’invention. [0191] La figure 7 montre un exemple d’un ensemble de réactions d’hybridation, d’élongation et de dénaturation se déroulant au cours de trois cycles successifs de réaction d’amplification PCR, les réactions représentées en figure 7 permettant de mieux illustrer les étapes des simulations des phases d’élongation et de dénaturation représentées en figure 6. [0192] La figure 7 représente un exemple simplifié d’une réaction d’amplification d’une unique cible. [0193] La figure 7 représente plus spécifiquement des séries de réactions d’hybridation, élongation, dénaturation se produisant dans un contexte donné, avec de nouvelles réactions apparaissant successivement au cycle 2 puis au cycle 3, à mesure que de nouveaux sous-produits sont générés. [0194] Dans l’exemple de la figure 7, la simulation comprend initialement (début de la phase d’hybridation du cycle 1) : - des acides nucléiques sous formes de simple brin « sens » et « anti-sens » de la cible, respectivement ^^ ^^ ^^ ^^ et ^^ ^^ ^^ ^^ ; - une amorce « sens » ^^1 ^^ ^^ ^^, et deux amorces « anti-sens » ^^1 ^^ ^^ ^^ et ^^2 ^^ ^^ ^^ ; [0195] Lors du premier cycle les réactions sont les suivantes : - réaction React71 : ^^ ^^ ^^ ^^ s’apparie avec l’amorce ^^1 ^^ ^^ ^^ en une première position pour donner le duplexe ^^ ^ 1 ^ ^^ ^^ ^^ ^^ , qui sera ensuite élongué en un duplexe élongué ^^ ^ 1 ^ ^ ∗ ^ ^^ ^^ ^^ , qui sera dénaturé en deux acides nucléiques sous forme de simple brin ^^ ^^ ^^ ^^ et ^^ ^^ ^ 1 ^ ^^ ^^ ; - réaction React72 : ^^ ^^ ^^ ^^ s’apparie avec l’amorce ^^1 ^^ ^^ ^^ en une deuxième position pour donner le duplexe ^^ ^ 2 ^ ^^ ^^ ^^ ^^ , qui sera ensuite élongué en un duplexe élongué ^^ ^ 2 ^ ^ ∗ ^ ^^ ^^ ^^ , qui sera dénaturé en deux acides nucléiques sous forme de simple brin ^^ ^^ ^^ ^^ et ^^ ^^ ^ 2 ^ ^^ ^^ . Bien que les molécules appariées soient les mêmes dans les réactions React71 et React72, ces réactions sont distinctes, car l’appariement se fait en deux position distinctes, l’élongation se fait donc sur une distance plus courte dans le cas de la réaction React72. On parle dans ce cas de « multi-hybridation ». Les variations d’enthalpie libre ΔG associée à ces deux réactions peuvent par ailleurs être différentes. Les réactions React71 et React72 génèrent donc respectivement deux molécules sous forme simples brins distinctes ^^ ^^ ^ 1 ^ ^^ ^^ et ^^ ^^ ^ 2 ^ ^^ ^^ ; - réaction React73 : ^^ ^^ ^^ ^^ s’apparie avec l’amorce ^^1 ^^ ^^ ^^ pour donner le duplexe ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^, qui sera ensuite élongué en un duplexe élongué ^^ ^ ∗ ^ ^^ ^^ ^^ ^^ , qui sera dénaturé en deux acides nucléiques sous forme de simple brin ^^ ^^ ^^ ^^ et ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ; - réaction React74 : ^^1 ^^ ^^ ^^ s’apparie avec ^^2 ^^ ^^ ^^ pour donner le duplexe ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ , qui sera ensuite élongué en un duplexe élongué ^^ ^ ∗ ^ ^^ ^^ ^^ ^^ , qui sera dénaturé en deux acides nucléiques sous forme de simple brin ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ et ^^1 ^^ ^^ ^^ ; - réaction React75 : ^^1 ^^ ^^ ^^ s’apparie avec ^^2 ^^ ^^ ^^ pour donner le duplexe ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ , qui sera ensuite élongué en un duplexe élongué ^^ ^ ∗ ^ ^^ ^^ ^^ ^^ , qui sera dénaturé en deux acides nucléiques sous forme de simple brin ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ et ^^2 ^^ ^^ ^^. Bien que les amorces appariées dans les réactions React74 et React75 soient les mêmes, ces réactions sont distinctes, car l’élongation ne se produit pas sur le même brin : dans le cas de la réaction React74 c’est le brin « anti-sens » qui est élongué, alors que dans le cas de la réaction React75 c’est le brin « sens » qui est élongué. [0196] A l’issue de ce deuxième cycle, de nouveaux sous-produits de réaction sont donc ajoutés aux produits déjà présents : ^^ ^^ ^ 1 ^ ^^ ^^ , ^^ ^^ ^ 2 ^ ^^ ^^ , ^^ ^^ ^^ ^^ ^^, ^^ ^^ ^^ ^^ ^^, ^^ ^^ ^^ ^^ ^^. [0197] Au deuxième cycle, la présence de ces nouveaux sous-produits génère 6 nouvelles réactions, en plus des 5 réactions React71 à React75 ayant déjà lieu au premier cycle : - réaction React76 : ^^ ^^ ^ 1 1 ^ ^^ ^^ s’apparie avec l’amorce ^^1 ^^ ^^ ^^ pour donner le duplexe ^^ ^^/ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ qui sera ensuite élongué en un duplexe élongué
Figure imgf000029_0001
^^qui sera dénaturé en deux acides nucléiques sous forme de simple brin ^^ 1 ^^ ^^ ^^ et ^^ ^^ ^ 1 ^ ^^ ^^ ; - réaction React77 : ^^ ^^ ^ 2 ^ ^^ ^^ s’apparie avec l’amorce ^^1 ^^ ^^ ^^ pour donner le duplexe
Figure imgf000029_0002
sera ensuite élongué en un duplexe élongué
Figure imgf000029_0003
^^qui sera dénaturé en deux acides nucléiques sous forme de simple brin ^^ 2 ^^ ^^ ^^ et ^^ ^^ ^ 2 ^ ^^ ^^ ; - réaction React78 : ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ s’apparie avec l’amorce ^^1 ^^ ^^ ^^ en une première position pour donner le duplexe ^^ ^ 1 ^/ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ , qui sera ensuite élongué en un duplexe élongué ^^ ^ 1 ^/ ∗ ^^ ^^ ^^
Figure imgf000030_0001
, qui sera dénaturé en deux acides nucléiques sous forme de simple brin ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ et ^^ 1 ^^ ^^ ^^ ; - réaction React79 : ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ s’apparie avec l’amorce ^^1 ^^ ^^ ^^ en une deuxième position pour donner le duplexe ^^ ^ 2 ^/ ^^ ^^ ^^
Figure imgf000030_0002
, qui sera ensuite élongué en un duplexe élongué ^^ ^ 2 ^/ ∗ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ , qui sera dénaturé en deux acides nucléiques sous forme de simple brin ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ et ^^ 2 ^^ ^^ ^^ . Bien que les molécules appariées soient les mêmes dans les réactions React78 et React79, ces réactions sont distinctes, car l’appariement se fait en deux position distinctes, l’élongation se fait donc sur une distance plus courte dans le cas de la réaction React79. On parle dans ce cas de « multi-hybridation ». Les réactions React78 et React79 génèrent donc respectivement deux molécules sous forme simples brins distinctes ^^ 1 ^^ ^^ ^^ et ^^ 2 ^^ ^^ ^^ ; - réaction React710 : ^^ ^^ ^^ ^^ ^^s’apparie avec ^^2 ^^ ^^ ^^ pour donner le duplexe ^^ ^^/ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ , qui sera ensuite élongué en un duplexe élongué ^^ ∗ ^^/ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ , qui sera dénaturé en deux acides nucléiques sous forme de simple brin ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ et ^^ ^^ ^^ ^^ ^^; - réaction React711 : ^^1 ^^ ^^ ^^ s’apparie avec ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ pour donner le duplexe ^^ ^^/ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^, qui sera ensuite élongué en un duplexe élongué ^^ ∗ ^^/ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ , qui sera dénaturé en deux acides nucléiques sous forme de simple brin ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ et ^^ ^^ ^^ ^^ ^^. Bien que les produits des réactions React710 et React711 soient les mêmes, ces réactions sont distinctes, car les molécules appariées sont différentes et l’élongation ne se produit pas sur le même brin : dans le cas de la réaction React710 c’est le brin « anti-sens » qui est élongué, alors que dans le cas de la réaction React711 c’est le brin « sens » qui est élongué. Il convient également de noter que, bien que ^^ ∗ ^^/ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ et ^^ ∗ ^^/ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ soient considérées pour les besoins de la simulation comme deux molécules différentes associées à deux concentrations différentes, il s’agit en réalité de la même molécule. [0198] A l’issue de ce deuxième cycle, de nouveaux sous-produits de réaction sont donc ajoutés aux produits déjà présents : ^^ 1 ^^ ^^ ^^ , ^^ 2 ^^ ^^ ^^ , ^^ 1 ^^ ^^ ^^ et ^^ 2 ^^ ^^ ^^ [0199] Au troisième cycle, la présence de ces nouveaux sous-produits génère 4 nouvelles réactions, en plus des 11 réactions React71 à React711 ayant déjà lieu au deuxième cycle : - réaction React712 : ^^ 1 ^^ ^^ ^^ s’apparie avec l’amorce ^^1 1 ^^ ^^ ^^ pour donner le duplexe ^^ ^^ ^^ ^^ ^^, qui sera ensuite élongué en un duplexe élongué ^^1∗ ^^ ^^ ^^ ^^, qui sera dénaturé en deux acides nucléiques sous forme de simple brin ^^ 1 ^^ ^^ ^^ et ^^ 1 ^^ ^^ ^^ ; - réaction React713 : ^^ 2 s’apparie avec l’amorce ^^ pour donner le d 2 ^^ ^^ ^^ 1 ^^ ^^ ^^ uplexe ^^ ^^ ^^ ^^ ^^,qui sera ensuite élongué en un duplexe élongué ^^ ^2 ^∗ ^^ ^^ ^^, qui sera dénaturé en deux acides nucléiques sous forme de simple brin ^^ 2 ^^ ^^ ^^ et ^^ 2 ^^ ^^ ^^ ; - réaction React714 : ^^ 1 ^^ ^^ ^^ s’apparie avec l’amorce ^^1 ^^ ^^ ^^ pour donner le duplexe
