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WO2024054020A1 - 변형핵산 함유 mrna의 체내 전달용 조성물 - Google Patents

변형핵산 함유 mrna의 체내 전달용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2024054020A1
WO2024054020A1 PCT/KR2023/013302 KR2023013302W WO2024054020A1 WO 2024054020 A1 WO2024054020 A1 WO 2024054020A1 KR 2023013302 W KR2023013302 W KR 2023013302W WO 2024054020 A1 WO2024054020 A1 WO 2024054020A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
glycero
nucleic acid
composition
modified nucleic
mrna
Prior art date
Application number
PCT/KR2023/013302
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
조양제
김석현
김광성
Original Assignee
아이진 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020230102612A external-priority patent/KR102785258B1/ko
Application filed by 아이진 주식회사 filed Critical 아이진 주식회사
Priority to AU2023274159A priority Critical patent/AU2023274159A1/en
Priority to EP23814344.0A priority patent/EP4356933A1/en
Publication of WO2024054020A1 publication Critical patent/WO2024054020A1/ko

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars

Definitions

  • the present invention relates to a composition for in vivo delivery of mRNA containing modified nucleic acid, and more specifically, to a composition for in vivo delivery of mRNA containing modified nucleic acid containing a cationic lipid-based liposome.
  • Gene therapy and gene vaccines are technologies that have already been proven in the medical field and are widely applied, and can be used to treat not only genetic diseases but also autoimmune diseases, infectious diseases, cancer or tumor-related diseases, and inflammatory diseases.
  • DNA and RNA can be used as nucleic acid molecules for gene administration, and DNA is known to be relatively more stable and easier to handle than RNA.
  • DNA is known to be relatively more stable and easier to handle than RNA.
  • a potential risk may arise if the DNA fragment administered into the patient's genome is inserted into an undesirable location and the gene is damaged.
  • unwanted anti-DNA antibodies may appear, and another problem is that the expression level of peptides or proteins expressed by transcription/translation after DNA administration is limited.
  • the presence or absence of specific transcription factors that regulate DNA transcription has a major impact on the expression level of administered DNA. In the absence of specific transcription factors, sufficient amounts of RNA are not produced by DNA transcription and, consequently, are produced by translation.
  • the level of peptide or protein is also limited.
  • RNA when used as a tool for gene administration, RNA does not require transcription, so it can synthesize proteins directly in the cytoplasm without having to enter the nucleus like DNA, and can insert into cell chromosomes and cause unwanted gene damage. No worries. In addition, it has a shorter half-life than DNA, so it does not induce long-term genetic modification (Sayour EJ, et al., J Immunother Cancer 2015;3:13, 2015).
  • a general RNA vaccine When a general RNA vaccine is delivered into a cell, it is activated for only a short period of time to express the target protein, and is destroyed due to an enzymatic reaction within a few days, and the specific immune response to the expressed target antigen (protein) remains.
  • RNA when used as a tool for gene administration, it does not need to pass through the nuclear membrane and acts only by passing through the cell membrane, so a similar amount of target protein as DNA can be expressed even if a smaller amount is used than DNA. .
  • RNA itself has immune adjuvant properties, so the same immune effect can be seen even when administered in a small amount compared to DNA.
  • RNA is a highly unstable molecular species that can be easily degraded by ubiquitous RNases.
  • nucleic acid-based therapeutics have tremendous potential, but in order to realize this potential, there is a need to effectively deliver nucleic acids to the appropriate site within a cell or organism.
  • RNA is susceptible to degradation by nucleases in the blood.
  • free RNA has limited ability to access intracellular compartments where the translation machinery that translates it resides.
  • Introducing lipid nanoparticles formed from cationic lipids and other lipid components such as neutral lipids, cholesterol, PEG, pegylated lipids and oligonucleotides has been attempted to block the degradation of RNA in the blood and promote cellular uptake of nucleic acids. there is.
  • mRNA When using lipid-based carriers such as liposomes or lipid nanoparticles, mRNA is usually adsorbed on the outside or encapsulated on the inside.
  • mRNA when adsorbed to the outside of the carrier, it is generally known to exist as an aggregate of liposomes and nucleic acids rather than as a single liposome, and the adsorption capacity varies depending on the combination of lipids, the state of the nucleic acids, and the ratio of nucleic acids to liposomes. Since this has an impact on stability, optimization is necessary.
  • mRNA using modified nucleic acid has a higher in vivo expression efficiency than mRNA using unmodified nucleic acid. This is known to be high (US8278036B2, KR10-2171849B1, KR10-2014601B1).
  • Mainly used modified nucleic acids include pseudouridine and N1-methyl-pseudouridine, but optimization is required for the optimal combination of the modified nucleic acid and the modified nucleic acid.
  • the present inventors have made extensive research efforts to find a delivery vehicle improvement technology that can induce stable protein expression by stably delivering mRNA containing modified nucleic acid into the body and increasing intracellular expression efficiency.
  • the present invention was completed by demonstrating that [liposome + mRNA complex] based on mRNA containing a specific modified nucleic acid and cationic liposome shows a low inflammatory response and has an excellent in vivo expression rate.
  • the purpose of the present invention is to provide a composition for delivering mRNA containing a modified nucleic acid comprising a cationic lipid-based liposome that exhibits a low inflammatory response and excellent expression rate in the body.
  • Another object of the present invention is to prevent or treat diseases selected from the group consisting of cancer, tumor, autoimmune disease, genetic disease, inflammatory disease, viral infection, and bacterial infection, which contains the composition for delivering mRNA containing the modified nucleic acid as an active ingredient.
  • diseases selected from the group consisting of cancer, tumor, autoimmune disease, genetic disease, inflammatory disease, viral infection, and bacterial infection.
  • Another object of the present invention is to provide a vaccine containing the modified nucleic acid-containing mRNA delivery composition as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a functional cosmetic composition containing the modified nucleic acid-containing mRNA delivery composition as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for delivering mRNA containing modified nucleic acid containing a cationic lipid-based liposome.
  • the present invention also provides the composition for the delivery of mRNA containing the modified nucleic acid as an active ingredient for the prevention or treatment of diseases selected from the group consisting of cancer, tumor, autoimmune disease, genetic disease, inflammatory disease, viral infection, and bacterial infection.
  • diseases selected from the group consisting of cancer, tumor, autoimmune disease, genetic disease, inflammatory disease, viral infection, and bacterial infection.
  • Pharmaceutical compositions are provided.
  • the present invention also provides a vaccine containing the modified nucleic acid-containing mRNA delivery composition as an active ingredient.
  • the present invention also provides a functional cosmetic composition containing the modified nucleic acid-containing mRNA delivery composition as an active ingredient.
  • the present invention also provides a group consisting of cancer, tumor, autoimmune disease, genetic disease, inflammatory disease, viral infection and bacterial infection, comprising the step of administering a composition for delivering mRNA containing modified nucleic acid containing a cationic lipid-based liposome.
  • a composition for delivering mRNA containing modified nucleic acid containing a cationic lipid-based liposome Provides a method of preventing or treating a disease selected from.
  • the present invention also provides delivery of mRNA containing a modified nucleic acid containing a cationic lipid-based liposome for the prevention or treatment of diseases selected from the group consisting of cancer, tumor, autoimmune disease, genetic disease, inflammatory disease, viral infection, and bacterial infection. Provides a use for the composition.
  • the present invention also provides a modified nucleic acid containing a cationic lipid-based liposome for the production of a drug for the prevention or treatment of diseases selected from the group consisting of cancer, tumor, autoimmune disease, genetic disease, inflammatory disease, viral infection, and bacterial infection.
  • Figure 1 shows the mRNA expression efficiency in mice according to the type of modified nucleic acid in the mRNA-liposome complex.
  • Figure 2 shows the antibody titer of RBD-specific IgG analyzed by ELISA in the serum of mice administered mRNA-liposome complexes prepared according to the type of modified nucleic acid.
  • a desired immune response is induced against selected antigens such as characteristic components of the surface of viruses or bacteria, viral particles, and tumor antigens, and the expression of therapeutic proteins is induced to prevent or prevent diseases.
  • selected antigens such as characteristic components of the surface of viruses or bacteria, viral particles, and tumor antigens
  • the expression of therapeutic proteins is induced to prevent or prevent diseases.
  • treatment methods it was attempted to find a method to increase the intracellular expression efficiency of mRNA to achieve a stable effect. Accordingly, a composition for mRNA delivery using a cationic lipid-based liposome was prepared, and the composition for mRNA delivery was prepared. It was confirmed that it showed a low inflammatory response and had an excellent expression rate in vivo .
  • mRNA may exist in a complex form with a cationic lipid-based liposome, and accordingly, the composition for mRNA delivery using a cationic lipid-based liposome and [liposome + mRNA complex] is used with the same meaning.
  • the present invention relates to a composition for delivering mRNA containing modified nucleic acid comprising a cationic lipid-based liposome.
  • the modified nucleic acid may include one or more backbone modified, sugar modified, or base modified nucleic acids, but is not limited thereto.
  • Modified nucleosides and nucleotides that can be incorporated into modified mRNA compounds comprising an mRNA sequence as described herein may be modified at the sugar moiety.
  • the 2' hydroxyl group (OH) can be modified or replaced with a number of different “oxy” or “deoxy” substituents.
  • “Deoxy” modifications include hydrogen, amino (e.g. NH2; alkylamino, dialkylamino, heterocyclyl, arylamino, diarylamino, heteroaryl amino, diheteroaryl amino, or amino acid);
  • the amino group can be attached to the sugar through a linker, where the linker includes one or more of the atoms C, N, and O.
  • a sugar group may also contain one or more carbons that have an opposite stereochemical configuration compared to the corresponding carbon in the ribose. Accordingly, the modified mRNA may include nucleotides containing, for example, the sugar arabinose.
  • the phosphate backbone may be further modified in modified nucleosides and nucleotides, which may be incorporated into modified mRNA compounds comprising the mRNA sequence as described herein.
  • the phosphate group of the backbone can be modified by replacing one or more of the oxygen atoms with a different substituent.
  • Modified nucleosides and nucleotides may also include complete replacement of an unmodified phosphate moiety with a modified phosphate described herein.
  • modified phosphate groups include phosphorothioate, phosphoroselenate, borano phosphate, borano phosphate ester, hydrogen phosphonate, phosphoroamidate, alkyl or aryl phosphonate and phosphotriester. , but is not limited to this.
  • Phosphorodithioate has both unlinked oxygens replaced by sulfur.
  • Phosphate linkers can also be modified by substitution of the linking oxygen with nitrogen (cross-linked phosphoroamidate), sulfur (cross-linked phosphorothioate) and carbon (cross-linked methylene-phosphonate).
  • Modified nucleosides and nucleotides that can be incorporated into a modified mRNA compound comprising an mRNA sequence as described herein may be further modified at the nucleobase moiety.
  • nucleobases found in mRNA include, but are not limited to, adenine, guanine, cytosine, and uracil.
  • the nucleosides and nucleotides described herein can be chemically modified in the major groove face. In some embodiments, chemical modifications of the major groove may include amino groups, thiol groups, alkyl groups, or halo groups.
  • the nucleotide analogs/modifications are preferably 2-amino-6-chloropurine riboside-5'-triphosphate, 2-aminopurine-riboside-5'-triphosphate; 2-Aminoadenosine-5'-triphosphate, 2'-amino-2'-deoxycytidine-triphosphate, 2-thiocitidine-5'-triphosphate, 2-thiouridine-5'-triphosphate , 2'-fluorothymidine-5'-triphosphate, 2'-O-methyl-inosine-5'-triphosphate, 4-thiouridine-5'-triphosphate, 5-aminoallylcytidine-5 '-triphosphate, 5-aminoallyluridine-5'-triphosphate, 5-bromocitidine-5'-triphosphate, 5-bromouridine-5'-triphosphate, 5-bromo-2 '-deoxycytidine-5'-triphosphate, 5-bromo-2'
  • 5-methylcytidine-5'-triphosphate 7-deazaguanosine-5'-triphosphate, 5-bromocitidine-5'-triphosphate, and pseudouridine-5'-triphosphate.
  • It is a nucleotide for base modification selected from the group of base modified nucleotides consisting of.
