[go: up one dir, main page]

WO2024204325A1 - 細胞膜タンパク質を検出する方法 - Google Patents

細胞膜タンパク質を検出する方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2024204325A1
WO2024204325A1 PCT/JP2024/012221 JP2024012221W WO2024204325A1 WO 2024204325 A1 WO2024204325 A1 WO 2024204325A1 JP 2024012221 W JP2024012221 W JP 2024012221W WO 2024204325 A1 WO2024204325 A1 WO 2024204325A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell membrane
fixed tissue
embedding medium
cancer
membrane protein
Prior art date
Application number
PCT/JP2024/012221
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
隆喜 井戸
文義 岡野
Original Assignee
東レ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 東レ株式会社 filed Critical 東レ株式会社
Publication of WO2024204325A1 publication Critical patent/WO2024204325A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting cell membrane proteins in fixed, embedded tissue and a method for determining a treatment for an individual from which the fixed tissue is derived, using the same.
  • Specific cell membrane proteins on cancer cells can be used as disease markers to detect cancer due to their cancer specificity, and various antibody drugs that target these proteins as antigens are used in cancer treatment as cancer treatment drugs with few side effects.
  • the cytopasmic-activation and proliferation-associated protein 1 (CAPRIN-1) protein is expressed on the cell membrane surface of many cancer cells, and is known to be a promising cancer disease marker (Patent Document 1).
  • antibodies against the CAPRIN-1 protein are known to be promising for use as a medicine for the treatment and/or prevention of cancer (Patent Document 2).
  • the objective of the present invention is to provide a highly accurate method for staining cell membrane proteins.
  • a method for detecting a cell membrane protein in an embedded fixed tissue comprising: an embedding medium removal step of contacting the fixed tissue containing a solid-state embedding medium with a removal solution to remove the embedding medium; an antigen activation step of activating the cell membrane protein in the fixed tissue after the removal step; a primary antibody reaction step of reacting the cell membrane protein of the fixed tissue with a primary antibody that is immunologically reactive with the cell membrane protein; a secondary antibody reaction step of reacting a labeled secondary antibody that is immunologically reactive with the primary antibody with the fixed tissue after the primary antibody reaction step; and a labeling detection step of detecting the labeled secondary antibody that has bound to the cell membrane protein via the primary antibody after the secondary antibody reaction step.
  • a method for detecting a cell membrane protein by removing an embedding medium from an embedded fixed tissue comprising: an embedding medium removal step of contacting the fixed tissue containing a solid-state embedding medium with a removal solution to remove the embedding medium; a labeling step of binding the cell membrane protein of the fixed tissue after the embedding medium removal step with a labeled antibody; and a labeling detection step of detecting the labeled antibody bound to the cell membrane protein after the labeling step.
  • the method according to [1-2] further comprising an antigen retrieval step of activating the cell membrane protein in the fixed tissue after the embedding medium removal step.
  • the labeling step includes a primary antibody reaction step in which the cell membrane protein of the fixed tissue after the embedding medium removal step is reacted with a primary antibody that is immunologically reactive with the cell membrane protein, and a secondary antibody reaction step in which a labeled secondary antibody that is immunologically reactive with the primary antibody is reacted with the fixed tissue after the primary antibody reaction step.
  • the embedding medium removal step is a step of removing the embedding medium by contacting the fixed tissue with the removal solution without baking the fixed tissue.
  • the embedding medium removing step is a step of removing the embedding medium by contacting the fixed tissue with the removal solution at a temperature lower than the melting point of the embedding medium.
  • the removal solution is a solution containing a surfactant and/or an organic solvent.
  • the contact in the embedding medium removal step is immersion.
  • the antigen retrieval step includes a heat treatment step at 90 to 130°C.
  • [6] The method according to any one of [1] to [5], further comprising a cooling step of cooling the fixed tissue after the antigen retrieval step.
  • the labeled secondary antibody is a complex in which an antibody immunologically reactive with the primary antibody and peroxidase are bound to a polymer carrier.
  • the label detection step is a step of detecting the cell membrane protein that has developed color using a color-developing reagent reactive with the peroxidase.
  • the color-developing reagent is 3,3'-diaminobenzidine (DAB).
  • [10-1] The method according to any one of [1] to [9], wherein the embedding medium is paraffin.
  • the embedding medium removing step is a step of removing the embedding medium by contacting the fixed tissue with the removal solution while maintaining the fixed tissue at a temperature below 45°C.
  • the cell membrane protein is a cell membrane protein expressed on the surface of a cancer cell.
  • the cell membrane protein is a disease marker.
  • the disease is cancer.
  • a method for determining a treatment method for an individual from which a fixed tissue is derived comprising: a step of detecting a disease marker in the embedded fixed tissue using the method according to any one of [11] to [13]; and a treatment method determination step of determining a treatment method for the individual based on the disease marker detected by the above step.
  • An apparatus for detecting cell membrane proteins in embedded fixed tissue comprising: an embedding medium removal section that removes the embedding medium by contacting the fixed tissue containing a solid-state embedding medium with a removal solution; a labeling reaction section that binds the cell membrane protein of the fixed tissue that has passed through the embedding medium removal section with a labeled antibody; and a label detection section that detects the labeled antibody that has bound to the cell membrane protein in the fixed tissue that has passed through the labeling reaction section.
  • the embedding medium removal unit is provided with a temperature control means for keeping the fixed tissue below the melting point of the embedding medium.
  • the detection method of the present invention makes it possible to detect cell membrane proteins with high accuracy in embedded, fixed tissue.
  • the method for determining a treatment method of the present invention makes it possible to determine an appropriate treatment method based on expression information of cell membrane proteins detected with high accuracy.
  • 1 shows exemplary stained images of ovarian cancer tissues obtained by the staining method of Example 1.
  • A shows a stained image of cell nuclei and CAPRIN-1 protein.
  • B shows a stained image in which the signal of cell nuclei is excluded.
  • the arrows indicate cells whose cell membranes are appropriately stained, and the scale bar indicates 50 ⁇ m.
  • 1 shows exemplary stained images of ovarian cancer tissues by the staining method of Comparative Example 1.
  • A shows a stained image of cell nuclei and CAPRIN-1 protein.
  • B shows a stained image excluding the signal of cell nuclei.
  • the arrowhead indicates a cell inappropriately stained up to the cytoplasm, and the scale bar indicates 50 ⁇ m.
  • the figures show stained images of gastric cancer tissues judged to have a score of 0 (CAPRIN-1 negative).
  • A shows a stained image of cell nuclei and CAPRIN-1 protein.
  • B shows a stained image in which the signal of cell nuclei has been excluded.
  • the scale bar indicates 50 ⁇ m.
  • the figures show stained images of gastric cancer tissues judged to be score 1 (CAPRIN-1 negative).
  • A shows a stained image of cell nuclei and CAPRIN-1 protein.
  • B shows a stained image in which the signal of cell nuclei has been excluded.
  • the scale bar indicates 50 ⁇ m.
  • the figures show stained images of gastric cancer tissues judged to be score 2 (CAPRIN-1 positive).
  • A shows a stained image of cell nuclei and CAPRIN-1 protein.
  • B shows a stained image in which the signal of cell nuclei has been excluded.
  • the scale bar indicates 50 ⁇ m.
  • the figures show stained images of gastric cancer tissues judged to be score 3 (CAPRIN-1 positive).
  • A shows a stained image of cell nuclei and CAPRIN-1 protein.
  • B shows a stained image in which the signal of cell nuclei has been excluded.
  • the scale bar indicates 50 ⁇ m.
  • the figures show stained images of kidney cancer tissues judged to be score 0 (CAPRIN-1 negative).
  • A shows a stained image of cell nuclei and CAPRIN-1 protein.
  • B shows a stained image excluding the signal of cell nuclei.
  • the scale bar indicates 50 ⁇ m.
  • the figures show stained images of kidney cancer tissues judged to be score 1 (CAPRIN-1 negative).
  • A shows a stained image of cell nuclei and CAPRIN-1 protein.
  • B shows a stained image excluding the signal of cell nuclei.
  • the scale bar indicates 50 ⁇ m.
  • the figures show stained images of kidney cancer tissues judged to be score 2 (CAPRIN-1 positive).
  • A shows a stained image of cell nuclei and CAPRIN-1 protein.
  • B shows a stained image in which the signal of cell nuclei has been excluded.
  • the scale bar indicates 50 ⁇ m.
  • the figures show stained images of kidney cancer tissues judged to be score 3 (CAPRIN-1 positive).
  • A shows a stained image of cell nuclei and CAPRIN-1 protein.
  • B shows a stained image excluding the signal of cell nuclei.
  • the scale bar indicates 50 ⁇ m. 1 shows exemplary stained images of ovarian cancer tissues obtained by the staining method of Example 1.
  • A shows a stained image of cell nuclei and CAPRIN-1 protein.
  • B shows a stained image in which the signal of cell nuclei has been excluded.
  • the scale bar indicates 50 ⁇ m. 1 shows exemplary stained images of ovarian cancer tissues obtained by the staining method of Example 3.
  • A shows a stained image of cell nuclei and CAPRIN-1 protein.
  • B shows a stained image in which the signal of cell nuclei has been excluded.
  • the scale bar indicates 50 ⁇ m.
  • FIG. 1 shows exemplary stained images of ovarian cancer tissues obtained by the staining method of Example 4.
  • A shows a stained image of cell nuclei and CAPRIN-1 protein.
  • B shows a stained image in which the signal of cell nuclei has been excluded.
  • the scale bar indicates 50 ⁇ m.
  • 1 shows exemplary stained images of ovarian cancer tissues obtained by the staining method of Example 5.
  • A shows a stained image of cell nuclei and CAPRIN-1 protein.
  • B shows a stained image in which the signal of cell nuclei has been excluded.
  • the scale bar indicates 50 ⁇ m.
  • 1 is a flow chart illustrating an exemplary embodiment of a method for detecting a cell membrane protein.
  • FIG. 11 is an exemplary functional block diagram of a cell membrane protein detection device according to the third embodiment.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating an example of the hardware configuration of a control unit of the cell membrane protein detection device.
  • the first aspect of the present invention is a method for detecting cell membrane proteins.
  • the method of this aspect includes an embedding medium removal step, a labeling step, and a label detection step as essential steps, and an antigen activation step, a cooling step, a non-specific reaction inhibition step, and a color development step as optional steps.
  • cell membrane proteins can be detected with high specificity.
  • Embedding medium refers to the reagent used for embedding.
  • Embedding refers to the process of permeating a biological sample with a reagent and hardening the biological sample.
  • Fixed tissue refers to a biological sample that contains fixed tissue.
  • Fixation refers to a process performed to protect a biological sample from deterioration due to autolysis or putrefaction by denaturing and/or precipitating proteins in the biological sample. Fixation in this specification includes any fixation process that uses a crosslinking agent, a coagulation precipitant, or a combination thereof.
  • biological sample refers to a sample composed of cells of an organism.
  • biological sample includes both samples isolated from an individual organism and samples containing cells prepared outside of a vitro system.
  • the individual organisms referred to herein are not particularly limited as long as they are eukaryotic organisms, but include, for example, mammalian organisms, including primates, pet animals, livestock, and sports animals. Preferred organisms include humans, horses, pigs, cows, sheep, goats, dogs, and cats.
  • Cell membrane protein refers to a protein present on the cell membrane.
  • “cell membrane protein” includes transmembrane proteins, cell membrane surface proteins, and lipid-modified proteins.
  • Cell membrane surface proteins and lipid-modified proteins are proteins that do not have a transmembrane domain.
  • a "transmembrane domain” is a protein domain that has affinity for the lipid bilayer that constitutes the cell membrane and penetrates the lipid bilayer.
  • the protein domain that is exposed on the outside of the cell is called the extracellular domain
  • the protein domain that is exposed on the inside of the cell is called the intracellular domain.
  • some lipid-modified proteins and cell membrane surface proteins are not entirely embedded in the cell membrane, and the entire protein can be called an extracellular domain or an intracellular domain.
  • Solid state refers to a state in which there is no fluidity.
  • the solid state preferably does not include a semi-solid state such as a gel.
  • immunologically reactive refers to the property of an antibody binding to an antigen or a partial polypeptide thereof in vivo. For example, it refers to having the activity of binding to an antigen based on an antigen-antibody reaction.
  • binding to an antigen includes both specific and non-specific binding.
  • an “antibody” refers to an immunoglobulin or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to another molecule.
  • antibody includes both monoclonal and polyclonal antibodies and antigen-binding fragments thereof.
  • Label refers to a substance whose presence is detectable. As used herein, labeling a substance refers to covalently linking the substance to a label.
  • Baking refers to the process of heating in an atmosphere.
  • “baking” specifically refers to the process of heating fixed tissue in an atmosphere to a temperature above the melting point of the embedding medium. This process is usually performed to partially melt the embedding medium and to attach the tissue to a glass slide or the like.
  • disease marker refers to a biological molecule (e.g., a nucleic acid molecule or a protein molecule) that serves as an indicator for determining whether or not a person has a disease or is at risk of developing the disease.
  • the term particularly refers to a protein that serves as an indicator for determining whether or not a person has a disease or is at risk of developing the disease.
  • cancer means a malignant neoplasm and is used interchangeably with “tumor.”
  • cancer includes primary cancer, metastatic cancer, metastatic cancer, and recurrent cancer.
  • CAPRIIN-1 cytopasmic-activation and proliferation-associated protein 1 protein
  • CAPRIN-1 protein refers to a cell membrane protein that is expressed mainly on the cell membrane of cancer cells.
  • the CAPRIN-1 protein also includes proteins that have biological functions equivalent to those of human CAPRIN-1 protein, such as homologs (i.e., homologs or orthologs), mutants such as genetic polymorphisms, and derivatives.
  • Treatment refers to a procedure to completely or partially cure or alleviate a disease or condition or its associated symptoms, or to prevent or delay its progression in an individual who already has the condition.
  • prevention refers to a procedure to prevent or delay the onset of a disease or condition in an individual who may be susceptible to the disease or condition.
  • Therapeutic method or “prophylactic method” refers to a method used for therapeutic or prophylactic treatment.
  • the method of this embodiment includes an embedding medium removing step, a labeling step, and a label detection step as essential steps, and an antigen retrieval step, a cooling step, a non-specific reaction inhibition step, and a color development step as optional steps. Each step is described in detail below.
  • Embedding medium removal process (S0101)
  • the "embedding medium removing step (S0101)" is an essential step, in which the fixed tissue containing the embedding medium in a solid state is brought into contact with a removal solution to remove the embedding medium.
  • the embedding medium is not particularly limited as long as it is a medium capable of embedding and hardening a tissue, and can be appropriately selected according to, for example, the type of fixed tissue to be fixed, the temperature conditions for embedding, the detection method used in the label detection step, and the like.
  • specific embedding media include, for example, wax, paraffin (e.g., Paraplast, Broloid, and Tissuecan), paraffin wax, acrylic resins, methacrylic acid resins (e.g., ethylene glycol dimethacrylate, glycol methacrylate, butyl methacrylate, hydroxypropyl methacrylate, methyl methacrylate, etc.), dammar resins, epoxy resins, divinylbenzene, other plastic resins (e.g., Sparplastics, Lowicryl®, Epon, Araldite, LR White, and Durcupan, etc.), and combination copolymers thereof.
  • Preferred embedding media herein are paraffin and paraffin wax.
  • specific embedding media include, for example, Optimum Cutting Temperature (OCT) compound (e.g., Tissue-Tek® O.C.T. compound or Tissue-plus® O.C.T. compound), PELCO® freezing embedding compound, PolarStat®, PolarStat Plus® embedding medium, and Tissue Freezing Medium (TFM®).
  • OCT Optimum Cutting Temperature
  • PELCO® freezing embedding compound e.g., Tissue-Tek® O.C.T. compound or Tissue-plus® O.C.T. compound
  • PELCO® freezing embedding compound
  • PolarStat® PolarStat Plus® embedding medium
  • Tissue Freezing Medium Tissue Freezing Medium
  • the embedding medium may be diluted with an organic solvent or aqueous solution to achieve the desired hardness.
  • the fixed tissue used in this step is the biological sample for which cell membrane proteins are to be detected by the method of this embodiment.
  • the individual, organ, and tissue from which the fixed tissue is derived are not particularly limited.
  • the individual may be a healthy individual, an individual possibly suffering from a disease, or an individual suffering from a disease.
  • the term “healthy individual” refers to an individual in a healthy state.
  • the term “healthy state” refers to a state in which the individual is at least not afflicted by the disease being tested, and preferably a healthy state free of any disease or disorder.
  • the fixed tissue may include diseased tissue, may potentially include diseased tissue, or may include only normal tissue.
  • the fixed tissue may be derived from a single individual, or may be derived from multiple individuals simultaneously.
  • the fixed tissues derived from each individual may be derived from a single organ or multiple organs.
  • the type of disease is not particularly limited. Examples include cancer and inflammation, and examples of tissues from which fixed tissues are derived include cancer tissue and inflamed tissue.
  • the cell membrane protein detected by the method of this embodiment may be, for example, a cell membrane protein expressed on the surface of diseased cells, and examples of such cell membrane proteins include a cell membrane protein expressed on the surface of inflammatory cells and a cell membrane protein expressed on the surface of cancer cells.
  • the cancers targeted by the present invention are not particularly limited.
  • the cancer may be one in which CAPRIN-1 protein is expressed on the cell membrane surface.
  • Preferred cancers include basal cell carcinoma, Paget's disease, skin cancer, breast cancer, kidney cancer, pancreatic cancer, colon cancer, lung cancer, brain tumor, stomach cancer, uterine cancer, ovarian cancer, prostate cancer, bladder cancer, esophageal cancer, leukemia, lymphoma, liver cancer, gallbladder cancer, sarcoma, mast cell tumor, adrenocortical carcinoma, Ewing's tumor, Hodgkin's lymphoma, mesothelioma, multiple myeloma, testicular cancer, thyroid cancer, head and neck cancer, Bowen's disease, melanoma, squamous cell carcinoma, extramammary Paget's disease, mycosis fungoides, Sezary syndrome, skin cancer, and leukemia.
  • T/NK cell lymphoma T cell leukemia/lymphoma with lesions only in the skin
  • cutaneous B cell lymphoma indolent group
  • cutaneous T cell lymphoma breast adenocarcinoma
  • hybrid breast adenocarcinoma malignant mixed tumor of the breast
  • intraductal papillary adenocarcinoma lung adenocarcinoma
  • squamous cell carcinoma small cell carcinoma, large cell carcinoma
  • neuroepithelial tissue tumors such as glioma, glioblastoma, neuroblastoma, ependymoma, neuronal cell tumor, embryonal neuroectodermal tumor, neurilemmoma, neurofibroma, meningioma, chronic lymphocytic leukemia , gastrointestinal lymphoma, digestive lymphoma, small to medium cell lymphoma, cecal cancer, ascending colon cancer, descending colon cancer, transverse
  • the type of cell membrane protein detected by the method of this embodiment is not particularly limited. It may be any of transmembrane proteins, cell membrane surface proteins, and lipid-modified proteins, and may be a protein that is localized on the cell membrane under specific conditions. For example, it may be a cell membrane protein that does not have a transmembrane domain, or a cell membrane protein that is exposed in whole or in part to the outside of the cell.
  • Cell membrane proteins in this specification can include, for example, disease markers such as cancer markers.
  • cancer markers include, for example, proteins such as CAPRIN-1, HER2, CD20, carcinoembryonic antigen (CEA), CA-125, CA19-9, CD117, ALK, BCR-ABL1, BRAF, CFTR, EGFR, IL2RA, RAS, and Claudin8.
  • the method of fixing the fixed tissue is not particularly limited, and any method known in the art can be used. For example, the method described in Hopwood D. "Fixatives and fixation: a review.” Histochem J. 1969;1(4):323-60 or the method described in "Immunohistochemical Staining Methods" 6th Edition (2013) (DAKO North America, Inc.) can be used.
  • the reagent used for fixation is not particularly limited. For example, it may be any of a crosslinking agent, a coagulation precipitant, or a combination thereof.
  • fixatives include crosslinking agents such as glutaraldehyde, formaldehyde, paraformaldehyde, paraformaldehyde-picric acid, periodic acid-lysine-paraformaldehyde, and zinc ion-formaldehyde solutions; coagulation precipitants such as methanol, ethanol, acetone, acetate-zinc chloride, and methanol-acetone mixtures; and mixtures thereof (e.g., formalin solutions). Fixatives can be used by diluting them with a buffer solution or the like, as necessary.
  • crosslinking agents such as glutaraldehyde, formaldehyde, paraformaldehyde, paraformaldehyde-picric acid, periodic acid-lysine-paraformaldehyde, and zinc ion-formaldehyde solutions
  • coagulation precipitants such as methanol, ethanol, acetone, acetate-zinc chloride, and methanol-acetone mixture
  • fixation conditions are not particularly limited.
  • fixation temperatures include 0°C or lower, 4°C to 45°C, 4°C to 37°C, 4°C to 30°C, and 4°C to 25°C.
  • fixation time examples include 30 seconds to 48 hours, 10 minutes to 36 hours, 20 minutes to 24 hours, and 30 minutes to 20 hours.
  • fixation can be performed once or more, twice or more, or three or more times. When fixation is performed multiple times, the fixation method, reagents, and conditions used for each fixation may be the same or different.
  • fixation, dehydration and replacement treatments can be performed as necessary. There are no particular limitations on the conditions for each, and any method known in the art can be used. For example, the method described in the washing step of this process can be used.
  • the fixed tissue used in the method of this embodiment may be either a tissue fragment in which the fixed tissue is embedded in the embedding medium described above, or a section thereof.
  • the fixed tissue is a section.
  • Sections can be prepared using methods known in the art, for example, by manual tomography or by using a thin-sectioning device (such as a microtome, vibratome, or cryostat).
  • a thin-sectioning device such as a microtome, vibratome, or cryostat.
  • the thickness of the slice is not particularly limited. Specific thicknesses include, for example, 0.5 ⁇ m or more, 1 ⁇ m or more, 2 ⁇ m or more, 3 ⁇ m or more, or 4 ⁇ m or more. Also, for example, the thickness can be 300 ⁇ m or less, 200 ⁇ m or less, 150 ⁇ m or less, 100 ⁇ m or less, 80 ⁇ m or less, 60 ⁇ m or less, 50 ⁇ m or less, 30 ⁇ m or less, 20 ⁇ m or less, 15 ⁇ m or less, 10 ⁇ m or less, 8 ⁇ m or less, 7 ⁇ m or less, 6 ⁇ m or less, or 5 ⁇ m or less.
  • the thickness of the slice may be within the range of 1 ⁇ m to 300 ⁇ m, 1 ⁇ m to 100 ⁇ m, 1 ⁇ m to 50 ⁇ m, 1 ⁇ m to 20 ⁇ m, 1 ⁇ m to 10 ⁇ m, 2 ⁇ m to 100 ⁇ m, 2 ⁇ m to 50 ⁇ m, 2 ⁇ m to 20 ⁇ m, 2 ⁇ m to 10 ⁇ m, etc.
  • the section may be placed on a support such as a glass slide, or may not be placed on a support and may be, for example, suspended in a solution.
  • the section is placed on a support such as a glass slide.
  • the material of the support is not particularly limited, but may include, for example, a polymeric material, a glass material, a plastic material, or a metal material. Examples of glass materials include soda-lime glass, borosilicate glass, crown glass, and combinations thereof.
  • the shape of the support is not particularly limited. For example, membranes, microtiter plates, beads, filters, test strips, slides, cover glasses, and test tubes can be used as supports.
  • the support may be surface-treated as necessary.
  • the section can be attached to the support.
  • the method of attachment is not particularly limited, but examples include methods using matrices such as silane, gelatin, and poly-L-lysine.
  • the fixed tissue includes an embedding medium in a solid state.
  • the embedding medium being in a solid state means that the embedding medium is not melted. In other words, in the fixed tissue used in the method of this embodiment, the embedding medium is not melted in whole or in part.
  • the ratio of the solid-state embedding medium to the total embedding medium in the fixed tissue is not particularly limited. For example, it may be 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, or 100%.
  • the fixed tissue used in this process has not been baked and has not been heated above the melting point of the embedding medium in the atmosphere.
  • Melting point refers to the transition temperature at which a substance in a solid state melts into a liquid state when heated.
  • the heating temperature here varies depending on the type of embedding medium used.
  • the melting point of a typical O.C.T. compound is -15°C to -5°C, although this varies depending on the product, so when using such a medium, temperatures exceeding this temperature apply.
  • Specific temperatures for example, it is preferable that the medium is not exposed to an atmosphere of -20°C or higher, -15°C or higher, -10°C or higher, -5°C or higher, or 0°C or higher for a certain period of time.
  • the melting point of a typical paraffin wax is 45°C to 75°C, although this varies depending on the product, so when using such a medium, temperatures exceeding this temperature apply. It is preferable that the medium is not exposed to an atmosphere of 40°C or higher, 45°C or higher, 50°C or higher, 55°C or higher, 60°C or higher, or 62°C or higher for a certain period of time.
  • the exposure time here is not particularly limited as long as it is a time sufficient for the embedding medium in the fixed tissue to begin to melt.
  • the tissue is not exposed to an atmosphere with a temperature above the melting point of the embedding medium for 1 minute or more, 2 minutes or more, 3 minutes or more, 5 minutes or more, 6 minutes or more, 7 minutes or more, 8 minutes or more, 9 minutes or more, 10 minutes or more, 11 minutes or more, 12 minutes or more, 14 minutes or more, or 15 minutes or more.
  • the tissue is not exposed to an atmosphere with a temperature of 50°C or more for 5 minutes or more, an atmosphere with a temperature of 55°C or more for 10 minutes or more, or an atmosphere with a temperature of 60°C or more for 15 minutes or more.
  • the term "removal solution” refers to a solution capable of dissolving the embedding medium.
  • the type of removal solution is not particularly limited.
  • the embedding medium is a lipophilic substance, for example, a solution containing a surfactant and/or an organic solvent can be used.
  • a solution containing an organic solvent is used.
  • the embedding medium is a hydrophilic substance, for example, water and/or an aqueous solution (such as an aqueous solution containing a sugar such as sucrose, a buffer solution, etc.) can be used.
  • the organic solvent used in this step is not particularly limited.
  • linear, branched, and cyclic alkanes having 4 to 16 carbon atoms (heptane, hexadecane, etc.); linear, branched, and cyclic dialkyl ethers having 4 to 16 carbon atoms (diethyl ether, dioctyl ether, etc.); aromatic hydrocarbons such as toluene and xylene; alcohols such as methanol, ethanol, and isopropyl alcohol; alkyl halides such as chloroform; monoterpenes such as limonene; vegetable oils such as citrus oil and coconut oil; or mixtures of these.
  • substitutes for these e.g., xylene substitutes, etc.
  • removal solutions provided with automatic staining devices e.g., Artisan Cleaning Solution (Agilent)
  • xylene substitutes include Tissue Clear xylene substitute, Shandon xylene substitute, aliphatic hydrocarbons such as heptane and hexadecane, derivatives of aliphatic hydrocarbons such as dioctyl ether, and mixtures thereof.
  • the concentration of the organic solvent contained in the removal solution is not particularly limited.
  • the concentration by weight percent can be 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, 99% or more, or 100%.
  • xylene and one or more concentrations of aqueous ethanol solutions can be used as the removal solution.
  • the removal solution used in this process is preferably xylene or a xylene substitute (e.g., one that contains an aliphatic hydrocarbon).
  • Step> the fixed tissue is brought into contact with a removal solution, so that all or part of the embedding medium in the fixed tissue is dissolved in the removal solution.
  • the contact method is not particularly limited as long as it is a method that allows contact between the removal solution and the embedding medium in the fixed tissue.
  • the removal solution can be sprayed, sprinkled, or applied to the fixed tissue, or the fixed tissue can be immersed in the removal solution.
  • the contact in this step is preferably immersion.
  • the contact location of the fixed tissue with the removal solution may be any of the whole or part of the fixed tissue, but if the removal solution comes into contact with a part of the fixed tissue, care should be taken to ensure that the removal solution comes into contact with at least most of the embedding medium in the fixed tissue.
  • this step can be carried out so that the removal solution comes into contact with 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, or 100% of the embedding medium.
  • the contact conditions in this step are not particularly limited as long as the embedding medium is soluble in the removal solution.
  • contact can be performed for a relatively long period of time at a relatively low temperature that is higher than the freezing point of the removal solution and lower than the melting point of the embedding medium.
  • Freezing point refers to the transition temperature at which a liquid substance solidifies into a solid state upon cooling.
  • the time in this case is not particularly limited, but can be, for example, 3 minutes or more, 5 minutes or more, 6 minutes or more, 8 minutes or more, 10 minutes or more, 11 minutes or more, 12 minutes or more, 13 minutes or more, 14 minutes or more, 15 minutes or more, 17 minutes or more, 19 minutes or more, or 20 minutes or more.
  • the contact can be for 48 hours or less, 36 hours or less, 30 hours or less, 24 hours or less, 20 hours or less, 18 hours or less, 16 hours or less, 15 hours or less, 12 hours or less, 8 hours or less, 6 hours or less, 3 hours or less, 2 hours or less, 90 minutes or less, 60 minutes or less, 30 minutes or less, 25 minutes or less, or 20 minutes or less.
  • the lower limit of the temperature is not particularly limited as long as it is higher than the freezing point of the removal solution.
  • This temperature varies depending on the type of removal solution used. For example, when xylene is used as the removal solution, the temperature may be higher than the freezing point of xylene, which is -25°C, and when ethanol is used, the temperature may be higher than the freezing point of ethanol, which is -114.5°C.
  • Specific temperatures include, for example, temperatures of -100°C or higher, -50°C or higher, -24°C or higher, -10°C or higher, 0°C or higher, 1°C or higher, 5°C or higher, 10°C or higher, 15°C or higher, 20°C or higher, and 25°C or higher.
  • the upper limit of the temperature is not particularly limited as long as it is lower than the melting point of the embedding medium.
  • This temperature varies depending on the type of embedding medium used.
  • the temperature may be lower than the melting point of paraffin wax, which is 45°C to 75°C.
  • Specific temperatures include, for example, temperatures below 75°C, below 70°C, below 65°C, below 60°C, below 55°C, below 50°C, below 45°C, below 40°C, below 37°C, below 35°C, below 30°C, or below 27°C.
  • it can be performed at room temperature (1°C to 30°C) or normal temperature (15°C to 25°C).
  • contact with an aromatic hydrocarbon such as xylene can be performed at normal temperature for 20 minutes or more.
  • the temperature may be maintained at a constant level during contact, or may be changed appropriately during contact or may vary naturally.
  • the contact may be performed multiple times.
  • the removal solution and the contact conditions used for each contact may be the same each time, or may be different for each contact.
  • the removal solution may be renewed for each contact.
  • it can be performed at a relatively high temperature, for example, above the melting point of the embedding medium and below the boiling point of the removal solution, for a relatively short time.
  • Biting point refers to the temperature at which the vapor pressure of a liquid is equal to the pressure of the system. In this specification, “boiling point” specifically refers to the temperature at which the vapor pressure of a liquid is equal to one atmosphere.
  • the time in this case is not particularly limited, but can be, for example, 3 seconds or more, 5 seconds or more, 10 seconds or more, 15 seconds or more, 20 seconds or more, 25 seconds or more, or 30 seconds or more.
  • the upper limit of the time is not particularly limited as long as it is within a range that does not cause excessive stress on the fixed tissue. For example, contact can be made for 1 minute or less, 55 seconds or less, 50 seconds or less, 45 seconds or less, 40 seconds or less, 35 seconds or less, or 30 seconds or less.
  • the lower limit of the temperature is not particularly limited as long as it is equal to or higher than the melting point of the embedding medium.
  • This temperature varies depending on the type of embedding medium used. For example, when paraffin is used as the embedding medium, the temperature may be equal to or higher than the melting point of paraffin wax, which is 45°C to 75°C. Specific temperatures include, for example, 45°C or higher, 50°C or higher, 55°C or higher, 60°C or higher, 65°C or higher, 70°C or higher, 72°C or higher, or 75°C or higher.
  • the upper limit of the temperature is not particularly limited as long as it is lower than the boiling point of the removal solution.
  • the temperature when xylene is used as the removal solution, the temperature may be lower than the boiling point of xylene, which is 138°C to 144°C, and when ethanol is used, the temperature may be lower than the boiling point of ethanol, which is 78.37°C.
  • Specific temperatures include, for example, 140°C or less, 130°C or less, 120°C or less, 110°C or less, 100°C or less, 90°C or less, 85°C or less, 80°C or less, 78°C or less, or 75°C or less.
  • the percentage of the embedding medium removed by this process is not particularly limited as long as it does not inhibit the antigen-antibody reaction using a primary antibody or the like.
  • this process removes 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, or 100% of the embedding medium.
  • the removal solution can be made to flow as needed.
  • the flow can be artificial, such as by stirring, or can occur naturally, such as by convection.
  • the fixed tissue can be moved as needed, such as by changing the position of the fixed tissue.
  • contact with the removal solution can be followed by a separation step to separate the dissolved embedding medium and the fixed tissue.
  • the method of separation is not particularly limited. Since the dissolved embedding medium is liquid and the fixed tissue is solid, any method for separating solids and liquids known in the art can be used. For example, separation can be performed by centrifugation using a dehydrator or the like.
  • the separation step may not be necessary if a large excess of removal solution is used in the contact step, if the removal solution is made to flow, or if the removal solution is renewed.
  • a washing step can be performed to wash away any remaining removal solution from the fixed tissue. Washing is performed by contacting the fixed tissue with a washing solution. The contact can be performed by the method and under the conditions described above for the contact step.
  • the cleaning solution is not particularly limited as long as it can remove the dissolved embedding medium remaining on the surface of the fixed tissue, the removal solution in which the embedding medium has dissolved, and/or the removal solution in the fixed tissue.
  • a solvent different from the solvent used in the contact step may be used as the cleaning solution.
  • a water-soluble solvent is used as the cleaning solution.
  • Specific examples of the cleaning solution that can be used include water, any buffer solution (such as phosphate buffer), alcohol (such as methanol and ethanol), or a mixture of these.
  • alcohol and/or a buffer solution more specifically, ethanol and/or phosphate buffer, can be used.
  • Washing can be performed multiple times.
  • the washing solution and washing conditions used for each wash may be the same each time, or may be different for each wash.
  • xylene is used as the removal solution
  • washing with an alcohol such as ethanol can be performed, and then washing with a buffer solution such as a phosphate buffer can be performed.
  • a buffer solution such as a phosphate buffer
  • xylene and ethanol can be used independently, and for example, the fixed tissue can be contacted with xylene and then with ethanol.
  • the concentration of the ethanol solution is not particularly limited.
  • concentrations can be used in weight percent: 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, 99% or more, or 100%.
  • concentrations can be used in weight percent: 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, 99% or more, or 100%.
  • three different concentrations of ethanol solutions can be contacted in order of decreasing concentration. Specifically, for example, washing can be performed by contacting the tissue with 100%, 90% and 80% ethanol solutions in sequence.
  • the washing solution can be made to flow as appropriate.
  • the flow can be artificially performed by stirring or the like, or can be natural by convection or the like.
  • the fixed tissue can be moved as appropriate, for example by changing the position of the fixed tissue. Washing can also be performed in any other step.
  • Antigen retrieval step (S0102) is an optional step for activating cell membrane proteins in the fixed tissue. This step can be carried out after the removal step (S0101). Optionally, this step can be carried out simultaneously with the removal step (S0101).
  • Antigen activation is performed by heat treatment, enzyme treatment, or a combination thereof.
  • any method known in the art can be used.
  • the methods described in Shi et al. J Histochemistry & Cytochemistry, 2011, 59:13-32
  • D'Amico et al. J Immunological Methods, 2009, 341:1-18
  • McNicoll and Richmond Histopathology, 1998, 32:97-103 can be used.
  • the necessity of this step and the treatment to be performed when this step is performed can be appropriately selected depending on the type of antigen and the properties of the fixed tissue.
  • This process includes, for example, an enzyme treatment step and/or a heat treatment step, and preferably includes a heat treatment step.
  • the enzyme treatment can be carried out using proteases such as trypsin, DNase, proteinase K, pepsin, pronase, and ficin.
  • proteases such as trypsin, DNase, proteinase K, pepsin, pronase, and ficin.