Figure imgf000031_0001
qui sera ensuite élongué en un duplexe élongué ^^1∗ ^^ ^^ ^^ ^^, qui sera dénaturé en deux acides nucléiques sous forme de simple brin ^^ 1 ^^ ^^ ^^ et ^^ 1 ^^ ^^ ^^ . Bien que les produits des réactions React712 et React714 soient les mêmes, ces réactions sont distinctes, car les molécules appariées sont différentes et l’élongation ne se produit pas sur le même brin : dans le cas de la réaction React712 c’est le brin « anti-sens » qui est élongué, alors que dans le cas de la réaction React714 c’est le brin « sens » qui est élongué. Il convient également de noter que, bien que ^^ ^1 ^∗ 1 ^^
Figure imgf000031_0002
^^ ^^ ^^soient considérées pour les besoins de la simulation comme deux molécules différentes associées à deux concentrations différentes, il s’agit en réalité de la même molécule ; - réaction React715 : ^^ 2 s’apparie avec l’amorce ^^ pour donner le duple 2 ^^ ^^ ^^ 1 ^^ ^^ ^^ xe ^^ ^^ ^^ ^^ ^^,qui sera ensuite élongué en un duplexe élongué ^^ ^2 ^∗ ^^ ^^ ^^, qui sera dénaturé en deux acides nucléiques sous forme de simple brin ^^ 2 ^^ ^^ ^^ et ^^ 2 ^^ ^^ ^^ . Bien que les produits des réactions React713 et React715 soient les mêmes, ces réactions sont distinctes, car les molécules appariées sont différentes et l’élongation ne se produit pas sur le même brin : dans le cas de la réaction React713 c’est le brin « anti-sens » qui est élongué, alors que dans le cas de la réaction React715 c’est le brin « sens » qui est élongué. Il convient également de noter que, bien que
Figure imgf000031_0003
^^ ^^ ^^soient considérées pour les besoins de la simulation comme deux molécules différentes associées à deux concentrations différentes, il s’agit en réalité de la même molécule. [0200] L’un des principes de la simulation des phases d’hybridation et de dénaturation dans les exemples de modes de réalisation de l’invention représentés en figure 6 et exemplifiés en figure 7 consiste à simuler plusieurs réactions d’hybridation multiples (par exemple, les réaction React71 et React72, ou encore les réactions React76 et React77) comme une seule réaction générant plusieurs produits de réaction, puis utiliser un tenseur de dénaturation pour répartir les concentrations des produits des réactions d’hybridation multiple en vue du prochain cycle de simulation. Les concentrations des duplexes et duplexes élongués correspondant à différentes positions d’appariement sont donc représentées par une valeur unique. [0201] L’utilisation d’une unique valeur de concentration pour l’ensemble des duplexes entre une paire de molécules d’acide nucléique quelle que soit la position d’appariement permet de réduire le nombre d’équations à résoudre pour le calcul de la dénaturation, et de rendre le problème de la simulation de la dénaturation soluble. [0202] Dans un ensemble de modes de réalisation de l’invention, certaines réactions résultent de l’appariement entre deux amorces en un duplexe. Dans ce cas, l’élongation peut s’effectuer dans les deux sens. C’est par exemple le cas des réactions React74 et React75. Dans ce cas, dans certains modes de réalisation de l’invention, la phase d’élongation simule l’élongation d’un tel duplexe en un unique duplexe élongué, et les coefficients du tenseur de dénaturation sont définis de sorte que la concentration de l’unique duplexe élongué résultant de l’appariement des deux amorces génère des produits de réaction correspondant aux élongations dans les deux sens. [0203] Ceci permet de simplifier la simulation des réactions issues de l’appariement entre deux amorces, afin de réduire encore la complexité de calcul de la simulation. [0204] Dans l’exemple de la figure 7, les réactions peuvent donc être représentées par les équations suivantes, dans lesquelles : - ^^ ^^ représente une constante d’élongation liée à chaque réaction ; - ^^ ^^ représente une constante de dénaturation liée à chaque réaction ; - ^^ représente les poids respectifs associées aux molécules issues de plusieurs réactions, lorsque pour les besoins de la simulation une concentration de duplexe élongué représente en fait la concentration de plusieurs duplexes distincts ; - les trois flèches successives pour chaque réaction représentent l’hybridation, l’élongation et la dénaturation ; - les molécules à droite de la dernière flèche représentent donc les produits de la dénaturation. Afin d’améliorer la lisibilité des équations, seules les nouvelles molécules ont été indiquées. [0205] Les réactions React71 et React72 peuvent être représentées par l’équation :
Figure imgf000032_0001
Équation 11 [0206] On note que, dans le cas de cette hybridation multiple, les deux concentrations de duplexes ^^1 ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ et ^^2 ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ sont représentées par une unique concentration ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^, les deux concentrations de duplexes élongués ^^ ^1 ^ ^∗ ^ ^^ ^^ ^^ et ^^ ^2 ^ ^∗ ^ ^^ ^^ ^^ sont représentées par une unique concentration ^^ ^∗ ^ ^^ ^^ ^^ ^^, et que l’applications des poids respectifs ^^ dans le tenseur de dénaturation permet de mettre à jour les concentrations des deux molécules ^^ ^^ ^ 1 ^ ^^ ^^ et ^^ ^^ ^ 2 ^ ^^ ^^ à pour prendre en compte les poids respectifs des réactions issues des deux appariements. [0207] La réaction React73 est représentée par l’équation :
Figure imgf000032_0002
Équation 12 [0208] Les réactions React74 et React75 peuvent être représentées par l’équation :
Figure imgf000032_0003
Équation 13 [0209] On note que, dans cette réaction issue de l’appariement de deux amorces (dimère d’amorces), les deux concentrations de duplexes élongués ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^et ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ sont représentées par une unique concentration ^^ ^^ ^^ , les deux concentrations de duplexes élongués ^^ ^ ∗ ^ ^^ ^^ ^^ ^^ et ^^ ^ ∗ ^ ^^ ^^ ^^ ^^ sont représentées par une unique concentration ^^ ^ ∗ ^ ^^ , et que l’application des poids respectifs ^^ dans le tenseur de dénaturation permet de mettre à jour les concentrations des deux molécules ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ et ^^ ^^ ^^ ^^ ^^. [0210] L’utilisation des poids se fait par exemple de la manière suivante : une équation représentant plusieurs réactions, telle que l’équation 13 peut être associée à plusieurs poids, par exemple stockés dans le tenseur de dénaturation, représentant l’importance relative des différentes réactions. Par exemple, pour l’équation 13, les réactions React74 et React75 peuvent être associées respectivement à un poids ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^74 et ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^75. A l’issue de chaque cycle, la concentration unique ^^ ^ ∗ ^ ^^ est répartie en concentrations des produits de la réaction. Par exemple, pour l’équation 13, la concentration de la molécule ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ serait augmentée en fin de cycle de ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^74 * ^^ ^ ∗ ^ ^^ , et la concentration de la molécule ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ serait augmentée en fin de cycle de ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^75 * ^^ ^ ∗ ^ ^^ . La somme des poids ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^74 et ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^75 doit donc être égale à 1, afin que ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^74 et ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^75 représentent l’importance respective des réactions React74 et React75. Par exemple, des poids ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^74 = 0,5 et ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^75 = 0,5 indiqueraient que les réactions React74 et React75 sont aussi fréquentes l’une que l’autre [0211] La réaction React76 est représentée par l’équation :
Figure imgf000033_0001
Équation 14 [0212] La réaction React77 est représentée par l’équation :
Figure imgf000033_0002
Équation 15 [0213] Les réactions React78 et React79 peuvent être représentées par l’équation :
Figure imgf000033_0003
Équation 16 [0214] On note que, dans le cas de cette hybridation multiple, les deux concentrations de duplexes ^^ 1 ^^/ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ 2 ^^/ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ sont représentées par une unique concentration ^^ ^^/ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ , les deux concentrations de duplexes élongués
Figure imgf000033_0004