  • the modified nucleoside is pyridin-4-one ribonucleoside, 5-aza-uridine, 2-thio-5-aza-uridine, 2-thiouridine, 4-thio-pseudo Uridine, 2-thio-pseudouridine, 5-hydroxyuridine, 3-methyluridine, 5-carboxymethyl-uridine, 1-carboxymethyl-pseudouridine, 5-propynyl-uridine, 1 -Prophinyl-pseudouridine, 5-taurinomethyluridine, 1-taurinomethyl-pseudouridine, 5-taurinomethyl-2-thio-uridine, 1-taurinomethyl-4-thio-uridine Dean, 5-methyl-uridine, 1-methyl-pseudouridine, 4-thio-1-methyl-pseudouridine, 2-thio-1-methyl-pseudouridine, 1-methyl-1-deaza- Pseudouridine, 2-thio-1
  • the modified nucleoside is 5-aza-cytidine, pseudoisocytidine, 3-methyl-cytidine, N4-acetylcytidine, 5-formylcytidine, N4-methylcytidine, 5- Hydroxymethylcytidine, 1-methyl-pseudoisocytidine, pyrrolo-cytidine, pyrrolo-pseudoisocytidine, 2-thio-cytidine, 2-thio-5-methyl-cytidine, 4-thio -Pseudoisecytidine, 4-thio-1-methyl-pseudoisocitidine, 4-thio-1-methyl-1-deaza-pseudoisocitidine, 1-methyl-1-deaza-pseudoisocitidine , zebularine, 5-aza-zebularine, 5-methyl-zebularine, 5-aza-2-thio-zebularine, 2-thio-zebularine, 2-methoxy-c
  • the modified nucleoside is 2-aminopurine, 2,6-diaminopurine, 7-deaza-adenine, 7-deaza-8-aza-adenine, 7-deaza-2-amino Purine, 7-deaza-8-aza-2-aminopurine, 7-deaza-2,6-diaminopurine, 7-deaza-8-aza-2,6-diaminopurine, 1-methyladenosine , N6-methyladenosine, N6-isopentyladenosine, N6-(cis-hydroxyisopentyl)adenosine, 2-methylthio-N6-(cis-hydroxyisopentenyl)adenosine, N6-glycinylcarbamoyl Adenosine, N6-threonylcarbamoyladenosine, 2-methylthio-N6-threonylcarbamoyladenosine, N6,N6
  • the modified nucleoside is inosine, 1-methyl-inosine, pseudosine, pseudobutocin, 7-deaza-guanosine, 7-deaza-8-aza-guanosine, 6-thio-guano Sine, 6-thio-7-deaza-guanosine, 6-thio-7-deaza-8-aza-guanosine, 7-methyl-guanosine, 6-thio-7-methyl-guanosine, 7- Methylinosine, 6-methoxy-guanosine, 1-methylguanosine, N2-methylguanosine, N2,N2-dimethylguanosine, 8-oxo-guanosine, 7-methyl-8-oxo-guanosine, 1 -methyl-6-thio-guanosine, N2-methyl-6-thio-guanosine, and N2,N2-dimethyl-6-thio-guanosine.
  • the nucleotide may be modified at the major groove face and may include replacement of a hydrogen at C-5 of uracil with a methyl or halo group.
  • the modified nucleoside is 5'-O-(1-thiophosphate)-adenosine, 5'-O-(1-thiophosphate)-cytidine, 5'-O-(1-thiophosphate) )-Guanosine, 5'-O-(1-thiophosphate)-uridine or 5'-O-(1-thiophosphate)-pseudouridine.
  • the modified mRNA is 6-aza-cytidine, 2-thio-cytidine, ⁇ -thio-cytidine, 5-aminoallyl-uridine, 5-iodo-uridine, N1-methyl- Pseudouridine, 5,6-dihydrouridine, ⁇ -thio-uridine, 4-thio-uridine, 6-aza-uridine, 5-hydroxy-uridine, deoxy-thymidine, 5- Methyl-uridine, pyrrolo-cytidine, inosine, ⁇ -thio-guanosine, 6-methyl-guanosine, 5-methyl-cytidine, 8-oxo-guanosine, 7-deaza-guanosine, N1 -Methyl-adenosine, 2-amino-6-chloro-purine, N6-methyl-2-amino-purine, pseudo-iso-cytidine, 6-chloro-purine, N6-methyl-aden
  • the modified nucleic acid is pseudouridine ( ⁇ ), N1-methylpseudouridine (m1 ⁇ ), 5-methyl-uridine (5-methyluridine (m5U), 2-thio -uridine (2-thiouridine, s2U), 2'-O-methyl-uridine (2'-O-methyl-U, Um), 5-methylcytidine (5-methylcytidine, m5C) and 5-meth It may be characterized as being selected from the group consisting of 5-methoxyuridine (5moU), and most preferably may be selected from the group consisting of 5-methoxyuridine (5moU). It is not limited to this.
  • 'cationic lipid' includes lipids that are continuously cationic without being affected by pH changes or ionic lipids that are converted to cationic properties by pH changes.
  • the cationic lipid is dimethyldioctadecylammonium bromide (DDA), C12-200, 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane (DOTAP), 3 ⁇ -[N-(N′ ,N′-dimethylaminoethane carbamoyl cholesterol (3 ⁇ -[N-(N′,N′-dimethylaminoethane) carbamoyl cholesterol, DC-Chol), 1,2-dioleoyloxy-3-dimethylammonium propane (DODAP) ), 1,2-di-O-octadecenyl-3-triethylammonium propane (DOTMA), 1,2-dimyristoleoyl- sn-glycero-3-ethylphosphocholine (1,2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 14:1 Etyle PC), 1-palmitoyl-2-o
  • DDA
  • DOTAP Dioleoyl-3-trimethylammonium propane
  • DOTAP Dioleoyl-3-trimethylammonium propane
  • the composition for delivering mRNA containing modified nucleic acid containing a cationic lipid-based liposome may be characterized in that it additionally contains neutral lipid.
  • 'neutral lipid' includes lipids that are continuously neutral without being affected by pH changes or ionic lipids that are converted to neutral by pH changes.
  • the neutral lipid is 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE), 1,2- Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DMPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho Choline (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphocholine, DPPC), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), 1,2-dilinoleoyl -sn-glycero-3-phosphocholine (1,
  • DOPE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • DOPE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
  • a preferred neutral lipid has the structure of Formula 2 and is an auxiliary lipid for forming cationic liposomes or lipid nanoparticles. It is used as.
  • the liposome according to the present invention additionally includes Protamine, Albumin, Transferrin, PTD (Protein transduction domains), CPP (Cell penetrating peptide), PEG (Polyethylene glycol), Pegylated lipid, metal ion-bound lipid, and Macrophage targeting moiety.
  • PTD Protein transduction domains
  • CPP Cell penetrating peptide
  • PEG Polyethylene glycol
  • Pegylated lipid Pegylated lipid
  • metal ion-bound lipid metal ion-bound lipid
  • Macrophage targeting moiety one or more selected transfer factors may be additionally included.
  • the weight ratio of the cationic lipid and neutral lipid is 1:9 to 9.5:0.5, preferably 2:8 to 9:1, more preferably 3:7 to 8:2, and most preferably 4. :6 to 7:3, but is not limited thereto.
  • weight ratio is outside the above weight ratio, mRNA delivery efficiency may be significantly reduced.
  • the composition for delivering mRNA containing modified nucleic acid containing a cationic lipid-based liposome may be characterized in that it additionally contains cholesterol.
  • the weight ratio of cationic lipid and cholesterol is 6:1 to 1:3, preferably 4:1 to 1.0:2.5, more preferably 3:1 to 1:2, Most preferably, it may be 2.5:1.0 to 1.0:1.5, but is not limited thereto.
  • the weight ratio of the cationic lipid, neutral lipid and cholesterol is preferably 1.0 to 9.5: 0.5 to 9.0: 0.05 to 3.00.
  • it may be 3 to 8:7 to 1:0.45 to 7.00, more preferably 1.0 to 3.5:1.0 to 3.5:0.5 to 3.0, but is not limited thereto.
  • weight ratio is outside the above weight ratio, mRNA delivery efficiency may be significantly reduced.
  • the weight ratio of cationic lipid, neutral lipid and cholesterol is 2:2:1 (40:40:20, w/w/w), but is not limited thereto.
  • liposomes can be prepared by mixing cholesterol at a weight ratio of 0.20 to 0.85, preferably 0.4 to 0.6, relative to DOTAP. .
  • the mixing ratio of liposome and mRNA can be expressed as N:P ratio, and the mRNA expression and composition according to the N:P ratio affects the stability of
  • the N:P ratio of the liposome or lipid nanoparticle and mRNA may be characterized as 0.2:1.0 to 1.4:1.0, preferably 0.23:1.00 to 1.0:1.0. and more preferably 0.46:1.00 to 1.0:1.0, but is not limited thereto.
  • an N:P ratio of 0.6:1.0 was used as an example.
  • the composition for delivering mRNA containing a modified nucleic acid containing a cationic lipid-based liposome may additionally include an adjuvant, but this is not essential, and a sufficient vaccine effect is exhibited even if the adjuvant is not present.
  • the immune enhancer that can be used in the present invention corresponds to a pathogen-associated molecular pattern (PAMP), a group of substances that react to a pattern recognition receptor (PRR), CpG DNA, Lipoprotein, Flagella, poly I: C, saponin, Squalene, Tricaprin, 3D-MPL, and non-toxic lipooligosaccharide (detoxified lipooligosaccharide (dLOS)), but is not limited thereto.
  • PAMP pathogen-associated molecular pattern
  • PRR pattern recognition receptor
  • CpG DNA CpG DNA
  • Lipoprotein Lipoprotein
  • Flagella poly I: C, saponin, Squalene, Tricaprin, 3D-MPL, and non-
  • the non-toxic lipooligosaccharide (detoxified lipooligosaccharide, dLOS) may be a substance disclosed in Republic of Korea Patent No. 1509456 or Republic of Korea Patent No. 2042993, but is not limited thereto.
  • the mRNA may be characterized as encoding a peptide or protein that can act as an immunogen.
  • the mRNA may typically be an mRNA that has at least one open reading frame (ORF) that can be translated by a cell or organism accompanying the mRNA.
  • the product of this translation is an antigen, preferably a peptide or protein that can act as an immunogen.
  • the product may also be a fusion protein consisting of two or more immunogens, for example, a fusion protein consisting of two or more epitopes, peptides or proteins derived from the same or different viral proteins, wherein the epitopes, peptides or proteins are attached to the linker sequence. can be connected by
  • the mRNA may be understood as artificial mRNA, that is, an mRNA molecule that does not occur naturally.
  • Artificial mRNA molecules can be understood as non-natural mRNA molecules. Such mRNA molecules may be non-natural due to individual sequences (that do not occur naturally) and/or other modifications that do not occur naturally, such as structural alterations in nucleotides.
  • Artificial mRNA molecules can be designed and/or generated by genetic engineering methods to correspond to a desired artificial sequence of nucleotides (heterologous sequence).
  • the mRNA may be degraded in vivo (e.g. by exo- or endo-nucleases) and/or in vitro (e.g. by manufacturing processes prior to vaccine administration, e.g. in the administered vaccine solution).
  • modifications may be made to increase resistance to Stabilization of RNA can be achieved, for example, by provision of a 5'-CAP structure, a poly-A-tail, or any other UTR modification.
  • stabilization of RNA can be achieved by chemical modification or modification of the G/C content of the nucleic acid.
  • Various other methods are known in the art and are applicable to the present invention.
  • composition for delivering modified nucleic acid-containing mRNA containing the cationic lipid-based liposome of the present invention may be in the form of encapsulating the modified nucleic acid-containing mRNA inside the liposome, and the modified nucleic acid-containing mRNA is additionally bound not only inside the liposome but also outside the liposome. It may be in the form.
  • composition of the present invention may be characterized as having a multi-lamellar vesicle (MLV) structure, but is not limited thereto.
  • MLV multi-lamellar vesicle
  • composition of the present invention may be characterized as having a negative surface charge value, but is not limited thereto.
