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WO2024090922A1 - 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 세포외소포를 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 세포외소포를 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Publication number
WO2024090922A1
WO2024090922A1 PCT/KR2023/016456 KR2023016456W WO2024090922A1 WO 2024090922 A1 WO2024090922 A1 WO 2024090922A1 KR 2023016456 W KR2023016456 W KR 2023016456W WO 2024090922 A1 WO2024090922 A1 WO 2024090922A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
culture medium
nervous system
stem cells
brain
preventing
Prior art date
Application number
PCT/KR2023/016456
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김윤배
최은경
김태명
박동선
Original Assignee
주식회사 디자인셀
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 디자인셀 filed Critical 주식회사 디자인셀
Publication of WO2024090922A1 publication Critical patent/WO2024090922A1/ko

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/50—Placenta; Placental stem cells; Amniotic fluid; Amnion; Amniotic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
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    • A23V2200/322—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on the health of the nervous system or on mental function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/20—Natural extracts
    • A23V2250/204—Animal extracts

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of brain nervous system diseases, comprising stem cell culture media and extracellular vesicles isolated therefrom as active ingredients.
  • Cerebral palsy is a disorder that includes impaired motor and posture development and is caused by various non-progressive damage to the brain during fetal or infancy. In patients with cerebral palsy, motor impairment is often accompanied by sensory, cognitive, communication, strabismus, visual perception, and behavioral impairments. Cerebral palsy can be caused by a variety of factors, but intrauterine infection or asphyxia during delivery are considered the main causes. It is known that the incidence of cerebral palsy is particularly high in premature babies, and it is well known that respiratory dysfunction is the main cause.
  • cerebral palsy is mainly carried out through rehabilitation treatment including physical, labor, language and psychological therapy, and treatments such as anti-cerebral palsy drugs, botulism injections, orthopedic surgery and orthotics are also used. .
  • rehabilitation treatment including physical, labor, language and psychological therapy, and treatments such as anti-cerebral palsy drugs, botulism injections, orthopedic surgery and orthotics are also used.
  • treatments such as anti-cerebral palsy drugs, botulism injections, orthopedic surgery and orthotics are also used.
  • cerebral palsy there is currently no fundamental treatment method that can actually treat cerebral palsy.
  • Republic of Korea Patent Publication No. 10-2021-0114946 relates to deutetrabenazine for the treatment of dyskinesia in cerebral palsy, and is administered at a dose of about 6 mg/day to about 48 mg/day to cerebral palsy patients in one or two doses. It is disclosed that administering a daily dose of deutetrabenazine at mg/day reduces abnormal involuntary movements in patients associated with dyskinesia in cerebral palsy.
  • the purpose of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of brain nervous system diseases containing stem cell culture medium and extracellular vesicles isolated therefrom as active ingredients.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cranial nervous system diseases comprising as an active ingredient at least one selected from the group consisting of stem cell culture medium and extracellular vesicles (extracellular vehicles (EV)) isolated therefrom.
  • Pharmaceutical compositions are provided.
  • the present invention provides a health functional food for preventing or improving cranial nervous system diseases containing as an active ingredient at least one selected from the group consisting of stem cell culture medium and extracellular vesicles isolated therefrom.
  • the present invention provides a method for preventing, improving, or treating a brain nervous system disease, comprising administering to an individual at least one selected from the group consisting of a stem cell culture medium and extracellular vesicles isolated therefrom.
  • the present invention provides the use of at least one selected from the group consisting of stem cell culture media and extracellular vesicles isolated therefrom for use in the production of drugs for preventing, improving, or treating cranial nervous system diseases.
  • the stem cell culture medium according to the present invention and the extracellular vesicles isolated therefrom are administered into the body, they move to brain tissue, protect neural stem cells and oligodendrocytes, suppress the expression of inflammatory factors, and inhibit the growth of oligodendrocytes. It can be useful in the treatment of cranial nervous system diseases by promoting differentiation and maturation and improving clinical symptoms in animal models of cerebral palsy.
  • Figure 1 is a photograph (A) showing the results of confirming the expression of exosome markers CD9, CD63, and CD81 in exosome-enriched culture medium (ERCM) of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells obtained in an example of the present invention (A).
  • the result of checking the number is a graph (B) and the result of observing exosomes under a microscope is a photo (C).
  • Figure 2 is a graph showing the results of confirming the expression of growth factors and neurotrophic factors in exosome-rich culture medium of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells obtained in an example of the present invention.
  • Figure 3 shows the results of confirming the degree of distribution within brain tissue according to the administration time of the exosome-rich culture medium of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells obtained in an example of the present invention (A) and the AUC analysis results of the result graph (B) This is a graph representing .
  • Figure 4 is a diagram showing the results of confirming the distribution of the normal culture medium of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells obtained in an example of the present invention in an animal model.
  • Figure 5 is a diagram showing the results of confirming the distribution of the exosome-rich culture medium of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells obtained in an example of the present invention in an animal model.
  • Figure 6 is a graph showing the results confirming the neural stem cell protection effect by LPS treatment of the exosome-rich culture medium of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells obtained in an example of the present invention.
  • Figure 7 is a graph showing the results confirming the neural stem cell protection effect by KCN treatment of the exosome-rich culture medium of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells obtained in an example of the present invention.
  • Figure 8 shows the results of confirming changes in the expression of proteins related to apoptosis or cell differentiation by treatment with LPS (A) or KCN (B) in the exosome-rich culture medium of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells obtained in an example of the present invention. am.
  • Figure 9 shows the results of confirming changes in expression of proteins related to oligodendrocyte differentiation by treatment with LPS (A) or KCN (B) in the exosome-rich culture medium of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells obtained in an example of the present invention. am.
  • Figure 10 is a graph showing the results confirming the protective effect of oligodendrocyte progenitor cells by LPS treatment of exosome-rich culture medium of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells obtained in an example of the present invention.
  • Figure 11 is a graph showing the results confirming the oligodendrocyte protection effect by KCN treatment of the exosome-rich culture medium of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells obtained in an example of the present invention.
  • Figure 12 shows the results of confirming changes in the expression of proteins related to apoptosis or cell differentiation by treatment with LPS (A) or KCN (B) in exosome-rich culture medium of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells obtained in an example of the present invention. am.
  • Figure 13 shows the results of confirming changes in expression of proteins related to oligodendrocyte differentiation by treatment with LPS (A) or KCN (B) in the exosome-rich culture medium of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells obtained in an example of the present invention. It is a drawing.
  • Figure 14 shows the results of confirming changes in expression of proteins related to oligodendrocyte maturation by treatment with LPS (A) or KCN (B) in the exosome-rich culture medium of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells obtained in an example of the present invention. It is a drawing.
  • Figure 15 is a graph showing the results of a cylinder test confirming the effect of treating cerebral palsy by an exosome-rich culture medium of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells obtained in an example of the present invention.
  • Figure 16 is a graph showing the results of confirming the treatment effect of cerebral palsy by the exosome-rich culture medium of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells obtained in an example of the present invention using a rotarod.
  • Figure 17 is a graph showing the results of confirming the effect of treating cerebral palsy by the exosome-rich culture medium of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells obtained in an example of the present invention using a passive avoidance test (A) or a water maze test (B).
  • Figure 18 is a graph showing the results of confirming changes in gene expression of inflammatory factors in the brain tissue of an animal model of cerebral palsy caused by exosome-rich culture medium of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells obtained in an example of the present invention.
  • Figure 19 is a diagram showing the results of confirming changes in the expression of proteins related to apoptosis or cell differentiation in the brain tissue of a cerebral palsy animal model by exosome-rich culture medium of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells obtained in an example of the present invention.
  • Figure 20 is a diagram showing the results of confirming the expression changes of proteins related to oligodendrocyte differentiation in the brain tissue of an animal model of cerebral palsy by exosome-rich culture medium of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells obtained in an example of the present invention.
  • Figure 21 is a diagram showing the results of confirming the expression changes of proteins related to oligodendrocyte maturation in the brain tissue of an animal model of cerebral palsy by exosome-rich culture medium of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells obtained in an example of the present invention.
  • Figures 22 and 23 are diagrams showing the results of confirming changes in the expression of growth factors and neurotrophic factors in the brain tissue of an animal model of cerebral palsy caused by exosome-rich culture medium of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells obtained in an example of the present invention.
  • Figure 24 is a diagram showing the results of confirming the expression of myelin protein in the brain tissue of a cerebral palsy animal model by exosome-rich culture medium of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells obtained in an example of the present invention.
  • Figure 25 is a diagram showing the results of simultaneously confirming the expression of PDGFR and SOX10 proteins in the brain tissue of a cerebral palsy animal model by exosome-rich culture medium of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells obtained in an example of the present invention.
  • Figure 26 is a diagram showing the results of simultaneously confirming the expression of PDGFR and Oligo2 proteins in the brain tissue of a cerebral palsy animal model by exosome-rich culture medium of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells obtained in an example of the present invention.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of brain nervous system diseases containing as an active ingredient at least one selected from the group consisting of stem cell culture medium and extracellular vesicles (extracellular vehicles (EV)) isolated therefrom.
  • stem cell culture medium and extracellular vesicles (extracellular vehicles (EV)) isolated therefrom.
  • extracellular vehicles (EV) extracellular vehicles
  • stem cell refers to a relatively underdeveloped, undifferentiated cell that has the ability to differentiate into cells of a specific tissue.
  • Stem cells can be divided into pluripotent stem cells, multipotent stem cells, or unipotent stem cells based on their differentiation ability.
  • the stem cells can be classified into embryonic stem cells, adult stem cells, or induced pluripotent stem cells (iPSC) produced from human somatic cells, depending on the cell of origin. You can.
  • the stem cells according to the present invention may be adult stem cells.
  • the term, adult stem cells refers to undifferentiated cells that exist in adult tissues or organs, can differentiate into desired cells, and can self-renew.
  • the stem cells according to the present invention may be amniotic membrane-derived adult stem cells.