sont représentées par une unique concentration ^^ ∗ ^^/ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^, et que l’applications des poids respectifs ^^ dans le tenseur de dénaturation permet de mettre à jour les concentrations des deux molécules ^^ 1 ^^ ^^ ^^ et ^^ 2 ^^ ^^ ^^ à pour prendre en compte les poids respectifs des réactions issues des deux appariements. [0215] La réaction React710 est représentée par l’équation :
Figure imgf000034_0001
Équation 17 [0216] La réaction React711 est représentée par l’équation :
Figure imgf000034_0002
Équation 18 [0217] La réaction React712 est représentée par l’équation :
Figure imgf000034_0003
Équation 19 [0218] La réaction React713 est représentée par l’équation :
Figure imgf000034_0004
Équation 20 [0219] La réaction React714 est représentée par l’équation :
Figure imgf000034_0005
Équation 21 [0220] La réaction React715 est représentée par l’équation :
Figure imgf000034_0006
Équation 22 [0221] Dans un ensemble de modes de réalisation de l’invention : - chaque molécule intervenant dans la simulation est associée à un indice dans le vecteur ^̅^; - les concentrations des duplexes issues de la phase d’hybridation sont notées dans une matrice carrée ^^ où chaque ligne et chaque colonne représente une des molécules, dans l’ordre de leurs indices dans le vecteur ^̅^. [0222] Dans l’exemple de la figure 7, la matrice ^^ peut par exemple s’écrire : Équation 23 [0223] Dans la représentation ci-dessus, les molécules sous forme de simples brins liées à chaque colonne et ligne sont respectivement notées au-dessus de chaque colonne et à gauche de chaque ligne. Conformément aux équations notées ci-dessus, en cas de multi-hybridation, une unique concentration de duplexe est notée dans la matrice, représentant en fait la concentration de plusieurs duplexes correspondant à plusieurs positions d’appariement. Par exemple : - la cellule correspondant à la ligne « ^^1 ^^ ^^ ^^ » et la colonne « ^^ ^^ ^^ ^^» comprend la concentration ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^, représentant en fait la somme des concentrations ^^ ^1 ^ ^^ 2 ^^ ^^ ^^ et ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ; - la cellule correspondant à la ligne « ^^1 ^^ ^^ ^^ » et la colonne « ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ » comprend la concentration ^^ , représenta 1 ^^/ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ nt en fait la somme des concentrations ^^ ^^/ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ et ^^ 2 ^^/ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^. [0224] Il convient de noter que ces exemples sont donnés pour des multi-hybridations selon deux positions d’appariement distinctes, mais ce principe peut être généralisé à des multi-hybridations avec des appariements selon n’importe quel nombre de positions distinctes supérieur ou égal à 2. [0225] Dans un ensemble de modes de réalisation de l’invention, l’obtention des concentrations des duplexes élongués lors de la simulation S42 de la phase d’élongation se fait par multiplication des concentrations des duplexes par des constantes d’élongation. [0226] Par exemple les constantes d’élongation peuvent être listées dans un tenseur d’élongation construit sur le même principe que la matrice ^^ , c’est-à-dire que chaque cellule du tenseur d’élongation̿ ^̿^ ^ ̿ ^ contient un coefficient d’élongation du duplexe de la cellule correspondante de la matrice ^^. Dans l’exemple de la figure 7 le tenseur d’élongation serait donc :
Figure imgf000035_0001
Équation 24 [0227] La numérotation des constantes d’élongations fait ici référence aux indices des molécules d’acide nucléique sous forme de simples brins dans le vecteur ^̅^. Par exemple, la constante ^^ ^^11,1, notée à la 1e colonne et la 11e ligne du tenseur̿ ^̿^ ^ ̿ ^ , représente le coefficient d’élongation du duplexe formé par l’hybridation des molécules d’indice 1 et 11 dans le vecteur ^̅^ (donc les molécules ^^ ^^ ^ 1 ^ ^^ ^^ et ^^ ^ 1 ^ ^^ ^^ ), c’est-à-dire ^^ ^ 1 ^/ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ , également notée à la 1e colonne et la 11e ligne de la matrice ^^.Les constantes d’élongations peuvent par exemple être lues dans une base de données, ou obtenues expérimentalement. [0228] Chaque coefficient d’élongation représente donc le coefficient, compris entre 0 et 1, des molécules d’un duplexe donné qui sont élongués durant une phase d’élongation. Par exemple, un coefficient de 0,5 pour un duplexe donné signifie que la moitié des molécules de ce duplexe sont élongués lors de la phase d’élongation. La concentration des duplexes élongués à l’issue de la phase d’élongation sera donc la moitié de la concentration des duplexes non-élongués au début de la phase d’élongation. Le tenseur d’élongation est donc constitué de coefficients d’élongation compris entre 0 et 1. [0229] Plus généralement, la phase simulation de la phase d’élongation peut se réaliser par une étape S421 de multiplication de la matrice de concentration des duplexes non-élongués par le tenseur d’élongation :
Figure imgf000036_0001
Équation 25 [0230] Dans laquelle : - C représente l’indice du cycle d’amplification PCR; - ∆ ^^ ^ représente la durée de la phase d’élongation : - ^^ ^^ représente la matrice de concentration des duplexes non-élongués au C-ième cycle d’amplification PCR ; - ^^∗ ^^ représente la matrice de concentration des duplexes élongués au C-ième cycle d’amplification PCR ; - ̿ ^̿^ ^ ̿ ^ représente le tenseur d’élongation. [0231] L’intégralité des duplexes n’ayant en général pas été élongués au cours de la phase d’élongation, la concentration des duplexes non-élongués en fin de cycle est donc égale à la concentration des duplexes non-élongués en début de cycle moins la concentration des duplexes élongués en fin de phase. Par exemple : ^^ ^^+1(0) = ^^ ^^(0) − ^^∗ ^^(∆ ^^ ^) Équation 26 [0232] La phase d’élongation a ici été illustrée par le biais d’un produit matriciel de Hadamard. Cependant, ce n’est pas la seule manière de simuler une phase d’élongation. Par exemple, la phase d’élongation peut être de manière plus générale simulée en multipliant la concentration de chaque duplexe non élongué en début de phase d’élongation par le coefficient d’élongation de ce duplexe. Par exemple, les concentrations des duplexes non élongués peuvent être intégrées dans un vecteur de concentration des duplexes non-élongués, et ce vecteur peut être multiplié par un vecteur de coefficients d’élongation. [0233] La phase de dénaturation peut en pratique comprendre deux étapes : - une étape S431 de multiplications des concentrations de duplexes élongués et éventuellement non-élongués par un ou plusieurs tenseurs de dénaturation représentant la répartition des duplexes en molécules d’acide nucléiques sous forme de simples brins ; - une étape S432 de multiplication des concentrations des duplexes, ou du produit des concentrations des duplexes par le ou les tenseurs de dénaturation par un ou plusieurs coefficients de dénaturations représentant le taux de duplexes effectivement dénaturés pendant la phase de dénaturation. [0234] Dans un ensemble de modes de réalisation de l’invention, la phase de dénaturation comprend la multiplication des concentrations de duplexes élongués par un tenseur de dénaturation des duplexes élongués. Le tenseur de dénaturation des duplexes élongués représente en pratique la redistribution des duplexes élongués vers les molécules d’acides nucléiques sous forme de simples brins lors de la phase de dénaturation. [0235] Ceci permet de simuler la dénaturation des duplexes qui ont été élongués, et d’intégrer les concentrations de duplexes élongués et dénaturés dans les conditions initiales du cycle suivant. [0236] Dans un ensemble de modes de réalisation de l’invention, la phase de dénaturation comprend de plus la multiplication des concentrations de duplexes non-élongués par un tenseur de dénaturation des duplexes non-élongués. [0237] Ainsi, la simulation de la phase de dénaturation prend en compte à la fois la dénaturation des duplexes élongués, mais également la dénaturation des duplexes qui n’ont pas été élongués, permettant ainsi d’obtenir un résultat de simulation plus précis. [0238] Lors de la simulation de la phase de dénaturation, un coefficient de dénaturation peut également être appliqué aux concentrations de duplexes élongués/non-élongués et/ou aux concentrations d’acide nucléiques sous forme de simples brins résultant de la multiplication des concentrations de duplexes élongués/non-élongués par les tenseurs de dénaturation. [0239] Les coefficients de dénaturation représentent la proportion des duplexes d’un type donné qui sont effectivement dénaturés lors de la phase de dénaturation. Les coefficients de dénaturation peuvent par exemple être lus dans une base de données, ou obtenus expérimentalement. [0240] Chaque coefficient de dénaturation représente donc le coefficient, compris entre 0 et 1, des molécules d’un duplexe donné qui sont dénaturés durant une phase de dénaturation. Par exemple, un coefficient de 0,5 pour un duplexe donné signifie que la moitié des molécules de ce duplexe sont dénaturés lors de la phase dénaturation. [0241] Selon différents modes de réalisation : - un même coefficient de dénaturation peut être appliqué à un duplexe élongué donné, et au duplexe non-élongé correspondant. Ceci permet une bonne approximation de la dénaturation, tout en simplifiant les calculs ; - deux coefficients de dénaturation distincts peuvent être appliqués respectivement à un duplexe élongué donné, et au duplexe non-élongué correspondant. Ceci permet une simulation plus précise, dans des cas où la dénaturation se produit de manière différente pour le duplexe élongué et le duplexe non élongué. [0242] Les coefficients de dénaturation peuvent par exemple être appliqués par le biais de multiplications matricielles. Par exemple, la phase de dénaturation peut être simulée par les équations suivantes :