  • the present invention is directed to the prevention of diseases selected from the group consisting of cancer, tumor, autoimmune disease, genetic disease, inflammatory disease, viral infection, and bacterial infection, comprising the composition for mRNA delivery containing the above-described modified nucleic acid as an active ingredient. or to a pharmaceutical composition for treatment.
  • 'prevention' refers to all actions that suppress or delay the progression of the above-mentioned disease by administering the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • treatment' refers to any action in which the symptoms of the above-mentioned disease are improved or beneficially changed by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may comprise one or more pharmaceutically or physiologically acceptable carriers, diluents or excipients in combination.
  • the pharmaceutical composition may include a buffering agent such as neutral buffered saline, phosphate buffered saline, citric acid buffered solution, etc.; Carbohydrates such as glucose, mannose, sucrose or dextran, mannitol; protein; polypeptides or amino acids such as glycine; antioxidant; Chelating agents such as EDTA or glutathione; adjuvants (eg, aluminum hydroxide); and preservatives.
  • a buffering agent such as neutral buffered saline, phosphate buffered saline, citric acid buffered solution, etc.
  • Carbohydrates such as glucose, mannose, sucrose or dextran, mannitol
  • protein polypeptides or amino acids such as glycine
  • antioxidant Chelating agents such as EDTA or glutathione
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, such as intravenous administration, subcutaneous administration, intradermal administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration, intratumoral administration, intracerebral administration, intracranial administration, intrapulmonary administration, and rectal administration. It can be administered intravenously, but is not limited to this.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • “pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective amount refers to the type, severity, activity of the drug, and It can be determined based on factors including sensitivity, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, concurrently used drugs, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with the minimum amount without side effects, and this can be easily determined by a person skilled in the art.
  • the effective amount of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the patient's age, gender, condition, weight, absorption, inactivation rate and excretion rate of the active ingredient in the body, type of disease, and drug used in combination.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains the above-described modified nucleic acid-containing mRNA delivery composition as an active ingredient, the description of overlapping content is omitted to avoid excessive complexity of the specification.
  • the present invention includes the step of administering the composition for delivering mRNA containing the modified nucleic acid of the present invention to a patient in need of prevention or treatment for cancer, tumor, autoimmune disease, inflammatory disease, viral infection, and bacterial infection. It relates to methods of preventing or treating cancer, tumors, autoimmune diseases, inflammatory diseases, viral infections, and bacterial infections.
  • the dosage of the mRNA is 1 to 5 ⁇ g, 5 to 10 ⁇ g, 10 to 15 ⁇ g, 15 to 20 ⁇ g, 10 to 25 ⁇ g, 20 to 25 ⁇ g, 20 to 50 ⁇ g, 30 to 50 ⁇ g, 40 to 50 ⁇ g per dose.
  • the present invention relates to a vaccine containing a composition for delivering mRNA containing modified nucleic acid as an active ingredient.
  • the vaccine is influenza, coronavirus, shingles, human papillomavirus, Zika virus, herpes virus, AIDS virus, SFTS virus, measles virus, chicken pox virus, Ebola virus, MERS virus, hepatitis virus, avian influenza. , it may be a vaccine against viruses that can cause infection in humans and animals, such as rabies virus and foot-and-mouth disease virus, but is not limited to this.
  • the vaccine may be a multivalent vaccine
  • the viruses included in the multivalent vaccine include influenza, coronavirus, shingles, human papillomavirus, Zika virus, herpes virus, AIDS virus, SFTS virus, measles virus, chickenpox virus, It may be two or more viruses selected from the group consisting of viruses that can cause infection in humans and animals, such as Ebola virus, MERS virus, hepatitis virus, avian influenza, rabies virus, and foot-and-mouth disease virus, but is not limited thereto.
  • the vaccine comprises an mRNA containing at least one modified nucleic acid having an ORF encoding a polypeptide of at least one viral antigen or an immunogenic fragment thereof.
  • the vaccine is administered at an appropriate concentration in consideration of the body weight, age, dietary stage, and/or immunity of the subject to be administered within the scope of the purpose of preventing diseases caused by peptides or proteins in which the above-described mRNA can act as an immunogen. It may include a composition for delivering mRNA containing modified nucleic acid.
  • the vaccine may further include one or more selected from the group consisting of a carrier, diluent, excipient, and adjuvant.
  • a carrier diluent, excipient, and adjuvant.
  • the type of carrier is not particularly limited, but may include any solvent, dispersion medium, coating, stabilizer, preservative, antibacterial and antifungal agent, isotonic agent, absorption delay agent, etc.
  • the vaccine can be administered orally, parenterally, subcutaneously, intramuscularly, intradermally, sublingually, transdermally, rectally, transmucosally, superficially via inhalation, buccal administration, or a combination thereof.
  • the vaccine can be administered once or several times, and intermittently, for example, in the same amount or different doses every day for several days, weeks or months, depending on the desired duration and effectiveness of vaccination or treatment. Injections may be administered in the desired amount, by subcutaneous or intranasal spray, or alternatively, continuous infusion.
  • the vaccine may be characterized as being in the form of a freeze-dried formulation, but is not limited thereto.
  • the vaccine of the present invention contains the above-described modified nucleic acid-containing mRNA delivery composition as an active ingredient, description of overlapping content is omitted to avoid excessive complexity of the specification.
  • the present invention relates to a functional cosmetic composition containing the above-described modified nucleic acid-containing mRNA delivery composition as an active ingredient.
  • the cosmetic composition according to the present invention may contain ingredients commonly used in cosmetic compositions, such as metal ion sequestrants, active ingredients (e.g., Sodium Hyaluronate and Tocopheryl Acetate, etc.), preservatives, thickeners, and fragrances. Contains common adjuvants and carriers.
  • the cosmetic composition according to the present invention may be manufactured in a formulation common in the art, for example, an emulsified formulation or a solubilized formulation.
  • emulsified formulations include nutritional lotion, cream, and essence
  • solubilized formulations include flexible lotion.
  • the cosmetic composition of the present invention can be manufactured in the form of an adjuvant for topical or systemic application commonly used in the field of dermatology by containing a dermatologically acceptable medium or base in addition to cosmetics.
  • Suitable cosmetic formulations include, for example, solutions, gels, solid or anhydrous products, emulsions obtained by dispersing the oil phase in the water phase, suspensions, microemulsions, microcapsules, microgranules, or ionic (liposome) or non-ionic types. It may be provided in the form of a vesicular dispersant, cream, skin, lotion, powder, ointment, spray or conceal stick. Additionally, it can be manufactured in the form of foam or an aerosol composition further containing a compressed propellant.
  • the cosmetic composition of the present invention further contains fatty substances, organic solvents, solubilizers, thickening and gelling agents, softeners, antioxidants, suspending agents, stabilizers, foaming agents, fragrances, surfactants, water, ionic or non-ionic types.
  • Cosmetic such as emulsifiers, fillers, sequestering and chelating agents, preservatives, vitamins, blocking agents, wetting agents, essential oils, dyes, pigments, hydrophilic or lipophilic actives, lipid vesicles or any other ingredients commonly used in cosmetics.
  • it may contain adjuvants commonly used in the field of dermatology.
  • the above ingredients can be introduced in amounts commonly used in the field of dermatology.
  • Products to which the cosmetic composition of the present invention can be added include, for example, cosmetics such as astringent lotion, softening lotion, nourishing lotion, various creams, essences, packs, foundations, cleansing products, face washes, soaps, treatments, and serums. etc.
  • compositions of the present invention include skin lotion, skin softener, skin toner, astringent, lotion, milk lotion, moisture lotion, nutritional lotion, massage cream, nutritional cream, moisture cream, hand cream, essence, nutritional essence, pack, It includes formulations such as soap, shampoo, cleansing foam, cleansing lotion, cleansing cream, body lotion, body cleanser, emulsion, press powder, loose powder, patch, and spray.
  • the cosmetic composition of the present invention contains the above-described modified nucleic acid-containing mRNA delivery composition as an active ingredient, description of overlapping content is omitted to avoid excessive complexity of the specification.
  • the present invention provides a modified nucleic acid comprising a cationic lipid-based liposome for the prevention or treatment of diseases selected from the group consisting of cancer, tumor, autoimmune disease, genetic disease, inflammatory disease, viral infection, and bacterial infection. It relates to the use of a composition for delivering mRNA containing.
  • the present invention includes a cationic lipid-based liposome for the production of a drug for preventing or treating diseases selected from the group consisting of cancer, tumor, autoimmune disease, genetic disease, inflammatory disease, viral infection, and bacterial infection. It relates to the use of a composition for delivering mRNA containing modified nucleic acid.
  • N1-methylpseudouridine m1 ⁇ , TriLink BioTechnologies, USA
  • 5-methoxyuridine 5moU, TriLink BioTechnologies, USA
  • F. Luc Firefly Luciferase
  • EG-COVARo SARS-CoV-2 omicron spike protein mRNA
  • mRNA containing modified nucleic acid all uridines were replaced with the corresponding modified nucleic acid and synthesized.
  • the specifically synthesized mRNA is as follows, Luciferase and SARS-CoV-2 omicron spike protein mRNA (EG-COVARo) used. ) ORF and the amino acid sequence produced from it are shown in Table 1 below.
  • DOTAP CH2900014, Merck, Germany
  • DOPE L-R4-069, Corden Pharma, Germany
  • Cholesterol W004591, Sigma-Aldrich, USA
  • Lipid mixture was prepared by mixing the liquid solution at a certain weight ratio in a round bottom flask, and the lipid mixture containing DOTAP was volatilized with chloroform at 60°C for 30 minutes using a rotary evaporator (B491_R200, Buchi, Switzerland). , a lipid membrane film was produced on the wall of the flask.
  • An mRNA-liposome complex was prepared by mixing the liposome prepared in Example 2 (LP-DOTAP/DOPE/Cholesterol (40:40:20)) and 6 types of mRNA in 20mM HEPES buffer containing 4% sucrose.
  • the liposome solution (LP-DOTAP/DOPE/Cholesterol (40:40:20)) was used as a sample that was refrigerated immediately after preparation or for up to 2 weeks after preparation.
  • the mRNA solution was stored below -70°C and used after thawing on ice immediately before use.
  • 20mM HEPES buffer containing 4% sucrose was prepared and used immediately before the experiment, or prepared the day before the experiment and stored in the refrigerator (2-8°C).
  • the N/P ratio which is the mixing ratio of liposomes and mRNA, was calculated using the following formula.
  • N Number of DOTAP moles: Number of mRNA moles * Number of mRNA nucleotides
  • the N/P ratio of cationic liposomes and each mRNA was manufactured to be 0.6:1.0.
  • the mRNAs 2) and 3) prepared in Example 1 were mixed with cationic liposomes by the method of Example 3 to form an mRNA-liposome complex. Manufactured.
  • the prepared mRNA-liposome complex was injected intramuscularly (IM injection) into the left thigh at 100 ⁇ L each into 6-week-old, female Balb/c nude mice (Orient Bio, Korea).
  • mice were anesthetized by intraperitoneally administering 250 mg/kg of Avertin working solution, and 20 mL of 1x PBS was added to the luciferase substrate (VivoGloTM Luciferin, P1043, Promega, USA) to create a 50 mg/mL substrate solution ( Substrate working solution) was prepared, diluted to 15 mg/mL before administration, and 200 ⁇ L per mouse was injected intravenously (IV injection) through the caudal vein.
  • luciferase substrate VivoGloTM Luciferin, P1043, Promega, USA
  • IVIS In vivo imaging system
  • the mRNAs 5) and 6) prepared in Example 1 were mixed with cationic liposomes by the method of Example 3 to prepare an mRNA-liposome complex.
  • mRNA-liposome complexes were injected into the left thigh of 6-week-old, female Balb/c mice (Central Laboratory Animals, Korea), 100 ⁇ L per mouse, 3 times at 3-week intervals. Intramuscular injection (IM injection) was performed.
  • IM injection Intramuscular injection
  • mice Two weeks after the final immunization, mice were sacrificed, serum was separated, and SARS-CoV-2 omicron receptor binding domain (RBD) protein-specific total IgG antibody titer (log 10 ) was analyzed using indirect ELISA. Thus, the end-point titer was derived.
