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WO2024112115A1 - 구제역 바이러스 유사 입자 또는 나노입자 생산을 위한 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 백신 조성물 - Google Patents

구제역 바이러스 유사 입자 또는 나노입자 생산을 위한 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 백신 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2024112115A1
WO2024112115A1 PCT/KR2023/018972 KR2023018972W WO2024112115A1 WO 2024112115 A1 WO2024112115 A1 WO 2024112115A1 KR 2023018972 W KR2023018972 W KR 2023018972W WO 2024112115 A1 WO2024112115 A1 WO 2024112115A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
virus
foot
mouth disease
particles
nanoparticles
Prior art date
Application number
PCT/KR2023/018972
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이지훈
윤빛나래
박상미
오미경
오종민
최재방
한범구
김현일
Original Assignee
주식회사 옵티팜
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 옵티팜 filed Critical 주식회사 옵티팜
Priority claimed from KR1020230164017A external-priority patent/KR20240087552A/ko
Publication of WO2024112115A1 publication Critical patent/WO2024112115A1/ko

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Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12Viral antigens
    • A61K39/125Picornaviridae, e.g. calicivirus
    • A61K39/135Foot- and mouth-disease virus
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • A61P31/14Antivirals for RNA viruses

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant expression vector for producing foot-and-mouth disease virus-like particles or nanoparticles and a vaccine composition using the same.
  • FMDV is a single-stranded positive-sense RNA virus belonging to the Aphtovirus genus of the Picornaviridae family.
  • seven serotypes are known: O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2, and SAT3, and each serotype is known to have several topotypes.
  • O type occurs continuously, and in East Asia, such as China and North Korea, O type, Asia1, and A type tend to occur intermittently.
  • Foot-and-mouth disease viruses show significant genetic or antigenic differences between viruses of different serotypes, to the extent that they are not serologically neutralized and are not cross-protected by vaccines.
  • FMDV has an exposed capsid, which has an icosahedral structure.
  • the P1 region of the FMDV polyprotein encodes structural proteins, while the P2 and P3 regions encode non-structural proteins.
  • the structural protein precursor P1 is cleaved by viral protease 2A, and the P1 precursor is processed into the capsid proteins VPO, VP3, and VP1.
  • 3C is a viral protease responsible for processing the P1 precursor into capsid protein.
  • protein VP0 is cleaved into two proteins, VP4 and VP2.
  • an inactivated virus vaccine is commercialized and sold.
  • the virus is inactivated with ethyleneimine after cell culture and mixed with an adjuvant to be used as a vaccine.
  • the shortcomings of foot-and-mouth disease vaccines to date include short antibody persistence and low immunogenicity in pigs, so there is a need to develop a more effective and stable vaccine.
  • disadvantages such as local side effects such as formation of lesions in the inoculated muscle such as fibrosis and granuloma at the injection site, and low safety.
  • the foot-and-mouth disease vaccine which was administered intramuscularly using a commercial vaccine, remained in the form of granulomas or suppurations until the point of shipment, causing problems with abnormal meat, and this became the main reason why farms that suffered economic losses due to abnormal meat avoided vaccination.
  • An ideal vaccine design is needed to overcome these limitations of current commercial vaccines.
  • the present inventors produced virus-like particles or nanoparticles by co-expressing VP4, VP1, VP2, and VP3 among the FMDV structural proteins, or by expressing VP1, VP2, and VP3 excluding VP4, and found that a vaccine composition using the same induced an effective immune response.
  • the present invention was completed by confirming that it could be done.
  • the purpose of the present invention is to provide a recombinant expression vector containing an FMDV antigen, a transformant transformed with the recombinant expression vector, a virus-like particle or nanoparticle produced by the transformant, and a method for producing the same.
  • Another object of the present invention is to provide a vaccine composition for foot-and-mouth disease virus and a method for preventing diseases caused by foot-and-mouth disease virus infection.
  • Another object of the present invention is to provide a use of the virus-like particles or nanoparticles for preventing foot-and-mouth disease virus disease.
  • the present invention provides a recombinant expression method comprising a first promoter and genes encoding Foot and Mouth Disease Virus (FMDV) proteins VP2, VP3, VP1 and 3C operably linked to the promoter.
  • FMDV Foot and Mouth Disease Virus
  • the present invention provides a first promoter and genes encoding FMDV VP2, VP3, VP1 and 3C operably linked to the promoter; and a second promoter and a gene encoding the FMDV protein VP4 operably linked to the promoter.
  • the present invention provides a transformant transformed with the recombinant expression vector, a virus-like particle or nanoparticle produced by the transformant, and a method for producing the same.
  • the present invention provides a vaccine composition for foot-and-mouth disease virus containing the above virus-like particles or nanoparticles as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing disease caused by foot-and-mouth disease virus infection, comprising administering the vaccine composition.
  • the present invention provides a use of the virus-like particles or nanoparticles for preventing foot-and-mouth disease virus disease.
  • the present invention relates to a recombinant expression vector for producing foot-and-mouth disease virus-like particles or nanoparticles and a vaccine composition using the same.
  • the present invention relates to co-expressing VP4, VP1, VP2, and VP3 among FMDV structural proteins, or VP1, VP2, and VP3 excluding VP4.
  • virus-like particles or nanoparticles produced by expressing VP3 and a method for producing the same and the virus-like particles or nanoparticles produced according to the method of the present invention can be effectively used to prevent diseases caused by foot-and-mouth disease virus infection.
  • Figure 1 is a schematic diagram showing the VP4 Co-expression form of the present invention.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing the Delta-VP4 expression form of the present invention.
  • Figure 3 is a schematic diagram showing the full form.
  • Figure 4 is a diagram showing the results of confirming whether the recombinant virus of the present invention expresses the target protein through Coomassie staining.
  • Figure 5 is a diagram showing the results of confirming whether the recombinant virus of the present invention expresses the VP1 protein through Western blot.
  • Figure 6 is a diagram showing the results of confirming the expression of VP1 protein using a culture cultured with a recombinant virus transformed into the Delta-VP4 form.
  • Figure 7 is a diagram showing the results of confirming whether the recombinant virus transformed into full form expresses the target protein through Coomassie staining.
  • Figure 8 is a diagram showing the results of confirming the expression of VP1 protein using a culture of a recombinant virus transformed into full form.
  • FIG. 9 This diagram shows the results of comparing antigen amounts by performing ELISA using an antibody specific for the FMDV VP1 protein.
  • Figure 10 is a diagram showing the results of confirming the expression of O type FMDV VP1 protein through Western blot.
  • Figure 11 is a diagram showing the results of confirming the expression of O type FMDV VP2 protein through Western blot.
  • Figure 12 is a diagram showing the results of confirming the expression of O type FMDV VP3 protein through Western blot.
  • Figure 13 is a diagram showing the results of confirming the expression of O type FMDV VP4 protein through Western blot.
  • Figure 14 is a diagram showing the results of confirming the expression of A type FMDV VP1 protein through Western blot.
  • Figure 15 is a diagram showing the results of confirming the expression of A type FMDV VP2 protein through Western blot.
  • Figure 16 is a diagram showing the results of confirming the expression of A type FMDV VP3 protein through Western blot.
  • Figure 17 is a diagram showing the results of confirming the expression of A type FMDV VP0 protein through Western blot.
  • Figure 18 is a diagram showing the results of confirming the expression of A type FMDV VP4 protein through Western blot.
  • Figure 19 is a diagram observing nanoparticles of FMDV antigen candidate materials through TEM.
  • Figure 20 is a view showing VLP particles of FMDV antigen candidate materials observed through TEM.
  • Figure 21 is a diagram showing a method of administering the vaccine composition of the present invention.
  • Figure 22 is a graph showing the results of confirming the immunogenicity of the vaccine candidate material.
  • Figure 23 is a graph showing the results of measuring antibody titers according to the concentration of vaccine candidates for types O and A.
  • Figure 24 is a graph showing the results of measuring neutralizing antibody titers according to the concentration of vaccine candidates for types O and A.
  • Figure 25 is a diagram showing the histopathological observation results of a pig administered a vaccine composition produced from a recombinant virus transformed with the VP4 Co expression form.
  • Figure 26 is a diagram showing the histopathological observation results of pigs administered the control vaccine.
  • the present invention provides a recombinant expression vector comprising a first promoter and genes encoding Foot and Mouth Disease Virus (FMDV) proteins VP2, VP3, VP1 and 3C operably linked to the promoter.
  • FMDV Foot and Mouth Disease Virus
  • the present invention provides a first promoter and genes encoding FMDV VP2, VP3, VP1 and 3C operably linked to the promoter; and a second promoter and a gene encoding the FMDV protein VP4 operably linked to the promoter.