Figure imgf000038_0001
Équation 29 [0243] Dans lesquelles : - ° représente le produit de Hadamard ; - ̿ ^̿^ ^̿^ est la matrice identité ; - ̿ ^̿^ ^ ̿ ^ est une matrice de dénaturation comprenant des coefficients de dénaturation associés à chaque duplexe ; - ̿ ^̿^ ^ ̿ ^ est la matrice d’élongation ; - ^^ ^^(∆ ^^) est la matrice de concentration de duplexes non-élongués en fin de phase de dénaturation au cycle C ; - est la matrice de concentration de duplexes élongués en début de phase de dénaturation au cycle C ; - ^^ ^^+1(0) est la matrice de concentration des duplexes non-élongués au début du cycle suivant C+1 ; - ^^∗ ^^+1(0) est la matrice de concentration des duplexes élongués au début du cycle suivant C+1 ; - ∙ représente le produit tensoriel; - ^̿^ ^ ∗ ^ est le tenseur de dénaturation des duplexes élongués ; - ^̿^ ^^ est le tenseur de dénaturation des duplexes non-élongués ; - ^^ ^ ∗ ^ ^ ^ ^ ^ ^^ ^^ (∆ ^^) est la concentration des duplexes élongués en fin de phase d’élongation, mise sous forme de vecteur ; - ^^ ^ ^ ^ ^ ^^ ^^ ^^ (∆ ^^) est la concentration des duplexes non-élongués en fin de phase d’élongation, mise sous forme de vecteur ; - ^̅^ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ (∆ ^^ ) représente le vecteur de concentration des molécules d’acide nucléique sous forme de simple brins en fin de phase d’élongation au cycle d’amplification PCR C ; - représente le vecteur de concentration des molécules d’acide nucléique sous forme de simple brins en début du cycle d’amplification PCR suivant C+1 ; [0244] L’Équation 27 représente la concentration des duplexes non élongués et non-dénaturées se retrouvant en début du cycle d’amplification suivant C+1. [0245] L’Équation 28 représente la concentration des duplexes élongués et non-dénaturées se retrouvant en début du cycle d’amplification suivant C+1. [0246] L’Équation 29 représente la distribution en acides nucléiques sous forme de simples brins des duplexes dénaturés en début du cycle d’amplification suivant C+1. Plus spécifiquement : - ∙ ^^ ^ ∗ ^ ^ ^ ^ ^ ^^ ^^ (∆ ^^ ) représente la distribution des duplexes élongués en acides nucléiques sous forme de simples brins par application du tenseur de dénaturation des duplexes élongués ; - ^ ^^ ^̿^ ^^ ∙
Figure imgf000039_0001
représente la distribution des duplexes non élongués en acides nucléiques sous forme de simples brins par application du tenseur de dénaturation des duplexes non élongués ; - ̿ ^̿^ ^ ̿ ^ ° représente l’application du tenseur de dénaturation à la distribution des acides nucléiques sous forme de simples brins ; - le terme ̿ ^̿^ ^ ̿ ^ ° [ ^^ ^
Figure imgf000039_0002
∙ ^^ ^ ^ ^ ^ ^^ ^^ ^^ (∆ ^^ )] représente donc la variation des acides nucléiques sous forme de simples brins au cours du cycle d’amplification PCR d’indice C. [0247] Il convient de noter que les exemple fournis ci-dessus sont fournis à titre d’exemples non- limitatifs uniquement, et que d’autres formulations pourraient être appliquées pour simuler la phase de dénaturation. Par exemple, des formules équivalentes de distribution des duplexes vers les molécules sous forme de simple brins, et de multiplication par des constantes de dénaturation peuvent être utilisées. Par exemple, la multiplication par les constantes de dénaturation peut se faire sous la forme de multiplications vectorielles. [0248] Dans l’exemple des Équation 28 et Équation 29, les constantes de dénaturation sont listées dans un tenseur de dénaturation construit sur le même principe que la matrice ^^, c’est-à-dire que chaque cellule du tenseur d’élongation ̿ ^̿^ ^ ̿ ^ contient un coefficient d’élongation du duplexe de la cellule correspondante de la matrice ^^. Dans l’exemple de la figure 7 le tenseur de dénaturation serait donc :
Figure imgf000040_0001
Équation 30 [0249] La numérotation des constantes d’élongations fait ici référence aux indices des molécules d’acide nucléique sous forme de simples brins dans le vecteur ^̅^. Par exemple, la constante ^^ ^^11,1, notée à la 1e colonne et la 11e ligne du tenseur̿
Figure imgf000040_0002
, représente le coefficient de dénaturation du duplexe formé par l’hybridation des molécules d’indice 1 et 11 dans le vecteur ^̅^ (donc les molécules ^^ ^^ ^ 1 ^ ^^ ^^ et ^^ ^ 1 ^ ^^ ^^ ), c’est-à-dire ^^ ^ 1 ^/ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ , également notée à la 1e colonne et la 11e ligne de la matrice ^^. Dans cet exemple, un même coefficient de dénaturation est appliqué aux duplexes et aux duplexes élongués correspondants (par exemple
Figure imgf000040_0003
Cependant, dans d’autres modes de réalisation de l’invention, des coefficients de dénaturation distincts peuvent être appliqués à certains duplexes et duplexes élongués, par exemple si la dynamique de dénaturation est significativement différente entre les deux versions. Les coefficients de dénaturation peuvent par exemple être lus dans une base de données, ou obtenus expérimentalement. [0250] Chaque coefficient de dénaturation représente donc le coefficient, compris entre 0 et 1, des molécules d’un duplexe donné qui sont dénaturées durant une phase de dénaturation. Par exemple, un coefficient de 0,5 pour un duplexe donné signifie que la moitié des molécules de ce duplexe sont dénaturées pendant la phase d’élongation. La concentration des duplexes élongués/non-élongués à l’issue de la phase de dénaturation sera donc la moitié de la concentration des duplexes élongués/non-élongués au début de la phase de dénaturation. Le tenseur de dénaturation est donc constitué de coefficients de dénaturation compris entre 0 et 1. [0251] Dans le cas des duplexes non-élongués (c’est-à-dire les duplexes résultant de l’hybridation de deux molécules d’acide nucléique sous forme de simples brins n’ayant pas été élongués), les molécules n‘ont pas été transformées, et la dénaturation a pour effet de restaurer les deux molécules d’acide nucléique sous forme de simple brins hybridées. [0252] Dans l’exemple de la figure 7, la dénaturation des duplexes élongués est résumée dans le tableau ci-dessous, où chaque ligne comprend la référence d’un duplexe partiel, son indice dans le vecteur ^^ ^^ ^^ ^^ ^^, les deux molécules d’acide nucléique sous forme de simple brin dont l’hybridation a permis de former le duplexe, et qui sont re-créées à l’issue de la phase de dénaturation, et les indices de ces deux molécules : Tableau 1 [0253] Le tenseur de dénaturation des duplexes non-élongués ^̿^ ^^ peut donc s’écrire dans cet exemple :
Figure imgf000041_0001
Équation 31 [0254] Le tenseur de dénaturation des duplexes non-élongués ^̿^ ^^ est dans cet exemple un tenseur de taille 12x14 : il comprend 12 lignes correspondant respectivement aux 12 duplexes dans le vecteur ^^ ^^ ^^ ^^ ^^. Les 12 duplexes sont notés à gauche de chaque ligne correspondante, et notés dans l’ordre de leurs indices dans le vecteur ^^ ^^ ^^ ^^ ^^. Il comprend également 14 colonnes correspondant respectivement aux 14 molécules d’acide nucléique sous forme de simple brin dans le vecteur ^̅^. Les 14 molécules d’acide nucléique sous forme de simple brins sont notés au-dessus de chaque colonne correspondante, et notés dans l’ordre de leurs indices dans le vecteur ^̅^. La valeur « 1 » est inscrite dans chaque cellule appartenant à la ligne d’un duplexe, et la colonne d’un acide nucléique sous forme de simple brins généré par la dénaturation de ce duplexe élongé. [0255] Le tenseur de dénaturation permet ainsi de distribuer les concentrations de molécules de ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ vers
Figure imgf000042_0001