  • the amniotic membrane-derived adult stem cells may be any one or more selected from the group consisting of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells and epithelial stem cells. .
  • the stem cell culture medium according to the present invention can be obtained by culturing stem cells under low oxygen concentration.
  • the low oxygen concentration may be lower than the average oxygen concentration of about 20% under normal atmosphere.
  • the low oxygen concentration is 10% or less, 0.1 to 10%, 0.1 to 8%, 0.1 to 5%, 0.1 to 4%, 1 to 10%, 1 to 8%, 1 to 5%, 1 to 4%. %, 2 to 10%, 2 to 8%, 2 to 5% or 2 to 4%.
  • the culture is performed for 1 to 80 hours, 1 to 70 hours, 1 to 60 hours, 1 to 50 hours, 10 to 80 hours, 10 to 70 hours, 10 to 60 hours, 10 to 50 hours, 20 to 80 hours, 20 to 70 hours, 20 to 60 hours, 20 to 50 hours, 30 to 80 hours, 30 to 70 hours, 30 to 60 hours, 30 to 50 hours, 40 to 80 hours, 40 to 70 hours, 40 to 60 hours, or It can be performed for 40 to 50 hours.
  • Stem cell culture medium cultured as described above may contain a higher level of exosomes compared to culture medium cultured under conventional conditions. That is, the stem cell culture medium may be an exosome-rich culture medium.
  • exosome-rich conditioned medium refers to a culture medium obtained by culturing stem cells having the characteristics described above. That is, the pharmaceutical composition according to the present invention can achieve the desired effect not only by stem cell culture medium but also by exosomes contained therein.
  • exosome refers to an extracellular vesicle (EV) with a membrane structure secreted from various types of cells.
  • the exosomes perform various functions such as binding to other cells or tissues and delivering membrane components, proteins, and RNA, and may generally have an average diameter of about 50 to 200 nm.
  • the exosomes can be identified using marker proteins contained therein.
  • the marker protein may include all types of marker proteins known in the art.
  • the marker protein may be the CD9 protein.
  • the stem cell culture medium according to the present invention may be filtered or concentrated to remove impurities as needed.
  • methods for isolating exosomes from the culture medium are also known in the art. The method may be appropriately modified and performed by a person skilled in the art as needed.
  • composition according to the present invention may include extracellular vesicles contained in stem cell culture medium having the characteristics described above as an active ingredient.
  • extracellular vehicle refers to a vesicle secreted from a cell and surrounded by a double phospholipid membrane like a cell membrane.
  • the extracellular vesicle may include all components known as extracellular vesicles in the art, and may specifically be one or more selected from the group consisting of exosomes and microvesicles.
  • Extracellular vesicles are known to serve as essential mediators for information exchange between cells, and contain specific proteins, mRNA, miRNA, ncRNA, etc. depending on the nature and state of the cell from which they are derived.
  • Extracellular vesicles are usually spherical with a diameter of 50 to 200 nm, and specific biomarkers are expressed on their membrane surface, and the biomarkers include integrins, MHC molecules, and cytoskeletal proteins. More specifically, the biomarker may be a tetraspanin protein such as CD9, CD63, and CD81.
  • microvesicle refers to an extracellular vesicle that has a phospholipid bilayer membrane with a diameter of 30 to 1,000 nm and is involved in communication between cells and transports mRNA, miRNA, etc.
  • microvesicles remove misfolding proteins, cytotoxic substances, and metabolic wastes from cells, and changes in the level of these microvesicles can cause diseases such as cancer. Unlike exosomes, they are formed through the process of membrane budding or exocytosis.
  • the cranial nervous system disease may include all diseases caused by abnormalities or disorders in some or all of the brain, spinal cord, cranial nerves, spinal nerves, and autonomic nervous system that constitute the cranial nervous system.
  • the cranial nervous system disease may be a brain damage disease.
  • the brain nervous system disease may be a nerve damage disease.
  • the brain nervous system diseases include cerebral palsy, brain injury, cerebral brain injury, ischemic brain injury, concussion, brain contusion, stroke, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, amyotrophic axonal sclerosis, primary axonal sclerosis, multiple sclerosis, nervous system dysfunction, or It may be degenerative ataxia.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may contain 10 to 95% by weight of the active ingredient, the stem cell culture medium, and the extracellular vesicles separated therefrom, based on the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include one or more active ingredients that exhibit the same or similar functions in addition to the above-mentioned effective ingredients.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include carriers, diluents, excipients, or mixtures thereof commonly used in biological products.
  • Any pharmaceutically acceptable carrier can be used as long as it is suitable for delivering the composition into the body.
  • the carrier is Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc., saline solution, sterile water, Ringer's solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, or mixtures thereof.
  • conventional additives such as antioxidants, buffers, bacteriostatic agents, etc. can be added as needed.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants may be added.
  • the composition of the present invention may be formulated as an oral preparation or a parenteral preparation.
  • Oral preparations may include solid preparations and liquid preparations.
  • the solid preparation may be a tablet, pill, powder, granule, capsule, or troche, and such solid preparation may be prepared by adding at least one excipient to the composition.
  • the excipient may be starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin, or mixtures thereof.
  • the solid preparation may contain a lubricant, examples of which include magnesium styrate and talc.
  • the liquid preparation may be a suspension, oral solution, emulsion, or syrup.
  • the liquid formulation may contain excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc.
  • the parenteral preparations may include injections, suppositories, powders for respiratory inhalation, aerosol preparations for sprays, powders, eye drops and creams.
  • the injection may include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, etc.
  • the non-aqueous solvent or suspension may be propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, or injectable ester such as ethyl oleate.
  • the present invention provides a health functional food for preventing or improving cranial nervous system diseases containing as an active ingredient at least one selected from the group consisting of stem cell culture medium and extracellular vesicles isolated therefrom.
  • the stem cell culture medium contained in the health functional food according to the present invention and the extracellular vesicles isolated therefrom may have the characteristics described above.
  • the brain nervous system disease may also have the characteristics described above.
  • the health functional food can be added as is to food with its active ingredient, stem cell culture medium, and extracellular vesicles isolated therefrom, or can be used together with other foods or food ingredients.
  • the content of the active ingredient added may be determined depending on the purpose, and may generally be 0.01 to 90 parts by weight of the total weight of the food.
  • the form and type of the health functional food are not particularly limited.
  • the health functional food may be in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, and pills.
  • the health functional food may contain various flavors, sweeteners, or natural carbohydrates as additional ingredients.
  • the sweetener may be a natural or synthetic sweetener, and examples of natural sweeteners include thaumatin and stevia extract. Meanwhile, examples of synthetic sweeteners include saccharin and aspartame.
  • the natural carbohydrate may be monosaccharide, disaccharide, polysaccharide, oligosaccharide, sugar alcohol, etc.
  • the health functional food of the present invention contains nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pexane and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, and preservatives. , glycerin, alcohol, etc. may be further included. These ingredients can be used independently or in combination.
  • the ratio of the additive may be selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the present invention provides a method for preventing, improving, or treating a brain nervous system disease, comprising administering to an individual at least one selected from the group consisting of a stem cell culture medium and extracellular vesicles isolated therefrom.
  • Stem cell culture medium and extracellular vesicles isolated therefrom used in the prevention, improvement or treatment method according to the present invention may have the characteristics described above.
  • the brain nervous system disease may also have the characteristics described above.
  • the subject may be a mammal, and may specifically be a human.
  • the administration may be oral or parenteral depending on the desired method.
  • Parenteral administration may include intraperitoneal, intrarectal, subcutaneous, intravenous, intramuscular, or intrathoracic injection.
  • the administration may be administered in a pharmaceutically effective amount. This may vary depending on the type of disease, severity, activity of the drug, patient's sensitivity to the drug, administration time, administration route, treatment period, drugs used simultaneously, etc. However, for a desirable effect, the amount of the active ingredient included in the administration may be 0.0001 to 1,000 mg/kg, specifically 0.001 to 500 mg/kg. The administration may be once or several times a day.
  • administration may be administered alone or in combination with other therapeutic agents.
  • administration may be sequential or simultaneous.
  • the present invention provides the use of at least one selected from the group consisting of stem cell culture media and extracellular vesicles isolated therefrom for use in the production of drugs for preventing, improving, or treating cranial nervous system diseases.
  • Stem cell culture medium and extracellular vesicles isolated therefrom used for manufacturing the drug according to the present invention may have the characteristics described above.
  • the brain nervous system disease may also have the characteristics described above.
  • AMMSC Human amniotic mesenchymal stem cells
  • the collected amniotic tissue was treated with collagenase I, an equal amount of culture medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) was added, and centrifuged at 1,500 rpm for 10 minutes. The supernatant was removed, the pellet was washed twice, and red blood cells were lysed with RBC lysis buffer. The remaining cells from the lysate were suspended in keratinocyte serum-free medium (SFM, Invitrogen, USA) containing 5% FBS, 100 unit/ml of penicillin, and 100 mg/ml of streptomycin. The suspension was cultured under conditions of 37°C and 5% CO 2 while the culture medium was replaced every 2 to 3 days. By analyzing the cultured stem cells using a flow cytometry system to identify marker genes, it was confirmed that the stem cells were amniotic mesenchymal stem cells.
  • FBS fetal bovine serum
  • the human amniotic mesenchymal stem cells obtained above were cultured as follows to prepare an exosome-rich culture medium.
  • the human amniotic mesenchymal stem cells were placed in a hyper flask (Nunc, USA) and suspended in serum-free medium. It was cultured for 3 days under 5% carbon dioxide and 2% oxygen conditions. The culture medium was taken and filtered using a bottle-top vacuum filter system (0.22 ⁇ m, PES membrane, Corning, USA). The filtered culture medium was concentrated 30 times using Vivaflow-200 (Sartorius, Germany) and freeze-dried to prepare an exosome-rich conditioned medium. Meanwhile, a culture medium in which the human amniotic mesenchymal stem cells and epithelial stem cells were cultured under 20% oxygen was prepared as a normal conditioned medium.
