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WO2024025343A1 - 항-ror1 항체 및 이의 용도 - Google Patents

항-ror1 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Publication number
WO2024025343A1
WO2024025343A1 PCT/KR2023/010847 KR2023010847W WO2024025343A1 WO 2024025343 A1 WO2024025343 A1 WO 2024025343A1 KR 2023010847 W KR2023010847 W KR 2023010847W WO 2024025343 A1 WO2024025343 A1 WO 2024025343A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
antibody
antigen
variable region
light chain
Prior art date
Application number
PCT/KR2023/010847
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
민병귀
유민영
김지원
김종빈
Original Assignee
(주)에임드바이오
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)에임드바이오 filed Critical (주)에임드바이오
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Priority to EP23847000.9A priority patent/EP4563597A1/en
Priority to IL318546A priority patent/IL318546A/en
Priority to AU2023313641A priority patent/AU2023313641A1/en
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to an anti-ROR1 (Receptor Tyrosine Kinase Like Orphan Receptor 1) antibody or antigen-binding fragment thereof, a nucleic acid encoding the same, a recombinant expression vector containing the nucleic acid, a host cell transfected with the recombinant expression vector, and the antibody or its Method for producing an antigen-binding fragment, a dual or multispecific antibody comprising the antibody or an antigen-binding fragment thereof, an scFv of the antibody, and a second binding domain comprising at least one scFv of an antibody that binds to an immune cell activating antigen.
  • ROR1 Receptor Tyrosine Kinase Like Orphan Receptor 1
  • ROR Receptor Tyrosine Kinase Like Orphan Receptor
  • RTK Receptor Tyrosine Kinase
  • the ROR family consists of ROR1 and ROR2, and the amino acid sequence similarity between the two proteins amounts to approximately 60%.
  • the ROR family consists of Ig, Cysteine-rich, and Kringle domains extracellularly and tyrosine kinase, Ser/Thr-rich, and Proline-rich domains internally.
  • ROR1 is expressed during embryogenesis and affects various early cell activities, but its expression gradually decreases as adult tissue formation progresses.
  • ROR1 is expressed in the intermediate stage of the normal B cell maturation process, but is not expressed in mature B and T cells or monocytes.
  • ROR1 is overexpressed in various tumor cells, it is considered to be a fetal gene for malignant tumors. It has been reported that ROR1 acts as a receptor for Wnt5a, activating non-canonical Wnt signals, resulting in cancer cell proliferation and metastasis. Accordingly, ROR1 began to emerge as a representative target for anticancer antibody treatments.
  • CLL chronic lymphocytic leukemia
  • AML acute myeloid leukemia
  • ALL acute lymphocytic leukemia
  • DLBCL diffuse large B-cell lymphoma
  • each anti-ROR1 antibody has different characteristics, it is possible to develop a variety of anticancer antibodies according to the cancer type in which the antigen is expressed.
  • cancer types with a high recurrence rate, such as CLL, the unmet demand for anticancer antibodies can be satisfied.
  • the purpose of the present invention is to provide a novel antibody or antigen-binding fragment thereof against ROR 1 (Receptor Tyrosine Kinase Like Orphan Receptor 1).
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant expression vector containing the above nucleic acid or a host cell transfected with the recombinant expression vector.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to ROR1.
  • Another object of the present invention is to provide a dual/multispecific antibody or an immune cell engaging dual/multispecific antibody comprising the antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • Another object of the present invention is to provide an antibody-drug conjugate (ADC) in which the antibody or antigen-binding fragment thereof is bound to a drug.
  • ADC antibody-drug conjugate
  • Another object of the present invention is to provide a chimeric antigen receptor (CAR) containing the scFv of the antibody as an antigen-binding site of the extracellular domain, an immune cell into which the chimeric antigen receptor is introduced, and a composition for combination treatment containing the immune cell. is to provide.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • Another object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating cancer or a composition for preventing or treating cancer comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof, the dual or multispecific antibody, the antibody-drug conjugate, the chimeric antigen receptor or the immune cell.
  • the goal is to provide treatment methods.
  • Another object of the present invention is to provide a use of the antibody or antigen-binding fragment thereof, the dual or multispecific antibody, the antibody-drug conjugate, the chimeric antigen receptor, or the immune cell for the prevention or treatment of cancer. .
  • Another object of the present invention is to provide the use of the antibody or antigen-binding fragment thereof, the dual or multispecific antibody, the antibody-drug conjugate, the chimeric antigen receptor or the immune cell for the production of a drug for preventing or treating cancer. There is something to do.
  • the present invention provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to ROR 1 (Receptor Tyrosine Kinase Like Orphan Receptor 1), including:
  • Heavy chain CDR1 comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 16,
  • a heavy chain CDR2 comprising one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 17 to SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 184, and SEQ ID NO: 185,
  • Heavy chain CDR3 comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 42 to SEQ ID NO: 65,
  • a light chain CDR1 comprising one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 66 to SEQ ID NO: 86,
  • a light chain CDR2 comprising one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 87 to SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 186, and SEQ ID NO: 187, and
  • a light chain CDR3 comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 103 to SEQ ID NO: 121.
  • the present invention also provides a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention also provides a recombinant expression vector containing the above nucleic acid.
  • the present invention also provides host cells transfected with the above recombinant expression vector.
  • the present invention also includes the steps of culturing host cells to produce antibodies; and isolating and purifying the produced antibody.
  • a method for producing an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to ROR1 is provided.
  • the present invention also provides a dual/multispecific antibody or an immune cell engaging dual/multispecific antibody comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention also provides an antibody-drug conjugate (ADC) in which the antibody or antigen-binding fragment thereof is bound to a drug.
  • ADC antibody-drug conjugate
  • the present invention also provides a chimeric antigen receptor (CAR) comprising an extracellular domain including an antigen binding site, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain, wherein the antigen binding site of the extracellular domain is the scFv of the antibody.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the present invention also provides immune cells containing the chimeric antigen receptor (CAR).
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the present invention also provides a composition for preventing or treating cancer, comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof, the dual or multispecific antibody, the antibody-drug conjugate, the chimeric antigen receptor, or the immune cell.
  • the present invention also provides a use of the antibody or antigen-binding fragment thereof, the dual or multispecific antibody, the antibody-drug conjugate, the chimeric antigen receptor, or the immune cell for the prevention or treatment of cancer.
  • the present invention also provides the use of the antibody or antigen-binding fragment thereof, the dual or multispecific antibody, the antibody-drug conjugate, the chimeric antigen receptor, or the immune cell for the production of a drug for preventing or treating cancer.
  • Figure 1 shows the results of analyzing ROR1 binding characteristics according to clones through ELISA.
  • Figure 2 shows the results confirming that anti-ROR1 antibodies cross-link to human ROR1 and mouse ROR1.
  • Figure 3 shows the results of analyzing anti-ROR1 antibody clones binding to each domain through ELISA.
  • Figure 4 shows the results of measuring the ROR1 expression level of cells used in the examples of the present invention.
  • Figure 5 shows the results of analysis of the binding ability of the antibodies used in the examples of the present invention with the ROR1 antigen expressed in AMB-LC-0003T lung cancer patient-derived cells.
  • Figure 6 shows the results of analysis of the binding ability of the antibodies used in the examples of the present invention with the ROR1 antigen expressed in the Jeko-1 cell line.
  • Figure 7 shows the results of cell internalization analysis of the antibodies used in the examples of the present invention.
  • Figure 8 shows the structure of anti-ROR1 antibody-drug conjugate.
  • Figure 9 shows the results of purity analysis of the antibody-drug conjugate used in the examples of the present invention.
  • Figure 10 shows the results of analysis of the average number of drug molecules per antibody molecule of the antibody-drug conjugates used in the examples of the present invention.
  • Figure 11 shows the results of ELISA analysis of ROR1 binding of the antibody-drug conjugate used in the examples of the present invention.
  • Figure 12 shows the results of in vitro toxicity evaluation of the antibody-drug conjugate used in the examples of the present invention on patient-derived cells.
  • Figure 13 shows the results of in vitro toxicity evaluation of the antibody-drug conjugate used in the examples of the present invention on patient-derived cells, confirming that it exhibits significantly increased efficacy compared to the existing antibody-drug conjugate.
  • the present invention provides a heavy chain CDR1 comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 to SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 184, and SEQ ID NO: 185.
  • Heavy chain CDR2 containing the above amino acid sequence
  • heavy chain CDR3 containing at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 42 to SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66 to SEQ ID NO: 86, including at least one amino acid sequence selected from the group Light chain CDR1, SEQ ID NO: 87 to SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 186, light chain CDR2 comprising one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 187, and one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 103 to SEQ ID NO: 121 It relates to an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to ROR1 (Receptor Tyrosine Kinase Like Orphan Receptor 1) containing a light chain CDR3.
  • ROR1 Receptor Tyrosine Kinase Like Orphan Receptor 1
  • antibody refers to an anti-ROR1 antibody that specifically binds to ROR1.
  • the scope of the present invention includes not only complete antibody forms that specifically bind to ROR1, but also antigen-binding fragments of this antibody molecule.
  • a complete antibody has a structure of two full-length light chains and two full-length heavy chains, with each light chain connected to the heavy chain by a disulfide bond.
  • the term “heavy chain” refers to a full-length heavy chain comprising a variable region domain VH and three constant region domains CH1, CH2, and CH3, including an amino acid sequence with sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen. and fragments thereof.
  • the term “light chain” as used herein refers to a full-length light chain and fragments thereof comprising a variable region domain VL and a constant region domain CL containing an amino acid sequence having a sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen. It all means.
  • the total antibody includes subtypes of IgA, IgD, IgE, IgM and IgG, and especially IgG includes IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4.
  • the heavy chain constant region has gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ), and epsilon ( ⁇ ) types and is subclassed as gamma1 ( ⁇ 1), gamma2 ( ⁇ 2), and gamma3 ( ⁇ 3). ), gamma 4 ( ⁇ 4), alpha 1 ( ⁇ 1), and alpha 2 ( ⁇ 2).
  • the constant region of the light chain has kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ) types.
  • An antigen-binding fragment of an antibody or an antibody fragment refers to a fragment that possesses an antigen-binding function and includes Fab, F(ab'), F(ab') 2 , and Fv.
  • Fab has a structure that includes the variable regions of the light and heavy chains, the constant region of the light chain, and the first constant region (CH1) of the heavy chain, and has one antigen binding site.
  • Fab' differs from Fab in that it has a hinge region containing one or more cysteine residues at the C-terminus of the heavy chain CH1 domain.