en vue du prochain cycle en une seule simple opération algébrique. La forme du tenseur de dénaturation permet aussi de vérifier que la réaction est correcte en sommant chaque ligne. En effet, la somme des éléments de chaque ligne doit être égale à 2 (puisque chaque duplexe génère lors de la phase de dénaturation deux molécules d’acide nucléique sous forme de simples brins). [0256] Le tenseur de dénaturation des duplexes élongués est également dans notre exemple de taille 12x14, chaque ligne représentant un duplexe élongué dans l’ordre de leurs indices dans le vecteur ^^ ^ ∗ ^ ^^ ^^ ^^ , et chaque colonne représentant une molécule d’acide nucléique sous forme de simple brin dans l’ordre de leurs indices dans le vecteur ^̅^. Pour les cas de duplexes correspondant à une unique réaction d’hybridation en un seul emplacement, il est construit comme le tenseur de dénaturation, en inscrivant la valeur « 1 » dans chaque cellule appartenant à la ligne d’un duplexe élongué, et la colonne d’un acide nucléique sous forme de simple brins généré par la dénaturation de ce duplexe élongué. [0257] Dans un ensemble de modes de réalisation de l’invention, le tenseur de dénaturation des duplexes élongués contient aussi des coefficients spécifiques en cas d’hybridations multiples, c’est- à-dire d’hybridation d’une même amorce en plusieurs emplacements d’un même acide nucléique sous forme de simple brins, comme par exemple dans le cas des réactions React71 et React72, ou des réactions React78 et React79 par exemple. [0258] Dans ce cas, la dénaturation génère non pas deux mais au moins trois acides nucléiques sous forme de simple brins. Dans le cas des React71 et React72, ou des réactions React78 et React79, la dénaturation produira trois acides nucléiques sous forme de simples brins car l’hybridation multiple s’est réalisée en deux positions, mais le même principe peut être étendu à un plus grand nombre de produits de dénaturation en cas d’hybridations en un plus grand nombre de positions. [0259] Dans ce cas, les concentrations de duplexes et les concentrations de duplexes élongués comprennent respectivement une concentration d’un duplexe virtuel égale à la somme des concentrations des duplexes formés par les réactions d’hybridations multiples, et une concentration d’un duplexe virtuel élongué égale à la somme des concentrations des duplexes élongués formés par l’élongation des duplexes formés par les réactions d’hybridations multiples. [0260] Par exemple : - dans le cas des réactions de multi-hybridation React71 et React72 : - les concentrations de duplexes non-élongués comprennent la concentration de représentant la somme des concentrations
Figure imgf000042_0002
et
Figure imgf000042_0003
- les concentrations de duplexes élongués comprennent la concentration de duplexe virtuel élongé ^^ ^ ∗ ^ ^^ ^^ ^^ ^^ représentant la somme des concentrations ^^ ^ 1 ^ ^ ∗ ^ ^^ ^^ ^^
Figure imgf000043_0001
; - dans le cas des réactions de multi-hybridation React78 et React79 : - les concentrations de duplexes non-élongués comprennent la concentration de duplexe virtuel ^^ ^^/ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ représentant la somme des concentrations ^^ ^ 1 ^/ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ et ^^ ^ 2 ^/ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ ; - les concentrations de duplexes élongués comprennent la concentration de duplexe virtuel élongé ^^ ^ ∗ ^/ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ représentant la somme des concentrations ^^ ^ 1 ^/ ∗ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ et ^^ ^ 2 ^/ ∗ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ . [0261] Dans ce cas, les coefficients du tenseur de dénaturation des duplexes élongués correspondant à la distribution de la concentration du duplexe virtuel élongué vers chaque acide nucléique sous forme de simple brin associé à une des réactions d’hybridation multiple peuvent être respectivement égaux au ratio entre l’énergie d’interaction de la réaction d’hybridation multiple divisée par la somme des énergies d’interactions de toutes les réactions d’hybridations multiples avec ledit acide nucléique à simple brin. [0262] Par exemple, dans le cas des réactions de multi-hybridation React71 et React72, le duplexe virtuel ^^ ^ ∗ ^ ^^ ^^ ^^ ^^ sera dénaturé : - d’une part, vers ^^ ^^ ^^ ^^ , qui était présent dans les deux réactions React71 et React72. Le coefficient associé sera donc 1 ; - d’autre part, vers ^^ ^^ ^ 1 ^ ^^ ^^ et ^^ ^^ ^ 2 ^ ^^ ^^ , correspondant aux réactions React71 et React72. Les coefficients associés aux molécules ^^ ^^ ^ 1 ^ ^^ ^^ et ^^ ^^ ^ 2 ^ ^^ ^^ doivent donc correspondre aux importances respectives des réactions React71 et React72, c’est-à-dire à l’importance respective de l’hybridation de React71 et l’hybridation de React72. A cet effet, ces deux coefficients peuvent être respectivement égaux à l’énergie d’interaction de l’hybridation de React71 divisée par la somme des énergies d’hybridation de React71 et React72, et l’énergie d’interaction de l’hybridation de React72 divisée par la somme des énergies d’hybridation de React71 et React72. [0263] Par exemple, si la réaction d’hybridation de React71 a une énergie d’interaction ^^ ^^1, et la réaction d’hybridation de React72 une énergie d’interaction ^^ ^^2 , les poids associés à ^^ ^^ ^ 1 ^ ^^ ^^ et ^^ ^^ ^ 2 ^ ^^ ^^ dans le tenseur de dénaturation des duplexes élongués seront respectivement égaux à : 1 = ^^ ^ 1 - ^^ ^ ^^ ^^ 1 + ^^ ^^ 2 pour ^^ ^^ ^ 1 ^ ^^ ^^ ; t ^^2 = ^^ 2 - e ^^ ^^ ^^ 1 + ^^ ^^ 2 pour ^^ ^^ ^ 2 ^ ^^ ^^ . [0264] Ainsi, les réactions d’hybridation multiple, et les élongations et dénaturation associées peuvent être simulées comme une seule série de réactions, tout en préservant l’exactitude de la simulation. [0265] Dans un ensemble de modes de réalisation de l’invention, le tenseur de dénaturation des duplexes élongués contient aussi des coefficients spécifiques en cas d’hybridations entre deux amorces, ou « dimère d’amorce ». En effet, dans ce cas, le duplexe formé par l’hybridation des deux amorces peut être élongué dans les deux sens, ce qui génère in fine des produits de dénaturation distincts, comme par exemple dans les réactions React74 et React75. [0266] Dans ce cas, les concentrations de duplexes élongués comprennent une concentration d’un duplexe virtuel élongué égale à la somme des concentrations des duplexes élongués formés par l’élongation dans chacun des deux sens du duplexe formé par l’hybridation des deux amorces. [0267] Par exemple, dans le cas des réactions React74 et React75, les concentrations des duplexes élongués peuvent comprendre une concentration d’un duplexe virtuel élongué ^^ ^ ∗ ^ ^^ , représentant la somme des concentrations de ^^ ^ ∗ ^ ^^ ^^ ^^ ^^ et ^^ ^ ∗ ^ ^^ ^^ ^^ ^^ .Ainsi, la concentration du duplexe virtuel élongué ^^ ^ ∗ ^ ^^ ne correspond pas à une concentration d’un duplexe réel, mais permet de faciliter la simulation. [0268] Les coefficients du tenseur de dénaturation des duplexes élongués correspondant à la distribution de la concentration du duplexe virtuel élongué vers chacune des deux amorces, et chacun des deux acides nucléiques sous forme de simple brins résultant de l’élongation dans un des deux sens peuvent alors tous être égaux à 0,5, pour représenter le fait que l’élongation s’effectue sensiblement une fois sur deux dans chacun des deux sens. Par exemple, dans le cas des réactions React74 et React75, les produits de dénaturation sont les amorces ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ et ^^ ^^ ^^ ^^ ^^, ainsi que les acide nucléiques ^^1 ^^ ^^ ^^ et ^^2 ^^ ^^ ^^. Dans le tenseur de dénaturation des duplexes élongués, les cellules sur la ligne de ^^ ^ ∗ ^ ^^ et les colonnes de ^^ ^^ ^^ ^^ ^^, ^^ ^^ ^^ ^^ ^^, ^^1 ^^ ^^ ^^ et ^^2 ^^ ^^ ^^ seront donc tous égaux à 0,5. [0269] Ceci permet de simuler de manière efficace les réactions résultant d’hybridations entre amorces, tout en limitant la complexité de la simulation. [0270] Dans l’exemple de la figure 7, les coefficients du tenseur de dénaturation peuvent être définis pour chaque réaction de dénaturation d’un duplexe élongué, dans un tableau construit sur le même principe que le tableau pour les duplexes non élongués :
Tableau 2 [0271] On observe ici : - La présence de coefficients correspondant aux réactions d’hybridation multiple, pour les duplexes virtuels élongués ^^∗ ∗ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^ et ^^ ^^/ ^^ ^^ ^^ ^^ ^^, - la présence des coefficients correspondant à l’hybridation entre les amorces pour le duplexes partiel virtuel élongé ^^ ^ ∗ ^ ^^ . [0272] Dans cet exemple, les coefficients associés aux deux paires de réactions d’hybridation multiples ont tous deux été définis à 0,8 et 0,2. [0273] Ceci permet donc de construire le tenseur de dénaturation des duplexes élongués suivant :