  • exosomes present in the exosome-rich culture medium obtained above were analyzed by confirming the expression of exosome markers CD9, CD63, and CD81.
  • exosomes were isolated from the prepared exosome-rich culture medium by a conventional method.
  • the amount of protein in the isolated exosomes was quantified using a protein DC assay kit (Bio-Rad Laboratories, USA), and 25 ⁇ g was taken and mixed with 6 ⁇ denaturation buffer, and incubated at 95°C for 10 minutes.
  • the protein was denatured by reacting for a while.
  • the denatured protein was subjected to electrophoresis using a 12% SDS-polyacrylamide gel and transferred to an immobilon-P PVDF membrane. To prevent non-specific binding with antibodies, the membrane was pretreated in 5% skim milk.
  • the pretreated PVDF membrane was washed, and primary antibodies against CD9, CD63, or CD81 proteins (1:1000, Abcam, UK) were added and reacted overnight. After the reaction was over, the PVDF membrane was washed with TBS-T buffer containing 0.1% Tween-20, treated with a secondary antibody, HRP-conjugated anti-mouse antibody (1:2000, Abcam, UK), and incubated at room temperature. The reaction was again conducted for 2 hours. After the reaction was over, the PVDF membrane was washed with TBS-T buffer, checked with the WestFemto maximum sensitivity substrate kit, and the resulting image was captured with a ChemiDoc Imager (Bio-Rad Laboratories, USA). was analyzed. As a result, the expression levels of CD9, CD63, and CD81 were photographed and the results are shown in Figure 1A.
  • Exosomes present in the exosome-rich culture medium obtained above were quantitatively confirmed using the NTA system (Nanosight NS300, NanoSight, UK). At this time, all analysis samples were diluted 1:1000 to prepare 1.0 ⁇ 10 8 particles/ml. As a result, the content of exosomes is shown in Figure 1B, and the results of observing exosomes using transmission electron microscopy (TEM) are shown in Figure 1C.
  • exosomes were confirmed in the culture medium of amniotic mesenchymal stem cells cultured under conditions of low oxygen concentration, and specifically contained 4.5 ⁇ 10 10 exosomes/ml. Meanwhile, 9.0 ⁇ 10 8 exosomes/ml were confirmed in the amniotic mesenchymal stem cell culture medium cultured under normal conditions.
  • the isolated exosomes had a size of approximately 68 nm.
  • the growth factors and neurotrophic factors present in the exosome-rich culture medium obtained above were analyzed as follows. Specifically, fibroblast growth factor (FGF), elongation factor G (EFG), platelet-derived growth factor (PDGF), insulin-like growth factor (IGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), and transforming growth factor (TGF- ⁇ ). - ⁇ ), BDNF (brain-derived neurotrophic factor), and PDGF (platelet-derived growth factor) protein expression levels were confirmed using ELISA analysis according to the manufacturer's protocol. At this time, normal culture medium was used as a control, and the expression levels of the identified growth factors and neurotrophic factors are shown in Figure 2.
  • FGF fibroblast growth factor
  • EGF elongation factor G
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • TGF- ⁇ transforming growth factor
  • - ⁇ BDNF (brain-derived neurotrophic factor)
  • Sprague-Dawley rats at 9 weeks of gestation were prepared by rearing at a constant temperature of 23 ⁇ 3°C and relative humidity of 50 ⁇ 10% with a 12-hour light/dark cycle. When reared, they were fed a standard rodent diet and water was provided ad libitum. Pregnant rats gave birth through vaginal delivery, and 5 days later, the left common carotid artery was occluded by surgery, placed in a hypoxia incubator (Don Whitley Scientific, UK), and exposed to 8% O 2 and 92% N 2 for 2 hours. . Thereafter, the sutures of the baby rats were removed to induce reperfusion, and after recovery for 30 minutes, 1 mg/kg LPS was injected intraperitoneally to induce inflammation.
  • Exosome-rich culture medium containing 10 ⁇ 10 12 particles was mixed with 2 ⁇ l of ExoGlowTM-Vivo fluorescence dye and reacted at room temperature for 2 hours to determine the presence of exosome-rich culture medium.
  • the exosomes were labeled.
  • the reactant was filtered in a conventional manner using a column filled with Sepharose CL-6B to remove the fluorescent dye that was not labeled in the exosomes.
  • Seven days after birth 4.5 ⁇ 10 10 pn of exosome-rich culture medium was administered to the baby rat in which cerebral palsy was induced in Experimental Example 2-1 through the tail vein. At this time, normal rats were used as a control group.
  • Brain extraction was performed after completely anesthetizing the rat and perfusing the whole body with PBS through the heart for 5 minutes.
  • the fluorescence intensity from the extracted brain was measured at a wavelength in the near-infrared range (excitation: 784 nm, emission: 806 nm), and the measured results are shown in Figure 3A, and the results of AUC analysis using the results are shown in Figure 3B.
  • pictures of the fluorescence intensity were shown in Figures 4 and 5.
  • the F3 cell line a human neural stem cell line
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium, Biowest, France
  • penicillin and streptomycin as antibiotics
  • 10% heat-inactivated FBS at 37°C and 5% CO 2 conditions. It was cultured in .
  • the prepared F3 cell line was dispensed into a culture dish with a diameter of 10 cm and cultured for 24 hours, and then the cultured cells were washed with PBS.
  • Washed cells were treated with 10 ⁇ g/ml of lipopolysaccharide (LPS) or potassium cyanide (KCN) at 5 ⁇ M, and simultaneously treated with 10, 30, or 100 ⁇ g/ml of exosome-rich culture medium. At this time, the concentration of exosomes was confirmed using the commonly used BCA method. After culturing the cells for 24 hours, the content of LDH (lactate dehydrogenase) released into the culture medium was confirmed using an LDH assay kit (Promega, USA) according to the manufacturer's protocol. Meanwhile, the mRNA expression levels of inflammatory factors were confirmed by performing qRT-PCR using a conventional method, and the sequences of the primers used are shown in Table 1 below.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • Bax protein which is related to apoptosis
  • Bcl-2 a protein that inhibits apoptosis
  • AKT and PI3K proteins related to cell differentiation
  • the protective effect of the exosome-rich culture medium obtained above on oligodendrocyte progenitor cells from damage caused by prenatal factors or hypoxia was confirmed by the following method.
  • the experiment was performed in the same manner as Experiment 3 above, except that the F3.Olig2 cell line was used instead of the F3 cell line.
  • the results of confirming the concentration of LDH and mRNA expression of inflammatory factors are shown in Figures 10 and 11, and the results of confirming the expression of proteins related to apoptosis or differentiation are shown in Figures 12 to 14.
  • the concentration of LDH and the mRNA expression of inflammatory factors which were significantly increased by treatment with LPS or KCN, were suppressed in a treatment concentration-dependent manner in the exosome-rich culture medium.
  • Bax protein which is associated with apoptosis, significantly increased by treatment with LPS or KCN, was suppressed by exosome-rich culture medium
  • Bcl-2 a protein that inhibits apoptosis, was expressed in exosomes. Expression was increased by treatment with worm-rich cultures.
  • AKT and PI3K proteins related to cell differentiation, was also significantly increased by treatment with exosome-rich culture medium.
  • CNPase (2'3'-cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase) and MBP (myelin basic protein) proteins, which are proteins related to the maturation of oligodendrocytes, increased upon treatment of LPS or KCN.
  • MBP myelin basic protein
  • an exosome-rich culture medium was administered into the tail vein of a baby rat in which cerebral palsy was induced through the procedure. At this time, in the case of one-time administration, the dose was 1.5 was administered. Then, on the 10th, 20th, 30th or 40th day after birth of the baby rat, the rat was placed in a glass cylinder with a diameter of 21 cm and a length of 34 cm and the front paw was in contact with the wall of the carrier for 3 minutes. If the weight bearing was on the left paw, Normal, if caught on the right side, it was recorded as damaged. From the above results, foot preference (%) was calculated using Equation 1 below, and the results are shown in Figure 15.
  • rats with induced brain damage had a decreased preference for using the forelimb opposite to the brain injury area, but this was significantly recovered due to the administration of exosome-rich culture medium, and both forelimbs were used on the 20th to 40th day after birth. was used in similar proportions.
  • the animal model administered the exosome-rich culture medium was placed on a rod rotating at a constant speed of 12 rpm, and the time it maintained balance on the rod was recorded. Recordings were performed on the 10th, 20th, 30th, or 40th day after birth of the baby rats, and were repeated three times, and the average values are shown in Figure 16.
  • the animal model administered the exosome-rich culture medium was tested once a day for 5 days starting on the 41st day after birth using a passive avoidance box (Med Associated). Specifically, the animal was placed in the bright room of a passive avoidance box divided into a dark room and a bright room, and when the animal moved to the dark room, an electric shock was applied at 1 mA for 2 seconds. Afterwards, in the same test, memory was evaluated by measuring the time the animal stayed in the bright room to confirm the memory caused by the electric shock in the dark room. At this time, a residence time of 300 seconds was evaluated as complete recovery of memory, and the evaluated results are shown in Figure 17A.
  • a passive avoidance box Med Associated
  • rats with induced brain damage had a reduced residence time in the bright room, but this was recovered by administration of exosome-rich culture medium.
  • a water maze test was performed once a day for 5 days starting from day 41 of birth using an animal model administered with an exosome-rich culture medium.
  • a hidden platform device fills a circular tank with water to a depth of 27 cm, maintains the temperature at 22 ⁇ 2°C, and fills the water surface with Styrofoam to cover the refuge platform 2 cm below the water surface. , 10 cm in diameter, 25 cm in height) was installed.
  • a baby rat was placed in a water tank, and the time required to memorize the markers around the tank and find a platform located at a certain location in the tank was measured. As a result, the time required to find the platform is shown in Figure 17B.
  • the brain tissue of the animal model administered the exosome-rich culture medium was sacrificed and obtained after the experiment was completed, and changes in gene expression of inflammatory factors in the obtained brain tissue were confirmed.
