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WO2024170798A1 - Procede de selection d'un compose ecobiologique apte a augmenter le seuil de tolerance de la peau - Google Patents

Procede de selection d'un compose ecobiologique apte a augmenter le seuil de tolerance de la peau Download PDF

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Publication number
WO2024170798A1
WO2024170798A1 PCT/EP2024/054201 EP2024054201W WO2024170798A1 WO 2024170798 A1 WO2024170798 A1 WO 2024170798A1 EP 2024054201 W EP2024054201 W EP 2024054201W WO 2024170798 A1 WO2024170798 A1 WO 2024170798A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tafa4
skin
advantageously
cells
cell
Prior art date
Application number
PCT/EP2024/054201
Other languages
English (en)
Inventor
Jean-Noël THOREL
Original Assignee
Naos Institute Of Life Science
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Naos Institute Of Life Science filed Critical Naos Institute Of Life Science
Publication of WO2024170798A1 publication Critical patent/WO2024170798A1/fr

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    • G01N2800/20—Dermatological disorders

Definitions

  • TITLE METHOD FOR SELECTING AN ECOBIOLOGICAL COMPOUND CAPABLE OF INCREASING THE SKIN'S TOLERANCE THRESHOLD
  • the present invention relates to a method for selecting at least one compound capable of increasing the tolerance threshold of the skin, in particular via the activity of the chemokine TAFA4.
  • it is a method for selecting at least one compound, preferably ecobiological, intended for the prevention and/or care of sensitive and/or sensitized skin, comprising in particular a step of quantifying the content of TAFA4, and/or of nucleic acids encoding TAFA4, and a step of comparing this quantification to a reference value so as to identify the presence or absence of a variation in the content of TAFA4 and/or of nucleic acids encoding TAFA4.
  • the skin is the main barrier that separates the body from the external environment and is composed of the superposition of three main layers, respectively from the deepest to the most superficial: the hypodermis, the dermis and the epidermis, colonized by the microbiota which is often considered as the last skin layer. Due to its constant interaction with the environment, the skin undergoes multiple attacks that alter its balance. In parallel with these exogenous attacks, each individual presents internal factors that have an impact on the health of the skin, namely, genetic heritage or hormones. These different exogenous and endogenous factors generate remarkable differences between individuals in the levels of skin tolerance and skin sensitivity, with a growing part of the population perceiving their skin as irritable or sensitive.
  • Sensitive skin is characterized by skin hyperreactivity: the skin reacts excessively to external and internal aggressions and stimuli that should normally be well tolerated (Stdecker et al., 2009). In other words, sensitive skin reacts more quickly due to a lowering of its tolerance threshold.
  • Sensitive skin is now recognized as a real syndrome by the medical community with an official definition established by the International Forum for the Study of Itch (IFSI): "a syndrome defined by the occurrence of unpleasant sensations (tingling, tightness, warming, itching and irritation) in response to stimuli that should not normally cause such sensations.
  • IFSI International Forum for the Study of Itch
  • the skin may appear normal or be accompanied by erythema. Sensitive skin can affect all parts of the body, particularly the face" (Misery et al., 2017).
  • sensitive skin syndrome is the result of a cumulative effect of a set of skin changes described below:
  • pro-inflammatory mediators such as cytokines (IL-1, IL-8, TNFa), inflammatory lipid mediators (prostaglandins E2, prostaglandins F2a and leukotrienes) and histamine; and
  • Skin hypersensitivity has a significant impact on overall quality of life and often leads people suffering from this condition to reduce or stop using cosmetic products in order not to exacerbate irritation.
  • cosmetic products generally contain compounds that can cause inflammatory phenomena, such as surfactants or preservatives. These intolerance reactions can be specific to an individual and limited to very specific conditions and/or combinations of compounds, and are therefore difficult to predict.
  • specific products such as sunscreens and products targeting specific dermatological conditions, reducing the frequency of application and/or the quantities applied to cosmetic products is not recommended as this could lead to worsening of skin hypersensitivity.
  • EP 1 457 780 describes a screening method in which the decrease in the production of stem cell factor (SCF), used as a specific biomarker, allows the selection of an ingredient of interest capable of treating pruritus and dry or sensitive skin syndromes.
  • SCF stem cell factor
  • SCF is known at the cutaneous level to be mainly involved in the survival of melanocytes and in the induction of melanin synthesis (Grabbe et al., 1994; Atef et al., 2019). Consequently, the modulation of this factor could lead to significant adverse effects on skin pigmentation.
  • TAFA4 protein also called FAM19A4 (family with sequence similarity 19 (chemokine (C-C motif)-like) member A4), a neurokine mainly produced in humans by certain nerve fibers (Wang et al., 2015; Yoo et al., 2021), is identified as an anti-inflammatory and soothing agent.
  • amino acid sequence of TAFA4 corresponds to the sequence SEQ ID NO: 1 and/or to the sequence SEQ ID NO: 2 and/or is encoded by the nucleotide sequence of mRNAs corresponding, partially or totally, to the sequence SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7.
  • TAFA4 protein is composed of two domains, including a signal peptide and a highly conserved chemokine-like sequence (Wang et al., 2015). In humans, TAFA4 is highly expressed in the brain, and more weakly in other organs such as the colon, spleen, pancreas, prostate, liver, and lungs (Leeman et al., 2020; Liu et al., 2017; Tom Tang et al., 2004; Wang et al., 2015).
  • TAFA4 is expressed and secreted by certain neurons whose free endings are found in the skin, notably DRG neurons (dorsal root ganglion), and C-LTMRs (C-low-threshold mechanoreceptors) sensory nerve fibers, the latter being involved in the transmission of sensory signals (Delfini et al., 2013; Hoeffel et al., 2021; Salio et al., 2021). Studies have shown that TAFA4 KO mice are viable, without apparent abnormalities, and respond to acute thermal and mechanical stimuli (Delfini et al., 2013).
  • TAFA4 KO mice have a defective resolution of inflammation 35 days post-irradiation in an actinic erythema-like model via UVC irradiation. This state can be compensated by intradermal injection of recombinant TAFA4 protein post-irradiation (Hoeffel et al., 2021).
  • TAFA4 KO mice develop significantly increased hypersensitivity to pain in pathological conditions (via intradural injection of inflammatory pain agonist or via partial sciatic nerve injury) compared to control mice.
  • Intradural injection of recombinant human TAFA4 compensates for the condition of TAFA4 KO mice.
  • mice also appears to play a restorative role during healing, particularly following sunburn (Hoeffel et al., 2021).
  • it could control allergic phenomena by inducing the synthesis of IL-10, which in turn acts on immune-mediated inflammation (Qiu et al., 2022).
  • mice In vivo in mice, an injection of the human TAFA4 protein, subcutaneously or at the level of neurons present in the bone marrow, reduces pain/hypersensitivity felt locally in the skin, up to 4 hours post-injection, particularly in a neuropathic pain model or a post-operative pain model (Kambrun et al., 2018; Yoo et al., 2021).
  • TAFA4 protein, peptide fragments thereof or a nucleic acid encoding it as an anti-inflammatory and soothing agent has already been proposed.
  • WO2014/180853A1 discloses the use of TAFA4 in pharmaceutical compositions for preventing, relieving or treating pain.
  • WO2020/064907A1 describes the use of TAFA4 or a nucleic acid encoding it for combating skin inflammation.
  • WO2021/156310A1 discloses the use of TAFA4 or a nucleic acid molecule encoding it for treating inflammatory diseases.
  • TAFA4 is described as an anti-inflammatory and soothing agent
  • its formulation in cosmetic or dermatological compositions, particularly for topical use is difficult due in particular to bioavailability issues, its molar mass of 15-20 kDa preventing its skin penetration, but also maintenance of biological activity, metabolization by skin cells or bacteria of the microbiota, etc.
  • compounds, preferably non-pharmaceutical cosmetics in particular capable of being presented in a galenic form suitable for topical application, advantageously ecobiological, which allow the prevention and/or care of sensitive and/or sensitized skin, in particular by increasing the skin tolerance threshold and/or reducing skin discomfort, also by acting on the endogenous mechanisms for controlling pain and inflammation specific to human skin.
  • the Applicant pursuing its ecobiological approach in the search for action on the real causes of skin problems and to give the skin the means to strengthen itself, has demonstrated that modulation of the endogenous content of TAFA4 and/or the nucleic acid encoding it (i.e., modulation of the transcription and/or protein expression of TAFA4) was possible, in particular at the cutaneous level, more particularly by topical intervention (excluding exogenous supply of TAFA4 and/or the nucleic acid encoding it).
  • the Applicant has demonstrated that the main living cells of the skin, namely keratinocytes and fibroblasts, also express TAFA4 endogenously, and that they can modulate this expression.
  • the Applicant has thus identified that the modulation of the endogenous content of TAFA4 and/or the nucleic acid encoding it is an indicator making it possible to classify candidate compounds according to their capacity or not to prevent and/or treat sensitive and/or sensitized skin, in particular by increasing the skin tolerance threshold, in particular via the use of relevant experimental models.
  • the Applicant has developed a reliable means (i.e., having acceptable sensitivity and/or specificity), easy to read/interpret and integrable into routine research and development, particularly in the cosmetic field, in order to decide on the selection or not of a compound, preferably ecobiological, intended for the prevention and/or care of sensitive and/or sensitized skin, this means being based on the modulation of the content of TAFA4 and/or of the nucleic acid encoding it.
  • a first subject of the present invention relates to a method for selecting at least one compound, preferably ecobiological, intended for the prevention and/or care of sensitive and/or sensitized skin, advantageously following stress, more advantageously an allergy, implementing the identification of a modulation, advantageously an increase, in the content of TAFA4 and/or nucleic acid, advantageously in mRNA, encoding it (i.e., encoding TAFA4).
  • it is a method comprising in particular a step of identifying a modulation, advantageously an increase, in the content of TAFA4 and/or nucleic acid, advantageously in mRNA, encoding TAFA4.
  • the method according to the invention comprises the following steps: a) bringing said at least one compound into contact with at least one skin cell; b) measuring the content of TAFA4 and/or nucleic acid, advantageously messenger ribonucleic acid (mRNA), encoding TAFA4; c) comparing the value obtained in step b) with a reference value; d) selecting said at least one compound inducing an increase in the content of TAFA4 and/or nucleic acid encoding TAFA4 in step c).
  • mRNA messenger ribonucleic acid
  • the term "compound” designates a substance or compound which has biological and/or therapeutic properties which underlie a physiological and/or galenic effect. It may be an active ingredient, an excipient or their mixtures.
  • the expressions "ecobiological composition”, “ecobiological compound”, “ecobiological ingredient”, “ecobiological active ingredient” or “ecobiological excipient” respectively designate a composition, a compound, an ingredient or an excipient that respects the person, their interactions with the world, and the planet. In particular, they designate a composition, a compound, an ingredient, an active ingredient or an excipient that respects the communities of living cells constituting the skin (i.e., skin microbiota, keratinocytes, fibroblasts, etc.) that constantly interact with each other and with their environment.
  • skin i.e., skin microbiota, keratinocytes, fibroblasts, etc.
  • the term "ecobiological approach” refers to the particular approach initiated and developed by the inventor/Applicant which combines skin biology and ecology to help the skin live according to its natural mechanisms, over the long term.
  • the expression "TAFA4" designates, together and individually, any protein, polypeptide or peptide originating from a mammalian cell, advantageously human or murine, more advantageously human, corresponding to the active peptide sequence of the protein, including the different existing or predicted isoforms generated by alternative mRNAs, as well as all the peptide fragments composing it and all its biologically active derivatives.
  • the amino acid sequence of TAFA4 corresponds to the sequence SEQ ID NO: 1 and/or to the sequence SEQ ID NO: 2.
  • the term "derivative or fragment” means a protein sequence identical to the sequence SEQ ID NO: 1 and/or to the sequence SEQ ID NO: 2 to at least 60%, preferably to at least 70%, more preferably to at least 80%, more preferably to at least 85%, or even to at least 90%, which therefore includes TAFA4 of different origins (non-human mammals, etc.).
  • biologically active derivatives designates isoforms, fragments or modified versions of the isoforms or fragments, in particular covalently modified with grafts of organic groups, such as capryloyl, stearoyl, palmitoyl fatty chains or by acetylation, methylation, etc. Said derivatives may exhibit a biological activity similar to or even superior to the protein from which they are derived.
  • nucleic acid encoding TAFA4 designates, together and individually, any nucleic acid, preferably any ribonucleic acid, more preferably any messenger ribonucleic acid (mRNA), originating from a mammalian cell encoding TAFA4, including its different isoforms.
  • nucleic acid preferably any ribonucleic acid, more preferably any messenger ribonucleic acid (mRNA), originating from a mammalian cell encoding TAFA4, including its different isoforms.
  • mRNA messenger ribonucleic acid
  • nucleotide sequence of TAFA4 corresponds, partially or totally, to the sequence SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 or to a sequence identical to one of the sequences SEQ ID NO: 3 to 7 at least 60%, preferably at least 70%, more preferably at least 80%, more preferably at least 85%, or even at least 90%, which therefore includes the nucleotide sequence coding for a TAFA4 protein of different origins (non-human mammals, etc.).
  • cDNA complementary deoxyribonucleic acids
  • care designates a topical care, in particular cosmetic and non-therapeutic.
  • the expression “sensitized skin” designates skin that is damaged and/or attacked and/or in an inflammatory state and/or made painful and/or disrupted, advantageously as a result of stress, more advantageously an allergy.
  • the expression "bringing into contact with at least one skin cell” designates any direct exposure (eg, cells in culture) or indirect exposure (eg, by topical application) to said at least one candidate compound according to the invention.
  • indirect exposure by topical application can be performed on the skin of an entire living organism, advantageously a human being, on a skin explant, on a reconstructed epidermis or on reconstructed skin.
  • skin explant designates a biopsy of human skin from surgical waste and which comprises the entire epidermis and a dermal and/or hypodermal compartment.
  • the expression "skin substitute” designates a reconstructed skin or a reconstructed epidermis, preferably human, which contains differentiated cells and distributed in several layers.
  • the reconstructed skin contains at least two compartments, namely: a dermal compartment and an epidermal compartment.
  • These models can be generated by 3D printing or by cell differentiation and can include several cell types in order to come as close as possible to the complete functionalities of the human or animal epidermis (innervation, immunization, pigmentation, vascularization, etc.). Examples of suitable models of this type are marketed by the companies LabSkin Creations or Straticell, Skin Ethic, Episkin or Phenion.
  • the expression "reconstructed epidermis” designates an epidermis generated in vitro by conventional techniques well known to those skilled in the art (e.g., Limât and Hunziker 2002; Poumay et al., 2004).
  • the keratinocytes used in this epidermis are advantageously derived from sensitive human skin.
  • the expression "reconstructed skin” designates an epidermal component, containing keratinocytes, generated in vitro and a dermal component, containing fibroblasts, generated in vitro integrated into a dermal matrix tissue.
  • the reconstructed skin is commercially available.
  • the keratinocytes and fibroblasts used in this skin can advantageously be derived from sensitive human skin.
  • the expression "skin cells” designates any cell type likely to be found, at least partially, in one of the three layers of the skin, i.e. epidermal cells (for example keratinocytes, melanocytes, sebocytes, Merkel cells, immune cells such as Langerhans cells, nerve endings of type C fibers), dermal cells (for example mast cells, vascular smooth muscle cells, specialized muscle cells, fibroblasts and immune cells, dermal dendritic cells, fibrocytes, endothelial cells), hypodermal cells (for example adipocytes), nerve cells and macrophages.
  • epidermal cells for example keratinocytes, melanocytes, sebocytes, Merkel cells, immune cells such as Langerhans cells, nerve endings of type C fibers
  • dermal cells for example mast cells, vascular smooth muscle cells, specialized muscle cells, fibroblasts and immune cells, dermal dendritic cells, fibrocytes, endothelial cells
  • hypodermal cells for example adip
  • the expression "skin cell” includes any neuronal cell whose endings or fibers are found in the skin.
  • the skin cells are fibroblasts or keratinocytes, advantageously human, in particular, the skin cells are macrophages, advantageously Ml-type macrophages, preferably human.
  • the methods for obtaining Ml-type macrophage cells are known to those skilled in the art, for example by differentiating THP-1 monocytes (Horiba et al., 2022) or PMBC monocytes (human peripheral blood mononuclear cells; Wang et al., 2015). In particular, these are GINIP+ type C neurons (Salio et al., 2021; Jung et al., 2023).
  • the expressions "reference value”, “normal value”, “normal”, “standard”, “usual value” or “reference biological sample” are used interchangeably and designate a value or an average of the values of a parameter (e.g., gene expression, in particular at the mRNA level, etc.), originating from one or more subjects and representing the basal state of the envisaged measurement; as opposed to a "tested value”, “test value” or “test biological sample”.
  • the reference value and the test value are obtained by implementing the same method of detection, quantification, identification, etc.
  • the reference value according to the invention is the measurement obtained without bringing the at least one skin cell according to the invention into contact with the at least one compound according to the invention.
  • the reference value according to the invention is the measurement obtained under the same conditions (in particular experimental, measurement, etc.) as in step b) but in the absence of step a) in the method according to the invention.
  • the measurement of the reference value according to the invention is carried out before or at the same time as step b) according to the invention, more advantageously under the same conditions, even more advantageously using the same culture of the at least one skin cell.
  • the expression “content of TAFA4 and/or of the nucleic acid(s) encoding it” designates the levels present in the cells (i.e., intracellular medium) and/or in the extracellular medium after secretion by said cells.
  • the expression “cutaneous content of TAFA4 and/or of the nucleic acid(s) encoding it” designates the levels present in the skin cells (Le., intracellular medium) and/or in the extracellular medium after secretion by said skin cells.
  • the expression "endogenous cutaneous content of TAFA4 and/or of the nucleic acid(s) encoding it” designates the basal levels present in the cutaneous cells (Le., intracellular medium) and/or in the extracellular medium after secretion by said cutaneous cells under normal conditions, in particular under normal culture conditions, and without induction or depletion of the expression of TAFA4.
  • the content of TAFA4 and/or nucleic acid encoding TAFA4 according to the invention is measured in the intra and/or extracellular medium of at least one skin cell according to the invention.
  • intracellular medium refers to the environment within a cell where intracellular biological processes take place. It includes the cytoplasm, nucleus and organelles.
  • extracellular medium refers to the space outside a cell, composed of fluids such as blood, lymph, interstitial fluid and in particular in the case of skin cells, the extracellular matrix or ECM, which is secreted by the skin cells.
  • ECM extracellular matrix
  • the expression “modulation of the content of TAFA4 and/or of the nucleic acid encoding TAFA4” designates any modification of the content of TAFA4 and/or of the nucleic acid encoding it, of the transcription and/or of the protein expression of TAFA4.
  • said modulation according to the invention corresponds to an increase in the content of TAFA4 and/or in the nucleic acid encoding it compared to the reference value according to the invention.