  • F(ab') 2 is generated when the cysteine residue in the hinge region of Fab' forms a disulfide bond.
  • Double-chain Fv corresponds to the minimum antibody fragment containing only the heavy chain variable region and light chain variable region.
  • Double-chain Fv two-chain Fv
  • single-chain Fv single-chain Fv
  • the regions can be covalently linked or linked directly at the C-terminus to form a dimer-like structure, such as double-chain Fv.
  • antibody fragments can be created using proteolytic enzymes (for example, Fab can be obtained by restriction digestion of the complete antibody with papain, and F(ab') 2 can be obtained by digestion with pepsin) or genetic recombination technology. It can be produced using .
  • Fv fragment is an antibody fragment that contains the complete antibody recognition and binding site. This region is a dimer of one heavy chain variable domain and one light chain variable domain.
  • the “Fab” fragment includes the variable and constant domains of the light chain and the variable and first constant domains (CH1) of the heavy chain.
  • F(ab') 2 antibody fragments generally comprise a pair of Fab' fragments covalently linked by a cysteine in the hinge region present at the C-terminus of the Fab' fragments.
  • a “single chain Fv (scFv)” antibody fragment is a structure consisting of a single polypeptide chain containing the VH and VL domains of an antibody.
  • a polypeptide linker that allows the scFv to form a desired structure for antigen binding may be additionally included between the VH domain and the VL domain.
  • the antibodies of the invention include monoclonal antibodies, multispecific antibodies, human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, scFvs, Fab fragments, F(ab') 2 fragments, disulfide-linked Fvs (sdFv) and anti-idiotype (anti-Id) antibodies, or epitope-binding fragments of these antibodies, but are not limited thereto.
  • the heavy chain constant region may be selected from any one of gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ), or epsilon ( ⁇ ) isotype.
  • the constant region is gamma 1 (IgG1), gamma 2 (IgG2), gamma 3 (IgG3), or gamma 4 (IgG4).
  • the light chain constant region may be of kappa or lambda type.
  • the monoclonal antibody refers to an antibody obtained from a substantially homogeneous antibody population, i.e., the individual antibodies comprising the population are identical except for possible naturally occurring mutations that may be present in trace amounts. Monoclonal antibodies are highly specific, being directed against a single antigenic site. In contrast to conventional (polyclonal) antibodies, which typically contain different antibodies against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody is directed against a single determinant on the antigen.
  • Epitope refers to a protein determinant to which an antibody can specifically bind. Epitopes usually consist of groups of chemically active surface molecules, such as amino acids or sugar side chains, and generally have specific three-dimensional structural features as well as specific charge characteristics. Conformational epitopes and non-steric epitopes are distinguished in that binding to the former is lost in the presence of a denaturing solvent, but binding to the latter is not.
  • non-human antibodies are chimeric antibodies that contain minimal sequence derived from non-human immunoglobulins.
  • humanized antibodies are derived from a non-human species (donor antibody) that retains the desired specificity, affinity, and ability to transfer residues from the recipient hypervariable region, such as mouse, rat, rabbit, or non-human primate. It is a human immunoglobulin (recipient antibody) replaced with residues from the hypervariable region of .
  • human antibody is a molecule derived from human immunoglobulin, meaning that the entire amino acid sequence constituting the antibody, including the complementarity determining region and structural region, is composed of human immunoglobulin.
  • While portions of the heavy and/or light chain are identical to or homologous to corresponding sequences in antibodies derived from a particular species or belonging to a particular antibody class or subclass, the remaining chain(s) are derived from another species or belong to another antibody class or subclass. Included are “chimeric” antibodies (immunoglobulins) that are identical or homologous to the corresponding sequence in an antibody belonging to a subclass, as well as fragments of such antibodies that exhibit the desired biological activity.
  • variable region of an antibody refers to the light and heavy chain portions of an antibody molecule including the amino acid sequences of the complementarity determining regions (CDRs; i.e., CDR1, CDR2, and CDR3) and framework regions (FR).
  • CDRs complementarity determining regions
  • FR framework regions
  • VH refers to the variable domain of the heavy chain.
  • VL refers to the variable domain of the light chain.
  • CDR complementarity determining region
  • a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 1, the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 17, and the heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 42, the light chain CDR1 of SEQ ID NO: 66, the light chain CDR2 of SEQ ID NO: 87, and the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 103. light chain variable region,
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  • a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 7, the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 23, and the heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 49, the light chain CDR1 of SEQ ID NO: 71, the light chain CDR2 of SEQ ID NO: 92, and the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 109. light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 10, the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 38, and the heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 62, the light chain CDR1 of SEQ ID NO: 83, the light chain CDR2 of SEQ ID NO: 100, and the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 109. light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 7, the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 23, and the heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 49, the light chain CDR1 of SEQ ID NO: 71, the light chain CDR2 of SEQ ID NO: 92, and the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 109. light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 7, the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 23, and the heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 49, the light chain CDR1 of SEQ ID NO: 71, the light chain CDR2 of SEQ ID NO: 92, and the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 119. light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 10, the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 39, and the heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 63, the light chain CDR1 of SEQ ID NO: 84, the light chain CDR2 of SEQ ID NO: 101, and the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 120. light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 10, the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 39, and the heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 63, the light chain CDR1 of SEQ ID NO: 84, the light chain CDR2 of SEQ ID NO: 101, and the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 109. light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 1, the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 40, and the heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 64, the light chain CDR1 of SEQ ID NO: 85, the light chain CDR2 of SEQ ID NO: 97, and the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 108. light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 16, the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 41, and the heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 65, the light chain CDR1 of SEQ ID NO: 86, the light chain CDR2 of SEQ ID NO: 102, and the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 121. light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 10, the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 184, and the heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 63, the light chain CDR1 of SEQ ID NO: 84, the light chain CDR2 of SEQ ID NO: 101, and the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 109. light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 10, the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 185, and the heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 63, the light chain CDR1 of SEQ ID NO: 84, the light chain CDR2 of SEQ ID NO: 101, and the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 109. light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 10, the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 39, and the heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 63, the light chain CDR1 of SEQ ID NO: 84, the light chain CDR2 of SEQ ID NO: 186, and the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 109. light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 10, the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 39, and the heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 63, the light chain CDR1 of SEQ ID NO: 84, the light chain CDR2 of SEQ ID NO: 187, and the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 109. light chain variable region,
  • a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 10, the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 39, and the heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 63, the light chain CDR1 of SEQ ID NO: 84, the light chain CDR2 of SEQ ID NO: 101, and the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 110. light chain variable region, or
  • a heavy chain variable region comprising the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 10, the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 185, and the heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 63, the light chain CDR1 of SEQ ID NO: 84, the light chain CDR2 of SEQ ID NO: 187, and the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 110.
  • Light chain variable region comprising the heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 10, the heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 185, and the heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 63, the light chain CDR1 of SEQ ID NO: 84, the light chain CDR2 of SEQ ID NO: 187, and the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 110.
  • Framework regions (FR) are variable domain residues other than CDR residues. Each variable domain typically has four FRs: FR1, FR2, FR3, and FR4.
  • the binding affinity of anti-ROR1 antibodies to ROR1 is in the range of 10 -5 M to 10 -12 M.
  • the binding affinity of an anti-ROR1 antibody to ROR1 is 10 -6 M to 10 -12 M, 10 -7 M to 10 -12 M, 10 -8 M to 10 -12 M, 10 -9 M to 10 -9 M.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to ROR1 may include a heavy chain variable region including one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 122 to SEQ ID NO: 152 and SEQ ID NO: 188 to SEQ ID NO: 193.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to ROR1 may include a light chain variable region including one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 153 to SEQ ID NO: 183 and SEQ ID NO: 194 to SEQ ID NO: 199.
  • it may include:
  • Heavy chain variable region of SEQ ID NO: 193 and light chain variable region of SEQ ID NO: 199 are Heavy chain variable region of SEQ ID NO: 193 and light chain variable region of SEQ ID NO: 199.
  • An scFv is an antibody fragment, a structure consisting of a single polypeptide chain containing the VH and VL domains of an antibody.
  • a polypeptide linker that allows the scFv to form a desired structure for antigen binding may be additionally included between the VH domain and the VL domain.
  • a single chain Fv comprising the VH and VL domains of an antibody
  • the VH and VL domains may be connected via a linker.
  • the heavy chain variable region containing one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 122 to SEQ ID NO: 152 and SEQ ID NO: 188 to SEQ ID NO: 193 is linked to SEQ ID NO: 153 to SEQ ID NO: 183 and SEQ ID NO: 194 to SEQ ID NO: 199 through a linker. It may be linked to a light chain variable region containing one or more amino acid sequences selected from the group consisting of.
  • it may include:
  • Heavy chain variable region of SEQ ID NO: 193 and light chain variable region of SEQ ID NO: 199 are Heavy chain variable region of SEQ ID NO: 193 and light chain variable region of SEQ ID NO: 199.
  • the linker may be a peptide linker and may be about 10-25 aa long.
  • hydrophilic amino acids such as glycine and/or serine may be included, but are not limited thereto.
  • the linker may include, for example, (GS) n , (GGS) n , (GSGGS) n , or (G n S) m (n, m are each 1 to 10), but the linker is For example, it may be (G n S) m (n and m are each 1 to 10).
  • the linker may include GGGGS, for example, GGGGSGGGGSGGGGS of SEQ ID NO: 200 repeated three times.
  • “Phage display” is a technique for displaying a variant polypeptide as a fusion protein with at least a portion of an envelope protein on the surface of a phage, for example, a fibrous phage particle.
  • the usefulness of phage display lies in the fact that it can quickly and efficiently classify sequences that bind to target antigens with high affinity by targeting large libraries of randomized protein variants. Displaying peptide and protein libraries on phage has been used to screen millions of polypeptides for those with specific binding properties.
  • Phage display technology has provided a powerful tool for generating and screening novel proteins that bind to specific ligands (e.g., antigens). Using phage display technology, large libraries of protein variants can be generated and sequences that bind with high affinity to target antigens can be rapidly sorted.
  • a nucleic acid encoding a variant polypeptide is fused with a nucleic acid sequence encoding a viral envelope protein, such as a gene III protein or a gene VIII protein.
  • a monovalent phage display system has been developed in which a nucleic acid sequence encoding a protein or polypeptide is fused with a nucleic acid sequence encoding a portion of a gene III protein. In the monovalent phage display system, the gene fusion is expressed at low levels and the wild-type Gene III protein is also expressed to maintain particle infectivity.