  • the treatment conditions are not particularly limited as long as the enzyme can exhibit activity.
  • the treatment conditions can be determined based on the optimum temperature and optimum pH of the enzyme.
  • the heat treatment step can be performed by applying a heated antigen retrieval solution to the fixed tissue.
  • the type of antigen retrieval solution is not particularly limited, but examples thereof include citrate buffer, a solution containing a divalent ion chelating agent such as EDTA, tris(hydroxymethyl)methylamine (TRIS) buffer, 4-2-hydroxyethyl-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffer, 2- ⁇ [tris(hydroxymethyl)methyl]amino ⁇ ethanesulfonic acid (TES) buffer, 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (TAPS) buffer, N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine (Bicine) buffer, N-tris(hydroxymethyl)methylglycine (Tricine) buffer, glycine-HCl buffer, periodic acid solution, urea solution, lead thiocyanate solution, and the like.
  • the buffer may include, for example, an acidic compound such as potassium dihydrogen phosphate, boric acid, diethylbarbituric acid, piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid), dimethylarsinic acid, 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid, or combinations thereof.
  • an acidic compound such as potassium dihydrogen phosphate, boric acid, diethylbarbituric acid, piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid), dimethylarsinic acid, 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid, or combinations thereof.
  • the pH is not particularly limited, but can be in the range of, for example, 6 to 11, 7 to 10, 7.5 to 9.5, or 8 to 9.
  • the temperature of the heat treatment is not particularly limited, but can be, for example, in the range of 90°C to 130°C. Specifically, it can be, for example, in the range of 90°C to 130°C, 92°C to 128°C, 95°C to 125°C, or 99°C to 121°C.
  • the heating time is not particularly limited.
  • the treatment can be performed for 10 minutes or more, 20 minutes or more, 25 minutes or more, 30 minutes or more, 35 minutes or more, or 40 minutes or more.
  • the treatment time can be, for example, 3 hours or less, 2 hours or less, 90 minutes or less, 60 minutes or less, 50 minutes or less, or 45 minutes or less.
  • the conditions may be constant or may change intermittently or continuously. If the conditions change, the change may be artificial or natural.
  • the solution may be made to flow as appropriate. In this case, the flow may be artificial, such as by stirring, or natural, such as by convection.
  • the fixed tissue may be moved as appropriate, such as by changing the position of the fixed tissue.
  • each antigen activation can be carried out under different conditions or the same conditions.
  • the "cooling step” is an optional step in which the fixed tissue is cooled. This step can be performed after the antigen retrieval step.
  • this step can be performed when antigen activation is performed by heat treatment or when the temperature is increased for enzyme treatment.
  • the cooling method is not particularly limited as long as it can lower the temperature of the fixed tissue to a certain temperature.
  • a method of leaving the tissue in a low-temperature atmosphere or in a solution, a method using a cooling device such as a refrigerator or freezer, or a combination of these methods can be used.
  • the temperature after cooling is not particularly limited. For example, it can be freezing temperature (0°C or below), refrigerated temperature (0°C to 5°C), room temperature (1°C to 30°C), or normal temperature (15°C to 25°C). It is preferably cooled to room temperature or normal temperature.
  • the cooling rate and cooling time are not particularly limited.
  • the cooling time in this step refers to the time required for the fixed tissue to drop to the desired temperature. Therefore, if the temperature reaches equilibrium after the drop and is maintained at that temperature, the time until equilibrium is reached is the time for this step. If necessary, the fixed tissue can be stored for any length of time by leaving it to stand after this step or any other step.
  • the cooling time can be, for example, 10 minutes to 24 hours, 20 minutes to 16 hours, 30 minutes to 12 hours, 35 minutes to 6 hours, 40 minutes to 3 hours, 40 minutes to 2 hours, or 40 minutes to 1 hour.
  • the solution and atmosphere can be made to flow as appropriate.
  • the flow in this case can be artificial, such as by stirring, or can be natural, such as by convection.
  • the fixed tissue can be moved as appropriate, such as by changing the position of the fixed tissue.
  • Non-specific reaction suppression step is an optional step in which the fixed tissue is contacted with a reaction suppressor to suppress non-specific reactions in the antibody reaction and/or color reaction. This step can be performed after the embedding medium removal step. If the antigen retrieval step is performed, this step can be performed simultaneously with or after the antigen retrieval step. If the cooling step is performed, this step can be performed simultaneously with or after the cooling step.
  • This process is broadly divided into a blocking step that suppresses non-specific binding of antibodies, and an endogenous reaction suppression step that suppresses non-specific color reactions. Either one of these steps may be performed, or both steps may be performed. Each step may be performed independently multiple times, and one or more other steps may be performed between each step.
  • ⁇ Blocking step> the fixed tissue is contacted with a blocking solution to prevent non-specific binding of the antibody used.
  • the timing of this step is not particularly limited, so long as it is performed after the embedding medium removal step. If an antigen activation step is performed, it can be performed simultaneously with or after that. For example, it may be performed before, simultaneously with or after the labeling step described below. For example, it may be performed before, simultaneously with or after the primary antibody reaction step and the secondary antibody reaction step. This step may be performed multiple times, in which case the steps may be performed consecutively with one another, and one or more steps may be included in between.
  • any method known in the art can be used for blocking.
  • this step is performed by incubating the fixed tissue in contact with the blocking solution for a certain period of time.
  • the blocking solution can be placed on the fixed tissue and incubated for a certain period of time.
  • the solution can be replaced with the blocking solution and incubated for a certain period of time.
  • Blocking solutions generally contain proteins. There are no particular limitations on the type of protein contained in the blocking solution. Examples include animal serum proteins, immunoglobulin proteins, skim milk, non-fat milk, casein, and mixtures thereof.
  • the animal from which the serum protein is derived is not particularly limited.
  • serum proteins from goats, horses, humans, mice, rabbits, rats, or pigs include serum proteins from goats, horses, humans, mice, rabbits, rats, or pigs.
  • bovine serum albumin, fetal bovine serum, horse serum, goat serum, etc. can be used.
  • the solvent of the blocking solution is not particularly limited, but is usually a buffer solution.
  • the specific type of buffer solution is not particularly limited.
  • a phosphate buffer solution such as PBS
  • the buffer solution can be a tris(hydroxymethyl)methylamine (TRIS) buffer solution, a 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (TAPS) buffer solution, an N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine (Bicine) buffer solution, an N-tris(hydroxymethyl)methylglycine (Tricine) buffer solution, a 4-2-hydroxyethyl-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffer solution, a 2- ⁇ [tris(hydroxymethyl)methyl]amino ⁇ ethanesulfonic acid (TES) buffer solution, an acetate buffer solution, a carbonate buffer solution, a citrate buffer solution, or a combination thereof.
  • TAS tris(hydroxymethyl)methylamine
  • TAPS 2-(N-morpholino)ethan
  • the solvent may contain additives as appropriate, for example, surfactants such as Tween 20 and Triton X-100.
  • surfactants such as Tween 20 and Triton X-100.
  • a buffer solution to which these additives have already been added such as PBS-T (PBS containing 0.05% Tween 20), can be used.
  • the pH of the solvent is not particularly limited. Specific pH values include, for example, 6 to 8, 7 to 8, 7.2 to 7.8, 7.3 to 7.6, and 7.4 to 7.5.
  • the protein concentration is not particularly limited.
  • the concentration can be 0.1% to 30%, 1% to 30%, 5% to 30%, or 10% to 20% by weight and volume.
  • Endogenous response inhibition step In the endogenous reaction inhibition step, the fixed tissue is contacted with an inhibitor of the color reaction to inhibit non-specific reactions.
  • the timing of this step is not particularly limited as long as it is performed after the embedding medium removal step and before the color development step described below.
  • an antigen activation step it can be performed simultaneously with or after that and before the color development step described below.
  • a blocking step it may be performed before, simultaneously with or after that, and it may be performed before, simultaneously with or after the labeling step described below.
  • it may be performed before, simultaneously with or after the primary antibody reaction step and the secondary antibody reaction step. This step may be performed multiple times, in which case the steps may be performed consecutively with one another and one or more steps may be included in between.
  • the method for suppressing endogenous reactions is not particularly limited as long as it can suppress endogenous reactions of fixed tissues that may be involved in color reactions and inhibit detection of the label bound to the primary antibody described below.
  • it can be appropriately determined depending on the type of label used and the color reaction used.
  • a quenching agent can be applied to the fixed tissue to suppress the autofluorescence of the fixed tissue.
  • H2O2 e.g., 3% H2O2
  • a peroxidase inhibitor or a peroxidase inhibitor reagent can be used to suppress the activity of peroxidase in the fixed tissue.
  • biotin is used as a label
  • an excess of avidin and biotin can be applied to the fixed tissue to reduce the amount of biotin present in the fixed tissue.
  • a phosphatase inhibitor such as levamisole
  • a phosphatase inhibitor can be applied to the fixed tissue to suppress the activity of phosphatase in the fixed tissue.
  • this step can be performed using a reagent that has two or more of these activities.
  • the duration of this process is not particularly limited. For example, it can be 15 minutes or more, 30 minutes or more, 40 minutes or more, or 60 minutes or more. It can also be 24 hours or less, 16 hours or less, 12 hours or less, 6 hours or less, 3 hours or less, or 2 hours or less.
  • the temperature of this process is not particularly limited.
  • it can be carried out under temperature conditions such as freezing temperature (0°C or below), refrigerated temperature (0°C to 5°C), room temperature (1°C to 30°C), or normal temperature (15°C to 25°C).
  • the conditions may be constant or may change intermittently or continuously. If the conditions change, the change may be artificial or natural.
  • Labeling step (S0103) is an essential step, and is a step of binding the cell membrane protein of the fixed tissue with the labeled antibody. This step can be performed after the embedding medium removal step (S0101). Antigen When the activation step (S0102) is performed, this step can be performed simultaneously with or after the antigen activation step (S0102). When the non-specific reaction suppression step is performed, it can be performed simultaneously with the blocking step. Or it can be done later.
  • the method for reacting the labeled antibody with the cell membrane protein of the fixed tissue is not particularly limited, as long as it is a method that can directly or indirectly bind the labeled antibody to the cell membrane protein in the fixed tissue.
  • this may be done by using a labeled antibody that is immunologically reactive with the cell membrane protein, or by using a labeled antibody that is immunologically reactive with a complex of the cell membrane protein and a binding molecule that binds to the cell membrane protein (e.g., an antibody that is immunologically reactive with the cell membrane protein).
  • a step of binding the labeled antibody to the cell membrane protein is carried out to perform labeling.
  • This step can be carried out after the embedding medium removal step.
  • an antigen activation step is carried out, this step can be carried out simultaneously with or after the antigen activation step.
  • a non-specific reaction suppression step is carried out, this step can be carried out particularly simultaneously with or after the blocking step.
  • labeling typically involves a first binding step in which the binding molecule (e.g., an antibody that is immunologically reactive with the cell membrane protein) is bound to the membrane protein, and a second binding step in which a labeled antibody that is immunologically reactive with the complex of the binding molecule and the cell membrane protein is bound to the complex.
  • the binding molecule e.g., an antibody that is immunologically reactive with the cell membrane protein
  • a second binding step in which a labeled antibody that is immunologically reactive with the complex of the binding molecule and the cell membrane protein is bound to the complex.
  • the first binding step can be performed after the embedding medium removal step. For example, if an antigen activation step is performed, the first binding step can be performed simultaneously with or after the antigen activation step. If a non-specific reaction suppression step is performed, the first binding step can be performed simultaneously with or after the blocking step.
  • the second binding step can usually be performed after the first binding step. Optionally, this step can be performed simultaneously with the second binding step.
  • the binding step may be performed three or more times.
  • the second and subsequent binding steps are performed using a binding molecule capable of binding to the complex formed in the previous binding step.
  • the binding molecule used in the binding steps other than the last binding step (corresponding to the second binding step) may be labeled or may be an unlabeled binding molecule.
  • the type of binding molecule is not particularly limited, but is preferably a binding molecule that specifically binds to a cell membrane protein.
  • a binding molecule that specifically binds to a cell membrane protein.
  • the binding mode between the binding molecule and the cell membrane protein is not particularly limited.
  • the binding molecule binds to the transmembrane domain of the cell membrane protein, a portion of the cell membrane protein other than the transmembrane domain, for example, a portion not embedded in the cell membrane, an intracellular domain or an extracellular domain of the cell membrane protein.
  • the specific details of the binding properties of the binding molecule, the reaction solution, and the application method are as described below in relation to the "primary antibody reaction step.”
  • the binding mode between the labeled antibody having immunological reactivity to the complex of the binding molecule and the cell membrane protein and the complex is not particularly limited.
  • the labeled antibody may be capable of binding only after the complex is formed, or may be capable of binding to either one of the components of the complex (the cell membrane protein or the binding molecule). Specific details regarding the labeled antibody are as described below in relation to the "secondary antibody reaction step.”
  • the first binding step is called the primary antibody reaction step
  • the second binding step is called the secondary antibody reaction step.
  • the "primary antibody reaction step” is a step in which a cell membrane protein of the fixed tissue is reacted with a primary antibody that is immunologically reactive with the cell membrane protein. This step can be performed after the embedding medium removal step. For example, when an antigen activation step is performed, this step can be performed simultaneously with or after the antigen activation step. When a non-specific reaction suppression step is performed, this step can be performed particularly simultaneously with or after the blocking step.
  • the primary antibody used in this step is not particularly limited as long as it is an antibody that has immunological reactivity with the cell membrane protein to be detected.
  • it may be an antibody that can bind to or specifically bind to the cell membrane protein of interest.
  • Specific antibodies can be appropriately determined based on the type of cell membrane protein to be detected. For example, they may be antibodies capable of binding to the transmembrane domain of a cell membrane protein, or they may be antibodies capable of binding to a portion of a cell membrane protein other than the transmembrane domain, for example, a portion that is not embedded in the cell membrane, or they may be antibodies capable of binding to the intracellular or extracellular domain of a cell membrane protein.
  • an anti-CAPRIN-1 antibody or an antigen-binding fragment thereof can be used.
  • Specific anti-CAPRIN-1 antibodies are not particularly limited. For example, see WO2010/016526, WO2011/096517, WO2011/096528, WO2011/096519, WO2011/096533, WO2011/096534, WO2011/096535, WO2013/018886, WO2013/018894, WO2013/018892, WO2013/018891, WO2013/0188 89, WO2013/018883, WO2013/125636, WO2013/125654, WO2013/125630, WO2013/125640, WO2013/147169, WO2013/147176, WO2015/020212, WO2018/079740, and WO2019/189780.
  • the primary antibody used in this step may be easier to detect if it has a high binding affinity to the cell membrane protein.
  • an antibody having a binding constant (affinity constant) K a (k on /k off ) of preferably at least 10 7 M -1 , at least 10 8 M -1 , at least 5 ⁇ 10 8 M -1 , at least 10 9 M -1 , at least 5 ⁇ 10 9 M -1 , at least 10 10 M -1 , at least 5 ⁇ 10 10 M -1 , at least 10 11 M -1 , at least 5 ⁇ 10 11 M -1 , at least 10 12 M -1 , or at least 10 13 M -1 may be used.
  • the type of antibody is not particularly limited.
  • any class and isotype may be used, such as IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, and IgM.
  • Antigen-binding fragments can be used as antibodies. Examples of antigen-binding fragments include Fab, Fv, F(ab') 2 , and Fab'.
  • aggregates, polymers, and conjugates of immunoglobulins or their antigen-binding fragments can also be used in appropriate cases, as long as the immunological reactivity with cell membrane proteins is substantially maintained.
  • the antibody used in this step may be either a monoclonal or polyclonal antibody.
  • the origin of the antibody is not particularly limited. Examples include human antibodies, non-human animal antibodies, recombinant antibodies, humanized antibodies, and chimeric antibodies.
  • the non-human animal is not particularly limited. For example, antibodies derived from mice, hamsters, rats, guinea pigs, rabbits, ferrets, goats, monkeys, etc. can be used.
  • the antibody production and purification methods used in this step are not particularly limited, and any method known in the art can be used.
  • the production and purification methods described in the literature exemplified for anti-CAPRIN-1 antibodies may be used.
  • any method known in the art can be used for the primary antibody reaction. Typically, this step is performed by incubating the fixed tissue in a solution of the primary antibody for a certain period of time.
  • composition of the antibody solution is not particularly limited as long as it contains an antibody and the antibody is not denatured.
  • the solvent of the antibody solution is not particularly limited, and may be, for example, any buffer solution or commercially available antibody diluent.
  • the specific type of buffer is not particularly limited.
  • the buffer solution exemplified for the blocking step may be used, and additives may be included as necessary. Any substance known in the art may be used as the additive, and examples of such additives include animal serum and serum proteins (bovine serum albumin, fetal bovine serum, goat serum, etc.), surfactants (Tween 20, Triton X-100, etc.). Multiple additives may be included, and may include, for example, fetal bovine serum, goat serum, and Tween 20.
  • the concentration of the additive is not particularly limited. For example, the concentration may be 0.1% to 30%, 1% to 30%, 5% to 30%, or 10% to 20% by weight and volume.
  • the pH of the solvent is not particularly limited. Specific pH values include, for example, 6 to 8, 7 to 8, 7.2 to 7.8, 7.3 to 7.6, and 7.4 to 7.5.
  • the solvent may have the same composition as the blocking solution, or it may have a different composition.
  • the concentration of the antibody solution is not particularly limited as long as the cell membrane protein can be detected.
  • it can be appropriately set depending on the amount of antigen in the fixed tissue and the type of label linked to the secondary antibody.
  • the concentration can be, for example, 0.1 ⁇ g/mL or more, 0.2 ⁇ g/mL or more, 0.3 ⁇ g/mL or more, 0.4 ⁇ g/mL or more, 0.5 ⁇ g/mL or more, 0.6 ⁇ g/mL or more, 0.7 ⁇ g/mL or more, or 0.8 ⁇ g/mL or more.
  • the concentration can be, for example, 10 ⁇ g/mL or less, 8 ⁇ g/mL or less, 7 ⁇ g/mL or less, 5 ⁇ g/mL or less, 4 ⁇ g/mL or less, 3 ⁇ g/mL or less, 2.5 ⁇ g/mL or less, or 2 ⁇ g/mL.
  • incubation is performed at refrigerated temperature for 12 to 24 hours or at room temperature for 15 to 40 minutes, but any incubation conditions known in the art can be used and are not particularly limited.
  • the incubation temperature can be, for example, freezing temperature (0°C or below), refrigerated temperature (0°C to 5°C), room temperature (1°C to 30°C), or normal temperature (15°C to 25°C).
  • the incubation time can be, for example, 15 minutes or more, 30 minutes or more, 40 minutes or more, or 60 minutes or more. It can also be, for example, 24 hours or less, 16 hours or less, 12 hours or less, 6 hours or less, 3 hours or less, or 2 hours or less.
  • the humidity conditions during incubation are not particularly limited as long as the antibody solution and the fixed tissue can continue to be in contact during incubation.
  • incubation is performed in an environment with 100% humidity (e.g., in a moist chamber).
  • the conditions may be constant, or may change intermittently or continuously. If the conditions change, the change may be artificial or natural.
  • the "secondary antibody reaction step” is a step of reacting a fixed tissue with a labeled secondary antibody that has immunological reactivity with the primary antibody. This step can usually be performed after the primary antibody reaction step. Optionally, this step may be performed simultaneously with the primary antibody reaction step.
  • the solvent for the antibody solution may be of the same composition as that used in the primary antibody reaction step, or may be of a different composition.
  • the type of secondary antibody is not particularly limited as long as it has immunological reactivity with the primary antibody.
  • the primary antibody has a constant region
  • an antibody capable of binding to the constant region of the primary antibody can be used as the secondary antibody.
  • the animal from which the secondary antibody is derived is not particularly limited, but preferably the secondary antibody is derived from an animal different from the animal from which the primary antibody is derived.
  • the type of label is not particularly limited. Examples include luminescent substances, fluorescent substances, enzymes, radioactive substances, biotin, avidin, quantum dots, enzyme substrates, enzyme cofactors, enzyme inhibitors, dyes, and metal ions.
  • luminescent substances include acridinium esters, 3-(2'-spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3"-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetane (AMPPD), luminol and its modified forms, 4-aminophthalhydrazide, various coelenterazines, and luciferin.
  • fluorescent substances include fluorescent dyes such as FITC, Texas, Cy3, Cy5, Cy7, FAM, HEX, VIC, JOE, Rox, TET, Bodipy493, NBD, TAMRA, and Alexa-Fluor dyes; fluorescent proteins such as GFP, EGFP, BFP, and YFP; and so on.
  • fluorescent dyes such as FITC, Texas, Cy3, Cy5, Cy7, FAM, HEX, VIC, JOE, Rox, TET, Bodipy493, NBD, TAMRA, and Alexa-Fluor dyes
  • fluorescent proteins such as GFP, EGFP, BFP, and YFP; and so on.
  • Enzymes include, for example, proteases, peroxidases, phosphatases (e.g., alkaline phosphatase), sulfatases, peptidases, glycosidases, hydrolases, oxidoreductases, lyases, transferases, isomerases, ligases, and synthetases.
  • peroxidases such as horseradish peroxidase and alkaline phosphatases such as calf intestinal alkaline phosphatase are used.
  • radioactive substances examples include 14 C, 123 I, 124 I, 131 I, 125 I, Tc99m, 32 P, 35 S, or 3 H.
  • the label may be directly bound to the antibody, or may be bound via a linker or the like, or may form a complex with the antibody via a polymer carrier or the like.
  • linker or polymer carrier There are no particular limitations on the specific type of linker or polymer carrier.
  • a linker known in the art such as a peptide linker, may be used.
  • a complex formed between an enzyme as a label and an antibody via a polymer carrier may be used.
  • a complex formed between a peroxidase as a label and an antibody via a polymer carrier for example, Peroxidase Labelled Polymer Conjugated (manufactured by DAKO) may be used.
  • the application method is not particularly limited. For example, it can be performed in accordance with the application method of the blocking solution in the blocking step.
  • Color development step is an optional step in which the fixed tissue is exposed to a reaction agent to make the label detectable. This step can be performed simultaneously with or after the labeling step. For example, this step can be performed simultaneously with or after the secondary antibody reaction step. If an endogenous reaction suppression step is performed, this step can be performed after that.
  • a color reaction is a reaction that makes a label detectable.
  • the reaction agent is not particularly limited as long as it is an agent that induces a color reaction of the label used.
  • an agent containing an antibody against the label, an agent containing a substrate when the label is an enzyme, an agent containing avidin when the label is biotin, an agent containing biotin when the label is avidin, etc. can be used.
  • the substrate can be appropriately determined based on the enzyme used as the label.
  • the substrate when peroxidase is used as the label, can be, for example, 3,3'-diaminobenzidine (DAB), 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC), 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), Bajoran Purple, Vina Green, or other color-developing reagents.
  • DAB 3,3'-diaminobenzidine
  • ABTS 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
  • AEC 3-amino-9-ethylcarbazole
  • TMB 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine
  • Bajoran Purple Vina Green
  • Vina Green or other color-developing reagents.
  • examples of substrates include color-developing reagents such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP), Nitro Blue Tetrazolium Chloride (NBT), naphthol AS phosphate, fuchsin, Ferangi Blue, Vulcan Fast Red, and Warp Red.
  • BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate
  • NBT Nitro Blue Tetrazolium Chloride
  • naphthol AS phosphate naphthol AS phosphate
  • fuchsin fuchsin
  • Ferangi Blue Ferangi Blue
  • Vulcan Fast Red Vulcan Fast Red
  • Warp Red Warp Red
  • a substance or agent that accelerates the color-developing reaction can be additionally used.
  • divalent ions such as Ni2 + or Co2 + can be used, or other commercially available enzyme reaction accelerators can be used.
  • naphthol AS phosphate a diazonium salt can be used in combination to form an azo dye by the enzyme activity of naphthol.
  • Reactants can be used in combination with multiple types. For example, if biotin is used as a label, avidin and biotinylated peroxidase can be used, and a peroxidase substrate can be added.
  • the reaction conditions for this step are not particularly limited. For example, they can be appropriately determined according to the concentration of the antibody used and the expected amount of antigen in the fixed tissue.
  • the reaction time is not particularly limited.
  • the reaction can be carried out for 5 seconds or more, 10 seconds or more, 15 seconds or more, 16 seconds or more, 19 seconds or more, or 20 seconds or more.
  • the reaction can be carried out for, for example, 60 minutes or less, 50 minutes or less, 30 minutes or less, 25 minutes or less, 20 minutes or less, 10 minutes or less, 9 minutes or less, 8 minutes or less, or 7 minutes or less.
  • the temperature is not particularly limited.
  • it can be freezing temperature (0°C or below), refrigerated temperature (0°C to 5°C), room temperature (1°C to 30°C), or normal temperature (15°C to 25°C).
  • the processing is performed at room temperature or normal temperature.
  • a dehydration treatment can be performed after the color reaction.
  • the method of dehydration treatment is not particularly limited.
  • ethanol can be used for gradual dehydration, and then further dehydration can be performed using an organic solvent such as xylene.
  • the sample can be immersed in 70%, 80%, 90%, 95%, and 100% ethanol aqueous solutions in that order. Further dehydration can be performed using xylene.
  • Label detection step (S0104) is an essential step, which is a step of detecting the label bound to the cell membrane protein. This step can be performed after the labeling step (S0103). When a color development step is performed, this step can be performed simultaneously with or after the color development step. Optionally, this step can be performed simultaneously with the labeling step (S0103), for example, simultaneously with the secondary antibody reaction step.
  • any other staining may be performed in combination.
  • cell nuclei may be stained.
  • the types of other staining are not particularly limited, but examples include DAPI staining, hematoxylin-eosin (HE) staining, Gomori methenamine silver staining (GMS), periodic acid-Schiff (PAS) stain, trichrome blue staining, Masson's trichrome staining, Prussian blue staining, Giemsa staining, Gram staining, mucicarmine staining, Verhoeff-van Gieson staining, Elastica staining, carbol fuchsin staining, Golgi staining, and combinations thereof.
  • Encapsulation can be performed prior to detection. There are no particular limitations on the encapsulation method and encapsulant used.
  • the detection method can be appropriately selected depending on the label and reagent used, and the properties of the fixed tissue, and the equipment required for that detection method can be used.
  • detection can be performed by visual inspection, using a microscope (e.g., optical microscope such as a stereomicroscope, confocal microscope, or fluorescent microscope), using a detector (e.g., fluorescence activated cell sorting (FACS), luminescence photometer, absorption photometer, etc.), or a combination thereof.
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • luminescence photometer luminescence photometer
  • absorption photometer etc.
  • detection can be performed, for example, by autoradiography, a scintillation counter, positron emission tomography (PET), or a combination thereof.
  • a color-developing reagent e.g., a color-developing reagent reactive with peroxidase
  • it is preferably detected in bright field using an optical microscope.
  • one or more organelles can be stained to determine the location of the label.
  • a target cell membrane protein eg, CAPRIN-1 protein
  • a target cell membrane protein present on a cell membrane can be detected with high sensitivity and specificity.
  • This method can be performed manually, but can also be performed automatically using an automatic staining device, etc.
  • a second aspect of the present invention is a method for determining a treatment method.
  • the method of this aspect includes a disease marker detection step and a treatment method determination step as essential steps.
  • a treatment method for an individual from which a fixed tissue is derived can be determined.
  • the "disease marker detecting step” is a step of detecting a disease marker in the embedded fixed tissue.
  • This step can be carried out in accordance with the method for detecting cell membrane proteins described in the first embodiment.
  • the method described in the first embodiment differs from this step in that the cell membrane proteins detected in this step are disease markers.
  • the individual from which the fixed tissue of this embodiment is derived is not particularly limited. For example, it may be an individual who has a disease correlated with the disease marker to be detected, an individual who may have the disease, or a healthy individual.
  • the "treatment method determination step” is a step of determining a treatment method for the individual based on the disease marker detected in the disease marker detection step. This step can be performed simultaneously with or after the disease marker detection step.
  • the method of determining the treatment method is not particularly limited as long as it is based on the correspondence between the disease marker and the treatment method. For example, it is possible to determine whether or not a disease marker has been detected in the fixed tissue, and to determine the treatment method from the obtained determination result based on the correspondence between the disease marker and the treatment method.
  • the method of determining whether or not a disease marker has been detected is not particularly limited.
  • the disease marker may be determined to have been detected when a label is detected, or the disease marker may be determined to have been detected when the detected label satisfies a certain condition.
  • the conditions here are not particularly limited.
  • the amount of label in the fixed tissue can be quantified and the condition can be that it is equal to or greater than a certain amount.
  • the method of quantification is not particularly limited.
  • a score value reflecting the staining state can be calculated and quantified.
  • the score values are set, for example, in two or more stages, preferably in four stages.
  • An example of setting each score when classifying the score values reflecting the staining state of cell membrane proteins expressed on the cell membrane (e.g., cell surface) into four stages is shown below.
  • - Score 0 The positive cell rate (the percentage of cells in which the label is detected on the cell membrane) is less than 10%.
  • - Score 1 The positive cell rate is 10% or more, but the label is limited to a part of the cell membrane of the diseased cell (e.g., cancer cell), and shows weak staining intensity.
  • - Score 2 The positive cell rate is 10% or more, the label is localized to the cell membrane of the diseased cell (e.g., cancer cell), and shows moderate staining intensity.
  • - Score 3 The positive cell rate is 10% or more, the label is localized to the cell membrane of the diseased cell (e.g., cancer cell), and shows strong staining intensity.
  • score values are determined by the American Society of Clinical Oncology in the United States for cancer markers, and are recognized by the Japanese Society of Pathology in Japan. They are also applied to the "Hercept Test" which quantifies the amount of Her2, a cancer antigen, present in a patient sample. The quantification of Her2 is determined in the ASCO/CAP Her2 Testing Guideline, and in Japan, the Trastuzumab Pathology Committee has established a Her2 Testing Guide that includes the setting of this score. For example, when detecting a protein whose amount on the cell membrane increases based on a disease as a disease marker, the score value can be set according to this example.
  • a disease marker has been detected when the score is 1 or more, 2 or more, or 3 or more.
  • a disease marker is determined to have been detected when the score is 2 or more (scores 2 and 3).
  • the percentage of diseased cells in which the label is detectable, as indicated by each score value can be estimated by increasing the sensitivity of the optical microscope by 4 times, 10 times, or 20 times, counting at least 500 cells in the field of view, and counting the cells that show a stained image on the cell membrane indicated by each score value, using the following formula: Number of positive cells/total number of cells (around 500) x 100 (%)
  • a disease marker may be determined to have been detected by comparing the amount of label detected in the fixed tissue to be detected with the amount of label in a control tissue (e.g., a fixed tissue not having the disease, or a fixed tissue having the disease). For example, in the case of a disease marker whose expression increases based on a disease, it can be determined that a disease marker has been detected if the amount of label detected is greater than or statistically significantly greater than the amount of label in the fixed tissue not having the disease. Conversely, in this case, it can be determined that a disease marker has not been detected if the amount of label detected is less than or statistically significantly less than the amount of label in the fixed tissue having the disease.
  • a control tissue e.g., a fixed tissue not having the disease, or a fixed tissue having the disease.
  • “statistically significant” means that there is a significant difference when the quantitative difference between two things is statistically processed. Specific examples include cases where the risk rate (significance level) is less than 5%, 1%, or 0.1%. There are no particular limitations on the testing method, so long as it is a publicly known method that can determine the presence or absence of significance. For example, the Student's t-test or multiple comparison test can be used.
  • the determination may be based on a cutoff value for determining that a disease marker has been detected.
  • the disease marker can be determined to have been detected when an amount of marker that exceeds the cutoff value is detected.
  • the treatment method can be determined by collating information on the detected disease marker with information on the correspondence between the presence or absence of detection of various disease markers and the treatment method.
  • information on a plurality of disease markers can be used, and the treatment method can be determined in combination with information on disease markers (e.g., disease markers other than cell membrane proteins, disease markers obtained from tissues other than fixed tissues, etc.) detected without using the disease marker detection process of this embodiment.
  • disease markers e.g., disease markers other than cell membrane proteins, disease markers obtained from tissues other than fixed tissues, etc.
  • Any information known in the technical field can be used as information on the relationship between the presence or absence of detection of a disease marker and a treatment method.
  • either or both of the determination that a disease marker has been detected and the decision on a treatment method can be performed by a computer or other electronic calculator.
  • a treatment method for an individual from which the fixed tissue is derived can be determined with high accuracy based on whether or not a disease marker is detected in the fixed tissue.
  • the third aspect of the present invention is a cell membrane protein detection device (0200).
  • the device of this aspect includes an embedding medium removal unit (0210), a labeling reaction unit (0230), and a label detection unit (0240) as essential components, and an antigen activation reaction unit (0220), a cooling unit, a non-specific reaction inhibition unit, a color reaction unit, and a control unit (0250) as optional components.
  • an embedding medium removal unit (0210) a labeling reaction unit (0230), and a label detection unit (0240) as essential components
  • an antigen activation reaction unit 0220
  • cooling unit a cooling unit
  • non-specific reaction inhibition unit a color reaction unit
  • a control unit (0250) as optional components.
  • cell membrane proteins can be detected with high specificity.
  • FIG. 16 A functional block diagram of a configuration example of the manufacturing device of the present invention is shown in Figure 16.
  • the embedding medium, fixed tissue, disease, cell membrane protein, etc. are as described in the first embodiment.
  • Each part constituting the detection device of this embodiment will be described below.
  • the cell membrane protein in the device of this embodiment may be, for example, a cell membrane protein expressed on the surface of a cancer cell, as described in the first embodiment, and may preferably be a disease marker such as a cancer marker, specifically, CAPRIN-1 protein, etc.
  • the "embedding medium removal unit (0210)" is an essential component of the device of this embodiment, and is configured to allow the embedding medium to be removed by contacting the fixed tissue containing the solid embedding medium with a removal solution.