  • RBD SARS-CoV-2 omicron receptor binding domain
  • the mouse was anesthetized by intraperitoneally administering 250 mg/kg of Avertin working solution, and whole blood was collected through cardiac blood sampling.
  • the collected whole blood was transferred to a microtube and left at room temperature for 3 hours, centrifuged at 4°C and 15,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was transferred to a new microtube to obtain serum and stored at -20°C or below until analysis. It was stored in .
  • RBD antigen SARS-CoV-2 spike protein, MBS335825, Mybiosource, USA
  • 1x PBS 1x PBS
  • the solution in each well was removed with an ELISA washer (Hydroflexelisa, Tecan, Switzerland) and washed three times using washing buffer (500 ⁇ L of Tween-20 added to 1 L of 1x PBS diluted with purified water).
  • Dispense 200 ⁇ L/well of reagent diluent (1% BSA in PBS (w/v), prepared by dissolving 1 g of BSA in 100 mL of PBS) into the immunoplate, cover with a sealing film, and place in a 37°C reactor. It was held for 1 hour. The solution in each well was removed with an ELISA washer and washed three times using washing buffer. Reagent diluent was dispensed into the immunoplate at 100 ⁇ L/well.
  • the negative control group (Buffer administration group) was diluted 1:50 and the vaccine administration group was diluted 1:100, and then diluted at 1:10 in B to G of the immunoplate. Dispense 100 ⁇ L into each column, mix the sample by pipetting within the well several times, then take 100 ⁇ L from column 1 and place it in column 2, thereby serially diluting the sample by 1/2 up to 12 rows on the ELISA plate. did.
  • hyper serum was diluted 1:200 using a reagent diluent, then dispensed at 100 ⁇ L into each row of immunoplate H, and then administered in half in the same manner as above. Sequential dilution was performed.
  • the immunoplate was covered with a sealing film and reacted in a reactor at 37°C for 2 hours.
  • the solution in each well was removed with an ELISA washer and washed three times using washing buffer.
  • the solution in each well was removed with an ELISA washer and washed three times using washing buffer.
  • the TMB substrate solution equilibrated to room temperature was dispensed into the immunoplate at 100 ⁇ L/well and reacted in the dark at room temperature for 12 minutes. The reaction was stopped by dispensing 100 ⁇ L/well of 1 NH 2 SO 4 solution into the immunoplate, and the absorbance was measured at 450 nm using an ELISA reader (Epoch, Biotek, USA).
  • Example 6 Confirmation of inflammatory response according to type of modified nucleic acid
  • the mRNAs 4), 5) and 6) prepared in Example 1 were mixed with cationic liposomes by the method of Example 3 to form an mRNA-liposome complex. Manufactured.
  • J774A.1 cells (TIB-67, ATCC, USA), a mouse immune cell line, were seeded at 1 x 10 6 cells/well in a 24-well cell culture plate and cultured overnight in a CO 2 incubator at 37°C.
  • each mRNA-liposome complex was treated at 10 ⁇ g/well based on mRNA, and cultured overnight in a CO 2 incubator at 37°C.
  • LPS was treated at 10 ⁇ g/well. Afterwards, the plate was centrifuged at 3,000 rpm and 4°C for 3 minutes, the supernatant was removed, and the cell culture fluid was collected.
  • the concentration of inflammatory cytokine markers secreted in each culture was measured using ELISA method, and the ELISA kit used is as follows.
  • the secretion amount of IL-1 ⁇ , IL-6, TNF- ⁇ , and IFN- ⁇ in the mRNA + Liposome group using unmodified nucleic acid was approximately 1.9 to 159.5 times that of the 5moU modified mRNA + Liposome group. It was confirmed that the secretion amounts of IL-6, TNF- ⁇ , and IFN- ⁇ in the m1 ⁇ modified mRNA + Liposome group were approximately 2.5 to 94.3 times higher than those in the 5moU modified mRNA + Liposome group.
  • the inflammatory response is lower than that of non-modified nucleic acid due to the influence of non-inflammatory mRNA.
  • the 5moU modified mRNA + Liposome group showed a lower level of inflammatory cytokine secretion compared to the m1 ⁇ modified mRNA + Liposome group, confirming that the combination of 5moU modified mRNA + Liposome significantly reduces the inflammatory response.
  • composition for delivering mRNA containing modified nucleic acid according to the present invention has excellent storage stability and exhibits high intracellular delivery and expression rates in vivo , thereby improving the stability of mRNA vaccines or therapeutic agents other than mRNA vaccines for cancer treatment or mRNA vaccines for preventing viral infection. Efficiency can be improved.

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Abstract

본 발명은 양이온성 지질 기반의 리포좀을 포함하는 변형핵산 함유mRNA 전달용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 의한 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물은 보관 안정성 및 in vivo에서 체내 발현율이 우수하여 암 치료용 mRNA 백신 또는 바이러스 감염 예방용 mRNA 백신 외 기타 mRNA 백신 또는 치료제의 안정성 및 효율을 향상시킬 수 있다.

Description

변형핵산 함유 MRNA의 체내 전달용 조성물
본 발명은 변형핵산 함유 mRNA 체내 전달용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 양이온성 지질 기반의 리포좀을 포함하는 변형핵산 함유 mRNA 체내 전달용 조성물에 관한 것이다.
유전자 치료법 및 유전자 백신은 의약 분야에서 이미 증명되고 일반에 적용되는 기술로, 유전적 질환뿐만 아니라 자가면역질환, 감염성 질환, 암 또는 종양 관련 질환, 염증성 질환 등도 치료대상이 될 수 있다.
유전자 백신은 타겟 유전자를 코딩하는 DNA 및 RNA를 직접 동물에 주입하면, 타겟 유전자가 살아있는 동물에서 발현하고, 이 발현에 의해 면역이 가능하다는 것이 보고되면서부터 개발되기 시작하였다 (Wolff JA et al. Science, 247:1465-8, 1990).
유전자 백신 접종은 박테리아 표면의 특징적인 구성요소, 바이러스 입자, 종양 항원 등과 같은 선택된 항원에 대해 원하는 면역 반응을 일으킬 수 있게 한다. 대체로, 백신 접종은 현대 의학의 중추적인 성과 중 하나이다. 그러나 효과적인 백신은 현재 한정된 수의 질환에만 이용될 수 있다. 따라서, 백신 접종에 의해 예방할 수 없는 감염증은 여전히 매년 수백만 명의 사람들에게 영향을 미친다.
유전자 치료 또는 유전자 백신 접종에서 DNA와 RNA가 유전자 투여를 위한 핵산 분자로서 사용될 수 있으며, DNA가 RNA에 비해 상대적으로 안정하고 다루기 쉬운 것으로 알려져 있다. 그러나 DNA의 경우, 환자의 유전체 내로 투여된 DNA-절편이 원하지 않은 위치에 삽입되어, 유전자가 손상되는 경우, 잠재적인 위험이 발생할 수 있다. 추가적으로, 원하지 않는 항-DNA 항체가 나타낼 수 있으며, 또 다른 문제점은, DNA 투여 이후 전사/번역에 의해 발현되는 펩타이드 또는 단백질의 발현 수준이 한정적이라는 점이다. DNA 전사를 조절하는 특정 전사 인자의 존재 여부가 투여된 DNA의 발현 수준에 주요한 영향을 미치며, 특정 전사 인자가 없는 경우에는 DNA 전사에 의해 충분한 양의 RNA가 생성되지 않아, 결과적으로, 번역되어 생성되는 펩타이드 또는 단백질의 수준도 한정된다.
반면, RNA를 유전자 투여를 위한 도구로 사용할 경우, RNA는 전사가 필요하지 않아 DNA처럼 핵으로 들어가야 할 필요없이 세포질 내에서 바로 단백질을 합성할 수 있어, 세포 염색체 내로 끼어들어가 원치 않는 유전자 손상을 일으킬 염려가 없다. 또한, DNA에 비해 반감기가 짧아 장기 유전자 변형을 유도하지 않는다 (Sayour EJ, et al., J Immunother Cancer 2015;3:13, 2015). 일반적인 RNA 백신은 세포 안에 전달되게 되면 단기간만 활성화되어 타겟 단백질을 발현하게 되고, 수일 안에 효소학적 반응으로 인해 파괴되고, 발현한 타켓 항원 (단백질)에 대한 특이적인 면역 반응은 남아있게 된다.
또한, 유전자 투여를 위한 도구로 RNA를 사용하는 경우, 핵막을 통과할 필요가 없이 세포막만을 통과하면 작용하기 때문에, DNA 보다 적은 양을 사용하여도, DNA와 유사한 양의 타겟 단백질을 발현할 수 있다. 또한, RNA는 자체가 면역 보강원성을 가지고 있어, DNA에 비해 소량만 투여하여도 동일한 면역효과를 볼 수 있다.
유전자 백신 접종을 위해 DNA 대신 RNA를 이용함으로써, 원치않는 게놈으로의 통합 및 항-DNA 항체의 생성 위험을 최소화하거나 방지할 수 있다. 그러나 RNA는 편재하는 RNase에 의해 용이하게 분해될 수 있는 상당히 불안정한 분자 종이다.
지난 수년간 많은 발전이 이루어졌으나, 면역반응을 유발할 수 있는 mRNA 백신 접종을 위한 효율적인 방법으로, 항원의 조기 분해 또는 세포에서의 mRNA의 비효율적인 방출로 인한 mRNA의 비효율적인 번역에 의해 투여효과가 손상되지 않는 방법을 제공할 필요성이 당해 분야에 여전히 남아 있다. 나아가, 잠재적인 안전성 우려를 감소시키고, 백신을 제 3세계에서 감당할 수 있게 하기 위하여, mRNA 백신의 용량을 감소시킬 필요 또한 존재한다.
생물학적 시스템에서 원하는 반응을 얻기 위한 핵산 전달과 관련하여서는 아직 해결하여야 할 과제가 많다. 핵산기반의 치료제는 엄청난 가능성이 있으나, 이 가능성을 실현하기 위해서는 세포 또는 유기체 내에서 적절한 부위로 핵산을 효과적으로 전달할 필요가 있다.
그러나 치료 및 예방 목적에서의 핵산의 사용은 현재 두 가지 문제와 직면하고 있다. 첫째, 유리 RNA는 혈액 내에서 뉴클레아제에 의한 분해에 취약하다. 둘째, 유리 RNA는 이를 번역하는 번역 기구가 존재하는 세포 내 구획에 접근하는 능력이 제한적이다. 중성 지질, 콜레스테롤, PEG, 페길화 지질 및 올리고뉴클레오타이드와 같은 다른 지질 구성요소와 양이온성 지질로부터 형성된 지질 나노입자를 도입하는 것이 혈액에서 RNA의 분해를 차단하고 핵산의 세포 흡수를 촉진하기 위해서 시도되고 있다.
리포좀 (Liposome)이나 지질나노입자 (Lipid nanoparticle)와 같은 지질 기반의 전달체를 이용할 경우, mRNA는 통상적으로 외부에 흡착 (Adsorption)되거나, 내부에 봉입 (Encapsulation)되는 방법을 이용하게 된다. 특히 mRNA를 전달체 외부에 흡착시킬 경우에는 일반적으로 단일의 리포좀이 아닌, 리포좀과 핵산의 응집체로 존재하는 것으로 알려져 있으며, 지질의 조합, 핵산의 상태 및 핵산과 리포좀의 비율에 따라, 흡착력에 차이가 있고, 안정성에도 영향이 있기 때문에, 이에 대한 최적화가 필요하다.
또한, mRNA의 발현능에 있어서, 일반적으로 전달체의 in vitro에서 발현이 검증되었다 하더라도 in vivo에서의 발현의 결과는 차이가 있을 수 있다는 문제가 있다. In vivo에서는 지질의 구성 및 전달체의 물리화학적 특성에 따라, 혈액 내 단백질의 응집으로 인한 half-life 및 bio-distribution 감소, 지질 구성에 따른 cellular uptake 방식 차이, 그리고 ECM (Extracellular matrix)에 의한 barrier 등이, 세포 내로 전달되는 효율을 감소시키는 요인이다.