  • Phage display technology has several advantages over conventional hybridoma and recombinant methods for producing antibodies with desired characteristics. This technology allows the generation of large antibody libraries with diverse sequences in a short period of time without using animals. The production of hybridomas or humanized antibodies may require several months of production time. Additionally, because no immunity is required, phage antibody libraries can generate antibodies even against toxic or low antigenic antigens. Phage antibody libraries can also be used to generate and identify new therapeutic antibodies.
  • a non-sensitized or non-immune antigen-binding library can be prepared using various lymphoid tissues.
  • Isolation of high affinity antibodies from a library can depend on the size of the library, the efficiency of production in bacterial cells, and the diversity of the library.
  • the size of the library is reduced by inefficient production due to improper folding of the antibody or antigen-binding protein and the presence of stop codons.
  • Expression in bacterial cells can be inhibited if the antibody or antigen binding domain is not properly folded.
  • Expression can be improved by alternatively mutating residues on the surface of the variable/invariant interface or in selected CDR residues.
  • the sequence of the framework region is one element to provide appropriate folding when generating an antibody phage library in bacterial cells.
  • CDR3 regions have been shown to often participate in antigen binding. Since the CDR3 region on the heavy chain varies considerably in size, sequence, and structural conformation, various libraries can be prepared using it.
  • diversity can be generated by randomizing the CDR regions of the variable heavy and light chains using all 20 amino acids at each position. Using all 20 amino acids can generate a greater diversity of variant antibody sequences and increase the opportunity to identify novel antibodies.
  • the antibody or antibody fragment of the present invention may include not only the sequence of the anti-ROR1 antibody of the present invention described herein, but also its biological equivalent, to the extent that it can specifically recognize ROR1.
  • additional changes can be made to the amino acid sequence of the antibody to further improve the binding affinity and/or other biological properties of the antibody.
  • Such modifications include, for example, deletions, insertions and/or substitutions of amino acid sequence residues of the antibody. These amino acid mutations are made based on the relative similarity of amino acid side chain substitutions, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, etc.
  • arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. Therefore, based on these considerations, arginine, lysine and histidine; Alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan, and tyrosine can be said to be biologically equivalent in function.
  • the antibody of the present invention or the nucleic acid molecule encoding the same is interpreted to also include a sequence showing substantial identity with the sequence shown in SEQ ID NO.
  • the above-mentioned substantial identity is at least 90% when the sequence of the present invention and any other sequence are aligned to the maximum extent possible and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art. It means a sequence showing homology, most preferably at least 95% homology, at least 96% homology, at least 97% homology, at least 98% homology, and at least 99% homology. Alignment methods for sequence comparison are known in the art.
  • NCBI Basic Local Alignment Search Tool is accessible from NBCI, etc., and can be used in conjunction with sequence analysis programs such as blastp, blasm, blastx, tblastn, and tblastx on the Internet.
  • BLAST can be accessed at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.
  • sequence homology comparison method using this program can be found at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention has 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% compared to the specified sequence or the entire sequence described in the specification. , may have 99% or more homology.
  • homology can be determined by sequence comparison and/or alignment by methods known in the art. For example, sequence comparison algorithms (i.e., BLAST or BLAST 2.0), manual alignment, or visual inspection can be used to determine the percent sequence homology of a nucleic acid or protein of the invention.
  • the present invention relates to a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof can be produced recombinantly by isolating the nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention.
  • Nucleic acid is meant to comprehensively include DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules, and nucleotides, the basic structural unit of nucleic acids, include not only natural nucleotides but also analogues with modified sugar or base sites. .
  • the sequences of nucleic acids encoding the heavy and light chain variable regions of the present invention may be modified. The modifications include additions, deletions, or non-conservative or conservative substitutions of nucleotides.
  • the DNA encoding the antibody can be easily isolated or synthesized using conventional molecular biology techniques (for example, by using an oligonucleotide probe that can specifically bind to the antibody and the DNA encoding the heavy and light chains). This can be done by isolating the nucleic acid and inserting it into a replicable vector for further cloning (DNA amplification) or further expression. Based on this, the present invention relates to a recombinant expression vector containing the above nucleic acid from another perspective.
  • the term "vector” refers to a means for expressing a gene of interest in a host cell, and includes viral vectors such as plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, adenovirus vectors, retrovirus vectors, and adeno-associated virus vectors. Includes etc.
  • Components of a vector generally include, but are not limited to, one or more of the following: a signal sequence, an origin of replication, one or more antibiotic resistance marker genes, an enhancer element, a promoter, and a transcription termination sequence. Nucleic acids encoding antibodies are operably linked, such as promoter and transcription termination sequences.
  • “Operably linked” means a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence (e.g., a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, whereby the control sequence is connected to the other nucleic acid sequence. regulates transcription and/or translation.
  • a nucleic acid expression control sequence e.g., a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites
  • a strong promoter capable of advancing transcription e.g., tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.
  • a ribosome binding site for initiation of translation e.g., amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.
  • promoters derived from the genome of mammalian cells e.g., metallothionein promoter, ⁇ -actin promoter, human heroglobin promoter, and human muscle creatine promoter
  • mammalian cell genomes Promoters derived from animal viruses (e.g., adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, tk promoter of HSV, mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter, LTR promoter of HIV , the promoter of Moloney virus, the promoter of Epstein-Barr virus (EBV), and the promoter of Roux Sarcoma virus (RSV) can be used, and generally have a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.
  • adenovirus late promoter vaccinia virus 7.5K promoter
  • SV40 promoter cytomegalovirus (CMV) promoter
  • tk promoter of HSV e
  • the vector may be fused with other sequences to facilitate purification of the antibody expressed therefrom.
  • Sequences to be fused include, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA), and 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA).
  • the vector contains an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selection marker, for example, for ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin, and tetracycline. There is a resistance gene.
  • the present invention relates to host cells transfected with the above recombinant expression vector.
  • Host cells used to produce the antibodies of the present invention may be prokaryotic, yeast, or higher eukaryotic cells, but are not limited thereto.
  • Strains of the genus Bacillus such as Escherichia coli, Bacillus subtilus and Bacillus thuringiensis, Streptomyces, Pseudomonas (e.g. Pseudomonas putida) Prokaryotic host cells such as (Pseudomonas putida), Proteus mirabilis, and Staphylococcus (e.g., Staphylocus carnosus) can be used.
  • Bacillus such as Escherichia coli, Bacillus subtilus and Bacillus thuringiensis, Streptomyces, Pseudomonas (e.g. Pseudomonas putida)
  • Prokaryotic host cells such as (Pseudomonas putida), Proteus mirabilis, and Staphylococcus (e.g., Staphylocus carnosus)
  • animal cells are of greatest interest, and examples of useful host cell lines include COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0 , U20S, or HT1080, but is not limited thereto.
  • the present invention includes the steps of culturing the host cells to produce antibodies; and a method for producing an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to ROR1, comprising the steps of isolating and purifying the produced antibody.
  • the host cells can be cultured in various media. Any commercially available medium can be used as a culture medium without limitation. All other necessary supplements known to those skilled in the art may also be included in suitable concentrations. Culture conditions, such as temperature, pH, etc., are already used with host cells selected for expression and will be clear to those skilled in the art.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof can be recovered by, for example, centrifugation or ultrafiltration to remove impurities, and the resulting product can be purified using, for example, affinity chromatography. Additional other purification techniques may be used, such as anion or cation exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, hydroxylapatite chromatography, etc.
  • the present invention relates to a dual or multispecific antibody comprising the above antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • a bispecific antibody refers to an antibody that has binding or antagonistic ability to more than one target. It is a combination of antibodies with binding or antagonistic ability to two different targets or an antibody that has binding ability to one target. refers to an antibody that is bound to a substance that has antagonistic activity against a different target.
  • a multi-specific antibody refers to an antibody that has binding specificity for at least three different antigens.
  • Multispecific antibodies may include antibodies targeting tri-specific or more targets, such as tri-specific antibodies, tetra-specific antibodies, or antibodies targeting more targets. there is.
  • Antibodies belonging to bispecific or multispecific antibodies can be divided into scFv-based antibodies, Fab-based antibodies, and IgG-based antibodies.
  • they can inhibit or amplify two or more signals at the same time, so they can be more effective than inhibiting/amplifying a single signal, and can be more effective than inhibiting/amplifying a single signal.
  • low-dose administration is possible, and two or more signals in the same time and space can be suppressed/amplified.
  • bispecific or multispecific antibodies Methods for producing bispecific or multispecific antibodies are well known. Traditionally, the recombinant production of bispecific antibodies is based on the co-expression of two or more immunoglobulin heavy/light chain pairs under conditions where the two or more heavy chains have different specificities.
  • a diabody can be created by combining the VL and VH of different scFvs to produce a hybrid scFv in a heterodimeric form, and connecting different scFvs to each other.
  • a tendem ScFv can be produced, and a heterodimeric miniantibody can be produced by expressing Fab's CH1 and CL at the end of each scFv, and by substituting some amino acids in the CH3 domain, which is the homodimeric domain of Fc, a 'knob' A minibody in the form of a heterodimeric scFv can be prepared by changing it to a heterodimeric structure in the form of 'into hole' and expressing these changed CH3 domains at the ends of each different scFv.
  • Fab-based bispecific or multispecific antibodies individual Fab' for a specific antigen can be combined with each other using a disulfide bond or a mediator to produce a heterodimeric Fab form, and the heavy or light chain of the specific Fab can be produced.
  • the antigen-binding valency can be set to two, or by placing a hinge region between Fab and scFv, it can be manufactured to have four antigen-binding valencies in homodimeric form.
  • a dual-targeting bibody is created by fusing scFvs for different antigens to the light and heavy chain ends of the Fab, thereby increasing the binding valency for the antigen to three, and fusing different scFvs to the light and heavy chain ends of the Fab, respectively, to the antigen.
  • a triple-targeted bibody with a binding valency of 3 can be obtained by chemically conjugating 3 different Fabs.
  • bispecific or multispecific antibodies based on IgG hybrid hybridomas, so-called quadromas, were produced by recrossing mouse and rat hybridomas by Trion Pharma. Therefore, methods for producing bispecific antibodies are known.
  • bispecific antibodies can be manufactured in the so-called 'Holes and Knob' form, which is made into a heterodimeric form by modifying some amino acids of the CH3 homodimeric domain of Fc for different heavy chains while sharing the light chain part.
  • homodimeric (scFv)4-IgG can be produced by fusion-expressing two different scFvs to the constant domains instead of the variable domains of the light and heavy chains of IgG.
  • ImClone is based on IMC-1C11, a chimeric monoclonal antibody against human VEGFR-2, and attaches mouse Platelet-derived Growth Factor Receptor- ⁇ to the light chain amino terminus of this antibody. ) was produced and reported by fusing only a single variable domain.