  • the embedding medium removing unit performs the embedding medium removing step (S0101) in the method for detecting a cell membrane protein according to the first aspect.
  • the storage means (0211) is a container configured to store the removal solution.
  • the specific configuration of the storage means for the removal solution is not particularly limited.
  • the overall shape of the storage means is not particularly limited as long as it can contain the solution inside.
  • it may be any shape such as a polygonal prism (including a regular polygonal prism and an approximately polygonal prism), an elliptical cylinder (including a cylindrical liquid and an approximately elliptical cylinder), or a sphere (including an approximately spherical shape).
  • the volume of the container is not particularly limited, and may be determined appropriately according to the amount of solution used in one run with the device of this embodiment. For example, when the device of this embodiment is used on a laboratory scale, a volume of about 10 mL to 200 mL is sufficient, but when used on a factory scale or configured to withstand repeated runs over a certain period of time, the volume can be several liters or more, or even several tens of liters or more.
  • the material that the container is made of but considering that a solution will be stored inside, it is preferable that the material has the strength to store the solution and the rigidity to maintain its shape when stored inside, that the solution does not penetrate to the outside, and that at least the inner wall is not decomposed or altered by the solution.
  • the material include, but are not limited to, metal, synthetic resin (plastic), glass, and porcelain.
  • the contacting means when the fixed tissue is brought into contact with the solution in the storage means, there are no particular limitations as long as the shape and size are such that at least the part of the fixed tissue to be subjected to the reaction can be stored.
  • the container may be equipped with additional openings for passing liquid (such as an outlet and/or water inlet), flow paths, flow valves, flow mechanisms such as stirring blades, and filtering mechanisms for removing solid matter derived from the fixed tissue, in addition to the opening for passing the fixed tissue.
  • liquid such as an outlet and/or water inlet
  • flow paths such as an outlet and/or water inlet
  • flow valves such as stirring blades
  • filtering mechanisms for removing solid matter derived from the fixed tissue, in addition to the opening for passing the fixed tissue.
  • the configuration of the storage means used in the embedding medium removal section may be the same as the storage means used in one or more other sections, or may be different from any of the storage means used in the other sections.
  • the contact means (0212) is configured to be able to bring the fixed tissue held in the holding means (0213) into contact with the removal solution stored in the storage means (0211).
  • the specific configuration of the contact means is as follows: There are no particular limitations to the method, and the method may be, for example, a method capable of spraying, scattering, or applying the removal solution to the fixed tissue, or a method capable of immersing the fixed tissue in the removal solution.
  • any mechanism for reducing the distance may be provided.
  • Such mechanisms include, for example, a mechanism for moving the holding means and/or the storage means, a flow path capable of transporting the removal solution from the storage means to a position close to the holding means, or a combination thereof.
  • the configuration of the contact means used in the embedding medium removal unit may be the same as the contact means used in one or more other units, or may be different from any of the contact means used in the other units. It may also be configured so that it can be commonly used in two or more units.
  • the holding means (0213) is configured to hold the fixed tissue including the solid-state embedding medium.
  • the specific configuration of the holding means for the fixed tissue is not particularly limited.
  • a holding means that is commonly used in staining can be used.
  • the holding means can be configured to hold, clamp, or place a fixed tissue, or can be configured to accommodate a fixed tissue inside the holding means. You may do so.
  • the graspable configuration includes, but is not limited to, both an integrated configuration and a detachable configuration, such as a magnetic holding means such as a permanent magnet or temporary magnet, a hanging means such as a hook or a string, a fastening means such as a chuck, or a combination of these.
  • a magnetic holding means such as a permanent magnet or temporary magnet
  • a hanging means such as a hook or a string
  • a fastening means such as a chuck, or a combination of these.
  • the clamping configuration includes both a structure that clamps the entire fixed tissue (such as a structure in which the fixed tissue is placed in a space sandwiched between partitions) and a structure that clamps only a portion of the fixed tissue (such as a structure in which the fixed tissue is placed upright between low partitions), and is not particularly limited.
  • the configuration on which the fixed tissue can be placed includes any configuration on which the fixed tissue can be placed, and is not particularly limited.
  • the surface shape of the placement surface is not particularly limited, and may be a configuration that allows the position of the fixed tissue to be restricted, or a configuration that does not restrict the position of the fixed tissue.
  • the surface may have one or more holes (such as a shape composed of linear structures that may or may not intersect with each other), or may have no holes. If holes are present, the size, number, and shape of the holes are not particularly limited as long as the fixed tissue does not fall out.
  • the configuration capable of accommodating fixed tissue therein includes any configuration capable of accommodating fixed tissue therein and in which the internal space communicates with the external space, and is not particularly limited.
  • the configuration in which the internal space communicates with the external space includes both a configuration in which communication with the external space is constantly maintained, and a configuration in which communication with the external space is only maintained under specific conditions. Examples of configurations in which communication with the external space is constantly maintained include a configuration in which the fixed tissue is surrounded by a material having holes, such as a mesh, cloth, filter, or a combination thereof, or a configuration in which the fixed tissue is accommodated within the material.
  • Examples of configurations that communicate with the external space only under specific conditions include a configuration (such as a container) in which the fixed tissue is accommodated within a space made of a material that does not have holes through which a drug can enter. In this case, an opening that can be opened or closed depending on the conditions can be additionally included.
  • the material of the holding means is not particularly limited.
  • a fiber material, an organic resin, a glass-based material, a metal material, or a combination of these can be used.
  • the holding means may be made of a rigid body, or at least a part of the holding means may be made of a soft body.
  • the holding means has a portion that comes into contact with the drug, it is preferable that the portion be made of a material that is not decomposed or denatured by the drug.
  • each unit can be provided with a holding means independent of the other units, and can be configured to allow the fixed tissue to be transferred between the holding means of different units.
  • the configuration of the holding means used in the embedding medium removal unit may be the same as the holding means used in one or more other units, or may be different from any of the holding means used in the other units.
  • the temperature control means is configured to be able to adjust the temperature of the fixed tissue.
  • the temperature control means here is configured to be able to maintain the fixed tissue at a temperature lower than the melting point of the embedding medium.
  • the specific configuration of the temperature control means is not particularly limited.
  • the temperature of the fixed tissue itself may be directly adjustable, or the temperature of the solution surrounding the fixed tissue may be adjustable.
  • the temperature adjustment means may be configured to maintain heat, or to change the temperature.
  • Examples of configurations that can maintain heat include configurations that use insulating materials, gas layers, vacuum layers, or combinations thereof. In the case of a configuration that can change the temperature, it may be configured to enable both heating and cooling, or to enable only one of them. Specific examples include thermostats, heaters and coolers for liquids or solids, heat generating agents and heat absorbing agents that are generated by chemical reactions, and storage tanks for high or low temperature solutions.
  • One or more of the holding means (0213), contact means (0212), and storage means (0211) may be equipped with a temperature adjustment means, or a temperature adjustment means may be provided separately from them.
  • the temperature of the fixed tissue is maintained below the melting point of the embedding medium by the temperature control means.
  • the temperature can be appropriately set depending on the type of embedding medium, and is not particularly limited. The temperature is as described in the first embodiment.
  • the cleaning means is configured to be capable of cleaning the surface of the fixed tissue.
  • the specific configuration of the cleaning means is not particularly limited. For example, it can be configured to be capable of storing or supplying the cleaning solution described in the first aspect.
  • the configuration capable of storing is similar to the above-mentioned storage means (0211) except that the liquid to be stored is not a removal solution but a cleaning solution.
  • the configuration of the cleaning means used in the embedding medium removal unit may be the same as the cleaning means used in one or more other units, or may be different from any of the cleaning means used in the other units. It may also be configured so that it can be used in common by two or more units.
  • the antigen activation reaction unit (0220) is an optional component of the device of this embodiment, and is configured to be capable of activating cell membrane proteins in fixed tissue that have been subjected to the embedding medium removal unit (0210).
  • the antigen activation reaction unit (0220) performs the antigen activation step (S0102) in the method for detecting cell membrane proteins described in the first embodiment.
  • the antigen activation reaction unit (0220) usually includes an antigen activation means (0221), a contact means (0222), a means for holding the fixed tissue, and a washing means.
  • the contacting means (0222), holding means and cleaning means shall conform to the description of each means in the embedding medium removal section (0210).
  • the antigen activating means (0221) is configured to activate cell membrane proteins of fixed tissue.
  • the specific configuration of the antigen activating means (0221) is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the type of antigen activation treatment to be performed.
  • the enzyme liquid storage means described in the first embodiment can be used, and if the antigen activation process is based on a heat treatment step, the antigen activation solution storage means described in the first embodiment can be used.
  • the storage means for various liquids are similar to the removal solution storage means (0211) except that the solution stored is an enzyme liquid or antigen activation solution.
  • the antigen activation means is preferably configured so that the temperature of the liquid can be adjusted.
  • the adjusted temperature is the temperature in the antigen activation process described in the first embodiment, it is similar to the temperature control means in the embedding medium removal unit (0210). Even if only one step is performed in a single run, storage means for solutions corresponding to both steps can be provided, and storage means for multiple types of solutions for each of the enzyme liquid and antigen activation solution can be provided.
  • Cooling section is an optional component of the device of this embodiment, and is configured to be capable of cooling the fixed tissue that has passed through the antigen activation reaction section (0220).
  • the cooling section performs the cooling step in the method for detecting cell membrane proteins described in the first embodiment.
  • the cooling section usually includes a cooling means and a means for holding the fixed tissue, and may further include a contacting means and a washing means.
  • the holding means, contacting means and cleaning means shall conform to the description of each means in the embedding medium removal section (0210).
  • the cooling means is configured to be able to lower the temperature of the fixed tissue that is in contact with it.
  • the fixed tissue may be configured to be able to dissipate heat, or may be configured to be able to absorb heat from the fixed tissue.
  • the specific configuration it basically conforms to the temperature adjustment means in the embedding medium removal unit (0210) except that the purpose is cooling and the temperature to be adjusted is the temperature in the cooling step of the first embodiment. Only the cooling function of the means capable of heating may be used.
  • the cooling here can bring the fixed tissue into contact with any solid, solution, gas or combination thereof.
  • the cooling means may be configured to bring the fixed tissue into contact with a solid, solution, gas, etc. that is at a lower temperature than the fixed tissue.
  • Non-specific reaction suppression unit is an optional component of the device of this embodiment, and is configured to be able to contact the fixed tissue that has passed through the embedding medium removal unit (0210) with a reaction suppressor. In some cases, it may be configured to be able to process the fixed tissue that has passed through the antigen activation reaction unit (0220) and/or the cooling unit.
  • the non-specific reaction suppression unit performs the non-specific reaction suppression step in the method for detecting cell membrane proteins described in the first embodiment.
  • the non-specific reaction suppression unit usually includes a reaction suppressor storage means, a contact means, and a fixed tissue holding means, and in some cases, further includes a washing means.
  • the contact means, holding means and cleaning means shall conform to the description of each means in the embedding medium removal section (0210).
  • the specific configuration of the reaction inhibitor storage means can be appropriately selected depending on the type of nonspecific reaction inhibition treatment performed, and is not particularly limited.
  • the storage means for the blocking solution described in the first embodiment can be used, and when the nonspecific reaction inhibition treatment is based on an endogenous reaction inhibition step, the storage means for the reaction inhibitor for the color reaction described in the first embodiment can be used.
  • the storage means for various liquids are similar to the storage means for the removal solution, except that the solution stored is a reaction inhibitor. Even when only one step is performed in a single implementation, storage means for solutions corresponding to both steps can be provided, and storage means for multiple types of reaction inhibitors can be provided.
  • the labeling reaction section (0230) is an essential component of the device of this embodiment, and is configured to be capable of reacting the cell membrane protein of the fixed tissue that has passed through the embedding medium removal section (0210) with a labeled antibody that is immunologically reactive with the cell membrane protein. In some cases, it may be configured to be capable of processing the fixed tissue that has passed through the antigen activation reaction section (0220), the cooling section, and/or the non-specific reaction suppression section.
  • the labeling reaction section (0230) performs the labeling step (S0103) in the method for detecting a cell membrane protein described in the first embodiment.
  • the labeling reaction section (0230) usually includes a labeled antibody storage means (0233), a contact means (0234), and a fixed tissue holding means, and in some cases, further includes a binding molecule storage means (0231), a contact means (0232), and a washing means.
  • the contacting means (0232, 0234), holding means and washing means shall conform to the description of each means in the embedding medium removal section (0210).
  • a binding molecule storage means (0231) for storing the binding molecules used in each binding step can be provided.
  • the binding molecule storage means (0231) can include a storage means for the primary antibody solution described in the first aspect
  • the labeled antibody storage means (0233) can include a storage means for the secondary antibody solution described in the first aspect.
  • the storage means for each solution is similar to the storage means for the removal solution (0211) except that the stored solution is the antibody solution or binding molecule solution described in the first embodiment. Even if only a binding reaction using a labeled antibody is performed in one run, a storage means for the binding molecule solution can be provided, and storage means for multiple types of antibodies or binding molecules can be provided.
  • the color reaction section is an optional component of the device of this embodiment, and is configured to allow exposure of the fixed tissue that has passed through the labeling reaction section (0230) to a reactant so that the label becomes detectable.
  • the color reaction section performs the color development step in the method for detecting cell membrane proteins described in the first embodiment.
  • the color reaction section usually includes a reactant storage section, a contact means, and a means for holding the fixed tissue, and may further include a washing means.
  • the contact means, holding means, and washing means are the same as those described for the embedding medium removal section (0210).
  • the reactant storage means is the same as the removal solution storage means (0211) except that the stored solution is the reactant described in the first embodiment.
  • the label detection unit (0240) is an essential component of the device of this embodiment, and is configured to be capable of detecting the labeled antibody of the labeled antibody-bound immobilized tissue that has passed through the labeling reaction unit.
  • the label detection unit (0240) performs the label detection step (S0104) in the method for detecting cell membrane proteins according to the first embodiment.
  • the label detection unit usually includes a detection means (0241), an analysis means (0242), and a holding means for the fixed tissue.
  • the holding means shall conform to the description of the holding means (0213) in the embedding medium removal section (0210).
  • the detection means (0241) is configured to be capable of detecting a label bound to a cell membrane protein in a fixed tissue.
  • the configuration of the detection means (0241) can be appropriately selected depending on the label and reagent used, the properties of the fixed tissue, and the like, and is not particularly limited.
  • a microscope e.g., optical microscope such as a stereo microscope, a confocal microscope, or a fluorescence microscope
  • a detector e.g., fluorescence activated cell sorting (FACS), a luminometer, an absorptiometer, etc.
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • a luminometer e.g., a luminometer
  • an absorptiometer e.g., a laser scanner
  • autoradiography e.g., a scintillation counter
  • PET positron emission tomography
  • the analysis means (0242) is configured to be capable of analyzing the signal data of the label detected by the detection means (0241).
  • the configuration of the analysis means (0242) varies depending on the detection means (0241) used. It can be selected appropriately and is not particularly limited.
  • an analysis means that is normally used to analyze signal data using each detection means may be provided, or an analysis mechanism built into the detection means used may be used as the analysis means of this embodiment.
  • the analysis means includes a computer.
  • the specific configuration of the hardware means and software means is not particularly limited, but for example, the configuration described below for the control unit can be adopted.
  • the specific content of the analysis process performed here is not particularly limited. For example, a process of converting the signal into image data, a process of removing noise from the signal data, etc. may be performed. If necessary, the device may be further configured to be capable of performing a process of determining whether or not the disease marker described in the second aspect has been detected.
  • the analysis means may further include an output mechanism for displaying the analysis results to a user.
  • Control unit (0250) is an optional component of the device of this embodiment, and is configured to be able to adjust the connection between each unit and the fixed tissue and the processing conditions in each unit.
  • the control unit (0250) allows the fixed tissue to be connected to a predetermined unit at a predetermined timing, and the fixed tissue is processed under predetermined processing conditions (such as the type of reaction solution and temperature conditions) for a predetermined period of time.
  • the control unit may be configured to enable the device of this embodiment to execute the series of methods described in the first embodiment, or may be configured to enable the device to execute some of the steps of the methods described in the first embodiment.
  • the control unit includes a computer.
  • the control unit is composed of hardware means, or hardware means and software means
  • the hardware means is composed of the following components: a CPU (0251), a volatile memory (0252), a non-volatile memory (0253), an interface (0254), a system bus (0255) connecting these, and peripheral devices.
  • Peripheral devices include, but are not limited to, a clock, a water level sensor, and the like.
  • the software means is composed of programs that can be executed on the hardware memory, and the like.
  • various programs e.g., communication control programs and processing condition control programs
  • various programs stored in the non-volatile memory (0253) of the hardware means are expanded on the volatile memory (0252), and the programs are executed sequentially, thereby processing, storing, outputting, etc., data in the memory and data input via the interface (0254).
  • the contact means by operating the contact means when a programmed predetermined time is reached, the fixed tissue can be brought into contact with the target drug, etc., and the contact means can be operated again after a certain time has passed to stop the contact.
  • the temperature control means or cooling means when a programmed predetermined time is reached, the fixed tissue can be adjusted to a predetermined temperature, and the contact means can be operated again after a certain time has passed to stop the contact. Furthermore, if information indicating that the target conditions are deviated from during the reaction in each unit is input via the interface (0254) from various sensors such as a temperature sensor or a pH sensor, the reaction condition control program expanded on the volatile memory (0252) can be executed, and a drug can be added or the temperature control means can be operated to adjust the conditions to within the target range.
  • a display unit that presents information to the user can be provided, the contents of which are controlled by the display control unit.
  • the display control unit There are no particular limitations on the hardware of the display unit, but examples include a display.
  • an input device through which the user inputs information may be provided, and examples of input devices include a keyboard, mouse, touch panel, and touch pen.
  • the information input from the input device is controlled by an input/output control unit.
  • the input/output control unit controls the input of data and commands from the input device as well as the output of various data output from the processing device.
  • the user may be asked to set the time and reaction conditions for each process, as well as to specify the process to be performed and the criteria for updating the solution in the storage means (e.g., turbidity, period, etc.).
  • Example 1 Detection of CAPRIN-1 protein by immunohistochemical staining 1 (Paraffin removal process) Paraffin was removed from 4 ⁇ m-thick paraffin-embedded human cancer tissue sections (breast cancer tissue, lung cancer tissue, pancreatic cancer tissue, kidney cancer tissue, colon cancer tissue, gastric cancer tissue, ovarian cancer tissue, and prostate cancer tissue; US BIOMAX; sections derived from 1,361 different subjects were used) using xylene for 20 minutes. The xylene was replaced three times every 5 minutes. Next, washing was performed using 100%, 90%, and 80% ethanol aqueous solutions instead of xylene, for 5 minutes each, in the same manner. These steps were performed at room temperature. Then, washing was performed three times for 5 minutes each using PBS-T (phosphate buffer solution (PBS) containing 0.05% Tween 20, pH 7.4).
  • PBS-T phosphate buffer solution
  • Non-specific inhibition reaction process (Peroxidase endogenous reaction inhibition step) Excess water was removed from the surroundings of each type of human cancer tissue section that had been subjected to the antigen activation step, and an appropriate amount of Peroxidase Block (manufactured by DAKO) was added dropwise and allowed to stand at room temperature for 5 minutes.
  • a primary antibody solution containing the mouse anti-CAPRIN-1 monoclonal antibody prepared in WO2013/018891 was added to various human cancer tissue sections that had been subjected to the nonspecific inhibition reaction step, and the sections were incubated overnight in a moist chamber at 4° C.
  • the primary antibody solution was prepared by adding the above-mentioned mouse anti-CAPRIN-1 antibody to a PBS-T solution containing 5% FBS and 20% normal goat serum to a final concentration of 2 ⁇ g/mL.
  • FIG. 1 The stained images obtained for ovarian cancer tissue are shown in Figure 1.
  • A shows the stained image of the cell nucleus and CAPRIN-1 protein
  • B shows the stained image of CAPRIN-1 protein excluding the signal of the cell nucleus.
  • the signal of CAPRIN-1 protein localized on the cell membrane was observed to border the cells ( Figure 1B).
  • the antibodies used in the primary antibody reaction step are those disclosed in WO2010/016526, WO2011/096517, WO2011/096528, WO2011/096519, WO2011/096533, WO2011/096534, WO2013/018894, WO2013/018892, WO2013/018891, WO2013/018889, WO20 It was found that the signals of cell membrane proteins on the cell membrane can be detected with high accuracy, similar to the above, by applying mouse anti-CAPRIN-1 monoclonal antibodies or rabbit anti-CAPRIN-1 monoclonal antibodies prepared in WO2013/018883, WO2013/125636, WO2013/125654, WO2013/125630, WO2013/125640 and WO2015/020212.
  • Comparative Example 1 Detection of CAPRIN-1 Protein by Immunohistochemical Staining
  • Various paraffin-embedded human cancer tissue sections manufactured by BIOMAX derived from the same specimens as in Example 1 were subjected to immunohistochemical staining according to the steps described in Example 1, except that a heat treatment (baking) was performed at 62°C for 15 minutes before paraffin removal in the paraffin removal step, and that the heat treatment in the antigen activation step was performed at 121°C.
  • Example 2 Determination of CAPRIN-1 positive cancer cells
  • a 4x objective lens of an optical microscope was used to observe CAPRIN-1 protein stained images and positive stained signal intensities in cancer cells in the cancer tissues of the sections mounted in Example 1 and Comparative Example 1.
  • the objective lens was switched to 10x or 20x, and the ratio of cancer cells showing specific coloring in the cell membrane (CAPRIN-1 positive cell rate) to all cells of the cancer tissues in all sections derived from each specimen was calculated.
  • each cancer tissue sample was classified into the following scores of 0 to 3. Of these scores, scores of 2 and 3 were determined to be CAPRIN-1 positive cancer tissue samples.
  • Score 0 (no CAPRIN-1 protein overexpression): CAPRIN-1 positive cell rate (proportion of cells exhibiting a signal specific to the cell membrane) is less than 10%.
  • Score 1 (no CAPRIN-1 protein overexpression): CAPRIN-1 positive cell rate is 10% or more, but the signal is localized to a part of the cancer cell membrane, and the staining intensity is weak.
  • Score 2 (CAPRIN-1 protein overexpression): CAPRIN-1 positive cell rate is 10% or more, the signal is localized to the cancer cell membrane, and the staining intensity is moderate.
  • Score 3 (CAPRIN-1 protein overexpression): CAPRIN-1 positive cell rate is 10% or more, the signal is localized to the cancer cell membrane, and the staining intensity is strong. Tissue specimens with scores 2 and 3 are determined to be CAPRIN-1 positive cancer tissue specimens.
  • Illustrative staining images for each score are shown in Figures 3 to 10.
  • the specimen with a score of 0 Figure 3
  • the specimen with a score of 1 Figure 4
  • the signal on the cell membrane was weak and the boundaries between cells were not clear.
  • the specimen with a score of 2 Figure 5
  • the specimen with a score of 3 Figure 6
  • a strong signal was observed on the cell membrane and the boundaries between cells were clear.
  • the proportion of CAPRIN-1 positive cancer tissue specimens in the samples stained in Example 1 i.e., the proportion of CAPRIN-1 positive cancer tissue specimens in the number of each type of cancer tissue specimen, was 75% for breast cancer tissue, 65% for lung cancer tissue, 70% for pancreatic cancer tissue, 70% for kidney cancer tissue, 60% for colon cancer tissue, 60% for gastric cancer tissue, 65% for ovarian cancer tissue, and 90% for prostate cancer tissue.
  • the percentage of CAPRIN-1 positive cancer tissue specimens was 52% for breast cancer tissue, 54% for lung cancer, 58% for pancreatic cancer, 55% for kidney cancer, 49% for colon cancer, 40% for gastric cancer, 45% for ovarian cancer, and 54% for prostate cancer, which was significantly different from the results based on the staining in Example 1.
  • the antibodies used in the primary antibody reaction step are those disclosed in WO2010/016526, WO2011/096517, WO2011/096528, WO2011/096519, WO2011/096533, WO2011/096534, WO2013/018894, WO2013/018892, WO2013/018891, WO2013/
  • a similar decrease in staining accuracy was observed when mouse anti-CAPRIN-1 monoclonal antibodies or rabbit anti-CAPRIN-1 monoclonal antibodies prepared in WO2013/018889, WO2013/018883, WO2013/125636, WO2013/125654, WO2013/125630, WO2013/125640, and WO2015/020212 were used.
  • Example 3 Detection of CAPRIN-1 protein by immunohistochemical staining 2
  • immunohistochemical staining was performed as described in Example 1, except that the antibody concentration of the primary antibody solution used in the primary antibody reaction step was 0.8 ⁇ g/mL and the color development time in the color development step was approximately 7 minutes.
  • CAPRIN-1 positive cancer tissue specimens were determined in the same manner as in Example 2.
  • CAPRIN-1 positive cancer tissues was 80% for breast cancer tissue, 70% for lung cancer, 80% for pancreatic cancer, 80% for kidney cancer, 70% for colon cancer, 55% for gastric cancer, 55% for ovarian cancer, and 80% for prostate cancer, which was generally consistent with the results based on staining in Example 1.
  • the antibodies used in the primary antibody reaction step are those disclosed in WO2010/016526, WO2011/096517, WO2011/096528, WO2011/096519, WO2011/096533, WO2011/096534, WO2013/018894, WO2013/018892, WO2013/018891, WO2013/018889, WO20
  • mouse anti-CAPRIN-1 monoclonal antibodies or rabbit anti-CAPRIN-1 monoclonal antibodies prepared in WO2013/018883, WO2013/125636, WO2013/125654, WO2013/125630, WO2013/125640 and WO2015/020212 were used, the same percentage of CAPRIN-1 positive cancer tissue specimens as above was obtained.
  • Example 4 Detection of CAPRIN-1 protein by immunohistochemical staining method 3
  • immunohistochemical staining was performed as described in Example 1, except that the heat treatment in the antigen activation step was performed at 121°C, and CAPRIN-1 positive cancer tissue specimens were evaluated in the same manner as in Example 2.
  • the stained image obtained for the ovarian cancer tissue is shown in Figure 13. It was found that even if the heating temperature in the antigen activation process was changed, staining with the same accuracy as the stained image obtained in Example 1 ( Figure 11) was possible.
  • the percentage of CAPRIN-1 positive cancer tissue samples was 77% for breast cancer tissue, 67% for lung cancer, 75% for pancreatic cancer, 75% for kidney cancer, 65% for colon cancer, 60% for gastric cancer, 60% for ovarian cancer, and 85% for prostate cancer, which was generally consistent with the determination results based on the staining in Example 1.
  • the antibodies used in the primary antibody reaction step are those disclosed in WO2010/016526, WO2011/096517, WO2011/096528, WO2011/096519, WO2011/096533, WO2011/096534, WO2013/018894, WO2013/018892, WO2013/018891, WO2013/018889, WO20
  • mouse anti-CAPRIN-1 monoclonal antibodies or rabbit anti-CAPRIN-1 monoclonal antibodies prepared in WO2013/018883, WO2013/125636, WO2013/125654, WO2013/125630, WO2013/125640 and WO2015/020212 were used, the same percentage of CAPRIN-1 positive cancer tissue specimens as above was obtained.
  • Example 5 Detection of CAPRIN-1 protein by immunohistochemical staining 4
  • immunohistochemical staining was performed as described in Example 1, except that the heat treatment in the antigen activation step was performed at 121°C, the antibody concentration of the primary antibody solution used in the primary antibody reaction step was 0.8 ⁇ g/mL, and the color development time in the color development step was approximately 7 minutes.
  • CAPRIN-1 positive cancer tissue specimens were determined in the same manner as in Example 2.
  • the stained image obtained for the ovarian cancer tissue is shown in Figure 14. It was found that even if the heating temperature, antibody concentration, and color development time in the antigen activation process were changed, staining with the same accuracy as the stained image obtained in Example 1 ( Figure 11) was possible.
  • the percentage of CAPRIN-1 positive cancer tissue samples was 79% for breast cancer tissue, 68% for lung cancer, 77% for pancreatic cancer, 76% for kidney cancer, 62% for colon cancer, 62% for gastric cancer, 61% for ovarian cancer, and 86% for prostate cancer, which was generally consistent with the results based on the staining in Example 1.
  • the antibodies used in the primary antibody reaction step are those disclosed in WO2010/016526, WO2011/096517, WO2011/096528, WO2011/096519, WO2011/096533, WO2011/096534, WO2013/018894, WO2013/018892, WO2013/018891, WO2013/018889, WO20
  • mouse anti-CAPRIN-1 monoclonal antibodies or rabbit anti-CAPRIN-1 monoclonal antibodies prepared in WO2013/018883, WO2013/125636, WO2013/125654, WO2013/125630, WO2013/125640 and WO2015/020212 were used, the same percentage of CAPRIN-1 positive cancer tissue specimens as above was obtained.
  • Example 6 Detection of CAPRIN-1 protein by immunohistochemical staining 5
  • immunohistochemical staining was carried out in accordance with the description of Example 1, except that the paraffin removal process was carried out as follows, and CAPRIN-1 positive cancer tissue specimens were determined in the same manner as in Example 2.
  • Paraffin removal process Paraffin-embedded human cancer tissues (BIOMAX) were deparaffinized using Artisan Cleaning Solution (Agilent) for 15 minutes. The Artisan Cleaning Solution was replaced twice every 5 minutes. This step was carried out at room temperature. The tissues were then washed three times with PBS-T for 5 minutes each.
  • the percentage of CAPRIN-1 positive cancer tissue samples was 78% for breast cancer tissue, 66% for lung cancer, 76% for pancreatic cancer, 79% for kidney cancer, 63% for colon cancer, 64% for gastric cancer, 62% for ovarian cancer, and 88% for prostate cancer, which was generally consistent with the results based on the staining in Example 1.
  • the antibodies used in the primary antibody reaction step are those disclosed in WO2010/016526, WO2011/096517, WO2011/096528, WO2011/096519, WO2011/096533, WO2011/096534, WO2013/018894, WO2013/018892, WO2013/018891, WO2013/018889, WO20
  • mouse anti-CAPRIN-1 monoclonal antibodies or rabbit anti-CAPRIN-1 monoclonal antibodies prepared in WO2013/018883, WO2013/125636, WO2013/125654, WO2013/125630, WO2013/125640 and WO2015/020212 were used, the same percentage of CAPRIN-1 positive cancer tissue specimens as above was obtained.
  • Example 7 Detection of CAPRIN-1 protein by immunohistochemical staining 6
  • immunohistochemical staining was performed in the same manner as in Example 6, except that the antibody concentration of the primary antibody solution used in the primary antibody reaction step was 0.8 ⁇ g/mL and the color development time in the color development step was approximately 7 minutes, and CAPRIN-1 positive cancer tissue specimens were determined in the same manner as in Example 2.
  • the percentage of CAPRIN-1 positive cancer tissue samples was 77% for breast cancer tissue, 67% for lung cancer, 72% for pancreatic cancer, 72% for kidney cancer, 68% for colon cancer, 58% for gastric cancer, 64% for ovarian cancer, and 82% for prostate cancer, which was generally consistent with the determination results based on the staining in Example 1.
  • the antibodies used in the primary antibody reaction step are those disclosed in WO2010/016526, WO2011/096517, WO2011/096528, WO2011/096519, WO2011/096533, WO2011/096534, WO2013/018894, WO2013/018892, WO2013/018891, WO2013/018889, WO20
  • mouse anti-CAPRIN-1 monoclonal antibodies or rabbit anti-CAPRIN-1 monoclonal antibodies prepared in WO2013/018883, WO2013/125636, WO2013/125654, WO2013/125630, WO2013/125640 and WO2015/020212 were used, the same percentage of CAPRIN-1 positive cancer tissue specimens as above was obtained.
  • Example 8 Detection of CAPRIN-1 protein by immunohistochemical staining method 7
  • immunohistochemical staining was performed in the same manner as in Example 6, except that the heat treatment in the antigen activation step was carried out at 121°C, and CAPRIN-1 positive cancer tissue specimens were determined in the same manner as in Example 2.
  • CAPRIN-1 positive cancer tissue samples was 80% for breast cancer tissue, 70% for lung cancer, 70% for pancreatic cancer, 78% for kidney cancer, 69% for colon cancer, 55% for gastric cancer, 60% for ovarian cancer, and 90% for prostate cancer, which was generally consistent with the results based on staining in Example 1.
  • the antibodies used in the primary antibody reaction step are those disclosed in WO2010/016526, WO2011/096517, WO2011/096528, WO2011/096519, WO2011/096533, WO2011/096534, WO2013/018894, WO2013/018892, WO2013/018891, WO2013/018889, WO20
  • mouse anti-CAPRIN-1 monoclonal antibodies or rabbit anti-CAPRIN-1 monoclonal antibodies prepared in WO2013/018883, WO2013/125636, WO2013/125654, WO2013/125630, WO2013/125640, and WO2015/020212 were used, the same percentage of CAPRIN-1 positive cancer tissue specimens as above was obtained.
  • Example 9 Detection of CAPRIN-1 protein by immunohistochemical staining 8
  • immunohistochemical staining was performed in the same manner as in Example 6, except that the heating treatment in the antigen activation step was performed at 121°C, the antibody concentration of the primary antibody solution used in the primary antibody reaction step was 0.8 ⁇ g/mL, and the color development time in the color development step was approximately 7 minutes.
  • CAPRIN-1 positive cancer tissue specimens were determined in the same manner as in Example 2.
  • the percentage of CAPRIN-1 positive cancer tissue samples was 75% for breast cancer tissue, 65% for lung cancer, 80% for pancreatic cancer, 80% for kidney cancer, 62% for colon cancer, 55% for gastric cancer, 65% for ovarian cancer, and 80% for prostate cancer, which was generally consistent with the determination results based on the staining in Example 1.
  • the antibodies used in the primary antibody reaction step are those disclosed in WO2010/016526, WO2011/096517, WO2011/096528, WO2011/096519, WO2011/096533, WO2011/096534, WO2013/018894, WO2013/018892, WO2013/018891, WO2013/018889, WO20
  • mouse anti-CAPRIN-1 monoclonal antibodies or rabbit anti-CAPRIN-1 monoclonal antibodies prepared in WO2013/018883, WO2013/125636, WO2013/125654, WO2013/125630, WO2013/125640 and WO2015/020212 were used, the same percentage of CAPRIN-1 positive cancer tissue specimens as above was obtained.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本発明は、精度の高い細胞膜タンパク質の染色方法を提供することを課題とする。　固体状態の包埋媒体を含む固定組織をベーキングせずに除去溶液に接触させて包埋媒体を除去する包埋媒体除去工程を含む、包埋された固定組織において細胞膜タンパク質を検出する方法を提供する。