  • the increase in the content of TAFA4 is at least 120%, more preferably 150%, even more preferably 200% compared to the reference value according to the invention; and/or the increase in the content of nucleic acids encoding TAFA4 is at least 120%, more preferably 150%, even more preferably 200%, or even more than 1000% compared to the reference value according to the invention.
  • the expression “variation of expression” designates an overexpression or an underexpression of the gene.
  • overexpression means that the expression of a gene is increased relative to a reference value;
  • underexpression means that the expression of a gene is decreased relative to a reference value.
  • nucleotide sequence encoding an amino acid sequence means all nucleotide sequences that encode the amino acid sequence, including degenerate nucleotide sequences that make it possible to obtain said amino acid sequence.
  • the nucleotide sequence that encodes a protein or an RNA or a cDNA may optionally comprise introns.
  • coding or “coding for”, “code” or “code for” are used interchangeably and refer to the inherent property of specific nucleotide sequences in a polynucleotide, such as a gene, cDNA or mRNA, to serve as a template for the synthesis of polypeptides having a defined sequence of amino acids, and the biological properties that result therefrom.
  • a gene codes for a protein if transcription and translation of the mRNA corresponding to that gene produces the protein in a cell or other biological system.
  • Both the coding strand, whose nucleotide sequence is identical to the mRNA sequence and which is generally described in sequence listings and databases, and the non-coding strand, which is used as a template for transcription of a gene or cDNA, may be referred to as coding for the protein or other product of that gene or cDNA.
  • peptide For the purposes of the invention, the terms “peptide”, “polypeptide” and “protein” are used interchangeably and refer to a compound consisting of amino acid residues covalently linked by peptide bonds.
  • a protein by definition contains at least two amino acids, without limitation as to the maximum number of amino acids.
  • Polypeptides include indifferently several peptides and/or proteins, which themselves comprise two or more amino acids linked to each other by peptide bonds.
  • the term refers to both short chains, which are also commonly referred to in the art as peptides, oligopeptides and oligomers for example, and to longer chains, which are generally referred to in the art as proteins, of which there are many types.
  • Polypeptides include, for example, biologically active fragments, substantially homologous polypeptides, oligopeptides, homodimers, heterodimers, polypeptide variants, modified polypeptides, derivatives, analogs, fusion proteins, among others. Polypeptides include natural peptides, recombinant peptides, synthetic peptides, or a combination thereof.
  • sequence similarity refers to sequence similarity, which is measured as the percentage of sequence identity between two polypeptides or between two nucleic acid molecules.
  • a position in each of two sequences being compared is occupied by the same base or amino acid monomer subunit (for example, when a position in each of two DNA molecules is occupied by an adenine)
  • the percent identity, or similarity, between two sequences is a function of the number of corresponding positions shared by the two sequences, and is that number divided by the number of positions being compared and multiplied by 100. For example, if 6 out of 10 of the positions in two paired sequences are identical, then the two sequences are 60% identical or similar.
  • the comparison is made by aligning the two sequences to give maximum identity and, for protein sequences, ignoring conservative substitutions as part of the sequence identity.
  • amplification primer designates a nucleotide fragment which may comprise from 5 to 100 nucleotides, preferably from 15 to 30 nucleotides, and which has a specificity of hybridization with a target nucleotide sequence, under conditions determined for the initiation of an enzymatic polymerization, for example in an enzymatic amplification reaction of the target nucleotide sequence.
  • primer pairs are used, consisting of two primers hybridizing to the two complementary strands. When it is desired to carry out the amplification of several different genes, several different primer pairs are preferably used, each preferably having a capacity to hybridize specifically with a different gene.
  • hybridization probe designates a nucleotide fragment typically comprising from 5 to 100 nucleotides, preferably from 15 to 90 nucleotides, even more preferably from 15 to 35 nucleotides, having a hybridization specificity under determined conditions to form a hybridization complex with a target nucleotide sequence.
  • the probe also comprises a reporter (such as a fluorophore, an enzyme or any other detection system), which will allow the detection of the target nucleotide sequence.
  • the target nucleotide sequence may be a nucleotide sequence included in a messenger RNA (mRNA) or a nucleotide sequence included in a complementary DNA (cDNA) obtained by reverse transcription of said mRNA.
  • mRNA messenger RNA
  • cDNA complementary DNA
  • hybridization means the process during which, under appropriate conditions, two nucleotide fragments, such as for example a hybridization probe and a target nucleotide fragment, having sufficiently complementary sequences, are capable of forming a double strand with stable and specific hydrogen bonds.
  • a nucleotide fragment "capable of "hybridize” with a polynucleotide is a fragment capable of hybridizing with said polynucleotide under hybridization conditions, which can be determined in each case in a known manner.
  • the hybridization conditions are determined by the stringency of the operating conditions. The hybridization is all the more specific as it is carried out with greater stringency.
  • the temperature for the hybridization reaction is between approximately 20 and 70°C, in particular between 35 and 65°C in a saline solution at a concentration of approximately 0.5 to 1 M.
  • a step of detecting the hybridization reaction is then carried out.
  • the expression "enzymatic amplification reaction” designates a process generating multiple copies of a target nucleotide fragment, by the action of at least one enzyme.
  • amplification reactions are well known to those skilled in the art and the following techniques may be cited in particular: Polymerase Chain Reaction (PCR), Ligase Chain Reaction (LCR), Repair Chain Reaction (RCR), Self Sustained Sequence Replication (3SR) with document WO-A-90/06995, Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA), Transcription Mediated Amplification (TMA) with document US5399491 and Loop mediated isothermal amplification (LAMP) with document US6410278.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • LCR Ligase Chain Reaction
  • RCR Repair Chain Reaction
  • 3SR Self Sustained Sequence Replication
  • NASBA Nucleic Acid Sequence-Based Amplification
  • TMA Transcription Mediated Amplification
  • LAMP Loop mediated isothermal amplification
  • RT-PCR reverse transcription
  • mRNA messenger RNA
  • cDNA complementary DNA
  • the term “inducer” and the expression “inducer of the synthesis of TAFA4 and/or nucleic acid encoding it” are used interchangeably and designate an agent, a treatment or a culture condition capable of triggering a determined reaction or a programmed sequence of reactions in the biological system, namely the production (i.e., transcription and/or translation) of TAFA4 and/or nucleic acid encoding it.
  • the term “inhibitor” and the expression “inhibitor of the synthesis of TAFA4 and/or of the nucleic acid encoding it” are used interchangeably and designate an agent, a treatment or a culture condition capable of triggering a determined reaction or a programmed sequence of reactions in the biological system, namely the partial or total inhibition of the production (i.e., transcription and/or translation) of TAFA4 and/or of the nucleic acid encoding it.
  • the expression "depletion of the endogenous cutaneous content of TAFA4 and/or of the nucleic acid encoding it” designates the application of an agent, a treatment or a culture condition capable of inducing a reduction or even an elimination of the content of TAFA4 and/or of the nucleic acid encoding it, in the biological system.
  • the expressions "sensitizing agent” or “irritant agent” or “polluting agent” are used interchangeably and designate an agent, a treatment or a culture condition at the origin of a deregulation or a sensitization of the skin, namely a skin presenting different physiological constants to degrees which deviate from normal, in particular presenting an inflammatory state such as that observed during an increase in the expression and/or the concentration of IL-8, IL-1, TNFa or other inflammatory cytokines.
  • such an agent may be a surfactant, more advantageously sodium lauryl sulfate (SDS), or a preservative, more advantageously methylisothiazolinone, or another substance, not corresponding to a cosmetic raw material but which may be found as a contaminant of cosmetic raw materials, more advantageously a chromium salt, a nickel salt, cobalt, or a substance present in the environment, more advantageously microparticles, pollen.
  • SDS sodium lauryl sulfate
  • preservative more advantageously methylisothiazolinone
  • another substance not corresponding to a cosmetic raw material but which may be found as a contaminant of cosmetic raw materials, more advantageously a chromium salt, a nickel salt, cobalt, or a substance present in the environment, more advantageously microparticles, pollen.
  • non-sensitized cell designates a cell derived from a donor which is not characterized by sensitive and/or sensitized skin, and which has not been subjected to stress likely to sensitize it.
  • the subject of the present invention is a method for selecting at least one compound, as defined above and having the following technical characteristics, taken alone or in combinations:
  • - Said increase in the TAFA4 content corresponds to at least 120%, more preferably 150%, even more preferably 200% compared to the reference value according to the invention
  • nucleic acid encoding TAFA4 corresponds to at least 120%, more preferably 150%, even more preferably 200%, or even more than 1000% compared to the reference value according to the invention
  • said at least one compound is not the TAFA4 protein nor/or one of its biologically active derivatives nor/or one of its isoforms;
  • said method is an in vivo, in vitro or ex vivo method
  • said method is an in vivo or ex vivo method and is characterized in that the contacting of step a) is carried out by topical application of said at least one compound to the skin of an entire living organism, advantageously the skin of a whole living non-human organism, a skin explant, a reconstructed epidermis or a reconstructed skin;
  • said method is an in vivo method in a human subject
  • said method is an in vivo method in a non-human subject, advantageously a rodent (e.g., mouse, rat, guinea pig or rabbit), a cat, a dog, a primate (e.g., a chimpanzee), a bird (e.g., a chicken), a reptile, an amphibian or even a fish (e.g., zebrafish);
  • rodent e.g., mouse, rat, guinea pig or rabbit
  • a cat e.g., a dog
  • a primate e.g., a chimpanzee
  • a bird e.g., a chicken
  • a reptile e.g., an amphibian or even a fish (e.g., zebrafish)
  • said method is an in vitro method comprising the culture of skin cells, advantageously selected from the group consisting of keratinocytes, melanocytes, sebocytes, Merkel cells, vascular smooth muscle cells, specialized muscle cells, fibroblasts, mast cells, lymphocytes, monocytes, dendritic cells, advantageously dermal dendritic cells; Langerhans cells, adipocytes, nerve cells, macrophages, advantageously macrophages of type M1 or M2; endothelial cells; and mixtures thereof; preferentially chosen from keratinocytes, fibroblasts and mixtures thereof; and is characterized in that the contacting of step a) is carried out by addition to the culture medium;
  • said at least one skin cell is at least one macrophage, advantageously at least one macrophage of type Ml, preferably at least one macrophage of human type Ml;
  • said at least one skin cell is at least one keratinocyte, advantageously at least one human keratinocyte, more advantageously at least one normal human keratinocyte;
  • said at least one skin cell is at least one fibroblast, advantageously at least one human fibroblast, more advantageously at least one normal human fibroblast;
  • said method further comprises, before implementing step a), a step of adding to the culture medium an inducer of the synthesis of TAFA4 and/or of nucleic acid encoding it, by said at least one skin cell, advantageously chosen from: phorbol 12-myristate 13-acetate (PAM), preferably at a concentration of between 1 and 20 ng/ml; lipopolysaccharide (LPS), preferably at a concentration of between 0.1 pg/ml and 2 mg/ml; calcium, preferably at a concentration of between 0.1 mM and 10 mM; forskolin, preferably at a concentration of between 10 pM and 200 pM; the combination of calcium, preferably at a concentration of between 0.1 mM and 10 mM, and forskolin, preferably at a concentration of between 10 pM and 200 pM; epidermal growth factor (EGF), preferably at a concentration of between 10 ng/ml and 200 ng/ml; fetal
  • said method further comprises, before implementing step a), a step of adding to the culture medium an inhibitor of the synthesis of TAFA4 and/or of nucleic acid encoding it, by said at least one skin cell;
  • said method further comprises, before carrying out step a), a step of depleting the endogenous cutaneous content of TAFA4 and/or of the nucleic acid encoding it produced by said at least one cutaneous cell;
  • step b) of measuring the content of TAFA4 and/or nucleic acid, advantageously mRNA, encoding it is carried out at a protein level by an ELISA test, immunohistochemistry (including colorimetry, fluorescence, luminescence), other colorimetric method, or western-blot, dot-blot, simplified western by capillary immunoelectrophoresis (WES) and/or at the nucleic level by in situ hybridization, northern blot, sequencing or RT-PCR, advantageously RT-qPCR;
  • WES capillary immunoelectrophoresis
  • said content of TAFA4 and/or nucleic acid, advantageously mRNA, coding TAFA4 is measured in the intra and/or extracellular medium of said at least one skin cell;
  • said at least one skin cell has been brought into contact, preferably by topical application or by addition to the culture medium, with a sensitizing agent, advantageously a sensitizing cosmetic agent, more advantageously a surfactant or a preservative;
  • a sensitizing agent advantageously a sensitizing cosmetic agent, more advantageously a surfactant or a preservative
  • amino acid sequence of TAFA4 corresponds, partially or totally, to the sequence SEQ ID NO: 1 and/or to SEQ ID NO: 2, or to a sequence identical to one of the sequences SEQ ID NO: 1 to 2 at least 60%, preferably at least 70%, more preferably at least 80%, more preferably at least 85%, or even at least 90%;
  • nucleotide sequence of TAFA4 corresponds, partially or totally, to the sequence SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7, or to a sequence identical to one of the sequences SEQ ID NO: 3 to 7 at least 60%, preferably at least 70%, more preferably at least 80%, more preferably at least 85%, or even at least 90%;
  • said method comprises, in said step b), the additional measurement of the content of at least one indicator agent different from TAFA4 and/or the nucleic acid encoding it, for example IL-8, IL-1, TNF-a or other anti-inflammatory cytokines, said indicator agent content also being compared with a reference value specific to said step c);
  • - said reference value is the measurement obtained without bringing the at least one skin cell into contact with said at least one compound; - said reference value is the measurement obtained under the same conditions as in said step b) but in the absence of said step a);
  • step d) is associated with another selection step based on the induction of an increase or a decrease in the content of said indicator agent (modulation dependent on the indicator agent chosen) to decide on the selection or not of said at least one compound;
  • step d further comprises, after the implementation of step d), a step e) of formulating said at least one selected compound in a non-therapeutic, advantageously ecobiological, cosmetic and/or food composition, more advantageously presented in a galenic form suitable for topical and/or oral administration;
  • said step e) of formulating said at least one selected compound corresponds to the addition of at least one active ingredient usually used in the cosmetic, food and/or dermatological fields, advantageously selected from an anti-radical or more generally an antioxidant, a whitening agent, a pigmenting agent, an emollient, a moisturizer, anti-seborrheic agents, an anti-inflammatory agent, an anti-acne agent, a keratolytic and/or desquamating agent, an anti-wrinkle and/or tensor agent, a mineral or organic sunscreen that is hydrophilic or lipophilic, a draining agent, an anti-irritant agent, a soothing agent, a vitamin and their mixtures, a mattifying agent, an anti-aging active ingredient such as retinol, a healing agent, an antiseptic and an essential oil; and
  • step e) of formulation of said at least one selected compound corresponds to the addition of at least one excipient usually used in the cosmetic, food and/or dermatological fields, advantageously selected from a fatty substance, an emulsifier, a co-emulsifier, a hydrophilic or lipophilic gelling agent, a preservative, an antioxidant, a solvent, an exfoliating agent, a perfume, a filler, a neutralizer, a pro-penetrating agent, and a polymer.
  • excipient usually used in the cosmetic, food and/or dermatological fields, advantageously selected from a fatty substance, an emulsifier, a co-emulsifier, a hydrophilic or lipophilic gelling agent, a preservative, an antioxidant, a solvent, an exfoliating agent, a perfume, a filler, a neutralizer, a pro-penetrating agent, and a polymer.
  • the method according to the invention is an in vitro method, said contacting is carried out by addition to the culture medium, and the at least one skin cell is chosen from keratinocytes, melanocytes, sebocytes, Merkel cells, vascular smooth muscle cells, specialized muscle cells, fibroblasts, mast cells, lymphocytes, monocytes, dendritic cells, advantageously dermal dendritic cells; Langerhans cells, adipocytes, nerve cells, macrophages, advantageously of type M1 or M2; endothelial cells; and mixtures thereof.
  • the at least one skin cell is selected from keratinocytes and fibroblasts, preferably human, more preferably normal; and mixtures thereof.
  • the at least one skin cell is a murine cell, advantageously a cell derived from an immortalized murine line of B16 melanocytes.
  • the measurement of the content of TAFA4 and/or nucleic acid, advantageously mRNA, encoding it can be carried out with any method known to those skilled in the art. Examples include Northern blot, Southern blot, PCR, RT-PCR, quantitative RT-PCR, SAGE and its derivatives, nucleic acid chips, including cDNA chips, oligonucleotide chips and mRNA chips, tissue chips and RNA-Seq, immunohistology methods, immunoprecipitation, Western blot, simplified Western by capillary immunoelectrophoresis (WES), dot-blot, ELISA or ELISPOT, protein chips, antibody chips, or tissue chips coupled with immunohistochemistry, FRET or BRET techniques, microscopy or histochemistry methods, including in particular confocal microscopy and electron microscopy methods, methods based on the use of one or more excitation wavelengths and a suitable optical method, such as an electrochemical method (voltammetry and amperometric techniques), the atomic force microscope,
  • the quantification of the TAFA4 content can be carried out by immunohistochemistry or immunocytochemistry on sections of skin or cultured cells and other methods; by western blot; by dot blot; by simplified western by capillary immunoelectrophoresis (WES).
  • the protein dot blot is based on the principle of hybridization between a probe, generally labeled antibodies, and the target sought. It is simple and rapid, requiring no complex purification steps.
  • the biological sample cell supernatants or protein extracts
  • the membrane is incubated with the probe in order to detect the protein sought.
  • the simplified Western method by capillary immunoelectrophoresis combines the principles of Western blotting and capillary immunoelectrophoresis to detect and quantify specific proteins in a biological sample without resorting to membrane transfer, a laborious procedure.
  • the proteins are first separated by capillary electrophoresis according to their size and their electrical charge; the detection of the target proteins is then done using specific antibodies labeled directly on the capillaries, followed by an automated analysis in a dedicated apparatus.
  • the quantification of the TAFA4 content can be carried out by an ELISA test for example on the supernatants of cell cultures or cell extracts, by interpolating the optical density of the sample on a calibration curve obtained with serial dilutions of the recombinant human TAFA4 protein (for example from 0.1561 ng/ml to 10 ng/ml).
  • a viability test with ((3-4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) or MTT, known to those skilled in the art, can be carried out.
  • TAFA4 assays are only used if cell viability is greater than 80%, and are reported at this cell viability value.
  • RNA encoding TAFA4 can be carried out advantageously by in situ hybridization on cell sections; by northern blot; or by RT-qPCR.
  • total RNA is extracted from tissues, for example using commercially available kits (such as the Rneasy Plus Mini QIAGEN). The extraction can be followed by a dosage of total RNA which makes it possible to know the quantity and quality of RNA in the cell extract; this step can be carried out for example using the Bioanalyzer and the RNA 6000 Nano kit.
  • cDNA is generated using the QuantiTect Reverse Transcription Kit (QIAGEN), followed by real-time quantitative PCR at each treatment time point for the TAFA4 gene, using for example the QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN), and following the expression of a housekeeping gene (e.g., GAPDH) as a control and TAFA4 with specific primers based on SEQ ID NOs 3, 4, 5, 6 or 7.