  • multiple antigen binding to CD20 is possible through the so-called 'dock and lock (DNL)' method using the dimerization and docking domain (DDD) of the protein kinase A (PKA) R subunit and the anchoring domain of PKA. It can be produced as an antibody having .
  • DDD dimerization and docking domain
  • PKA protein kinase A
  • bispecific, trivalent, or tetravalent bispecific or multispecific antibodies include bispecific, trivalent, or tetravalent bispecific or multispecific antibodies.
  • International Patent Application Publication Nos. WO2001/077342, WO2009/080251, WO2009/080252, WO2009/080253, WO2009/080254, WO2010/112193, WO2010/115589 It also includes bivalent, trivalent, or tetravalent antibodies described in WO2010/136172, WO2010/145792, WO2010/145793, and WO2011/117330.
  • a bivalent, trivalent, or tetravalent antibody indicates that two or more binding domains, three or more binding domains, or four or more binding domains are present in the antibody molecule, respectively.
  • the dual or multispecific antibody according to the present invention may be an anti-ROR1 antibody or antigen-binding fragment, specifically an IgG complete antibody or fragment form thereof, such as a single chain Fv, V H domain and/or V L It may be included in the form of a domain, Fab or (Fab) 2 .
  • the bispecific antibody according to the present invention is ROR1 and PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137 (4-1BB), VISTA, CD258 (LIGHT), TIGIT , CD134(OX40), CD28, CD278(ICOS), CD27, CD154(CD40L), CD357(GITR), CD30, DR3, CD226(DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2 , KDR, PDGFRa, NRP1, and MARCO can be simultaneously targeted at one or more selected from the group.
  • the multispecific antibodies according to the present invention include ROR1, PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137 (4-1BB), VISTA, CD258 (LIGHT), TIGIT , CD134(OX40), CD28, CD278(ICOS), CD27, CD154(CD40L), CD357(GITR), CD30, DR3, CD226(DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2 , KDR, PDGFRa, NRP1, and MARCO can be simultaneously targeted at two or more selected from the group.
  • the present invention provides an immune cell engaging bispecific or It relates to multispecific antibodies.
  • the immune cell engaging bispecific or multispecific antibody temporarily induces a cytolytic synapse between cytotoxic T cells and cancer target cells to release toxic substances.
  • the immune cells include T cells, NK cells, cytokine-induced killer cells (CIK), activated cytotoxic T lymphocytes (CTL), macrophages, and T infiltrating tumor tissue. It may be one or more cells selected from the group consisting of Tumor-Infiltrating Lymphocytes (TIL) and dendritic cells.
  • TIL Tumor-Infiltrating Lymphocytes
  • the immune cell activating antigen may be selected from, for example, the following, and an antibody that binds to it may serve to engage immune cells:
  • T cell activating antigens include CD3, TCR ⁇ , TCR ⁇ , TCR ⁇ , TCR ⁇ , ICOS, CD28, CD27, HVEM, LIGHT, CD40, 4-1BB, OX40, DR3, GITR, CD30, TIM1, SLAM, CD2, or CD226;
  • NK cell activation antigens include NKp30, NKp40, NKp44, NKp46, NKG2D, DNAM1, DAP10, CD16 (e.g., CD16a, CD16b), CRTAM, CD27, PSGL1, CD96, CD100 (SEMA4D), NKp80, CD244 (SLAMF4 or 2B4), SLAMF6, SLAMF7, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR3DS1, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR2DS1, CD94, NKG2C, NKG2E or CD160;
  • CD16 e.g., CD16a, CD16b
  • CRTAM CD27, PSGL1, CD96, CD100 (SEMA4D)
  • NKp80 CD244
  • SLAMF4 or 2B4 SLAMF6, SLAMF7, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR3DS1, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR2DS1, CD94, NKG2
  • B cell activating antigens are OX40, CD40, or CD70;
  • Macrophage activation antigens include CD2 agonist, CD40, CD70, Toll-like receptor (TCR) agonist, CD47, STING, or OX40L; or
  • the dendritic cell activating antigen is a CD2 agonist, OX40, OX40L, 41BB agonist, TCR agonist, CD47 agonist, or STING agonist.
  • Immune cell engager is specifically described in US Patent Application Publication No. 2017/0368169, which may be incorporated by reference into the present invention.
  • the immune cell engaging bispecific or multispecific antibody comprises a tandem scFv and can bind to the following antigens and surface antigens on cancer cells.
  • the surface antigen on the cancer cells is ROR1, targeted by the antibody according to the invention:
  • CD16 e.g., CD16a, CD16b
  • CRTAM CD27, PSGL1, CD96, CD100 (SEMA4D)
  • NKp80 CD244
  • SLAMF4 or 2B4 SLAMF6, SLAMF7, KIR2DS2 , KIR2DS4, KIR3DS1, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR2DS1, CD94, NKG2C, NKG2E
  • CD2 agonist CD40, CD70, Toll-like receptor (TCR) agonist, CD47, STING, or OX40L; or
  • CD2 agonist OX40, OX40L, 41BB agonist, TCR agonist, CD47 agonist, or STING agonist.
  • the immune cell engaging bispecific or multispecific antibodies are, for example, VL(ROR1)-VH(ROR1)-VH(CD3 or CD16A)-VL(CD3 or CD16A), VH(ROR1)-VL(ROR1) )-VH(CD3 or CD16A)-VL(CD3 or CD16A), VH(CD3 or CD16A)-VL(CD3 or CD16A)-VH(ROR1)-VL(ROR1) or VH(CD3 or CD16A)-VL(CD3) Alternatively, it may include a structure in the form of CD16A)-VL(ROR1)-VH(ROR1).
  • the scFv includes a heavy chain variable region comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 122 to SEQ ID NO: 152 and SEQ ID NO: 188 to SEQ ID NO: 193, and SEQ ID NO: 153 to SEQ ID NO: 183 and SEQ ID NO: 194 to 194. It includes a light chain variable region comprising at least one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 199, and the heavy chain variable region and the light chain variable region may be connected by a linker.
  • the linker may be a peptide linker and may be about 10-25 aa long.
  • hydrophilic amino acids such as glycine and/or serine may be included.
  • the linker may include, for example, (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n or (GnS)m (n, m are each 1 to 10), but the linker may include, for example, (G n S) m (n and m may be 1 to 10, respectively).
  • the linker may include GGGGS, for example, GGGGSGGGGSGGGGS of SEQ ID NO: 200 repeated three times.
  • Examples of the immune cell engaging bispecific or multispecific antibodies include blinatumomab (Amgen) that binds to CD3 and CD19; solitomab (Amgen), which binds to CD3 and EpCAM; MEDI 565 (MedImmune, Amgen), which binds CD3 and CEA; and BAY2010112 (Bayer, Amgen), which binds CD3 and PSMA.
  • Exemplary DARTs include MGD006 (Macrogenics), which binds CD3 and CD123; and MGD007 (Macrogenics), which binds to CD3 and gpA33.
  • Exemplary TandAbs include AFM11 (Affimed Therapeutics), which binds CD3 and CD19; and AFM13 (Affimed Therapeutics), which binds to CD30 and CD16A.
  • ADC Antibody-Drug Conjugate
  • the present invention relates to an antibody-drug conjugate (ADC) in which the antibody or antigen-binding fragment thereof is bound to a drug.
  • ADC antibody-drug conjugate
  • Anticancer drug conjugates require the anticancer drug to be stably bound to the antibody until the anticancer drug is delivered to the target cancer cells.
  • the drug delivered to the target must be released from the antibody and induce death of the target cell.
  • the drug must stably bind to the antibody and at the same time have sufficient cytotoxicity to induce death of the target cell when released from the target cell.
  • the antibody may be linked to a drug through a linker.
  • the linker is a site that connects the anti-ROR1 antibody and the drug, and allows the drug to be released from the antibody in a cleavable form under intracellular conditions, that is, in the intracellular environment. Reflecting the long half-life of the antibody, the antibody circulates throughout the body. It must be stable and the binding of the linker to the drug must not affect the stability and pharmacokinetics of the antibody.
  • the linker may include, for example, a cleavable linker or a non-cleavable linker.
  • a cleavable linker like a peptide linker, it can be cleaved by intracellular peptidase or protease enzymes, such as lysosomal or endosomal proteases, and in the case of a non-cleavable linker, for example, a thioether linker, the antibody can be cleaved by intracellular hydrolysis. The drug may be released after non-selective degradation.
  • the cleavable linker may include a peptide linker.
  • the peptide linker has a length of at least two amino acids.
  • Val-Cit, Val-Ala, or a dipeptide of Val-Cit or Phe-Leu or Gly-Phe-Leu-Gly may be included.
  • linkers are specifically described in International Patent Application Publication No. WO2004/010957, which may be incorporated by reference into the present invention.
  • the antibody-drug conjugate binds the antibody region of the ADC to the antigen of the target cancer cell to form an ADC-antigen complex and is then internalized into the cancer cell through the endosome-lysosomal pathway.
  • the intracellular release of cytotoxic drugs is controlled by the internal environment of endosomes/lysosomes.
  • the cleavable linker is pH sensitive, meaning it may be susceptible to hydrolysis at certain pH values.
  • pH sensitive linkers indicate that they can be hydrolyzed under acidic conditions.
  • acid labile linkers that can be hydrolyzed in lysosomes such as hydrazone, semicarbazone, thiosemicarbazone, cis-aconitic amide, orthoester, acetal, It may be ketal, etc.
  • the linker may be cleaved under reducing conditions, for example, a disulfide linker.
  • SATA N-succinimidyl-S-acetylthioacetate
  • SPDP N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate
  • SPDB N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)butyrate
  • SMPT N-succinimidyl-oxycarbonyl
  • a variety of disulfide bonds can be formed using -alpha-methyl-alpha-(2-pyridyl-dithio)toluene).
  • This disulfide linker can be cleaved by disulfide exchange with the thiol of intracellular glutathione.
  • the drug and/or drug-linker may be randomly conjugated through the lysine of the antibody, or may be conjugated through the cysteine exposed when the disulfide bond chain is reduced.
  • a linker-drug may be bound through a genetically engineered tag, for example, cysteine present in a peptide or protein.
  • the genetically engineered tag for example, a peptide or protein, may include an amino acid motif that can be recognized by, for example, isoprenoid transferase.
  • the peptide or protein has a deletion at the carboxy terminus of the peptide or protein, or has a covalent addition of a spacer unit to the carboxy (C) terminus of the peptide or protein.