Figure imgf000045_0001
Équation 32 [0274] La forme de ce tenseur permet de distribuer les concentrations des duplexes élongués vers les molécules d’acide nucléique sous forme de simple brins par une simple opération algébrique. [0275] De plus, il est possible de vérifier que la dénaturation est sous contrôle, en vérifiant que la somme des valeurs sur chaque ligne est égale à 2. [0276] Il est maintenant fait référence à la figure 8. [0277] La figure 8 montre un exemple d’un procédé selon un ensemble de modes de réalisation de l’invention intégrant une validation ou modification des paramètres de l’amplification PCR. [0278] Dans un ensemble de modes de réalisation de l’invention, les caractéristiques du kit PCR, par exemple le choix de la pluralité d’amorces et de la valeur initiale du vecteur de concentrations pour ladite pluralité d’amorces au premier cycle de la réaction, peuvent être validées ou modifiées en fonction des résultats de la simulation. [0279] Par exemple, le procédé P8 comprend, en plus des étapes du procédé P4 : - une étape S81 d’affichage des résultats de la simulation. Cet affichage peut par exemple comprendre un affichage de courbes d’évolution des concentrations des molécules, des valeurs représentatives de la cinétique de la réaction, etc ; - une étape S82 de comparaison d’une valeur représentative de la cinétique d’une réaction à un seuil ; - si la comparaison est positive, une étape S83 de validation des amorces et des concentrations initiales des amorces ; - sinon, une étape S84 de modification des amorces et/ou des concentrations initiales des amorces. [0280] A l’issue de l’étape S84, la simulation peut être réexécutée sur la base des paramètres modifiés. [0281] Ceci permet donc de s’assurer que les paramètres des amorces et de leur concentration permettent bien de réaliser l’amplification désirée avec une cinétique suffisamment forte, ou au contraire les modifier pour satisfaire cette contrainte. [0282] L’étape S82 de comparaison d’une valeur représentative de la cinétique d’une réaction à un seuil permet notamment de vérifier qu’une réaction donnée d’amplification sera suffisamment rapide pour être détectée. Par exemple, le seuil considéré peut être un des seuils suivants : - un cycle seuil (Ct) ; - un point de croisement (Cp) ; - une concentration finale d’une molécule d’acide nucléique amplifiée par la réaction ; - une concentration d’amplicons en fin de réaction. [0283] Ainsi, l’étape S82 peut consister à vérifier qu’un Ct ou Cp pour une réaction d’amplification d’une cible donnée est supérieur à un seuil de référence (c’est-à-dire que le cycle seuil Ct, ou point de croisement Cp est trop élevé, ce qui signifie que la réaction d’amplification n’est pas assez rapide), ce qui signifie que la réaction ne sera pas suffisamment rapide. [0284] Si le procédé P8 comprend une étape S81 d’affichage, ceci est un exemple non limitatif. En effet, l’affichage peut par exemple permettre à un utilisateur expert de valider ou non les paramètres de la simulation, mais la comparaison à l’étape S82 peut également s’effectuer automatiquement, sans affichage préalable. [0285] La mise en œuvre d’une modification à l’étape S84 peut s’effectuer de différentes manières. Par exemple, la modification peut être effectuée manuellement par un utilisateur expert. Alternativement, une modification peut être effectuée automatiquement, ou proposée à l’utilisateur expert en fonction des résultats de la simulation. [0286] Un exemple de modification à l’étape S84 va être décrit ci-dessous. [0287] Tout d’abord, l’étape S84 peut comprendre une sous-étape S841 d’identification d’une cible à favoriser en fonction des résultats de la simulation de l’amplification en chaîne par polymérase. [0288] Par exemple, la cible à favoriser peut être une cible dont la cinétique n’est pas suffisamment rapide. Par exemple, une ou plusieurs des comparaisons discutées pour l’étape S82 peuvent être effectuées pour chaque cible, et une cible pour lequel la comparaison est négative (par exemple, une cible dont le Ct ou Cp est supérieur à un seuil prédéfini) considérée comme une cible à favoriser, car la cinétique d’amplification est en l’état actuel des choses insuffisante. [0289] L’étape S84 peut ensuite comprendre une deuxième sous-étape S842 d’identification, à partir de la matrice d’association ou de la matrice de dissociation, d’une molécule d’acide nucléique sous forme de simple brin formant une paire avec une amorce associée à ladite cible. [0290] La sous-étape S842 consiste donc à identifier une molécule autre que la cible formant une paire avec une amorce associée à ladite cible, c’est-à-dire une molécule qui fera concurrence à la cible (et aux amplicons résultant de l’amplification de la cible) pour s’apparier avec l’amorce. Une telle molécule peut être identifiée grâce à la matrice d’association ^^ ^^ ^^, ou la matrice de dissociation ^^ ^^ ^^ ^^. En effet, ces matrices contiennent des coefficients pour chaque paire de molécules liées par une réaction d’hybridation suffisamment forte. La molécule peut donc par exemple être identifiée comme une molécule ayant une constante d’association avec l’amorce, ou une constante d’association supérieure à un seuil avec l’amorce. [0291] L’étape S84 peut ensuite comprendre la réalisation d’au moins une modification de l’amplification en chaîne par polymérase. L’au moins une modification de l’amplification en chaîne par polymérase peut notamment comprendre au moins une modification choisie parmi : - une diminution, dans le vecteur de concentration initiale, de la concentration initiale de ladite molécule d’acide nucléique sous forme de simple brin formant une paire avec l’amorce associée à ladite cible ; - une modification de la concentration de sels ; - une modification de la température d’hybridation pour au moins un cycle. [0292] Ces modifications permettent notamment de défavoriser l’hybridation de la molécule d’acide nucléique sous forme de simple brin formant une paire avec l’amorce associée à ladite cible avec l’amorce, ce qui permet ainsi de favoriser l’hybridation de la cible (et des amplicons résultant de l’amplification de la cible) avec l’amorce, et donc la réaction d’amplification de la cible. [0293] Cet exemple montre que la simulation de réaction d’amplification selon l’invention permet non seulement de vérifier qu’une amplification souhaitée est bien réalisée, mais également de modifier les paramètres de l’amplification afin de favoriser une réaction souhaitée Si l’exemple des étapes S841 à S843 de la figure 8 est basé sur une identification de réaction concurrente via analyse de la matrice d’association ^^ ^^ ^^ , ou la matrice de dissociation ^^ ^^ ^^ ^^ , cet exemple n’est pas limitatif, et d’autres procédés d’identification de freins à une réaction d’amplification peuvent être utilisés dans un ensemble de modes de réalisation de l’invention. Plus généralement, l’invention n’est pas limitée à un procédé particulier de modification des paramètres de la simulation. [0294] Il est maintenant fait référence à la figure 9. [0295] La figure 9 montre un exemple d’un procédé selon un ensemble de modes de réalisation de l’invention intégrant une validation ou modification des paramètres de l’amplification PCR, et une fabrication d’un kit d’amplification PCR validé. [0296] La procédé P9 est un procédé de fabrication comprenant toutes les étapes du procédé P8. [0297] La procédé P9 comprend en plus, à l’issue de la validation à l’étape S83, une étape de fabrication d’un kit pour la caractérisation de microorganismes compris dans un échantillon par utilisation d’une réaction d’amplification en chaine par polymérase, ou « kit PCR » tel que le kit K1 représenté en figure 1 par exemple. [0298] Le kit fabriqué par le procédé P9 comprend ainsi les amorces, et concentrations telles que validées par le procédé P8, c’est-à-dire dont la simulation a montré qu’une amplification souhaitée pourra être réalisée avec une cinétique satisfaisante. [0299] Le procédé P9 permet donc de fabriquer un kit validé par la simulation, et permettant une amplification satisfaisante des cibles souhaitées. [0300] Il est maintenant fait référence à la figure 10. [0301] La figure 10 montre un exemple d’un procédé P10 de caractérisation d’un microorganisme utilisant un kit d’amplification PCR fabriqué selon un ensemble de modes de réalisation de l’invention. [0302] La procédé P10 comprend une première étape S101 de préparation de l’échantillon de manière à réaliser sur l’échantillon préparé une PCR, ladite préparation comprenant une étape d’ajout d’un kit (K1) fabriqué conformément à un procédé tel