  • QIAGEN QuantiTect Reverse Transcription Kit
  • GAPDH housekeeping gene
  • the measurement of the TAFA4 content is carried out by an ELISA test, by immunohistochemistry on cell sections; by western blot; the measurement of the content of messenger ribonucleic acids (mRNA) coding TAFA4 is carried out by immunohistochemistry, in situ hybridization on cell sections, by northern blot, sequencing or RT-PCR, advantageously RT-qPCR.
  • mRNA messenger ribonucleic acids
  • Quantification of the content of at least one marker different from TAFA4 as mentioned above, and/or of the nucleic acid encoding it can be carried out according to the methods specified above.
  • the method for selecting at least one compound, preferably ecobiological, intended for the prevention and/or care of sensitive and/or sensitized skin, advantageously following stress, more advantageously an allergy comprises the following steps: a) Bringing said at least one compound into contact in vitro with at least one skin cell by addition to the culture medium; b) measuring the content of TAFA4 and/or of nucleic acid encoding TAFA4, preferably in the culture medium and/or in the intracellular medium of said at least one skin cell; c) comparing the value obtained in step b) with a reference value, preferably obtained without bringing said at least one skin cell into contact with said at least one compound; d) selecting said at least one compound inducing an increase in the content of TAFA4 and/or of nucleic acid encoding it in step c), preferably of more than 120%, advantageously of more than 150%, relative to said reference value.
  • the method for selecting at least one compound, preferably ecobiological, intended for the prevention and/or care of sensitive and/or sensitized skin, advantageously following stress, more advantageously an allergy comprises the following steps: a) bringing said at least one compound into contact ex vivo with at least one skin cell by topical application to a skin explant, a skin substitute, a reconstructed epidermis or a reconstructed skin; b) measuring the content of TAFA4 and/or of the nucleic acid encoding it, preferably in the intra and/or extracellular medium of said at least one skin cell; c) comparing the value obtained in step b) with a reference value, preferably obtained without bringing said at least one skin cell into contact with said at least one compound; d) Selecting said at least one compound inducing an increase in the content of TAFA4 and/or nucleic acid encoding it in step c), preferably of more than 120%, advantageously of more than 150%, compared
  • the method for selecting at least one compound, preferably ecobiological, intended for the prevention and/or care of sensitive and/or sensitized skin, advantageously following stress, more advantageously an allergy comprises the following steps: a) bringing said at least one compound into contact in vivo with at least one skin cell by topical application to the skin of a whole living organism, advantageously a human or non-human being; b) measuring the content of TAFA4 and/or nucleic acid encoding it, preferably in the intra and/or extracellular medium of said at least one skin cell; c) comparing the value obtained in step b) with a reference value, preferably obtained without bringing said at least one skin cell into contact with said at least one compound; d) Selecting said at least one compound inducing an increase in the content of TAFA4 and/or nucleic acid encoding it in step c), preferably of more than 120%, advantageously of more than 150%, compared to said reference value.
  • said at least one skin cell, to be used in the method according to the invention is not sensitized.
  • said at least one skin cell, to be used in the method according to the invention is sensitized.
  • said at least one cell comes from a donor characterized by sensitive or sensitized skin, advantageously irritable, or reactive.
  • said at least one cell has been previously brought into contact, by topical application or by addition to the culture medium, with a sensitizing agent, advantageously a sensitizing cosmetic agent, even more advantageously chosen from a surfactant and a preservative.
  • a sensitizing agent advantageously a sensitizing cosmetic agent, even more advantageously chosen from a surfactant and a preservative.
  • the endogenous cutaneous contents of TAFA4 and/or of the nucleic acid encoding it of said cell according to the invention were depleted, before bringing said cell into contact with the at least one candidate compound.
  • said compound according to the invention does not correspond to the TAFA4 protein nor/or to one of its isoforms nor/or to one of its biologically active derivatives nor/or to TAFA4 nor/or to a ribonucleic acid encoding it nor/or to a nucleic acid encoding it, nor/or to their formulation.
  • Another object of the present invention also relates to a composition comprising at least one compound selected by the method described above.
  • the subject of the present invention is a composition as described above and having the following technical characteristics, taken alone or in combinations:
  • composition comprises at least one compound selected by the method described above;
  • composition consists of at least one compound selected by the method described above;
  • the composition is presented in at least one of the galenic forms suitable for topical application to the skin and/or mucous membranes, and/or appendages, for example in anhydrous form, in the form of an oil-in-water emulsion, a water-in-oil emulsion, a multiple emulsion, a silicone emulsion, a microemulsion, a nanoemulsion, a gel, an aqueous solution or a hydroalcoholic solution;
  • composition is fluid or not and is presented in the form of a cream, an ointment, a milk, a lotion, a serum, or a gel;
  • composition is presented in at least one of the galenic forms suitable for non-therapeutic food application, advantageously orally;
  • the composition is colored or not, advantageously colored using a coloring agent.
  • Another subject of the present invention also relates to the use of modulation of the content of TAFA4 and/or nucleic acid, advantageously in mRNA, encoding it, as an indicator making it possible to classify candidate compounds according to their capacity or not to increase the skin tolerance threshold.
  • Another subject of the present invention also relates to a method for formulating a non-therapeutic, advantageously ecobiological, cosmetic and/or food composition, more advantageously presented in a galenic form suitable for topical and/or oral administration, comprising the incorporation into said composition of at least one compound selected by the selection method according to the invention.
  • Figure 1 shows the effect of valproic acid, TGF-P and LPS tested at different concentrations and LPS at one concentration (1 pg/ml) on TAFA4 synthesis in normal human fibroblasts (NHFs) expressed as percentage induction.
  • NS p>0.05; *: p ⁇ 0.05; **: p ⁇ 0.01; ***: p ⁇ 0.001.
  • Figure 2 shows the effect of EGF protein at a concentration (30 ng/ml) on TAFA4 synthesis in normal human keratinocytes (NHK) expressed as percentage induction.
  • NS p>0.05; *: p ⁇ 0.05; **: p ⁇ 0.01; ***: p ⁇ 0.001.
  • the aim of the study is to provide a simple and rapid protocol to study the modulation of TAFA4 expression or transcription in keratinocyte and fibroblast lines by cosmetic compounds and compositions.
  • an inducer of the expression of TAFA4 can be implemented to potentiate the expression of the gene encoding this protein, in particular in the case where the quantity of gene encoding the TAFA4 protein or the quantity of TAFA4 protein is less than or equal to the detection limit imposed by the method implemented by the person skilled in the art and/or to provide a reference TAFA4 production value, Le., a positive control, this value having to be reached in order to classify the candidate compound in the category of compounds, preferably ecobiological, suitable for the prevention and/or care of sensitive and/or sensitized skin.
  • Normal human keratinocytes (NHK) and normal human fibroblasts (NHF) were used in this study. They were obtained from Promocell (France), Lonza (France).
  • Seeding density 15,000 cells/well in 96-well plates at 48 hours
  • inducers were selected as positive controls based on literature data.
  • the cells (KHN, FHN) are seeded in 96-well plates in the corresponding complete culture medium. After 24 hours of culture at 37°C, 5% CO2, the compounds or compositions to be evaluated are added at the chosen concentrations in the culture medium and the cells are incubated for 48 hours or 72 hours at 37°C 5% CO2. A positive induction control is evaluated in parallel with the active ingredients.
  • the supernatants are harvested and stored at -80°C before performing the TAFA4 assay by ELISA.
  • the assay is performed only if cell viability is greater than 80%.
  • the cells are recovered after incubation of the active or positive controls on shorter kinetics (30 min to 24 h).
  • Different pharmaceutical or cosmetic molecules can be pre-selected and tested. These molecules will be directly solubilized in the culture medium or solubilized in ethanol or DMSO depending on their nature.
  • TAFA4 concentration is calculated from the standard range (0.1561 ng/ml to 10 ng/ml) established with recombinant human TAFA4 protein.
  • results are expressed in ng/ml of TAFA4 per well. On the cell lawn an MTT viability test is performed. TAFA4 assays are used only if cell viability is greater than 80%, and are reported at this cell viability value.
  • Total RNA assay allows to know the quantity and quality of RNA in the cell extract.
  • the assay is carried out using the Bioanalyzer and the RNA 6000 Nano kit.
  • Quantitative real-time PCR at each treatment time is performed for the TAFA4 gene.
  • the QuantiFast SYBR Green PCR kit from Qiagen is used.
  • % viability (OD condition treated/OD (100% viability)) x 100.
  • the cells representing 100% viability correspond to the cells incubated at different times in the control culture medium.
  • MTT ((3-4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) is a soluble yellow dye that is metabolized by mitochondrial enzymes (succinate dehydrogenase) into a dark blue compound: formazan.
  • mitochondrial enzymes succinate dehydrogenase
  • formazan crystals are then solubilized in DMSO and the optical density is measured spectrophotometrically at 540 nm.
  • the aim of the study is to provide a simple and rapid protocol to study the modulation of TAFA4 expression or transcription in an inflammatory macrophage model by cosmetic compounds and compositions.
  • a depletion of the TAFA4 content (depletion of the expression of the gene encoding the TAFA4 protein and/or of the amount of TAFA4 protein) can be implemented to provide a model in which the endogenous constitutive production of TAFA4 must be restored in order to classify the candidate compound in the category of compounds, preferably ecobiological, intended for the prevention and/or care of sensitive and/or sensitized skin.
  • Macrophages are immune cells capable of infiltrating tissues. Macrophages are differentiated from monocytes (blood cells), which are themselves differentiated from bone marrow stem cells. Macrophages and monocytes are cells capable of phagocytosis. Their role is to phagocytose cellular debris and pathogens and they participate more broadly in the immune response by synthesizing different types of mediators.
  • M2s which have anti-inflammatory and pro-inflammatory properties. At the cutaneous level, they are notably involved in the repair phase of healing.
  • THP-1 cells are the most described and used cells in the literature.
  • THP-1 Culture medium: RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) + 10% FBS (fetal bovine serum) (Wang et al., 2015) +/- 100 mg/L gentamicin, 4.5 g/L glucose, 1 mM pyruvate, 0.05 mM 2-mercaptoethanol and 2 mM L-glutamine (Shen et al., 2014) and +/- penicillin (100 units/mL) and streptomycin (100 pg/mL) in a humid environment at 5% CO2 in air and 37°C (Kawano et al., 2015).
  • FBS fetal bovine serum
  • THP-1 can be differentiated into MO, Ml and M2 type macrophages according to the culture conditions described by Horiba et al., 2022.
  • Monocyte-derived macrophages from human PBMC human peripheral blood mononuclear cells obtained from human peripheral blood samples.
  • PMBCs are isolated from blood by Polymorphprep. Monocytes (CD14+) are then recovered after 4h of PMBC adhesion. Culture medium: RPMI 1640 + 10% FBS. Monocytes can be differentiated into MO macrophages by M-CSF (macrophage colony-stimulating factor) stimulation in vitro followed by LPS (Escherichia coli 055:B5) treatment, combined with IFN-y (interferon gamma) or IL-4 (interleukin-4), to differentiate them into Ml or M2 macrophages respectively, for 24h (Wang et al., 2015) in a humid environment at 5% CO2 in air and 37°C.
  • M-CSF macrophage colony-stimulating factor
  • LPS Escherichia coli 055:B5
  • IFN-y interferon gamma
  • IL-4 interleukin-4
  • the cells are seeded in 96-well plates in the corresponding complete culture medium. After 24 hours of culture at 37°C, 5% CO2, the active ingredients to be evaluated are added at the chosen concentrations in the culture medium and the cells are incubated for 48 hours or 72 hours at 37°C 5% CO2. A positive induction control is evaluated in parallel with the active ingredients.
  • the supernatants are harvested and stored at -80°C before performing the TAFA4 assay by ELISA.
  • the assay is performed only if cell viability is greater than 80%.
  • the cells are recovered after incubation of the active or positive controls on shorter kinetics (30 min to 24 h).
  • the cells After removal of the culture medium and rinsing with D-PBS, the cells are irradiated with UV.
  • UVX-36 UVP, Inc., San Gabriel, CA
  • No UVB was detected with a UVX-31 sensor.
  • the irradiance at the samples is 2.5 mW/cm 2 (Kawano et al., 2015).
  • Total RNA assay allows to know the quantity and quality of RNA in the cell extract.
  • the assay is carried out using the Bioanalyzer and the RNA 6000 Nano kit.
  • Quantitative real-time PCR at each treatment time is performed for the TAFA4 gene.
  • the Qiagen QuantiFast SYBR Green PCR Kit is used.
  • the quantification of TAFA4 in the supernatants is carried out using an ELISA test, Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Ref: abx522987, Cliniscience, France) with the reagents recommended by the manufacturer.
  • the Optical Density (OD) is read with a spectrophotometer at 450 nm.
  • the concentration of TAFA4 is calculated from the standard range (0.1561 ng/ml to 10 ng/ml) established with the recombinant human protein of
  • TAFA4 The results are expressed in ng/ml of TAFA4 per well. On the cell lawn an MTT viability test is performed. TAFA4 assays are used only if cell viability is greater than 80%, and are reported at this cell viability value.
  • Example III Differentiation of SH-SY5Y cells into sensory neuronal cells and analysis of TAFA4 levels
  • the aim of the study is to test the modulation of TAFA4 expression in a neuronal cell type likely to produce it.
  • Human neuroblastoma SH-SY5Y cells used in this study were obtained from Sigma Aldrich (94030304). Cells were thawed at P13 in a 37°C water bath and then immediately placed in DMEM. The cell suspension was centrifuged at 125 x g for 7 min at 4°C and the pellets were suspended in a 1:1 mixture of Eagle's Minimum Essential Medium, and F12 Medium, supplemented with 10% fetal bovine serum, and PS solution.
  • Cells were seeded in the 96-well plate at a density of 7,000 cells per well and were cultured at 37°C in a 95% air, 5% CO2 incubator. To avoid any edge effects, the first and last column as well as the first and last row of the plate were not used in the study. Empty wells were filled with water. Cells were allowed to grow to confluence (80%).
  • RNA samples are stored below -70°C.
  • cDNAs were obtained by reverse transcription using prime script reverse transcriptase (SensiFAST cDNA synthesis kit, Bioline meridian) from 25 ng of total RNA according to the manufacturer's instructions. cDNA samples were stored at -15/-25°C.
  • the PCR reaction was performed using the CFX96TM real-time system (Biorad). An equivalent of 10 ng of initial RNA was subjected to PCR amplification using 3 pM of primers and the SYBR Premix (ONEGreen Fast qPCR Premix, OZYME). The PCR reaction was performed using the following cycling procedure: 95°C for 30s, then 95°C for 5s, 60°C for 30s, and a total of 40 cycles were performed.
  • Each sample is analyzed for the selected gene (GAPDH and TAFA4) using RT-qPCR to measure the relative expression levels of mRNAs encoding the selected genes.
  • Gene expression analysis is assessed using the 2-AACt method (Livak and Schmittgen, 2001), where Ct is the cycle threshold value.
  • a negative control (no cDNA) is performed for each primer pair.
  • Expression is normalized to a housekeeping gene (e.g. GAPDH).
  • the aim of the study is to develop a cellular model to quantify the synthesis of TAFA4 in skin cells.
  • Dot blotting is an immunoenzymatic detection method for quantifying a protein in a sample after depositing it on a nitrocellulose membrane in a well.
  • Equipment specific Biorad, France
  • the apparatus and consumables used in this experiment are shown in Table 2 below.
  • the device is subjected to a vacuum pressure which will allow the suction of the sample (supernatant or protein extract) to be created and therefore the fixation of the proteins on the nitrocellulose membrane.
  • the equipment is placed at a height in relation to the vacuum pump, to respect the principle of gravity.
  • the membrane is pre-hydrated with 100 ⁇ l of TBS buffer (Tris base + NaCl diluted in water adjusted to pH 7.5) per well. This operation is repeated twice to optimize the hydration of the membrane for optimal fixation of the proteins contained in the samples.
  • TBS buffer Tris base + NaCl diluted in water adjusted to pH 7.5
  • the samples to be analyzed (supernatants and protein extracts) and the different solutions of TAFA4 recombinant proteins at different concentrations of the TAFA4 standard range (0.78 to 100 ng/ml) are placed in the plate (volume 100 ⁇ l/well used for protein extracts and 500 ⁇ l/well used for supernatants) then the aspiration flow is activated.
  • 100 ⁇ l of TBS is added per well to ensure that the entire sample has passed over the membrane.
  • the proteins contained in the samples will thus be deposited on the nitrocellulose membrane and create a 1 cm 2 spot.
  • a saturation step of the aspecific sites is carried out by incubating the membrane in a bath containing 5% skimmed milk in a TBS buffer (volume: 30 ml) with stirring at 4 ° C overnight. The next day, the membrane is washed with 20 ml of TBS-Tween buffer (TBS + Tween 20 at 0.05%) with stirring for 10 minutes. This wash is repeated 3 times, changing the washing buffer (volume: 30 ml). The membrane is incubated in a bath containing primary antibody diluted to 1/200 in TTBS buffer + 1% skimmed milk (volume: 20 ml) for 2 hours at room temperature with stirring. Then, the membrane is washed in the same way as described above.
  • the membrane is then incubated in a solution containing the secondary antibody (antibody coupled to HRP) diluted to 1/500 in TTBS buffer + 1% skimmed milk (volume: 20 ml) for 2 hours at room temperature with stirring.
  • the membrane is washed in the same way as described above.
  • the secondary antibody alone is used as a negative control.
  • the revelation of the proteins present in each of the deposits is carried out by incubating the membrane in a bath of pure ECL, a chemiluminescent substrate allowing the detection of the activity of peroxidase (HRP, horseradish peroxidase) conjugated to the secondary antibody.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the presence of the TAFA4 protein on the membrane results in the formation of a gray to black spot depending on the intensity of the reaction and therefore on the quantity of protein.
  • the membrane is read with the Fusion FX device (Vilber Lourmat) coupled with the VisionCapt software (Vilber Lourmat).
  • the quantification of the TAFA4 protein in the tested samples is carried out with the VisionCapt software which allows the intensity of the different spots to be measured.
  • the quantity of the samples is then carried out using the TAFA4 standard calibration curve established with the recombinant protein.
  • Figure 1 reports the effect of valproic acid, TGF-P and LPS on the modulation of TAFA4 in FHN supernatant after 72 h of incubation. The results are expressed as percentage of TAFA4 expression by normalizing the control to 100% (DMEM medium control). The data were obtained from 2 independent experiments performed in triplicate.
  • Valproic acid and TGF-P induce TAFA4 synthesis in a dose-dependent manner (statistically significant induction for 2 out of 2 doses for TGF-P; 1 out of 2 doses for valproic acid).
  • the aim of the study is to develop a cellular model to quantify the synthesis of TAFA4 in skin cells.