  • the peptide or protein may be directly covalently linked to the amino acid motif or may be covalently linked to the amino acid motif with a spacer unit.
  • the amino acid spacer unit consists of 1 to 20 amino acids, of which glycine unit is preferable.
  • the isoprenoid transferase may be, for example, farnesyltransferase (FTase, farnesyl protein transferase) or geranylgeranyl transferase (GGTase), and FTase and GGTase I are of the formula 1 mentioned above. It can recognize the CAAX motif, and GGTase II can recognize the XXCC, XCXC or CXX motif (where C is cysteine, A is an aliphatic amino acid, and there is.
  • FTase farnesyltransferase
  • GGTase II can recognize the XXCC, XCXC or CXX motif (where C is cysteine, A is an aliphatic amino acid, and there is.
  • the linker may include a beta-glucuronide linker that is recognized and hydrolyzed by beta-glucuronidase, which is present in large numbers in lysosomes or overexpressed in some tumor cells. You can. Unlike peptide linkers, it has a large hydrophilicity and has the advantage of increasing the solubility of the antibody-drug complex when combined with a highly hydrophobic drug.
  • beta-glucuronide linker disclosed in International Patent Application Publication No. WO2015/182984, for example, a beta-glucuronide linker containing a self-immolative group can be used; , the above documents are incorporated by reference.
  • the linker may be, for example, a non-cleavable linker, and the drug is released through only one step of antibody hydrolysis within the cell, producing, for example, an amino acid-linker-drug complex.
  • This type of linker can be a thioether group or maleimidocaproyl group and can maintain stability in the blood.
  • the linker-drug may be linked randomly through cysteine exposed when the disulfide bond chain of the antibody is reduced or by introducing an antibody terminal binding peptide having the sequence GGGGGGGCVIM.
  • the drug is an agent that exhibits pharmacological effects and may be bound to an antibody, and may specifically be a chemotherapeutic agent, toxin, micro RNA (miRNA), siRNA, shRNA, or radioactive isotope.
  • the chemotherapy agent may be, for example, a cytotoxic agent or an immunosuppressive agent. Specifically, it may include a microtubulin inhibitor, a mitotic inhibitor, a topoisomerase inhibitor, or a chemotherapeutic agent that can function as a DNA intercalator. Additionally, it may include immunomodulatory compounds, anticancer agents, antiviral agents, antibacterial agents, antifungal agents, anthelmintic agents, or combinations thereof.
  • drugs include, for example, maytansinoids, auristatin (including MMAE, MMAF), aminopterin, actinomycin, bleomycin, thalisomycin, camptocecin, N8-acetyl spermidine, 1-(2 Chloroethyl)-1,2-dimethyl sulfonyl hydrazide, esferamycin, etoposide, 6-mercaptopurine, dolastatin, trichothecene, calicheamicin, taxol, taxane, paclitaxel , docetaxel, methotrexate, vincristine, vinblastine, doxorubicin, melphalan, mitomycin A, mitomycin C, chlorambucil, duocamycin, L-asparaginase, mercaptopurine (mercaptopurine), thioguanine, hydroxyurea, cytarabine, cyclophosphamide, if
  • the drug may be an amine, thiol, hydroxyl, hydrazide, oxime, hydrazine, thiosemicarbazone, hydrazine carboxylate, or And it may include one or more nucleophilic groups selected from the group consisting of an arylhydrazide group.
  • an ADC was produced in which the antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention was linked to a drug, such as auristatin (MMAE), through an MC-vc-PAB linker. It was confirmed that this ADC exhibited the desired cytotoxicity.
  • a drug such as auristatin (MMAE)
  • the present invention is a chimeric antigen receptor (CAR) comprising an extracellular domain including an antigen binding site, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain, wherein the antigen binding site of the extracellular domain is the scFv of the antibody. It relates to a chimeric antigen receptor characterized in that:
  • Chimeric antigen receptor is a synthetic construct designed to induce an immune response against a target antigen and cells expressing the antigen.
  • CARs include an extracellular domain, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain.
  • Cancer cells can be killed by introducing a gene encoding a receptor that recognizes a cancer cell surface antigen specifically expressed on the surface of cancer cells into immune cells. Through immune cells that contain receptors that bind to antigens specifically expressed in cancer cells, an immune response can be generated by targeting only cancer cells.
  • the CAR contains the scFv of the anti-ROR1 antibody according to the present invention as an antigen recognition site of the extracellular domain.
  • the first generation CAR contains an extracellular domain including an antigen recognition site specifically expressed in cancer cells, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain, and only CD3 ⁇ was used as the signaling domain, but the therapeutic effect on cancer was minimal. There was a problem that the duration was short.
  • This first generation CAR is specifically described in U.S. Patent No. 6,319,494, which is incorporated herein by reference.
  • a second-generation CAR was manufactured combining a co-stimulatory domain (CD28 or CD137/4-1BB) and CD3 ⁇ . Compared to the first-generation CAR, the number of CAR-containing immune cells remaining in the body was significantly increased. While the second generation CAR used one costimulation domain, the third generation CAR used two or more costimulation domains. To achieve expansion and persistence of CAR-containing immune cells in vivo, the costimulatory domain can be combined with 4-1BB, CD28, or OX40.
  • the second-generation CAR is specifically described in U.S. Patent No. 7,741,465, 7,446,190, or No. 9,212,229, and the third-generation CAR is specifically described in U.S. Patent No. 8,822,647, which is incorporated herein by reference.
  • the 4th generation CAR includes additional genes encoding cytokines such as IL-12 or IL-15, allowing additional expression of CAR-based immune proteins of cytokines, while the 5th generation CAR contains interleukin to strengthen immune cells. It further comprises a receptor chain, for example IL-2R ⁇ .
  • the 4th generation CAR is specifically described in US Patent No. 10,316,102, and the 5th generation CAR is specifically described in US Patent No. 10,336,810, which are incorporated herein by reference.
  • the antigen binding site of the extracellular domain is an scFv of an antibody.
  • the VH and VL domains may be connected via a linker.
  • the heavy chain variable region containing one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 122 to SEQ ID NO: 152 and SEQ ID NO: 188 to SEQ ID NO: 193 is linked to SEQ ID NO: 153 to SEQ ID NO: 183 and SEQ ID NO: 194 to SEQ ID NO: 199 through a linker. It may be linked to a light chain variable region containing one or more amino acid sequences selected from the group consisting of.
  • the linker may be a peptide linker and may be about 10-25 aa long.
  • hydrophilic amino acids such as glycine and/or serine may be included.
  • the linker may include, for example, (GS) n , (GGS) n , (GSGGS) n or (G n S) m (n, m are each 1 to 10), but the linker may include, for example (G n S) m (n and m may each be 1 to 10).
  • the linker may include GGGGS, for example, GGGGSGGGGSGGGGS of SEQ ID NO: 200 repeated three times.
  • the transmembrane domain may be derived from natural or synthetic sources. If the source is natural, the domain may be derived from any membrane-bound or transmembrane protein.
  • the transmembrane domain is alpha, beta of T-cell receptor, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, ICOS Or it may contain a zeta chain. When synthesizing the transmembrane domain, it may include hydrophobic residues such as leucine and valine, or peptides containing phenylalanine, tryptophan, and valine at each end.
  • a short oligo- or polypeptide linker 2 to 10 amino acids in length, can form the linkage between the transmembrane domain and the cytoplasmic signaling domain of the CAR.
  • Glycine-serine peptide can be used as a linker.
  • the signaling domain can induce activation of the normal effector functions of the immune cell in which the CAR is placed. For example, cytolytic activation or helper activation can be induced through the secretion of cytokines.
  • the signaling domain may comprise a truncated fragment of the intracellular signaling domain sufficient to transduce an effector function signal.
  • the signaling domain may include the cytoplasm of the T cell receptor (TCR) and co-receptors that act cooperatively to initiate signal transduction following antigen receptor engagement.
  • TCR T cell receptor
  • T cell activation may involve initiating antigen-dependent primary activation via the TCR and acting in an antigen-dependent manner to provide secondary or co-stimulatory signals.
  • Primary cytoplasmic signaling sequences regulate primary activation of the TCR complex either in a stimulatory or an inhibitory manner.
  • Primary cytoplasmic signaling sequences that act in a stimulatory manner may contain signaling motifs known as immunoreceptor tyrosine-based activation motifs, or ITAMs.
  • ITAMs containing primary cytoplasmic signaling sequences may include TCR zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, and CD66d.
  • the cytoplasmic domain of the CAR may include a CD3 zeta chain portion and a costimulatory signaling domain.
  • Costimulatory signaling domain refers to the portion of the CAR that contains the intracellular domain of the costimulatory molecule.
  • CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, lymphocyte function-related antigen-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7- H3, and a ligand that specifically binds to CD83 may be included.
  • Cytoplasmic signaling sequences within the cytoplasmic signaling portion of the CAR may be linked via a peptide linker containing 2 to 10 amino acids, for example, glycine-serine.
  • the present invention relates to immune cells into which the chimeric antigen receptor (CAR) has been introduced.
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the immune cells are capable of inducing immunity and causing the desired cancer treatment effect, for example, T cells, NK cells, Cytokine Induced Killer cells (CIK), and activated cytotoxic T lymphocytes (Cytotoxic cells). It may be selected from the group consisting of T lymphocytes (CTL), macrophages, tumor-infiltrating lymphocytes (TIL), and dendritic cells, but is not limited thereto.
  • TTL T lymphocytes
  • TIL tumor-infiltrating lymphocytes
  • dendritic cells dendritic cells
  • Antibodies other than the above antibodies include, for example, PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137 (4-1BB), VISTA, CD258 (LIGHT), TIGIT, CD134 (OX40), CD28, CD278 (ICOS), CD27, CD154 (CD40L), CD357 (GITR), CD30, DR3, CD226 (DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1 It may be an antibody or antigen-binding fragment thereof targeting one or more selected from the group consisting of MARCO.
  • the present invention relates to the antibody or antigen-binding fragment thereof, a dual or multispecific antibody comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof, an antibody-drug conjugate comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof, the antibody or It relates to a composition for preventing or treating cancer containing a chimeric antigen receptor containing an antigen-binding fragment thereof or an immune cell containing the chimeric antigen receptor.