  • the experiment was performed in the same manner as Experiment 3 above, except that rat brain tissue was used instead of the F3 cell line, and in this case, the primers listed in Table 2 below were used. As a result, the results of confirming the mRNA expression of inflammatory factors are shown in Figure 18.
  • the mRNA expression of inflammatory factors was significantly increased in the brain tissue of rats induced with cerebral palsy, but this was significantly suppressed by the administration of exosome-rich culture medium.
  • the exosome-rich culture medium was administered three times repeatedly, the mRNA expression of inflammatory factors was suppressed to normal levels.
  • the brain tissue of the animal model administered the exosome-rich culture medium was sacrificed and obtained after the experiment was completed, and changes in protein expression in the obtained brain tissue were confirmed by Western blot.
  • the experiment tested Bax, Bcl-2, p-AKT, p-PI3K, PDGFR A, SOX10, Nkx2.2, Oligo2, NT3 (neurotrophin-3), NGF (nerve growth factor), BDNF, CNTF (ciliary neurotrophic factor), glial cell-derived growth factor (GDNF), PDGF A, platelet-derived growth factor B (PDGF B), CNPase, MBP, or actin protein. It was performed in the same manner as described above. The results of confirming the expression changes of the above proteins are shown in Figures 19 to 23.
  • neurotrophic factors NT3, NGF, BDNF, CNTF, GDNF, PDGF A, and PDGF B proteins were also significantly increased by treatment with exosome-rich culture medium.
  • the brain tissue of the animal model administered the exosome-rich culture medium was sacrificed and obtained after the experiment was completed.
  • the obtained brain tissue was perfused with a 10% paraformaldehyde solution and then placed in the same solution and fixed for 48 hours.
  • the fixed brain tissue was cryoprotected for 72 hours using a 30% sucrose solution, and the brain tissue was cut into 10 ⁇ m thick cross sections to obtain samples.
  • the obtained sample was treated with LFB dye, and images were observed and photographed under a microscope, and the results are shown in FIG. 24.
  • the concentration of myelin was significantly decreased due to the induction of cerebral palsy, but this was recovered by administration of exosome-rich culture medium. In particular, when exosome-rich culture medium was administered three times, it recovered to normal levels.
  • brain tissue was cryoprotected by the method described in Experimental Example 8, and a coronal cryosection was obtained by cutting at a thickness of 10 ⁇ m at a position of 1.0 mm from bregma.
  • the obtained fragments were washed with TBS (Tris-buffered saline) buffer and treated with 3% hydrogen peroxide for 5 minutes to inhibit endogenous peroxidase activity.
  • the sections were washed again with TBS buffer and pretreated with 5% BSA.
  • the pretreated sections were treated with a primary antibody (1:300, rabbit polyclonal antibody, Chemicon, USA) that specifically binds to PDGFR and reacted at 4°C overnight.
  • PDGFR protein As shown in Figures 25 and 26, the expression of PDGFR protein was decreased in rats with cerebral palsy, but this was recovered by administration of exosome-rich culture medium. Additionally, PDGFR-positive cells also had high expression of SOX10 and Oligo2 proteins.

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Abstract

본 발명은 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 세포외소포를 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 세포외소포는 체내로 투여되었을 때 뇌 조직으로 이동하여 신경줄기세포 및 희소돌기아교세포를 보호하고, 염증성 인자들의 발현을 억제하며, 희소돌기아교세포의 분화 및 성숙을 촉진하고, 뇌성마비 동물모델에서 임상증상을 개선함으로써, 뇌신경계 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 세포외소포를 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 세포외소포를 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
뇌성마비(cerebral palsy)는 운동 및 자세 발달 손상을 포함하는 장애의 하나로, 태아 또는 유아기에 뇌에 다양한 비진행성 손상을 입어 발생한다. 뇌성마비 환자에서 운동 장애는 흔히 감각, 인지, 의사소통, 사시, 시지각 및 행동 장애를 동반한다. 뇌성마비는 다양한 요인에 의해 발생할 수 있으나, 그중에서 자궁내 감염 또는 분만 중 질식이 주요한 원인으로 간주된다. 특히 미숙아에서 뇌성마비의 발병률이 높은 것으로 알려져 있는데, 이는 호흡 기능 장애가 주된 원인이라는 것이 잘 알려져 있다. 현재 뇌성마비의 치료는 신체, 노동, 언어 및 심리 치료를 포함하는 재활 치료를 통해 주로 진행되고 있으며, 항-뇌성마비 약물, 보툴리누스균의 주사, 정형외과적 수술 및 보조기 등의 치료법이 함께 사용되고 있다. 그러나, 실제로 뇌성마비를 치료할 수 있는 근본적인 치료방법은 없는 실정이다.
이에, 최근 연구자들은 뇌 가소성의 가능성을 자극하여 뇌성마비 치료의 잠재적 효과를 나타낼 수 있다고 보고하였으며, 이는 뇌손상 환자에서 긍정적인 효과를 나타내었다. 이는 성인에서보다 소아의 뇌에서 높은 잠재적 가소성을 갖는다고 예상되는데, 이는 뇌손상이 있는 어린 래트(생후 10일)가 뇌손상이 있는 늙은 래트(생후 63일 이후)에 비해 빠르고 완전한 회복을 보이는 점에서 알 수 있다.
또한, 대한민국 특허공개 제10-2021-0114946호는 뇌성마비에서의 운동이상증의 치료를 위한 듀테트라베나진에 관한 것으로, 뇌성마비 환자에게 1회 또는 2회 용량으로 약 6 ㎎/일 내지 약 48 ㎎/일의 듀테트라베나진의 1일량을 투여하여 뇌성마비에서 운동이상증과 관련된 환자의 비정상 불수의 운동이 감소됨을 개시하고 있다.
본 발명의 목적은 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 세포외소포를 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 세포외소포(extracellular vehicle, EV)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 세포외소포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 세포외소포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 뇌신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 세포외소포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 세포외소포는 체내로 투여되었을 때 뇌 조직으로 이동하여 신경줄기세포 및 희소돌기아교세포를 보호하고, 염증성 인자들의 발현을 억제하며, 희소돌기아교세포의 분화 및 성숙을 촉진하고, 뇌성마비 동물모델에서 임상증상을 개선함으로써, 뇌신경계 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액(ERCM)에서 엑소좀의 마커인 CD9, CD63 및 CD81의 발현을 확인한 결과 사진(A), 엑소좀의 수를 확인한 결과 그래프(B) 및 현미경으로 엑소좀을 관찰한 결과 사진(C)이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액에서 성장인자 및 신경영양인자의 발현을 확인한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액의 투여 시간에 따른 뇌 조직내 분포 정도를 확인한 결과(A) 및 상기 결과 그래프의 AUC 분석 결과(B)를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 정상 배양액의 동물모델 내 분포를 확인한 결과 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액의 동물모델 내 분포를 확인한 결과 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액의 LPS 처리에 의한 신경줄기세포 보호 효과를 확인한 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액의 KCN 처리에 의한 신경줄기세포 보호 효과를 확인한 결과 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액의 LPS(A) 또는 KCN(B) 처리에 의한 세포사멸 또는 세포분화 관련 단백질의 발현 변화를 확인한 결과 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액의 LPS(A) 또는 KCN(B) 처리에 의한 희소돌기아교세포 분화 관련된 단백질의 발현 변화를 확인한 결과 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액의 LPS 처리에 의한 희소돌기아교 전구세포 보호 효과를 확인한 결과 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액의 KCN 처리에 의한 희소돌기아교 보호 효과를 확인한 결과 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액의 LPS(A) 또는 KCN(B) 처리에 의한 세포사멸 또는 세포분화 관련 단백질의 발현 변화를 확인한 결과 도면이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액의 LPS(A) 또는 KCN(B) 처리에 의한 희소돌기아교세포 분화와 관련된 단백질의 발현 변화를 확인한 결과 도면이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액의 LPS(A) 또는 KCN(B) 처리에 의한 희소돌기아교세포 성숙과 관련된 단백질의 발현 변화를 확인한 결과 도면이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액에 의한 뇌성마비 치료 효과를 실린더 테스트로 확인한 결과 그래프이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액에 의한 뇌성마비 치료 효과를 로타로드로 확인한 결과 그래프이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액에 의한 뇌성마비 치료 효과를 수동회피시험(A) 또는 수중미로시험(B)으로 확인한 결과 그래프이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액에 의한 뇌성마비 동물 모델의 뇌조직 내 염증성 인자들의 유전자 발현 변화를 확인한 결과 그래프이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액에 의한 뇌성마비 동물 모델의 뇌조직 내 세포사멸 또는 세포분화 관련 단백질의 발현 변화를 확인한 결과 도면이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액에 의한 뇌성마비 동물 모델의 뇌조직 내 희소돌기아교세포 분화와 관련된 단백질의 발현 변화를 확인한 결과 도면이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액에 의한 뇌성마비 동물 모델의 뇌조직 내 희소돌기아교세포 성숙과 관련된 단백질의 발현 변화를 확인한 결과 도면이다.