  • “foot-and-mouth disease virus (FMDV)” belongs to the genus Aphtovirus of the Picornaviridae family.
  • the virus consists of 60 copies of four capsid proteins (VP1, VP2, VP3, and VP4) and a single-stranded RNA genome (about 8.5 kb), and is highly contagious by infecting artiodactyls, especially cattle, pigs, and sheep. This is a strong disease.
  • the four capsid proteins of FMDV are VP1, VP2, VP3, and VP4.
  • the proteins exposed on the capsid surface are VP1, VP2, and VP3.
  • VP1 is most related to the infectivity of the virus
  • VP4 is a small protein. It is located inside.
  • serotypes There are many serotypes depending on the region, and there are seven serotypes, including A, O, C, SAT1, SAT2, SAT3, and Asia1, depending on the antigen structure, and these serotypes have over 80 serosubtypes.
  • VLP Virus-Like Particle
  • Nanoparticle have a shape almost identical to that of a virus containing non-structural proteins responsible for virus replication and intracellular penetration. It is an antigen that does not contain genetic material and has almost the same form as the virus through the combination of structural surface (envelope) proteins that represent the antigenicity of the virus using genetic recombination technology.
  • the envelope of the foot-and-mouth disease virus is an antigenic portion that is most definitely detected by the immune system after infection in the body, and it is possible to manufacture a safe and effective new vaccine using the protein that forms this envelope.
  • the recombinant expression vector contains a polynucleotide in which the base sequences of VP2, VP3, VP1, and 3C of the foot-and-mouth disease virus are sequentially arranged, and when expressed as a protein, it is possible to produce foot-and-mouth disease virus-like particles through self-assembly. Additionally, it can be produced to express the VP4 base sequence in the opposite direction to the polynucleotide.
  • the foot-and-mouth disease virus may be selected from O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2, and SAT3 types.
  • the foot-and-mouth disease virus O type is O-Andong, O-PanAsia2 (O-PA2), O-manisa, O-Taiwan97 (O-Twn97), O-Campos, O-Boeun (O-BE), and O-Jincheon. (O-JC), O-Anseong (O-AS), and O-Gimje (O-GJ).
  • O-Andong GenBank: KF112887.1
  • the nucleic acid sequence was codon-optimized using insect cell-preferred codons in the present invention.
  • the base sequences encoding the VP1, VP2, VP3, VP4, and 3C proteins are the base sequences represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 9, respectively, or variants thereof. It can be.
  • the O type VP1, VP2, VP3, or VP4 protein may each consist of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, and SEQ ID NO: 13, or may include a variant thereof.
  • the foot-and-mouth disease virus type A includes A-Pocheon (A-PC), A-Yeoncheon (A-YC), A-Bangladesh (A-Ban), A-Malaysia97 (A- May97), and A-Gimpo (A- GP), and A22-Iraq.
  • type A may use the gene sequence of A-Pocheon (GenBank: KC588943.1) or A-Yeoncheon (GenBank: KY766148.1). Additionally, in order to improve the expression level of the protein in some embodiments, the nucleic acid sequence was codon-optimized using insect cell-preferred codons in the present invention.
  • the base sequences encoding the VP1, VP2, VP3, VP4, and 3C proteins are the base sequences represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, and SEQ ID NO: 9, respectively, or variants thereof. It can be.
  • the A type VP1, VP2, VP3, or VP4 protein may each consist of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 17, or may include a variant thereof.
  • the 3C may be a base sequence encoding the amino acid of SEQ ID NO: 9 or a variant thereof, and may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 or a variant thereof.
  • the FMDV 3C is a protease and cleaves FMDV VP4, VP2, VP3, and VP1 proteins to enable self-assembly of FMDV VLP.
  • the 3C does not differ in sequence depending on the FMDV serotype, and has a common conserved sequence. However, the sequences of VP4-VP2-VP3-VP1 of FMDV are different among serotype O, serotype A, serotype Asia1, serotype SAT, and serotype C, and even for the same serotype, the sequences are different for each serosubtype.
  • the recombinant expression vector may contain any sequences, preferably a promoter and/or a sequence for promoting expression (e.g., a 2A sequence and/or or burst sequence, etc.) may be additionally included.
  • a promoter and/or a sequence for promoting expression e.g., a 2A sequence and/or or burst sequence, etc.
  • promoter can be applied without limitation as long as it is a sequence sufficient to drive transcription.
  • the polyhedrin promoter of the polyhedral protein coding gene is located in front of the target protein of VP2-VP3-VP1-3C, thereby increasing the expression efficiency of the target protein.
  • the promoter of the polyhedral protein coding gene may be the base sequence of SEQ ID NO: 19 or a variant thereof.
  • the promoter of the polyhedra protein coding gene may be located in front of the vp39 promoter (SEQ ID NO: 20). Meanwhile, different promoters can be used to express the target protein of VP4.
  • the p10 promoter can be located in front of the target protein of VP4 to increase the expression efficiency of the target protein, and the p10 promoter may be the base sequence of SEQ ID NO: 21 or a variant thereof.
  • the recombinant expression vector may further include a 2A sequence.
  • the 2A gene sequence encodes 18 to 22 amino acids, of which the four terminal amino acids Asparagine (N), Proline (P), Glycine (G), and Proline (P) are significantly conserved between species. It is an amino acid.
  • This sequence shows a tendency to self-cleavage when synthesized into a peptide. Due to this property, when the ribosome proceeds with protein transcription, when it reaches the genetic code encoding N, P, and G located at the end of the 2A sequence, it recognizes NPG in turn to create a peptide bond and the next amino acid, proline.
  • a releasing factor (RF) factor is imported. After the RF factor binds, the previously formed peptide is no longer able to continue the peptide bond and is released from the ribosome. And the code encoded after the 2A sequence operates normally and proceeds with the next protein transcription.
  • the recombinant expression vector of the present invention can simultaneously express the genes by inserting the 2A sequence between the genes.
  • a 2A sequence may be further included between the VP1 and 3C genes.
  • the 2A sequence may be the base sequence of SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23, or a variant thereof.
  • the recombinant expression vector may further include a Burst sequence.
  • the burst sequence is a part of the polyhedrin promoter and is located between the translation initiation site and TAAG. It is known that Vlf-1 binds specifically to the burst sequence at the end of baculovirus infection to promote transcription. there is.
  • the burst sequence may be the base sequence represented by SEQ ID NO: 24 or a variant thereof.
  • vector refers to any vehicle for cloning and/or transferring a base to a host cell.
  • a vector may be a replication unit (replicon) that can bind different DNA fragments and result in replication of the combined fragments.
  • Replication unit refers to any genetic unit (e.g., plasmid, phage, cosmid, chromosome, virus) that functions as a self-unit of DNA replication in vivo, that is, is capable of replicating under its own control.
  • the term “vector” includes viral and non-viral vehicles for introducing bases into host cells in vitro, ex vivo or in vivo.
  • the term "recombinant expression vector” refers to a vector manufactured to express a target protein in a suitable host cell, and refers to a genetic construct containing essential regulatory elements operably linked to express the gene insert.
  • the recombinant expression vector of the present invention may contain genes encoding FMDV proteins VP2, VP3, VP1 and 3C or may contain a gene encoding FMDV protein VP4.
  • the genes encoding the FMDV proteins VP2, VP3, VP1, and 3C and the gene encoding the FMDV protein VP4 can be linked to two different promoters in one vector, and the two promoters in the vector are positioned in opposite directions to achieve positive expression. The influence between promoters can be minimized.
  • nucleic acid refers to (i) a portion or fragment of a referenced nucleotide sequence; (ii) the complement of the referenced nucleotide sequence or portion thereof; (iii) a nucleic acid that is substantially identical to the referenced nucleic acid or its complement; or (iv) a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a referenced nucleic acid, its complement, or a sequence substantially identical thereto.
  • a “variant” for a peptide or polypeptide differs in amino acid sequence by insertion, deletion, or conservative substitution of amino acids, but retains at least one biological activity.
  • Variant may also refer to a protein having an amino acid sequence that is substantially identical to a referenced protein having an amino acid that retains at least one biological activity.
  • Conservative substitution of an amino acid i.e. replacement of an amino acid with a different amino acid of similar properties (e.g., hydrophilicity, degree and distribution of charged regions), is recognized in the art as typically involving small changes.
  • the present invention provides a transformant transformed with the above recombinant expression vector.