  • Normal human keratinocytes were used in this study. They were obtained from Promocell (Germany). The cells were seeded at 100,000 cells/well in 24-well plates in KGM. After 24 h, the cells were incubated with the compound presented in the table below in KBM + P/S medium at 37°C, 5% CO 2 .
  • Figure 2 reports the effect of EGF on TAFA4 modulation in KHN supernatant after 72 h of incubation. The results are expressed as percentage of TAFA4 expression by normalizing the control to 100% (KGM medium control). The data were obtained on 1 independent experiment performed in triplicate.
  • EGF tested at 30 ng/ml inhibits TAFA4 synthesis (statistical significance).
  • TAFA4 a chemokine-like protein, modulates injury-induced mechanical and chemical pain hypersensitivity in mice. Cell Rep 5:378-388.
  • Sensitive skin can be small fiber neuropathy: results from a case-controlled quantitative sensory testing study. Br J Dermatol. 179:1157-1162.
  • TAFA a novel secreted family with conserved cysteine residues and restricted expression in the brain. Genomics 83:727-734.
  • FAM19A4 is a novel cytokine ligand of formyl peptide receptor 1 (FPR1) and is able to promote the migration and phagocytosis of macrophages.
  • FPR1 formyl peptide receptor 1

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de sélection d'au moins un composé, de préférence écobiologique, destiné à la prévention et/ou au soin de la peau sensible et/ou sensibilisée, mettant en œuvre l'identification d'une modulation de la teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique la codant.

Description

DESCRIPTION
TITRE : PROCEDE DE SELECTION D'UN COMPOSE ECOBIOLOGIQUE APTE A AUGMENTER LE SEUIL DE TOLERANCE DE LA PEAU
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un procédé de sélection d'au moins un composé apte à augmenter le seuil de tolérance de la peau, notamment par le biais de l'activité de la chimiokine TAFA4. En particulier, il s'agit d'un procédé de sélection d'au moins un composé, de préférence écobiologique, destiné à la prévention et/ou au soin de la peau sensible et/ou sensibilisée, comprenant notamment une étape de quantification de la teneur en TAFA4, et/ou en acides nucléiques codant TAFA4, et une étape de comparaison de cette quantification à une valeur de référence de sorte à identifier la présence ou non d'une variation de la teneur en TAFA4 et/ou en acides nucléiques codant TAFA4.
ETAT DE LA TECHNIQUE
La peau constitue la principale barrière qui sépare l'organisme du milieu extérieur et se compose de la superposition de trois couches principales, respectivement de la plus profonde à la plus superficielle : l'hypoderme, le derme et l'épiderme, colonisée par le microbiote qui est souvent considéré comme l'ultime couche cutanée. En raison de son interaction constante avec l'environnement, la peau subit de multiples agressions qui altèrent son équilibre. En parallèle de ces atteintes exogènes, chaque individu présente des facteurs internes ayant une incidence sur la santé de la peau à savoir, le patrimoine génétique ou encore les hormones. Ces différents facteurs exogènes et endogènes engendrent des différences remarquables entre individus dans les niveaux de tolérance cutanée et de sensibilité de la peau, avec une partie croissante de la population qui perçoit sa peau comme irritable ou sensible.
Les résultats des études épidémiologiques montrent que le syndrome de la peau sensible est un problème global en constante augmentation avec une prévalence qui varie d'un pays à l'autre (Misery et al., 2018b). En France, 59% de la population déclare avoir une peau sensible (Misery et al., 2018a). Plus généralement, en Europe ces dernières années, la prévalence des peaux sensibles a considérablement augmenté, à savoir de +7% en 10 ans (Misery et al., 2018a). Des prévalences comparables ont été retrouvées également en Asie et en Amérique latine.
La peau sensible se caractérise par une hyperréactivité cutanée : la peau réagit de manière excessive aux agressions externes et internes et aux stimuli qui devraient normalement être bien tolérés (Stânder et al., 2009). En d'autres termes, la peau sensible réagit plus rapidement en raison d'un abaissement de son seuil de tolérance.
La peau sensible est désormais reconnue comme un véritable syndrome par la communauté médicale avec une définition officielle établie par l'international Forum for the Study of Itch ( I FSI ) : « syndrome défini par la survenue de sensations désagréables (picotements, tiraillements, échauffements, démangeaisons et irritations) en réponse à des stimuli qui ne devraient pas normalement provoquer de telles sensations. La peau peut apparaître normale ou être accompagnée d'érythème. La peau sensible peut affecter toutes les parties du corps, en particulier le visage » (Misery et al., 2017).
Selon le modèle actuel accepté par la communauté scientifique, le syndrome de la peau sensible est le résultat d'un effet cumulatif d'un ensemble de changements cutanés décrits ci-dessous :
- une fonction barrière altérée, ce qui permet aux agents agresseurs de pénétrer plus facilement dans la peau, entraînant une inflammation cutanée ;
- une altération des terminaisons nerveuses cutanées de type C, notamment une neuropathie des petites fibres nerveuses (Huet et al., 2018) ;
- une inflammation non spécifique des kératinocytes impliquant des médiateurs pro-inflammatoires tels que les cytokines (IL-1, IL-8, TNFa), des médiateurs lipidiques inflammatoires (prostaglandines E2, prostaglandines F2a et leucotriènes) et l'histamine; et
- une inflammation neurogène générée par la libération de neuromédiateurs, qui entretiennent l'inflammation cutanée et entraînent une vasodilatation (Stânder et al., 2009).
L'hypersensibilité cutanée a un impact considérable sur la qualité de vie globale et induit souvent les personnes souffrant de cette condition à réduire ou arrêter l'utilisation de produits cosmétiques afin de ne pas exacerber l'irritation. En effet, les produits cosmétiques contiennent de façon générale des composés susceptibles d'engendrer des phénomènes inflammatoires, comme les tensioactifs ou les conservateurs. Ces réactions d'intolérance peuvent être spécifiques à un individu et limitées à des conditions et/ou combinaisons de composés très spécifiques, et sont donc difficiles à prévoir. Or, dans le cas de produits spécifiques comme les produits solaires et les produits visant des affections dermatologiques particulières, la réduction de la fréquence d'application et/ou des quantités appliquées de produits cosmétiques n'est pas recommandée au risque de conduire à une aggravation de l'hypersensibilité cutanée.
Par ailleurs, il est important de pouvoir contrôler la sensibilité au niveau cutané, par exemple celle générée par les agents atmosphériques (pollution, température, humidité etc), les phénomènes d'allergie, la cicatrisation ou encore le coup de soleil en utilisant des composés cosmétiques non pharmaceutiques, avantageusement écobiologiques, notamment présentés sous une forme apte à une application topique.
A titre d'exemple, le document EP 1 457 780 décrit un procédé de criblage dans lequel la diminution de la production du facteur de cellules souches (« stem cell factor » ou SCF), utilisé comme un biomarqueur spécifique, permet la sélection d'un ingrédient d'intérêt apte à traiter le prurit et les syndromes de peau sèche ou sensible. Toutefois, SCF est connu au niveau cutané pour être principalement impliqué dans la survie des mélanocytes et dans l'induction de la synthèse de mélanine (Grabbe et al., 1994 ; Atef et al., 2019). Par conséquent, la modulation de ce facteur pourrait entrainer des effets indésirables significatifs au niveau de la pigmentation cutanée.
Il subsiste donc un besoin évident d'un procédé permettant d'identifier des composés, préférentiellement cosmétiques non pharmaceutiques, notamment aptes à se présenter sous une forme galénique adaptée à une administration par voie topique et/ou orale, avantageusement écobiologiques, qui permettent d'augmenter le seuil de tolérance cutanée et/ou réduire l'inconfort cutané également en agissant sur les mécanismes endogènes de contrôle de la douleur et de l'inflammation propre à la peau humaine.
A ce jour, la protéine TAFA4 (TAFA Chemokine Like Family Member 4), également appelée FAM19A4 (family with sequence similarity 19 (chemokine (C-C motif)-like) member A4), une neurokine majoritairement produite chez l'Homme par certaines fibres nerveuses (Wang et al., 2015 ; Yoo et al., 2021), est identifiée comme un agent anti-inflammatoire et apaisant. Chez l'Homme, la séquence en acides aminés de TAFA4 correspond à la séquence SEQ ID NO : 1 et/ou à la séquence SEQ ID NO : 2 et/ou est codée par la séquence de nucléotides des ARNm correspondant, partiellement ou totalement, à la séquence SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6 ou SEQ ID NO : 7.
La protéine TAFA4 est composée de deux domaines, incluant un peptide signal et une séquence de type chimiokine hautement conservée (Wang et al., 2015). Chez l'Homme, TAFA4 est fortement exprimée dans le cerveau, et plus faiblement dans d'autres organes comme le colon, la rate, le pancréas, la prostate, le foie ou encore les poumons (Leeman et al., 2020 ; Liu et al., 2017 ; Tom Tang et al., 2004 ; Wang et al., 2015).
Au niveau cutané, in vivo chez la souris, TAFA4 est exprimée et sécrétée par certains neurones dont les terminaisons libres sont retrouvées dans la peau, notamment les neurones DRG (ganglion de la racine dorsale), et les fibres nerveuses sensitives C-LTMRs (C-low-threshold mechanoreceptors), ces dernières étant impliquées dans la transmission de signaux sensoriels (Delfini et al., 2013 ; Hoeffel et al., 2021 ; Salio et al., 2021). Des études ont montré que des souris KO pour TAFA4 sont viables, sans anormalités apparentes et répondent aux stimuli thermiques et mécaniques aigus (Delfini et al., 2013). En revanche, elles présentent des défauts de régénération cutanée après exposition aux UV (Hoeffel et al., 2021) et une hypersensibilité à la douleur (Delfini et al., 2013, Kambrun et al., 2018 ; Salio et al., 2021). En particulier, les souris KO pour TAFA4 ont un défaut de résolution de l'inflammation 35 jours post-irradiation dans un modèle d'érythème actinique-like via irradiation par les UVC. Cet état peut être compensé par injection intradermique de la protéine TAFA4 recombinante post-irradiation (Hoeffel et al., 2021).
Par ailleurs, les souris KO pour TAFA4 développent une hypersensibilité à la douleur significativement accentuée en condition pathologique (via l'injection intradurale d'agoniste de la douleur inflammatoire ou via la lésion partielle du nerf sciatique) par rapport aux souris contrôles. Une injection intradurale de TAFA4 recombinant humain compense l'état des souris TAFA4 KO. Chez la souris, TAFA4 semble également jouer un rôle réparateur lors de la cicatrisation, notamment à la suite à un coup de soleil (Hoeffel et al., 2021). En outre, elle pourrait contrôler les phénomènes allergiques en induisant notamment la synthèse d'IL-10 qui a son tour, agit sur l'inflammation d'origine immunitaire (Qiu et al., 2022).
In vivo sur des souris, une injection de la protéine TAFA4 humaine, sous cutanée ou au niveau des neurones présents dans la moelle osseuse, diminue-la douleur/l'hypersensibilité ressentie de façon locale dans la peau, jusqu'à 4h post-injection, notamment dans un modèle de douleur neuropathique ou un modèle de douleur post-opératoire (Kambrun et al., 2018 ; Yoo et al., 2021).
L'utilisation de la protéine TAFA4, des fragments peptidiques la composant ou d'un acide nucléique codant pour celle-ci comme agent anti-inflammatoire et apaisant a déjà été proposée. Ainsi, le document WO2014/180853A1 divulgue l'utilisation de TAFA4 dans des compositions pharmaceutiques permettant de prévenir, de soulager ou de traiter la douleur. Le document W02020/064907A1 décrit l'utilisation de TAFA4 ou d'un acide nucléique codant pour celle-ci pour combattre l'inflammation cutanée. Le document W02021/156310A1 divulgue l'utilisation de TAFA4 ou d'une molécule d'acide nucléique codant pour celle-ci pour traiter des maladies inflammatoires.
Bien que TAFA4 soit décrite comme agent anti-inflammatoire et apaisant, sa formulation dans des compositions cosmétiques ou dermatologiques, notamment à usage topique, est difficile en raison notamment de problématiques de biodisponibilité, sa masse molaire de 15-20 kDa empêchant sa pénétration cutanée, mais aussi de maintien de l'activité biologique, de métabolisation par les cellules cutanées ou les bactéries du microbiote, etc. Il subsiste donc un besoin évident d'identifier des composés, préférentiellement cosmétiques non pharmaceutiques, notamment aptes à se présenter sous une forme galénique adaptée à une application topique, avantageusement écobiologique, qui permettent la prévention et/ou le soin de la peau sensible et/ou sensibilisée, notamment en augmentant le seuil de tolérance cutanée et/ou en réduisant l'inconfort cutané, également en agissant sur les mécanismes endogènes de contrôle de la douleur et de l'inflammation propre à la peau humaine.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
De façon surprenante, la Demanderesse, poursuivant sa démarche écobiologique dans la recherche d'action sur les causes réelles des problématiques cutanées et de donner à la peau les moyens de se renforcer, a démontré que la modulation de la teneur endogène en TAFA4 et/ou en acide nucléique la codant (i.e., modulation de la transcription et/ou de l'expression protéique de TAFA4) était possible, en particulier au niveau cutané, plus particulièrement par une intervention topique (hors apport exogène en TAFA4 et/ou en acide nucléique la codant).
De façon encore plus surprenante, la Demanderesse a mis en évidence que les principales cellules vivantes de la peau, à savoir les kératinocytes et les fibroblastes, expriment également TAFA4 de manière endogène, et qu'elles peuvent moduler cette expression.
Ces découvertes majeures ouvrent la voie à une toute nouvelle prise en charge de la sensibilité cutanée, en particulier par voie topique, notamment cosmétique, plus efficace, plus durable, et plus respectueuse de l'écosystème de la peau, en agissant dans le respect et via ses propres mécanismes naturels ainsi élucidés.
La Demanderesse a ainsi identifié que la modulation de la teneur endogène en TAFA4 et/ou en acide nucléique la codant est un indicateur permettant de classer des composés candidats selon leur capacité ou non à prévenir et/ou soigner la peau sensible et/ou sensibilisée, notamment en augmentant le seuil de tolérance cutanée, notamment via l'utilisation de modèles expérimentaux pertinents.
Sur la base de ce constat, la Demanderesse a mis au point un moyen fiable (i.e., présentant une sensibilité et/ou spécificité acceptable), facile à lire/interpréter et intégrable en routine de recherche et développement notamment dans le domaine cosmétique, afin de statuer sur la sélection ou non d'un composé, de préférence écobiologique, destiné à la prévention et/ou au soin de la peau sensible et/ou sensibilisée, ce moyen s'appuyant sur la modulation de la teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique codant celle-ci. Ainsi, un premier objet de la présente invention concerne un procédé de sélection d'au moins un composé, de préférence écobiologique, destiné à la prévention et/ou au soin de la peau sensible et/ou sensibilisée, avantageusement à la suite d'un stress, plus avantageusement une allergie, mettant en oeuvre l'identification d'une modulation, avantageusement d'une augmentation, de la teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique, avantageusement en ARNm, la codant (i.e., codant TAFA4). En d'autres termes, il s'agit d'un procédé comprenant notamment une étape d'identification d'une modulation, avantageusement d'une augmentation, de la teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique, avantageusement en ARNm, codant TAFA4.
En particulier, le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes : a) Mettre en contact ledit au moins un composé avec au moins une cellule cutanée ; b) Mesurer la teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique, avantageusement en acide ribonucléique messager (ARNm), codant TAFA4 ; c) Comparer la valeur obtenue à l'étape b) avec une valeur de référence ; d) Sélectionner ledit au moins un composé induisant une augmentation de la teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique codant TAFA4 à l'étape c).
Dans le cadre de l'invention, le terme « composé », désigne une substance ou un composé qui possède des propriétés biologiques et/ou thérapeutiques qui sous-tendent un effet physiologique et/ou galénique. Il peut s'agir d'un principe actif, d'un excipient ou de leurs mélanges.
Dans le cadre de l'invention, les expressions « composition écobiologique », « composé écobiologique », « ingrédient écobiologique », « actif écobiologique » ou « excipient écobiologique » désignent respectivement une composition, un composé, un ingrédient ou un excipient respectueux de la personne, de ses interactions avec le monde, et de la planète. En particulier, elles désignent une composition, un composé, un ingrédient, un actif ou encore un excipient respectueux des communautés de cellules vivantes constitutives de la peau (i.e., microbiote cutané, kératinocytes, fibroblastes etc.) qui interagissent constamment entre elles et avec leur environnement.
Dans le cadre de l'invention, par « démarche écobiologique », on désigne l'approche particulière initiée et développée par l'inventeur/la Demanderesse qui associe biologie et écologie cutanées pour aider la peau à vivre selon ses mécanismes naturels, sur le long terme.
Dans le cadre de la présente invention, l'expression « TAFA4 » désigne, ensemble et individuellement, toute protéine, polypeptide ou peptide issu d'une cellule de mammifère, avantageusement humaine ou murine, plus avantageusement humaine, correspondant à la séquence peptidique active de la protéine, incluant les différentes isoformes existantes ou prédites générées par des ARNm alternatifs, ainsi que tous les fragments peptidiques la composant et tous ses dérivés biologiquement actifs. En particulier, la séquence en acides aminés de TAFA4 correspond à la séquence SEQ ID NO : 1 et/ou à la séquence SEQ ID NO : 2. Plus précisément, on entend par dérivé ou fragment, une séquence protéique identique à la séquence SEQ ID NO : 1 et/ou à la séquence SEQ ID NO : 2 à au moins 60 %, de préférence à au moins 70 %, de préférence encore à au moins 80 %, de préférence encore à au moins 85%, voire à au moins 90 %, ce qui inclut donc les TAFA4 d'origines différentes (mammifères non humains, etc.).
Dans le cadre de l'invention, l'expression « dérivés biologiquement actifs » désigne des isoformes, fragments ou des versions modifiées des isoformes ou fragments, notamment modifiées de façon covalente avec des greffages de groupements organiques, comme des chaînes grasses capryloyle, stearoyle, palmitoyle ou encore par acétylation, méthylation, etc. Lesdits dérivés peuvent présenter une activité biologique similaire voire supérieure à la protéine dont ils dérivent.
Dans le cadre de la présente invention, l'expression « acide nucléique codant pour TAFA4 » désigne, ensemble et individuellement, tout acide nucléique, préférentiellement tout acide ribonucléique, plus préférentiellement tout acide ribonucléique messager (ARNm), issu d'une cellule de mammifère codant pour TAFA4, dont ses différentes isoformes. En particulier, la séquence nucléotidique de TAFA4 correspond, partiellement ou totalement, à la séquence SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6 ou SEQ ID NO : 7 ou à une séquence identique à l'une des séquences SEQ ID NO : 3 à 7 à au moins 60 %, de préférence à au moins 70 %, de préférence encore à au moins 80 %, de préférence encore à au moins 85%, voire à au moins 90 %, ce qui inclut donc la séquence nucléotidique codant pour une protéine TAFA4 d'origines différentes (mammifères non humains, etc.) Ces acides désoxyribonucléiques complémentaires (ADNc) correspondant à autant d'ARNm alternatifs identifiés chez l'Homme.