한편 체내로 전달된 mRNA의 체내 발현 효율을 높이기 위하여 mRNA의 염기를 변형하여 제조한 변형 mRNA를 사용하는 방법이 시도되고 있으며, 변형핵산을 이용한 mRNA는 변형되지 않은 핵산을 이용한 mRNA에 비하여 체내 발현 효율이 높은 것으로 알려져 있다 (US8278036B2, KR10-2171849B1, KR10-2014601B1). 주로 사용되는 변형핵산으로는 슈도우리딘, N1-메틸-슈도우리딘 등이 있으나, 각각의 변형핵산과 전달체의 조합에 따른 최적의 전달체와 변형핵산의 조합에는 최적화가 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 변형핵산을 포함하는 mRNA를 안정적으로 체내에 전달하여 세포 내 발현 효율을 높임으로써 안정적인 단백질 발현을 유도할 수 있는 전달체 개량 기술을 찾고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 특정 변형핵산을 함유한 mRNA와 양이온성 리포좀 기반의 [리포좀 + mRNA 복합체]가 낮은 염증 반응을 보이고 in vivo에서의 체내 발현율이 우수함을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 낮은 염증 반응 및 우수한 체내 발현율을 나타내는, 양이온성 지질 기반 리포좀을 포함하는 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 함유하는 암, 종양, 자가면역질환, 유전질환, 염증성질환, 바이러스 감염 및 박테리아 감염으로 구성된 군에서 선택되는 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 함유하는 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 양이온성 지질 기반 리포좀을 포함하는 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 함유하는 암, 종양, 자가면역질환, 유전질환, 염증성질환, 바이러스 감염 및 박테리아 감염으로 구성된 군에서 선택되는 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 함유하는 백신을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 양이온성 지질 기반 리포좀을 포함하는 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암, 종양, 자가면역질환, 유전질환, 염증성질환, 바이러스 감염 및 박테리아 감염으로 구성된 군에서 선택되는 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 암, 종양, 자가면역질환, 유전질환, 염증성질환, 바이러스 감염 및 박테리아 감염으로 구성된 군에서 선택되는 질병의 예방 또는 치료를 위한 양이온성 지질 기반 리포좀을 포함하는 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 암, 종양, 자가면역질환, 유전질환, 염증성질환, 바이러스 감염 및 박테리아 감염으로 구성된 군에서 선택되는 질병의 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 양이온성 지질 기반 리포좀을 포함하는 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물의 사용을 제공한다.
도 1은 mRNA-리포좀 복합체에서 변형핵산의 종류에 따른 마우스 내 mRNA 발현 효율을 나타낸 것이다.
도 2는 변형핵산의 종류에 따라 제조한 mRNA-리포좀 복합체를 투여한 마우스의 혈청을 ELISA로 분석한 RBD 특이적 IgG의 항체가를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 핵산을 이용한 체내 유전자 전달에 있어서, 바이러스나 박테리아 표면의 특징적인 구성요소, 바이러스 입자 및 종양 항원 등과 같은 선택된 항원에 대해 원하는 면역반응을 유도하고 치료용 단백질 발현을 유도하여 질병을 예방 또는 치료하는 방법이 개발됨에 따라, mRNA의 세포 내 발현 효율을 높여 안정적인 효과를 나타내게 할 수 있는 방법을 찾고자 하였으며, 이에 양이온성 지질 기반 리포좀을 이용한 mRNA 전달용 조성물을 제조하고, 상기 mRNA 전달용 조성물이 낮은 염증 반응을 보이고 in vivo에서의 체내 발현율이 우수한 것을 확인하였다.
특히, 특정 종류의 변형핵산을 포함한 mRNA 전달용 조성물의 성능이 월등히 뛰어나다는 것을 확인하였다.
본 발명의 양이온성 지질 기반 리포좀을 이용한 mRNA 전달용 조성물에서, mRNA는 양이온성 지질 기반 리포좀과 복합체를 이루는 형태로 존재할 수 있으며, 이에 따라 양이온성 지질 기반 리포좀을 이용한 mRNA 전달용 조성물과, [리포좀 + mRNA의 복합체]는 동일한 의미로 사용된다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명은 양이온성 지질 기반 리포좀을 포함하는 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 변형핵산은 하나 이상의 백본 변형, 당 변형 또는 염기 변형된 핵산을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
당 변형:
본 발명에 기술된 바와 같은 mRNA 서열을 포함하는 변형된 mRNA 화합물 내로 혼입될 수 있는 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 당 모이어티에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 2’ 하이드록실 기 (OH)는 다수의 상이한 “옥시” 또는 “데옥시” 치환기로 변형되거나 교체될 수 있다. “옥시”-2’ 하이드록실 기 변형의 예로는 알콕시 또는 알릴옥시 (-OR, 예를 들어, R = H, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당); 폴리에틸렌글리콜 (PEG), -O(CH2CH2O)nCH2CH2OR; 동일한 리보스 당의 4’ 탄소에, 예를 들어 메틸렌 가교에 의해, 2’하이드록실이 연결된 “잠긴 (locked)” 핵산 (LNA); 및 아미노 기 (-O-아미노, 이때, 아미노 기, 예를 들어 NRR은 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노, 에틸렌디아민, 폴리아미노일 수 있음) 또는 아미노알콕시를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
“데옥시” 변형은 수소, 아미노 (예를 들어 NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴 아미노, 디헤테로아릴 아미노, 또는 아미노산)를 포함하거나; 아미노 기가 링커를 통해 당에 부착될 수 있으며, 이때, 링커는 원자 C, N, 및 O 중 하나 이상을 포함한다.
당 기는 또한, 리보스 내 상응하는 탄소에 비해 반대의 입체 화학적 배치를 갖는 하나 이상의 탄소를 함유할 수 있다. 따라서, 변형된 mRNA는 예를 들어 당과 같은 아라비노스를 함유하는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
백본 변형:
포스페이트 백본은 본 발명에 기술된 바와 같은 mRNA 서열을 포함하는 변형된 mRNA 화합물 내로 혼입될 수 있는, 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드에서 추가적으로 변형될 수 있다. 백본의 포스페이트 기는 산소 원자 중 하나 이상을 다른 치환기로 교체함으로써 변형될 수 있다. 또한, 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 비변형된 포스페이트 모이어티의 본 설명에 기술된 변형된 포스페이트로의 완전한 교체를 포함할 수 있다. 변형된 포스페이트 기의 예로는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트에스테르, 하이드로겐 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 포스포로디티오에이트는 황에 의해 교체된 양쪽 비-연결 산소를 갖는다.
포스페이트 링커는 또한, 연결 산소의 질소 (가교된 포스포로아미데이트), 황 (가교된 포스포로티오에이트) 및 탄소 (가교된 메틸렌-포스포네이트)로의 치환에 의해 변형될 수 있다.
염기 변형:
본 발명에 기술된 바와 같은 mRNA 서열을 포함하는 변형된 mRNA 화합물 내로 혼입될 수 있는 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 핵염기 모이어티에서 추가적으로 변형될 수 있다. mRNA에서 발견된 핵염기의 예로는 아데닌, 구아닌, 시토신 및 우라실을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 본 설명에 기술된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 메이저 그루브 (major groove) 페이스에서 화학적으로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 메이저 그루브의 화학적 변형은 아미노 기, 티올 기, 알킬 기, 또는 할로 기를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 뉴클레오타이드 유사체/변형은 바람직하게는 2-아미노-6-클로로퓨린리보사이드-5’-트리포스페이트, 2-아미노퓨린-리보사이드-5’-트리포스페이트; 2-아미노아데노신-5’-트리포스페이트, 2’-아미노-2’-데옥시시티딘-트리포스페이트, 2-티오시티딘-5’-트리포스페이트, 2-티오우리딘-5’-트리포스페이트, 2’-플루오로티미딘-5’-트리포스페이트, 2’-O-메틸-이노신-5’-트리포스페이트, 4-티오우리딘-5’-트리포스페이트, 5-아미노알릴시티딘-5’-트리포스페이트, 5-아미노알릴우리딘-5’-트리포스페이트, 5-브로모시티딘-5’-트리포스페이트, 5-브로모우리딘-5’-트리포스페이트, 5-브로모-2’-데옥시시티딘-5’-트리포스페이트, 5-브로모-2’-데옥시우리딘-5’-트리포스페이트, 5-요오도시티딘-5’-트리포스페이트, 5-요오도-2’-데옥시시티딘-5’-트리포스페이트, 5-요오도우리딘-5’-트리포스페이트, 5-요오도-2’-데옥시우리딘-5’-트리포스페이트, 5-메틸시티딘-5’-트리포스페이트, 5-메틸우리딘-5’-트리포스페이트, 5-프로피닐-2’-데옥시시티딘-5’-트리포스페이트, 5-프로피닐-2’-데옥시우리딘-5’-트리포스페이트, 6-아자시티딘-5’-트리포스페이트, 6-아자우리딘-5’-트리포스페이트, 6-클로로퓨린리보사이드-5’-트리포스페이트, 7-데아자아데노신-5’-트리포스페이트, 7-데아자구아노신-5’-트리포스페이트, 8-아자아데노신-5’-트리포스페이트, 8-아지도아데노신-5’-트리포스페이트, 벤지미다졸-리보사이드-5’-트리포스페이트, N1-메틸아데노신-5’-트리포스페이트, N1-메틸구아노신-5’-트리포스페이트, N6-메틸아데노신-5’-트리포스페이트, O6-메틸구아노신-5’-트리포스페이트, 슈도우리딘-5’-트리포스페이트, 또는 퓨로마이신-5’-트리포스페이트, 잔토신-5’-트리포스페이트로부터 선택되는 염기 변형으로부터 선택된다.
바람직한 것은 5-메틸시티딘-5'-트리포스페이트, 7-데아자구아노신-5'-트리포스페이트, 5-브로모시티딘-5'-트리포스페이트, 및 슈도우리딘-5'-트리포스페이트로 구성된 염기 변형된 뉴클레오타이드의 군으로부터 선택된 염기변형에 대한 뉴클레오타이드다.
일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 피리딘-4-온 리보뉴클레오사이드, 5-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시우리딘, 3-메틸우리딘, 5-카르복시메틸-우리딘, 1-카르복시메틸-슈도우리딘, 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸우리딘, 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘, 1-타우리노메틸-4-티오-우리딘, 5-메틸-우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디하이드로우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-메톡시우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 및 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 5-아자-시티딘, 슈도이소시티딘, 3-메틸-시티딘, N4-아세틸시티딘, 5-포밀시티딘, N4-메틸시티딘, 5-하이드록시메틸시티딘, 1-메틸-슈도이소시티딘, 피롤로-시티딘, 피롤로-슈도이소시티딘, 2-티오-시티딘, 2-티오-5-메틸-시티딘, 4-티오-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 제부라린 (zebularine), 5-아자-제부라린, 5-메틸-제부라린, 5-아자-2-티오-제부라린, 2-티오-제부라린, 2-메톡시-시티딘, 2-메톡시-5-메틸-시티딘, 4-메톡시-슈도이소시티딘 및 4-메톡시-1-메틸-슈도이소시티딘을 포함한다.
다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2,6-디아미노퓨린, 1-메틸아데노신, N6-메틸아데노신, N6-이소펜틸아데노신, N6-(시스-하이드록시이소펜틸)아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-하이드록시이소펜테닐) 아데노신, N6-글리시닐카르바모일아데노신, N6-트레오닐카르바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐카르바모일아데노신, N6,N6-디메틸아데노신, 7-메틸아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 및 2-메톡시-아데닌을 포함한다.
다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 이노신, 1-메틸-이노신, 위오신, 위부토신, 7-데아자-구아노신, 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신, 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸구아노신, N2-메틸구아노신, N2,N2-디메틸구아노신, 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신, 및 N2,N2-디메틸-6-티오-구아노신을 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드는 메이저 그루브 페이스에서 변형될 수 있으며 우라실의 C-5에서 수소의 메틸기 또는 할로 기로의 교체를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드는 5'-O-(1-티오포스페이트)-아데노신, 5'-O-(1-티오포스페이트)-시티딘, 5'-O-(1-티오포스페이트)-구아노신, 5'-O-(1-티오포스페이트)-우리딘 또는 5'-O-(1-티오포스페이트)-슈도우리딘이다.