  • transformation refers to the introduction of DNA into a host so that the DNA can be replicated as a chromosomal factor or through completion of chromosomal integration. It refers to artificial genetic change by introducing external DNA into a cell. refers to a phenomenon that causes
  • transgenic plant or transgenic animal produced through transformation, and a genetic recombinant produced by causing modification or mutation of a specific gene using genetic recombination technology. Includes.
  • host cells for producing “transformants” are preferably those with high DNA introduction efficiency and high expression efficiency of the introduced DNA, and all microorganisms, including prokaryotic and eukaryotic, can be used.
  • the host cell is a bacterium of the genus Escherichia; Bacillus genus bacteria; Pseudomonas genus bacteria; Lactobacillus; leaven; animal cells; and insect cells.
  • the host cells may be insect cells.
  • the transformant is used to produce foot-and-mouth disease virus-like particles or nanoparticles.
  • the present invention provides virus-like particles or nanoparticles produced by transformants.
  • the present invention includes the steps of (1) constructing a recombinant expression vector of the present invention; (2) preparing a transformant using the recombinant expression vector; (3) transfecting the transformant into a host cell; (4) culturing the transfected host cells and obtaining the culture; and (5) obtaining virus-like particles or nanoparticles from the culture.
  • the present invention provides a vaccine composition for foot-and-mouth disease virus containing the above virus-like particles or nanoparticles as an active ingredient.
  • the term "vaccine” refers to a biological agent containing an antigen that provides immunity to a living body, and refers to an immunogen or antigenic substance that creates immunity in a living body by injecting or orally administering it to humans or animals to prevent infectious diseases. .
  • the content of the antigen may be 1 to 15% by weight based on the total weight of the vaccine composition.
  • the vaccine composition of the present invention may further include one or more adjuvants.
  • adjuvant generally refers to any substance that increases humoral and/or cellular immune responses to antigens.
  • Traditional vaccines consist of raw preparations of killed pathogenic microorganisms, which contain homogeneous preparations of purified protein subunits as antigens for vaccination, while impurities associated with cultures of pathogenic microorganisms can act as adjuvants to enhance the immune response.
  • the immunity triggered by the above antigen is insufficient, so the addition of some foreign substances as an adjuvant is necessary.
  • adjuvants By using adjuvants, a smaller dose of antigen may be required to stimulate an immune response, thereby reducing vaccine production costs.
  • the adjuvant includes EMULSIGEN, aluminum hydroxide, Carbigen, saponin, and CpG or a combination thereof.
  • the adjuvant may be a well-known oil emulsion, preferably a single oil emulsion.
  • the vaccine composition according to the present invention contains stabilizers, emulsifiers, aluminum hydroxide, aluminum phosphate, pH adjusters, surfactants, liposomes, iscom adjuvants, synthetic glycopeptides, extenders, carboxypolymethylene, bacterial cell walls, derivatives of bacterial cell walls, Bacterial vaccines, animal poxvirus proteins, subviral particle adjuvants, cholera toxin, N, N-dioctadecyl-N',N'-bis(2-hydroxyethyl)-propanediamine, monophosphoryl lipids A, it may additionally contain at least one second auxiliary agent selected from the group consisting of dimethyldioctadecyl-ammonium bromide and mixtures thereof.
  • the vaccine composition of the present invention may include a veterinary acceptable carrier.
  • veterinary acceptable carrier includes any and all solvents, dispersion media, coating agents, adjuvants, stabilizers, diluents, preservatives, antibacterial and antifungal agents, isotonic agents, adsorption delay agents, etc.
  • Carriers, excipients, and diluents that may be included in vaccine compositions include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, maltitol, starch, glycerin, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the vaccine composition of the present invention can be formulated and used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., and sterile injectable solutions according to conventional methods.
  • oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., and sterile injectable solutions according to conventional methods.
  • it can be prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations contain the lecithin-like emulsifier plus at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, or sucrose.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, oral solutions, emulsions, and syrups.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives can be used. You can.
  • Preparations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous preparations, suspensions, emulsions, and freeze-dried preparations.
  • Non-aqueous preparations and suspensions include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate.
  • VLP vaccines express one or multiple structural proteins of the virus through molecular biology techniques, and these structural proteins have a natural self-assembly ability, so they can form spatial structures and epitopes similar to natural virus particles. It contains no viral nucleic acid and is not only highly immunogenic but also non-infectious. In addition, because a high density of viral antigens exist on the surface, they can be delivered to immune cells in the same way that viruses infect the living body, effectively inducing humoral and cellular immunity of the biological immune system and shortening the incubation period. You can do it.
  • the present invention provides a method for preventing disease caused by foot-and-mouth disease virus infection, comprising administering the vaccine composition to a mammal other than a human.
  • prevention refers to any act of suppressing or delaying the foot-and-mouth disease virus infection by administering a composition containing foot-and-mouth disease virus-like particles or nanoparticle proteins self-assembled using the recombinant expression vector of the present invention as an active ingredient.
  • the mammal is applicable to animals such as chicken, pig, monkey, dog, cat, rabbit, guinea pig, rat, mouse, cow, sheep, goat, etc. without limitation.
  • the mammal is an artiodactyl such as a pig or a cow.
  • the administration may be performed by any administration means known in the art.
  • the administration can be administered directly to the subject intravenously, intramuscularly, orally, transdermal, mucosally, intranasally, intratracheally, or subcutaneously.
  • the administration may be administered systemically or locally.
  • the composition of the present invention may be administered in a therapeutically or prophylactically effective amount.
  • the “therapeutically or prophylactically effective amount” can be appropriately selected by those skilled in the art, taking into account the severity of symptoms, gender, age, and weight of the individual.
  • the therapeutically or prophylactically effective amount is, for example, 1 pg to 5 g of the polynucleotide per 1 kg of the administered subject, foot-and-mouth disease virus-like particles or nanoparticles self-assembled using the polynucleotide, a protein extract of the transformant, or the trait. It may be a recombinant protein isolated from the transformant.
  • the present invention provides a use of the virus-like particles or nanoparticles for preventing foot-and-mouth disease virus disease.
  • foot-and-mouth disease virus or “virus-like particles or nanoparticles” is as described above.
  • a transfer vector capable of expressing the structural proteins and major antigen candidates of FMDV was constructed.
  • the Delta-VP4 expression form was created by cloning the target genes listed in the order of VP2, VP3, VP1, and 3C behind the polyhedrin promoter using the high-expression vector pPol-6 ( Figure 1). Afterwards, the p10 promoter and VP4 were cloned in the opposite direction to the polyhedrin promoter of Delta-VP4 expression to create a VP4 co-expression form ( Figure 2). Meanwhile, as a control, a full form was created to clone the target genes listed in the order of VP4, VP2, VP3, VP1, and 3C behind the polyhedrin promoter ( Figure 3). To improve cloning efficiency, the codon-optimized gene sequence was inserted into the vector.
  • a recombinant transfer vector containing an O type antigen-determining region corresponding to the codon-optimized base sequence and amino acid sequence was constructed.
  • a recombinant transfer vector containing a type A antigen-determining region corresponding to the codon-optimized base sequence and amino acid sequence was constructed.
  • Each of the constructed transfer vectors was inserted into Bacmid from which the chitinase and chathepsin of the virus based on AcMNPV (Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus) had been removed to create a recombinant virus, and the recombinant virus was mass-produced by propagation in Sf9 cells, an insect cell line.
  • AcMNPV Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus
  • the recombinant virus was inoculated into insect cells Hi5, and after several days, centrifugation was performed at 4000 rpm, 5 minutes, and 4°C to collect the cells and culture medium.
  • the collected cells were resuspended by treating them with the same amount of PBS as the culture medium.
  • the collected cells and culture fluid samples were subjected to SDS-PAGE and Western blot, respectively.
  • proteins expressed from recombinant viruses transformed into Delta-VP4 form and VP4 Co-expression form were analyzed.
  • proteins expressed from cultures (cells and supernatants) of recombinant viruses transformed into the Delta-VP4 form were analyzed.
  • proteins expressed from cultures (cells and supernatants) of recombinant viruses transformed into full form were analyzed.
  • ELISA was performed to compare the amount of FMDV antigen produced from the recombinant virus of the present invention.
  • the recombinant virus was inoculated into insect cells Hi5, and after several days, centrifugation was performed at 4000 rpm, 5 minutes, and 4°C to collect the culture medium.
  • ELISA was performed on the collected culture fluid samples using an antibody specific for FMDV VP1.
  • the commercial vaccine which was the control group, used the Bioatogen FMD vaccine.