Dans le cadre de l'invention, le terme « soin » désigne un soin topique, en particulier cosmétique et non- thérapeutique.
Dans le cadre de l'invention, l'expression « peau sensibilisée » désigne la peau lésée et/ou agressée et/ou dans un état inflammatoire et/ou rendue douloureuse et/ou déréglée, avantageusement à la suite d'un stress, plus avantageusement d'une allergie.
Dans le cadre de l'invention, l'expression « mise en contact avec au moins une cellule cutanée » désigne toute exposition directe (e.g., des cellules en culture) ou indirecte (e.g., par application topique) audit au moins un composé candidat selon l'invention. En particulier, l'exposition indirecte par application topique peut être effectuée sur la peau d'un organisme vivant entier, avantageusement d'un être humain, sur un expiant cutané, sur un épiderme reconstruit ou sur une peau reconstruite.
Dans le cadre de la présente invention, l'expression « expiant cutané » désigne une biopsie de peau humaine issue de déchet opératoire et qui comprend la totalité de l'épiderme et un compartiment dermique et/ou hypodermique.
Dans le cadre de la présente invention, l'expression « substitut cutané » désigne une peau reconstruite ou un épiderme reconstruit, de préférence humain, qui contient des cellules différenciées et reparties en plusieurs couches. En particulier, au sens de l'invention, la peau reconstruite contient au moins deux compartiments à savoir : un compartiment dermique et un compartiment épidermique. Ces modèles peuvent être générés par impression 3D ou par différenciation cellulaires et peuvent inclure plusieurs types cellulaires afin de se rapprocher le plus possible des fonctionnalités complètes de l'épiderme humain ou animal (innervation, immunisation, pigmentation, vascularisation, etc.). Des exemples de modèles adaptés de ce type sont commercialisés par les sociétés LabSkin Creations ou encore Straticell, Skin Ethic, Episkin ou Phenion.
Dans le cadre de la présente invention, l'expression « épiderme reconstruit » désigne un épiderme généré in vitro par des techniques classiques bien connues de l'Homme du métier (e.g., Limât and Hunziker 2002 ; Poumay et al., 2004). Les kératinocytes utilisés dans cet épiderme sont avantageusement issus de peau humaine sensible.
Dans le cadre de la présente invention, l'expression « peau reconstruite » désigne une composante épidermique, contenant des kératinocytes, générée in vitro et une composante dermique, contenant des fibroblastes, générée in vitro intégrés dans un tissu matriciel dermique. La peau reconstruite est disponible commercialement. Les kératinocytes et les fibroblastes utilisés dans cette peau peuvent être issus, avantageusement, de peau humaine sensible.
Dans le cadre de la présente invention, l'expression « cellules cutanées » désigne tout type cellulaire susceptible de se retrouver, au moins partiellement, dans l'une des trois couches de la peau, c'est à dire les cellules de l'épiderme (par exemple les kératinocytes, les mélanocytes, les sébocytes, les cellules de Merkel, les cellules immunitaires tels que les cellules de Langerhans, les terminaisons nerveuses des fibres de type C), les cellules du derme (par exemple les mastocytes, les cellules musculaires lisses vasculaires, les cellules musculaires spécialisées, les fibroblastes et les cellules immunitaires, les cellules dendritiques dermiques, les fibrocytes, les cellules endothéliales), les cellules de l'hypoderme (par exemple les adipocytes), les cellules nerveuses et les macrophages. Il apparaît clairement que selon l'invention, l'expression « cellule cutanée » comprend toute cellule neuronale dont les terminaisons ou fibres se retrouvent dans la peau. En particulier, les cellules cutanées sont des fibroblastes ou des kératinocytes, avantageusement humains, en particulier, les cellules cutanées sont des macrophages, avantageusement des macrophages de type Ml, de préférence humains. Les méthodes pour obtenir des cellules de type macrophage Ml sont connus par l'Homme du métier, par exemple en différenciant des monocytes THP-1 (Horiba et al., 2022) ou des monocytes PMBC (cellules mononucléées du sang périphérique humain ; Wang et al., 2015). En particulier, il s'agit de neurones de type GINIP+ de type C (Salio et al., 2021 ; Jung et al., 2023).
Dans le cadre de l'invention, les expressions « valeur de référence », « valeur normale », « normale », « norme », « valeur usuelle » ou « échantillon biologique de référence » sont utilisées indifféremment et désignent une valeur ou une moyenne des valeurs d'un paramètre (e.g., expression de gène, notamment au niveau ARNm, etc.), issue d'un ou plusieurs sujets et représentant l'état basal de la mesure envisagée; par opposition à une « valeur testé », « valeur test » ou « échantillon biologique test ». La valeur de référence et la valeur test sont obtenues par la mise en oeuvre du même procédé de détection, quantification, identification, etc.
Selon un mode de réalisation particulier, la valeur de référence selon l'invention est la mesure obtenue sans mise en contact de l'au moins une cellule cutanée selon l'invention avec l'au moins un composé selon l'invention. Autrement dit, la valeur de référence selon l'invention est la mesure obtenue selon les mêmes conditions (notamment expérimentales, de mesure, ...) qu'à l'étape b) mais en l'absence d'étape a) dans le procédé selon l'invention.
Préférentiellement, la mesure de la valeur de référence selon l'invention est réalisée avant ou en même temps que l'étape b) selon l'invention, plus avantageusement dans les mêmes conditions, encore plus avantageusement en utilisant la même culture de l'au moins une cellule cutanée.
Dans le cadre de l'invention, les termes « teneur », « quantité » et « niveau » sont utilisés de manière interchangeable.
Dans le cadre de l'invention, l'expression « teneur de TAFA4 et/ou de(s) acide(s) nucléique(s) la codant » désigne les niveaux présents dans les cellules (i.e., milieu intracellulaire) et/ou dans le milieu extracellulaire après sécrétion par lesdites cellules. Dans le cadre de l'invention, l'expression « teneur cutanée de TAFA4 et/ou de(s) acide(s) nucléique(s) la codant » désigne les niveaux présents dans les cellules cutanées (Le., milieu intracellulaire) et/ou dans le milieu extracellulaire après sécrétion par lesdites cellules cutanées.
Dans le cadre de l'invention, l'expression « teneur cutanée endogène de TAFA4 et/ou de(s) acide(s) nucléique(s) la codant » désigne les niveaux basaux présents dans les cellules cutanées (Le., milieu intracellulaire) et/ou dans le milieu extracellulaire après sécrétion par lesdites cellules cutanées en condition normale, notamment en condition normale de culture, et sans induction ni déplétion de l'expression de TAFA4.
Selon un mode de réalisation particulier, la teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique codant TAFA4 selon l'invention est mesurée dans le milieu intra et/ou extracellulaire de l'au moins une cellule cutanée selon l'invention.
Dans le cadre de l'invention, le terme « milieu intracellulaire » ou « espace intracellulaire » désigne l'environnement à l'intérieur d'une cellule où les processus biologiques intracellulaires se déroulent. Il comprend le cytoplasme, le noyau et les organelles. Le terme « milieu extracellulaire » ou « espace extracellulaire » désigne l'espace à l'extérieur d'une cellule, composé de liquides tels que le sang, la lymphe, le liquide interstitiel et notamment dans le cas des cellules de la peau, la matrice extracellulaire ou ECM, qui est secrétée par les cellules de la peau. Par définition, la sécrétion des constituants intracellulaires, comme les précurseurs de la matrice extracellulaires ou les cytokines, a lieu dans le milieu extracellulaire.
Dans le cadre de l'invention, l'expression « modulation de la teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique codant TAFA4 » désigne toute modification de la teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique la codant, de la transcription et/ou de l'expression protéique de TAFA4.
Selon un mode de réalisation particulier, ladite modulation selon l'invention correspond à une augmentation de la teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique la codant par rapport à la valeur de référence selon l'invention. Préférentiellement, l'augmentation de la teneur en TAFA4 est d'au moins 120%, plus préférentiellement 150%, encore plus préférentiellement 200% par rapport à la valeur de référence selon l'invention ; et/ou l'augmentation de la teneur en acides nucléiques codant TAFA4 est d'au moins 120%, plus préférentiellement 150%, encore plus préférentiellement 200%, voire plus de 1000% par rapport à la valeur de référence selon l'invention.
Dans le cadre de l'invention, l'expression « variation de l'expression » désigne une surexpression ou une sous- expression du gène. En particulier, le terme « surexpression » signifie que l'expression d'un gène est augmentée par rapport à une valeur de référence ; le terme « sous-expression » signifie que l'expression d'un gène est diminuée par rapport à une valeur de référence.
Sauf indication contraire, au sens de l'invention, une « séquence de nucléotides codant pour une séquence d'acides aminés » désigne toutes les séquences nucléotidiques qui codent pour la séquence d'acides aminés, y compris les séquences de nucléotides dégénérées permettant d'obtenir ladite séquence d'acide aminés. La séquence nucléotidique qui code pour une protéine ou un ARN ou un ADNc peut éventuellement comprendre des introns.
Les termes « codant » ou « codant pour », « code » ou « code pour » sont utilisés indifféremment et se réfèrent à la propriété inhérente aux séquences spécifiques de nucléotides dans un polynucléotide, tel qu'un gène, un ADNc ou un ARNm, à servir de matrice pour la synthèse de polypeptides ayant une séquence définie d'acides aminés, et les propriétés biologiques qui en découlent. Ainsi, un gène code pour une protéine si la transcription et la traduction de l'ARNm correspondant à ce gène produisent la protéine dans une cellule ou un autre système biologique. Tant le brin codant, dont la séquence nucléotidique est identique à la séquence d'ARNm et qui est généralement décrite dans les listages de séquences et bases de données, que le brin non codant, utilisé comme matrice pour la transcription d'un gène ou de l'ADNc, peuvent être désignés comme codant pour la protéine ou un autre produit de ce gène ou ADNc.
Au sens de l'invention, les termes « peptide », « polypeptide » et « protéine » sont utilisés de manière interchangeable et font référence à un composé constitué de résidus d'acides aminés liés de manière covalente par des liaisons peptidiques. Une protéine contient par définition au moins deux acides aminés, sans limitation quant au nombre maximum d'acides aminés. Les polypeptides comprennent indifféremment plusieurs peptides et/ou protéines, lesquels comprennent eux-mêmes deux acides aminés ou plus reliés les uns aux autres par des liaisons peptidiques. Tel qu'il est utilisé ici, le terme se réfère à la fois à des chaînes courtes, qui sont également couramment désignés dans la technique comme des peptides, des oligopeptides et oligomères par exemple, et à des chaînes plus longues, qui sont généralement désignés dans la technique comme des protéines, dont il existe de nombreux types. Les « polypeptides » comprennent, par exemple, des fragments biologiquement actifs, des polypeptides substantiellement homologues, des oligopeptides, des homodimères, des hétérodimères, des variants de polypeptides, des polypeptides modifiés, des dérivés, des analogues, des protéines de fusion, entre autres. Les polypeptides comprennent des peptides naturels, des peptides recombinants, des peptides synthétiques, ou une combinaison de ceux-ci.
Les termes « identique » et « similaire » se réfèrent à la similarité de séquence, qui se mesure en pourcentage d'identité de séquence entre deux polypeptides ou entre deux molécules d'acide nucléique. Quand une position dans chacune des deux séquences comparées est occupée par la même base ou sous-unité monomère d'acide aminé (par exemple, lorsqu'une position dans chacune des deux molécules d'ADN est occupée par une adénine), alors les molécules sont identiques pour cette position. Le pourcentage d'identité, ou similarité entre deux séquences est fonction du nombre de positions correspondant partagées par les deux séquences, et correspond à ce nombre divisé par le nombre de positions comparées et multiplié par 100. Par exemple, si 6 sur 10 des positions dans deux séquences appariées sont identiques, alors les deux séquences sont identiques ou similaires à 60%. En règle générale, la comparaison est effectuée en alignant les deux séquences de façon à donner une identité maximale et, en ce qui concerne les séquences protéiques, sans prendre en compte des substitutions conservatives comme faisant partie de l'identité de séquence.
Dans le cadre de l'invention, l'expression « amorce d'amplification » désigne un fragment nucléotidique pouvant comprendre de 5 à 100 nucléotides, de préférence de 15 à 30 nucléotides, et possédant une spécificité d'hybridation avec une séquence nucléotidique cible, dans des conditions déterminées pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une réaction d'amplification enzymatique de la séquence nucléotidique cible. Généralement, on utilise des « couples d'amorces », constitués de deux amorces s'hybridant aux deux brins complémentaires. Lorsque l'on souhaite réaliser l'amplification de plusieurs gènes différents, plusieurs couples d'amorces différents sont de préférence utilisés, ayant préférentiellement chacun une capacité à s'hybrider spécifiquement avec un gène différent.
Dans le cadre de l'invention, l'expression « sonde d'hybridation » désigne un fragment nucléotidique comprenant typiquement de 5 à 100 nucléotides, de préférence de 15 à 90 nucléotides, de manière encore plus préférée de 15 à 35 nucléotides, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec une séquence nucléotidique cible. La sonde comporte également un rapporteur (tel qu'un fluorophore, une enzyme ou tout autre système de détection), qui va permettre la détection de la séquence nucléotidique cible. Dans la présente invention, la séquence nucléotidique cible peut être une séquence nucléotidique comprise dans un ARN messager (ARNm) ou une séquence nucléotidique comprise dans un ADN complémentaire (ADNc) obtenu par transcription inverse dudit ARNm. Lorsque l'on souhaite cibler plusieurs gènes différents, plusieurs sondes différentes sont de préférence utilisées, ayant préférentiellement chacune une capacité à s'hybrider spécifiquement avec un gène différent.
Dans le cadre de l'invention, par « hybridation », on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques, tels que par exemple une sonde d'hybridation et un fragment nucléotidique cible, ayant des séquences suffisamment complémentaires, sont susceptibles de former un double brin avec des liaisons hydrogènes stables et spécifiques. Un fragment nucléotidique "capable de s'hybrider" avec un polynucléotide est un fragment pouvant s'hybrider avec ledit polynucléotide dans des conditions d'hybridation, qui peuvent être déterminées dans chaque cas de façon connue. Les conditions d'hybridation sont déterminées par la rigueur des conditions opératoires. L'hybridation est d'autant plus spécifique qu'elle est effectuée à plus forte rigueur. Celle-ci est définie notamment en fonction de la composition en bases d'un duplex sonde/cible, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux acides nucléiques. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. En général, selon la longueur des sondes d'hybridation utilisées, la température pour la réaction d'hybridation est comprise entre environ 20 et 70°C, en particulier entre 35 et 65°C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M. On réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation.
Dans le cadre de l'invention, l'expression « réaction d'amplification enzymatique » désigne un processus générant de multiples copies d'un fragment nucléotidique cible, par l'action d'au moins une enzyme. De telles réactions d'amplification sont bien connues de l'Homme du métier et on peut citer notamment les techniques suivantes : Polymerase Chain Reaction (PCR), Ligase Chain Reaction (LCR), Repair Chain Reaction (RCR), Self Sustained Sequence Replication (3SR) avec le document WO-A-90/06995, Nucleic Acid Sequence- Based Amplification (NASBA), Transcription Mediated Amplification (TMA) avec le document US5399491 et Loop mediated isothermal amplification (LAMP) avec le document US6410278. Lorsque la réaction d'amplification enzymatique est une PCR, on parlera plus particulièrement de RT-PCR (RT pour « reverse transcription »), lorsque l'étape d'amplification est précédée d'une étape de reverse-transcription d'ARN messager (ARNm) en ADN complémentaire (ADNc), et de qPCR ou RT-qPCR lorsque la PCR est quantitative.
Dans le cadre de l'invention, le terme « inducteur » et l'expression « inducteur de la synthèse de TAFA4 et/ou d'acide nucléique la codant » sont utilisés de manière interchangeable et désignent un agent, un traitement ou une condition de culture capable de déclencher une réaction déterminée ou une séquence programmée de réactions dans le système biologique, à savoir la production (i.e., transcription et/ou traduction) de TAFA4 et/ou d'acide nucléique la codant.
Dans le cadre de l'invention, le terme « inhibiteur » et l'expression « inhibiteur de la synthèse deTAFA4 et/ou d'acide nucléique la codant » sont utilisés de manière interchangeable et désignent un agent, un traitement ou une condition de culture capable de déclencher une réaction déterminée ou une séquence programmée de réactions dans le système biologique, à savoir l'inhibition partielle ou totale de la production (i.e., transcription et/ou traduction) de TAFA4 et/ou d'acide nucléique la codant. Dans le cadre de l'invention, l'expression « déplétion de la teneur cutanée endogène en TAFA4 et/ou en acide nucléique la codant » désigne l'application d'un agent, un traitement ou une condition de culture capable d'induire une diminution voire une élimination de la teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique la codant, dans le système biologique.
Dans le cadre de l'invention, les expressions « agent sensibilisant » ou « agent irritant » ou « agent polluant » sont utilisées de façon interchangeable et désignent un agent, un traitement ou une condition de culture à l'origine d'un dérèglement ou d'une sensibilisation de la peau, à savoir une peau présentant différentes constantes physiologiques à des degrés qui s'écartent de la normale, en particulier présentant un état inflammatoire tel que celui observé lors d'une augmentation de l'expression et/ou de la concentration en IL- 8, IL-1, TNFa ou d'autres cytokines inflammatoires. Avantageusement, un tel agent peut être un tensioactif, plus avantageusement, du sodium lauryl sulfate (SDS), ou encore un conservateur, plus avantageusement le méthylisothiazolinone, ou encore une autre substance, ne correspondant pas à une matière première cosmétique mais qui peut se retrouver comme contaminant des matières premières cosmétiques, plus avantageusement un sel de chrome, un sel de nickel, le cobalt, ou encore une substance présente dans l'environnement, plus avantageusement des microparticules, du pollen.
Dans le cadre de l'invention, l'expression « cellule non sensibilisée » désigne une cellule issue d'un donneur qui n'est pas caractérisé par une peau sensible et/ou sensibilisée, et qui n'a pas été soumise à un stress susceptible de la sensibiliser.