도 22 및 23은 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액에 의한 뇌성마비 동물 모델의 뇌조직 내 성장인자 및 신경영양인자의 발현 변화를 확인한 결과 도면이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액에 의한 뇌성마비 동물 모델의 뇌조직 내 미엘린 단백질의 발현을 확인한 결과 도면이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액에 의한 뇌성마비 동물 모델의 뇌조직 내 PDGFR 및 SOX10 단백질의 발현을 동시에 확인한 결과 도면이다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에서 수득된 양막 유래 중간엽 줄기세포의 엑소좀 풍부 배양액에 의한 뇌성마비 동물 모델의 뇌조직 내 PDGFR 및 Oligo2 단백질의 발현을 동시에 확인한 결과 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 세포외소포(extracellular vehicle, EV)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "줄기세포(stem cell)"는 상대적으로 발생이 덜된 미분화된 세포로서 특정 조직의 세포로 분화할 수 있는 능력을 지닌 세포를 의미한다. 줄기세포는 분화 능력을 기준으로 만능줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell) 또는 단분화능 줄기세포(unipotent stem cell)로 나눌 수 있다. 또한, 상기 줄기세포는 기원이 되는 세포에 따라 배아 줄기세포(embryonic stem cell), 성체 줄기세포(adult stem cell) 또는 인간 체세포로부터 제조된 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)로 구분될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 줄기세포는 성체 줄기세포일 수 있다. 상기 용어, 성체 줄기세포는 성체의 조직 또는 기관에 존재하고, 원하는 세포로 분화가 가능하며 자기복제(self-renew)를 할 수 있는 미분화된 세포를 의미한다. 일례로, 본 발명에 따른 줄기세포는 양막 유래 성체줄기세포일 수 있고, 구체적으로, 상기 양막 유래 성체줄기세포는 양막 유래 중간엽 줄기세포 및 상피줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 줄기세포 배양액은 낮은 산소 농도하에서 줄기세포를 배양함으로써 수득될 수 있다. 상기 낮은 산소 농도는 통상적인 대기하에서의 평균 산소농도인 약 20%보다 낮은 농도일 수 있다. 구체적으로, 상기 낮은 산소 농도는 10% 이하, 0.1 내지 10%, 0.1 내지 8%, 0.1 내지 5%, 0.1 내지 4%, 1 내지 10%, 1 내지 8%, 1 내지 5%, 1 내지 4%, 2 내지 10%, 2 내지 8%, 2 내지 5% 또는 2 내지 4%일 수 있다. 또한, 상기 배양은 1 내지 80시간, 1 내지 70시간, 1 내지 60시간, 1 내지 50시간, 10 내지 80시간, 10 내지 70시간, 10 내지 60시간, 10 내지 50시간, 20 내지 80시간, 20 내지 70시간, 20 내지 60시간, 20 내지 50시간, 30 내지 80시간, 30 내지 70시간, 30 내지 60시간, 30 내지 50시간, 40 내지 80시간, 40 내지 70시간, 40 내지 60시간 또는 40 내지 50시간 동안 수행될 수 있다.
상기와 같이 배양된 줄기세포 배양액은 통상적인 조건에서 배양된 배양액과 비교하여, 더 높은 수준의 엑소좀을 포함할 수 있다. 즉, 상기 줄기세포 배양액은 엑소좀 풍부 배양액일 수 있다. 상기 용어, "엑소좀 풍부 배양액(exosome-rich conditioned medium, ERCM)"은 상기 서술한 바와 같은 특징을 갖는 줄기세포를 배양하여 수득된 배양액을 의미한다. 즉, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 줄기세포 배양액뿐 아니라 이에 포함되는 엑소좀에 의해서도 목적하는 효과를 달성할 수 있다.
상기 용어, "엑소좀(exosome)"은 여러 종류의 세포로부터 분비되는 막 구조의 세포외소포체(extracellular vesicle, EV)를 의미한다. 상기 엑소좀은 다른 세포나 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등 다양한 기능을 하며, 일반적으로 약 50 내지 200 ㎚의 평균 직경을 가질 수 있다. 상기 엑소좀은 이에 포함되는 마커 단백질을 이용하여 확인할 수 있다. 상기 마커 단백질은 통상의 기술분야에 알려진 모든 종류의 마커 단백질을 포함할 수 있고, 일례로, 상기 마커 단백질은 CD9 단백질일 수 있다.
본 발명에 따른 줄기세포 배양액은 필요에 따라 불순물을 제거하기 위해 여과되거나, 농축될 수 있다. 또한, 상기 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 방법 또한 통상의 기술분야에 자명하다. 상기 방법은 필요에 따라 통상의 기술자에 의해 적절히 변형되어 수행될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 조성물은 상기 서술한 바와 같은 특징을 갖는 줄기세포 배양액에 포함되는 세포외소포를 유효성분으로 포함할 수 있다.
상기 용어, "세포외소포(extracellular vehicle, EV)"는 세포로부터 분비되고, 세포막과 동일하게 이중 인지질막으로 둘러싸인 소포를 의미한다. 상기 세포외소포는 통상의 기술분야에 세포외소포로 알려진 모든 성분을 포함할 수 있으며, 구체적으로 엑소좀(exosome) 및 미세소포(microvesicle)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 세포외소포는 세포 사이의 정보교환에 필수적인 매개체 역할을 하는 것으로 알려져 있고, 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 단백질, mRNA, miRNA, ncRNA 등을 포함한다. 세포외소포는 보통 50 내지 200 ㎚의 직경을 갖는 구형으로, 이의 막 표면에 특이적인 바이오마커가 발현되어 있으며, 상기 바이오마커는 인테그린, MHC 분자, 세포골격 단백질 등이 포함되어 있다. 더욱 구체적으로, 상기 바이오마커는 CD9, CD63 및 CD81과 같은 테트라스패닌(tetraspanin) 단백질일 수 있다.
상기 용어, "미세소포(microvesicle)"는 세포외소포의 하나로서, 30 내지 1,000 ㎚의 직경을 갖는 인지질 이중층막을 가지며 세포 사이의 통신에 관여하고 mRNA, miRNA 등을 운반한다. 또한, 미세소포는 미스폴딩(misfolding) 단백질, 세포독성 물질, 대사 폐기물 등을 세포 내에서 제거하며, 이들 미세소포 수준의 변화에 의해 암과 같은 질병이 유발될 수 있다. 엑소좀과 달리 막 발아(membrane budding) 또는 엑소사이토시스(exocytosis) 과정을 통해 형성된다.
줄기세포 배양액으로부터 세포외소포를 분리하는 것은 통상의 기술분야에 잘 알려져 있다.
상기 뇌신경계 질환은 뇌신경계를 구성하는 뇌, 척수, 뇌신경, 척수신경, 자율신경계 등에서 이들의 일부 또는 전부에 이상이나 장애가 발생하여 생성된 질환을 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 일 측면에서, 상기 뇌신경계 질환은 뇌손상 질환일 수 있다. 또한, 본 발명의 다른 측면에서, 상기 뇌신경계 질환은 신경손상 질환일 수 있다. 구체적으로, 상기 뇌신경계 질환은 뇌성마비, 뇌손상, 뇌상성 뇌손상, 허혈성 뇌손상, 뇌진탕, 뇌타박상, 뇌졸중, 뇌경색, 뇌출혈, 근위축송축삭경화증, 원발성축삭경화증, 다발성경화증, 신경계 기능장애 또는 퇴행성 운동 실조증일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 세포외소포를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 담체는 Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등과 같은 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 조성물을 제제화하는 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구용 제제 또는 비경구용 제제로 제형화될 수 있다. 경구용 제제로는 고형 제제 및 액상 제제가 포함될 수 있다. 상기 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 또는 트로키제일 수 있고, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제를 첨가하여 조제할 수 있다. 상기 부형제는 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 윤활제를 포함할 수 있고, 그 예로는 마그네슘 스티레이트, 탈크 등이 있다. 한편, 상기 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제일 수 있다. 이때, 상기 액상 제제에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.
상기 비경구용 제제는 주사제, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 파우더, 안약 및 크림 등을 포함할 수 있다. 상기 주사제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등을 포함할 수 있다. 이때, 비수성용제 또는 현탁용제로서는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름이나, 에틸올레이트와 같이 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 세포외소포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 건강기능식품에 포함되는 줄기세포 배양액 및 이로부터 분리된 세포외소포는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 상기 뇌신경계 질환 또한 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
상기 건강기능식품은 이의 유효성분인 줄기세포 배양액 및 이로부터 분리된 세포외소포를 식품에 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있다. 이때, 첨가되는 유효성분의 함량은 목적에 따라 결정될 수 있고, 일반적으로는 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부일 수 있다.
상기 건강기능식품의 형태 및 종류는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환의 형태일 수 있다. 상기 건강기능식품은 추가성분으로서 여러 가지 향미제, 감미제 또는 천연 탄수화물을 포함할 수 있다. 상기 감미제는 천연 또는 합성 감미제일 수 있고, 천연 감미제의 예로는 타우마틴, 스테비아 추출물 등이 있다. 한편, 합성 감미제의 예로는 사카린, 아스파르탐 등이 있다. 또한, 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고당 및 당알코올 등일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 서술한 추가성분 외에, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙스탄 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물의 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 세포외소포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 예방, 개선 또는 치료 방법에 사용되는 줄기세포 배양액 및 이로부터 분리된 세포외소포는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 상기 뇌신경계 질환 또한 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
상기 개체는 포유동물일 수 있고, 구체적으로 인간일 수 있다.
상기 투여는 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구일 수 있다. 비경구 투여는 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있다.
상기 투여는 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 상기 투여에 포함되는 유효성분의 양은 0.0001 내지 1,000 ㎎/㎏, 구체적으로 0.001 내지 500 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회 또는 수회일 수 있다.
상기 투여는 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.
나아가, 본 발명은 뇌신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 세포외소포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 약제의 제조에 사용되는 줄기세포 배양액 및 이로부터 분리된 세포외소포는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 상기 뇌신경계 질환 또한 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다, 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
실시예 1. 양막 유래 줄기세포의 준비
인간 양막 중간엽 줄기세포(AMMSC)를 우수제조관리기준(디자인셀, 한국)에 따라 다음과 같은 방법으로 준비하였다.
먼저, 채취된 양막 조직에 콜라게나아제 I(collagenase I)을 처리하고, 동량의 10% FBS(fetal bovine serum)을 포함하는 배양배지를 첨가하여 1,500 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 펠렛을 2회 세척한 후, 적혈구를 RBC 용해완충액으로 용해시켰다. 상기 용해물에서 남은 세포를 5% FBS, 100 unit/㎖의 페니실린 및 100 ㎎/㎖의 스트렙토마이신이 포함된 각질형성세포(keratinocyte) 무혈청 배지(SFM, Invitrogen, 미국)에 현탁시켰다. 상기 현탁액을 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 배양하면서 2 내지 3일마다 배양배지를 교체하였다. 배양된 줄기세포를 유세포 분석 시스템으로 분석하여 마커 유전자를 확인함으로써, 상기 줄기세포가 양막 중간엽 줄기세포인 것을 알 수 있었다.