추가적인 구현예에서, 변형된 mRNA는 6-아자-시티딘, 2-티오-시티딘, α-티오-시티딘, 5-아미노알릴-우리딘, 5-요오도-우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 5,6-디하이드로우리딘, α-티오-우리딘, 4-티오-우리딘, 6-아자-우리딘, 5-하이드록시-우리딘, 데옥시-티미딘, 5-메틸-우리딘, 피롤로-시티딘, 이노신, α-티오-구아노신, 6-메틸-구아노신, 5-메틸-시티딘, 8-옥소-구아노신, 7-데아자-구아노신, N1-메틸-아데노신, 2-아미노-6-클로로-퓨린, N6-메틸-2-아미노-퓨린, 슈도-이소-시티딘, 6-클로로-퓨린, N6-메틸-아데노신, α-티오-아데노신, 8-아지도-아데노신, 7-데아자-아데노신으로부터 선택된 뉴클레오사이드 변형을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 변형핵산은 슈도우리딘 (pseudouridine, Ψ), N1-메틸-슈도우리딘 (N1-methylpseudouridine, m1Ψ), 5-메틸-우리딘 (5-methyluridine, m5U), 2-티오-우리딘 (2-thiouridine, s2U), 2’-O-메틸-우리딘 (2′-O-methyl-U, Um), 5-메틸-시티딘 (5-methylcytidine, m5C) 및 5-메톡시-우리딘 (5-methoxyuridine, 5moU)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 가장 바람직하게는 5-메톡시-우리딘 (5-methoxyuridine, 5moU)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 '양이온성 지질'은 pH 변화의 영향 없이 지속적으로 양이온성을 가지는 지질 또는 pH 변화에 의하여 양이온성으로 전환되는 이온성 지질을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 양이온성 지질은 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDA), C12-200, 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄프로페인 (DOTAP), 3β-[N-(N′,N′-디메틸아미노에테인 카바모일 콜레스테롤 (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane) carbamoyl cholesterol, DC-Chol), 1,2-디올레오일옥시-3-디메틸암모늄프로페인 (DODAP), 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리에틸암모늄 프로페인 (1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane, DOTMA), 1,2-디미리스토레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1,2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 14:1 Etyle PC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 16:0/18:1 Ethyl PC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 18:1 Ethyl PC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin, 18:0 Ethyl PC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 16:0 Ethyl PC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 14:0 Ethyl PC), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin, 12:0 Ethyl PC), N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3-아미노-프로필)아미노]부틸카복사미도)에틸]-3,4-디[올레일옥시]-벤자마이드 (N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropyl)amino]-4-[di(3-amino-propyl)amino]butylcarboxamido)ethyl]-3,4-di[oleyloxy]-benzamide, MVL5), 1,2-디미리스토일-3-디메틸암모늄-프로페인 (1,2-dimyristoyl-3-dimethylammonium-propane, 14:0 DAP), 1,2-디팔미토일-3-디메틸암모늄-프로페인 (1,2-dipalmitoyl-3-dimethylammonium-propane, 16:0 DAP), 1,2-디스테아로일-3-디메틸암모늄-프로페인 (1,2-distearoyl-3-dimethylammonium-propane, 18:0 DAP), N-(4-카복시벤질)-N,N-디메틸-2,3-비스(올레오일옥시)프로판-1-아미늄 (N-(4-carboxybenzyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)propan-1-aminium, DOBAQ), 1,2-스테아로일-3-트리메틸암모늄-프로페인 (1,2-stearoyl-3-trimethylammonium-propane, 18:0 TAP), 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄-프로페인 (1,2-dipalmitoyl-3-trimethylammonium-propane, 16:0 TAP), 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄-프로페인 (1,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium-propane, 14:0 TAP) 및 N4-콜레스테릴-스퍼민 (N4-Cholesteryl-Spermine, GL67)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 C12-200 또는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄프로페인 (DOTAP)일 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어, 바람직한 양이온성 지질의 예인 "DOTAP (Dioleoyl-3-trimethylammonium propane)"은 화학식 1의 구조를 가지는 양이온성 유화제로, 섬유 유연제로 사용되고 있으며, 근래에는 리포좀 또는 지질 나노입자를 형성하는 핵산 운반체를 비롯한, 단백질, 화합물, 펩타이드 등의 운반체로 사용되고 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2023013302-appb-img-000001
본 발명에 있어서, 양이온성 지질 기반 리포좀을 포함하는 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물은 추가적으로 중성 지질이 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 '중성 지질'은 pH 변화의 영향 없이 지속적으로 중성을 가지는 지질 또는 pH 변화에 의하여 중성으로 전환되는 이온성 지질을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 중성지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC), 1,2-디리노레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DLPC), 포스파티딜세린 (PS), 포스포에탄올아민 (PE), 포스파티딜글리세롤 (PG), 포스포릭액시드 (PA) 포스파티딜콜린 (PC) 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1’-미오-이노시톨) (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol), DOPI) 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포이노시톨 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol, DSPI)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE) 일 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명에 있어, 바람직한 중성 지질의 예인 "DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)"는 화학식 2의 구조를 가지며, 양이온성 리포좀 또는 지질 나노입자를 형성하기 위한 보조 지질로 사용된다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2023013302-appb-img-000002
본 발명에 따른 리포좀에는 추가적으로 Protamine, Albumin, Transferrin, PTD (Protein transduction domains), CPP (Cell penetrating peptide), PEG (Polyethylene glycol), Pegylated lipid, 금속이온이 결합된 지질 및 Macrophage targeting moiety로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 전달용 인자가 추가로 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 양이온성 지질과 중성지질의 중량비는 1:9 내지 9.5:0.5, 바람직하게는 2:8 내지 9:1, 더욱 바람직하게는 3:7 내지 8:2, 가장 바람직하게는 4:6 내지 7:3일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 중량 비율을 벗어나는 경우, mRNA 전달 효율이 현저히 떨어질 수 있다.
본 발명에 있어서, 양이온성 지질 기반 리포좀을 포함하는 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물은 추가적으로 콜레스테롤이 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 리포좀 또는 지질 나노입자에 있어, 양이온성 지질과 콜레스테롤의 중량비는 6:1 내지 1:3, 바람직하게는 4:1 내지 1.0:2.5, 더욱 바람직하게는 3:1 내지 1:2, 가장 바람직하게는 2.5:1.0 내지 1.0:1.5일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 본 발명에 따른 양이온성 지질, 중성 지질 및 콜레스테롤이 모두 포함되는 경우, 양이온성 지질, 중성 지질 및 콜레스테롤의 중량비는 1.0 내지 9.5 : 0.5 내지 9.0 : 0.05 내지 3.00, 바람직하게는 3 내지 8 : 7 내지 1 : 0.45 내지 7.00, 더욱 바람직하게는 1.0 내지 3.5 : 1.0 내지 3.5 : 0.5 내지 3.0 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 중량 비율을 벗어나는 경우, mRNA 전달 효율이 현저히 떨어질 수 있다.
본 발명의 일 양태에서 양이온성 지질, 중성 지질 및 콜레스테롤의 중량비는 2:2:1 (40:40:20, w/w/w)를 사용하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
콜레스테롤이 추가로 포함될 경우, 예시적으로 DOTAP:DOPE를 1:1의 중량비로 사용할 경우, 콜레스테롤을 DOTAP 대비 0.20 내지 0.85, 바람직하게는 0.4 내지 0.6의 중량비의 비율로 혼합하여 리포좀을 제조할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 양이온성 지질 기반 리포좀을 포함하는 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물에 있어서, 리포좀과 mRNA의 혼합비율은 N:P ratio로 표시할 수 있으며, N:P ratio에 따라 mRNA 발현 및 조성물의 안정성에 영향을 미친다.
본 발명에 있어서, 상기 리포좀 또는 지질나노입자와 mRNA의 N:P ratio는 0.2:1.0 내지 1.4:1.0 인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 0.23:1.00 내지 1.0:1.0인 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.46:1.00 내지 1.0:1.0일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에서는 예시적으로 0.6:1.0의 N:P ratio를 사용하였다.
본 발명에 있어서, 양이온성 지질 기반 리포좀을 포함하는 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물은 면역증강제를 추가로 포함할 수 있으나, 필수적인 것은 아니며, 면역증강제가 존재하지 않더라도 충분한 백신 효과를 나타낸다. 본 발명에서 사용 가능한 면역증강제는 병원체 연관 분자유형 (Pathogen-associated molecular pattern, PAMP)에 해당하여 패턴인식수용체 (Pathogen recognition receptor, PRR)에 반응하는 물질군, CpG DNA, Lipoprotein, Flagella, poly I:C, 사포닌, 스쿠알렌 (Squalene), 트리카프린 (Tricaprin), 3D-MPL, 비독성 리포올리고사카라이드 (detoxified lipooligosaccharide, dLOS)로 구성된 군으로부터 선택된 면역증강제인 것을 특징으로 하며, 이에 한정된 것은 아니다.
상기 면역증강제에 있어서, 상기 비독성 리포올리고사카라이드 (detoxified lipooligosaccharide, dLOS)는 대한민국 등록특허 제1509456호 또는 대한민국 등록특허 제2042993호에 개시된 물질일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 mRNA는 면역원으로 작용할 수 있는 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 mRNA는 전형적으로 mRNA와 함께 제공되는 세포 또는 유기체에 의해 번역될 수 있는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임 (Open Reading Frame, ORF)을 갖는 mRNA일 수 있다. 이 번역의 산물은 항원, 바람직하게 면역원으로 작용할 수 있는 펩타이드 또는 단백질이다. 이 산물은 또한, 둘 이상의 면역원으로 이루어진 융합 단백질, 예를 들어 동일하거나 상이한 바이러스 단백질로부터 유래된 둘 이상의 에피토프, 펩타이드 또는 단백질로 이루어지는 융합 단백질일 수 있고, 이때, 에피토프, 펩타이드 또는 단백질은 링커 서열에 의해 연결될 수 있다.
또한, 상기 mRNA는 인공 mRNA, 즉 자연적으로 발생하지 않는 mRNA 분자인 것으로 이해될 수 있다. 인공 mRNA 분자는 비-천연 mRNA 분자로서 이해될 수 있다. 이러한 mRNA 분자는 (자연적으로 발생하지 않는) 개별 서열 및/또는 자연적으로 발생하지 않는 다른 변경, 예컨대 뉴클레오타이드의 구조적 변경으로 인해 비-천연적일 수 있다. 인공 mRNA 분자는 뉴클레오타이드의 원하는 인공 서열 (이종서열)에 상응하는 유전자 조작 방법에 의해 설계 및/또는 생성될 수 있다.
나아가, 상기 mRNA는 생체 내 분해 (예를 들어 엑소- 또는 엔도-뉴클레아제에 의한 분해) 및/또는 생체 외 분해 (예를 들어 백신 투여 전 제조 과정에 의해, 예를 들어 투여되는 백신 용액의 제조 과정에서)에 대한 내성을 증가시키는 변형을 나타낼 수 있다. RNA의 안정화는 예를 들어 5'-CAP 구조, 폴리-A-꼬리, 또는 임의의 기타 UTR 변형의 제공에 의해 달성될 수 있다. 또한, RNA의 안정화는 화학적 변형 또는 핵산의 G/C 함량의 변형에 의해 달성될 수 있다. 다양한 다른 방법이 당해 분야에 공지되어 있으며, 본 발명의 적용이 가능하다.