  • the present invention includes, for example, (a) an antibody against ROR1 according to the invention or an antigen-binding fragment thereof, a dual or multispecific antibody comprising said antibody or antigen-binding fragment thereof, said antibody or antigen-binding fragment thereof; A pharmaceutically effective amount of an antibody-drug conjugate, a chimeric antigen receptor comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof, or an immune cell comprising the chimeric antigen receptor; and (b) a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention also provides an antibody against ROR1 or an antigen-binding fragment thereof according to the present invention, a dual or multispecific antibody comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof, and an antibody-drug conjugate comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof. , it may be a method for preventing or treating cancer, comprising administering a chimeric antigen receptor containing the antibody or an antigen-binding fragment thereof, or an immune cell containing the chimeric antigen receptor, to a cancer patient.
  • Prevention refers to any action that inhibits the growth or delays the progression of cancer by administering the composition according to the present invention
  • treatment refers to inhibition of cancer development, alleviation of tumor, or removal of cancer.
  • Such cancers include, for example, Hodgkin's lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma (e.g., B cell lymphoma, diffuse large B cell lymphoma, follicular lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, mantle cell lymphoma, marginal zone B cell lymphoma, Burkitt's lymphoma). , lymphoplasmacytic lymphoma, hairy cell leukemia), acute myeloid leukemia, chronic myeloid leukemia, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, or acute lymphocytic leukemia.
  • non-Hodgkin's lymphoma e.g., B cell lymphoma, diffuse large B cell lymphoma, follicular lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, mantle cell lymphoma, marginal zone B cell lymphoma, Burkitt's lymphoma
  • the cancers include, for example, ovarian cancer, rectal cancer, stomach cancer, testicular cancer, anal cancer, uterine cancer, colon cancer, rectal cancer, renal cell carcinoma, liver cancer, non-small cell carcinoma of the lung, small intestine cancer, esophageal cancer, melanoma, Kaposi's sarcoma, Endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head and neck cancer, skin or intraocular malignant melanoma, uterine cancer, brain stem glioma, pituitary adenocarcinoma, epidermoid cancer, cervical squamous cell carcinoma, fallopian tube cancer.
  • CNS central nervous system
  • the cancer may be, for example, glioblastoma, lung cancer, bladder cancer, oral cancer, head and neck squamous cell cancer, gallbladder cancer, or cervical cancer.
  • compositions of the present invention are those commonly used in preparation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, and calcium silicate. , microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, but are not limited thereto.
  • the composition of the present invention may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, and intrarectal administration. It can be administered, etc.
  • compositions When administered orally, proteins or peptides are digested, so oral compositions must be formulated to coat the active agent or protect it from degradation in the stomach. Additionally, pharmaceutical compositions can be administered by any device that allows the active agent to move to target cells.
  • the suitable dosage of the composition according to the present invention varies depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate and reaction sensitivity, and is usually A skilled doctor can easily determine and prescribe an effective dosage for desired treatment or prevention.
  • the daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.0001-100 mg/kg.
  • the term “pharmaceutically effective amount” refers to an amount sufficient to prevent or treat cancer or autoimmune disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by a person skilled in the art. Alternatively, it can be manufactured by placing it in a multi-capacity container. At this time, the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, suppository, powder, granule, tablet, or capsule, and may additionally contain a dispersant or stabilizer.
  • the present invention relates to the antibody or antigen-binding fragment thereof, a dual or multispecific antibody comprising the antibody or antigen-binding fragment, an antibody-drug conjugate, a chimeric antigen receptor, or an immune cell comprising the chimeric antigen receptor. It relates to a composition for treating cancer, including.
  • the present invention also provides administration of the antibody or antigen-binding fragment thereof, a dual or multispecific antibody containing the antibody or antigen-binding fragment, an antibody-drug conjugate, a chimeric antigen receptor, or an immune cell containing the chimeric antigen receptor. It relates to a cancer treatment method including the steps of:
  • the present invention provides the antibody or antigen-binding fragment thereof, a dual or multispecific antibody comprising the antibody or antigen-binding fragment, an antibody-drug conjugate, a chimeric antigen receptor, or the chimera for the prevention or treatment of cancer. It relates to the use of immune cells containing antigen receptors.
  • the present invention relates to the antibody or antigen-binding fragment thereof, a dual or multispecific antibody comprising the antibody or antigen-binding fragment, an antibody-drug conjugate, or a chimeric antigen receptor for the production of a drug for preventing or treating cancer. Or it relates to the use of immune cells containing the chimeric antigen receptor.
  • the present invention relates to a composition for combination therapy comprising immune cells and drugs other than anti-ROR1 antibodies.
  • the drug other than the anti-ROR1 antibody may include a chemotherapy agent or an antibody other than the anti-ROR1 antibody.
  • drugs include maytansinoids, auristatin (including MMAE, MMAF), aminopterin, actinomycin, bleomycin, thalisomycin, camptothecin, N8-acetyl spermidine, 1-(2 chloroethyl)- 1,2-dimethyl sulfonyl hydrazide, esferamycin, etoposide, 6-mercaptopurine, dolastatin, trichothecene, calicheamicin, taxol, taxane, paclitaxel, docetaxel ), methotrexate, vincristine, vinblastine, doxorubicin, melphalan, mitomycin A, mitomycin C, chlorambucil, duocamycin, L-asparaginase, mercaptopurine, Thioguanine, hydroxyurea, cytarabine, cyclophosphamide, ifosfamide, nitrosourea,
  • antibodies other than the anti-ROR1 antibody include, for example, PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137 (4-1BB), VISTA, CD258 (LIGHT ), TIGIT, CD134(OX40), CD28, CD278(ICOS), CD27, CD154(CD40L), CD357(GITR), CD30, DR3, CD226(DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, It may be an antibody or antigen-binding fragment thereof targeting one or more selected from the group consisting of EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1, and MARCO.
  • the present invention relates to a composition for combination treatment comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof and at least one selected from the group consisting of:
  • CAR antigen receptor
  • the present invention relates to a composition for combination treatment comprising the above immune cell engaging bispecific or multispecific antibody and one or more selected from the group consisting of:
  • CAR antigen receptor
  • the immune cells can induce the desired cancer treatment effect by inducing immunity, for example, T cells, NK cells, cytokine induced killer cells (CIK), activated cells. It may be selected from the group consisting of Cytotoxic T Lymphocytes (CTL), macrophages, Tumor-Infiltrating Lymphocytes (TIL), and dendritic cells, but is not limited thereto.
  • TTL Cytotoxic T Lymphocytes
  • TIL Tumor-Infiltrating Lymphocytes
  • dendritic cells dendritic cells
  • Antibodies other than the above anti-ROR1 antibodies are antibodies targeting targets other than ROR1, such as LAG3, TIM3, CD137 (4-1BB), VISTA, CD258 (LIGHT), TIGIT, CD134 (OX40), CD28, CD278. (ICOS), CD27, CD154 (CD40L), CD357 (GITR), CD30, DR3, CD226 (DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1, or MARCO It may be an antibody that binds to or an antigen-binding fragment thereof, but is not limited thereto.
  • targets other than ROR1 antibodies such as LAG3, TIM3, CD137 (4-1BB), VISTA, CD258 (LIGHT), TIGIT, CD134 (OX40), CD28, CD278. (ICOS), CD27, CD154 (CD40L), CD357 (GITR), CD30, DR3, CD226 (DNAM
  • the immune checkpoint inhibitor refers to an agent that can induce T cell activation by blocking T cell inhibitory signals at the site where antigen presenting cells (APCs, antigen presenting cells) and immune cells, such as T cells, meet.
  • the immune checkpoint inhibitors include, for example, PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137 (4-1BB), CD258 (LIGHT), TIGIT, CD134 (OX40), CD28, It may be a drug targeting CD278 (ICOS), CD27, CD154 (CD40L), CD357 (GITR), CD30, DR3, CD226 (DNAM1), CD96, CD200, or CD200R, but is not limited thereto.
  • Each of the first and second components subject to combined administration may be administered simultaneously.
  • each of the first and second components subject to combined administration may be administered separately at certain time intervals.
  • the second component may be administered separately before or after administration of the first component.
  • kanamycin antibiotic an antibiotic gene introduced into the helper phage
  • PEG 8000 polyethylene glycol 8000
  • NaCl sodium chloride
  • the phage library was recovered by centrifuging at 10,000g, 4°C for 30 minutes, adding PBS to the precipitated pellet, and then centrifuging at 15,000g, 4°C for 30 minutes, adding PBS to the precipitated phage pellet.
  • concentration of the amplified sub-library was calculated as the number of colonies generated by diluting the recovered phage, infecting TG1 cells, and culturing them on LB/ampicillin solid culture medium.
  • Panning was performed to select human antibodies that specifically bind to ROR1.
  • Biopanning was performed using ROR1-Fc, ROR1-His proteins, and patient-derived cells as follows.
  • the recombinant antigen is Human ROR1 Fc protein (R&D systems, 9490-RO, Recombinant Human ROR1 Fc Chimera Protein, CF) and human ROR1 His protein (Sino Biological, 13968-H08H, ROR1 Protein, Human, Recombinant (ECD, His Tag).
  • LC-074T which overexpresses ROR1 and is owned by Aimed Bio, was used as the patient-derived cell.
  • Antigen fixation biopanning human ROR1 Fc protein and negative Fc protein at a concentration of 5-10 ⁇ g/ml were coated on a 96-well plate at 4°C for 16 hours and blocked using 3% skim milk. . After emptying the plate, the library (approximately 2.0x10 13 pfu) was added to a plate coated with negative Fc protein and reacted at room temperature for 30 minutes. This is a step to prevent non-specific binding other than ROR1 by removing phages that bind to proteins other than human ROR1 from the antibody phage library. Phages that did not bind to the negative Fc protein were recovered and bound to a plate coated with human ROR1 Fc for 1 hour.
  • Bead-based bio-panning Repeated bead panning was performed by attaching magnetic beads to biotinylated human ROR1 protein. Streptavidin-conjugated magnetic beads (Invitrogen, 11206D, DynabeadsTM M-280 Streptavidin) were used, and human conjugation was performed using a Biotinylation Kit (abcam, ab201795, Biotin Conjugation Kit (Fast, Type A) - Lightning-Link®). ROR1 protein was biotinylated.
  • the library bound to human ROR1 beads was recovered using a magnetic bead separator, washed 7-12 times with PBST (Phosphate buffered saline-0.1% Tween 20) solution and PBS solution, and then washed with IgG Elution Buffer (Thermo Scientific, 21028). , PierceTM IgG Elution Buffer, pH 2.0) was used to elute the phage antibodies bound to biotinylated human ROR1-beads. A total of three rounds were conducted, and the results of bead-based bio-panning are shown in Table 2.