실시예 2. 엑소좀 풍부 배양액의 제조
상기 수득된 인간 양막 중간엽 줄기세포를 다음과 같이 배양하여 엑소좀 풍부 배양액을 제조하였다.
구체적으로, 상기 인간 양막 중간엽 줄기세포를 하이퍼 플라스크(hyper flask, Nunc, 미국)에 넣고, 무혈청 배지로 현탁하였다. 이를 5% 이산화탄소 및 2% 산소 조건하에서 3일 동안 배양하였다. 상기 배양액을 취하여 병뚜껑 진공 필터 시스템(bottle-top vacuum filter system, 0.22 ㎛, PES membrane, Corning, 미국)을 사용하여 여과하였다. 여과된 배양액을 비바플로우-200(vivaflow-200, Sartorius, 독일)을 사용하여 30배 농축하고, 동결건조함으로써, 엑소좀 풍부 배양액(exosome-rich conditioned medium)을 제조하였다. 한편, 상기 인간 양막 중간엽 줄기세포 및 상피줄기세포를 20% 산소하에서 배양한 배양액을 정상 배양액(normal conditioned medium)으로서 준비하였다.
실시예 3. 엑소좀 확인-(1)
상기에서 수득된 엑소좀 풍부 배양액 내 존재하는 엑소좀을 엑소좀 표지자인 CD9, CD63 및 CD81의 발현을 확인하여 분석하였다.
먼저, 상기 준비된 엑소좀 풍부 배양액으로부터 엑소좀을 통상적인 방법으로 분리하였다. 분리된 엑소좀의 단백질량을 단백질 DC 분석 키트(protein DC assay kit, Bio-Rad Laboratories, USA)로 정량하고, 25 ㎍을 취하여 6× 변성 완충액(denaturation buffer)과 혼합하고, 95℃에서 10분 동안 반응시켜 단백질을 변성시켰다. 변성된 단백질은 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 전기영동하고, 임모빌온-P PVDF 막(immobilon-P PVDF membrane)으로 옮겼다. 항체와의 비특이적 결합을 막기 위해 상기 막을 5% 탈지유에 넣고 전처리하였다. 전처리된 PVDF 막을 세척하고, CD9, CD63 또는 CD81 단백질에 대한 1차 항체(1:1000, Abcam, 영국)를 첨가하여 하룻밤 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, PVDF 막을 0.1% Tween-20이 포함된 TBS-T 완충액으로 세척하고 여기에 2차 항체인 HRP-결합된 항-마우스 항체(1:2000, Abcam, 영국)를 처리하고 실온에서 다시 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, PVDF 막을 TBS-T 완충액으로 세척하고, 웨스트펨토 맥시멈 민감성 기질 키트(WestFemto maximum sensivity substrate kit)로 확인하고, 결과 이미지를 케미독 이미저(ChemiDoc Imager, Bio-Rad Laboratories, 미국)로 분석하였다. 그 결과, CD9, CD63 및 CD81의 발현 정도를 촬영한 결과 사진을 도 1A에 나타내었다.
도 1A에 나타난 바와 같이, 정상 조건에서 배양된 양막 중간엽 줄기세포의 배양액과 비교하여, 낮은 산소농도의 조건하에서 배양된 양막 중간엽 줄기세포의 배양액에서 CD9, CD63 및 CD81의 발현이 유의적으로 증가하였다.
실시예 4. 엑소좀 확인-(2)
상기에서 수득된 엑소좀 풍부 배양액 내 존재하는 엑소좀을 NTA 시스템(Nanosight NS300, NanoSight, 영국)을 사용하여 정량적으로 확인하였다. 이때, 모든 분석 샘플은 1:1000로 희석하여, 1.0×108 particles/㎖이 되도록 준비하였다. 그 결과, 엑소좀의 함량을 도 1B에, 투과 전자 현미경(transmission electron microscopy, TEM)을 사용하여 엑소좀을 관찰한 결과를 도 1C에 나타내었다.
도 1B에 나타난 바와 같이, 낮은 산소농도의 조건하에서 배양된 양막 중간엽 줄기세포의 배양액에서 엑소좀이 확인되었으며, 구체적으로 4.5×1010 개/㎖의 엑소좀을 포함하였다. 한편, 정상 조건에서 배양된 양막 중간엽 줄기세포 배양액에서는 9.0×108 개/㎖의 엑소좀이 확인되었다.
또한, 도 1C에 나타난 바와 같이, 분리된 엑소좀은 약 68 ㎚의 크기를 나타내었다.
실험예 1. 성장인자 및 신경영양인자의 분석
상기에서 수득된 엑소좀 풍부 배양액 내 존재하는 성장인자 및 신경영양인자를 다음과 같이 분석하였다. 구체적으로, FGF(fibroblast growth factor), EFG(elongation factor G), PDGF(platelet-derived growth factor), IGF(insuline-like growth factor), VEGF(vascular endothelial growth factor), TGF-β(transforming growth factor-β), BDNF(brain-derived neurotrophic factor) 및 PDGF(platelet-derived growth factor) 단백질의 발현 수준을 ELISA 분석방법으로 제조사의 프로토콜에 따라 확인하였다. 이때, 대조군으로서는 정상 배양액을 사용하였고, 확인된 성장인자 및 신경영양인자의 발현 수준은 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 정상 조건에서 배양된 양막 중간엽 줄기세포의 배양액과 비교하여, 낮은 산소농도의 조건하에서 배양된 양막 중간엽 줄기세포 배양액에서 성장인자 및 신경영양인자의 발현 수준이 현저히 증가하였다.
실험예 2. 엑소좀의 체내 분포
상기에서 수득된 엑소좀 풍부 배양액 내 존재하는 엑소좀이 체내에서 병변으로의 이동 정도를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
2-1. 뇌성마비 동물모델
임신 9주령의 스프라그-다우니(Sprague-Dawley) 래트는 23±3℃의 일정한 온도 및 50±10%의 상대습도하에서, 12시간 명암주기로 사육하여 준비하였다. 사육 시, 표준 설치류 식단을 급식하였고, 물은 자유롭게 급수하였다. 임신한 래트가 자연분만으로 출산한 새끼 래트를 5일 후 수술하여 왼쪽 총경동맥을 폐쇄하고 저산소증 인큐베이터(Don Whitley Scientific, 영국)에 넣고 2시간 동안 8% O2 및 92%의 N2하에 노출시켰다. 이후, 새끼 래트의 봉합사를 제거하여 재관류를 유도하고, 30분 동안 회복시킨 후, 1 ㎎/㎏ LPS를 복강내 주사하여 염증을 유발시켰다. 모든 처치를 마친 후, 새끼 래트는 엄마 래트의 보살핌을 받으며 사육되었다. 모든 실험은 충북대학교 실험동물센터 표준운영절차에 따라 수행되었으며, 충북대학교 기관동물관리 및 사용위원회(#CBNUA-1720-22-02)의 승인을 받았다.
2-2. 엑소좀 분포
10×1012개의 입자를 포함하는 엑소좀 풍부 배양액을 2 ㎕의 엑소글로우™-비보 형광염료(ExoGlow™-Vivo fluorescence dye)와 혼합하고, 상온에서 2시간 동안 반응시켜, 엑소좀 풍부 배양액 내 존재하는 엑소좀을 표지하였다. 반응이 끝난 후, 반응물을 세파로스 CL-6B(Sepharose CL-6B)로 충전된 컬럼을 사용하여 통상적인 방법으로 여과함으로써, 엑소좀에 표지되지 않은 형광염료를 제거하였다. 상기 실험예 2-1에서 뇌성마비가 유발된 새끼 래트의 출생 7일 후, 4.5×1010 pn의 엑소좀 풍부 배양액을 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 이때, 대조군으로서 정상 래트를 사용하였다. 이후, 투여 0.25, 1, 2, 3, 5 또는 24시간 째에 뇌를 적출하였다. 뇌의 적출은 래트를 완전 마취하고, 5분 동안 심장을 통해 전신에 PBS를 관류시킨 후 수행되었다. 적출된 뇌로부터 형광강도는 근적외선 범위의 파장(여기: 784 ㎚, 방출: 806 ㎚)에서 측정되었고, 측정된 결과값을 도 3A에, 상기 결과를 이용한 AUC 분석 결과를 도 3B에 나타내었다. 또한, 형광강도를 촬영한 결과 사진을 도 4 및 5에 나타내었다.
도 3A, 4 및 5에 나타난 바와 같이, 엑소좀 풍부 배양액이 처리된 뇌성마비가 유발된 동물 모델에서 투여 2시간까지 뇌조직 내 존재하는 엑소좀의 함량이 현저히 증가하였으며, 이는 3시간 이후부터 감소하였다. 한편, 도 3B에 나타난 바와 같이, AUC 분석 결과를 통해 뇌성마비가 유발된 동물 모델에서 정상 동물 모델과 비교하여 뇌조직에서 엑소좀의 함량이 2배 이상 높은 것을 알 수 있었다.
실험예 3. 신경줄기세포 보호
상기에서 수득된 엑소좀 풍부 배양액의, 산전 인자(prenatal factor) 또는 저산소증에 의한 손상으로부터 신경줄기세포 보호 효과를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
3-1. 염증성 인자들의 유전자 발현
먼저, 인간 신경줄기세포주인 F3 세포주를 통상의 기술분야에 알려진 방법에 따라 계대배양하여 준비하였다. 이때, 세포는 항생제로서 페니실린 및 스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Biowest, 프랑스) 배양배지에 10% 열-불활성화된 FBS를 첨가한 배지를 사용하여 37℃ 및 5% CO2 조건에서 배양하였다. 준비된 F3 세포주를 직경 10 ㎝의 배양접시에 분주하고 24시간을 배양한 후, 배양된 세포를 PBS로 세척하였다. 세척한 세포에 10 ㎍/㎖의 LPS(lipopolysaccharide) 또는 5 μM의 KCN(potassium cyanide)을 처리하고, 동시에 10, 30 또는 100 ㎍/㎖의 엑소좀 풍부 배양액을 처리하였다. 이때, 엑소좀의 농도는 통상적으로 사용되는 BCA 방법으로 확인하였다. 세포를 24시간 동안 배양한 후, 배양배지 내로 방출된 LDH(lactate dehydrogenase)의 함량을 LDH 분석 키트(Promega, 미국)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 확인하였다. 한편, 염증성 인자들의 mRNA 발현량을 통상적인 방법으로 qRT-PCR을 수행하여 확인하였고, 이때, 사용된 프라이머의 서열을 하기 표 1에 나타내었다. 이때, GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 기준으로 염증성 인자들의 mRNA 발현 변화를 표준화하였다. 그 결과, LDH의 농도 및 염증성 인자들의 mRNA 발현을 확인한 결과를 도 6 및 7에 나타내었다.