본 발명의 양이온성 지질 기반 리포좀을 포함하는 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물은 리포좀 내부에 변형핵산 함유 mRNA가 봉입되는 형태일 수 있고, 리포좀 내부뿐만 아니라, 외부에도 변형핵산 함유 mRNA가 추가로 결합된 형태일 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 조성물은 multi-lamellar vesicle (MLV) 구조를 가지는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 조성물은 표면 전하 값이 음의 값 (Negative value)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, 상술한 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 함유하는 암, 종양, 자가면역질환, 유전질환, 염증성 질환, 바이러스 감염 및 박테리아 감염으로 구성된 군에서 선택되는 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 '예방'이란 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여에 의해 상술한 질환을 억제시키거나 이의 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 '치료'란 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여에 의해 상술한 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 제약상 또는 생리학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합으로 포함할 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 완충제, 예컨대 중성 완충 염수, 포스페이트 완충 염수, 시트르산 완충 용액 등; 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩타이드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 어주번트 (예를 들어, 수산화알루미늄); 및 방부제를 포함할수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 종양 내 투여, 뇌내 투여, 두개골내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효량은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 포함하므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 암, 종양, 자가면역질환, 염증성질환, 바이러스 감염 및 박테리아 감염에 대한 예방 또는 치료가 필요한 환자에게, 본 발명의 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암, 종양, 자가면역질환, 염증성질환, 바이러스 감염 및 박테리아 감염에 대한 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
상기 mRNA의 투여량은 용량 당 1 내지 5 ㎍, 5 내지 10 ㎍, 10 내지 15 ㎍, 15 내지 20 ㎍, 10 내지 25 ㎍, 20 내지 25 ㎍, 20 내지 50 ㎍, 30 내지 50 ㎍, 40 내지 50 ㎍, 40 내지 60 ㎍, 60 내지 80 ㎍, 60 내지 100 ㎍, 50 내지 100 ㎍, 80 내지 120 ㎍, 40 내지 120 ㎍, 40 내지 150 ㎍, 50 내지 150 ㎍, 50 내지 200 ㎍, 80 내지 200 ㎍, 100 내지 200 ㎍, 120 내지 250 ㎍, 150 내지 250 ㎍, 180 내지 280 ㎍, 200 내지 300 ㎍, 50 내지 300 ㎍, 80 내지 300 ㎍, 100 내지 300 ㎍, 40 내지 300 ㎍, 50 내지 350 ㎍, 100 내지 350 ㎍, 200 내지 350 ㎍, 300 내지 350 ㎍, 320 내지 400 ㎍, 40 내지 380 ㎍, 40 내지 100 ㎍, 100 내지 400 ㎍, 200 내지 400 ㎍, 300 내지 400 ㎍, 30 내지 500 ㎍, 40 내지 500 ㎍, 50 내지 500 ㎍, 100 내지 500 ㎍, 200 내지 500 ㎍, 300 내지 500 ㎍, 400 내지 500 ㎍, 40 내지 600 ㎍, 100 내지 600 ㎍, 200 내지 600 ㎍, 400 내지 600 ㎍, 40 내지 700 ㎍, 100 내지 700 ㎍, 300 내지 700 ㎍, 500 내지 700 ㎍, 40 내지 내지 800 ㎍, 100 내지 800 ㎍, 200 내지 800 ㎍, 400 내지 800 ㎍, 600 내지 800 ㎍일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 포함하는 백신에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 백신은 인플루엔자, 코로나바이러스, 대상포진, 사람파필로마바이러스, 지카바이러스, 헤르페스바이러스, 에이즈바이러스, SFTS 바이러스, 홍역바이러스, 수두바이러스, 에볼라바이러스, 메르스바이러스, 간염바이러스, 조류 인플루엔자, 광견병바이러스 및 구제역바이러스 등 인간과 동물에 감염을 일으킬 수 있는 바이러스에 대한 백신일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 백신은 다가 백신일 수 있으며, 다가 백신에 포함되는 바이러스는 인플루엔자, 코로나바이러스, 대상포진, 사람파필로마바이러스, 지카바이러스, 헤르페스바이러스, 에이즈바이러스, SFTS 바이러스, 홍역바이러스, 수두바이러스, 에볼라바이러스, 메르스바이러스, 간염바이러스, 조류 인플루엔자, 광견병바이러스 및 구제역바이러스 등 인간과 동물에 감염을 일으킬 수 있는 바이러스로 구성된 군에서 선택되는 2 이상의 바이러스 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 백신은 적어도 하나의 바이러스 항원의 폴리펩타이드 또는 이의 면역원성 단편을 암호화하는 ORF를 갖는 적어도 하나의 변형핵산을 함유한 mRNA를 포함한다.
본 발명에서, 상기 백신은 상술한 mRNA가 면역원으로 작용할 수 있는 펩타이드 또는 단백질에 의해 야기되는 질병의 예방 목적 범위에서 투여 대상의 체중, 연령, 식이 단계 및/또는 면역력을 고려하여 적절한 농도로 상술한 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 백신은 담체, 희석제, 부형제, 및 어주번트 (Adjuvant)로 이루어진 군에서 선택되는 한가지 이상을 더 포함할 수 있다. 담체는 그 종류를 특별히 한정하지 않으나, 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 안정제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장제, 흡수지연제 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 백신은 경구, 비경구, 피하, 근육내, 피내, 설하, 경피, 직장, 경점막, 흡입을 통한 표면적, 협측 투여를 통해, 또는 이의 조합으로 투여될 수 있다.
본 발명에서, 상기 백신은 백신 접종 또는 치료의 원하는 기간 및 유효성에 따라 1회 또는 여러 번, 또한 간헐적으로, 예컨대 수일, 수주 또는 수개월 동안 매일 동일한 양 또는 다른 투여량으로 투여될 수 있다. 주사는 원하는 양으로 주사하거나 피하 혹은 비강에 분무하여 주입할 수 있다, 또는 대안적으로 연속 주입할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 백신은 동결 건조된 제형 형태인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 백신은 상술한 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 포함하므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상술한 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 금속이온봉쇄제, 활성성분 (예를 들면, Sodium Hyaluronate 및 Tocopheryl Acetate 등), 방부제, 점증제 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 당 업계에서 일반적인 제형, 예를 들어 유화 제형이나 가용화 제형 등의 형태로 제조될 수 있다. 유화 제형으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등을 예로 들 수 있으며, 가용화 제형으로는 유연화장수를 예로 들 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 화장품 이외에도 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소 적용 또는 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.
적합한 화장품의 제형으로는 예를 들면, 용액, 겔, 고체 또는 반죽무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형 (리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱 (Conceal stick)의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말 (Foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종 크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 패취, 분무제 등의 제형을 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 상술한 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 포함하므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 암, 종양, 자가면역질환, 유전질환, 염증성질환, 바이러스 감염 및 박테리아 감염으로 구성된 군에서 선택되는 질병의 예방 또는 치료를 위한 양이온성 지질 기반 리포좀을 포함하는 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 암, 종양, 자가면역질환, 유전질환, 염증성질환, 바이러스 감염 및 박테리아 감염으로 구성된 군에서 선택되는 질병의 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 양이온성 지질 기반 리포좀을 포함하는 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물의 사용에 관한 것이다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 변형핵산 함유 IVT mRNA 제조
변형핵산으로는 N1-메틸-슈도우리딘 (N1-methylpseudouridine, m1Ψ, TriLink BioTechnologies, USA) 및 5-메톡시-우리딘 (5-methoxyuridine, 5moU, TriLink BioTechnologies, USA)을 사용하였으며, 대상 mRNA template는 Firefly Luciferase (F. Luc) 및 SARS-CoV-2 omicron spike protein mRNA (EG-COVARo)을 사용하였다.
변형핵산을 포함하는 mRNA의 경우에는 모든 우리딘을 해당하는 각각의 변형핵산으로 치환하여 합성하였으며, 구체적으로 합성한 mRNA는 아래와 같고, 사용한 Luciferase와 SARS-CoV-2 omicron spike protein mRNA (EG-COVARo)의 ORF와 이로 제작되는 아미노산 서열은 하기 표 1과 같다.
1) Unmodified Firefly Luciferase mRNA
2) 5moU modified Firefly Luciferase mRNA
3) m1Ψ modified Firefly Luciferase mRNA
4) Unmodified SARS-CoV-2 omicron spike protein mRNA
5) 5moU modified SARS-CoV-2 omicron spike protein mRNA
6) m1Ψ modified SARS-CoV-2 omicron spike protein mRNA
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실시예 2: Film method를 이용한 리포좀 전달체의 제조
DOTAP (CH2900014, Merck, Germany), DOPE (LP-R4-069, Corden Pharma, Germany) 및 Cholesterol (W004591, Sigma-Aldrich, USA)에 클로로포름을 각각 혼합하여 40:40:20의 비율이 되도록 하고, 37℃에서 10분간 완전히 용해시켜 액상 용액으로 제조하였다.
둥근바닥 플라스크에 상기 액상 용액을 일정 중량비로 혼합하여 지질 혼합물 (Lipid mixture)을 만들고, Rotary evaporator (B491_R200, Buchi, Switzerland)를 이용하여 DOTAP을 함유하는 지질 혼합물을 60℃에서 30분간 클로로포름을 휘발시키고, 플라스크 벽면에 지질막 필름을 제작하였다.
플라스크에 4% 수크로오스를 함유하는 20 mM HEPES 버퍼를 넣고 60℃에서 지질막을 녹여 리포좀을 형성하였다. 형성된 리포좀은 동적광산란 분석장비로 입자의 사이즈, 제타포텐셜, 분산도를 측정하였다. 제조된 리포좀은 시험 전까지 냉장 (2-8℃) 보관하였다.
실시예 3: mRNA-리포좀 복합체 제조
4% 수크로오스를 함유한 20 mM HEPES 버퍼에 실시예 2에서 제조한 리포좀 (LP-DOTAP/DOPE/Cholesterol (40:40:20)) 및 6 종류의 mRNA를 혼합하여 mRNA-리포좀 복합체를 제조하였다.
이때, 리포좀 용액 (LP-DOTAP/DOPE/Cholesterol (40:40:20))은 제조 직후 또는 최대 제조 후 2주 이내 기간 동안 냉장 보관된 시료를 사용하였다. mRNA 용액은 -70℃ 이하에 보관하였고, 사용 직전 아이스 위에서 해동 후 사용하였다. 4% 수크로오스를 함유한 20 mM HEPES 버퍼는 실험 직전 만들어 사용하거나 실험 전일 제조한 후 냉장 (2-8℃) 보관하였다.
리포좀과 mRNA의 혼합비율인 N/P 비율 (N/P ratio)은 다음의 계산식으로 계산하였다.
N : P = DOTAP mol 수:mRNA mol 수 * mRNA nucleotide 수
양이온성 리포좀과 각각의 mRNA의 N/P ratio가 0.6:1.0이 되도록 제작하였다.
실시예 4: 변형핵산 종류에 따른 mRNA 발현 효율 확인
양이온성 리포좀과 혼합하였을 시 변형핵산에 따른 in vivo 발현 효율을 확인하기 위해 실시예 1에서 제조한 2), 3)의 mRNA를 실시예 3의 방법으로 양이온성 리포좀과 혼합하여 mRNA-리포좀 복합체를 제조하였다.
제조된 mRNA-리포좀 복합체를 6주령, 암컷 Balb/c nude 마우스 (오리엔트바이오, 대한민국)에 각 100 μL씩 좌측 대퇴부에 근육내 주사 (Intramuscular injection, IM injection)하였다.
투여 6시간 후 Avertin working solution을 250 mg/kg으로 복강 투여하여 마우스를 마취시키고, 루시퍼레이즈 기질 (VivoGlo™ Luciferin, P1043, Promega, USA)에 1x PBS를 20 mL 넣어 50 mg/mL의 기질 용액 (Substrate working solution)을 만든 후, 투여 전 15 mg/mL로 희석하여 마우스 한 마리당 200 μL씩 미정맥을 통하여 정맥주사 (Intravenous injection; IV injection)하였다.
기질투여 직후, In vivo imaging system (IVIS) (Ami HTX, Spectral Instrument, USA)에 마우스를 넣고 노출 시간을 60초로 설정하여 촬영하고, 투여부위의 루시퍼레이즈 발현 정도 (Region of interest, ROI)를 수치화하였다.
그 결과, 도 1에 기재된 바와 같이 5moU modified mRNA + Liposome 군의 ROI 값이 m1ψ modified mRNA + Liposome 군 보다 약 4.3~10.2배 정도 높은 것을 확인하였다.