Description

細胞膜タンパク質を検出する方法
　本発明は、包埋された固定組織において細胞膜タンパク質を検出する方法およびこれを用いた固定組織が由来する個体に対する治療法を決定する方法に関する。
　癌細胞上の特異的細胞膜タンパク質は、その癌特異性から、癌を検出するための疾患マーカーとして利用できるだけでなく、当該タンパク質を標的抗原にした各種抗体医薬は、副作用が少ない癌治療薬として癌治療に適用されている。例えば、多くの癌細胞の細胞膜表面には、Ｃｙｔｏｐａｓｍｉｃ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１（ＣＡＰＲＩＮ－１）タンパク質が発現しており、癌の疾患マーカーとして有望であることが知られている（特許文献１）。また、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質に対する抗体は、癌の治療および／または予防用医薬用途として有望であることが知られている（特許文献２）。
　近年、これら抗体医薬の薬効を増強する検討が進められ、特に、細胞に対して直接的に強い殺傷能力を有する薬物と抗体をコンジュゲートした、抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）の開発が盛んに進められている（非特許文献１および２）。このように、抗体医薬は活発に開発され、様々な種類の医薬が上市されている。
　しかし、これら抗体医薬を含む分子標的薬を使用した処置において、個体によって薬効に大きな差が出ることが大きな技術的課題の一つとされている。これには、癌細胞などの疾患細胞における、抗体医薬の抗原である細胞膜タンパク質の存在比率や種類が個体によって異なることが大きく関与している。このことから、近年、患者から得た検体から得た情報から、その患者に特に有効な治療法を選択するコンパニオン診断が重要視されている。特に、抗体医薬の抗原として細胞膜タンパク質が多く利用されることから、検体における細胞膜タンパク質の存在を正確に把握することは重要である。
　検体におけるタンパク質発現の解析では、しばしば免疫組織化学染色が利用される。一般的な免疫組織化学染色では、まず、雰囲気下で検体を加熱するベーキング（焼成などとも称される）という手法により包埋媒体（パラフィンなど）を融解し、その後、有機溶媒などに溶解させることによって包埋媒体を除去する（特許文献３および４）。さらに、包埋媒体が除去された検体を抗体とインキュベートすることにより染色が行われる。しかしながら、精度の高い細胞膜タンパク質の染色方法はいまだ確立されていない。
ＷＯ２０１０／０１６５２７ ＷＯ２０１０／０１６５２６ ＷＯ２０１１／０２５４４２ ＷＯ２００４／０７７０５７
Ｌａｎｃｅｔ　Ｏｎｃｏｌ　２０１６；１７：ｅ２５６－６２ Ｐｈａｒｍ　Ｒｅｓ．２０１５　Ｎｏｖ；３２（１１）：３５２６－４０
　本発明の課題は、精度の高い細胞膜タンパク質の染色方法を提供することである。
　本発明者は鋭意研究の結果、これまで結果に悪影響を及ぼすものと考えられていなかったベーキングの操作をなくすことによって、細胞膜タンパク質の染色の精度が顕著に改善されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　具体的には、本発明は以下の［１］～［２１］の特徴を有する。
［１－１］包埋された固定組織において細胞膜タンパク質を検出する方法であって、固体状態の包埋媒体を含む前記固定組織を除去溶液に接触させて前記包埋媒体を除去する包埋媒体除去工程、前記除去工程後に、前記固定組織中の前記細胞膜タンパク質を賦活化する抗原賦活化工程、前記固定組織の前記細胞膜タンパク質と前記細胞膜タンパク質と免疫学的反応性を有する一次抗体を反応させる一次抗体反応工程、前記一次抗体反応工程後の前記固定組織に、前記一次抗体と免疫学的反応性を有する標識化二次抗体を反応させる二次抗体反応工程、および前記二次抗体反応工程後、前記一次抗体を介して前記細胞膜タンパク質と結合した前記標識化二次抗体を検出する標識検出工程を含む、前記方法。
［１－２］包埋された固定組織から包埋媒体を除去して細胞膜タンパク質を検出する方法であって、固体状態の包埋媒体を含む前記固定組織を除去溶液に接触させて前記包埋媒体を除去する包埋媒体除去工程、前記包埋媒体除去工程後の固定組織の前記細胞膜タンパク質と標識化抗体を結合させる標識化工程、および前記標識化工程後、前記細胞膜タンパク質と結合した標識化抗体を検出する標識検出工程を含む、前記方法。
［１－３］前記包埋媒体除去工程後に、前記固定組織中の前記細胞膜タンパク質を賦活化する抗原賦活化工程を含む、［１－２］に記載の方法。
［１－４］前記標識化工程が、前記包埋媒体除去工程後の固定組織の前記細胞膜タンパク質と前記細胞膜タンパク質と免疫学的反応性を有する一次抗体を反応させる一次抗体反応ステップ、および、前記一次抗体反応工程後の前記固定組織に、前記一次抗体と免疫学的反応性を有する標識化二次抗体を反応させる二次抗体反応ステップ、を含む、［１－２］または［１－３］に記載の方法。
［２－１］前記包埋媒体除去工程が、前記固定組織をベーキングせずに前記除去溶液に接触させて前記包埋媒体を除去する工程である、［１－１］～［１－４］のいずれかに記載の方法。
［２－２］前記包埋媒体除去工程が、前記固定組織を包埋媒体の融点未満で前記除去溶液に接触させて前記包埋媒体を除去する工程である、［１－１］～［２－１］のいずれかに記載の方法。
［３］前記除去溶液が界面活性剤および／または有機溶媒を含む溶液である、［１－１］～［２－２］のいずれかに記載の方法。
［４］前記包埋媒体除去工程における接触が浸漬である、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記抗原賦活化工程が９０～１３０℃での加熱処理ステップを含む、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記抗原賦活化工程後に、前記固定組織を冷却する冷却工程を含む、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記標識化二次抗体が、前記一次抗体と免疫学的反応性を有する抗体およびペルオキシダーゼがポリマー担体上結合した複合体である、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記標識検出工程が、前記ペルオキシダーゼと反応性を有する発色試薬により発色した前記細胞膜タンパク質を検出する工程である、［７］に記載の方法。
［９］発色試薬が３，３’－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）である、［８］に記載の方法。
［１０－１］前記包埋媒体がパラフィンである、［１］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１０－２］前記包埋媒体除去工程が、前記固定組織を４５℃未満に維持しながら前記除去溶液に接触させて前記包埋媒体を除去する工程である、［１０－１］に記載の方法。
［１１－１］前記細胞膜タンパク質が癌細胞表面に発現する細胞膜タンパク質である、［１］～［１０－２］のいずれかに記載の方法。
［１１－２］前記細胞膜タンパク質が疾患マーカーである、［１］～［１１－１］のいずれかに記載の方法。
［１２］前記疾患が癌である、［１１－２］に記載の方法。
［１３］前記疾患マーカーがＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質である、［１１－２］または［１２］に記載の方法。
［１４］固定組織が由来する個体に対する治療法を決定する方法であって、［１１］～［１３］のいずれかに記載の方法を用いて包埋された固定組織中の疾患マーカーを検出する工程、および前記工程によって検出された疾患マーカーに基づいて、前記個体に対する治療法を決定する治療法決定工程を含む、前記方法。
［１５］包埋された固定組織において細胞膜タンパク質を検出する装置であって、固体状態の包埋媒体を含む前記固定組織を除去溶液に接触させて前記包埋媒体を除去する包埋媒体除去部、前記包埋媒体除去部を経た固定組織の前記細胞膜タンパク質と標識化抗体を結合させる標識化反応部、および、前記標識化反応部を経た固定組織において前記細胞膜タンパク質と結合した標識化抗体を検出する標識検出部を備える、前記装置。
［１６］前記包埋媒体除去部が、前記固定組織を包埋媒体の融点未満とする調温手段を備える、［１５］に記載の装置。
［１７］前記包埋媒体除去部を経た固定組織中の前記細胞膜タンパク質を賦活化する抗原賦活化反応部をさらに備える、［１５］または［１６］に記載の装置。
［１８］前記細胞膜タンパク質が癌細胞表面に発現する細胞膜タンパク質である、［１５］～［１７］のいずれかに記載の装置。
［１９］前記細胞膜タンパク質が疾患マーカーである、［１５］～［１８］のいずれかに記載の装置。
［２０］前記疾患が癌である、［１９］に記載の装置。
［２１］前記疾患マーカーがＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質である、［１９］または［２０］に記載の装置。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０２３－０５０７７６号の開示内容を包含する。
　本発明の検出方法によれば、包埋された固定組織において細胞膜タンパク質を高い精度で検出することができる。
　本発明の治療法決定方法によれば、高い精度で検出される細胞膜タンパク質の発現情報に基づいて適切な治療法を決定することができる。
実施例１の染色方法による卵巣癌組織の例示的な染色像を示す。Ａは、細胞核およびＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の染色像を示す。Ｂは、細胞核のシグナルを除外した染色像を示す。図中、矢印は細胞膜が適切に染色された細胞を示し、スケールバーは５０μｍを示す。 比較例１の染色方法による卵巣癌組織の例示的な染色像を示す。Ａは、細胞核およびＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の染色像を示す。Ｂは、細胞核のシグナルを除外した染色像を示す。図中、矢頭は細胞質まで不適切に染色された細胞を示し、スケールバーは５０μｍを示す。 スコア０（ＣＡＰＲＩＮ－１陰性）と判定された胃癌組織の染色像を示す。Ａは、細胞核およびＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の染色像を示す。Ｂは、細胞核のシグナルを除外した染色像を示す。図中、スケールバーは５０μｍを示す。 スコア１（ＣＡＰＲＩＮ－１陰性）と判定された胃癌組織の染色像を示す。Ａは、細胞核およびＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の染色像を示す。Ｂは、細胞核のシグナルを除外した染色像を示す。図中、スケールバーは５０μｍを示す。 スコア２（ＣＡＰＲＩＮ－１陽性）と判定された胃癌組織の染色像を示す。Ａは、細胞核およびＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の染色像を示す。Ｂは、細胞核のシグナルを除外した染色像を示す。図中、スケールバーは５０μｍを示す。 スコア３（ＣＡＰＲＩＮ－１陽性）と判定された胃癌組織の染色像を示す。Ａは、細胞核およびＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の染色像を示す。Ｂは、細胞核のシグナルを除外した染色像を示す。図中、スケールバーは５０μｍを示す。 スコア０（ＣＡＰＲＩＮ－１陰性）と判定された腎臓癌組織の染色像を示す。Ａは、細胞核およびＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の染色像を示す。Ｂは、細胞核のシグナルを除外した染色像を示す。図中、スケールバーは５０μｍを示す。 スコア１（ＣＡＰＲＩＮ－１陰性）と判定された腎臓癌組織の染色像を示す。Ａは、細胞核およびＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の染色像を示す。Ｂは、細胞核のシグナルを除外した染色像を示す。図中、スケールバーは５０μｍを示す。 スコア２（ＣＡＰＲＩＮ－１陽性）と判定された腎臓癌組織の染色像を示す。Ａは、細胞核およびＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の染色像を示す。Ｂは、細胞核のシグナルを除外した染色像を示す。図中、スケールバーは５０μｍを示す。 スコア３（ＣＡＰＲＩＮ－１陽性）と判定された腎臓癌組織の染色像を示す。Ａは、細胞核およびＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の染色像を示す。Ｂは、細胞核のシグナルを除外した染色像を示す。図中、スケールバーは５０μｍを示す。 実施例１の染色方法による卵巣癌組織の例示的な染色像を示す。Ａは、細胞核およびＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の染色像を示す。Ｂは、細胞核のシグナルを除外した染色像を示す。図中、スケールバーは５０μｍを示す。 実施例３の染色方法による卵巣癌組織の例示的な染色像を示す。Ａは、細胞核およびＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の染色像を示す。Ｂは、細胞核のシグナルを除外した染色像を示す。図中、スケールバーは５０μｍを示す。 実施例４の染色方法による卵巣癌組織の例示的な染色像を示す。Ａは、細胞核およびＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の染色像を示す。Ｂは、細胞核のシグナルを除外した染色像を示す。図中、スケールバーは５０μｍを示す。 実施例５の染色方法による卵巣癌組織の例示的な染色像を示す。Ａは、細胞核およびＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の染色像を示す。Ｂは、細胞核のシグナルを除外した染色像を示す。図中、スケールバーは５０μｍを示す。 細胞膜タンパク質の検出方法の例示的な実施形態を示すフローチャートである。 第３態様に記載の細胞膜タンパク質の検出装置の例示的な機能ブロック図である。 細胞膜タンパク質の検出装置に係る制御部のハードウェア構成例を示す図である。
１．細胞膜タンパク質の検出方法
１－１．概要
　本発明の第１の態様は細胞膜タンパク質の検出方法である。本態様の方法は、包埋媒体除去工程、標識化工程および標識検出工程を必須工程として含み、抗原賦活化工程、冷却工程、非特異的反応抑制工程、および発色工程を任意工程として含む。本態様の方法によれば、細胞膜タンパク質を特異性高く検出することができる。
１－２．定義
　「包埋媒体」とは、包埋に使用される試薬をいう。「包埋」とは、生体試料に試薬を浸透させ、生体試料を硬化させる処理をいう。
　「固定組織」とは、固定された組織を含む生体試料をいう。「固定」とは、生体試料中のタンパク質を変性および／または沈殿させることにより、生体試料を自己分解や腐敗による劣化から保護するために行われる処理をいう。本明細書における固定には、架橋剤、凝固沈殿剤またはその組合せを利用した固定処理のいずれも含まれる。
　「生体試料」とは、生物の細胞により構成された試料をいう。特に、本明細書における「生体試料」には、生物個体から単離された試料および生体外で調製された細胞を含む試料のいずれも含まれる。ここで、本明細書における生物個体は、真核生物個体であれば特に限定しないが、例えば、霊長類、ペット動物、家畜類、競技用動物などを含む哺乳動物の個体を含む。また、好ましい生物としては、ヒト、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌおよびネコなどの個体が挙げられる。
　「細胞膜タンパク質」とは、細胞膜上に存在するタンパク質をいう。本発明における「細胞膜タンパク質」には、膜貫通タンパク質、細胞膜表在性タンパク質および脂質修飾タンパク質のいずれも含む。細胞膜表在性タンパク質および脂質修飾タンパク質はいずれも膜貫通ドメインを有さないタンパク質である。
　「膜貫通ドメイン」とは、細胞膜を構成する脂質二重層に対する親和性を有し、脂質二重膜を貫通するタンパク質ドメインである。これに対し、細胞膜タンパク質のうち、細胞外側に露出しているタンパク質ドメインを細胞外ドメイン、細胞内側に露出しているタンパク質ドメインを細胞内ドメインと称する。例えば、脂質修飾タンパク質および細胞膜表在性タンパク質の一部はその全体が細胞膜に埋め込まれておらず、タンパク質全体が細胞外ドメインまたは細胞内ドメインということができる。
　「固体状態」とは、流動性がない状態をいう。本明細書における固体状態は、好ましくはゲルの様な半固体状態を含まない。
　本明細書において「免疫学的反応性を有する」とは、生体内で抗体と抗原またはその部分ポリペプチドとが結合する特性を意味する。例えば、抗原抗体反応に基づいて抗原に結合する活性を有することを指す。ここでの抗原への結合は、特異的な結合および非特異的な結合のいずれも含む。
　「抗体」とは、別の分子に特異的に結合する免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片をいう。本明細書における「抗体」は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体ならびにその抗原結合性断片のいずれも含む。
　「標識」とは、その存在が検出可能である物質をいう。本明細書において、ある物質を「標識化」するとは、その物質を共有結合により標識に連結することを指す。
　「ベーキング」とは、雰囲気下で加熱する処理をいう。本明細書における「ベーキング」は特に、雰囲気下で固定組織を包埋媒体の融点以上の温度に加熱する処理を指す。この処理は通常、包埋媒体を部分的に融解させると共に、組織をスライドガラスなどに付着させるために行われる。
　「疾患マーカー」とは、疾患の罹患または発症リスクの有無を判定するための指標となる生体分子（例えば、核酸分子やタンパク質分子）をいう。本明細書においては、特に疾患の罹患または発症リスクの有無を判定するための指標となるタンパク質を指す。
　「癌」とは、悪性新生物を意味し、「腫瘍」と互換的に用いられる。本明細書における「癌」には、原発の癌、転移性の癌、転移した癌および再発した癌のいずれも含まれる。
　「ＣＡＰＲＩＮ－１（Ｃｙｔｏｐａｓｍｉｃ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１）タンパク質」とは、主に癌細胞において細胞膜上に発現する細胞膜タンパク質をいう。本明細書におけるＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質には、ヒトＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質、例えば同族体（すなわち、ホモログもしくはオーソログ）、遺伝子多型などの変異体、および誘導体も包含される。
　「治療」とは、既に症状を有する個体において、疾患もしくは状態またはこれに伴う症状を完全もしくは部分的に治癒もしくは軽減する、またはその進行を防止もしくは遅延するための処置をいう。「予防」とは、疾患もしくは状態を罹患する可能性を有する個体において発症を防止または遅延するための処置をいう。「治療方法」または「予防方法」とは、治療または予防の処置に使用される方法をいう。
１－３．方法
　本態様の方法は、包埋媒体除去工程、標識化工程および標識検出工程を必須工程として含み、抗原賦活化工程、冷却工程、非特異的反応抑制工程および発色工程を任意工程として含む。各工程について以下に詳細に説明する。
１－３－１．包埋媒体除去工程（Ｓ０１０１）
　「包埋媒体除去工程（Ｓ０１０１）」は必須工程であり、固体状態の包埋媒体を含む固定組織を除去溶液に接触させて前記包埋媒体を除去する工程である。
＜包埋媒体＞
　包埋媒体は、組織を包埋し硬化することが可能な媒体であれば特に限定しない。例えば、対象となる固定組織の種類や包埋の温度条件、標識検出工程で使用する検出方法などに従って適宜選択することができる。
　例えば、０℃を超える温度で包埋する場合、具体的な包埋媒体としては、例えば、ワックス、パラフィン（例えば、Ｐａｒａｐｌａｓｔ、ＢｒｏｌｏｉｄおよびＴｉｓｓｕｅｃａｎなど）、パラフィンワックス、アクリル樹脂、メタクリル酸樹脂（例えば、エチレングリコールジメタクリレート、グリコールメタクリレート、ブチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、メチルメタクリレートなど）、ダンマル樹脂、エポキシ樹脂、ジビニルベンゼン、その他のプラスチック樹脂（例えば、スパープラスチック、Ｌｏｗｉｃｒｙｌ（登録商標）、Ｅｐｏｎ、Ａｒａｌｄｉｔｅ、ＬＲ　ＷｈｉｔｅおよびＤｕｒｃｕｐａｎなど）など、およびこれらの組合せコポリマーなどが挙げられる。本明細書における好ましい包埋媒体は、パラフィンおよびパラフィンワックスである。
　例えば、０℃以下の温度で包埋する場合、具体的な包埋媒体としては、例えば、Ｏｐｔｉｍｕｍ　Ｃｕｔｔｉｎｇ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＯＣＴ）コンパウンド（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ（登録商標）Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンドまたはＴｉｓｓｕｅ－ｐｌｕｓ（登録商標）Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド）、ＰＥＬＣＯ（登録商標）凍結包埋コンパウンド、ＰｏｌａｒＳｔａｔ（商標）、ＰｏｌａｒＳｔａｔ　Ｐｌｕｓ（商標）包埋媒体、およびＴｉｓｓｕｅ　Ｆｒｅｅｚｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＴＦＭ（商標））などが挙げられる。これらの包埋媒体は、水溶性グリコールおよび樹脂を含んでいてもよい。具体的には、例えば、５～１５％のポリビニルアルコールおよび１～１０％のポリエチレングリコールを含む。
　包埋媒体は所望の硬度を達成するために、有機溶媒や水溶液で適宜希釈されてもよい。
＜固定組織＞
　本工程で使用される固定組織は本態様の方法により細胞膜タンパク質を検出する対象の生体試料である。
　固定組織の由来する個体、器官および組織は特に限定しない。例えば、個体としては、健常個体、疾患に罹患している可能性がある個体、疾患に罹患している個体のいずれであってもよい。
　本明細書において「健常個体」とは、健常状態にある個体をいう。本明細書において「健常状態」とは、少なくとも検査対象の疾患に罹患していない状態、好ましくはあらゆる疾患や障害のない健全な状態を意味する。
　固定組織は病変組織を含んでもよく、病変組織を含む可能性があってもよく、正常な組織のみを含んでもよい。
　本態様の方法では、固定組織として単一個体に由来するものを使用してもよく、複数個体に由来するものを同時に使用してもよい。各個体に由来する固定組織は、単一の器官に由来するものであっても、複数の器官に由来するものであってもよい。
　疾患の種類は特に限定しない。例えば、癌、炎症などが挙げられ、固定組織が由来する組織としては、例えば、癌組織、炎症組織などが挙げられる。本態様の方法で検出される細胞膜タンパク質は、例えば、疾患細胞表面に発現する細胞膜タンパク質であってよく、そのような細胞膜タンパク質としては、例えば、炎症細胞表面に発現する細胞膜タンパク質、癌細胞表面に発現する細胞膜タンパク質などが挙げられる。
　本発明において対象となる癌は特に限定しない。例えば、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質を細胞膜表面上に発現している癌であってもよい。好ましい癌としては、基底細胞癌、バジェット病、皮膚癌、乳癌、腎癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、脳腫瘍、胃癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、リンパ腫、肝臓癌、胆嚢癌、肉腫、肥満細胞腫、副腎皮質癌、ユーイング腫瘍、ホジキンリンパ腫、中皮腫、多発性骨髄腫、睾丸癌、甲状腺癌、頭頸部癌、ボーエン病、メラノーマ、有棘細胞癌、乳房外パジェット病、菌状息肉症、Ｓｅｚａｒｙ症候群、皮膚Ｔ／ＮＫ細胞リンパ腫、皮膚のみに病変を有するＴ細胞白血病・リンパ腫、皮膚Ｂ細胞リンパ腫（ｉｎｄｏｌｅｎｔ群）、皮膚Ｔ細胞リンパ乳線癌、複合型乳腺癌、乳腺悪性混合腫瘍、乳管内乳頭状腺癌、肺腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、大細胞癌、神経上皮組織性腫瘍である神経膠腫、膠芽腫、神経芽腫、脳室上衣腫、神経細胞性腫瘍、胎児型の神経外胚葉性腫瘍、神経鞘腫、神経線維腫、髄膜腫、慢性型リンパ球性白血病、消化管型リンパ腫、消化器型リンパ腫、小～中細胞型リンパ腫、盲腸癌、上行結腸癌、下行結腸癌、横行結腸癌、Ｓ状結腸癌、直腸癌、卵巣上皮癌、胚細胞腫瘍、間質細胞腫瘍、膵管癌、浸潤性膵管癌、膵臓癌の腺癌、腺房細胞癌、腺扁平上皮癌、巨細胞腫、膵管内乳頭粘液性腫瘍、粘液性嚢胞腺癌、膵芽腫、膵頭細胞腫、Ｆｒａｎｔｓ腫瘍、漿液性嚢胞腺癌、固体乳頭状癌、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、インスリノーマ、多発性内分泌腺腫症１（Ｗｅｒｍｅｒ症候群）、非機能性島細胞腫、ソマトスタチノーマ、ＶＩＰ産生腫瘍、子宮頸癌、子宮体癌、線維肉腫、骨・関節肉種、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、肝芽腫、軟部肉腫、急性白血病、慢性白血病、脊髄腫瘍、軟部悪性腫瘍、奇形腫群腫瘍、頭頸部癌には、下咽頭癌、中咽頭癌、舌癌、上咽頭癌、口腔癌、口唇癌、副鼻腔癌、喉頭癌などが挙げられるが、これらに限定されない。また上記癌を原発とする触診可能な癌、皮下に存在する癌、皮内に存在する癌、表在性の癌、真皮に存在する癌あるいは非実質臓器に存在する癌が包含される。
　本態様の方法により検出される細胞膜タンパク質の種類は特に限定しない。膜貫通タンパク質、細胞膜表在性タンパク質および脂質修飾タンパク質のいずれであってもよく、特定の条件において細胞膜上に局在するタンパク質であってもよい。例えば、膜貫通ドメインを有さない細胞膜タンパク質であってもよく、細胞外側に全部または一部が露出する細胞膜タンパク質であってもよい。
　本明細書における細胞膜タンパク質としては、例えば、癌マーカーなどの疾患マーカーを挙げることができる。具体的な癌マーカーとしては、例えば、ＣＡＰＲＩＮ－１、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ－１２５、ＣＡ１９－９、ＣＤ１１７、ＡＬＫ、ＢＣＲ－ＡＢＬ１、ＢＲＡＦ、ＣＦＴＲ、ＥＧＦＲ、ＩＬ２ＲＡ、ＲＡＳ、Ｃｌａｕｄｉｎ８などのタンパク質が挙げられる。
　固定組織の固定方法は特に限定せず、当該技術分野において公知の方法を使用することができる。例えば、Ｈｏｐｗｏｏｄ　Ｄ．　“Ｆｉｘａｔｉｖｅｓ　ａｎｄ　ｆｉｘａｔｉｏｎ：　ａ　ｒｅｖｉｅｗ．”　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ　Ｊ．　１９６９；１（４）：３２３－６０に記載される方法や、「Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｍｅｔｈｏｄｓ」第６版（２０１３）（ＤＡＫＯ　Ｎｏｒｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．）に記載される方法などを使用することができる。固定に使用される試薬は、特に限定しない。例えば、架橋剤、凝固沈殿剤またはその組合せなどのいずれであってもよい。具体的な固定試薬としては、例えば、架橋剤であるグルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド－ピクリン酸、過ヨウ素酸－リシン－パラホルムアルデヒド、亜鉛イオン－ホルムアルデヒドを含む溶液；凝固沈殿剤であるメタノール、エタノール、アセトン、酢酸－塩化亜鉛、メタノール－アセトン混合物；またはその混合物（例えば、ホルマリン溶液）などを挙げることができる。固定試薬は、必要に応じて緩衝液などに希釈して使用することができる。
　固定の条件は特に限定しない。固定の温度としては、例えば、０℃以下、４℃～４５℃、４℃～３７℃、４℃～３０℃、４℃～２５℃などが挙げられる。また、固定の時間は特に限定しない。例えば、３０秒～４８時間、１０分～３６時間、２０分～２４時間、３０分～２０時間などが挙げられる。固定の回数は特に限定しない。例えば、１回以上、２回以上、３回以上行うことができる。固定を複数回行う場合は、各回の固定の方法、使用する試薬および条件は同じであっても互いに異なってもよい。
　固定後に必要に応じて脱水処理や置換処理を行うことができる。それぞれの条件は特に限定せず、当該技術分野において公知の任意の方法を使用することができる。例えば、本工程の洗浄ステップにおいて記載される方法などを使用することができる。
　本態様の方法に使用される固定組織は、固定後の組織を上述の包埋媒体により包埋した組織片、またはその切片のいずれであってもよい。好ましくは、固定組織は切片である。
　切片の作製方法は特に限定しない。当該技術分野において公知の方法を使用して、例えば、手作業で断層することにより、または薄切装置（ミクロトーム、バイブラトームまたはクライオスタットなど）を用いて切片を作製することができる。
　切片の厚さは特に限定しない。具体的な厚さとしては、例えば、０．５μｍ以上、１μｍ以上、２μｍ以上、３μｍ以上または４μｍ以上の厚さが挙げられる。また、例えば、３００μｍ以下、２００μｍ以下、１５０μｍ以下、１００μｍ以下、８０μｍ以下、６０μｍ以下、５０μｍ以下、３０μｍ以下、２０μｍ以下、１５μｍ以下、１０μｍ以下、８μｍ以下、７μｍ以下、６μｍ以下、５μｍ以下とすることができる。例えば、切片の厚さは１μｍ～３００μｍ、１μｍ～１００μｍ、１μｍ～５０μｍ、１μｍ～２０μｍ、１μｍ～１０μｍ、２μｍ～１００μｍ、２μｍ～５０μｍ、２μｍ～２０μｍ、２μｍ～１０μｍなどの範囲内であればよい。
　切片は、スライドガラスなどの支持体に配置されていてもよく、支持体に配置されておらず、例えば、溶液中に浮遊した状態であってもよい。好ましくは、切片はスライドガラスなどの支持体に配置されている。支持体の材質は特に限定しないが、例えば、高分子材料、ガラス材料、プラスチック材料または金属材料を含むことができる。ガラス材料としては、例えば、ソーダ石灰ガラス、ホウケイ酸ガラス、クラウンガラスおよびそれらの組合せなどが挙げられる。支持体の形状は特に限定しない。例えば、メンブレン、マイクロタイタープレート、ビーズ、フィルター、試験条片、スライド、カバーガラスおよび試験管などを支持体として使用することができる。支持体は必要に応じて表面加工がされていてもよい。切片は支持体に付着させることができる。付着の方法は特に限定しないが、シラン、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リジンなどのマトリックスを使用する方法などが挙げられる。
　固定組織は固体状態の包埋媒体を含む。包埋媒体が固体状態であるとは、包埋媒体が融解していないことを指す。つまり、本態様の方法に使用される固定組織において、包埋媒体はその全部または一部が融解していない。
　固定組織中の包埋媒体全体に対する、固体状態の包埋媒体の割合は特に限定しない。例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上または１００％であればよい。
　好ましくは、本工程で使用される固定組織はベーキングしておらず、雰囲気下における包埋媒体の融点以上の加熱を受けていない。
　「融点」とは、加熱によって固体状態の物質が液体状態へと融解する転移温度をいう。
　ここでの加熱の温度は使用する包埋媒体の種類によって異なる。凍結切片用の包埋媒体であれば、例えば、製品により異なるものの、一般的なＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンドの融点は－１５℃～－５℃であるため、それを使用する場合には、この温度を超える温度が該当する。具体的な温度としては、例えば、－２０℃以上、－１５℃以上、－１０℃以上、－５℃以上または０℃以上の雰囲気下に一定時間以上曝露されていないことが好ましい。それ以外の包埋媒体であれば、例えば、製品により異なるものの、一般的なパラフィンワックスの融点は４５℃～７５℃であるため、それを使用する場合には、この温度を超える温度が該当する。４０℃以上、４５℃以上、５０℃以上、５５℃以上、６０℃以上または６２℃以上の温度の雰囲気下に一定時間以上曝露されていないことが好ましい。
　ここでの曝露の時間は、固定組織中の包埋媒体が融解し始めるのに十分な時間であれば特に限定しない。例えば、１分以上、２分以上、３分以上、５分以上、６分以上、７分以上、８分以上、９分以上、１０分以上、１１分以上、１２分以上、１４分以上または１５分以上の時間、包埋媒体の融点以上の温度の雰囲気下に曝露されていないことが好ましい。例えば、５０℃以上の温度の雰囲気下に５分以上、５５℃以上の温度の雰囲気下に１０分以上、６０℃以上の温度の雰囲気下に１５分以上曝露されていないことが好ましい。
＜除去溶液＞