De préférence, la présente invention a pour objet un procédé de sélection d'au moins un composé, tel que défini précédemment et présentant les caractéristiques techniques suivantes, prises seules ou en combinaisons :
- Ladite modulation de la teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique codant TAFA4 est une augmentation ;
- Ladite augmentation de la teneur en TAFA4 correspond à au moins 120%, plus préférentiellement 150%, encore plus préférentiellement 200% par rapport à la valeur de référence selon l'invention ;
- Ladite augmentation de la teneur en acide nucléique codant TAFA4 correspond à au moins 120%, plus préférentiellement 150%, encore plus préférentiellement 200%, voire plus de 1000% par rapport à la valeur de référence selon l'invention ;
- ledit au moins un composé n'est pas la protéine TAFA4 ni/ou l'un de ses dérivés biologiquement actifs ni/ou l'une de ses isoformes ;
- ledit procédé est un procédé in vivo, in vitro ou ex vivo ;
- ledit procédé est un procédé in vivo ou ex vivo et est caractérisé en ce que la mise en contact de l'étape a) est réalisée par application topique dudit au moins un composé sur la peau d'un organisme vivant entier, avantageusement la peau d'un organisme non-humain vivant entier, un expiant cutané, un épiderme reconstruit ou une peau reconstruite ;
- ledit procédé est un procédé in vivo chez un sujet humain ;
- ledit procédé est un procédé in vivo chez un sujet non-humain, avantageusement un rongeur (e.g., souris, rat, cochon d'Inde ou lapin), un chat, un chien, un primate (e.g., un chimpanzé), un oiseau (e.g., une poule), un reptile, un amphibien ou encore un poisson (e.g., poisson-zèbre) ;
- ledit procédé est un procédé in vitro comprenant la culture de cellules cutanées, avantageusement sélectionnées dans le groupe constitué des kératinocytes, mélanocytes, sébocytes, cellules de Merkel, cellules musculaires lisses vasculaires, cellules musculaires spécialisées, fibroblastes, mastocytes, lymphocytes, monocytes, cellules dendritiques, avantageusement les cellules dendritiques dermiques ; cellules de Langerhans, adipocytes, cellules nerveuses, macrophages, avantageusement des macrophages de type Ml ou M2 ; des cellules endothéliales ; et leurs mélanges ; préférentiellement choisie parmi les kératinocytes, les fibroblastes et leurs mélanges ; et est caractérisé en ce que la mise en contact de l'étape a) est réalisée par ajout dans le milieu de culture ;
- ladite au moins une cellule cutanée est au moins un macrophage, avantageusement au moins un macrophage de type Ml, de préférence au moins un macrophage de type Ml humain ;
- ladite au moins une cellule cutanée est au moins un kératinocyte, avantageusement au moins un kératinocyte humain, plus avantageusement au moins un kératinocyte normal humain ;
- la dite au moins une cellule cutanée est au moins un fibroblaste, avantageusement au moins un fibroblaste humain, plus avantageusement au moins un fibroblaste normal humain ;
- ledit procédé comprend, en outre, avant la mise en oeuvre de l'étape a), une étape d'ajout dans le milieu de culture d'un inducteur de la synthèse de TAFA4 et/ou d'acide nucléique la codant, par ladite au moins une cellule cutanée, avantageusement choisi parmi : le phorbol 12-myristate 13- acétate (PAM), de préférence à une concentration comprise entre 1 et 20 ng/ml ; le lipopolysaccharide (LPS), de préférence à une concentration comprise entre 0,1 pg/ml et 2 mg/ml ; le calcium, de préférence à une concentration comprise entre 0,1 mM et 10 mM, ; la forskoline, de préférence à une concentration comprise entre 10 pM et 200 pM ; la combinaison de calcium, de préférence à une concentration comprise entre 0,1 mM et 10 mM, et de forskoline, de préférence à une concentration comprise entre 10 pM et 200 pM ; le facteur de croissance épidermique (Epidermal Growth Factor ou EGF), de préférence à une concentration comprise entre 10 ng/ml et 200 ng/ml ; le sérum de veau foetal (SVF), avantageusement dans une concentration comprise entre 0,1 et 5% en poids sur le total du milieu de culture ; l'exposition à la lumière UV, de préférence une exposition à une dose comprise entre 2 et 10 J/cm2 d'UVA pendant au moins 5 minutes, de préférence au moins 10 minutes ; et leurs mélanges ; - ladite étape d'ajout est réalisée dans un intervalle compris entre 30 minutes et 72 heures, préférentiellement dans les conditions de culture suivantes : 37°C, 5% de CO2 et/ou atmosphère saturée d'humidité ;
- ledit procédé comprend, en outre, avant la mise en oeuvre de l'étape a), une étape d'ajout dans le milieu de culture d'un inhibiteur de la synthèse de TAFA4 et/ou d'acide nucléique la codant, par ladite au moins une cellule cutanée ;
- ledit procédé comprend, en outre, avant la mise une oeuvre de l'étape a), une étape de déplétion de la teneur cutanée endogène en TAFA4 et/ou en acide nucléique la codant produite par ladite au moins une cellule cutanée ;
- ladite étape b) de mesure de la teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique, avantageusement en ARNm, la codant est réalisée à un niveau protéique par un test ELISA, immunohistochimie (dont colorimétrie, fluorescence, luminescence), autre méthode colorimétrique, ou western-blot, dot-blot, western simplifié par immunoélectrophorèse capillaire (WES) et/ou au niveau nucléique par hybridation in situ, northern blot, séquençage ou RT-PCR, avantageusement RT-qPCR ;
- ladite teneur en TAFA4et/ou en acide nucléique, avantageusement en ARNm, codant TAFA4 est mesurée dans le milieu intra et/ou extracellulaire de ladite au moins une cellule cutanée ;
- avant la mise en oeuvre de ladite étape a), ladite au moins une cellule cutanée a été mise en contact, préférentiellement par application topique ou par ajout dans le milieu de culture, avec un agent sensibilisant, avantageusement un agent cosmétique sensibilisant, plus avantageusement un tensioactif ou un conservateur ;
- la séquence en acides aminés de TAFA4 correspond, partiellement ou totalement, à la séquence SEQ ID NO : 1 et/ou à la SEQ ID NO : 2, ou à une séquence identique à l'une des séquences SEQ ID NO : 1 à 2 à au moins 60 %, de préférence à au moins 70 %, de préférence encore à au moins 80 %, de préférence encore à au moins 85 %, voire à au moins 90 % ;
- la séquence nucléotidique de TAFA4 correspond, partiellement ou totalement, à la séquence SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6 ou SEQ ID NO : 7, ou à une séquence identique à l'une des séquences SEQ ID NO : 3 à 7 à au moins 60 %, de préférence à au moins 70 %, de préférence encore à au moins 80 %, de préférence encore à au moins 85 %, voire à au moins 90 % ;
- ledit procédé comprend, à ladite étape b), la mesure additionnelle de la teneur en au moins un agent indicateur différent de TAFA4 et/ou de l'acide nucléique la codant, par exemple IL-8, IL-1, TNF-a ou encore d'autres de cytokines anti-inflammatoires, ladite teneur en agent indicateur étant également comparée avec une valeur de référence propre à ladite étape c) ;
- ladite valeur de référence est la mesure obtenue sans mise en contact de l'au moins une cellule cutanée avec ledit au moins un composé ; - ladite valeur de référence est la mesure obtenue selon les mêmes conditions qu'à ladite étape b) mais en l'absence de ladite étape a) ;
- la mesure de ladite valeur de référence est réalisée avant ou en même temps que ladite étape b) selon l'invention, plus avantageusement dans les mêmes conditions, encore plus avantageusement en utilisant la même culture de ladite au moins une cellule cutanée ; - ladite étape d) de sélection est associée à une autre étape de sélection basée sur l'induction d'une augmentation ou d'une diminution de la teneur en ledit agent indicateur (modulation dépendante de l'agent indicateur choisi) pour statuer sur la sélection ou non dudit au moins un composé ;
- ledit procédé comprend, en outre, après la mise en oeuvre de l'étape d), une étape e) de formulation dudit au moins un composé sélectionné dans une composition cosmétique et/ou alimentaire, non-thérapeutique, avantageusement écobiologique, plus avantageusement se présentant sous une forme galénique adaptée à une administration par voie topique et/ou orale ;
- ladite étape e) de formulation dudit au moins un composé sélectionné correspond à l'ajout d'au moins un ingrédient actif habituellement utilisés dans les domaines cosmétique, alimentaire et/ou dermatologique, avantageusement sélectionné parmi un anti-radicalaire ou plus généralement un antioxydant, un agent blanchissant, un pigmentant, un émollient, un hydratant, les anti-séborrhéique, un anti-inflammatoire, un anti-acnéique, un agent kératolytique et/ou desquamant, un agent antiride et/ou tenseur, un filtre solaire minéral ou organique qui soit hydrophile ou lipophile, un agent drainant, un agent anti-irritant, un agent apaisant, une vitamine et leurs mélanges, un agent matifiant, un actif anti-âge tel que le rétinol, un cicatrisant, un antiseptique et une huile essentielle ; et
- ladite étape e) de formulation dudit au moins un composé sélectionné correspond à l'ajout d'au moins un excipient habituellement utilisé dans les domaines cosmétique, alimentaire et/ou dermatologique, avantageusement sélectionné parmi une matière grasse, un émulsionnant, un co-émulsionnant, un gélifiant hydrophile ou lipophile, un conservateur, un antioxydant, un solvant, un agent exfoliant, un parfum, une charge, un neutralisant, un agent pro-pénétrant, et un polymère.
Ainsi, et selon un aspect de l'invention, le procédé selon l'invention est un procédé in vitro, ladite mise en contact est réalisée par ajout dans le milieu de culture, et l'au moins une cellule cutanée est choisie parmi les kératinocytes, les mélanocytes, les sébocytes, les cellules de Merkel, les cellules musculaires lisses vasculaires, les cellules musculaires spécialisées, les fibroblastes, les mastocytes, les lymphocytes, les monocytes, les cellules dendritiques, avantageusement les cellules dendritiques dermiques ; les cellules de Langerhans, les adipocytes, les cellules nerveuses, les macrophages, avantageusement de type Ml ou M2 ; les cellules endothéliales ; et leurs mélanges. Selon un aspect, l'au moins une cellule cutanée est choisie parmi les kératinocytes et les fibroblastes, de préférence humains, plus préférentiellement normaux ; et leurs mélanges.
Selon un aspect de l'invention, l'au moins une cellule cutanée est une cellule murine, avantageusement une cellule issue d'une lignée murine immortalisée de mélanocytes B16.
La mesure de la teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique, avantageusement en ARNm, la codant peut être effectuée avec toute méthode connue de l'Homme du métier. A titre d'exemple on peut citer le Northern blot, le Southern blot, la PCR, la RT-PCR, la RT-PCR quantitative, le SAGE et ses dérivés, les puces d'acides nucléiques, notamment les puces à ADNc, les puces à oligonucléotides et les puces à ARNm, les puces à tissu et le RNA-Seq, les méthodes d'immunohistologie, l'immunoprécipitation, le western blot, le western simplifié par immunoélectrophorèse capillaire (WES), le dot-blot, I' ELISA ou l'ELISPOT, les puces à protéines, les puces à anticorps, ou les puces à tissu couplées à l'immunohistochimie, les techniques de FRET ou de BRET, les méthodes de microscopie ou d'histochimie, dont notamment les méthodes de microscopie confocale et de microscopie électronique, les méthodes basées sur l'utilisation d'une ou plusieurs longueurs d'onde d'excitation et d'une méthode optique adaptée, comme une méthode électrochimique (les techniques voltamétrie et d'ampèrométrie), le microscope à force atomique, et les méthodes de radiofréquence, comme la spectroscopie de résonance multipolaire, confocale et non-confocale, la détection de fluorescence, luminescence, chimiluminescence, absorbance, réflectance, transmittance, et biréfringence ou index de réfraction (par exemple, par résonance des plasmons de surface, par ellipsométrie, par méthode de miroir résonnant, etc.), cytométrie de flux, imagerie par résonance radio isotopique ou magnétique, analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE); par spectrophotométrie HPLC, par chromatographie liquide/spectrophotométrie de masse/spectrométrie de masse (LC-MS/MS).
Avantageusement, la quantification de la teneur en TAFA4 peut être réalisée par immunohistochimie ou immunocytochimie sur des coupes de peau ou de cellules en culture et autres méthodes ; par western-blot ; par dot-blot ; par western simplifié par immunoélectrophorèse capillaire (WES). En particulier, le dot-blot protéique repose sur le principe de l'hybridation entre une sonde, généralement des anticorps marqués, et la cible recherchée. Elle est simple et rapide, ne nécessitant pas d'étapes de purification complexes. Pour réaliser un dot-blot, on dépose l'échantillon biologique (surnageants cellulaires ou extraits protéiques) sur une membrane de nitrocellulose ou de nylon, formant ainsi des petits points ou "dots". Après séchage, la membrane est incubée avec la sonde afin de détecter la protéine recherchée. La méthode de Western simplifié par immunoélectrophorèse capillaire (WES) combine les principes de la technique Western blot et de l'immunoélectrophorèse capillaire pour détecter et quantifier des protéines spécifiques dans un échantillon biologique sans passer par le transfert sur membrane, une procédure laborieuse. Dans cette approche, les protéines sont d'abord séparées par électrophorèse capillaire en fonction de leur taille et de leur charge électrique ; la détection des protéines cibles se fait ensuite en utilisant des anticorps spécifiques marqués directement sur les capillaires, suivis d'une analyse automatisée dans un appareillage dédié. Alternativement, la quantification de la teneur en TAFA4 peut être réalisée par un test ELISA par exemple sur les surnageants des cultures cellulaires ou extraits cellulaires, en interpolant la densité optique de l'échantillon sur une courbe d'étalonnage obtenue avec des dilutions sérielles de la protéine humaine recombinante TAFA4 (par exemple de 0,1561 ng/ml à 10 ng/ml). En pratique, sur le tapis cellulaire, un test de viabilité au ((3-4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tétrazolium bromide) ou MTT, connu à l'Homme de l'art, peut être réalisé. Les dosages de TAFA4 sont exploités seulement si la viabilité cellulaire est supérieure à 80%, et sont rapportés à cette valeur de viabilité cellulaire.
La mesure de la teneur en acide ribonucléique messager (ARNm) codant TAFA4 peut s'effectuer avantageusement par hybridation in situ sur des coupes de cellules ; par northern blot ; ou encore par RT- qPCR. Avantageusement, l'ARN total est extrait à partir de tissus, par exemple à l'aide de kits commercialement disponibles (comme l'Rneasy Plus Mini QIAGEN). L'extraction peut être suivi d'un dosage des ARN totaux qui permet de connaître la quantité et la qualité des ARN dans l'extrait cellulaire ; cette étape peut être réalisée par exemple à l'aide du Bioanalyseur et du kit RNA 6000 Nano. L'ADNc est généré à l'aide du kit QuantiTect Reverse Transcription (QIAGEN), suivi par une PCR Quantitative en temps réel à chaque temps de traitement pour le gène TAFA4, en utilisant par exemple le Kit QuantiFast SYBR Green PCR (QIAGEN), et en suivant l'expression d'un gène de ménage (par exemple, GAPDH) comme contrôle et de TAFA4 avec des amorces spécifiques basées sur les SEQ ID NO 3, 4, 5, 6 ou 7.
Ainsi, et selon un mode de réalisation particulier, la mesure de la teneur en TAFA4 est réalisée par un test ELISA, par immunohistochimie sur des coupes de cellules ; par western-blot ; la mesure de la teneur en acides ribonucléiques messager (ARNm) codant TAFA4 est effectuée par immunohistochimie, hybridation in situ sur des coupes de cellules, par northern blot, séquençage ou RT-PCR, avantageusement RT-qPCR.
La quantification de la teneur en au moins un marqueur différent de TAFA4 tel que mentionné précédemment, et/ou de l'acide nucléique la codant peut s'effectuer selon les méthodes précisées ci-dessus.
Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de sélection d'au moins un composé, de préférence écobiologique, destiné à la prévention et/ou au soin de la peau sensible et/ou sensibilisée, avantageusement à la suite d'un stress, plus avantageusement une allergie, selon l'invention comprend les étapes suivantes : a) Mettre en contact in vitro ledit au moins un composé avec au moins une cellule cutanée par ajout dans le milieu de culture ; b) Mesurer la teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique codant TAFA4, de préférence dans le milieu de culture et/ou dans le milieu intracellulaire de ladite au moins une cellule cutanée ; c) Comparer la valeur obtenue à l'étape b) avec une valeur de référence, de préférence obtenue sans mise en contact de ladite au moins une cellule cutanée avec le dit au moins un composé ; d) Sélectionner ledit au moins un composé induisant une augmentation de la teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique la codant à l'étape c), de préférence de plus de 120%, avantageusement de plus 150%, par rapport à ladite valeur de référence.
Selon un mode de réalisation alternatif, le procédé de sélection d'au moins un composé, de préférence écobiologique, destiné à la prévention et/ou au soin de la peau sensible et/ou sensibilisée, avantageusement à la suite d'un stress, plus avantageusement une allergie, selon l'invention comprend les étapes suivantes : a) Mettre en contact ex vivo ledit au moins un composé avec au moins une cellule cutanée par application topique sur un expiant cutané, un substitut cutané, un épiderme reconstruit ou une peau reconstruite ; b) Mesurer la teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique la codant, de préférence dans le milieu intra et/ou extracellulaire de ladite au moins une cellule cutanée ; c) Comparer la valeur obtenue à l'étape b) avec une valeur de référence, de préférence obtenue sans mise en contact de ladite au moins une cellule cutanée avec le dit au moins un composé ; d) Sélectionner ledit au moins un composé induisant une augmentation de la teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique la codant à l'étape c), de préférence de plus de 120%, avantageusement de plus 150%, par rapport à ladite valeur de référence.
Selon encore une autre mode de réalisation, le procédé de sélection d'au moins un composé, de préférence écobiologique, destinée à la prévention et/ou au soin de la peau sensible et/ou sensibilisée, avantageusement à la suite à un stress, plus avantageusement une allergie, selon l'invention comprend les étapes suivantes : a) Mettre en contact in vivo ledit au moins un composé avec au moins une cellule cutanée par application topique sur la peau d'un organisme vivant entier, avantageusement un être humain ou non-humain ; b) Mesurer la teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique la codant, de préférence dans le milieu intra et/ou extracellulaire de ladite au moins une cellule cutanée ; c) Comparer la valeur obtenue à l'étape b) avec une valeur de référence, de préférence obtenue sans mise en contact de ladite au moins une cellule cutanée avec le dit au moins un composé ; d) Sélectionner ledit au moins un composé induisant une augmentation de la teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique la codant à l'étape c), de préférence de plus de 120%, avantageusement de plus 150%, par rapport à ladite valeur de référence.
Selon un mode de réalisation particulier, ladite au moins une cellule cutanée, à utiliser dans le procédé selon l'invention n'est pas sensibilisée.
Selon un mode de réalisation alternatif, ladite au moins une cellule cutanée, à utiliser dans le procédé selon l'invention est sensibilisée.
Selon un autre mode de réalisation, ladite au moins une cellule est issue d'un donneur caractérisé par une peau sensible ou sensibilisée, avantageusement irritable, ou réactive.
Selon un mode de réalisation alternatif, ladite au moins une cellule a été préalablement mise en contact, par application topique ou par ajout dans le milieu de culture, avec un agent sensibilisant, avantageusement un agent cosmétique sensibilisant, encore plus avantageusement choisi parmi un tensioactif et un conservateur.
Selon un aspect particulier de l'invention, les teneurs cutanés endogènes de TAFA4 et/ou de l'acide nucléique la codant de ladite cellule selon l'invention ont été dépiétés, avant la mise en contact de ladite cellule avec le au moins un composé candidat.