  • PBST Phosphate buffered saline-0.1% Tween 20
  • IgG Elution Buffer PierceTM IgG Elution Buffer, pH 2.0
  • Bio-panning using patient-derived cells Phage antibodies obtained from antigen-immobilized bio-panning and bead-based bio-panning were treated with Jurkat cells and bound to them for 1 hour at 4°C, and the supernatant that did not bind to cells derived from patients overexpressing ROR1 was recovered. This is a step to prevent non-specific binding other than ROR1 by removing phages that bind to cell membrane proteins other than ROR1 from the phage antibody. The recovered supernatant was treated with LC-074T (1.5 Afterwards, to remove phages that did not bind to the patient-derived cells, they were transferred to a 15 ml conical tube and centrifuged at 1,000 g for 3 minutes to separate the cells.
  • scFv screening was performed to select monoclonal antibodies that specifically bind to ROR1 from the phages recovered through the final round of panning. Colonies from the final round of panning were taken, inoculated into a 96-well plate containing 200 ⁇ l SB/ampicillin culture medium, and cultured at 37°C for 2-3 hours. Afterwards, to induce scFv-pIII protein expression, each well was treated with IPTG (Isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside) at a final concentration of 1 mM and cultured overnight at 30°C.
  • IPTG Isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside
  • the cultured plate was centrifuged at 3,000 rpm for 15 minutes to remove the supernatant, and then 40 ⁇ l of TES (50 mM Tris, 1 mM EDTA, 20% Sucrose, pH 8.0) solution was added to each well to recover phage particles. Cells were lysed for 30 minutes at room temperature. Afterwards, cells were lysed by treatment with 60 ⁇ l of 0.2
  • the supernatant was added to each well in a 96-well plate coated with human ROR1, mouse ROR1, and negative Fc protein, allowed to bind at room temperature for 2 hours, and then washed four times with PBST and distilled water. Afterwards, it was bound at room temperature for 1 hour using an anti-HA antibody containing HRP that can bind to the HA tag, and then washed six times using PBST and distilled water. After developing color by adding TMB Substrate Solution (Thermo Scientific, 34029, 1-StepTM Ultra TMB-ELISA Substrate Solution), the color reaction was stopped with stop solution (Invitrogen, SS04, ELISA Stop Solution), and the absorbance was measured at OD 450 nm. . 30 antibody clones binding to human ROR1 or mouse ROR1 were selected through ELISA, and the CDR sequences of each antibody are shown in Table 5, and the amino acid sequences of the heavy and light chain variable regions are shown in Table 6.
  • ELISA was performed to analyze the domains using scFvs of the 30 selected antibody clones described above.
  • An expression vector capable of expressing the antigen domain for the binding domain analysis was constructed, and the protein was expressed and purified.
  • residues corresponding to amino acids 1 to 542 or 165 to 395 of the ROR1 amino acid sequence indicated by UniProt ID: Q01973 were used.
  • a gene block encoding the extracellular domain of ROR1 was constructed. The 3' end of the gene was conjugated with a His tag. The vector was secured by introducing the gene into the pcDNA3.3 vector. Proteins were expressed and purified using transient transfection.
  • Proteins were purified from the cell culture supernatant after culturing for 5 days at 8% CO 2 , 37°C, 130 rpm.
  • the culture medium was passed through a column (GE healthcare, 17-5438-01, MabSelectTM SuRe) to allow the expressed antibody to bind to the column.
  • IgG Elution Buffer Thermo Scientific, 21028, PierceTM IgG Elution Buffer, pH 2.0
  • the eluted antibody fraction was filtered through an Amicon Ultra 30kDa tube (Merck Millipore, UFC903024, Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Unit). Concentration was performed by exchanging the buffer with PBS (pH 7.4) using ).
  • the purified domain was quantified using absorbance and extinction coefficient at a wavelength of 280 nm.
  • each scFv was treated and reacted for 2 hours, and washed 4 times using PBST and distilled water.
  • an HRP-conjugated anti-HA antibody (Roche, 12013819001, Anti-HA-Peroxidase, High Affinity) that can bind to the HA tag was used to bind at room temperature for 1 hour, and then incubated for 6 minutes using PBST and distilled water. Washed twice.
  • Example 5 Mammalian cell expression and purification of anti-ROR1 antibody
  • Cloning and production were performed to produce each clone obtained in the examples as a complete immunoglobulin (IgG) monoclonal antibody.
  • IgG immunoglobulin
  • To construct a heavy chain expression vector DNA encoding the heavy chain including the heavy chain variable region and constant region were cloned into the pOptivec vector, respectively. Additionally, in order to construct a vector expressing the light chain, DNA encoding the light chain including the light chain variable region and light chain constant region was cloned into the pcDNA3.3 vector.
  • Proteins were expressed and purified using the light chain and heavy chain expression vectors using transient transfection.
  • Expi293F suspension cells Gibco, A14527, Expi293FTM Cells
  • Expi293 Expression medium Gibco, A1435101, Expi293TM Expression Medium
  • Opti-MEMI Gabco, 31985070, Opti-MEMTM I Reduced Serum Medium
  • Transfection was performed with a mixture of ExpiFectamine293 (Gibco, 100014995, ExpiFectamineTM293).
  • Proteins were purified from the cell culture supernatant after culturing for 5 days at 8% CO 2 , 37°C, 130 rpm.
  • the culture medium was passed through a column (GE healthcare, 17-5438-01, MabSelectTM SuRe) to allow the expressed antibody to bind to the column.
  • IgG Elution Buffer Thermo Scientific, 21028, PierceTM IgG Elution Buffer, pH 2.0
  • the eluted antibody fraction was filtered through an Amicon Ultra 30kDa tube (Merck Millipore, UFC903024, Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Unit). Concentration was performed by exchanging the buffer with PBS (pH 7.4) using ).
  • Purified anti-ROR1 antibody was quantified using absorbance and extinction coefficient at a wavelength of 280 nm.
  • Antibody optimization was performed to remove unwanted PTM sites of the antibody obtained in the above example. Optimization was performed based on the P015042v1 antibody sequence, which showed excellent efficacy in the in vitro experiment results. Among the antibody sequences, we found sequences that are likely to cause deamidation and isomerization under stressed conditions during and after production due to unwanted PTMs: HC 55G, LC S51, and LC G95A. According to what is known from existing papers, substituting N or D among sequences at risk of deamidation and isomerzation significantly damages the affinity of the antibody (Patel, C. N., Bauer, S. P., Davies, J., Durbin, J. D., Shiyanova , T. L., Zhang, K., & Tang, J. https://doi.org/10.1016/s0022-3549(15)00185-9). Therefore, optimization was performed by substituting the sequence following N or D in the sequence.
  • the affinity of the antibody was measured by substituting each of the above-mentioned sequences through rational design.
  • HC G55 was replaced with V (P015042v1-1) and K (P015042v1-2).
  • LC S51 was replaced with A (P015042v1-3) and K (P015042v1-4), and LC G95 was replaced with A (P015042v1-5).
  • P015042v1-1 to P015042v1-5) it was determined that it was best to replace the HC G55 sequence with K and LC S51 and LC G95 with K and A, respectively. Therefore, P015042v1-6, which has all three sequence modifications, was created.
  • Human ROR1 and mouse ROR1 proteins were each coated on a 96-well plate at a concentration of 2 ⁇ g/mL for 16 hours at 4°C, and blocked using 3% skim milk. Afterwards, each antibody was treated at concentrations of 300nM, 60nM, 12nM, 2.4nM, 0.48nM, 0.096nM, and 0.0192nM and reacted for 1 hour. After washing with PBST and distilled water, the antibody was conjugated with goat-derived HRP-conjugated anti-human antibody (Invitrogen, 31482, Goat anti-Human IgG F(ab') 2 Secondary Antibody, HRP) for 1 hour at room temperature. , and washed again using PBST and distilled water.
  • HRP goat-derived HRP-conjugated anti-human antibody
  • SPR surface plasmon resonance
  • human ROR1 or mouse ROR1 was diluted in 10 mM sodium acetate, pH 4.5, and immobilized on a CM5 sensor chip (GE healthcare) at 300 response units (RU).
  • the activated portion remaining on the surface of the sensor chip was deactivated by adding 1 M ethanolamine-HCl (pH 8.5).
  • Our anti-ROR1 antibody was injected into the antibody protein immobilized on the CM5 sensor chip at concentrations of 300, 150, 75, 37.5, 18.75, 9.375, and 4.6875 nM for 180 seconds (Ka), and then at the same flow rate for 180 seconds.
  • Kd the KD combined sensorgram was investigated.
  • the anti-ROR1 antibody showed a sensorgram specifically binding to human ROR1 and mouse ROR1, and the final KD value through Ka and Kd values was (1:1 Langmuir 1:1 kinetics) are shown in Table 9 and Table 10.
  • ELISA was performed to analyze the binding domain using the IgG antibody of the selected clone.
  • each antibody was treated at concentrations of 300nM, 60nM, 12nM, 2.4nM, 0.48nM, 0.096nM, and 0.0192nM and reacted for 1 hour.
  • the antibody was bound at room temperature for 1 hour using an anti-human antibody conjugated with goat-derived HRP (Invitrogen, 31482, Goat anti-Human IgG F(ab')2 Secondary Antibody, HRP). , and washed again using PBST and distilled water.
  • T-47D, Jeko-1 (abnormal cell line), AMB-BT-0024T, AMB-BT-0016T, AMB-BT-0013T, AMB-LC-0002T, AMB-LC-0003T, KUC-OC21-025T (abnormal patient derived cells) were distributed in duplicate to 96-well plates at 2 x 10 5 cells each. Dispense 100 nM of Mouse IgG1-PE isotype (Invitrogen, 12-4714-82) and ROR1-2A2-PE (Biolegend, 357804) per well.
  • Jeko-1 a human lymphoma cell line
  • PXC patient-derived cells
  • AMB-LC-0003T a lung cancer-derived cell
  • anti-ROR1 antibodies Before anti-ROR1 antibodies are used for treatment, it is very important to first confirm whether they bind to the antigen expressed on the cell surface.
  • the cell-binding ability of the anti-ROR1 antibodies developed by the present inventors was measured in Jeko-1 cell line and AMB-LC-0003T patient-derived cells, which were confirmed to have high ROR1 expression, using FACS. Each cell was dispensed into a 96-well plate at 1 x 10 5 cells/100 ⁇ l FACS buffer per well.
  • PE-labeled Goat anti-human IgG Fc PE (Thermofisher; 12-4998-82) was diluted at a ratio of 1:100 in FACS buffer solution as a secondary antibody, and 100 ⁇ l was dispensed into each well. It was reacted again at 4°C for 30 minutes and washed twice. Finally, 100 ⁇ l FACS buffer solution was dispensed into each well, mixed well with a pipette, and then flow cytometry was performed using a NovoCyte Flow Cytometer (Agilent). Analyzed using GraphPad Prism 9.3.1, log(agonist) vs. The EC 50 value was derived using a response - Variable slope nonlinear graph model.