  • Example 3 Analysis of expressed proteins using antibodies specific for VP1, VP2, VP3, and VP4 structural proteins
  • each band for FMDV structural proteins VP1, VP2, VP3, and VP4 was confirmed by the O type recombinant virus. Through the above results, it was confirmed that all proteins existed individually after expression, meaning that 3C protease was expressed and operated normally.
  • each protein VP1, VP2, VP3, and VP4 is expressed singly and secreted outside the cell, which means that the 3C protease was expressed and operated normally.
  • the culture medium of the recombinant virus using the VP4 Co-expression form was concentrated and purified.
  • the culture medium was passed through a 100kDa hollow fiber filter, concentrated 20 times, and then exchanged with 20mM Tris-HCl, pH6.5 Buffer.
  • the concentrate of the obtained culture medium was subjected to IEX (Ion Exchange Chromatography) using Captocore Q impress. Purified FMDV antigen candidates were confirmed through SDS-PAGE and Western blot.
  • the FMDV antigen candidate material obtained through purification was photographed using TEM (Transmission electron microscopes) to observe its morphology.
  • a vaccine was prepared for inoculation into target animals.
  • the vaccine candidate used consisted of a structural protein for serotype O, was produced from a recombinant virus constructed from the VP4 Co-expression form, and was prepared by emulsifying it with an oil emulsion.
  • the vaccine is administered in two doses, with the first vaccination administered at week 0 from the start of the test and the second vaccination administered at week 4. Blood was collected every week until week 15, and pig serum was isolated (Figure 21).
  • Antibody titers were measured using the separated serum using an ELISA kit (PrioCHECK FMDV Type O Andibody SP ELISA kit).
  • the commercial vaccine which was the control group, used the Bioatogen FMD vaccine.
  • Antibody titers and neutralizing antibody titers were evaluated depending on the concentration of the vaccine candidate.
  • the vaccine is administered in two doses, with the first vaccination administered at week 0 from the start of the test and the second vaccination administered at week 4.
  • Separate vaccines for O type and A type were produced and applied. Serum was collected every week from pigs inoculated with each serotype, and the antibody titer for each week was measured using an ELISA kit (PrioCHECK FMDV Type O Andibody SP ELISA kit, PrioCHECK FMDV Type A Andibody SP ELISA kit) using the collected serum. did.
  • the commercial vaccine which was the control group, used the Bioatogen FMD vaccine.
  • type O showed antibody titers equivalent to those of the control group at all antigen doses.
  • Type A antibody titer reached 50% 2 weeks later than the control group at the low dose, and increased similarly at all other doses.
  • O type achieved 32-fold increase from the 2nd week at all doses and was maintained at more than 100-fold thereafter.
  • neutralizing antibodies were formed late at low doses, the medium dose started to increase from the 2nd week and gradually increased, and at high doses, it reached 32 times from the 2nd week.
  • the skin of pigs inoculated with the vaccine candidate was observed histopathologically.
  • the vaccine candidate used consisted of a structural protein for serotype O and was produced from a recombinant virus constructed from the VP4 Co-expression form.
  • the vaccine is administered in two doses, with the first vaccination administered at week 0 from the start of the test, the second vaccination administered at week 4, and the vaccination site observed.
  • the commercial vaccine which was the control group, used the Bioatogen FMD vaccine.
  • the above results mean that the vaccine candidate of the present invention has a low side effect of developing abnormal meat.

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Abstract

본 발명은 구제역 바이러스 유사 입자 또는 나노입자 생산을 위한 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 백신 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 FMDV 구조 단백질 중 VP4와 VP1, VP2, VP3를 동시 발현하거나 VP4를 제외한 VP1, VP2, VP3를 발현시켜 생성한 바이러스 유사 입자 또는 나노입자 및 이의 제조 방법을 제공하며, 본 발명의 방법에 따라 제조된 바이러스 유사 입자 또는 나노입자는 구제역 바이러스 감염에 의한 질환의 예방에 효과적으로 이용할 수 있다.

Description

구제역 바이러스 유사 입자 또는 나노입자 생산을 위한 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 백신 조성물
본 발명은 구제역 바이러스 유사 입자 또는 나노입자 생산을 위한 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 백신 조성물에 관한 것이다.
구제역 바이러스 (Foot and Mouth Disease Virus, FMDV)는 소와 돼지를 비롯한 우제류에게 치명적인 급성 전염병을 일으키는 바이러스다. 이 바이러스는 전염시 발열, 파행, 수포 형성 등 다양한 증상을 유발하며, 접촉을 하거나 오염된 지역을 통과한 사람이나 차량, 여러 물건들에 의해서 전파가 일어나기도 한다. 또한 공기를 통해 최대 250km 이상까지 전파할 수 있는 높은 전염성을 가진다. 이로 인해 가축 산업에 심각한 영향을 미치며 임신 문제와 우유 생산 감소와 같은 경제적 손실을 초래한다. 구제역은 세계동물보건기구(WOAH)에서 가축전염예방법 제1종 가축전염병으로 지정한 질병이다.
FMDV는 피코르나바이러스과 (Picornaviridae)의 아프토바이러스 (Aphtovirus) 속에 속하는 단일가닥의 양성-극성 RNA 바이러스 (single-stranded positive-sense RNA virus)이다. 현재까지 혈청형은 O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2, SAT3로 총 7가지 유형이 알려져 있으며, 각 혈청형에는 여러가지 지역형(Topotype)이 존재한다고 알려져 있다. 세계적으로 주로 O type이 지속적으로 발생하며, 중국, 북한 등 동아시아지역에서 O type을 비롯하여 Asia1 및 A type이 간헐적으로 발생하고 있는 추세이다. 구제역 바이러스는 혈청형이 다른 바이러스 간에는 혈청학적으로 중화가 되지 않고, 백신에 의해 교차방어가 되지 않을 만큼 유전적, 또는 항원적으로 큰 차이를 보인다.
FMDV는 노출된 캡시드 (capsid)를 갖고 있으며, 상기 캡시드는 정20면체 구조를 가진다. FMDV 다단백질 (polyprotein)의 P1 영역은 구조 단백질을 암호화하며, P2 및 P3 영역은 비구조 단백질을 암호화한다. 바이러스 프로테아제 2A에 의해 구조 단백질 전구체 P1이 분할되고, P1 전구체는 캡시드 단백질 VPO, VP3 및 VP1으로 가공된다. 3C는 P1 전구체를 캡시드 단백질로 가공하는 역할을 하는 바이러스 프로테아제이다. 비리온에서, 단백질 VP0는 2개 단백질, VP4 및 VP2로 절단된다.
구제역 예방을 위해 불활화 바이러스 백신이 상용화되어 판매되고 있으며, 일반적으로 바이러스를 세포배양 후 ethyleneimine으로 불활화하고 애쥬반트 (adjuvant)와 혼합하여 백신으로 사용한다. 현재까지의 구제역 백신은 항체의 지속성이 짧으며, 돼지에서의 낮은 면역원성 등이 단점으로 지적되고 있어 보다 효과적이고 안정한 백신 개발의 필요성이 요구되고 있다. 특히, 돼지에 근육 접종 시 접종 부위에 섬유증(fibrosis), 육아종(granuloma) 등의 접종된 근육에 병변이 형성되는 등의 국소 부작용 및 안전성이 낮다는 단점이 있다. 상용백신을 근육접종한 구제역 백신이 출하시점까지 육아종이나 화농 형태로 남으면서 이상육 문제를 일으켰고, 이상육으로 인해 경제적 손실을 입은 농장이 백신 접종을 기피하는 주 원인이 됐다. 이러한 현재 상용백신의 한계를 극복하기 위한 이상적 백신 디자인이 필요하다.
이에 본 발명자들은 FMDV 구조 단백질 중 VP4와 VP1, VP2, VP3를 동시 발현하거나 VP4를 제외한 VP1, VP2, VP3를 발현시켜 바이러스 유사 입자 또는 나노입자를 생산하였고, 이를 이용한 백신 조성물이 효과적인 면역 반응을 유도할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 FMDV 항원을 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체에 의하여 생산되는 바이러스 유사입자 또는 나노입자, 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 구제역 바이러스의 백신 조성물 및 구제역 바이러스 감염에 의한 질환의 예방 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 구제역 바이러스 질환의 예방을 위한 상기 바이러스 유사 입자 또는 나노입자의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제1의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 구제역 바이러스 (Foot and Mouth Disease Virus, FMDV) 단백질 VP2, VP3, VP1 및 3C를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 제1의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 FMDV VP2, VP3, VP1 및 3C를 암호화하는 유전자; 및 제2의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 FMDV 단백질 VP4를 암호화하는 유전자;를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체에 의하여 생산되는 바이러스 유사입자 또는 나노입자, 이의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바이러스 유사입자 또는 나노입자를 유효성분으로 포함하는 구제역 바이러스의 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 구제역 바이러스 감염에 의한 질환의 예방 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 구제역 바이러스 질환의 예방을 위한 상기 바이러스 유사 입자 또는 나노입자의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 구제역 바이러스 유사 입자 또는 나노입자 생산을 위한 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 백신 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 FMDV 구조 단백질 중 VP4와 VP1, VP2, VP3를 동시 발현하거나 VP4를 제외한 VP1, VP2, VP3를 발현시켜 생성한 바이러스 유사 입자 또는 나노입자, 이의 제조 방법을 제공하며, 본 발명의 방법에 따라 제조된 바이러스 유사 입자 또는 나노입자는 구제역 바이러스 감염에 의한 질환의 예방에 효과적으로 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 VP4 Co-expression form을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 Delta-VP4 expression form을 나타내는 모식도이다.