Selon un aspect particulier, ledit composé selon l'invention ne correspond pas à la protéine TAFA4 ni/ou à une de ses isoformes ni/ou à l'un de ses dérivés biologiquement actifs ni/ou à TAFA4 ni/ou à un acide ribonucléique la codant ni/ou à un acide nucléique la codant, ni/ou à leur formulation.
Un autre objet de la présente invention concerne un kit pour la mise en oeuvre du procédé de sélection d'au moins un composé, de préférence écobiologique, destiné à la prévention et/ou au soin de la peau sensible et/ou sensibilisée, avantageusement à la suite d'un stress, plus avantageusement une allergie, tel que défini précédemment, comprenant des moyens d'amplification et/ou des moyens de détection de la teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique la codant, avantageusement lesdits moyens d'amplifications et/de détection sont des réactifs spécifiques des produits d'expression de TAFA4 gènes cibles choisis parmi les amorces d'amplification, les sondes d'hybridation ou encore des anticorps se liant spécifiquement à TAFA4, avantageusement la protéine TAFA4 et/ou à l'un de ses dérivés biologiquement actifs. Un autre objet de la présente invention concerne également une composition comprenant au moins un composé sélectionné par le procédé décrit précédemment.
De préférence, la présente invention a pour objet une composition telle que décrite précédemment et présentant les caractéristiques techniques suivantes, prises seules ou en combinaisons :
- la composition comprend au moins un composé sélectionné par le procédé décrit précédemment ;
- la composition est constituée d'au moins un composé sélectionné par le procédé décrit précédemment ;
- la composition se présente sous au moins l'une des formes galéniques adaptées pour une application topique sur la peau et/ou les muqueuses, et/ou les phanères, par exemple sous forme anhydre, sous forme d'une émulsion huile-dans-eau, d'une émulsion eau-dans-huile, d'une émulsion multiple, d'une émulsion siliconée, d'une microémulsion, d'une nanoémulsion, d'un gel, d'une solution aqueuse ou d'une solution hydroalcoolique ;
- la composition est fluide ou non et se présenter sous forme d'une crème, d'une pommade, d'un lait, d'une lotion, d'un sérum, ou d'un gel ;
- la composition se présente sous au moins l'une des formes galéniques adaptées pour une application alimentaire non thérapeutique, avantageusement par voie orale ; et
- la composition est colorée ou non, avantageusement colorée au moyen d'un agent colorant.
Un autre objet de la présente invention concerne également l'utilisation de la modulation de la teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique, avantageusement en ARNm, la codant, comme indicateur permettant de classer des composés candidats selon leur capacité ou non à augmenter le seuil de tolérance cutanée.
Un autre objet de la présente invention concerne également un procédé de formulation d'une composition cosmétique et/ou alimentaire, non-thérapeutique, avantageusement écobiologique, plus avantageusement se présentant sous une forme galénique adaptée à une administration par voie topique et/ou orale, comprenant l'incorporation dans ladite composition d'au moins un composé sélectionné par le procédé de sélection selon l'invention.
Les exemples ci-après, sans être limitatifs, font partie intégrante de l'invention et toute caractéristique qui apparait être nouvelle par rapport à l'état de la technique antérieure est revendiquée en tant que telle et en tant que moyen général.
La figure 1 montre l'effet de l'acide valproïque, du TGF-P et du LPS testés à différentes concentrations et du LPS à une concentration (1 pg/ml) sur la synthèse de TAFA4 dans des fibroblastes humains normaux (FHN) exprimé en pourcentage d'induction. NS : p>0.05 ; * : p<0.05 ; ** : p<0.01 ; *** : p<0.001. La figure 2 montre l'effet de la protéine EGF à une concentration (30 ng/ml) sur la synthèse de TAFA4 dans des kératinocytes humains normaux (FHN) exprimé en pourcentage d'induction. NS : p>0.05 ; * : p<0.05 ; ** : p<0.01 ; *** : p<0.001.
EXEMPLES DE REALISATION
Exemple I - Protocole kératinocytes et fibroblastes
1.1 Introduction
Le but de l'étude est de fournir un protocole simple et rapide permettant d'étudier la modulation de l'expression ou transcription de TAFA4 dans des lignées de kératinocytes et fibroblastes par des composés et compositions cosmétiques.
Il est à noter que, optionnellement, un inducteur de l'expression de TAFA4 peut être mis en oeuvre pour potentialiser l'expression du gène codant cette protéine, notamment dans le cas où la quantité de gène codant la protéine TAFA4 ou la quantité de protéine TAFA4 est inférieure ou égale à la limite de détection imposée par la méthode mise en oeuvre par l'Homme du métier et/ou pour fournir une valeur de production de TAFA4 de référence, Le., un contrôle positif, cette valeur devant être atteinte afin de classer le composé candidat dans la catégorie des composés, de préférence écobiologique, apte à la prévention et/ou au soin de la peau sensible et/ou sensibilisée .
1.2 Culture cellulaire
Des kératinocytes humains normaux (KHN) et des fibroblastes humains normaux (FHN) ont été utilisés dans cette étude. Ils proviennent de Promocell (France), Lonza (France).
Les conditions testées pour la mise au point du modèle sont :
• Type cellulaire : KHN, FHN
• Milieu de culture : KBM + 1% P/S pour les KHN, DMEM + 1% P/S pour les FHN.
• Temps de traitement : 48h et 72h
• Densité d'ensemencement : 15000 cellules/puits dans les plaques 96 puits au temps 48h
10000 cellules/puits dans les plaques 96 puits au temps 72h.
Nous avons choisi de tester différentes conditions d'inductions pour les 2 types cellulaires :
Ces inducteurs ont été sélectionnés en tant que contrôles positifs sur la base des données de la bibliographie.
• Prétraitement 24h avec PMA à 10 ng/ml (P1585-1MG, SIGMA)
• Prétraitement 24h avec PMA à 50 ng/ml
• LPS à 1 mg/ml (L2880-10MG, SIGMA)
- LPS à 1 mg/ml + PMA à 10 ng/ml (prétraitement 24h pour PMA) - LPS à 1 mg/ml + PMA à 50 ng/ml (prétraitement 24h pour PMA)
• Calcium 1.2 mM (C7902-500G, SIGMA)
- Calcium 1.2 mM + Forskolin à 10 pM
• lOOpM Forskolin (93049-10MG, SIGMA)
• 10 pM Forskolin
Spécifiquement pour les KHN :
• 10 ng/ml EGF (AF100-15, Peprotech)
• 30 ng/ml EGF
• 10 ng/ml EGF + 100 pM Forskolin
• 30 ng/ml EGF + 100 pM Forskolin
Spécifiquement pour les FHN
• 0,5% SVF (S1900-500B, Dominique Dutscher)
• 2% SVF
• 0,5% SVF + lOOpM Forskolin
• 2% SVF + 100 pM Forskolin
1.3 Screening des composes ou compositions
Les cellules (KHN, FHN) sont ensemencées en plaque 96 puits dans le milieu de culture complet correspondant. Après 24h de culture à 37°C, 5% de CO2, les composés ou compositions à évaluer sont ajoutés aux concentrations choisies dans le milieu de culture et les cellules sont incubées 48h ou 72h à 37°C 5% CO2. Un contrôle positif d'induction est évalué en parallèle des actifs.
Après les différents temps d'incubation, les surnageants sont récoltés et conservés à -80°C avant la réalisation du dosage de TAFA4 par ELISA. Le dosage est réalisé seulement si la viabilité cellulaire est supérieure à 80%. Pour l'évaluation de l'expression de TAFA4 par RT-qPCR, les cellules sont récupérées après incubation des actifs ou contrôles positifs sur des cinétiques plus courtes (30 min à 24h).
1.4 Sélection des composés ou compositions à évaluer
Différentes molécules de type pharmaceutique ou cosmétique pourront être présélectionnées et testées. Ces molécules seront directement solubilisées dans le milieu de culture ou solubilisées dans l'éthanol ou le DMSO selon leur nature.
1.5 Dosage de TAFA4 dans les surnageants de culture par ELISA
La quantification de TAFA4 dans les surnageants ou extraits cellulaires est réalisée grâce à un test ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Ref : abx522987, Cliniscience, France) avec les réactifs recommandés par le fabricant. La Densité Optique (DO) est lue au spectrophotomètre à 450 nm. La concentration de TAFA4 est calculée à partir de la gamme étalon (0,1561 ng/ml à 10 ng/ml) établie avec la protéine humaine recombinante de TAFA4.
Les résultats sont exprimés en ng/ml de TAFA4 par puits. Sur le tapis cellulaire un test de viabilité au MTT est réalisé. Les dosages de TAFA4 sont exploités seulement si la viabilité cellulaire est supérieure à 80%, et sont rapportés à cette valeur de viabilité cellulaire.
1.6 Quantification de l'expression de TAFA4 par RT-qPCR
Après 30 min à 24h d'incubation avec les actifs, une extraction des ARN totaux est réalisée à l'aide du kit Rneasy Plus Mini selon les recommandations du fournisseur (Qiagen).
Le dosage des ARN totaux permet de connaître la quantité et la qualité des ARN dans l'extrait cellulaire. Le dosage est réalisé à l'aide du Bioanalyseur et du kit RNA 6000 Nano.
La Reverse Transcription réalisée à l'aide du kit QuantiTect Reverse Transcription (Qiagen) permet d'obtenir de l'ADNc.
Une PCR Quantitative en temps réel à chaque temps de traitement est réalisée pour le gène TAFA4. Le kit QuantiFast SYBR Green PCR de Qiagen est utilisé.
• Gène de ménage : GAPDH
• Gène d'intérêt : TAFA4 -> cf. les amorces spécifiques du gène
1.7 Test de viabilité cellulaire au MTT
Après incubation et récolte des surnageants de culture, les puits sont rincés avec du D-PBS. Après élimination du D-PBS, 100 pl de solution de MTT à 1 mg/ml sont rajoutés par puits et incubés 3 heures à 37°C. Le MTT est ensuite éliminé et 100 pl de DMSO sont rajoutés dans chaque puits pour dissoudre les cristaux de formazan. Après homogénéisation de la coloration, la densité optique est lue au spectrophotomètre à 540 nm (Victor 3, Perkin Elmer). Les résultats sont ensuite exprimés à partir de la formule : % viabilité = (DO condition traité/DO (100% de viabilité)) x 100. Les cellules qui représentent 100% de viabilité correspondent aux cellules incubées aux différents temps dans le milieu de culture témoin.
NB : Le MTT ((3-4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tétrazolium bromide) est un colorant soluble jaune qui est métabolisé par les enzymes mitochondriales (succinate déshydrogénase) en un composé bleu foncé : le formazan. Les cristaux de formazan sont ensuite solubilisés dans du DMSO puis la densité optique est mesurée spectrophotométriquement à 540 nm.
1.8 Analyses statistiques
Les données ont été collectées à partir d'expériences indépendantes réalisées en triplicate. Les analyses quantitatives sont exprimées sous forme de moyenne ± l'écart type. La significativité statistique est déterminée par un test de Student. Les différences sont considérées comme statistiquement significative à partir de p<0.05.
(NS : p>0.05 ; * : p<0.05 ; ** : p<0.01 ; *** : p<0.001).
Exemple II - Protocole macrophages
II.1 Introduction
Le but de l'étude est de fournir un protocole simple et rapide permettant d'étudier la modulation de l'expression ou transcription de TAFA4 dans un modèle de macrophages inflammatoires par des composés et compositions cosmétiques.
Il est à noter qu'une déplétion de la teneur en TAFA4 (déplétion de l'expression du gène codant la protéine TAFA4 et/ou de la quantité de protéine TAFA4) peut être mis en oeuvre pour fournir un modèle dans lequel la production constitutive endogène de TAFA4 doit être restaurée afin de classer le composé candidat dans la catégorie des composés, de préférence écobiologique, destinés à la prévention et/ou au soin de la peau sensible et/ou sensibilisée.
11.2 Culture cellulaire
Les macrophages sont des cellules immunitaires capables d'infiltrer les tissus. Les macrophages sont différenciés à partir de monocytes (cellules sanguines), elles-mêmes différenciées à partir de cellules souches de la moelle osseuse. Les macrophages et les monocytes sont des cellules capables de phagocytose. Leur rôle est de phagocyter les débris cellulaires et les agents pathogènes et ils participent de manière plus large à la réponse immunitaire en synthétisant différents types de médiateurs.
Il existe 3 grands types de macrophages :
• Les MO qui sont des macrophages non activés.
• Les Ml qui possèdent des propriétés pro-inflammatoires. Au niveau cutané, ils sont notamment impliqués dans la destruction d'agents pathogènes notamment au cours de la cicatrisation.
• Les M2 qui possèdent des propriétés anti-inflammatoires et pro-résolutives de l'inflammation. Au niveau cutané, ils sont notamment impliqués dans la phase de réparation de la cicatrisation.
Il existe au niveau vitro différents modèles cellulaires se rapprochant d'un phénotype de type macrophage. Ces différents modèles peuvent être utilisés dans ce cadre :
• Lignées de monocytes humains : THP-1, U-937, SC, AML-193, HL-60/S4
Les THP-1 sont les cellules les plus décrites et utilisées au niveau de la littérature.
Pour les THP-1 : Milieu de culture : RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) + 10% FBS (sérum de veau foetal) (Wang et al., 2015) +/- 100 mg/L gentamycine, 4.5 g/L glucose, 1 mM pyruvate, 0.05 mM 2- mercaptoethanol et 2 mM L-glutamine (Shen et al., 2014) et +/- pénicilline (100 units/mL) et streptomycine (100 pg/mL) dans un environnement humide à 5% de CO2 dans l'air et à 37°C (Kawano et al., 2015). Tl
Les THP-1 peuvent être différenciées en macrophages de type MO, Ml et M2 selon les conditions de culture décrites par Horiba et al., 2022.
• Macrophages dérivés de monocytes issus de PBMC humains (cellules mononucléées du sang périphérique humain) issus de prélèvement de sang périphérique humain.
Les PMBC sont isolés du sang par Polymorphprep. Les monocytes (CD14+) sont ensuite récupérés après 4h d'adhésion des PMBC. Milieu de culture : RPMI 1640 + 10% FBS. Les monocytes peuvent être différenciés en macrophages MO par stimulation M-CSF (macrophage colony-stimulating factor) in vitro puis par un traitement par LPS (Escherichia coli 055:B5), combinée à l'IFN-y (interféron gamma) ou à l'IL-4 (interleukine- 4), pour les différencier en macrophages Ml ou M2 respectivement, pendant 24h (Wang et al., 2015) dans un environnement humide à 5% de CO2 dans l'air et à 37°C.
• Macrophages dérivés de cellules souches hématopoïétiques CD34+
Ces cellules sont récupérées à partir de prélèvements dans la moelle osseuse, le sang périphérique et le sang du cordon ombilical humain in vivo (Clanchy and Hamilton, 2013). Classiquement ces cellules sont récupérées du sang de cordon.
11.3 Sélection des composés ou compositions efficaces pour induire l'expression ou la synthèse de TAFA4
11.3.1. Protocole
Les cellules sont ensemencées en plaque 96 puits dans le milieu de culture complet correspondant. Après 24h de culture à 37°C, 5% de CO2, les actifs à évaluer sont ajoutés aux concentrations choisies dans le milieu de culture et les cellules sont incubées 48h ou 72h à 37°C 5% CO2. Un contrôle positif d'induction est évalué en parallèle des actifs.
Après les différents temps d'incubation, les surnageants sont récoltés et conservés à -80°C avant la réalisation du dosage de TAFA4 par ELISA. Le dosage est réalisé seulement si la viabilité cellulaire est supérieure à 80%. Pour l'évaluation de l'expression de TAFA4 par RT-qPCR, les cellules sont récupérées après incubation des actifs ou contrôles positifs sur des cinétiques plus courtes (30 min à 24h).
11.3.2. Facteurs inducteurs (contrôles positifs)
Au cours des recherches bibliographiques, 2 inducteurs ont été identifiés comme pouvant induire la synthèse de TAFA4 au niveau cutané : le LPS et les UV (Hoeffel et al., 2021 ; Wang et al., 2015).
11.3.3. Cas de la stimulation par LPS
Pré-traitement des monocytes/macrophages avec PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate, 10 ng/ml) pendant 24h puis stimulés avec du LPS (1 pg/ml) pendant 12h ou 24h (Wang et al., 2015). 11.3.4. Cas de la stimulation par UV
Après élimination du milieu de culture et rinçage au D-PBS, les cellules sont irradiées aux UV.
Données sur les protocoles d'exposition décrits des macrophages :
- à une dose de 6.7 J/cm2 d'UVA pendant 15min dans un System Biosun comprenant une chambre d'irradiation équipée d'une lampe d'illumination 365nm, un dosimètre/senseur, un calibreur et un logiciel (Shen et al., 2014) ; ou
- aux UVA par une lampe noire avec un pic d'énergie d'émission à 360nm. La dose émise a été mesurée par un radiomètre (UVX-36 ; UVP, Inc., San Gabriel, CA). Aucun UVB n'a été détecté avec un senseur UVX-31. L'irradiance au niveau des échantillons est de 2,5 mW/cm2 (Kawano et al., 2015).
11.4 Sélection des composés ou compositions à évaluer
Différentes molécules peuvent être présélectionnées et testées. Ces molécules seront directement solubilisées dans le milieu de culture ou solubilisées dans l'éthanol ou le DMSO selon leur nature.
11.5 Test de viabilité cellulaire au MTT
Voir le point 1.7.
11.6 Quantification de l'expression de TAFA4 par RT-qPCR
Après 30 min à 24h d'incubation avec les actifs, une extraction des ARN totaux est réalisée à l'aide du Kit Rneasy Plus Mini selon les recommandations du fournisseur (Qiagen).
Le dosage des ARN totaux permet de connaître la quantité et la qualité des ARN dans l'extrait cellulaire. Le dosage est réalisé à l'aide du Bioanalyseur et du kit RNA 6000 Nano.
La Reverse Transcription réalisée à l'aide du kit QuantiTect Reverse Transcription (Qiagen) permet d'obtenir de l'ADNc.
Une PCR Quantitative en temps réel à chaque temps de traitement est réalisée pour le gène TAFA4. Le Kit QuantiFast SYBR Green PCR de Qiagen est utilisé.
• Gène de ménage : GAPDH
• Gène d'intérêt : TAFA4 -> cf les amorces spécifiques du gène
11.7 Dosage de TAFA4 dans les surnageants de culture par ELISA
La quantification de TAFA4 dans les surnageants est réalisée grâce à un test ELISA, Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Ref : abx522987, Cliniscience, France) avec les réactifs recommandés par le fabricant. La Densité Optique (DO) est lue au spectrophotomètre à 450 nm. La concentration de TAFA4 est calculée à partir de la gamme étalon (0,1561 ng/ml à 10 ng/ml) établie avec la protéine humaine recombinante de
TAFA4. Les résultats sont exprimés en ng/ml de TAFA4 par puits. Sur le tapis cellulaire un test de viabilité au MTT est réalisé. Les dosages de TAFA4 sont exploités seulement si la viabilité cellulaire est supérieure à 80%, et sont rapportés à cette valeur de viabilité cellulaire.