　本明細書おいて「除去溶液」とは、包埋媒体を溶解可能な溶液を指す。除去溶液の種類は特に限定しない。包埋媒体が親油性の物質である場合には、例えば、界面活性剤および／または有機溶媒を含む溶液を使用することができる。好ましくは、有機溶媒を含む溶液が使用される。一方、包埋媒体が親水性の物質である場合には、例えば、水および／または水溶液（スクロースなどの糖を含む水溶液、緩衝液など）を使用することができる。
　本工程で使用する有機溶媒は特に限定しない。例えば、炭素数が４～１６で直鎖、分岐鎖および環式のアルカン（ヘプタン、ヘキサデカンなど）；炭素数が４～１６で直鎖、分岐鎖および環式のジアルキルエーテル（ジエチルエーテル、ジオクチルエーテルなど）；トルエンおよびキシレンなどの芳香族炭化水素；メタノール、エタノールおよびイソプロピルアルコールなどのアルコール；クロロホルムなどのハロゲン化アルキル；リモネンなどのモノテルペン；柑橘油およびココナッツ油などの植物油脂；またはこれらの混合物を使用することができる。あるいは、これらの代用品（例えば、キシレン代用品など）や自動染色装置に付属の除去溶液（Ａｒｔｉｓａｎ　Ｃｌｅａｎｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）など）を使用することもできる。具体的には、例えば、キシレン代用品として、Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｌｅａｒキシレン代替品、Ｓｈａｎｄｏｎキシレン代用品、ヘプタン、ヘキサデカンなどの脂肪族炭化水素、ジオクチルエーテルなどの脂肪族炭化水素の誘導体、およびこれらの混合物などが挙げられる。
　除去溶液に含まれる有機溶媒の濃度は特に限定しない。例えば、重量パーセント濃度で７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上または１００％とすることができる。例えば、キシレンおよび一以上の濃度のエタノール水溶液を除去溶液として使用することができる。
　本工程において使用される除去溶液は、好ましくはキシレンまたはキシレン代用品（例えば、脂肪族炭化水素を含むもの）である。
＜接触ステップ＞
　本工程では、固定組織中を除去溶液に接触させることにより、固定組織中の包埋媒体の全部または一部を除去溶液に溶解させる。
　接触の方法は、除去溶液と固定組織中の包埋媒体が接触する方法であれば特に限定しない。例えば、除去溶液を固定組織に噴霧、散布、塗布することができ、または固定組織を除去溶液に浸漬することができる。本工程における接触は、好ましくは浸漬である。固定組織における除去溶液との接触場所は、固定組織の全部または一部のいずれであってもよいが、固定組織の一部と除去溶液が接触する場合、少なくとも固定組織中の包埋媒体のほとんどと除去溶液が接触するように留意する。例えば、包埋媒体の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上または１００％と除去溶液が接触するように本工程を行うことができる。
　本工程における接触の条件は、包埋媒体が除去溶液に溶解可能であれば特に限定しない。
　例えば、除去溶液の凝固点より高く包埋媒体の融点未満という比較的低い温度で比較的長い時間にわたり接触させることができる。
　「凝固点」とは、冷却によって液体状態の物質が固体状態へと凝固する転移温度をいう。
　この場合の時間は特に限定しないが、例えば、３分以上、５分以上、６分以上、８分以上、１０分以上、１１分以上、１２分以上、１３分以上、１４分以上、１５分以上、１７分以上、１９分以上、２０分以上の時間で接触させることができる。時間の上限は特に限定しない。例えば、４８時間以下、３６時間以下、３０時間以下、２４時間以下、２０時間以下、１８時間以下、１６時間以下、１５時間以下、１２時間以下、８時間以下、６時間以下、３時間以下、２時間以下、９０分以下、６０分以下、３０分以下、２５分以下または２０分以下の時間で接触させることができる。
　この場合の温度の下限は、除去溶液の凝固点より高ければ特に限定しない。この温度は使用する除去溶液の種類によって変動する。例えば、除去溶液としてキシレンを使用する場合は、キシレンの凝固点である－２５℃を超える温度であればよく、エタノールを使用する場合はエタノールの凝固点である－１１４．５℃を超える温度であればよい。具体的な温度としては、例えば、－１００℃以上、－５０℃以上、－２４℃以上、－１０℃以上、０℃以上、１℃以上、５℃以上、１０℃以上、１５℃以上、２０℃以上、２５℃以上の温度で行うことができる。また、この場合の温度の上限は、包埋媒体の融点未満であれば特に限定しない。この温度は使用する包埋媒体の種類により変動する。例えば、包埋媒体としてパラフィンを使用する場合は、パラフィンワックスの融点である４５℃～７５℃を下回る温度であればよい。具体的な温度としては、例えば、７５℃未満、７０℃未満、６５℃未満、６０℃未満、５５℃未満、５０℃未満、４５℃未満、４０℃未満、３７℃未満、３５℃未満、３０℃未満または２７℃未満の温度で行うことができる。例えば、室温（１～３０℃）または常温（１５℃～２５℃）で行うことができる。具体的には、例えば、キシレンなどの芳香族炭化水素との接触を常温で２０分以上行うことができる。
　温度は、接触の間一定水準に維持されてもよいが、接触の最中に適宜変更しても、自然に変化してもよい。例えば、接触の間、包埋媒体の融点未満の温度を維持することが好ましく、具体的には、例えば、包埋媒体としてパラフィンを使用する場合、固定組織をパラフィンワックスの融点未満（例えば４５℃未満）に維持することが好ましい。
　複数回に分けて接触を行ってもよい。この場合、各接触に使用される除去溶液および接触条件は毎回同じであってもよいし、接触ごとに異なってもよい。例えば、各接触ごとに除去溶液を更新することもできる。
　また、例えば、包埋媒体の融点以上、除去溶液の沸点未満の比較的高い温度で比較的短い時間にわたり行うことができる。
　「沸点」とは、液体の蒸気圧が系の圧力と等しくなる温度をいう。本明細書における「沸点」は特に、液体の蒸気圧が一気圧と等しくなる温度を指す。
　この場合の時間は特に限定しないが、例えば、３秒以上、５秒以上、１０秒以上、１５秒以上、２０秒以上、２５秒以上、３０秒以上とすることができる。時間の上限は、固定組織に過度な負荷とならない範囲であれば特に限定しない。例えば、１分以下、５５秒以下、５０秒以下、４５秒以下、４０秒以下、３５秒以下または３０秒以下の時間で接触させることができる。
　この場合の温度の下限は、包埋媒体の融点以上であれば特に限定しない。この温度は使用する包埋媒体の種類により変動する。例えば、包埋媒体としてパラフィンを使用する場合は、パラフィンワックスの融点である４５℃～７５℃と同じか、それを超える温度であればよい。具体的な温度としては、例えば、４５℃以上、５０℃以上、５５℃以上、６０℃以上、６５℃以上、７０℃以上、７２℃以上または７５℃以上の温度で行うことができる。また、この場合の温度の上限は、除去溶液の沸点未満であれば特に限定しない。例えば、除去溶液としてキシレンを使用する場合は、キシレンの沸点である１３８℃～１４４℃を下回る温度であればよく、エタノールを使用する場合はエタノールの沸点である７８．３７℃を下回る温度であればよい。具体的な温度としては、例えば、１４０℃以下、１３０℃以下、１２０℃以下、１１０℃以下、１００℃以下、９０℃以下、８５℃以下、８０℃以下、７８℃以下または７５℃以下の温度で行うことができる。
　本工程により除去される包埋媒体の割合は、一次抗体などを用いた抗原抗体反応を阻害しなければ特に限定しない。例えば、本工程により包埋媒体の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上または１００％が除去される。
　本ステップの間、除去溶液を適宜流動させることができる。この場合の流動は、撹拌などの操作により人為的に行っても、対流などにより自然に行われてもよい。また、固定組織の配置を変更するなど、固定組織を適宜移動させることができる。
＜分離ステップ＞
　必要に応じて、除去溶液との接触の後に、溶解した包埋媒体と固定組織を分離する分離ステップを行うことができる。
　分離の方法は特に限定しない。溶解した包埋媒体は液体であり、固定組織は固体であるため、当該技術分野において公知の固体と液体の分離方法を使用することができる。例えば、脱水装置などを用いた遠心分離法により分離することができる。
　接触ステップにおいて、大過剰の除去溶液を用いた場合、除去溶液を流動させた場合、および除去溶液の更新を行った場合などには分離ステップが不要な場合がある。
＜洗浄ステップ＞
　必要に応じて、固定組織に残存した除去溶液などを洗浄する洗浄ステップを行うことができる。洗浄は、洗浄液を固定組織と接触させることにより行われる。この際の接触は接触ステップについて上述した方法や条件により行うことができる。
　洗浄液は、固定組織の表面に残存する溶解した包埋媒体、包埋媒体が溶解した除去溶液および／または固定組織中の除去溶液などを除去可能であれば特に限定しない。例えば、除去溶液として例示した溶媒のうち、接触ステップにおいて使用した溶媒と異なる溶媒を洗浄液として使用してもよい。好ましくは、除去溶液として有機溶媒や界面活性剤を使用した場合は、水溶性の溶媒が洗浄液として使用される。具体的な洗浄液としては、例えば、水、任意の緩衝液（リン酸緩衝液など）、アルコール（メタノールおよびエタノールなど）、またはこれらの混合物を使用することができる。好ましくは、アルコールおよび／または緩衝液、より具体的には、エタノールおよび／またはリン酸緩衝液を使用することができる。
　洗浄は複数回行うことができる。この場合、各洗浄に使用される洗浄液および洗浄条件は毎回同じであってもよいし、洗浄ごとに異なってもよい。例えば、除去溶液としてキシレンを使用した場合、エタノールなどのアルコールによる洗浄を行い、さらにリン酸緩衝液などの緩衝液による洗浄を行うことができる。このように、本工程では、キシレンおよびエタノールをそれぞれ独立して使用することができ、例えば、固定組織をキシレンに接触させた後、エタノールに接触させることができる。この場合のエタノール水溶液の濃度は特に限定しない。例えば、重量パーセントで７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の濃度のうち、一以上を使用することができる。例えば、３種類の濃度のエタノール溶液に、順に濃度が低くなるように接触させることができる。具体的には、例えば、１００％、９０％および８０％のエタノール溶液に順に接触させることにより洗浄を行うことができる。
　本ステップの間、洗浄液を適宜流動させることができる。この場合の流動は、撹拌などの操作により人為的に行っても、対流などにより自然に行われてもよい。また、固定組織の配置を変更するなど、固定組織を適宜移動させることができる。
　洗浄は、他の任意の工程でも行うことができる。
１－３－２．抗原賦活化工程（Ｓ０１０２）
　「抗原賦活化工程（Ｓ０１０２）」は任意工程であり、固定組織中の細胞膜タンパク質を賦活化する工程である。本工程は、前記除去工程（Ｓ０１０１）の後に行うことができる。任意により、本工程を除去工程（Ｓ０１０１）と同時に行ってもよい。
　抗原賦活化は、加熱処理、酵素処理またはその組合せにより行われる。具体的な抗原賦活化の方法は特に限定せず、当技術分野において公知の任意の方法を使用することができる。例えば、本工程では、Ｓｈｉら（Ｊ　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＆　Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２０１１，　５９：１３－３２）、Ｄ’Ａｍｉｃｏら（Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　２００９，　３４１：１－１８）、およびＭｃＮｉｃｏｌｌおよびＲｉｃｈｍｏｎｄ（Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，　１９９８，　３２：９７－１０３）などに記載されている方法を使用することができる。本工程の要否、および本工程を実施する場合に行う処理は、抗原の種類や固定組織の性質などにより適宜選択することができる。
　本工程は、例えば、酵素処理ステップおよび／または加熱処理ステップを含み、好ましくは、本工程は加熱処理ステップを含む。
＜酵素処理ステップ＞
　酵素処理としては、例えば、トリプシン、ＤＮａｓｅ、プロテイナーゼＫ、ペプシン、プロナーゼおよびフィシンなどのプロテアーゼを用いて処理することができる。処理条件は酵素が活性を示すことができれば特に限定しない。例えば、酵素の至適温度および至適ｐＨなどに基づいて処理条件を決定することができる。
＜加熱処理ステップ＞
　加熱処理ステップは、加熱した抗原賦活化溶液を固定組織に適用することにより実施することができる。抗原賦活化溶液の種類は特に限定しないが、例えば、クエン酸緩衝液、ＥＤＴＡなどの二価イオンのキレート剤を含む溶液、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン（ＴＲＩＳ）緩衝液、４－２－ヒドロキシエチル－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、２－｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸（ＴＥＳ）緩衝液、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＴＡＰＳ）緩衝液、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）緩衝液、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）緩衝液、グリシン－ＨＣｌ緩衝液、過ヨウ素酸溶液、尿素溶液、チオシアン酸鉛溶液などが挙げられる。緩衝液には、例えば、リン酸二水素カリウム、ホウ酸、ジエチルバルビツール酸、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）、ジメチルアルシン酸、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸またはこれらの組合せなどの酸性化合物を含めることができる。
　ｐＨは特に限定しないが、例えば、６～１１、７～１０、７．５～９．５、８～９の範囲とすることができる。
　加熱処理の温度は特に限定しないが、例えば、９０℃～１３０℃の温度範囲とすることができる。具体的には、例えば、９０℃～１３０℃、９２℃～１２８℃、９５℃～１２５℃、９９℃～１２１℃の範囲とすることができる。加熱時間は特に限定しない。例えば、１０分以上、２０分以上、２５分以上、３０分以上、３５分以上または４０分以上の時間処理することができる。また、例えば、３時間以下、２時間以下、９０分以下、６０分以下、５０分以下または４５分以下の時間とすることができる。
　本工程の間、条件は一定であっても、断続的に、または連続的に変化してもよい。条件が変化する場合、その変化は人為的に変更したものであっても、自然に変化したものであってもよい。また、溶液は適宜流動させることができる。この場合の流動は、撹拌などの操作により人為的に行っても、対流などにより自然に行われてもよい。また、固定組織の配置を変更するなど、固定組織を適宜移動させることができる。
　また、本工程は複数回に分けて行うことができる。この場合、各抗原賦活化は異なる条件で行われても、同じ条件で行われてもよい。
１－３－３．冷却工程
　「冷却工程」は任意工程であり、固定組織を冷却する工程である。本工程は前記抗原賦活化工程の後に行うことができる。
　例えば、抗原賦活化を加熱処理によって行った場合、または酵素処理のために温度を上げた場合に、本工程を行うことができる。
　冷却方法は、固定組織の温度を一定の温度まで低下させられれば特に限定しない。例えば、低温の雰囲気下または溶液中に静置する方法、冷蔵庫や冷凍庫などの冷却器を用いた方法およびこれらの組合せを使用することができる。
　冷却後の温度は特に限定しない。例えば、冷凍温度（０℃以下）、冷蔵温度（０℃～５℃）、室温（１℃～３０℃）または常温（１５℃～２５℃）などとすることができる。好ましくは、室温または常温へと冷却される。
　冷却速度および冷却時間は特に限定しない。本工程における冷却時間は、固定組織が目的の温度まで低下するのに要する時間を指す。したがって、温度が低下した後に平衡に達し、そのまま維持された場合、平衡に達するまでの時間を本工程の時間とする。必要に応じて、本工程をはじめ、各工程の後に静置するなどして、固定組織を任意の時間にわたり保管することができる。
　一般に、冷却開始時の温度と固定組織の置かれた環境の温度の温度差が大きい程、冷却速度は速くなり、冷却時間は短くなる。冷却時間としては、例えば、１０分～２４時間、２０分～１６時間、３０分～１２時間、３５分～６時間、４０分～３時間、４０分～２時間または４０分～１時間とすることができる。
　本工程において、溶液や雰囲気は適宜流動させることができる。また、この場合の流動は、撹拌などの操作により人為的に行っても、対流などにより自然に行われてもよい。また、固定組織の配置を変更するなど、固定組織を適宜移動させることができる。
１－３－４．非特異的反応抑制工程
　「非特異的反応抑制工程」は任意工程であり、固定組織を反応抑制剤と接触させ、抗体反応および／または発色反応における非特異的な反応を抑制する工程である。本工程は前記包埋媒体除去工程の後に行うことができる。前記抗原賦活化工程を行う場合には、それと同時またはその後に行うことができる。冷却工程を行う場合は、それと同時またはその後に行うことができる。
　本工程は、抗体の非特異的な結合を抑制するブロッキングステップ、および非特異的な発色反応を抑制する内因性反応抑制ステップに大別される。これらのステップはいずれか一方のみを行ってもよく、両方のステップを行ってもよい。各ステップはそれぞれ独立に複数回行うことができ、各ステップの間に一または複数の他の工程が行われてもよい。
＜ブロッキングステップ＞
　ブロッキングステップでは、固定組織をブロッキング溶液と接触させ、使用する抗体の非特異的な結合を抑制する。
　本ステップを行うタイミングは、包埋媒体除去工程の後であれば特に限定しない。抗原賦活化工程を行う場合には、それと同時またはその後に行うことができる。例えば、後述する標識化工程前、それと同時またはその後に行ってもよい。例えば、一次抗体反応ステップおよび二次抗体反応ステップの前、それと同時またはその後に行ってもよい。本ステップは複数回行ってもよく、その場合、本ステップは互いに連続して行われてもよく、その間に一または複数の工程が含まれてもよい。
　ブロッキングの方法としては、当該技術分野において公知の任意の方法を使用することができる。通常、本ステップは、固定組織をブロッキング溶液に接触させた状態で一定時間インキュベートすることによって行われる。例えば、固定組織がスライドガラスに配置されている場合、固定組織に上ブロッキング溶液を載せて一定時間インキュベートすることができる。また、例えば、固定組織が溶液中に浮遊している場合、溶液をブロッキング溶液に置換して一定時間インキュベートすることができる。
　ブロッキング溶液は、一般にタンパク質を含む。ブロッキング溶液に含まれるタンパク質の種類は特に限定しない。例えば、動物血清タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、スキムミルクやノンファットミルク、カゼインおよびこの混合物などが挙げられる。
　例えば、血清タンパク質が由来する動物は特に限定しない。例えば、ヤギ、ウマ、ヒト、マウス、ウサギ、ラットまたはブタの血清タンパク質などが挙げられる。具体的には、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシ胎児血清、ウマ血清、ヤギ血清などを使用することができる。
　ブロッキング溶液の溶媒は特に限定しないが、通常は緩衝液である。具体的な緩衝液の種類は特に限定しない。例えば、リン酸緩衝液（ＰＢＳなど）、特定の実施形態では、緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン（ＴＲＩＳ）緩衝液、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＴＡＰＳ）緩衝液、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）緩衝液、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）緩衝液、４－２－ヒドロキシエチル－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、２－｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸（ＴＥＳ）緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液およびそれらの組合せを使用することができる。
　溶媒には適宜添加物を含んでもよい、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００などの界面活性剤を添加することができる。例えば、ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）など、これらの添加物が予め添加されている緩衝液を使用することができる。
　溶媒のｐＨは特に限定しない。具体的なｐＨとしては、例えば、６～８、７～８、７．２～７．８、７．３～７．６、７．４～７．５などが挙げられる。
　タンパク質の濃度は特に限定しない。例えば、重量体積パーセントで０．１％～３０％、１％～３０％、５％～３０％、１０％～２０％の濃度とすることができる。
＜内因性反応抑制ステップ＞
　内因性反応抑制ステップでは、固定組織を発色反応の反応抑制剤と接触させて非特異的な反応を抑制する。
　本ステップを行うタイミングは、包埋媒体除去工程の後で、後述する発色工程の前あれば特に限定しない。例えば、抗原賦活化工程を行う場合には、それと同時またはその後で、後述する発色工程の前に行うことができる。例えば、ブロッキングステップを行う場合には、その前、それと同時またはその後に行ってもよく、後述する標識化工程の前、それと同時またはその後に行ってもよい。例えば、一次抗体反応ステップおよび二次抗体反応ステップの前、それと同時またはその後に行ってもよい。本ステップは複数回行ってもよく、その場合、本ステップは互いに連続して行われてもよく、その間に一または複数の工程が含まれてもよい。
　内因性反応の抑制方法は、発色反応に関与して後述する一次抗体に結合した標識の検出を阻害し得る固定組織の内因性の反応を抑制できる限り特に限定しない。例えば、使用する標識の種類や、使用する発色反応によって適宜決定することができる。
　具体的には、例えば、標識として蛍光物質を使用する場合は、固定組織が有する自家蛍光を抑制するためにクエンチング剤を固定組織に適用することができる。
　また、例えば、標識としてペルオキシダーゼを使用する場合は、固定組織が有するペルオキシダーゼの活性を抑制するために、Ｈ２Ｏ２（例えば、３％　Ｈ２Ｏ２）、ペルオキシダーゼ抑制因子またはペルオキシダーゼ抑制試薬（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｂｌｏｃｋ（ＤＡＫＯ社製）など）などを適用することができる。
　例えば、標識としてビオチンを使用する場合は、固定組織が有するビオチンを減少させるために、例えば、過剰量のアビジンおよびビオチンを固定組織に適用することができる。
　例えば、標識としてフォスファターゼを使用する場合は、固定組織が有するフォスファターゼの活性を抑制するために、例えば、フォスファターゼ阻害剤（例えば、レバミゾールなど）を固定組織に適用することができる。
　あるいは、これらのうち２以上の活性を有する試薬を使用して本ステップを行うことができる。
　本工程の時間は特に限定しない。例えば、１５分以上、３０分以上、４０分以上、６０分以上とすることができる。また、例えば、２４時間以下、１６時間以下、１２時間以下、６時間以下、３時間以下、２時間以下とすることができる。
　本工程の温度は特に限定しない。例えば、冷凍温度（０℃以下）、冷蔵温度（０℃～５℃）、室温（１℃～３０℃）または常温（１５℃～２５℃）などの温度条件で実施することができる。
　本工程の間、条件は一定であっても、断続的に、または連続的に変化してもよい。条件が変化する場合、その変化は人為的に変更したものであっても、自然に変化したものであってもよい。
１－３－５．標識化工程（Ｓ０１０３）
　「標識化工程（Ｓ０１０３）」は必須工程であり、固定組織の細胞膜タンパク質と標識化抗体を結合させる工程である。本工程は、包埋媒体除去工程（Ｓ０１０１）の後に行うことができる。抗原賦活化工程（Ｓ０１０２）を行う場合には、本ステップは前記抗原賦活化工程（Ｓ０１０２）と同時またはその後に行うことができる。非特異的反応抑制工程を行う場合には、特にブロッキングステップと同時またはその後に行うことができる。
　本工程において標識化抗体と固定組織の細胞膜タンパク質を反応させる方法は、固定組織中の細胞膜タンパク質に直接的にまたは間接的に標識化抗体を結合させることが可能な方法であればよく、特に限定しない。
　例えば、細胞膜タンパク質と免疫学的反応性を有する標識化抗体を使用することにより行ってもよく、細胞膜タンパク質と結合する結合分子（例えば、細胞膜タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体）と細胞膜タンパク質の複合体に対して免疫学的反応性を有する標識化抗体を使用することによって行ってもよい。
　細胞膜タンパク質と免疫学的反応性を有する標識化抗体を使用する場合、標識化を行うためには、標識化抗体を細胞膜タンパク質と結合させるステップが行われる。このステップは前記包埋媒体除去工程の後に行うことができる。例えば、抗原賦活化工程を行う場合には、このステップは前記抗原賦活化工程と同時またはその後に行うことができる。非特異的反応抑制工程を行う場合には、特にブロッキングステップと同時またはその後に行うことができる。
　このステップにおける抗体、抗体溶液および抗体の適用方法についての具体的な内容は、「一次抗体反応ステップ」に関して後述する内容に準ずる。また、標識についての具体的な内容は、「二次抗体反応ステップ」に関して後述する内容に準ずる。
　細胞膜タンパク質と結合する結合分子を使用する場合、典型的には、標識化を行うためには、結合分子（例えば、細胞膜タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体）を膜タンパク質と結合させる第１結合ステップと、結合分子と細胞膜タンパク質の複合体に対して免疫学的反応性を有する標識化抗体を前記複合体に結合させる第２結合ステップが行われる。
　第１結合ステップは前記包埋媒体除去工程の後に行うことができる。例えば、抗原賦活化工程を行う場合には、第１結合ステップは前記抗原賦活化工程と同時またはその後に行うことができる。非特異的反応抑制工程を行う場合には、特にブロッキングステップと同時またはその後に行うことができる。第２結合ステップは通常、第１結合ステップの後に行うことができる。任意により、本ステップを第２結合ステップと同時に行ってもよい。
　結合ステップは３回以上行ってもよい。その場合、２回目以降の結合ステップは、それ以前の結合ステップにて形成された複合体に結合可能な結合分子を使用して行われる。この場合、最後の結合ステップ（第２の結合ステップに対応する）以外の結合ステップで使用される結合分子は標識されていてもよく、非標識結合分子であってもよい。
　結合分子の種類は特に限定しないが、好ましくは、細胞膜タンパク質と特異的に結合する結合分子である。例えば、抗体、アプタマー、環状ペプチド、細胞膜タンパク質の受容体またはリガンド、またはそれらの組合せなどを使用することができる。結合分子と細胞膜タンパク質の結合態様は特に限定しない。例えば、結合分子は、細胞膜タンパク質の膜貫通ドメイン、細胞膜タンパク質の膜貫通ドメイン以外の部分、例えば、細胞膜に埋め込まれていない部分、細胞膜タンパク質の細胞内ドメインまたは細胞外ドメインに結合する。結合分子の結合特性、反応溶液および適用方法についての具体的な内容は、「一次抗体反応ステップ」に関して後述する内容に準ずる。
　結合分子と細胞膜タンパク質の複合体に対して免疫学的反応性を有する標識化抗体と複合体の結合態様は特に限定しない。例えば、標識化抗体は、前記複合体が形成されてはじめて結合可能であってもよいし、複合体の構成因子（細胞膜タンパク質または結合分子）のいずれか一方に結合可能であってもよい。標識化抗体についての具体的な内容は、「二次抗体反応ステップ」に関して後述する内容に準ずる。
　結合分子として細胞膜タンパク質と免疫学的反応性を有する一次抗体を使用し、複合体に対して免疫学的反応性を有する標識化抗体として一次抗体と免疫学的反応性を有する標識化二次抗体を使用する場合、第１結合ステップを一次抗体反応ステップと称し、第２結合ステップを二次抗体反応ステップと称する。
　以下、一次抗体反応ステップおよび二次抗体反応ステップを行う場合を例にとり、本工程の詳細な内容を説明するが、上述した通り本工程はこれらのステップを行うことに限定されない。
＜一次抗体反応ステップ＞
　「一次抗体反応ステップ」は、固定組織の細胞膜タンパク質と細胞膜タンパク質と免疫学的反応性を有する一次抗体を反応させるステップである。本ステップは前記包埋媒体除去工程の後に行うことができる。例えば、抗原賦活化工程を行う場合には、本ステップは前記抗原賦活化工程と同時またはその後に行うことができる。非特異的反応抑制工程を行う場合には、特にブロッキングステップと同時またはその後に行うことができる。
　本ステップにおいて使用される一次抗体は検出対象の細胞膜タンパク質と免疫学的反応性を有する抗体であれば特に限定しない。例えば、対象となる細胞膜タンパク質と結合可能な抗体または特異的に結合可能な抗体などが挙げられる。
　具体的な抗体は、検出対象の細胞膜タンパク質の種類に基づいて適宜決定することができる。例えば、細胞膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合可能な抗体であってもよく、細胞膜タンパク質の膜貫通ドメイン以外の部分、例えば、細胞膜に埋め込まれていない部分に結合可能な抗体であってもよく、細胞膜タンパク質の細胞内ドメインまたは細胞外ドメインに結合可能な抗体であってもよい。
　例えば、細胞膜タンパク質がＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質である場合、抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体、またはその抗原結合性断片を使用することができる。具体的な抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体は特に限定しない。例えば、ＷＯ２０１０／０１６５２６、ＷＯ２０１１／０９６５１７、ＷＯ２０１１／０９６５２８、ＷＯ２０１１／０９６５１９、ＷＯ２０１１／０９６５３３、ＷＯ２０１１／０９６５３４、ＷＯ２０１１／０９６５３５、ＷＯ２０１３／０１８８８６、ＷＯ２０１３／０１８８９４、ＷＯ２０１３／０１８８９２、ＷＯ２０１３／０１８８９１、ＷＯ２０１３／０１８８８９、ＷＯ２０１３／０１８８８３、ＷＯ２０１３／１２５６３６、ＷＯ２０１３／１２５６５４、ＷＯ２０１３／１２５６３０、ＷＯ２０１３／１２５６４０、ＷＯ２０１３／１４７１６９、ＷＯ２０１３／１４７１７６、ＷＯ２０１５／０２０２１２、ＷＯ２０１８／０７９７４０およびＷＯ２０１９／１８９７８０などに記載の抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体が挙げられる。
　本ステップにおいて使用される一次抗体は、細胞膜タンパク質との結合親和性が高いほうが、より検出が容易になる場合がある。例えば、結合定数（親和定数）Ｋａ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）が、好ましくは、少なくとも１０７Ｍ－１、少なくとも１０８Ｍ－１、少なくとも５×１０８Ｍ－１、少なくとも１０９Ｍ－１、少なくとも５×１０９Ｍ－１、少なくとも１０１０Ｍ－１、少なくとも５×１０１０Ｍ－１、少なくとも１０１１Ｍ－１、少なくとも５×１０１１Ｍ－１、少なくとも１０１２Ｍ－１、あるいは、少なくとも１０１３Ｍ－１である抗体を使用することができる。
　抗体の種類は特に限定しない。例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＭなどのいずれのクラスおよびアイソタイプであってもよい。抗体として抗原結合性断片を使用することができる。抗原結合性断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂ’などが挙げられる。さらに、免疫グロブリンまたはそれらの抗原結合性断片の凝集体、高分子およびコンジュゲートも、細胞膜タンパク質との免疫学的反応性が実質的に維持される限り、適切な場合には使用することができる。
　本ステップにおいて使用される抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれであってもよい。
　抗体の由来は特に限定しない。例えば、ヒト抗体、非ヒト動物抗体、組換え抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体などが挙げられる。抗体の全部または一部が非ヒト動物抗体に由来する場合、その非ヒト動物は特に限定しない。例えば、マウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、フェレット、ヤギ、サルなどに由来する抗体を使用することができる。