프라이머 이름 서열(5'→3') 서열번호
NF-kappaB forward GTGGTGCGGCTCATGTTTAC 서열번호 1
NF-kappaB reverse CGTCTGATACCACGGGTTCC 서열번호 2
TNF-alpha forward GCTGCACTTTGGAGTGATCG 서열번호 3
TNF-alpha reverse TCACTCGGGGTTCGAGAAGA 서열번호 4
IL-6 forward AGTGAGGAACAAGCCAGAGC 서열번호 5
IL-6 reverse ATTTGTGGTTGGGTCAGGGG 서열번호 6
iNOS forward ACAACAAATTCAGGTACGCTGTG 서열번호 7
iNOS reverse TCTGATCAATGTCATGAGCAAAGG 서열번호 8
COX2 forward AAGTGCGATTGTACCCGGAC 서열번호 9
COX2 reverse GTGCACTGTGTTTGGAGTGG 서열번호 10
GAPDH forward AAGAAGGTGGTGAAGCAG 서열번호 11
GAPDH reverse GTCAAAGGTGGAGGAGTG 서열번호 12
도 6 및 7에 나타난 바와 같이, LPS나 KCN의 처리에 의해 유의적으로 증가한 LDH의 농도나 염증성 인자들의 mRNA 발현이 엑소좀 풍부 배양액의 처리 농도에 의존적으로 억제되었다.
3-2. 세포사멸 또는 분화관련 단백질 발현
상기 실험예 3-1에서 엑소좀 풍부 배양액을 처리한 F3 세포주에서 세포사멸이나 희소돌기아교세포 분화와 관련된 단백질의 발현 변화를 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 구체적으로, 실험은 Bax(BCL2 associated X), Bcl-2(B-cell lymphoma 2), p-AKT(phospo-RAC-alpha serine/threonine-protein linase), p-PI3K(phospo-phosphoinostide 3-kinase), PDGFR A(platelet-derived growth factor receptor A), SOX10(SRY-Box transcription factor 10), Nkx2.2(NK2 homeobox 2), Oligo2(oligodendrocyte transcription factor 2) 또는 액틴(actin) 단백질에 대한 1차 항체를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 2에 기재된 바와 동일한 방법으로 수행되었다. 상기 단백질들의 발현 변화를 확인한 결과 도면을 도 8 및 9에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 세포사멸과 관련된 Bax 단백질은 LPS 또는 KCN의 처리에 의해 그 발현이 유의적으로 증가하였으나, 엑소좀 풍부 배양액의 처리에 의해 억제되었다. 한편, 세포사멸을 억제하는 단백질인 Bcl-2는 엑소좀 풍부 배양액의 처리에 의해 발현이 증가하였다. 또한, 세포 분화와 관련된 단백질인 AKT 및 PI3K 또한 엑소좀 풍부 배양액의 처리에 의해 발현이 유의적으로 증가하였다.
또한, 도 9에 나타난 바와 같이, 희소돌기아교세포(oligodendrocyte) 분화와 관련된 단백질들인 PDGFR A, SOX10, Nkx2.2 또는 Oligo2 단백질은 LPS 또는 KCN의 처리에 의해 그 발현이 억제되었으나, 엑소좀 풍부 배양액의 처리에 의해 회복되었다.
실험예 4. 희소돌기아교 전구세포의 보호
상기에서 수득된 엑소좀 풍부 배양액의, 산전 인자 또는 저산소증에 의한 손상으로부터 희소돌기아교 전구세포의 보호 효과를 다음과 같은 방법으로 확인하였다. 실험은 F3 세포주 대신 F3.Olig2 세포주를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 3과 동일한 방법으로 수행하였다. 그 결과, LDH의 농도 및 염증성 인자들의 mRNA 발현을 확인한 결과를 도 10 및 11에, 세포사멸이나 분화와 관련된 단백질의 발현을 확인한 결과를 도 12 내지 14에 나타내었다.
도 10 및 11에 나타난 바와 같이, LPS나 KCN의 처리에 의해 유의적으로 증가한 LDH의 농도나 염증성 인자들의 mRNA 발현이 엑소좀 풍부 배양액의 처리 농도에 의존적으로 억제되었다.
한편, 도 12에 나타난 바와 같이, LPS나 KCN의 처리에 의해 유의적으로 증가한 세포사멸과 관련된 Bax 단백질의 발현이 엑소좀 풍부 배양액에 의해 억제되었고, 세포사멸을 억제하는 단백질인 Bcl-2는 엑소좀 풍부 배양액의 처리에 의해 발현이 증가하였다. 또한, 세포 분화와 관련된 단백질인 AKT 및 PI3K 또한 엑소좀 풍부 배양액의 처리에 의해 발현이 유의적으로 증가하였다.
또한, 도 13에 나타난 바와 같이, 희소돌기아교세포 분화와 관련된 유전자들인 PDGFR A, SOX10, Nkx2.2 또는 Oligo2 단백질은 LPS 또는 KCN의 처리에 의해 그 발현이 억제되었으나, 엑소좀 풍부 배양액의 처리에 의해 회복되었다.
나아가, 도 14에 나타난 바와 같이, 희소돌기아교세포의 성숙과 관련된 단백질인 CNPase(2'3'-cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase) 및 MBP(myelin basic protein) 단백질의 발현이 LPS 또는 KCN의 처리에 의해 그 발현이 억제되었으나, 엑소좀 풍부 배양액의 처리에 의해 회복되었다.
실험예 5. 뇌성마비 동물모델에서의 임상증상 개선
상기에서 수득된 엑소좀 풍부 배양액의 뇌성마비 임상증상 개선 효과를 상기에서 제조된 동물모델에서 확인하였다.
5-1. 실린더 테스트(cylinder test)
상기 제조된 뇌성마비 동물모델의 동측(ipsilateral) 뇌 손상에 의한 앞다리 사용 비대칭성을 다음과 같이 확인하였다.
구체적으로, 시술을 통해 뇌성마비가 유발된 새끼 래트의 꼬리 정맥으로 엑소좀 풍부 배양액 투여하였다. 이때, 1회 투여하는 경우, 출생 7일째에 1.5×1010 또는 6.0×1010의 투여량으로 투여하였으며, 반복 투여하는 경우, 출생 7일, 17일 및 27일째에 6.0×4010개의 투여량으로 투여하였다. 이후, 새끼 래트의 출생 10, 20, 30 또는 40일째 되는 날, 래트를 직경 21 ㎝ 및 길이 34 ㎝의 유리 실린더에 두고 3분 동안 실린거 벽과 접촉하는 앞발을 확인하여 체중 부하가 왼발에 걸리면 정상, 오른쪽에 걸리면 손상으로 기록하였다. 상기 결과로부터 하기 수학식 1을 사용하여 발 선호도(%)를 계산하고, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
[수학식 1]
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도 15에 나타난 바와 같이, 뇌손상이 유도된 래트는 뇌 손상부위와 반대쪽 앞다리의 사용 선호도가 감소하였으나, 이는 엑소좀 풍부 배양액의 투여로 인해 유의적으로 회복되어, 출생 20 내지 40일째에는 양쪽 앞발을 유사한 비율로 사용하였다.
5-2. 로타로드(rotarod) 수행
상기 실험예 5-1에 기재된 바와 같이 엑소좀 풍부 배양액을 투여한 동물모델을 12 rpm의 일정한 속도로 회전하는 막대 위에 올려놓고 막대에서 균형을 유지하는 시간을 기록하였다. 기록은 새끼 래트의 출생 10, 20, 30 또는 40일째 되는 날 수행되었고, 3번 반복 수행하여 평균값을 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타난 바와 같이, 뇌손상이 유도된 래트는 막대에서 균형을 유지하는 시간이 유의적으로 감소하였으나, 이는 엑소좀 풍부 배양액의 투여로 인해 회복되었다. 특히, 엑소좀 풍부 배양액을 3회 투여한 동물모델의 기능 장애는 거의 정상 수준으로 회복되었다.
5-3. 수동회피시험(passive avoidance test)
상기 실험예 5-1에 기재된 바와 같이 엑소좀 풍부 배양액을 투여한 동물모델을 출생 41일부터 5일동안 하루에 한 번씩 수동회피상자(Med Associated)를 이용하여 시험하였다. 구체적으로, 어두운 방과 밝은 방으로 나뉜 수동회피상자의 밝은 방에 동물을 위치시키고, 동물이 어두운 방으로 이동하면 1 ㎃로 2초 동안 전기충격을 가했다. 이후, 같은 시험에서 어두운 방에서의 전기충격으로 인한 기억을 확인하기 위해 밝은 방에서 동물이 체류하는 시간을 측정하여 기억력을 평가하였다. 이때, 체류 시간이 300초면 기억력의 완전한 회복으로 평가하였고, 평가된 결과를 도 17A에 나타내었다.
도 17A에 나타난 바와 같이, 뇌손상이 유도된 래트는 밝은 방에서의 체류 시간이 감소되었으나, 이는 엑소좀 풍부 배양액의 투여로 인해 회복되었다.