실시예 5. 변형핵산 종류에 따른 면역원성 확인
변형핵산 종류에 따른 in vivo 면역원성을 확인하기 위하여 실시예 1에서 제조한 5) 및 6)의 mRNA를 실시예 3의 방법으로 양이온성 리포좀과 혼합하여 mRNA-리포좀 복합체를 제조하였다.
mRNA 함량을 기준으로 각각 5, 10, 20 및 40 ug의 mRNA-리포좀 복합체를 6주령, 암컷 Balb/c 마우스 (중앙실험동물, 대한민국)의 좌측 대퇴부에 한 마리당 100 μL씩 3주 간격 3회 근육내 주사 (Intramuscular injection, IM injection)하였다.
최종 면역화 2주 후에 마우스를 희생하여 혈청을 분리하고, indirect ELISA법으로 SARS-CoV-2 omicron 수용체 결합 도메인 (Receptor binding domain, 이하 ‘RBD’) 단백질 특이적 total IgG 항체가 (log10)를 분석하여 end-point titer를 도출하였다.
5-1: 혈액 채취
mRNA-리포좀 복합체 마지막 투여 2주 후에 Avertin working solution을 250 mg/kg으로 복강 투여하여 마우스를 마취하고, 심장 채혈을 통해 전혈을 채취하였다. 상기 채취된 전혈을 마이크로튜브로 옮겨 상온에 3시간 동안 정치한 후, 4℃, 15,000 rpm 조건으로 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 새로운 마이크로튜브로 옮겨 혈청을 확보해 분석 전까지 -20℃ 이하에 보관하였다.
5-2: 항체가 분석
1x PBS를 이용하여 RBD 항원 (SARS-CoV-2 spike protein, MBS335825, Mybiosource, USA)을 1 ㎍/mL로 희석한 후 이뮤노플레이트 (Immunoplate)에 100 μL/well씩 분주하고 실링 필름 (Sealing film)을 덮어 4℃ 냉장고에 하룻밤 정치하였다. ELISA washer (Hydroflexelisa, Tecan, Switzerland)로 각 well의 용액을 제거하고 세척 버퍼 (20x PBS를 정제수로 희석한 1 L의 1x PBS에 500 μL의 Tween-20을 투입)를 사용하여 3회 세척하였다. 이뮤노플레이트에 시약 희석제 (Reagent diluent, 1% BSA in PBS (w/v), 1 g의 BSA를 100 mL의 PBS에 녹여 제조)를 200 μL/well씩 분주하고 실링 필름을 덮어 37℃ 반응기에서 1시간 동안 정치하였다. ELISA washer로 각 well의 용액을 제거하고 세척버퍼를 사용하여 3회 세척하였다. 시약 희석제를 이뮤노플레이트에 100 μL/well씩 분주하였다.
시약 희석제 (1% BSA in PBS)를 이용하여 상기에서 확보한 혈청 중 음성대조군 (Buffer 투여군)은 1:50으로, 백신 투여군은 1:100으로 희석한 후, 이뮤노플레이트의 B~G의 1열에 100 μL씩 분주하고, well 내에서 수회 파이펫팅하여 시료를 혼합한 후, 1열에서 100 μL를 취해 2번 열에 넣는 방법으로 ELISA 플레이트 상에서 시료를 12열까지 1/2 순차 희석 (Serial dilution)하였다. 이때, 시험의 적합성 평가를 위해, 시약 희석제를 이용하여 과혈청 (Hyper serum)을 1:200으로 희석한 뒤 각 이뮤노플레이트 H의 1열에 100 μL로 분주하고 상기와 같은 방법으로 1/2씩 순차 희석하였다.
이뮤노플레이트를 실링 필름으로 덮어 37℃ 반응기에서 2시간 동안 반응시켰다. ELISA washer로 각 well의 용액을 제거하고 세척 버퍼를 사용하여 3회 세척하였다. 시약 희석제를 이용하여 goat anti-mouse IgG 항체 (Jackson Laboratory, USA)를 1:5,000으로 희석한 후, 이뮤노플레이트에 100 μL씩 분주하고 실링 필름을 덮어 37℃ 반응기에서 1시간 동안 반응시켰다. ELISA washer로 각 well의 용액을 제거하고 세척 버퍼를 사용하여 3회 세척하였다.
상온과 평형화시킨 TMB 기질용액을 이뮤노플레이트에 100 μL/well씩 분주하고 상온의 암소에서 12분 동안 반응시켰다. 1 N H2SO4 용액을 이뮤노플레이트에 100 μL/well씩 분주하여 반응을 정지하고 ELISA reader (Epoch, Biotek, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 도 2에 기재된 바와 같이, 마우스 한 마리 당 mRNA 함량 기준 5 μg, 10 μg가 투여된 군에서 5moU modified mRNA + Liposome 군의 결합항체가가 m1ψ modified mRNA + Liposome 군 보다 높은 것을 확인하였다.
실시예 6: 변형핵산 종류에 따른 염증 반응 확인
변형핵산 종류에 따른 mRNA-리포좀 복합체의 염증 반응을 확인하기 위하여 실시예 1에서 제조한 4), 5) 및 6)의 mRNA를 실시예 3의 방법으로 양이온성 리포좀과 혼합하여 mRNA-리포좀 복합체를 제조하였다.
마우스 면역세포주인 J774A.1 세포 (TIB-67, ATCC, USA)를 24-well cell culture 플레이트에 1 x 106 세포/well로 seeding한 후 37℃, CO2 배양기에서 하룻밤 배양하였다. 세포의 confluency가 70~80%일 때, mRNA 기준으로 10 μg/well로 각 mRNA-리포좀 복합체를 세포에 처리하였으며, 37℃, CO2 배양기에서 하룻밤동안 배양하였다. 양성대조군으로는 10 μg/well로 LPS를 처리하였다. 이 후 3,000 rpm, 4℃ 조건에서 3분간 플레이트를 원심분리한 후 상층액을 걷어 세포 배양액을 수집하였다.
각 배양액 내 분비된 염증성 사이토카인 마커의 농도는 ELISA 방법을 이용하여 측정되었으며, 사용된 ELISA kit는 다음과 같다.
- IL-1β: Mouse IL-1β quantikine ELISA (SMLB00C, R&D systems, USA)
- IL-6: Mouse IL-6 quantikine ELISA (SM6000B, R&D systems, USA)
- TNF-α: Mouse TNF-α quantikine ELISA (SMTA00B, R&D systems, USA)
- IFN-α: Mouse IFN-α all subtype quantikine ELISA (MFNAS0, R&D systems, USA)
그 결과, 표 2에 기재되 바와 같이, 비변형핵산을 이용한 mRNA + Liposome 군의 IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-α 분비량이 5moU modified mRNA + Liposome 군 보다 약 1.9~159.5배 높았으며, m1ψ modified mRNA + Liposome 군의 IL-6, TNF-α, IFN-α 분비량도 5moU modified mRNA + Liposome 군 보다 약 2.5~94.3배 높은 것을 확인하였다.
Figure PCTKR2023013302-appb-img-000009
일반적으로 변형핵산을 사용하여 IVT를 수행하는 경우, non-inflammatory mRNA의 영향으로 비변형핵산에 비하여 염증반응이 낮다고 알려져 있다. 이러한 변형핵산 중에서도 5moU modified mRNA + Liposome 군은 m1ψ modified mRNA + Liposome 군 대비 낮은 수준의 염증성 사이토카인 분비량을 나타낸 것으로 미루어 보아 5moU modified mRNA + Liposome의 조합에서 염증반응을 크게 감소시킨다는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물은 보관 안정성이 우수하고, in vivo에서 높은 세포내 전달율과 발현율을 나타내어 암 치료용 mRNA 백신 또는 바이러스 감염 예방용 mRNA 백신 외 기타 mRNA 백신 또는 치료제의 안정성 및 효율을 향상시킬 수 있다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (17)

  1. 양이온성 지질 기반 리포좀을 포함하는 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 변형핵산은 슈도우리딘 (Pseudouridine, Ψ), N1-메틸-슈도우리딘 (N1-methylpseudouridine, m1Ψ), 5-메틸-우리딘 (5-methyluridine, m5U), 2-티오-우리딘 (2-thiouridine, s2U), 2’-O-메틸-우리딘 (2′-O-methyl-U, Um), 5-메틸-시티딘 (5-methylcytidine, m5C) 및 5-메톡시-우리딘 (5-methoxyuridine, 5moU)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 리포좀은 추가로 중성 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 리포좀은 콜레스테롤을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDA), C12-200, 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄프로페인 (DOTAP), 3β-[N-(N′,N′-디메틸아미노에테인 카바모일 콜레스테롤 (3β-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane) carbamoyl cholesterol, DC-Chol), 1,2-디올레오일옥시-3-디메틸암모늄프로페인 (DODAP), 1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리에틸암모늄 프로페인 (1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane, DOTMA), 1,2-디미리스토레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1,2-dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 14:1 Etyle PC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 16:0/18:1 Ethyl PC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 18:1 Ethyl PC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 18:0 Ethyl PC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 16:0 Ethyl PC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 14:0 Ethyl PC), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine, 12:0 Ethyl PC), N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3-아미노-프로필)아미노]부틸카복사미도)에틸]-3,4-디[올레일옥시]-벤자마이드 (N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropyl)amino]-4-[di(3-amino-propyl)amino]butylcarboxamido)ethyl]-3,4-di[oleyloxy]-benzamide, MVL5), 1,2-디미리스토일-3-디메틸암모늄-프로페인 (1,2-dimyristoyl-3-dimethylammonium-propane,14:0 DAP), 1,2-디팔미토일-3-디메틸암모늄-프로페인 (1,2-dipalmitoyl-3-dimethylammonium-propane, 16:0 DAP), 1,2-디스테아로일-3-디메틸암모늄-프로페인 (1,2-distearoyl-3-dimethylammonium-propane, 18:0 DAP), N-(4-카복시벤질)-N,N-디메틸-2,3-비스(올레오일옥시)프로판-1-아미늄(N-(4-carboxybenzyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)propan-1-aminium, DOBAQ), 1,2-스테아로일-3-트리메틸암모늄-프로페인 (1,2-stearoyl-3-trimethylammonium-propane, 18:0 TAP), 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄-프로페인 (1,2-dipalmitoyl-3-trimethylammonium-propane, 16:0 TAP), 1,2-디미리스토일-3-트리메틸암모늄-프로페인 (1,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium-propane, 14:0 TAP) 및 N4-콜레스테릴-스퍼민 (N4-Cholesteryl-Spermine, GL67)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 중성 지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC), 1,2-디리노레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DLPC), 포스파티딜세린 (PS), 포스포에탄올아민 (PE), 포스파티딜글리세롤 (PG), 포스포릭액시드 (PA) 포스파티딜콜린 (PC) 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포이노시톨 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (DOPI) 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포이노시톨 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (DSPI)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물.
  7. 제3항에 있어서, 상기 양이온성 지질과 중성지질의 중량비는 1:9 내지 9.5:0.5인 것을 특징으로 하는 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물.
  8. 제4항에 있어서, 상기 양이온성 지질과 콜레스테롤의 중량비는 6:1 내지 1:3인 것을 특징으로 하는 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 양이온성 지질, 중성 지질 및 콜레스테롤의 중량비는 1.0 내지 9.5:0.5 내지 9.0:0.05 내지 3.00인 것을 특징으로 하는 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 변형핵산 함유 mRNA는 면역원으로 작용할 수 있는 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 리포좀과 변형핵산 함유 mRNA의 N:P ratio는 0.23:1.00 내지 1.39:1.00 인 것을 특징으로 하는 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 면역증강제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 면역증강제는 PAMP, 사포닌, CpG DNA, Lipoprotein, Flagella, poly I:C, 스쿠알렌 (Squalene), 트리카프린 (Tricaprin), 3D-MPL, 및 비독성 리포올리고사카라이드 (detoxified lipooligosaccharide, dLOS)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 면역증강제를 포함하는 것을 특징으로 하는 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 함유하는 암, 종양, 자가면역질환, 유전질환, 염증성 질환, 바이러스 감염 및 박테리아 감염으로 구성된 군에서 선택되는 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 함유하는 백신.
  16. 제15항에 있어서, 상기 백신은 동결 건조된 제형 형태인 것을 특징으로 하는 백신.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 변형핵산 함유 mRNA 전달용 조성물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물.
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