도 3은 full form을 나타내는 모식도이다.
도 4는 쿠마시 염색을 통해 본 발명의 재조합 바이러스가 목적 단백질을 발현하는지 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 웨스턴 블랏을 통해 본 발명의 재조합 바이러스가 VP1 단백질을 발현하는지 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 Delta-VP4 form으로 형질전환된 재조합 바이러스를 배양한 배양물을 이용하여 VP1 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 쿠마시 염색을 통해 Full form으로 형질전환된 재조합 바이러스가 목적 단백질을 발현하는지 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 Full form으로 형질전환된 재조합 바이러스를 배양물을 이용하여 VP1 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 FMDV VP1 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 ELISA를 진행하여 항원량 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 O type FMDV VP1 단백질의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 O type FMDV VP2 단백질의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 O type FMDV VP3 단백질의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 O type FMDV VP4 단백질의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 A type FMDV VP1 단백질의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 A type FMDV VP2 단백질의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 A type FMDV VP3 단백질의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 A type FMDV VP0 단백질의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 A type FMDV VP4 단백질의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 TEM을 통해 FMDV 항원 후보 물질의 나노 입자를 관찰한 도이다.
도 20은 TEM을 통해 FMDV 항원 후보 물질의 VLP입자를 관찰한 도이다.
도 21은 본 발명의 백신 조성물의 투여 방법을 나타낸 도이다.
도 22는 백신 후보 물질의 면역원성을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 23은 O 및 A type에 대한 백신 후보 물질의 농도에 따른 항체가를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 24는 O 및 A type에 대한 백신 후보 물질의 농도에 따른 중화항체 역가를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 25는 VP4 Co expression form으로 형질전환된 재조합 바이러스로부터 생산된 백신 조성물을 투여한 돼지의 조직병리학적 관찰 결과를 나타낸 도이다.
도 26은 대조군 백신을 투여한 돼지의 조직병리학적 관찰 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 제1의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 구제역 바이러스 (Foot and Mouth Disease Virus, FMDV) 단백질 VP2, VP3, VP1 및 3C를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 제1의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 FMDV VP2, VP3, VP1 및 3C를 암호화하는 유전자; 및 제2의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 FMDV 단백질 VP4를 암호화하는 유전자;를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, "구제역 바이러스 (foot-and-mouth disease virus, 이하 FMDV)"는 피코르나바이러스과 (Picornaviridae)의 아프토바이러스 (Aphtovirus) 속에 속한다. 상기 바이러스는 4가지 캡시드 (capsid) 단백질 (VP1, VP2, VP3 및 VP4)의 60 개 카피와 단일 가닥인 RNA 게놈 (약 8.5kb)으로 구성되어 있으며, 우제류 특히 소, 돼지, 양에 감염하여 전염력이 강한 질병이다.
FMDV의 4가지 캡시드 단백질은 VP1, VP2, VP3, 및 VP4이며 이 중 캡시드 표면에 노출되어 있는 단백질은 VP1, VP2 및 VP3로 VP1이 바이러스의 감염성과 가장 관련되어 있으며, VP4는 작은 크기의 단백질이며 내부에 위치하고 있다. 지역에 따라 많은 혈청형이 있으며, 항원 구조에 따라 A, O, C, SAT1, SAT2, SAT3, Asia1 등 7종의 혈청형이 있고 이들 혈청형에는 80종이 넘는 혈청아형이 있다.
본 발명에 있어서, "바이러스 유사입자 (Virus-Like Particle, VLP) 및 나노입자 (Nanoparticle)"는 바이러스의 복제 및 세포내 침투 역할을 담당하는 비구조 단백질을 포함하는 바이러스와 거의 동일한 형태의 모양을 가지는 항원으로, 유전물질을 포함하지 않고, 유전자 재조합 기술을 이용하여 바이러스의 항원성을 대표하는 구조 표면(외피) 단백질의 조합을 통하여, 바이러스와 거의 동일한 형태를 가진다.
구제역 바이러스의 외피 부위는 체내 감염 후, 가장 확실하게 면역 시스템에 의해서 감지되는 항원성 부위로 이 외피를 형성하는 단백질을 이용하여 안전하고 효과적인 신규 백신의 제조가 가능하다.
상기 재조합 발현 벡터는 구제역 바이러스의 VP2, VP3, VP1, 및 3C의 염기서열이 순차적으로 배열된 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 단백질로 발현시 자가조립에 의해 구제역 바이러스 유사 입자의 제조가 가능하다. 또한 상기 폴리뉴클레오티드와 반대 방향으로 VP4의 염기 서열을 발현하도록 제작될 수 있다.
본 발명에서 상기 구제역 바이러스는 O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2, 및 SAT3 type에서 선택될 수 있다.
또한, 상기 구제역 바이러스 O type은 O-Andong, O-PanAsia2(O-PA2), O-manisa, O-Taiwan97(O-Twn97), O-Campos, O-Boeun(O-BE), O-Jincheon(O-JC), O-Anseong(O-AS) 및 O-Gimje(O-GJ)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서 O type은 O-Andong (GenBank: KF112887.1)의 유전자 서열을 이용할 수 있다. 또한, 일부 실시양태에서 단백질의 발현량을 향상시키기 위하여, 본 발명에서는 곤충세포 선호 코돈을 이용하여 상기 핵산 서열을 코돈 최적화하였다. 일 실시예로, 상기 VP1, VP2, VP3, VP4 및 3C 단백질을 코딩하는 염기서열은 각각 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 9로 표시되는 염기서열 또는 이의 변이체일 수 있다. 또한, O type VP1, VP2, VP3, 또는 VP4 단백질은 각각 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
또한, 상기 구제역 바이러스 A type은 A-Pocheon(A-PC), A-Yeoncheon(A-YC), A-Bangladesh(A-Ban), A-Malaysia97(A-May97), A-Gimpo(A-GP), 및 A22-Iraq로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서 A type은 A-Pocheon (GenBank: KC588943.1) 또는 A-Yeoncheon (GenBank: KY766148.1)의 유전자 서열을 이용할 수 있다. 또한, 일부 실시양태에서 단백질의 발현량을 향상시키기 위하여, 본 발명에서는 곤충세포 선호 코돈을 이용하여 상기 핵산 서열을 코돈 최적화하였다. 일 실시예로, 상기 VP1, VP2, VP3, VP4 및 3C 단백질을 코딩하는 염기서열은 각각 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 염기서열 또는 이의 변이체일 수 있다. 또한, A type VP1, VP2, VP3, 또는 VP4 단백질은 각각 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
상기 3C는 서열번호 9의 염기서열의 아미노산을 코딩하는 염기서열 또는 이의 변이체일 수 있고 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 FMDV 3C는 프로테아제이고, FMDV VP4, VP2, VP3, VP1 단백질을 절단하여 FMDV VLP의 자가조립을 가능하게 한다.
상기 3C는 FMDV 혈청형 별로 서열이 상이하지 않고, 공통적으로 보존된 서열을 가진다. 그러나, FMDV의 VP4-VP2-VP3-VP1의 서열은 O 혈청형, A 혈청형, Asia1 혈청형, SAT 혈청형, 및 C 혈청형에서 상이하고, 동일한 혈청형도 혈청아형 별로 서열이 상이하다.