que le procédé P9. [0303] L’échantillon peut avoir été prélevé sur un humain, un animal, ou encore un objet inanimé. [0304] Le procédé P10 comprend ensuite une étape S102 de mise en œuvre de la PCR sur l’échantillon prélevé. A l’issue de cette étape, les séquences d’acides nucléiques d’intérêt auront été amplifiées par la PCR, et sont présentes en quantités suffisantes pour être caractérisées. [0305] Le procédé P10 comprend donc une troisième étape S103 de caractérisation des microorganismes en fonction des résultats de la PCR. [0306] Un anti-microbien peut être choisi en fonction de la caractérisation et, soit administré à l’humain ou l’animal si l’échantillon a été prélevé sur un être vivant, soit appliqué sur un objet inanimé si l’échantillon a été prélevé sur un objet inanimé. [0307] Le procédé P10 permet ainsi d’effectuer une PCR sur un échantillon, afin de caractériser un microorganisme contenu dans l’échantillon, et le cas échéant sélectionner un antimicrobien adapté à ce microorganisme. [0308] Le kit ayant été validé par simulation pour permettre l’amplification des séquences d’acide nucléique caractéristiques de ce microorganisme, la méthode P10 permet une amplification, et donc une caractérisation efficace d’un microorganisme donné. [0309] Il est maintenant fait référence à la figure 11. [0310] La figure 11 montré un graphe Gr11 représentant l’évolution du Ct pour une simulation d’amplification d’un acide nucléique issue de levure du champignon (S. cerevisiae) en fonction de la durée de la phase d’hybridation selon un procédé de simulation de l’invention. [0311] Le graphe représente plus précisément : - sur l’axe des abscisses, la durée de la phase d’hybridation ^^ℎ ^^ ^^ ^^, en secondes ; - sur l’axe des ordonnées, la différence ^^ ^^ ^^ entre le ^^ ^^ correspondant au temps maximal testé de la phase d’hybridation (ici, 10 secondes), et le ^^ ^^ pour une durée donnée de phase d’hybridation, plus courte. [0312] Le simulations ont été réalisées pour 3 concentrations d’amorces, la concentration d’acide nucléique issue de levure du champignon étant maintenue constante : - la courbe Crv110 représente l’évolution simulée du ^^ ^^ ^^ en fonction de ^^ℎ ^^ ^^ ^^ , pour une concentration de 0,4 µM ; - la courbe Crv111 représente l’évolution simulée du ^^ ^^ ^^ en fonction de ^^ℎ ^^ ^^ ^^ , pour une concentration de 0,8 µM ; - la courbe Crv112 représente l’évolution simulée du ^^ ^^ ^^ en fonction de ^^ℎ ^^ ^^ ^^ , pour une concentration de 2 µM. [0313] Des expérimentations physiques correspondant à ces concentrations, pour certaines durées de la phase d’hybridation ont été menées, afin de mesurer la valeur ^^ ^^ ^^ sur des cas réels et comparer aux simulations. [0314] Les mesures réelles sont représentées : - par les mesures Mes1101, Mes1102, Mes1103 et Mes1104 pour les concentrations de 0,4 µM ; - par les mesures Mes1111, Mes1112, Mes1113, Mes1114, Mes1115 et Mes1116, pour les concentrations de 0,8 µM ; - par les mesures Mes1121, Mes1122, Mes1123, Mes1124 et Mes1125, pour les concentrations de 2 µM. [0315] On constate sur la figure 11 que : - les simulations fournissent des résultats précis, très proches des mesures réelles ; - lorsque la durée de la phase d’hybridation augmente, le Ct baisse rapidement puis plus lentement pour tendre vers une valeur minimale (représentée par ^^ ^^ ^^ = 0) ; - le point d’inflexion de la durée d’hybridation ^^ℎ ^^ ^^ ^^ à partir duquel le Ct se rapproche de la valeur minimale est plus élevé lorsque les concentrations sont faibles. [0316] La simulation permet donc d’évaluer le Ct de manière précise et fiable. On constate donc que les simulations effectuées permettent d’optimiser la durée de la phase d’hybridation pour atteindre une valeur cible de Ct. [0317] Il est maintenant fait référence à la figure 12. [0318] La figure 12 montre un exemple de visualisation de la cinétique de plusieurs réaction PCR dans deux conditions expérimentales distinctes selon un ensemble de modes de réalisation de l’invention. [0319] Dans l’exemple de la figure 12, deux simulations selon l’invention ont été exécutées pour reproduire : - l’amplification d’une cible au sein d’une première amplification multiplexe, avec un premier ensemble d’amorces. Cette première simulation est représentée par les points « OPA » , - l’amplification d’une cible au sein d’une deuxième amplification multiplexe, avec une modification du premier ensemble d’amorces. Cette première simulation est représentée par les points « OPB ». [0320] La simulation a été effectuée dans ce cas, suite à la constatation que, dans un exemple d’amplification réelle, le Ct d’une amplification a été augmenté d’environ 5,5 cycles suite à a modification du premier ensemble d’amorces. Deux simulations, correspondant au premier ensemble d’amorces, et à la modification de l’ensemble, ont donc été conduites. [0321] Les résultat de ces deux simulations sont représentés sur le graphe Gr12, avec : - en abscisses, l’indice du cycle ; - en ordonnées, la concentration des amplicons résultant de l’amplification de la cible. [0322] Les points « OPA » et « OPB » montrent donc les concentrations d’amplicons simulées à l’issue de chaque cycle, respectivement dans le cas où le premier ensemble d’amorce, et l’ensemble d’amorces modifié, sont utilisés. [0323] On constate que la simulation permet également de détecter une différence de Ct ^^ ^^ ^^ d’environ 5,5 cycles. [0324] Ce résultat démontre la capacité de la simulation d’amplification PCR selon l’invention à simuler de manière fiable le fonctionnement d’une amplification multiplexe. Ainsi, l’analyse des résultats de simulations permet d’optimiser le choix des paramètres d’amplifications, par exemple le choix des amorces, des concentrations d’amorces, ou des durées de phases afin de valider la capacité d’un kit d’amplification PCR construit selon les paramètres simulés à générer une amplification satisfaisante d’une cible donnée. [0325] La présente divulgation ne se limite pas aux exemples de procédé, programme d’ordinateur, kit pour l’amplification en chaîne par polymérase ci-avant, seulement à titre d’exemple, mais elle englobe toutes les variantes que pourra envisager l’homme de l’art dans le cadre de la protection recherchée. [0326] Grâce à l'invention, il est possible de déterminer si un choix initial des amorces et de leur concentration mène à une amplification appropriée des molécules d'acide nucléique cibles. Dans un tel cas, la conception d'un kit contenant lesdits amorces et leurs concentrations est validé et le kit peut passer en production pour sa commercialisation. [0327] L'invention permet également d'adopter une approche systématique pour la conception de kits d'amplification PCR. Notamment, partant d'une liste d’amorces possibles préalablement identifiés et d'un intervalle de concentrations possibles pour ces derniers, une grille de paramètre initiaux est déterminée. Par exemple pour chaque ensemble d’amorces candidates pour un kit, leur intervalle de concentration est discrétisé avec un pas prédéterminé. Un paramètre initial est alors cet ensemble d’amorces avec des valeurs de concentrations dans lesdits intervalles. Une simulation est lancée pour chacun des paramètres et une fois l'ensemble de la grille parcouru, on retient le ou les paramètres donnant les meilleures performances, puis un ou plusieurs kits correspondants sont fabriqués. [0328] L’invention permet également de tester un ensemble d’amorces dans le cadre d’une PCR multiplexe , et dans ce cas de tester et comparer des designs alternatifs afin d’atteindre les performances attendues. [0329] Le kit fabriqué est ensuite utilisé d'une manière connue en soi. Dans le cadre d'une application clinique, comme par exemple la détection de microorganismes pathogènes dans un échantillon biologique prélevé sur un patient (ou un animal), le clinicien (resp. le vétérinaire) peut alors adapter sa thérapie, par exemple choisir un antibiotique adapté au pathogène détecté. [0330] De manière privilégié, les paramètres ∆ ^^, ou de façon similaire les ^^ ^^ ^^ et ^^ ^^ ^^ ^^ , peuvent être obtenues selon des méthodes de l’état de l’art, par exemple les méthodes dites « Nearest Neighbours » divulguées par exemple par SantaLucia Jr, J. (1998). A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences, 95(4), 1460-1465. [0331] La simulation de l'amplification PCR est mise en œuvre par ordinateur, à savoir au moyen de circuits matériels comprenant des mémoires informatiques (cache, RAM, ROM…) et un ou plusieurs microprocesseurs ou processeurs, organisés ou non sous forme de nœuds de calcul, nécessaires à l'exécution d'instructions informatiques mémorisées dans les mémoires pour la mise en œuvre de ladite simulation.