　本ステップにおいて使用される抗体の作製方法や精製方法は特に限定せず、当該技術分野において公知の任意の方法を使用することができる。例えば、抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体について例示した文献に記載の作製方法や精製方法を使用してもよい。
　一次抗体反応の方法としては、当該技術分野において公知の任意の方法を使用することができる。通常、本ステップは、固定組織を一次抗体溶液に接触させた状態で一定時間インキュベートすることによって行われる。
　抗体溶液の組成は、抗体を含み、その抗体が変性しないものであれば特に限定しない。
　抗体溶液の溶媒は特に限定しないが、例えば、任意の緩衝液および市販の抗体希釈液などを使用することができる。具体的な緩衝液の種類は特に限定しない。例えば、ブロッキングステップについて例示した緩衝液を利用することができ、必要に応じて添加物を含めることができる。添加物には、当該技術分野において公知の任意の物質を使用することができるが、例えば、動物の血清および血清タンパク質（ウシ血清アルブミン、ウシ胎児血清、ヤギ血清など）、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００など）などが挙げられる。添加物は複数含むことができ、例えば、ウシ胎児血清、ヤギ血清およびＴｗｅｅｎ２０を含むことができる。添加物の濃度は特に限定しない。例えば、重量体積パーセントで０．１％～３０％、１％～３０％、５％～３０％、１０％～２０％の濃度とすることができる。
　溶媒のｐＨは特に限定しない。具体的なｐＨとしては、例えば、６～８、７～８、７．２～７．８、７．３～７．６、７．４～７．５などが挙げられる。
　溶媒は、ブロッキング溶液と同じ組成のものを使用してもよく、異なる組成のものを使用してもよい。
　抗体液の濃度は、細胞膜タンパク質が検出可能であれば特に限定しない。例えば、固定組織中の抗原の量や、二次抗体に連結した標識の種類などに応じて適宜設定することができる。具体的には、例えば、０．１μｇ／ｍＬ以上、０．２μｇ／ｍＬ以上、０．３μｇ／ｍＬ以上、０．４μｇ／ｍＬ以上、０．５μｇ／ｍＬ以上、０．６μｇ／ｍＬ以上、０．７μｇ／ｍＬ以上または０．８μｇ／ｍＬ以上の濃度とすることができる。また、例えば、１０μｇ／ｍＬ以下、８μｇ／ｍＬ以下、７μｇ／ｍＬ以下、５μｇ／ｍＬ以下、４μｇ／ｍＬ以下、３μｇ／ｍＬ以下、２．５μｇ／ｍＬ以下または２μｇ／ｍＬの濃度とすることができる。
　通常、冷蔵温度で１２時間～２４時間または常温で１５分～４０分の条件でインキュベートするが、インキュベートの条件として、当該技術分野において公知の任意の条件を使用することができ、特に限定しない。
　インキュベートの温度としては、例えば、冷凍温度（０℃以下）、冷蔵温度（０℃～５℃）、室温（１℃～３０℃）または常温（１５℃～２５℃）などの温度条件でインキュベートすることができる。
　インキュベートの時間としては、例えば、１５分以上、３０分以上、４０分以上、６０分以上などが挙げられる。また、例えば、２４時間以下、１６時間以下、１２時間以下、６時間以下、３時間以下、２時間以下とすることができる。
　インキュベート中の湿度条件は、インキュベート中に抗体溶液と固定組織が接触し続けることができれば特に限定しない。好ましくは、湿度が１００％の環境下（例えば、モイストチャンバー中）でインキュベートされる。
　本ステップの間、条件は一定であっても、断続的に、または連続的に変化してもよい。条件が変化する場合、その変化は人為的に変更したものであっても、自然に変化したものであってもよい。
＜二次抗体反応ステップ＞
　「二次抗体反応ステップ」は、固定組織に、一次抗体と免疫学的反応性を有する標識化二次抗体を反応させるステップである。本ステップは通常、前記一次抗体反応ステップの後に行うことができる。任意により、本ステップを一次抗体反応ステップと同時に行ってもよい。
　一次抗体の代わりに標識化二次抗体を使用する以外は一次抗体反応ステップに準じて行うことができる。
　抗体溶液の溶媒は、一次抗体反応ステップと同じ組成のものを使用してもよく、異なる組成のものを使用してもよい。
　二次抗体の種類は、一次抗体と免疫学的反応性を有するものであれば特に限定しない。例えば、一次抗体が定常領域を有する場合、二次抗体として、一次抗体の定常領域に結合可能な抗体を使用することができる。二次抗体が由来する動物は特に限定しないが、好ましくは、二次抗体は一次抗体が由来する動物とは異なる動物に由来する。
　標識の種類は特に限定しない。例えば、発光物質、蛍光物質、酵素、放射性物質、ビオチン、アビジン、量子ドット、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、色素または金属イオンなどが挙げられる。
　発光物質としては、例えば、アクリジニウムエステル、３－（２’－スピロアダマンタン）－４－メトキシ－４－（３”－ホスホリルオキシ）フェニル－１，２－ジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）、ルミノールおよびその修飾体、４－アミノフタルヒドラジド、各種セレンテラジン、およびルシフェリンなどが挙げられる。
　蛍光物質としては、例えば、ＦＩＴＣ、Ｔｅｘａｓ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、Ｒｏｘ、ＴＥＴ、Ｂｏｄｉｐｙ４９３、ＮＢＤ、ＴＡＭＲＡ、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ色素などの蛍光色素；ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰなどの蛍光タンパク質などが挙げられる。
　酵素としては、例えば、プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、フォスファターゼ（例えば、アルカリフォスファターゼ）、スルファターゼ、ペプチダーゼ、グリコシダーゼ、ヒドロラーゼ、オキシドレダクターゼ、リアーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼまたはシンテターゼなどが挙げられる。好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼや、仔ウシ小腸アルカリフォスファターゼなどのアルカリフォスファターゼが使用される。
　放射性物質としては、例えば、１４Ｃ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、Ｔｃ９９ｍ、３２Ｐ、３５Ｓ、または３Ｈなどが挙げられる。
　標識は、抗体に直接結合していても、リンカーなどを介して結合していてもよく、ポリマー担体などを介して抗体と複合体を形成していてもよい。具体的なリンカーやポリマー担体の種類は特に限定しない。例えば、ペプチドリンカーなどの当該技術分野において公知のリンカーを使用することができる。例えば、本明細書における二次抗体として、標識としての酵素と抗体がポリマー担体を介して形成した複合体を使用することができる。また、例えば、標識としてのペルオキシダーゼと抗体がポリマー担体を介して形成した複合体（例えば、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｌａｂｅｌｌｅｄ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＤＡＫＯ社製）など）を使用することができる。
　適用方法は特に限定しない。例えば、ブロッキングステップにおけるブロッキング溶液の適用方法などに準じて行うことができる。
１－３－６．発色工程
　「発色工程」は任意工程であり、固定組織を反応剤に曝露して標識を検出可能にする工程である。本工程は標識化工程と同時またはその後に行うことができる。例えば、二次抗体反応ステップと同時またはその後に行うことができる。内因性反応抑制ステップを行う場合は、その後に行うことができる。
　発色反応とは、標識を検出可能な状態にする反応を指す。
　反応剤は、使用される標識の発色反応を惹起する薬剤であれば特に限定しない。例えば、標識に対する抗体を含む薬剤、標識が酵素の場合には基質を含む薬剤、標識がビオチンの場合にはアビジンを含む薬剤、アビジンの場合にはビオチンを含む薬剤などを使用することができる。
　基質は標識として使用する酵素に基づいて適宜決定することができる。例えば、標識としてペルオキシダーゼを使用する場合の基質としては、例えば、３，３’－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）、２，２’－Ａｚｉｎｏｂｉｓ（３－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６－ｓｕｌｆｏｎｉｃ　Ａｃｉｄ）（ＡＢＴＳ）、３－ａｍｉｎｏ－９－ｅｔｈｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ（ＡＥＣ）、３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）、Ｂａｊｏｒａｎ　ＰｕｒｐｌｅおよびＶｉｎａ　Ｇｒｅｅｎなどの発色試薬が挙げられる。標識としてペルオキシダーゼが使用される場合、好ましい発色試薬はＤＡＢである。また、例えば、標識としてペルオキシダーゼを使用する場合の基質としては、例えば、５－Ｂｒｏｍｏ－４－ｃｈｌｏｒｏ－３－ｉｎｄｏｌｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＢＣＩＰ）、Ｎｉｔｒｏ　Ｂｌｕｅ　Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＮＢＴ）、ナフトールＡＳホスフェート、フクシン、Ｆｅｒａｎｇｉ　Ｂｌｕｅ、Ｖｕｌｃａｎ　Ｆａｓｔ　ＲｅｄおよびＷａｒｐ　Ｒｅｄなどの発色試薬が挙げられる。
　必要に応じて、発色反応を促進する物質や薬剤を追加で使用することができる。例えば、ＤＡＢを使用する場合は、Ｎｉ２＋やＣｏ２＋などの二価イオンを使用してもよく、その他の市販の酵素反応促進剤を使用してもよい。また、例えば、ナフトールＡＳホスフェートを使用する場合は、ナフトールの酵素活性によりアゾ色素を形成するためのジアゾニウム塩をあわせて使用することができる。
　反応剤は複数種類を組合せて使用することができる。例えば、標識としてビオチンを使用した場合、アビジンとビオチン化ペルオキシダーゼを使用し、さらにペルオキシダーゼの基質を追加で使用することができる。
　本工程の反応条件は特に限定しない。例えば、使用した抗体の濃度や想定される固定組織中の抗原量に従って適宜決定することができる。
　反応時間は特に限定しない。例えば、５秒以上、１０秒以上、１５秒以上、１６秒以上、１９秒以上または２０秒以上の時間行うことができる。また、例えば、６０分以下、５０分以下、３０分以下、２５分以下、２０分以下、１０分以下、９分以下、８分以下または７分以下の時間処理することができる。
　温度は特に限定しない。例えば、冷凍温度（０℃以下）、冷蔵温度（０℃～５℃）、室温（１～３０℃）または常温（１５℃～２５℃）などとすることができる。好ましくは、室温または常温で処理される。
　必要に応じて、発色反応の後に脱水処理を行うことができる。脱水処理の方法は特に限定しない。例えば、エタノールを使用して徐々に脱水した後にキシレンなどの有機溶媒を用いてさらに脱水を行うことができる。具体的には、例えば、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％濃度のエタノール水溶液に順番に浸漬することができる。また、さらにキシレンによる脱水を行うことができる。
１－３－７．標識検出工程（Ｓ０１０４）
　「標識検出工程（Ｓ０１０４）」は必須工程であり、細胞膜タンパク質と結合した標識を検出する工程である。本工程は標識化工程（Ｓ０１０３）の後に行うことができる。発色工程を行う場合は、本工程はそれと同時またはその後に行うことができる。任意により、本工程を標識化工程（Ｓ０１０３）と同時、例えば、二次抗体反応ステップと同時に行ってもよい。
　検出に先立って、他の任意の染色をあわせて行うことができる。例えば、細胞核の染色などを行うことができる。他の染色の種類は特に限定しないが、例えば、ＤＡＰＩ染色、ヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色、Ｇｏｍｏｒｉメテナミン銀染色（ＧＭＳ）、過ヨウ素酸－シッフ（ＰＡＳ）染料、トリクロムブルー染色、マッソントリクロム染色、プルシアンブルー染色、ギムザ染色、グラム染色、ムチカルミン染色、Ｖｅｒｈｏｅｆｆ－ｖａｎ　Ｇｉｅｓｏｎ染色、エラスチカ染色、カルボールフクシン染色、ゴルジ染色およびこれらの組合せなどが挙げられる。
　検出に先立って、封入作業を行うことができる。使用される封入方法および封入剤は特に限定しない。
　検出に使用する方法は特に限定しない。使用する標識および試薬、および固定組織の性質などに応じて検出方法を適宜選択し、その検出方法に必要な機器を使用することができる。例えば、目視検査によって、顕微鏡（例えば、実体顕微鏡、共焦点顕微鏡、蛍光顕微鏡などの光学顕微鏡）を用いて、検出器（例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、発光光度計、吸光光度計など）を用いて、またはその組合せにより検出することができる。放射性物質を標識として使用した場合は、例えば、オートラジオグラフィ、シンチレーションカウンター、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）またはその組合せにより検出することができる。
　発色試薬（例えば、ペルオキシダーゼと反応性を有する発色試薬）により発色して標識を可視化した場合、好ましくは光学顕微鏡を用いて明視野において検出される。
　必要に応じて、他の種類の染色処理をあわせて行うことができる。例えば、標識の位置を把握するために一以上の細胞小器官を染色することができる。
１－４．効果
　本態様の検出方法によれば、細胞膜上に存在する目的の細胞膜タンパク質（例えば、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質）を高い感度および特異度で検出することができる。
　本態様の方法は、手動で行うこともできるが、自動染色装置などを使用して自動で行うこともできる。
２．治療法の決定方法
２－１．概要
　本発明の第２の態様は治療法を決定する方法である。本態様の方法は、疾患マーカー検出工程および治療法決定工程を必須工程として含む。本態様の方法によれば、固定組織が由来する個体に対する治療法を決定することができる。
２－２．方法
２－２－１．疾患マーカー検出工程
　「疾患マーカー検出工程」は、包埋された固定組織中の疾患マーカーを検出する工程である。
　本工程は第１態様に記載の細胞膜タンパク質の検出方法に準じて行うことができる。第１態様に記載の方法と本工程では、本工程で検出される細胞膜タンパク質が疾患マーカーである点が異なる。
　疾患マーカーについては第１態様の包埋媒体除去工程において詳述したため、ここでの説明は省略する。
　本態様の固定組織が由来する個体は特に限定しない。例えば、検出される疾患マーカーと相関する疾患を有する個体、その疾患を有する可能性がある個体または健常個体のいずれであってもよい。
２－２－２．治療法決定工程
　「治療法決定工程」は、疾患マーカー検出工程によって検出された疾患マーカーに基づいて、前記個体に対する治療法を決定する工程である。本工程は疾患マーカー検出工程と同時またはその後に行うことができる。
　治療法の決定方法は、疾患マーカーと治療法の対応関係に基づいて行われればよく、特に限定しない。例えば、固定組織において疾患マーカーが検出されたか否かを判定し、疾患マーカーと治療法の対応関係に基づいて、得られた判定結果から治療法を決定することができる。
＜疾患マーカーが検出されたか否かの判定＞
　疾患マーカーが検出されたか否かの判定方法は特に限定しない。例えば、標識が検出された場合に疾患マーカーが検出されたと判定してもよく、検出された標識が一定の条件を満たしている場合に疾患マーカーが検出されたと判定してもよい。
　ここでの条件は特に限定しない。例えば、固定組織中の標識の量を定量化し、それが一定以上であることを条件とすることができる。
　定量化の方法は特に限定しない。例えば、染色状態を反映させたスコア値を割り出して数値化することができる。スコア値の設定は、例えば２段階以上、好ましくは４段階で分類される。細胞膜上（例えば、細胞表面）に発現する細胞膜タンパク質の染色状態を反映させたスコア値を４段階に分類する場合の各スコアの設定例を以下に示す。
　・スコア０：陽性細胞率（細胞膜に標識が検出される細胞の割合）が１０％に満たないもの
　・スコア１：陽性細胞率が１０％以上であるが、標識が疾患細胞（例えば、癌細胞）の細胞膜の一部に限局し、弱い染色強度を示すもの
　・スコア２：陽性細胞率が１０％以上であり、標識が疾患細胞（例えば、癌細胞）の細胞膜に局在し、中程度の染色強度を示すもの
　・スコア３：陽性細胞率が１０％以上であり、標識が疾患細胞（例えば、癌細胞）の細胞膜に局在し、強い強度の染色強度を示すもの
　このようなスコア値の設定は、癌マーカーに関して米国Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙにおいて定められたものであり、国内においては日本病理学会が認定している。また、癌抗原の１つであるＨｅｒ２の患者試料中の存在量を定量する「ハーセプテスト」にも適用されており、Ｈｅｒ２の定量についてはＡＳＣＯ／ＣＡＰ　Ｈｅｒ２検査ガイドラインに定められており、国内においてもトラスツマブ病理部会が本スコアの設定を含めたＨｅｒ２検査ガイドを定めている。例えば、疾患に基づいて細胞膜上の存在量が上昇するタンパク質を疾患マーカーとして検出する場合には、この例に準じてスコア値を設定することができる。また、特に限定しないが、例えば、スコアが１以上の場合、２以上の場合または３以上の場合に、疾患マーカーが検出されたと判定することができる。好ましくは、スコアが２以上（スコア２および３）の場合に、疾患マーカーが検出されたと判定する。
　各スコア値に記載している、標識が検出される疾患細胞の割合は、光学顕微鏡の感度を４倍、１０倍または２０倍に上げて、視野に入っている細胞を最低５００数え、各スコア値に記載の細胞膜に染色像を示す細胞を計測して、以下の式を利用して試算することができる。
　　　陽性細胞数／全細胞数（約５００前後）×１００（％）
　また、例えば検出対象である固定組織において検出された標識の量と、対照組織（例えば、その疾患を有さない固定組織、またはその疾患を有する固定組織）における標識の量とを比較することによって、疾患マーカーが検出されたと判定してもよい。例えば、疾患に基づいて発現が上昇する疾患マーカーである場合には、その疾患を有さない固定組織における標識の量より多くまたは統計的に有意に多く標識が検出された場合に、疾患マーカーが検出されたと判定することができる。この場合、逆に、例えば、その疾患を有する固定組織における標識の量より少なくまたは統計的に有意に少なく標識が検出された場合に、疾患マーカーが検出されなかったと判定することができる。
　本明細書において「統計学的に有意」とは、二者間の量的差異を統計学的に処理したときに有意差があることをいう。具体的には、例えば、危険率（有意水準）が５％、１％または０．１％より小さい場合が挙げられる。検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の方法であれば、特に限定しない。例えば、スチューデントｔ検定法、多重比較検定法を用いることができる。
　また、例えば、疾患マーカーが検出されたと判定するためのカットオフ値に基づいて決定してもよい。例えば、疾患に基づいて発現が上昇する疾患マーカーである場合には、カットオフ値を上回る量の標識が検出された場合に疾患マーカーが検出されたと判定することができる。
＜治療法の決定＞
　治療法を決定する方法は、特に限定しない。例えば、各種疾患マーカーの検出の有無と治療法の対応関係の情報に、検出された疾患マーカーの情報を照合することにより、治療法を決定することができる。この場合、複数の疾患マーカーの情報を利用することができ、例えば、本態様の疾患マーカー検出工程によらずに検出された疾患マーカー（例えば、細胞膜タンパク質以外の疾患マーカー、固定組織以外から取得された疾患マーカーなど）の情報とあわせて治療法を決定することができる。
　疾患マーカーの検出の有無と治療法の対応関係の情報としては、当該技術分野において公知の任意の情報を利用することができる。
　本工程における、疾患マーカーが検出されたとの判定および治療法の決定については、両方または一方をコンピュータなどの電子計算機が行うことができる。
２－３．効果
　本態様の方法によれば、固定組織から疾患マーカーが検出されるか否かに基づいて精度よく固定組織が由来する個体に対する治療法を決定することができる。
３．細胞膜タンパク質の検出装置
３－１．概要
　本発明の第３の態様は細胞膜タンパク質の検出装置（０２００）である。本態様の装置は、包埋媒体除去部（０２１０）、標識化反応部（０２３０）および標識検出部（０２４０）を必須の構成として含み、抗原賦活化反応部（０２２０）、冷却部、非特異的反応抑制部、発色反応部および制御部（０２５０）を任意の構成として含む。本態様の方法によれば、細胞膜タンパク質を特異性高く検出することができる。
３－２．構成
　本発明の製造装置の構成例の機能ブロック図を図１６に示す。包埋媒体、固定組織、疾患、細胞膜タンパク質などについては、第１態様にて記載した通りである。以下、本態様の検出装置を構成する各部について説明する。
　なお、本態様の装置における細胞膜タンパク質は、第１態様に記載の通り、例えば、癌細胞表面に発現する細胞膜タンパク質であってよく、好ましくは、癌マーカー等の疾患マーカー、具体的には、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質などであってよい。
３－２－１．包埋媒体除去部（０２１０）
　「包埋媒体除去部（０２１０）」は、本態様の装置における必須の構成要素であって、固体状態の包埋媒体を含む固定組織を除去溶液に接触させて包埋媒体を除去可能なように構成される。包埋媒体除去部により、第１態様に記載の細胞膜タンパク質の検出方法における包埋媒体除去工程（Ｓ０１０１）が実施される。例えば、除去溶液の貯留手段（０２１１）、固定組織と除去溶液の接触手段（０２１２）、固定組織の保持手段（０２１３）を含む。
＜貯留手段（０２１１）＞
　貯留手段（０２１１）は除去溶液を貯留可能なように構成された容器である。除去溶液の貯留手段の具体的な構成は特に限定しない。
　貯留手段の全体形状は、内部に溶液を収容できる形状であれば特に限定しない。例えば、多角柱形状（正多角柱形状、略多角柱形状を含む）、楕円柱形状（円柱液状、略楕円柱形状を含む）、球体形状（略球体形状を含む）などの形状のいずれであってもよい。
　容器の容積は、特に限定はされず、本態様の装置によって一度の実施で使用される溶液の量に応じて適宜定めればよく特に限定しない。例えば、本態様の装置を研究室規模で用いる場合には、容積は１０ｍＬ～２００ｍＬ程度で足りるが、工場的規模で用いる場合や、一定期間の反復実施に堪えるように構成する場合には数Ｌ以上または数十Ｌ以上などとすることができる。
　容器を構成する素材は特に限定はしないが、内部に溶液を収容することを鑑みれば、それらを収容可能な強度と収容時に形状を保持できる剛性を有し、また溶液が外に浸透せず、かつ少なくとも内壁は溶液により分解または変性しない素材であることが好ましい。例えば、金属、合成樹脂（プラスチック）、ガラス、磁器などが挙げられるが、これに限定はされない。
　接触手段の構成にもよるが、貯留手段中で固定組織を溶液に接触させる場合には、固定組織のうち少なくとも反応に供する部分を収納可能な形状および大きさであれば特に限定はされない。
　容器は、場合により、固定組織を通す開口の他、液体を通す開口（排出口および／または入水口など）、流路、流水弁、撹拌翼などの流動機構、固定組織由来の固形物を除去する濾過機構などを追加で備えることができる。
　包埋媒体除去部で使用される貯留手段の構成は、一以上の他の部で使用される貯留手段と同じであってもよく、他の部で使用されるいずれの貯留手段とも異なってもよい。
＜接触手段（０２１２）＞
　接触手段（０２１２）は保持手段（０２１３）に保持された固定組織と貯留手段（０２１１）に貯留された除去溶液を接触させることが可能なように構成される。接触手段の具体的な構成は特に限定しない。例えば、除去溶液を固定組織に噴霧、散布、塗布することが可能な手段であってもよく、固定組織を除去溶液に浸漬することが可能な手段であってもよい。
　保持手段の貯留手段が離れて位置している場合、その距離を減少させる任意の機構を備えることができる。このような機構としては、例えば、保持手段および／または貯留手段の移動機構、貯留手段から保持手段の近くへと除去溶液を運搬可能な流路、またはその組合せなどが挙げられる。
　包埋媒体除去部で使用される接触手段の構成は、一以上の他の部で使用される接触手段と同じであってもよく、他の部で使用されるいずれの接触手段とも異なってもよい。また、二以上の部で共通して使用可能なように構成されてもよい。
＜保持手段（０２１３）＞
　保持手段（０２１３）は、固体状態の包埋媒体を含む固定組織を保持可能なように構成される。固定組織の保持手段の具体的な構成は特に限定しない。例えば、固定組織の免疫化学的染色の際に通常使用される保持手段を使用することができる。例えば、固定組織を把持、挟持、または載置可能なように構成しても、固定組織をその内部の収容可能なように構成してもよい。
　把持可能な構成には、互いに一体化した構成、および例えば、永久磁石または一時磁石などの磁力による保持手段、フックまたは紐などの掛止手段、チャックなどの拘止手段またはこれらの組合せなどの着脱可能な構成のいずれも包含され、特に限定しない。
　挟持可能な構成には、固定組織の全体を挟む構造（仕切りで挟まれた空間に固定組織を配置するような構造など）および固定組織の一部を挟む構造（低い仕切りの間に固定組織を立てて配置するような構造など）のいずれも包含され、特に限定しない。
　載置可能な構成には、固定組織を載せることが可能な任意の構成が包含され、特に限定しない。載置面の表面形状は特に限定されず、固定組織の位置を制限可能なような構成であっても、固定組織の位置が制限されないような構成であってもよい。また、その表面に一以上の孔を有する形状（互いに交差する、または交差しない線状の構造で構成される形状など）であっても、孔を有さない形状であってもよい。孔を有する場合、孔の大きさ、数および形状は、固定組織が脱落しなければよく、特に限定しない。
　内部に固定組織を収容可能な構成には、内部に固定組織を収容可能であり、かつ、内部空間が外部空間と連通する任意の構成が包含され、特に限定しない。内部空間が外部空間と連通している構成は、外部空間との連通が常時維持される構成、および特定の条件下でのみ外部空間と連通する構成のいずれも包含する。外部空間との連通が常時維持される構成としては、例えば、網状、布状、フィルター状またはその組合せなどの孔を有する材料により固定組織を包囲、またはその内部に固定組織を収容する構成などが挙げられる。特定の条件下でのみ外部空間と連通する構成としては、例えば、薬剤が侵入可能な穴を有さない材料により構成される空間の内部に固定組織を収容する構成（例えば、容器など）が挙げられる。この場合、条件に応じて開閉可能な開口などを追加で含むことができる。
　保持手段の材料は特に限定しない。例えば、繊維材料、有機樹脂、ガラス系材料、金属材料またはこれらの組合せを使用することができる。また、保持手段は剛体により構成されてもよく、少なくとも一部が軟体により構成されてもよい。
　保持手段が薬剤と接触する部分を有する場合、その部分は、薬剤により分解または変性しない材料であることが好ましい。
　図１６においては、固定組織が標識検出部（０２４０）に至るまで一の保持手段により保持される実施形態が例示されているが、保持手段の構成の異同にかかわらず、各部は他の部と独立に保持手段を備えることができ、異なる部の保持手段の間で固定組織を受け渡し可能なように構成することができる。また、包埋媒体除去部で使用される保持手段の構成は、一以上の他の部で使用される保持手段と同じであってもよく、他の部で使用されるいずれの保持手段とも異なってもよい。
＜調温手段＞
　調温手段は固定組織の温度を調節可能なように構成される。特に、ここでの調温手段は固定組織を包埋媒体の融点未満に維持可能なように構成される。調温手段の具体的な構成は特に限定しない。
　例えば、固定組織自体の温度を直接調節可能なように構成されてもよく、固定組織周囲の溶液の温度を調節可能なように構成されてもよい。調温手段は、保温可能なように構成されてもよく、温度を改変可能なように構成されてもよい。保温可能な構成としては、例えば、断熱材、気体の層、真空層またはその組合せを利用した構成などが挙げられる。温度を改変可能な構成の場合、一つで加温および冷却をいずれも可能なように構成されてもよく、いずれか一方のみ可能なように構成されてもよい。具体的には、例えば、サーモスタット、液体または固体用のヒーターおよびクーラー、化学反応による発熱剤および吸熱剤、高温または低温の溶液の貯留槽などが挙げられる。保持手段（０２１３）、接触手段（０２１２）および貯留手段（０２１１）のいずれか一以上に調温手段を備え付けてもよく、それらとは別に調温手段を備えてもよい。
　好ましくは、調温手段により固定組織は包埋媒体の融点未満に維持される。調節される温度は包埋媒体の種類によって適宜設定することができ、特に限定しない。温度については、第１態様における記載に準ずる。
＜洗浄手段＞
　洗浄手段は固定組織表面を洗浄することが可能なように構成される。洗浄手段の具体的な構成は特に限定しない。例えば、第１態様に記載の洗浄溶液を貯留または供給可能なように構成することができる。例えば、貯留可能な構成は、貯留する液体が除去溶液でなく洗浄溶液であること以外は上述した貯留手段（０２１１）に準ずる。
　包埋媒体除去部で使用される洗浄手段の構成は、一以上の他の部で使用される洗浄手段と同じであってもよく、他の部で使用されるいずれの洗浄手段とも異なってもよい。また、二以上の部で共通して使用可能なように構成されてもよい。
３－２－２．抗原賦活化反応部（０２２０）
　抗原賦活化反応部（０２２０）は本態様の装置における任意の構成要素であって、包埋媒体除去部（０２１０）を経た固定組織中の細胞膜タンパク質を賦活化可能なように構成される。抗原賦活化反応部（０２２０）により、第１態様に記載の細胞膜タンパク質の検出方法における抗原賦活化工程（Ｓ０１０２）が実施される。抗原賦活化反応部（０２２０）は、通常、抗原賦活化手段（０２２１）、接触手段（０２２２）、固定組織の保持手段および洗浄手段を備える。
　接触手段（０２２２）、保持手段および洗浄手段については包埋媒体除去部（０２１０）における各手段の記載に準ずる。
＜抗原賦活化手段（０２２１）＞
　抗原賦活化手段（０２２１）は固定組織の細胞膜タンパク質を賦活化するように構成される。抗原賦活化手段（０２２１）の具体的な構成は、実施される抗原賦活化処理の種類によって適宜選択することができ、特に限定しない。
　例えば、抗原賦活化処理が酵素処理ステップに基づく場合には、第１態様に記載の酵素液の貯留手段を、抗原賦活化処理が加熱処理ステップに基づく場合には、第１態様に記載の抗原賦活化溶液の貯留手段を採用することができる。各種液体の貯留手段については、貯留される溶液が酵素液や抗原賦活化溶液であること以外は除去溶液の貯留手段（０２１１）に準ずる。
　抗原賦活化手段は、液体の温度が調整可能なように構成されることが好ましい。具体的な構成は特に限定しない。調整される温度が第１態様に記載の抗原賦活化工程における温度であること以外は包埋媒体除去部（０２１０）における調温手段に準ずる。一回の実施で一方のステップのみを行う場合であっても、両方のステップに対応する溶液の貯留手段を備えることができ、また、酵素液や抗原賦活化溶液のそれぞれに関し複数種類の溶液についての貯留手段を備えることができる。
３－２－３．冷却部
　冷却部は本態様の装置における任意の構成要素であって、抗原賦活化反応部（０２２０）を経た固定組織を冷却可能なように構成される。冷却部により、第１態様に記載の細胞膜タンパク質の検出方法における冷却工程が実施される。冷却部は、通常、冷却手段および固定組織の保持手段を備え、場合により、さらに接触手段および洗浄手段を備える。
　保持手段、接触手段および洗浄手段については包埋媒体除去部（０２１０）における各手段の記載に準ずる。
＜冷却手段＞
　冷却手段は、接触させた固定組織の温度を低下させることができるように構成される。固定組織の温度を低下可能であれば具体的な構成は特に限定しないが、例えば、固定組織が放熱可能なように構成されても、固定組織から吸熱可能なように構成されてもよい。具体的な構成は特に限定されず、冷却が目的であり、調節される温度が第１態様の冷却工程における温度であること以外は、基本的に包埋媒体除去部（０２１０）における調温手段に準ずる。加温も可能な手段の冷却機能のみを使用してもよい。
　特にここでの冷却では、固定組織を任意の固体、溶液、気体またはその組合せと接触することができる。したがって、冷却手段は、固定組織より低温の固体、溶液、気体などと固定組織を接触させることができるように構成されてもよい。
３－２－４．非特異的反応抑制部
　非特異的反応抑制部は本態様の装置における任意の構成要素であって、包埋媒体除去部（０２１０）を経た固定組織を反応抑制剤と接触させることが可能なように構成される。場合により、抗原賦活化反応部（０２２０）および／または冷却部を経た固定組織を処理可能なように構成されてもよい。非特異的反応抑制部により、第１態様に記載の細胞膜タンパク質の検出方法における非特異的反応抑制工程が実施される。非特異的反応抑制部は、通常、反応抑制剤貯留手段、接触手段および固定組織の保持手段を備え、場合により、さらに洗浄手段を備える。