본 발명에 있어서, 재조합 발현 벡터는 목적의 단백질의 발현 수준 또는 효율을 증가시킬 수 있는 한, 임의의 서열들, 바람직하게는 프로모터 및/또는 발현 촉진을 위한 서열 (예를들어, 2A 서열 및/또는 Burst 서열 등)을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프로모터"는 전사를 이끌기에 충분한 서열이면 제한없이 적용가능하다. 일 실시예로, 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터 (Polyhedrin promoter)는 VP2-VP3-VP1-3C의 목적 단백질의 앞부분에 위치하여, 목적 단백질의 발현 효율을 증가시킬 수 있다. 상기 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터는 서열번호 19의 염기서열 또는 이의 변이체일 수 있다. 또한, 상기 다각체 단백질 코딩 유전자의 프로모터는 vp39 프로모터 (서열번호 20) 앞부분에 위치할 수 있다. 한편, VP4의 목적 단백질의 발현을 위해 상이한 프로모터를 이용할 수 있다. 일 실시예로, p10 프로모터는 VP4의 목적 단백질의 앞부분에 위치하여, 목적 단백질의 발현 효율을 증가시킬 수 있으며, 상기 p10 프로모터는 서열번호 21의 염기서열 또는 이의 변이체일 수 있다.
상기 재조합 발현 벡터는 2A 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 2A 유전자서열은 18 내지 22개 아미노산을 코딩하고 있으며 그 중에서 말단에 위치하는 4개의 아미노산 Asparagine (N), Proline (P), Glycine (G), Proline (P)은 종간에 중요하게 보존되어 있는 아미노산이다. 상기 서열은 펩티드로 합성될 때, 자기-분열 (self-cleavage)이 일어나는 경향을 보인다. 이러한 성질로 인하여 리보좀(Ribosome)이 단백질 전사를 진행할 때 2A 서열 말단에 위치한 N, P, G를 암호화한 유전자 코드 (genetic code)에 도달하면, NPG를 차례로 인지하여 펩티드 결합을 만들고 다음 아미노산인 proline 암호화 코드에 Proline이 결합된 prolyl-tRNA을 가져오는 대신에 방출 요소 (releasing factor: RF) 인자를 가져온다. RF 인자가 결합하고 난 다음에는 앞에서 이미 형성된 펩티드는 더 이상 펩티드 결합을 이어가지 못하고 리보좀에서 방출된다. 그리고 2A 서열 이후에 암호화된 코드는 정상적으로 작동하여 다음 단백질 전사를 진행하게 된다. 결론적으로 2A 서열을 삽입함으로써 하나의 프로모터를 이용하여 여러 유전자를 발현시킬 수 있다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 이러한 2A 서열을 유전자들 사이 각각에 삽입함으로써, 상기 유전자들을 동시에 발현할 수 있다. 일 실시예로, 상기 VP2-VP3-VP1-3C 단백질을 코딩하는 염기서열이 순차적으로 배열되어 있는 경우, VP1과 3C 유전자 사이에 2A 서열을 더 포함할 수 있다. 일 실시예로, 2A 서열은 서열번호 22 또는 서열번호 23의 염기서열 또는 이의 변이체일 수 있다.
상기 재조합 발현 벡터는 Burst 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 Burst 서열은 폴리헤드린(Polyhedrin) 프로모터내 존재하는 일부분으로써 번역 개시 부위와 TAAG 사이에 위치한 서열이며, 배큘로바이러스 감염말기에 Vlf-1이 Burst 서열에 특이적으로 결합하여 전사를 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 일 실시예로, Burst 서열은 서열번호 24로 표시되는 염기서열 또는 이의 변이체일 수 있다.
본 발명에 있어서, "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비 바이러스 매개물을 포함한다.
본 발명에서 용어 "재조합 발현 벡터"는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있도록 제조된 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 FMDV 단백질 VP2, VP3, VP1 및 3C를 암호화하는 유전자를 포함하거나 FMDV 단백질 VP4를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다. 이때, FMDV 단백질 VP2, VP3, VP1 및 3C를 암호화하는 유전자와 FMDV 단백질 VP4를 암호화하는 유전자는 하나의 벡터 안에 서로 다른 두 개의 프로모터와 각각 연결될 수 있고, 벡터 내 두 프로모터의 방향을 반대로 위치시킴으로써 양 프로모터 간의 영향을 최소화할 수 있다.
본 발명에 있어서, 핵산에 대해 본원에서 이용되는 "변이체"는 (i) 참조된 뉴클레오티드 서열의 부분 또는 단편; (ii) 참조된 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분의 상보체; (iii) 참조된 핵산 또는 그의 상보체와 실질적으로 동일한 핵산; 또는 (iv) 참조된 핵산, 그의 상보체, 또는 이들과 실질적으로 동일한 서열에 엄격한 조건 하에 혼성화하는 핵산을 의미할 수 있다.
본 발명에 있어서, 펩티드 또는 폴리펩티드에 대한 “변이체”는 아미노산의 삽입, 결실, 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열이 상이하지만, 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지한다. 변이체는 또한 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산을 갖는 참조된 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환, 즉 유사한 특성 (예로, 친수성, 하전된 영역의 정도 및 분포)의 상이한 아미노산을 이용한 아미노산 대체는 당분야에서 전형적으로 작은 변화를 포함하는 것으로 인식된다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명에 있어서, "재조합 발현 벡터"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에 있어서, "형질전환(transformation)"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로, 외부의 DNA를 세포내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "형질전환체"는 형질전환으로 인해 생성된 형질전환식물 또는 형질전환동물을 의미하며, 유전자 재조합 기술을 이용하여 특정 유전자의 변형 또는 변이가 유발되어 생성된 유전자 재조합체를 포함한다.
본 발명에 있어서, "형질전환체" 제조를 위한 숙주 세포는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 바람직하며, 원핵 및 진핵을 포함한 모든 미생물이 사용될 수 있다. 상기 숙주세포는 에스케리키아(Escherichia)속 세균; 바실러스(Bacillus)속 세균; 슈도모나스 (Pseudomonas)속 세균; 유산균; 효모; 동물세포; 및 곤충 세포로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 바람직하게는, 상기 숙주세포는 곤충세포일 수 있다.
상기 형질전환체는 구제역 바이러스 유사 입자 또는 나노입자를 제조하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 형질전환체에 의하여 생산되는 바이러스 유사 입자 또는 나노입자를 제공한다.
본 발명에 있어서, "형질전환(transformation)", "바이러스 유사 입자 또는 나노입자"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명은 (1) 본 발명의 재조합 발현 벡터를 제작하는 단계; (2) 상기 재조합 발현 벡터를 이용하여 형질전환체를 제조하는 단계; (3) 상기 형질전환체를 숙주세포에 형질감염(transfection)시키는 단계; (4) 상기 형질감염된 숙주세포를 배양하고, 그 배양물을 수득하는 단계; 및 (5) 상기 배양물로부터 바이러스 유사 입자 또는 나노입자를 수득하는 단계;를 포함하는, 구제역 바이러스 감염에 의한 질환 예방용 바이러스 유사 입자 또는 나노입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, "재조합 발현 벡터", "숙주세포", "형질전환체", "구제역", " 바이러스 유사 입자 또는 나노입자"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명은 상기 바이러스 유사 입자 또는 나노입자를 유효성분으로 포함하는 구제역 바이러스의 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "백신"은 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 말한다.
상기 항원의 함량은 백신 조성물 총 중량에 대해서 1 내지 15 중량%일 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 1종 이상의 애쥬번트(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "애쥬번트"란, 일반적으로 항원에 대한 체액 및/또는 세포 면역 반응을 증가시키는 임의의 물질을 지칭한다. 전통적인 백신들은 죽은 병원성 미생물의 비가공 제제로 구성되어, 병원성 미생물의 배양액과 관련된 불순물들은 면역 반응을 향상시키기 위한 애쥬번트로서 작용할 수 있으나, 정제된 단백질 서브유닛의 균질 제제를 백신접종을 위한 항원으로서 사용하는 경우, 상기와 같은 항원에 의해 발동된 면역성은 불충분하여 애쥬번트로서 일부 외래물질의 첨가가 필요하다. 애쥬번트를 사용함으로써 면역 반응을 자극하는데 보다 적은 용량의 항원이 요구될 수 있으며, 이에 의해 백신 생산 비용이 절감될 수 있다. 일부 실시형태에서 상기 애쥬번트는 EMULSIGEN, 수산화알루미늄, Carbigen, 사포닌, 및 CpG 또는 이의 조합을 포함한다. 또 다른 실시형태에서 상기 애쥬번트는 널리 알려진 오일 에멀전 바람직하게 싱글 오일 에멀전일 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 세균 세포벽, 세균 세포벽의 유도체, 세균백신, 동물 폭스바이러스 단백질, 서브바이랄(subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N, N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제2 보조제를 추가로 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 백신 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
VLP 백신은 분자 생물학 기술을 통하여, 바이러스의 하나 또는 다수의 구조 단백질을 발현하며, 이러한 구조 단백질은 천연적인 자기조립 능력을 가지고 있기에, 천연 바이러스 입자와 유사한 공간 구조와 항원결정부를 형성할 수 있지만, 바이러스 핵산이 없고, 면역원성이 강할 뿐만 아니라 감염성도 없다. 또한, 표면에 고밀도의 바이러스 항원이 존재하므로, 바이러스가 생체를 감염하는 것과 동일한 방식으로 면역세포에 전달될 수 있어, 생체 면역시스템의 체액성 면역과 세포성 면 역을 효과적으로 유도하며, 잠복기를 단축시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 인간을 제외한 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 구제역 바이러스 감염에 의한 질환의 예방 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, "백신 조성물"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에 있어서, "예방"은 본 발명의 상기 재조합 발현 벡터를 이용하여 자가조립되는 구제역 바이러스 유사 입자 또는 나노입자 단백질을 유효성분으로 하는 조성물의 투여로 상기 구제역 바이러스 감염을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명에 있어서, 상기 포유 동물은 닭, 돼지, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 래트, 마우스, 소, 양, 염소 등과 같은 동물에 제한없이 적용가능하다. 바람직하게, 상기 포유동물은 돼지 또는 소와 같은 우제류이다.