II.8 Analyses statistiques
Les données ont été collectées à partir d'expériences indépendantes réalisées en triplicate. Les analyses quantitatives sont exprimées sous forme de moyenne ± l'écart type. La significativité statistique est déterminée par un test de Student. Les différences sont considérées comme statistiquement significative à partir de p<0.05.
(NS : p>0.05 ; * : p<0.05 ; ** : p<0.01 ; *** : p<0.001).
Exemple III - Différenciation des cellules SH-SY5Y en cellules neuronales sensorielles et analyses des niveaux de TAFA4
III.l Introduction
Le but de l'étude est de tester la modulation de l'expression de TAFA4 dans un type cellulaire neuronale susceptible d'en produire.
III.2 Matériels et méthodes
III.2.1 Culture des cellules SH-SY5Y et différenciation
Les cellules de neuroblastome humain SH-SY5Y utilisées dans cette étude sont obtenues auprès de Sigma Aldrich (94030304). Les cellules sont décongelées à P13 dans un bain-marie à 37°C puis immédiatement placées dans du DMEM. La suspension cellulaire est centrifugée à 125 x g pendant 7 min à 4°c et les culots sont suspendus dans un mélange de milieu 1:1 Eagle's Minimum Essential Medium, et F12 Medium, supplémenté avec 10% de sérum bovin foetal, et avec une solution de PS.
Les cellules sont ensemencées dans la plaque de 96 puits à la densité de 7 000 cellules par puits et sont cultivées à 37°C dans un incubateur à 95% d'air, 5% CO2. Pour éviter tout effet de bord, la première et la dernière colonne ainsi que la première et la dernière ligne de la plaque ne sont pas utilisées dans l'étude. Les puits vides sont remplis d'eau. Les cellules sont laissées à croître jusqu'à la confluence (80 %).
A confluence (1 jour plus tard), les cellules se développent dans un mélange de milieu 1:1 DMEM, et F12 Medium, supplémenté avec 1 % de sérum bovin foetal, NGF (5 ng/mL), solution de PS (1 %) et lOpM d'acide rétinoïque (AR), pour permettre leur différenciation. Le milieu est changé tous les 2 jours. Pour les plaques de 96 puits, seuls 60 puits sont utilisés. 111.2.2 Expression/libération de TAFA4 à différents moments, J8, J10, J12, après exposition à des composés Après 8, 10 ou 12 jours de différenciation avec l'AR, les cellules sont stressées pendant 24h avec deux composés individuellement dilués à différentes concentrations dans le milieu de culture. En parallèle, une condition de contrôle non stressé est réalisée à chaque temps de différenciation (8, 10 et 12 jours ; valeurs de référence).
Seuls 100 pL de milieu de culture sont appliqués.
111.2.3 qPCR : expression génique de TAFA4
Plusieurs heures (en fonction des facteurs de stress et des étapes) après l'application du facteur de stress, les cellules sont lysées avec le kit nucleo spin RNS XS (Macherey Nagel). Brièvement, 100 pL de tampon de lyse sont ajoutés par puits, selon les instructions du fabricant (Macherey Nagel). La procédure comprend un traitement à la DNase. L'extraction de l'ARN est réalisée dans une salle de laboratoire dédiée aux expériences biomoléculaires, avec des solutions stériles et exemptes de DNase/RNase et des consommables de laboratoire (par exemple, pointes filtrées, tubes). La quantité totale et la pureté de l'ARN présent dans chaque échantillon sont évaluées par spectrophotométrie à l'aide d'un appareil Nanodrop (NanoDrop technologies LLC). Les échantillons d'ARN sont conservés à une température inférieure à -70°C. Les ADNc sont obtenus par transcription inverse à l'aide de la transcriptase inverse prime script (SensiFAST cDNA synthesis kit, Bioline meridian) à partir de 25 ng d'ARN total selon les instructions du fabricant. Les échantillons d'ADNc sont conservés à -15/-25°C. La réaction de PCR est réalisée à l'aide du système en temps réel CFX96™ (Biorad). Un équivalent de 10 ng d'ARN initial est soumis à l'amplification PCR en utilisant 3 pM d'amorces et le SYBR Premix (ONEGreen Fast qPCR Premix, OZYME). La réaction PCR est effectuée en utilisant la procédure de cycle suivante : 95°C pendant 30s, puis 95°C pendant 5s, 60°C pendant 30s, et un total de 40 cycles est effectué.
Chaque échantillon est analysé pour le gène sélectionné (GAPDH et TAFA4) en utilisant la RT-qPCR pour mesurer les niveaux d'expression relative des ARNm codant pour les gènes sélectionnés. L'analyse de l'expression génique est évaluée à l'aide de la méthode 2-AACt (Livak et Schmittgen, 2001), où Ct est la valeur seuil du cycle. Un contrôle négatif (sans ADNc) est effectué pour chaque paire d'amorces. L'expression est normalisée par rapport à un gène de ménage (par exemple GAPDH).
111.2.4 Analyses statistiques
Toutes les valeurs sont exprimées en moyenne ± SEM (erreur standard de la moyenne). L'analyse statistique est effectuée par ANOVA à sens unique, suivie du test LSD de Fisher. p<0,05 est considéré comme significatif.
III.3 Résultats et conclusions
Ces tests ont permis d'identifier des modulateurs, c'est-à-dire des inhibiteurs et des inducteurs de l'expression de TAFA4 dans les cellules SH-SY5Y. Exemple IV - Evaluation de l'effet de composés sur la synthèse de TAFA4 dans des cultures de fibroblastes humains normaux
IV.l Introduction
Le but de l'étude est de mettre au point un modèle cellulaire permettant de quantifier la synthèse de TAFA4 dans des cellules cutanées.
IV.2 Matériels et méthodes
IV.2.1 Culture cellulaire
Des fibroblastes humains normaux (FHN) ont été utilisés dans cette étude (Lonza - Suisse). Les cellules sont ensemencées à 10000 cellules en plaques 24 puits dans du DMEM + 1% Pénicilline-streptomycine (P/S). Après 24h d'incubation, les cellules sont incubées avec les composés présentés dans le tableau 1.
[Tableau 1]
Figure imgf000032_0001
Après 72h d'incubation à 37°C, 5% CO2, les surnageants et extraits protéiques (obtenus à partir du tapis cellulaire) sont récupérés et stockés à -80°C.
En amont du dosage de la protéine TAFA4, une évaluation de la toxicité des composés testés est réalisée à l'aide du test MTT. Seules les concentrations permettant d'obtenir une viabilité supérieure à 80% sont sélectionnées pour être quantifiées en ELISA et Dot blot.
Les données ont été collectées à partir d'expériences indépendantes réalisées en triplicate.
IV.2.2 Test de viabilité cellulaire au MTT
Voir le point 1.7.
IV.2.3 Dosage de TAFA4 par dot-blot
Le dot blot est une méthode de détection immunoenzymatique permettant de quantifier une protéine dans un échantillon après dépôt de celui-ci sur une membrane de nitro-cellulose dans un puits. Un équipement spécifique (Biorad, France) est utilisé avec une membrane de nitrocellulose. L'appareillage et consommables utilisés dans cette expérience sont indiqués dans le tableau 2 ci-dessous.
[Tableau 2]
Figure imgf000033_0001
L'appareil est soumis à une pression sous vide qui va permettre de créer l'aspiration de l'échantillon (surnageant ou extrait protéique) et donc la fixation des protéines sur la membrane de nitrocellulose. L'équipement est placé en hauteur par rapport à la pompe à vide, pour respecter le principe de gravité.
La membrane est préalablement hydratée avec 100 pl de tampon TBS (Tris base + NaCI dilué dans l'eau ajusté à pH 7.5) par puits. Cette opération est répétée 2 fois afin d'optimiser l'hydratation de la membrane pour une fixation optimale des protéines contenues dans les échantillons. Les échantillons à analyser (surnageants et extraits protéiques) et les différentes solutions de protéines recombinantes TAFA4 à différentes concentrations de la gamme étalon TAFA4 (0.78 à 100 ng/ml) sont déposés dans la plaque (volume 100 pl/puits utilisé pour les extraits protéiques et 500 pl/puits utilisé pour les surnageants) puis le flux d'aspiration est activé. Lorsque la totalité des échantillons est aspirée, 100 pl de TBS est ajouté par puits pour être s'assurer que la totalité de l'échantillon est passé sur la membrane. Les protéines contenues dans les échantillons vont ainsi se déposer sur la membrane de nitrocellulose et créer un spot de 1 cm2.
Pour le marquage et la révélation, une étape de saturation des sites aspécifiques est réalisée en incubant la membrane dans un bain contenant 5% de lait écrémé dans un tampon de TBS (volume : 30 ml) sous agitation à 4°C pendant la nuit. Le lendemain un lavage de la membrane est réalisé avec 20 ml de tampon TBS-Tween (TBS + Tween 20 à 0,05%) sous agitation pendant 10 minutes. Ce lavage est répété 3 fois, en changeant le tampon de lavage (volume : 30 ml). La membrane est incubée dans un bain contenant de l'anticorps primaire dilué au l/200ème dans du tampon TTBS + lait écrémé à 1% (volume : 20 ml) pendant 2h à température ambiante sous agitation. Puis, un lavage de la membrane est réalisé de la même manière que décrit ci-dessus. La membrane est ensuite incubée dans une solution contenant l'anticorps secondaire (anticorps couplé à HRP) dilué au l/500ème dans du tampon TTBS + lait écrémé à 1% (volume : 20 ml) pendant 2h à température ambiante sous agitation. Un lavage de la membrane est réalisé de la même manière que décrit ci-dessus. L'anticorps secondaire seul est utilisé comme témoin négatif.
La révélation des protéines présentes dans chacun des dépôts est réalisée en incubant la membrane dans un bain d'ECL pure, substrat chimiluminescent permettant de détecter l'activité de la peroxydase (HRP, horseradish peroxidase) conjuguée à l'anticorps secondaire. La présence de la protéine TAFA4 sur la membrane se traduit par la formation d'un spot gris à noir dépendant de l'intensité de la réaction et donc de la quantité de protéine. La lecture de la membrane est réalisée avec de l'appareil Fusion FX (Vilber Lourmat) couplé au logiciel VisionCapt (Vilber Lourmat). La quantification de la protéine TAFA4 dans les échantillons testés est réalisé avec le logiciel VisionCapt qui permet de mesurer l'intensité des différents spots. La quantité des échantillons est ensuite réalisée grâce à la courbe étalon du standard TAFA4 établit avec la protéine recombinante
IV.2.4 Analyses statistiques
Les données ont été collectées à partir d'expériences indépendantes réalisées en triplicate. Les analyses quantitatives sont exprimées sous forme de moyenne ± l'écart type. La significativité statistique est déterminée par un test de Student. Les différences sont considérées comme statistiquement significative à partir de p<0.05.
(NS : p>0.05 ; * : p=0.05 ; ** : p=0.01 ; *** : p=0.001).
IV.3 Résultats et conclusions
La figure 1 reporte l'effet l'acide valproïque, du TGF-P et du LPS sur la modulation de TAFA4 dans le surnageant de FHN après 72h d'incubation. Les résultats sont exprimés sous forme de pourcentage d'expression de TAFA4 en normalisant le témoin à 100% (témoin milieu DMEM). Les données ont été obtenues sur 2 expériences indépendantes réalisées en triplicat.
L'acide valproïque et le TGF-P induisent la synthèse de TAFA4 de façon dose-dépendante (induction statistiquement significative pour 2 doses sur 2 pour TGF-P ; 1 dose sur 2 pour l'acide valproïque).
Le LPS inhibe la synthèse de TAFA4 (inhibition statistiquement significative) à la dose testée. Exemple V - Evaluation de l'effet de composés sur la synthèse de TAFA4 dans des cultures de kératinocytes humains normaux
V.l Introduction
Le but de l'étude est de mettre au point un modèle cellulaire permettant de quantifier la synthèse de TAFA4 dans des cellules cutanées.
V.2 Matériels et méthodes
V.2.1 Culture cellulaire
Des kératinocytes humains normaux (KHN) ont été utilisés dans cette étude. Ils proviennent de Promocell (Allemagne). Les cellules sont ensemencées à 100 000 cellules/puits dans les plaques 24 puits dans du KGM. Après 24h, les cellules sont incubées avec le composé présenté dans le tableau ci-dessous dans du milieu KBM + P/S à 37°C, 5% CO2.
Après 72h d'incubation, les surnageants et les extraits protéiques (obtenus à partir du tapis cellulaire) sont récupérés et stockés à -80°C. Le composé testé est indiqué dans le tableau 3 ci-dessous.
[Tableau 3]
Figure imgf000035_0001
Après 72h d'incubation à 37°C, 5% CO2, les surnageants et extraits protéiques (obtenus à partir du tapis cellulaire) sont récupérés et stockés à -80°C.
En amont du dosage de la protéine TAFA4, une évaluation de la toxicité des composés est réalisée à l'aide du test MTT. Seules les concentrations permettant d'obtenir une viabilité supérieure à 80% sont sélectionnées pour être quantifiées en ELISA et Dot blot.
Les données ont été collectées à partir d'expériences indépendantes réalisées en triplicate.
K2.2 Test de viabilité cellulaire au MTT
Voir le point 1.7.
V.2.3 Dosage de TAFA4 par dot-blot
Voir le point IV.2.3.
V.2.4 Analyses statistiques
Voir le point IV.2.4. V.3 Résultats et conclusions
La figure 2 reporte l'effet de l'EGF sur la modulation de TAFA4 dans le surnageant de KHN après 72h d'incubation. Les résultats sont exprimés sous forme de pourcentage d'expression de TAFA4 en normalisant le témoin à 100% (témoin milieu KGM). Les données ont été obtenues sur 1 expérience indépendante réalisée en triplicat.
L'EGF testé à 30 ng/ml inhibe la synthèse de TAFA4 (significativité statistique).
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Claims

REVENDICATIONS
1/ Procédé de sélection d'au moins un composé, de préférence écobiologique, destiné à la prévention et/ou au soin de la peau sensible et/ou sensibilisée, mettant en oeuvre l'identification d'une modulation, avantageusement d'une augmentation, de la teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique, avantageusement en acide ribonucléique messager (ARNm), codant TAFA4.
2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) Mettre en contact ledit au moins un composé avec au moins une cellule cutanée ; b) Mesurer la teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique codant TAFA4 ; c) Comparer la valeur obtenue à l'étape b) avec une valeur de référence ; d) Sélectionner ledit au moins un composé induisant une augmentation de la teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique à l'étape c).
3/ Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite valeur de référence est la mesure obtenue sans mise en contact de ladite au moins une cellule cutanée avec ledit au moins un composé.
4/ Procédé selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que ladite teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique codant TAFA4 est mesurée dans le milieu intra et/ou extracellulaire de ladite au moins une cellule cutanée.
5/ Procédé selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que :
Ladite augmentation de la teneur en TAFA4 correspond à au moins 120%, plus préférentiellement 150%, encore plus préférentiellement 200% par rapport à ladite valeur de référence ; et/ou
Ladite augmentation de la teneur en acide nucléique codant TAFA4 correspond à au moins 120%, plus préférentiellement 150%, encore plus préférentiellement 200%, voire plus de 1000% par rapport à ladite valeur de référence.
6/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le au moins un composé n'est pas la protéine TAFA4 ni l'un de ses dérivés biologiquement actifs.
7/ Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un procédé in vivo ou ex vivo et en ce que la mise en contact de l'étape a) est réalisée par application topique dudit au moins un composé sur la peau d'un organisme vivant entier, avantageusement la peau d'un organisme non- humain vivant entier, un expiant cutané, un épiderme reconstruit ou une peau reconstruite. 8/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à Ç>, caractérisé en ce que : il s'agit d'un procédé in vitro, ladite au moins une cellule cutanée est choisie parmi les kératinocytes, mélanocytes, sébocytes, cellules de Merkel, cellules musculaires lisses vasculaires, cellules musculaires spécialisées, fibroblastes, mastocytes, lymphocytes, monocytes, cellules dendritiques, avantageusement les cellules dendritiques dermiques ; cellules de Langerhans, adipocytes, cellules nerveuses, macrophages, avantageusement des macrophages de type Ml ou M2 ; les cellules endothéliales ; et leurs mélanges ; préférentiellement choisie parmi les kératinocytes, les fibroblastes et leurs mélanges ; et ladite mise en contact de l'étape a) est réalisée par ajout dans le milieu de culture.
9/ Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'au moins une cellule cutanée est :
- au moins un macrophage, avantageusement au moins un macrophage de type Ml, de préférence au moins un macrophage de type Ml humain ; et/ou
- au moins un kératinocyte, avantageusement au moins un kératinocyte humain, de préférence au moins un kératinocyte normal humain ; et/ou
- au moins un fibroblaste, avantageusement au moins un fibroblaste humain, de préférence au moins un fibroblaste normal humain ; et/ou
- au moins une cellule nerveuse.
10/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, caractérisé en ce que l'étape b) de mesure de la teneur en TAFA4 et/ou en acide nucléique, avantageusement en ARNm, codant TAFA4 est réalisée à un niveau protéique par un test ELISA, immunohistochimie, méthode colorimétrique, western-blot, dot-blot ou western simplifié par immunoélectrophorèse capillaire (WES) et/ou au niveau nucléique par hybridation in situ, northern blot, séquençage ou RT-PCR, avantageusement RT-qPCR.
11/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 10, caractérisé en ce que, avant la mise en oeuvre de l'étape a), ladite au moins une cellule cutanée a été mise en contact, par application topique ou par ajout dans le milieu de culture, avec un agent sensibilisant, avantageusement un agent cosmétique sensibilisant, plus avantageusement un tensioactif ou un conservateur.
12/ Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que : la séquence en 'acides aminés de TAFA4 correspond à la séquence SEQ ID NO : 1 et/ou à la SEQ ID NO : 2 et/ou à une séquence identique à l'une des séquences SEQ ID NO : 1 à 2 à au moins 60 %, de préférence à au moins 70 %, de préférence encore à au moins 80 %, de préférence encore à au moins 85 %, voire à au moins 90 % ; et/ou la séquence nucléotidique de TAFA4 correspond à la séquence SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6 ou SEQ ID NO : 7 ou à une séquence identique à l'une des séquences SEQ ID NO : 3 à 7 à au moins 60 %, de préférence à au moins 70 %, de préférence encore à au moins 80 %, de préférence encore à au moins 85 %, voire à au moins 90 %.
13/ Procédé de formulation d'une composition cosmétique et/ou alimentaire, non-thérapeutique, avantageusement écobiologique, plus avantageusement se présentant sous une forme galénique adaptée à une administration par voie topique et/ou orale, comprenant l'incorporation dans ladite composition d'au moins un composé sélectionné par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.
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