Claims

Revendications [Revendication 1] Procédé (P4) de simulation numérique d’une amplification en chaîne par polymérase d’au moins une cible, ledit procédé comprenant la simulation d’une pluralité de cycles successifs de l’amplification, chaque cycle comprenant, de manière séquentielle : - une phase d’hybridation (S41) entre l’au moins une cible et une pluralité d’amorces ; - une phase d’élongation (S42) ; - puis une phase de dénaturation (S43) ; dans lequel la phase d’hybridation comprend pour chaque cycle : - l’obtention (S411) d’une valeur initiale ( ^̅^0) pour le cycle d’un vecteur ( ^̅^) de concentrations d’une pluralité de molécules d’acide nucléique sous forme de simple brins comprenant l’au moins une cible et la pluralité d’amorces ; - l’initialisation (S412) d’une matrice de concentrations ( ^^ ) de duplexes formés par l’hybridation de la pluralité de molécules d’acide nucléique sous forme de simples brins; - le calcul (S413), par pas de temps successifs, de l’évolution de ladite matrice de concentrations au cours de la phase d’hybridation, par l’application à la matrice de concentrations d’une équation différentielle matricielle représentant la cinétique de formation desdits duplexes en fonction des concentrations de la pluralité de molécules d’acide nucléique, ladite équation différentielle matricielle étant paramétrée par au moins une matrice d’association comprenant les constantes d’associations associées à chaque duplex et une matrice de dissociation comprenant les constantes de dissociation associées à chaque duplex. [Revendication 2] Procédé de simulation numérique selon la revendication 1, dans lequel l’équation différentielle intègre des équations de conservation de masse de la forme :
Figure imgf000053_0001
dans lesquelles : - ^^∗ représente le temps écoulé depuis le début de la phase d’hybridation ; - les notations ^^ ^^ et ^^ ^^ désignent respectivement les concentrations de deux molécules d’acide nucléique sous forme de simple brins d’indices i et j dans le vecteur ^̅^ de concentrations d’une pluralité de molécules d’acide nucléique ; - la notation ^^ ^^ ^^ désigne la concentration d’un duplexe formé par l’hybridation de la paire de molécules d’acide nucléique sous forme de simple brins d’indices x et y dans le vecteur ^̅^ de concentrations d’une pluralité de molécules d’acide nucléique ; - les notations ^^ ^^0 et ^^ ^^0 désignent les valeurs de ^^ ^^ et ^^ ^^ à ^^∗ = 0 ; ou toute autre formulation mathématiquement équivalente. [Revendication 3] Procédé de simulation numérique selon la revendication 2, dans lequel l’équation différentielle matricielle est de la forme suivante :
Figure imgf000054_0001
dans laquelle : - H est la matrice de concentration des duplexes ; - T0 est la valeur initiale pour le cycle du vecteur de concentration de la pluralité de molécules ; - Kon est la matrice d’association ; - Koff est la matrice de dissociation ; - l’opérateur ^^ ^^, ^^ représente une matrice en deux dimensions comprenant i lignes et j colonnes dont tous les éléments sont égaux à 1 ; - l’opérateur « diag() » désigne un opérateur prenant en paramètre une matrice carrée et extrayant à partir de cette matrice carrée un vecteur ayant pour dimension le nombre de lignes ou de colonnes de la matrice carrée et contenant tous les éléments de la diagonale de la matrice carrée. [Revendication 4] Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, chaque matrice d’association ou de dissociation comporte des éléments, et chaque élément de la matrice d’association, ou chaque élément de la matrice de dissociation associé à une paire de molécules appartenant à ladite pluralité de molécules est : - nul, si la variation d’enthalpie libre (ΔG) associée à la réaction d’hybridation des molécules formant la paire est supérieur à un seuil ; - respectivement égal à une constante d’association, ou à une constante de dissociation de la réaction d’hybridation de la paire de molécule sinon. [Revendication 5] Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la valeur dudit seuil est choisie parmi au moins deux valeurs de seuil prédéfinies, la valeur de seuil la plus faible étant réservée aux paires de molécules comprenant un amplicon et une amorce appariés. [Revendication 6] Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant une étape préalable de définition de la pluralité de molécules comprenant : - une initialisation de la pluralité de molécules d’acide nucléique sous forme de simple brins comme étant les molécules initialement présentes dans l’amplification en chaîne par polymérase; - une simulation initiale d’une pluralité de cycles de l’amplification en chaîne par polymérase, chaque cycle de la simulation initiale comprenant: - une obtention des réactions d’hybridation des molécules formant chaque paire de molécules parmi ladite pluralité de molécules ayant une affinité inférieure à un seuil ; - une simulation d’une phase d’hybridation mettant en œuvre lesdites réactions d’hybridation ; - une simulation d’une phase d’élongation ; - une simulation d’une phase de dénaturation ; - un ajout à ladite pluralité de molécules des molécules additionnelles obtenues à l’issue des phases d’hybridation, d’élongation et de dénaturation. [Revendication 7] Procédé selon la revendication 5, dans lequel l’étape préalable de définition de la pluralité de molécules comprend l’exécution d’un nombre cycles de la simulation initiale compris entre 3 et 7. [Revendication 8] Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant, à l’issue de la simulation de ladite pluralité de cycles, une étape ultérieure d’affichage (S81) de l’évolution temporelle de la concentration d’au moins une desdites molécules. [Revendication 9] Procédé (P8) selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant, une étape ultérieure de validation (S83) ou de modification (S84) de la pluralité d’amorces et de la valeur initiale du vecteur de concentrations pour ladite pluralité d’amorces au premier cycle de la réaction par comparaison (S82) d’une valeur représentative de la cinétique d’une réaction à un seuil. [Revendication 10] Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la valeur représentative de la cinétique est une valeur choisie parmi: - un cycle seuil (Ct) ; - un point de croisement (Cp) ; - une concentration finale d’une molécule d’acide nucléique amplifiée par la réaction ; - une concentration d’amplicons en fin de réaction. [Revendication 11] Procédé selon l’une des revendications 9 ou 10, dans lequel la modification de la pluralité d’amorces comprend : - l’identification d’une cible à favoriser en fonction des résultats de la simulation de l’amplification en chaîne par polymérase; - l’identification, à partir de la matrice d’association ou de la matrice de dissociation, d’une molécule d’acide nucléique sous forme de simple brin formant une paire avec une amorce associée à ladite cible; - la réalisation d’au moins une modification de l’amplification en chaîne par polymérase choisie parmi : - une diminution, dans le vecteur de concentration initiale, de la concentration initiale de ladite molécule d’acide nucléique sous forme de simple brin formant une paire avec l’amorce associée à ladite cible ; - une modification de la concentration de sels ; - une modification de la température d’hybridation pour au moins un cycle ; - une modification de la durée d’hybridation d’au moins un cycle. [Revendication 12] Procédé (P9) de fabrication (S91) d’un kit pour la caractérisation de microorganismes compris dans un échantillon par utilisation d’une réaction d’amplification en chaine par polymérase, ledit kit comprenant une pluralité d’amorces validées, procédé dans lequel la pluralité d’amorces et le vecteur de concentrations pour ladite pluralité d’amorces sont obtenus par un procédé de simulation selon l’une des revendications 9 à 11. [Revendication 13] Kit (K1) pour l’’amplification en chaîne par polymérase fabriqué par le procédé selon la revendication précédente. [Revendication 14] Programme informatique comportant des instructions pour la mise en œuvre du procédé selon l’une des revendications 1 à 11 lorsque ce programme est exécuté par un processeur. [Revendication 15] Support d’enregistrement non transitoire lisible par un ordinateur sur lequel est enregistré un programme pour la mise en œuvre du procédé selon l’une des revendications 1 à 11 lorsque ce programme est exécuté par un processeur. [Revendication 16] Procédé (P10) de caractérisation de microorganismes compris dans un échantillon, comprenant : − la préparation (S101) de l’échantillon de manière à réaliser sur l’échantillon préparé une PCR, ladite préparation comprenant une étape d’ajout d’un kit (K1) fabriqué conformément à un procédé de la revendication 12 ; − la mise en œuvre (S102) de la PCR sur l’échantillon préparé ; − la caractérisation (S103) des microorganismes en fonction des résultats de la PCR. [Revendication 17] Procédé selon la revendication 16, dans lequel l’échantillon est prélevé sur un animal ou un être humain, ledit procédé comprenant le choix d’un antimicrobien en fonction de la caractérisation des microorganismes présent dans ledit échantillon, et l’administration dudit anti- microbien audit animal ou être humain. [Revendication 18] Procédé selon la revendication 16, dans lequel l’échantillon est prélevé sur un objet inanimé, ledit procédé comprenant le choix d’un antimicrobien en fonction de la caractérisation des microorganismes présent dans ledit échantillon, et l’application dudit anti-microbien audit objet inanimé.
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