본 발명에 있어서, 상기 투여는 당업계에 알려져 있는 임의의 투여 수단에 의하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 투여는 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하로 개체에 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 본 발명의 조성물은 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양으로 투여되는 것일 수 있다. 상기 "치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양"은 당업자라면, 증상의 경중, 개체의 성별, 나이 및 체중 등을 고려하여 적절하게 선택할 수 있다. 상기 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양은, 예를 들면 투여되는 개체 1kg 당 1pg 내지 5g의 상기 폴리뉴클레오티드를 이용하여 자가조립되는 구제역 바이러스 유사 입자 또는 나노 입자, 상기 형질전환체의 단백질 추출물 또는 상기 형질전환체에서 분리된 재조합 단백질일 수 있다.
또한, 본 발명은 구제역 바이러스 질환의 예방을 위한 상기 바이러스 유사 입자 또는 나노입자의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명에 있어서, "구제역 바이러스" 또는 "바이러스 유사 입자 또는 나노입자"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
<실시예 1> FMDV 항원 후보물질을 발현하는 재조합 벡터 및 바이러스의 제작
고발현 배큘로바이러스 발현계를 이용하기 위하여 FMDV의 구조 단백질 및 주요 항원 후보 물질을 발현할 수 있는 전이 벡터를 제작하였다.
구체적으로, 고발현벡터 pPol-6를 이용하여 Polyhedrin promoter 뒤로 VP2, VP3, VP1, 3C 순으로 나열된 목적 유전자를 클로닝하여 Delta-VP4 expression form을 제작하였다 (도 1). 이후 Delta-VP4 expression의 Polyhedrin promoter 반대 방향으로 p10 promoter와 VP4를 클로닝하여 VP4 Co-expression form을 제작하였다 (도 2). 한편, 대조군으로 Polyhedrin promoter 뒤로 VP4, VP2, VP3, VP1, 3C 순으로 나열된 목적 유전자를 클로닝하는 full form을 제작하였다 (도 3). 클로닝 효율을 향상시키기 위해 코돈 최적화한 유전자 서열을 벡터에 삽입하였다. 코돈 최적화된 염기서열과 아미노산 서열에 해당하는 O type의 항원 결정 부위를 포함하는 재조합 전이벡터를 제작하였다. 또한, 코돈 최적화된 염기서열과 아미노산 서열에 해당하는 A type의 항원 결정 부위를 포함하는 재조합 전이벡터를 제작하였다.
제작된 각각의 전이벡터는 AcMNPV (Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus)를 기반으로 하는 바이러스의 chitinase와 Chathepsin이 제거된 Bacmid에 삽입하여 재조합 바이러스를 제작하고 곤충세포주인 Sf9 세포에서 증식시켜 재조합 바이러스를 대량생산하였다.
<실시예 2> FMDV 구조 단백질을 발현하는 재조합 바이러스로부터 발현된 단백질 확인
<2-1> FMDV 구조단백질을 발현하는 재조합 바이러스로부터 발현된 단백질 전기영동 분석 결과
실시예1에서 제작한 FMDV 구조 단백질을 발현하는 재조합 바이러스가 목적 단백질을 발현하는지 확인하는 실험을 수행하였다.
구체적으로, 곤충세포 Hi5에 재조합 바이러스를 접종하고 수일 경과 후 4000rpm, 5분, 4℃ 조건에서 원심분리를 수행하여 세포와 배양액을 수거하였다. 수거된 세포는 배양액과 동량의 PBS를 처리하여 재현탁하였다. 수거된 세포와 배양액 시료를 각각 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯을 진행하였다.
먼저, Delta-VP4 form과 VP4 Co-expression form으로 형질전환된 재조합 바이러스로부터 발현된 단백질을 분석하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, VP2 단백질에 해당하는 23.1kDa, VP2 단백질에 해당하는 24.4kDa, VP3 단백질에 해당하는 23.9kDa, VP4 단백질에 해당하는 8.9kDa 크기의 목적 단백질 위치에 선명한 밴드를 확인하였으며, 육안으로 높은 수율의 단백질이 배양액으로 분비되었음을 확인하였다.
또한, 도 5에 나타난 바와 같이, VP1 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행한 결과 SDS-PAGE에서 확인된 단백질이 VP1 단백질임을 명확히 확인할 수 있었다. 또한, 3C의 정상적인 발현으로 P1에서 VP1이 절단되었음을 검증하였다. 특히, Delta-VP4 form에서도 높은 Secretion 효율이 확인되나 VP4 Co-expression form에서 가장 높은 구조단백질 발현량을 확인할 수 있었다.
추가적으로, Delta-VP4 formm으로 형질전환된 재조합 바이러스의 배양물 (세포와 상층액)로부터 발현된 단백질을 분석하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, Delta-VP4 form에서도 VP4 Co-expression form과 동일하게 발현 후 배양액 내로 Secretion 되는 효율이 높은 것으로 확인하였다.
상기의 결과를 통해 VP4 Co-expression form과 Delta-VP4 form과 같이 FMDV 구조단백질 P1 (VP4-VP2-VP3-VP1)에서 VP4를 제거하여 발현할 경우, 단백질이 발현 후 배양액 내로 secretion되며, 이러한 secretion은 항원 후보 물질 생산성에 높게 기여함을 알 수 있다.
한편, Full form으로 형질전환된 재조합 바이러스의 배양물 (세포와 상층액)로부터 발현된 단백질을 분석하였다.
그 결과, 도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이, Full form은 발현 후 세포에 다량의 단백질이 존재함을 볼 수 있으나, dpi (day of post inoculation)가 증가하여도 상층액으로 secretion되는 양상을 관찰할 수 없었다.
상기의 결과는 FMDV 구조단백질 P1(VP4-VP2-VP3-VP1)에서 VP4를 제거하고 발현하는 형태의 벡터 (Delta-VP4 form, VP4 Co-expression form)가 항원 후보물질 생산에 중요한 역할을 함을 시사한다.
<2-2> FMDV VP1에 특이적인 항체를 이용하여 ELISA를 진행하여 항원량 비교
본 발명의 재조합 바이러스로 부터 생산된 FMDV 항원량을 비교하기 위하여 ELISA를 수행하였다.
구체적으로, 곤충세포 Hi5에 재조합 바이러스를 접종하고 수일 경과 후 4000rpm, 5분, 4℃ 조건에서 원심분리를 수행하여 배양액을 수거하였다. 수거된 배양액 시료로 FMDV VP1에 특이적인 항체를 이용하여 ELISA을 진행하였다. 대조군인 commercial vaccine은 바이오아토젠 FMD 백신을 이용하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, VP4 Co-expression form에서 더 높은 결과값이 확인되어, VP4 co-expression form을 FMDV 구조 단백질 최적 발현 form으로 선정하였다.
<실시예 3> VP1, VP2, VP3, VP4 구조단백질에 특이적인 항체를 이용한 발현 단백질 분석
재조합 바이러스에 의해서 FMDV 구조 단백질이 모두 발현되었는지 확인하기 위한 실험을 쉬행하였다.
구체적으로, 재조합 바이러스를 이용하여 대량 배양된 배양액에서 VP0, VP1, VP2, VP3, VP4 각각에 해당하는 특이적 항체를 이용해서 웨스턴 블롯을 진행하였다. 대조군인 commercial vaccine은 바이오아토젠 FMD 백신을 이용하였다.