5-4. 수중미로시험(water-maze test)
상기 실험예 5-1에 기재된 바와 같이 엑소좀 풍부 배양액을 투여한 동물모델동물모델을 사용하여 출생 41일부터 5일동안 하루에 한 번씩 수중미로시험을 수행하였다. 구체적으로, 원형의 수조에 깊이 27 ㎝가 되도록 물을 채우고 이를 22±2℃의 온도로 유지하면서 수면을 스티로폼으로 채워 수면 2 ㎝ 아래의 피신용 플랫폼(platform)을 가리는 히든 플랫폼 장치(hidden platform device, 직경 10 ㎝, 높이 25 ㎝)를 설치하였다. 새끼 래트를 수조에 넣고, 수조 주변의 표지물을 기억하여 수조 내 일정한 장소에 위치한 플랫폼을 찾아갈 때까지의 소요시간을 측정하였다. 그 결과, 플랫폼을 찾아가는데 소요되는 시간을 도 17B에 나타내었다.
도 17B에 나타난 바와 같이, 뇌손상이 유도된 래트는 플랫폼을 찾아가는 소요시간이 증가하였으며, 이는 엑소좀 풍부 배양액의 투여로 인해 유의적으로 감소하였다.
실험예 6. 염증성 인자들의 유전자 발현 변화
상기 실험예 5-1에 기재된 바와 같이 엑소좀 풍부 배양액을 투여한 동물모델의 뇌조직을 실험이 모두 끝난 후 희생시켜 수득하고, 수득된 뇌조직에서 염증성 인자들의 유전자 발현 변화를 확인하였다. 실험은 F3 세포주 대신 래트의 뇌조직을 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 3과 동일한 방법으로 수행되었고, 이때, 하기 표 2에 기재된 프라이머를 사용하였다. 그 결과, 염증성 인자들의 mRNA 발현을 확인한 결과를 도 18에 나타내었다.
프라이머 이름 서열(5'→3') 서열번호
NF-kappaB forward AGAGGCCATTGAAGTGATCCA 서열번호 13
NF-kappaB reverse CTTGTGGAGGAGGACGAGAGA 서열번호 14
TNF-alpha forward ATCGGTCCCAACAAGGAGGA 서열번호 15
TNF-alpha reverse TTGCTACGACGTGGGCTAC 서열번호 16
IL-6 forward ACCCCAACTTCCAATGCTCTC 서열번호 17
IL-6 reverse ATGGTCTTGGTCCTTAGCCAC 서열번호 18
iNOS forward AGGCTGGAAGCCGTAACAAA 서열번호 19
iNOS reverse ACCACTGAATCCTGCCGATG 서열번호 20
COX2 forward TGATCTACCCTCCCCACGTC 서열번호 21
COX2 reverse CACTCTGTTGTGCTCCCGAA 서열번호 22
GAPDH forward GTCGGTGTGAACGGATTTGG 서열번호 23
GAPDH reverse CCACTTTGTCACAAGAGAAGGCA 서열번호 24
도 18에 나타난 바와 같이, 뇌성마비가 유발된 래트의 뇌조직에서 염증성 인자들의 mRNA 발현이 유의적으로 증가하였으나, 이는 엑소좀 풍부 배양액의 투여에 의해 현저히 억제되었다. 특히, 엑소좀 풍부 배양액을 3회 반복 투여한 경우, 정상 수준으로 염증성 인자들의 mRNA 발현이 억제되었다.
실험예 7. 단백질 발현 변화
상기 실험예 5-1에 기재된 바와 같이 엑소좀 풍부 배양액을 투여한 동물모델의 뇌조직을 실험이 모두 끝난 후 희생시켜 수득하고, 수득된 뇌조직에서 단백질의 발현 변화를 웨스턴 블롯으로 확인하였다.
구체적으로, 실험은 Bax, Bcl-2, p-AKT, p-PI3K, PDGFR A, SOX10, Nkx2.2, Oligo2, NT3(neurotrophin-3), NGF(nerve growth factor), BDNF, CNTF(ciliary neurotrophic factor), GDNF(glial cell-derived growth factor), PDGF A, PDGF B(platelet-derived growth factor B), CNPase, MBP 또는 액틴 단백질에 대한 1차 항체를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 2에 기재된 바와 동일한 방법으로 수행되었다. 상기 단백질들의 발현 변화를 확인한 결과 도면을 도 19 내지 23에 나타내었다.
도 19에 나타난 바와 같이, 뇌성마비가 유발된 래트의 뇌조직에서 세포사멸과 관련된 Bax 단백질의 발현이 엑소좀 풍부 배양액에 의해 억제되었고, 세포사멸을 억제하는 단백질인 Bcl-2는 엑소좀 풍부 배양액의 처리에 의해 발현이 증가하였다. 또한, 세포 분화와 관련된 단백질인 AKT 및 PI3K 또한 엑소좀 풍부 배양액의 처리에 의해 발현이 유의적으로 증가하였다.
또한, 도 20 및 21에 나타난 바와 같이, 희소돌기아교세포의 분화나 성숙과 관련된 단백질인 PDGFR A, SOX10, Nkx2.2, Oligo2, CNPase 및 MBP 단백질의 발현이 뇌성마비의 유발로 억제되었으나, 엑소좀 풍부 배양액의 투여에 의해 회복되었다.
나아가, 신경영양인자인 NT3, NGF, BDNF, CNTF, GDNF, PDGF A 및 PDGF B 단백질 또한 엑소좀 풍부 배양액의 처리에 의해 유의적으로 증가하였다.
실험예 8. 미엘린의 회복
뇌성마비가 유도된 래트에서 뇌량(corpus callosum)을 포함하는 뇌실하대(subventricular zone)에서 미엘린 단백질의 손실이 보고된 바 있어, 엑소좀 풍부 배양액의 투여에 따른 미엘린의 변화를 LFB(luxol fast blue) 염색으로 확인하였다.
먼저, 상기 실험예 5-1에 기재된 바와 같이 엑소좀 풍부 배양액을 투여한 동물모델의 뇌조직을 실험이 모두 끝난 후 희생시켜 수득하였다. 상기 수득된 뇌조직을 10% 파라포름알데하이드 용액으로 관류시킨 후, 동일한 용액에 넣어 48시간 동안 고정시켰다. 이후, 고정된 뇌조직을 30% 수크로스 용액을 사용하여 72시간 동안 동결보호(cryoprotect)하고, 뇌조직을 10 ㎛ 두께의 횡단면으로 절단하여 샘플을 수득하였다. 수득된 샘플에 LFB 염색약을 처리하고, 현미경으로 이미지를 관찰 및 촬영한 결과를 도 24에 나타내었다.
도 24에 나타난 바와 같이, 뇌성마비의 유도로 미엘린의 농도가 유의적으로 감소하였으나, 이는 엑소좀 풍부 배양액의 투여로 회복되었다. 특히, 3회 엑소좀 풍부 배양액을 투여한 경우 정상 수준까지 회복되었다.
실험예 9. 희소돌기아교세포의 분화 및 성숙
뇌성마비가 유도된 래트에서 엑소좀 풍부 배양액의 투여로 희소돌기아교세포의 분화 및 성숙이 진행되는지 확인하기 위해, PDGFR과, SOX10 또는 Oligo2 단백질을 동시에 면역염색하였다.
구체적으로, 상기 실험예 8에 기재된 방법으로 뇌조직을 동결보호하고, 브레그마(bregma)의 1.0 ㎜의 위치에서 10 ㎛ 두께로 절단한 관상 동결절편(coronal cryosection)을 수득하였다. 상기 수득된 절편을 TBS(Tris-buffered saline) 완충액으로 세척하고, 3% 과산화수소로 5분 동안 처리하여 내인성 퍼옥시다제(peroxidase) 활성을 억제하였다. 이후, 상기 절편을 TBS 완충액으로 다시 세척하고, 5% BSA로 전처리를 하였다. 전처리된 절편을 PDGFR에 특이적으로 결합하는 1차 항체(1:300, 토끼 다클론 항체, Chemicon, 미국)로 처리하고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 이후, 알렉사 플루오르-594(Alexa Fluor-594, 1:300, Molecular Probes, 미국)이 결합된 2차 항체로 처리하여 반응시켰다. 반응이 끝난 절편에 SOX10 또는 Oligo2에 특이적으로 결합하는 1차 항체를 처리하여 이중 염색을 수행하고, 알렉사 플루오르-488(Alexa Fluor-488, 1:200, Molecular Probes, 미국)이 결합된 2차 항체를 처리하였다. 이후, DAPI(4'6-diamidino-2-phenylindole)로 핵을 대조염색하였다. 염색된 절편은 형광 현미경(EVOS FL Auto 2 Cell 이미징 시스템, Thermo Fisher Scientific, 미국)을 사용하여 관찰하고, 촬영한 결과를 도 25 및 26에 나타내었다.
도 25 및 26에 나타난 바와 같이, 뇌성마비가 유발된 래트에서 PDGFR 단백질의 발현이 감소되었으나, 이는 엑소좀 풍부 배양액의 투여에 의해 회복되었다. 또한, PDGFR 양성 세포는 SOX10 및 Oligo2 단백질의 발현도 높았다.

Claims (10)

  1. 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 세포외소포(extracellular vehicle, EV)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 양막 유래 줄기세포인, 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 양막 유래 줄기세포는 양막 유래 중간엽 줄기세포 및 상피줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 배양액은 줄기세포를 10% 이하의 산소 농도하에서 배양하여 수득된, 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 배양액은 줄기세포를 1 내지 5%의 산소 농도하에서 배양하여 수득된, 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 뇌신경계 질환은 뇌성마비, 뇌손상, 뇌상성 뇌손상, 허혈성 뇌손상, 뇌진탕, 뇌타박상, 뇌졸중, 뇌경색, 뇌출혈, 근위축송축삭경화증, 원발성축삭경화증, 다발성경화증, 신경계 기능장애 또는 퇴행성 운동 실조증인, 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 세포외소포는 엑소좀(exosome) 및 미세소포(microvesicle)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 세포외소포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  9. 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 세포외소포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료 방법.
  10. 뇌신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 세포외소포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 용도.
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