　接触手段、保持手段および洗浄手段については包埋媒体除去部（０２１０）における各手段の記載に準ずる。
　反応抑制剤貯留手段の具体的な構成は、実施される非特異的反応抑制処理の種類によって適宜選択することができ、特に限定しない。例えば、非特異的反応抑制処理がブロッキングステップに基づく場合には、第１態様に記載のブロッキング溶液の貯留手段を、非特異的反応抑制処理が内因性反応抑制ステップに基づく場合には、第１態様に記載の発色反応の反応抑制剤の貯留手段を採用することができる。各種液体の貯留手段については、貯留される溶液が反応抑制剤であること以外は除去溶液の貯留手段に準ずる。一回の実施で一方のステップのみを行う場合であっても、両方のステップに対応する溶液の貯留手段を備えることができ、また、複数種類の反応抑制剤についての貯留手段を備えることができる。
３－２－５．標識化反応部（０２３０）
　標識化反応部（０２３０）は本態様の装置における必須の構成要素であって、包埋媒体除去部（０２１０）を経た固定組織の前記細胞膜タンパク質と、前記細胞膜タンパク質と免疫学的反応性を有する標識化抗体を反応させることが可能なように構成される。場合により、抗原賦活化反応部（０２２０）、冷却部および／または非特異的反応抑制部を経た固定組織を処理可能なように構成されてもよい。標識化反応部（０２３０）により、第１態様に記載の細胞膜タンパク質の検出方法における標識化工程（Ｓ０１０３）が実施される。標識化反応部（０２３０）は、通常、標識化抗体貯留手段（０２３３）、その接触手段（０２３４）および固定組織の保持手段を備え、場合により、さらに結合分子貯留手段（０２３１）、その接触手段（０２３２）、洗浄手段を備える。
　接触手段（０２３２、０２３４）、保持手段および洗浄手段については包埋媒体除去部（０２１０）における各手段の記載に準ずる。
　複数回の結合ステップが行われる場合には、各結合ステップにて使用される結合分子を貯留する結合分子貯留手段（０２３１）を備えることができる。具体的には、例えば、一次抗体反応ステップおよび二次抗体反応ステップが行われる場合には、結合分子貯留手段（０２３１）として、第１態様に記載の一次抗体溶液の貯留手段を備え、標識化抗体貯留手段（０２３３）として、第１態様に記載の二次抗体溶液の貯留手段を備えることができる。
　各溶液の貯留手段については、貯留される溶液が第１態様に記載の抗体溶液または結合分子の溶液であること以外は除去溶液の貯留手段（０２１１）に準ずる。一回の実施で標識化抗体による結合反応のみを行う場合であっても、結合分子の溶液の貯留手段を備えることができ、また、複数種類の抗体または結合分子についての貯留手段を備えることができる。
３－２－６．発色反応部
　発色反応部は本態様の装置における任意の構成要素であって、標識が検出可能になるように、標識化反応部（０２３０）を経た固定組織の反応剤への曝露が可能なように構成される。発色反応部により、第１態様に記載の細胞膜タンパク質の検出方法における発色工程が実施される。発色反応部は、通常、反応剤貯留部、接触手段および固定組織の保持手段を備え、場合により、さらに洗浄手段を備える。
　接触手段、保持手段および洗浄手段については包埋媒体除去部（０２１０）における各手段の記載に準ずる。反応剤の貯留手段については、貯留される溶液が第１態様に記載の反応剤であること以外は除去溶液の貯留手段（０２１１）に準ずる。
３－２－７．標識検出部（０２４０）
　標識検出部（０２４０）は本態様の装置における必須の構成要素であって、標識化反応部を経た標識化抗体結合固定化組織の標識化抗体を検出可能なように構成される。標識検出部（０２４０）により、第１態様に記載の細胞膜タンパク質の検出方法における標識検出工程（Ｓ０１０４）が実施される。標識検出部は、通常、検出手段（０２４１）、解析手段（０２４２）および固定組織の保持手段を備える。
　保持手段については包埋媒体除去部（０２１０）における保持手段（０２１３）の記載に準ずる。
＜検出手段（０２４１）＞
　検出手段（０２４１）は、固定組織における細胞膜タンパク質に結合された標識を検出可能なように構成される。検出手段（０２４１）の構成は、使用する標識および試薬、および固定組織の性質などに応じて適宜選択することができ、特に限定しない。
　具体的には、例えば、顕微鏡（例えば、実体顕微鏡、共焦点顕微鏡、蛍光顕微鏡などの光学顕微鏡）、検出器（例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、発光光度計、吸光光度計など）、オートラジオグラフィ、シンチレーションカウンター、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）またはその組合せなどを備えることができる。必要に応じて複数種類の検出手段を備えてもよい。
＜解析手段（０２４２）＞
　解析手段（０２４２）は、検出手段（０２４１）により検出された標識のシグナルデータを解析可能なように構成される。解析手段（０２４２）の構成は、使用される検出手段（０２４１）に応じて適宜選択することができ、特に限定しない。
　例えば、各検出手段を用いたシグナルデータの解析に通常使用される解析手段を備えてもよく、使用する検出手段に内蔵される解析機構を本態様の解析手段として使用してもよい。典型的には、解析手段はコンピュータを含む。解析手段がコンピュータを含む場合のハードウェア手段とソフトウェア手段の具体的な構成は特に限定しないが、例えば、制御部について後述する構成を採用することができる。
　ここで行われる解析処理の具体的な内容は特に限定しない。例えば、シグナルの画像データへの変換処理、シグナルデータからのノイズの除外処理などを行うことができる。必要に応じて、さらに第２態様に記載の疾患マーカーが検出されたか否かの判定処理を実行可能なように構成されてもよい。
　解析手段は、さらに解析結果をユーザに表示する出力機構を備えてもよい。
３－２－８．制御部（０２５０）
　制御部（０２５０）は本態様の装置における任意の構成要素であって、各部と固定組織の連絡および各部における処理条件を調整可能なように構成される。例えば、制御部（０２５０）により、固定組織は所定のタイミングで所定の部へと連絡され、所定の時間にわたり、所定の処理条件（反応溶液の種類や温度条件など）により処理を受ける。
　制御部は、本態様の装置により第１態様に記載の一連の方法を実行可能なように構成されてもよく、第１態様に記載の方法の一部の工程を実行可能なように構成されてもよい。典型的には、制御部はコンピュータを含む。
　制御部は、ハードウェア手段、またはハードウェア手段とソフトウェア手段によって構成され、ハードウェア手段はその構成要件として、ＣＰＵ（０２５１）、揮発性メモリ（０２５２）、不揮発性メモリ（０２５３）、インターフェース（０２５４）、これらを接続するシステムバス（０２５５）および周辺装置などで構成されている。周辺装置は、限定はしないが、例えば、時計、水量センサなどが挙げられる。ソフトウェア手段は、ハードウェアのメモリ上で実行可能なプログラムなどで構成されている。
　制御部では、例えば、ハードウェア手段の不揮発性メモリ（０２５３）内などに格納された各種プログラム（例えば、連絡制御プラグラムや処理条件制御プログラム）を揮発性メモリ（０２５２）上に展開させて、そのプログラムを順次実行することで、メモリ上のデータや、インターフェース（０２５４）を介して入力されるデータの加工、保存、出力などにより各部の機能が実現される。例えば、プログラムされた所定の時間に達したときに接触手段を作動させることで、固定組織と目的の薬剤などを接触させ、一定時間の経過後に再び接触手段を作動させて接触を止めることができる。また、例えば、プログラムされた所定の時間に達したとき調温手段や冷却手段を作動させることで、固定組織を所定の温度に調節し、一定時間の経過後に再び接触手段を作動させて接触を止めることができる。さらに、各部における反応中に、目的の条件と乖離しているという情報が温度センサやｐＨセンサなどの各種センサからインターフェース（０２５４）を介して入力された場合、揮発性メモリ（０２５２）上に展開された反応条件制御プログラムを実行し、条件を目的の範囲内に調整するように薬剤を追加したり、調温手段を作動させることができる。
　必要に応じて、ユーザに情報を提示する表示部を備えることができ、その内容は表示制御部により制御される。表示部のハードウェアは特に限定しないが、例えば、ディスプレイなどが挙げられる。
　また、必要に応じて、ユーザが情報を入力する入力デバイスを備えることができ、入力デバイスとしては、例えば、キーボード、マウス、タッチパネル、タッチペンなどが挙げられる。入力デバイスから入力された情報は、入出力制御部により制御される。入出力制御部は、入力デバイスからのデータや命令の入力の他、処理装置から出力される各種データの出力を制御する。ユーザに入力を求める情報は特に限定しないが、例えば、各工程の時間や反応条件の設定の他、実施する工程の指定、貯留手段にて溶液の更新を行う基準（例えば、濁度や期間など）の指定をユーザに求めることができる。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって制限されないものとする。
実施例１：免疫組織化学的染色によるＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質検出１
　（パラフィン除去工程）
　厚さ４μｍのパラフィン包埋された各種ヒト癌組織切片（乳癌組織、肺癌組織、膵臓癌組織、腎臓癌組織、大腸癌組織、胃癌組織、卵巣癌組織および前立腺癌組織；ＵＳ　ＢＩＯＭＡＸ社製；各１３６１人の異なる検体由来の切片を使用）からキシレンを用いて２０分間かけてパラフィンを除去した。キシレンは５分ごとに３回交換した。次にキシレンの代わりに１００％、９０％、８０％エタノール水溶液を用いて、同様の手順で各５分間かけて洗浄を行った。これらの工程は室温で行った。その後、ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４）を用いて５分間ずつ３回の洗浄を行った。
　（抗原賦活化工程）
　０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭ　クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を満たした染色瓶にパラフィン除去工程を経た各種ヒト癌組織切片を入れ、９９℃で４０分間の加熱処理をした。その後、室温で４０分以上静置することにより冷却した。
　（非特異的抑制反応工程）
　（ペルオキシダーゼの内因性反応抑制工程）
　抗原賦活化工程を経た各種ヒト癌組織切片周囲の余分な水分を除去し、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｂｌｏｃｋ（ＤＡＫＯ社製）を適量滴下して室温で５分間静置した。
　（タンパク質のブロッキング）
　ＰＢＳ－Ｔでの５分間ずつ３回の洗浄を行った後、ブロッキング液として、１０％　ＦＢＳを含むＰＢＳ－Ｔ溶液を添加し、モイストチャンバー内において室温で１時間インキュベートした。
　（標識化工程：一次抗体反応ステップ）
　非特異的抑制反応工程を経た各種ヒト癌組織切片に、ＷＯ２０１３／０１８８９１で作製したマウス抗ＣＡＰＲＩＮ－１モノクローナル抗体を含む一次抗体液を添加し、モイストチャンバー内において４℃で一晩インキュベートした。一次抗体液は、５％　ＦＢＳおよび２０％　ｎｏｒｍａｌ　ｇｏａｔ　ｓｅｒｕｍを含むＰＢＳ－Ｔ溶液に上述のマウス抗ＣＡＰＲＩＮ－１抗体を終濃度２μｇ／ｍＬとなるように添加して調製した。
　（標識化工程：二次抗体反応ステップ）
　一次抗体反応ステップを経た各種ヒト癌組織切片をＰＢＳ－Ｔで１０分間３回洗浄した後、切片にＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｌａｂｅｌｌｅｄ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＢＩＯＣＡＲＥ社製）を適量滴下し、モイストチャンバー内において室温で３０分間インキュベートした。
　（発色工程）
　二次抗体反応ステップを経た各種ヒト癌組織切片をＰＢＳ－Ｔで１０分間３回洗浄した後、切片にＤＡＢ発色液（ＢＩＯＣＡＲＥ社製）を添加し、室温で２０秒程度静置して発色させた。その後、発色液を捨て、ＰＢＳ－Ｔで１０分間３回の洗浄を行った後、蒸留水でリンスした。その後、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％濃度の各エタノール水溶液に順番に１分間ずつ浸漬し、キシレン中で一晩インキュベートすることで脱水処理を行った。
　（封入）
　発色工程を経た各種ヒト癌組織切片を、カバーガラスと、封入剤としてＧｌｙｃｅｒｇｅｌ　Ｍｏｕｎｔｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＢＩＯＣＡＲＥ社製）を用いて封入した。
　（観察）
　光学顕微鏡の４倍対物レンズを使用して、封入した切片の癌組織内の癌細胞におけるＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質染色像を観察した。
　卵巣癌組織について得られた染色像を図１に示す。図中、Ａは細胞核およびＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の染色像を示し、Ｂは細胞核のシグナルを除外したＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質の染色像を示す。図中矢印で示した通り、細胞膜上に局在するＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質のシグナルが細胞を縁取るように観察された（図１Ｂ）。
　このことから、この染色方法によって、細胞膜タンパク質の細胞膜上のシグナルを精度高く検出できることがわかった。
　また、本実施例にて、一次抗体反応ステップにおいて使用する抗体として、ＷＯ２０１０／０１６５２６、ＷＯ２０１１／０９６５１７、ＷＯ２０１１／０９６５２８、ＷＯ２０１１／０９６５１９、ＷＯ２０１１／０９６５３３、ＷＯ２０１１／０９６５３４、ＷＯ２０１３／０１８８９４、ＷＯ２０１３／０１８８９２、ＷＯ２０１３／０１８８９１、ＷＯ２０１３／０１８８８９、ＷＯ２０１３／０１８８８３、ＷＯ２０１３／１２５６３６、ＷＯ２０１３／１２５６５４、ＷＯ２０１３／１２５６３０、ＷＯ２０１３／１２５６４０およびＷＯ２０１５／０２０２１２で作製したマウス抗ＣＡＰＲＩＮ－１モノクローナル抗体またはウサギ抗ＣＡＰＲＩＮ－１モノクローナル抗体を適用しても、上記と同様に細胞膜タンパク質の細胞膜上のシグナルを精度高く検出できることがわかった。
比較例１：免疫組織化学染色によるＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質検出
　実施例１と同じ検体由来のパラフィン包埋された各種ヒト癌組織切片（ＢＩＯＭＡＸ社製）について、パラフィン除去工程でのパラフィン除去の前に６２℃で１５分間の加熱処理（ベーキング）を実施すること、および抗原賦活化工程における加熱処理を１２１℃で実施すること以外は実施例１の記載の工程に従って免疫組織化学的染色を実施した。
　卵巣癌組織について得られた染色像を図２に示す。図中矢頭で示した通り、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質は細胞膜上に局在するにもかかわらず、ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質のシグナルが細胞膜のみならず細胞質中にも見られ、細胞が塗りつぶされたようにシグナルが観察された（図２Ｂ）。
　このことから、実施例１の染色方法と異なり、ベーキングを行うことにより、細胞膜タンパク質の細胞膜上のシグナルの検出精度が著しく低下することがわかった。
実施例２：ＣＡＰＲＩＮ－１陽性癌細胞の判定
　まず、光学顕微鏡の４倍対物レンズを使用して、実施例１および比較例１で封入した切片の癌組織内の癌細胞におけるＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質染色像、陽性染色のシグナル強度を観察した。次に、対物レンズを１０倍または２０倍に切り替え、各検体由来の全ての切片における癌組織の全細胞に対する、細胞膜に特異的に発色が見られる癌細胞の比率（ＣＡＰＲＩＮ－１陽性細胞率）を算出した。
　ＣＡＰＲＩＮ－１陽性細胞率およびＣＡＰＲＩＮ－１シグナルの局在に基づいて、各癌組織検体を以下のスコア０～３に分類した。これらスコアのうち、スコア２および３をＣＡＰＲＩＮ－１陽性癌組織検体であると判定した。
・スコア０（ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質過剰発現なし）：ＣＡＰＲＩＮ－１陽性細胞率（細胞膜特異的にシグナルを呈している細胞の割合）が１０％に満たないもの
・スコア１（ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質過剰発現なし）：ＣＡＰＲＩＮ－１陽性細胞率が１０％以上であるが、癌細胞膜の一部に限局したシグナルを示し、弱い染色強度を示すもの
・スコア２（ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質過剰発現あり）：ＣＡＰＲＩＮ－１陽性細胞率が１０％以上であり、癌細胞の膜に局在したシグナルを示し、中程度の染色強度を示すもの
・スコア３（ＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質過剰発現あり）：ＣＡＰＲＩＮ－１陽性細胞率が１０％以上であり、癌細胞の膜に局在したシグナルを示し、染色強度が強い強度の染色強度を示すもの
・スコア２および３の組織検体をＣＡＰＲＩＮ－１陽性の癌組織検体と判定する。
　各スコアの例示的な染色像を図３～１０に示す。例えば胃癌組織においては、図２に示すようなスコア０の検体（図３）およびスコア１の検体（図４）はＣＡＰＲＩＮ－１陰性の検体と判定された。これらの検体では、細胞膜上のシグナルが弱く、細胞同士の境目が判然としなかった。一方、胃癌組織でも、図５および６に示すようなスコア２の検体（図５）およびスコア３の検体（図６）はＣＡＰＲＩＮ－１陽性の検体と判定された。これらの検体では、細胞膜上のシグナルが強く観察され、細胞同士の境目が明確であった。
　他の癌組織においても同様の判定を行った。例えば腎臓癌組織においては、細胞膜上のシグナルが弱い図７および８に示すようなスコア０の検体（図７）およびスコア１の検体（図８）はＣＡＰＲＩＮ－１陰性の検体と判定された。一方、細胞膜上のシグナルが強く観察された図９および１０に示すようなスコア２の検体（図９）およびスコア３の検体（図１０）はＣＡＰＲＩＮ－１陽性の検体と判定された。
　判定の結果、実施例１で染色を行った検体におけるＣＡＰＲＩＮ－１陽性の癌組織検体の割合、すなわち各癌組織検体数に占めるＣＡＰＲＩＮ－１陽性の癌組織検体の割合は、乳癌組織で７５％、肺癌組織で６５％、膵臓癌組織で７０％、腎臓癌組織で７０％、大腸癌組織で６０％、胃癌組織で６０％、卵巣癌組織で６５％、前立腺癌組織で９０％であった。
　一方、比較例１で染色を行った検体に基づいて判定を行った結果、ＣＡＰＲＩＮ－１陽性の癌組織検体の割合は、乳癌組織で５２％、肺癌で５４％、膵臓癌５８％、腎臓癌５５％、大腸癌４９％、胃癌４０％、卵巣癌４５％、前立腺癌５４％であり、実施例１の染色に基づく判定結果と大きく異なる結果となった。
　このことから、パラフィン除去工程にてベーキングすることによる染色の精度の低下が判定結果にも大きな影響を及ぼすことがわかった。
　なお、本比較例にて、一次抗体反応ステップにおいて使用する抗体として、ＷＯ２０１０／０１６５２６、ＷＯ２０１１／０９６５１７、ＷＯ２０１１／０９６５２８、ＷＯ２０１１／０９６５１９、ＷＯ２０１１／０９６５３３、ＷＯ２０１１／０９６５３４、ＷＯ２０１３／０１８８９４、ＷＯ２０１３／０１８８９２、ＷＯ２０１３／０１８８９１、ＷＯ２０１３／０１８８８９、ＷＯ２０１３／０１８８８３、ＷＯ２０１３／１２５６３６、ＷＯ２０１３／１２５６５４、ＷＯ２０１３／１２５６３０、ＷＯ２０１３／１２５６４０およびＷＯ２０１５／０２０２１２で作製したマウス抗ＣＡＰＲＩＮ－１モノクローナル抗体またはウサギ抗ＣＡＰＲＩＮ－１モノクローナル抗体を適用しても、上記と同様の染色の精度の低下が見られた。
実施例３：免疫組織化学的染色によるＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質検出２
　実施例１と同じ検体由来のパラフィン包埋された各種ヒト癌組織切片（ＢＩＯＭＡＸ社製）について、一次抗体反応ステップで使用する一次抗体液の抗体濃度を０．８μｇ／ｍＬとすること、および発色工程での発色時間を７分程度で実施すること以外は実施例１の記載に従って免疫組織化学的染色を実施し、実施例２と同様にＣＡＰＲＩＮ－１陽性癌組織検体を判定した。
　卵巣癌組織について得られた染色像を図１２に示す。抗体濃度および発色時間を変更しても、卵巣癌組織について実施例１で得られた染色像（図１１）と同等の精度での染色が可能であることがわかった。
　判定の結果、ＣＡＰＲＩＮ－１陽性の癌組織の割合は、乳癌組織で８０％、肺癌で７０％、膵臓癌８０％、腎臓癌８０％、大腸癌７０％、胃癌５５％、卵巣癌５５％、前立腺癌８０％であり、実施例１の染色に基づく判定結果と概ね一致した。
　また、本実施例にて、一次抗体反応ステップにおいて使用する抗体として、ＷＯ２０１０／０１６５２６、ＷＯ２０１１／０９６５１７、ＷＯ２０１１／０９６５２８、ＷＯ２０１１／０９６５１９、ＷＯ２０１１／０９６５３３、ＷＯ２０１１／０９６５３４、ＷＯ２０１３／０１８８９４、ＷＯ２０１３／０１８８９２、ＷＯ２０１３／０１８８９１、ＷＯ２０１３／０１８８８９、ＷＯ２０１３／０１８８８３、ＷＯ２０１３／１２５６３６、ＷＯ２０１３／１２５６５４、ＷＯ２０１３／１２５６３０、ＷＯ２０１３／１２５６４０およびＷＯ２０１５／０２０２１２で作製したマウス抗ＣＡＰＲＩＮ－１モノクローナル抗体またはウサギ抗ＣＡＰＲＩＮ－１モノクローナル抗体を適用しても、上記と同様の各癌組織検体数に占めるＣＡＰＲＩＮ－１陽性の癌組織検体の割合が得られた。
実施例４：免疫組織化学的染色方法によるＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質検出３
　実施例１と同じ検体由来のパラフィン包埋された各種ヒト癌組織（ＢＩＯＭＡＸ社製）について、抗原賦活化工程における加熱処理を１２１℃で実施すること以外は実施例１の記載に従って免疫組織化学的染色を実施し、実施例２と同様にＣＡＰＲＩＮ－１陽性癌組織検体を判定した。
　卵巣癌組織について得られた染色像を図１３に示す。抗原賦活化工程における加熱温度を変更しても、実施例１で得られた染色像（図１１）と同等の精度での染色が可能であることがわかった。
　判定の結果、ＣＡＰＲＩＮ－１陽性の癌組織検体の割合は、乳癌組織で７７％、肺癌で６７％、膵臓癌７５％、腎臓癌７５％、大腸癌６５％、胃癌６０％、卵巣癌６０％、前立腺癌８５％であり、実施例１の染色に基づく判定結果と概ね一致した。
　また、本実施例にて、一次抗体反応ステップにおいて使用する抗体として、ＷＯ２０１０／０１６５２６、ＷＯ２０１１／０９６５１７、ＷＯ２０１１／０９６５２８、ＷＯ２０１１／０９６５１９、ＷＯ２０１１／０９６５３３、ＷＯ２０１１／０９６５３４、ＷＯ２０１３／０１８８９４、ＷＯ２０１３／０１８８９２、ＷＯ２０１３／０１８８９１、ＷＯ２０１３／０１８８８９、ＷＯ２０１３／０１８８８３、ＷＯ２０１３／１２５６３６、ＷＯ２０１３／１２５６５４、ＷＯ２０１３／１２５６３０、ＷＯ２０１３／１２５６４０およびＷＯ２０１５／０２０２１２で作製したマウス抗ＣＡＰＲＩＮ－１モノクローナル抗体またはウサギ抗ＣＡＰＲＩＮ－１モノクローナル抗体を適用しても、上記と同様の各癌組織検体数に占めるＣＡＰＲＩＮ－１陽性の癌組織検体の割合が得られた。
実施例５：免疫組織化学的染色によるＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質検出４
　実施例１と同じ検体由来のパラフィン包埋された各種ヒト癌組織切片（ＢＩＯＭＡＸ社製）について、抗原賦活化工程における加熱処理を１２１℃で実施すること、一次抗体反応ステップで使用する一次抗体液の抗体濃度を０．８μｇ／ｍＬとすること、および発色工程での発色時間を７分程度で実施すること以外は実施例１の記載に従って免疫組織化学的染色を実施し、実施例２と同様にＣＡＰＲＩＮ－１陽性癌組織検体を判定した。
　卵巣癌組織について得られた染色像を図１４に示す。抗原賦活化工程における加熱温度、抗体濃度および発色時間を変更しても、実施例１で得られた染色像（図１１）と同等の精度での染色が可能であることがわかった。
　判定の結果、ＣＡＰＲＩＮ－１陽性の癌組織検体の割合は、乳癌組織で７９％、肺癌で６８％、膵臓癌７７％、腎臓癌７６％、大腸癌６２％、胃癌６２％、卵巣癌６１％、前立腺癌８６％であり、実施例１の染色に基づく判定結果と概ね一致した。
　また、本実施例にて、一次抗体反応ステップにおいて使用する抗体として、ＷＯ２０１０／０１６５２６、ＷＯ２０１１／０９６５１７、ＷＯ２０１１／０９６５２８、ＷＯ２０１１／０９６５１９、ＷＯ２０１１／０９６５３３、ＷＯ２０１１／０９６５３４、ＷＯ２０１３／０１８８９４、ＷＯ２０１３／０１８８９２、ＷＯ２０１３／０１８８９１、ＷＯ２０１３／０１８８８９、ＷＯ２０１３／０１８８８３、ＷＯ２０１３／１２５６３６、ＷＯ２０１３／１２５６５４、ＷＯ２０１３／１２５６３０、ＷＯ２０１３／１２５６４０およびＷＯ２０１５／０２０２１２で作製したマウス抗ＣＡＰＲＩＮ－１モノクローナル抗体またはウサギ抗ＣＡＰＲＩＮ－１モノクローナル抗体を適用しても、上記と同様の各癌組織検体数に占めるＣＡＰＲＩＮ－１陽性の癌組織検体の割合が得られた。
実施例６：免疫組織化学的染色によるＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質検出５
　実施例１と同じ検体由来のパラフィン包埋された各種ヒト癌組織切片（ＢＩＯＭＡＸ社製）について、パラフィン除去工程を以下の通り実施する以外は実施例１の記載に従って免疫組織化学的染色を実施し、実施例２と同様にＣＡＰＲＩＮ－１陽性癌組織検体を判定した。
　（パラフィン除去工程）
　パラフィン包埋された各種ヒト癌組織（ＢＩＯＭＡＸ社製）を、Ａｒｔｉｓａｎ　Ｃｌｅａｎｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて１５分間かけてパラフィンを除去した。Ａｒｔｉｓａｎ　Ｃｌｅａｎｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎは５分ごとに２回交換した。この工程は室温で行った。次にＰＢＳ－Ｔで５分間ずつ３回洗浄を行った。
　判定の結果、ＣＡＰＲＩＮ－１陽性の癌組織検体の割合は、乳癌組織で７８％、肺癌で６６％、膵臓癌７６％、腎臓癌７９％、大腸癌６３％、胃癌６４％、卵巣癌６２％、前立腺癌８８％であり、実施例１の染色に基づく判定結果と概ね一致した。
　また、本実施例にて、一次抗体反応ステップにおいて使用する抗体として、ＷＯ２０１０／０１６５２６、ＷＯ２０１１／０９６５１７、ＷＯ２０１１／０９６５２８、ＷＯ２０１１／０９６５１９、ＷＯ２０１１／０９６５３３、ＷＯ２０１１／０９６５３４、ＷＯ２０１３／０１８８９４、ＷＯ２０１３／０１８８９２、ＷＯ２０１３／０１８８９１、ＷＯ２０１３／０１８８８９、ＷＯ２０１３／０１８８８３、ＷＯ２０１３／１２５６３６、ＷＯ２０１３／１２５６５４、ＷＯ２０１３／１２５６３０、ＷＯ２０１３／１２５６４０およびＷＯ２０１５／０２０２１２で作製したマウス抗ＣＡＰＲＩＮ－１モノクローナル抗体またはウサギ抗ＣＡＰＲＩＮ－１モノクローナル抗体を適用しても、上記と同様の各癌組織検体数に占めるＣＡＰＲＩＮ－１陽性の癌組織検体の割合が得られた。
実施例７：免疫組織化学染色によるＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質検出６
　実施例１と同じ検体由来のパラフィン包埋された各種ヒト癌組織切片（ＢＩＯＭＡＸ社製）について、一次抗体反応ステップで使用する一次抗体液の抗体濃度を０．８μｇ／ｍＬとすること、および発色工程での発色時間を７分程度で実施すること以外は実施例６と同様に免疫組織化学的染色を実施し、実施例２と同様にＣＡＰＲＩＮ－１陽性癌組織検体を判定した。
　判定の結果、ＣＡＰＲＩＮ－１陽性の癌組織検体の割合は、乳癌組織で７７％、肺癌で６７％、膵臓癌７２％、腎臓癌７２％、大腸癌６８％、胃癌５８％、卵巣癌６４％、前立腺癌８２％であり、実施例１の染色に基づく判定結果と概ね一致した。
　また、本実施例にて、一次抗体反応ステップにおいて使用する抗体として、ＷＯ２０１０／０１６５２６、ＷＯ２０１１／０９６５１７、ＷＯ２０１１／０９６５２８、ＷＯ２０１１／０９６５１９、ＷＯ２０１１／０９６５３３、ＷＯ２０１１／０９６５３４、ＷＯ２０１３／０１８８９４、ＷＯ２０１３／０１８８９２、ＷＯ２０１３／０１８８９１、ＷＯ２０１３／０１８８８９、ＷＯ２０１３／０１８８８３、ＷＯ２０１３／１２５６３６、ＷＯ２０１３／１２５６５４、ＷＯ２０１３／１２５６３０、ＷＯ２０１３／１２５６４０およびＷＯ２０１５／０２０２１２で作製したマウス抗ＣＡＰＲＩＮ－１モノクローナル抗体またはウサギ抗ＣＡＰＲＩＮ－１モノクローナル抗体を適用しても、上記と同様の各癌組織検体数に占めるＣＡＰＲＩＮ－１陽性の癌組織検体の割合が得られた。
実施例８：免疫組織化学染色方法によるＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質検出７
　実施例１と同じ検体由来のパラフィン包埋された各種ヒト癌組織切片（ＢＩＯＭＡＸ社製）について、抗原賦活化工程における加熱処理を１２１℃で実施すること以外は実施例６と同様に免疫組織化学的染色を実施し、実施例２と同様にＣＡＰＲＩＮ－１陽性癌組織検体を判定した。
　判定の結果、ＣＡＰＲＩＮ－１陽性の癌組織検体の割合は、乳癌組織で８０％、肺癌で７０％、膵臓癌７０％、腎臓癌７８％、大腸癌６９％、胃癌５５％、卵巣癌６０％、前立腺癌９０％であり、実施例１の染色に基づく判定結果と概ね一致した。
　また、本実施例にて、一次抗体反応ステップにおいて使用する抗体として、ＷＯ２０１０／０１６５２６、ＷＯ２０１１／０９６５１７、ＷＯ２０１１／０９６５２８、ＷＯ２０１１／０９６５１９、ＷＯ２０１１／０９６５３３、ＷＯ２０１１／０９６５３４、ＷＯ２０１３／０１８８９４、ＷＯ２０１３／０１８８９２、ＷＯ２０１３／０１８８９１、ＷＯ２０１３／０１８８８９、ＷＯ２０１３／０１８８８３、ＷＯ２０１３／１２５６３６、ＷＯ２０１３／１２５６５４、ＷＯ２０１３／１２５６３０、ＷＯ２０１３／１２５６４０およびＷＯ２０１５／０２０２１２で作製したマウス抗ＣＡＰＲＩＮ－１モノクローナル抗体またはウサギ抗ＣＡＰＲＩＮ－１モノクローナル抗体を適用しても、上記と同様の各癌組織検体数に占めるＣＡＰＲＩＮ－１陽性の癌組織検体の割合が得られた。
実施例９：免疫組織化学染色によるＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質検出８
　実施例１と同じ検体由来のパラフィン包埋された各種ヒト癌組織切片（ＢＩＯＭＡＸ社製）について、抗原賦活化工程における加熱処理を１２１℃で実施すること、一次抗体反応ステップで使用する一次抗体液の抗体濃度を０．８μｇ／ｍＬとすること、および発色工程での発色時間を７分程度で実施する以外は実施例６と同様に免疫組織化学的染色を実施し、実施例２と同様にＣＡＰＲＩＮ－１陽性癌組織検体を判定した。
　判定の結果、ＣＡＰＲＩＮ－１陽性の癌組織検体の割合は、乳癌組織で７５％、肺癌で６５％、膵臓癌８０％、腎臓癌８０％、大腸癌６２％、胃癌５５％、卵巣癌６５％、前立腺癌８０％であり、実施例１の染色に基づく判定結果と概ね一致した。
　また、本実施例にて、一次抗体反応ステップにおいて使用する抗体として、ＷＯ２０１０／０１６５２６、ＷＯ２０１１／０９６５１７、ＷＯ２０１１／０９６５２８、ＷＯ２０１１／０９６５１９、ＷＯ２０１１／０９６５３３、ＷＯ２０１１／０９６５３４、ＷＯ２０１３／０１８８９４、ＷＯ２０１３／０１８８９２、ＷＯ２０１３／０１８８９１、ＷＯ２０１３／０１８８８９、ＷＯ２０１３／０１８８８３、ＷＯ２０１３／１２５６３６、ＷＯ２０１３／１２５６５４、ＷＯ２０１３／１２５６３０、ＷＯ２０１３／１２５６４０およびＷＯ２０１５／０２０２１２で作製したマウス抗ＣＡＰＲＩＮ－１モノクローナル抗体またはウサギ抗ＣＡＰＲＩＮ－１モノクローナル抗体を適用しても、上記と同様の各癌組織検体数に占めるＣＡＰＲＩＮ－１陽性の癌組織検体の割合が得られた。
　以上の結果から、本発明の染色方法は、除去溶液の種類やその他の条件を多少変更した場合であっても、細胞膜タンパク質を高い精度で検出可能であることがわかった。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
Ｓ０１０１　包埋媒体除去工程
Ｓ０１０２　抗原賦活化工程
Ｓ０１０３　標識化工程
Ｓ０１０４　標識検出工程
０２１０　包埋媒体除去部
０２１１　除去溶液貯留手段
０２１２、０２２２、０２３２、０２３４　接触手段
０２１３　保持手段
０２２０　抗原賦活化反応部
０２２１　抗原賦活化手段
０２３０　標識化反応部
０２３１　結合分子貯留手段
０２３３　標識化抗体貯留手段
０２４０　標識検出部
０２４１　検出手段
０２４２　解析手段
０２５０　制御部
０２５１　ＣＰＵ
０２５２　揮発性メモリ
０２５３　不揮発性メモリ
０２５４　インターフェース
０２５５　バス