그 결과, 도 10 내지 도 13에 나타난 바와 같이, O type에 대한 재조합 바이러스에 의해서 FMDV 구조단백질 VP1, VP2, VP3, VP4에 대한 각각의 밴드를 확인할 수 있었다. 상기의 결과를 통해 모든 단백질이 발현 후 개별적으로 존재함을 확인하였고, 이는 3C protease가 정상적으로 발현되고 작동되었음을 의미한다.
또한, 도 14 내지 도 18에 나타난 바와 같이, A type에 대한 재조합 바이러스에 의해서 FMDV 구조단백질 VP1, VP2, VP3, VP4이 모두 발현함을 확인할 수 있었다. 특히, VP4 Co-expression form은 VP2가 단일로 발현되어 약 24.4kDa 사이즈의 밴드를 확인할 수 있고 Full form은 VP0의 형태로 VP2와 VP4가 결합된 형태로 발현됨을 확인할 수 있다 (도 15). 또한, VP4 Co-expression form은 VP0가 확인되지 않는 점을 보아 VP0가 VP2와 VP4로 분리되어있으나, Full form은 VP2와 VP4가 결합된 형태인 VP0 형태로 발현되어 있음을 알 수 있었다 (도 17).
상기의 결과는 Full form과 달리 VP4 Co-expression form에서는 각각의 단백질 VP1, VP2, VP3, VP4가 단일로 발현되고 세포 밖으로 분비되어 존재하며, 이는 3C protease가 정상적으로 발현되고 작동되었음을 의미한다.
<실시예 4> TEM을 이용한 FMDV 항원 후보 물질의 형태적 관찰
상기 실시예에서 발현된 단백질에 대한 특성 분석하기 위한 실험을 수행하였다.
구체적으로, VP4 Co-expression form을 이용한 재조합 바이러스의 배양액을 농축 및 정제하였다. Tangential flow filtration (TFF) system을 이용하여 배양액을 100kDa 중공섬유필터(hollow fiber filter)에 통과시켜 20배 농축한 뒤 20mM Tris-HCl, pH6.5 Buffer로 교환해주었다. 확보된 배양액의 농축액은 Captocore Q impress를 이용하여 IEX (Ion Exchange Chromatography)를 진행하였다. 정제된 FMDV 항원 후보 물질은 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯을 통해서 확인되었다.
정제를 통해 확보된 FMDV 항원 후보 물질을 형태적 관찰을 하기 위하여 TEM (Transmission electron microscopes) 촬영하였다.
그 결과, 도 19에 나타난 바와 같이, 나노입자는 약 10~15nm 크기임을 확인하였다. 또한, 도 20에 나타난 바와 같이, VLP 입자는 모두 약 25~30nm로 적정한 크기임을 확인하였다.
<실시예 5> 백신 후보 물질의 면역원성 검정
백신 후보 물질의 면역 효능을 확인하기 위해서 목적 동물에 접종하기 위한 백신을 제조하였다.
구체적으로, 사용된 백신 후보 물질은 혈청형 O에 대한 구조 단백질로 이뤄졌으며, VP4 Co-expression form으로부터 제작된 재조합 바이러스로부터 생산되었으며, 오일 에멀전으로 유화시켜 제조하였다. 백신은 2회 접종하며 시험 시작 0주차에 1차 접종을 하고, 4주차에 2차 접종을 실시하였다. 15주차까지 매주 채혈하여 돼지 혈청을 분리하였다 (도 21). 분리된 혈청을 이용하여 ELISA kit (PrioCHECK FMDV Type O Andibody SP ELISA kit)를 통해서 항체가를 측정하였다. 대조군인 commercial vaccine은 바이오아토젠 FMD 백신을 이용하였다.
그 결과, 도 22에 나타난 바와 같이, 모든 개체에서 100% Percentage inhibition을 확인하였으며, 대조군과 비교하여 면역원성이 우수함을 확인하였다.
<실시예 6> 백신 후보 물질 농도에 따른 면역원성 검정
백신후보물질의 농도에 따라 항체가와 중화항체역가(VNT)를 평가하였다.
구체적으로, 백신은 2회 접종하며 시험 시작 0주차에 1차 접종을 하고, 4주차에 2차 접종을 실시하였다. O type과 A type에 대한 각각의 백신을 제작하고 적용하였다. 각각의 혈청형을 접종한 돼지에서 매주 혈청을 수거하였으며, 수거된 혈청을 이용하여 ELISA kit (PrioCHECK FMDV Type O Andibody SP ELISA kit, PrioCHECK FMDV Type A Andibody SP ELISA kit)를 통해 주차 별 항체가를 측정하였다. 대조군인 commercial vaccine은 바이오아토젠 FMD 백신을 이용하였다.
그 결과, 도 23에 나타난 바와 같이, O type은 모든 항원량에서의 항체가가 대조군과 동등한 결과를 나타내었다. A type은 저용량에서 대조군보다 2주 늦게 항체가가 50%를 달성하였고, 다른 용량에서는 모두 유사하게 증대하였다.
또한, 도 24에 나타난 바와 같이, 중화항체 역가(VNT)를 측정한 결과, O type은 모든 용량에서 2주차부터 32배를 달성하였고 이후 100배 이상으로 유지되었다. A type에서는 저용량에서는 중화항체가 늦게 형성되었고 중간용량은 2주차부터 증대하기 시작해서 점차 증대하였으며, 고용량에서는 2주차부터 32배를 달성하였다.
<실시예 7> 후보 백신 접종군에 대한 안전성 확인
백신 후보물질을 접종한 돼지의 피부를 조직병리학적으로 관찰하였다.
구체적으로, 사용된 백신 후보 물질은 혈청형 O에 대한 구조 단백질로 이뤄졌으며, VP4 Co-expression form으로부터 제작된 재조합 바이러스로부터 생산되었다. 백신은 2회 접종하며 시험 시작 0주차에 1차 접종을 하고, 4주차에 2차 접종을 실시하고 접종부위를 관찰하였다. 대조군인 commercial vaccine은 바이오아토젠 FMD 백신을 이용하였다.
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그 결과, 표 1, 도 25 및 도 26에 나타난 바와 같이, VP4 Co-exression form을 사용한 후보백신의 경우 전반적인 병변 형성의 정도가 낮음을 확인하였다. 한편, 대조군에서는 육안적 병변이 현저하게 관찰되었고, 심한 만성 육아종성 염증 소견을 확인하였으며 광범위한 근육세포의 변성 및 괴사가 진행됨을 확인하였다.
상기의 결과는 본 발명의 백신 후보 물질은 이상육의 발생의 부작용이 낮음을 의미한다.

Claims (13)

  1. 제1의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 구제역 바이러스(Foot and Mouth Disease Virus, FMDV) 단백질 VP2, VP3, VP1 및 3C를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 제2의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 FMDV 단백질 VP4를 암호화하는 유전자;를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1의 프로모터와 제2의 프로모터는 백터 내에서 반대방향으로 배열된 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 배큘로 바이러스 벡터에 의해 발현되는 것을 특징으로 하는, 재조합 발현 벡터.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 구제역 바이러스는 O, A, Asia1, C, SAT1, SAT2, 및 SAT3 혈청형으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 재조합 발현 벡터.
  6. 제1항 또는 제2항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된, 형질전환체.
  7. 제6항의 형질전환체에 의하여 생산되는, 바이러스 유사입자 (Virus-Like Particle, VLP) 또는 나노입자 (Nanoparticle, NP).
  8. (1) 제1항 또는 제2항의 재조합 발현 벡터를 제작하는 단계;
    (2) 상기 재조합 발현 벡터를 이용하여 형질전환체를 제조하는 단계;
    (3) 상기 형질전환체를 숙주세포에 형질감염(transfection)시키는 단계;
    (4) 상기 형질감염된 숙주세포를 배양하고, 그 배양물을 수득하는 단계; 및
    (5) 상기 배양물로부터 바이러스 유사 입자 또는 나노입자 수득하는 단계;
    를 포함하는, 구제역 바이러스 감염에 의한 질환 예방용 바이러스 유사 입자 또는 나노입자의 제조방법.
  9. 제7항의 바이러스 유사 입자 또는 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 구제역 바이러스의 백신 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 애쥬번트(adjuvant)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 애쥬번트는 오일 에멀전인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
  12. 제9항의 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 구제역 바이러스 감염에 의한 질환의 예방 방법.
  13. 구제역 바이러스 질환의 예방을 위한 제7항의 바이러스 유사 입자 또는 나노입자의 용도.
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PCT/KR2023/018972 WO2024112115A1 (ko) 2022-11-23 2023-11-23 구제역 바이러스 유사 입자 또는 나노입자 생산을 위한 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 백신 조성물

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