Claims (25)

  1. 　包埋された固定組織から包埋媒体を除去して細胞膜タンパク質を検出する方法であって、
    　固体状態の包埋媒体を含む前記固定組織を除去溶液に接触させて前記包埋媒体を除去する包埋媒体除去工程、
    　前記包埋媒体除去工程後の固定組織の前記細胞膜タンパク質と標識化抗体を結合させる標識化工程、および
    　前記標識化工程後、前記細胞膜タンパク質と結合した標識化抗体を検出する標識検出工程を含む、前記方法。
  2. 　前記包埋媒体除去工程が、前記固定組織を包埋媒体の融点未満で前記除去溶液に接触させて前記包埋媒体を除去する工程である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記包埋媒体がパラフィンである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記包埋媒体除去工程が、前記固定組織を４５℃未満に維持しながら前記除去溶液に接触させて前記包埋媒体を除去する工程である、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記除去溶液が界面活性剤および／または有機溶媒を含む溶液である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記包埋媒体除去工程における接触が浸漬である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記包埋媒体除去工程後に、前記固定組織中の前記細胞膜タンパク質を賦活化する抗原賦活化工程を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　前記抗原賦活化工程が９０～１３０℃での加熱ステップを含む、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記抗原賦活化工程後に、前記固定組織を冷却する冷却工程を含む、請求項７または８に記載の方法。
  10. 　前記標識化工程が、前記包埋媒体除去工程後の固定組織の前記細胞膜タンパク質と前記細胞膜タンパク質と免疫学的反応性を有する一次抗体を反応させる一次抗体反応ステップ、および、前記一次抗体反応工程後の前記固定組織に、前記一次抗体と免疫学的反応性を有する標識化二次抗体を反応させる二次抗体反応ステップ、を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　前記標識化二次抗体が、前記一次抗体と免疫学的反応性を有する抗体およびペルオキシダーゼがポリマー担体上結合した複合体である、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記標識検出工程が、前記ペルオキシダーゼと反応性を有する発色試薬により発色した前記細胞膜タンパク質を検出する工程である、請求項１１に記載の方法。
  13. 　発色試薬が３，３’－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）である、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 　前記細胞膜タンパク質が癌細胞表面に発現する細胞膜タンパク質である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 　前記細胞膜タンパク質が疾患マーカーである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 　前記疾患が癌である、請求項１５に記載の方法。
  17. 　前記疾患マーカーがＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質である、請求項１５または１６に記載の方法。
  18. 　固定組織が由来する個体に対する治療法を決定する方法であって、
    　請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法を用いて包埋された固定組織中の疾患マーカーを検出する工程、および
    　前記工程によって検出された疾患マーカーに基づいて、前記個体に対する治療法を決定する治療法決定工程
    を含む、前記方法。
  19. 　包埋された固定組織において細胞膜タンパク質を検出する装置であって、
    　固体状態の包埋媒体を含む前記固定組織を除去溶液に接触させて前記包埋媒体を除去する包埋媒体除去部、
    　前記包埋媒体除去部を経た固定組織の前記細胞膜タンパク質と標識化抗体を結合させる標識化反応部、および、
    　前記標識化反応部を経た固定組織において前記細胞膜タンパク質と結合した標識化抗体を検出する標識検出部を備える、前記装置。
  20. 　前記包埋媒体除去部が、前記固定組織を包埋媒体の融点未満とする調温手段を備える、請求項１９に記載の装置。
  21. 　前記包埋媒体除去部を経た固定組織中の前記細胞膜タンパク質を賦活化する抗原賦活化反応部をさらに備える、請求項１９または２０に記載の装置。
  22. 　前記細胞膜タンパク質が癌細胞表面に発現する細胞膜タンパク質である、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の装置。
  23. 　前記細胞膜タンパク質が疾患マーカーである、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の装置。
  24. 　前記疾患が癌である、請求項２３に記載の装置。
  25. 　前記疾患マーカーがＣＡＰＲＩＮ－１タンパク質である、請求項２３または２４に記載の装置。
PCT/JP2024/012221 2023-03-28 2024-03-27 細胞膜タンパク質を検出する方法 WO2024204325A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023-050776 2023-03-28
JP2023050776 2023-03-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024204325A1 true WO2024204325A1 (ja) 2024-10-03

Family

ID=92906670

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2024/012221 WO2024204325A1 (ja) 2023-03-28 2024-03-27 細胞膜タンパク質を検出する方法

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2024204325A1 (ja)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008527330A (ja) * 2004-12-30 2008-07-24 ベンタナ・メデイカル・システムズ・インコーポレーテツド 低温の脱パラフィン処理
JP2010501549A (ja) * 2006-08-23 2010-01-21 コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー 胆管癌治療用薬学的組成物、胆管癌の成長または浸潤抑制方法、および胆管癌の治療方法
WO2014014086A1 (ja) * 2012-07-19 2014-01-23 東レ株式会社 癌の検出方法
WO2020138427A1 (ja) * 2018-12-28 2020-07-02 国立大学法人 東京大学 がん細胞を認識する抗体とストレプトアビジン変異体との融合タンパク質

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008527330A (ja) * 2004-12-30 2008-07-24 ベンタナ・メデイカル・システムズ・インコーポレーテツド 低温の脱パラフィン処理
JP2010501549A (ja) * 2006-08-23 2010-01-21 コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー 胆管癌治療用薬学的組成物、胆管癌の成長または浸潤抑制方法、および胆管癌の治療方法
WO2014014086A1 (ja) * 2012-07-19 2014-01-23 東レ株式会社 癌の検出方法
WO2020138427A1 (ja) * 2018-12-28 2020-07-02 国立大学法人 東京大学 がん細胞を認識する抗体とストレプトアビジン変異体との融合タンパク質

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6875129B2 (ja) 直接的な免疫組織化学アッセイ
CN110337588B (zh) 用于定量免疫组织化学的方法和系统
Wayner et al. Development of an ELISA to detect the secreted prostate cancer biomarker AGR2 in voided urine
KR101976219B1 (ko) 유방암의 바이오마커
US20120065089A1 (en) Method For Detecting And Distinguishing Intrahepatic Cholangiocarcinoma
JP5767116B2 (ja) 白金に基づく治療に対する応答の予測
AU2007291077B2 (en) Antibodies to an epitope of AGR2. assays and hybridomas
Mebratie et al. Review of immunohistochemistry techniques: Applications, current status, and future perspectives
CN103403550A (zh) 使用与braf v600e特异性结合的抗体诊断癌症的工具和方法
CN111954816A (zh) 检测magea4的方法
US20120003664A1 (en) Method for evaluating pre-treatment
US8486657B2 (en) Anti-preproprotein and anti-preprotein antibodies as immunohistochemical markers
KR101495225B1 (ko) Ast 양의 측정을 통한 간 질환 진단, 예후 또는 모니터링 키트 및 방법
US20210011007A1 (en) Fluorescent premix particles, fluorescent stain containing same, and fluorescent staining method in which these are used
WO2024204325A1 (ja) 細胞膜タンパク質を検出する方法
US20210048432A1 (en) Direct immunohistochemistry and immunocytochemistry methods
JP7432578B2 (ja) がんマーカーおよびその用途
JP2013096783A (ja) 肺腺癌を判定するためのデータ検出方法、診断薬、及び診断用キット
US20140113385A1 (en) Compositions and Methods for Identifying Single Antigens or Other Molecules in Cell Preparations
WO2024262280A1 (ja) 抗ｇａｐ４３抗体、その製造方法、それを用いた組織解析方法および組織解析方法用キット
CN101208356A (zh) 癌症特异性pcna同种型结合性抗体及其用途
WO2007103538A2 (en) Methods of multiple antibody labeling and uses thereof
JP2021519284A (ja) 治療薬による処置から利益を受けうる被験体を特定するためのサンドウィッチｅｌｉｓａ
JP2024541935A (ja) ヒト及びサル組織における増強されたｂｃｍａ免疫組織化学検出のための方法
CN116396942A (zh) 杂交瘤细胞、抗p4hb的单克隆抗体和试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2024526940

Country of ref document: JP

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 24780431

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1