  • AMB-LC-0003T patient-derived cells which had the highest level of ROR1 expression, showed a higher MFI (Mean Fluorescence Intensity) than the Jeko-1 cell line.
  • Antibodies that showed sub-nanomolar EC50 values in both cell types include P015042 and P015042v1 and P015042v1-6, which had additionally modified sequences, and P015044 also showed nanomolar EC50 values.
  • Other anti-ROR1 clones, P015004 and P015043 also showed good cell binding ability, with EC50s of ⁇ 10 nM ( Figures 5 and 6).
  • the anti-ROR1 antibody In order to develop an antibody-drug conjugate, the anti-ROR1 antibody must not only bind to the ROR1 antigen in the cell but also be internalized into the cell so that the drug of the conjugate can penetrate into the cell and cause a reaction. To analyze this, internalization was confirmed by detecting ROR1 antigen remaining on the cell surface at various time points. Jeko- 1 cells were distributed in duplicate at 1 The ROR1 receptor that was not internalized and remained on the cell surface was identified. Cells were treated with 1 nM of each antibody and then incubated at 4°C for 30 minutes. Washed twice by centrifugation at 1100g for 2 minutes.
  • P015042v1-6 engineered by improving the biological and physical properties of the P015042 antibody, showed similar levels to Merck's UC-961 antibody, which had the best cellular internalization (Figure 7).
  • the antibody-drug conjugate represented by formula (1) in which the antibody (Y) and the drug-linker (LP) structure are connected via a thioether, can be produced, for example, by the following method.
  • An antibody-drug conjugate can be produced through the reaction between the maleimidyl group of LP and the sulfhydryl group of X.
  • Antibody (X) having a sulfhydryl group can be obtained according to the method described below.
  • the antibody can be reacted with a reducing agent such as tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) to reduce the disulfide bond in the hinge portion of the antibody to form a sulfhydryl group.
  • TCEP tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride
  • TCEP disulfide sugar reducing agent inside the antibody
  • EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
  • Antibodies (X) with partially or fully reduced sulfhydryl groups can be produced.
  • the disulfide reduction reaction in the antibody described above was carried out at 37°C for 2 hours.
  • the buffer used in this example is a phosphate buffer solution (pH 7.4) containing saline, which was also used during antibody production.
  • the disulfide reduction reaction in the antibody described above was carried out at 37°C for 2 hours.
  • Antibody (X) having a sulfhydryl group from which impurities were removed through buffer exchange was recovered in an Amicon Ultra (30kDa, Millipore Co.) container and reacted with 5 to 15 molar equivalents of 10mM drug-linker (LP) at room temperature for 2 hours. I order it. Since the drug-linker (LP) can be modified by light, this reaction was carried out in the dark. To increase the solubility of the compound, the drug-linker (LP) was dissolved in dimethylacetamide (DMA), a representative organic solvent. About 10 to 20% v/v of DMA was added to a buffer containing an antibody (X) having a sulfhydryl group.
  • DMA dimethylacetamide
  • the antibody-drug conjugation reaction can be terminated by inactivating the reactivity of the unreacted drug-linker (LP) with a thiol-containing reagent.
  • the thiol-containing reagent used in this example is N-acetyl-L-cysteine (NAC). Specifically, the reaction was terminated by adding 5 molar equivalents of NAC to the antibody-drug conjugation reaction solution and storing it at room temperature for 30 minutes.
  • the antibody-drug reaction solution was added to an Amicon Ultra (30 kDa, Millipore Co.) container and centrifuged (10 to 20 at 3950 G) using a centrifuge (Eppendorf centrifuge 5810 R). centrifuged for 10 minutes) and the buffer was exchanged with phosphate buffer solution (pH 7.4) containing saline. This process was repeated a total of three times. Finally, the antibody-drug conjugate was recovered from the filtration membrane in an Amicon Ultra (30 kDa, Millipore Co.) container.
  • Antibody concentration in the antibody-drug conjugate was measured using a spectrophotometer (Thermofisher Scientific NanoDrop 8000).
  • the purity of the antibody-drug conjugate was determined by size exclusion high-performance liquid chromatography (SEC-HPLC) analysis employing the method described below. Pretreatment of antibody-drug conjugate samples is prepared at a concentration of 0.5 mg/ml and a total volume of 25 ⁇ L. SEC-HPLC analysis is performed according to the following conditions.
  • the purity of the antibody-drug conjugate was measured by comparing and contrasting the retention time of each peak appearing in the antibody-drug conjugate chromatogram with the retention time for each peak of the size marker (Gel filtration standard, Bio-Rad, 1511901).
  • size exclusion chromatography larger molecules are detected first, so based on the antibody peak (150 kDa), the peak that appears first is a polymer aggregate that can be generated due to the hydrophobicity of the drug, and the peak that appears later is the drug that was conjugated and then separated. was analyzed.
  • the purity of the antibody-drug conjugate itself was calculated by converting the area of the peak corresponding to 150 kDa in the entire chromatogram into a percentage.
  • Example 16 Analysis of the average number of drug molecules per antibody molecule of anti-ROR1 antibody-drug conjugate (DAR analysis)
  • the average number of drug molecules per antibody molecule (Drug-to-Antibody Ratio, DAR) of the antibody-drug conjugate was measured through hydrophobic interaction high-performance liquid chromatography (HIC-HPLC) analysis using the method described below.
  • HIC-HPLC hydrophobic interaction high-performance liquid chromatography
  • the antibody-drug conjugate Compared to the same antibody without drug conjugation, the antibody-drug conjugate exhibits higher hydrophobicity in proportion to the number of conjugated drug molecules and therefore has a longer retention time.
  • the peaks that appear sequentially relative to the retention time of the drug-unconjugated antibody (DAR 0) were designated in the order of DAR 2, DAR 4, DAR 6, and DAR 8 as described above.
  • Affinity analysis of antibody-drug conjugates evaluates equivalence to the parent antibody and determines the potential affinity that may arise from manufacturing processes such as disulfide bond reduction and drug-linker conjugation to produce antibodies with sulfhydryl groups. This is to determine whether or not there is damage.
  • the analysis was conducted using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) described below.
  • the antigen-binding ability of the antibody-drug conjugate was 80% or more compared to the monoclonal antibody, the antigen-binding ability of the antibody-drug conjugate was judged to be similar.
  • Figure 9 shows the purity analysis results of the antibody-drug conjugates used in the examples of the present invention
  • Figure 10 shows the analysis results of the average number of drug molecules per antibody molecule of the antibody-drug conjugates used in the examples of the present invention
  • Figure 11 shows the results of the analysis of the average number of drug molecules per antibody molecule.
  • the ELISA analysis results for ROR1 binding of the antibody-drug conjugate used in the examples of the present invention are shown.
  • Example 18 In vitro cytotoxicity evaluation of anti-ROR1 antibody-drug conjugates
  • AMB-LC-0003T which is known to be lung cancer patient-derived cells with high ROR1 expression
  • AMB-LC-0002T which has very low ROR1 expression.
  • U bottom 384-well transparent plate (S-bio, #MS-9384UZ), AMB-LC-0003T and AMB-LC-0002T cells derived from lung cancer patients were placed at 500 cells per well with 40 ⁇ l M10018 (Aimedbio). ) Triplely busy with the media. After centrifugation at 250g for 2 minutes, reaction was performed at 37°C and 5% CO 2 for 24 hours. After the reaction, each antibody-drug conjugate was diluted three-fold from 500 nM to 0.314 pM. The plate was reacted again at 37°C and 5% CO 2 for 6 days.
  • the P015042-vc-PAB-MMAE antibody-drug conjugate described above shows a superior IC 50 (2.30 nM) value in AMB-LC-0003T with high ROR1 expression, and in AMB-LC-0002T, a patient-derived cell with low ROR1 expression. It was confirmed that only ROR1-specific effects were observed, with an IC 50 value of over 100 nM.
  • the antibody-drug conjugate of US Patent US 10,335,496 B2 it showed about 8 times the relative potency, allowing us to expect ROR1-specific anticancer efficacy as an antibody-drug conjugate (Figure 13 ).
  • the anti-ROR1 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention exhibits superior binding ability to ROR1 than existing anti-ROR1 antibodies, and can be usefully used for the prevention or treatment of a desired tumor or cancer.

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Abstract

본 발명은 항-ROR 1(Receptor Tyrosine Kinase Like Orphan Receptor 1) 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질감염된 숙주세포, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중/다중특이적 항체, 면역세포 인게이징(immune cell engage) 이중/다중특이적 항체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 약물에 결합된 항체-약물 접합체(ADC), 상기 항체의 scFv를 세포외 도메인의 항원 결합 부위로 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR), 상기 키메라 항원 수용체가 도입되어 있는 면역세포, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 병용 치료용 조성물, 암 예방 또는 치료용 조성물, 암 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

Description

항-ROR1 항체 및 이의 용도
본 발명은 항-ROR1(Receptor Tyrosine Kinase Like Orphan Receptor 1) 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질감염된 숙주세포, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 상기 항체의 scFv 및 면역세포 활성화 항원에 결합하는 항체의 scFv를 하나 이상 포함하는 제2결합 도메인으로 구성된 scFv를 포함하는 면역세포 인게이징(immune cell engage) 이중특이적 또는 다중특이적 항체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 약물에 결합된 항체-약물 접합체(ADC), 상기 항체의 scFv를 세포외 도메인의 항원 결합 부위로 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR), 상기 키메라 항원 수용체가 도입되어 있는 면역세포, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 면역세포를 포함하는 병용 치료용 조성물, 암 예방 또는 치료용 조성물, 암 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
ROR(Receptor Tyrosine Kinase Like Orphan Receptor)은 세포 활동 전반에 걸쳐 다양한 영향을 미치는 막전위 RTK(Receptor Tyrosine Kinase) 수용체의 대표적인 그룹이다. ROR 패밀리는 ROR1과 ROR2로 이루어져 있으며, 두 단백질의 아미노산 서열 유사성은 약 60%에 달한다. ROR 패밀리는 세포외적으로는 Ig, Cysteine-rich 및 Kringle 도메인, 내적으로는 tyrosine kinase, Ser/Thr-rich 및 Proline-rich 도메인으로 구성되어 있다.
ROR1은 배아형성 과정에서 발현되어 다양한 초기 세포활동에 영향을 끼치지만, 성체 조직 형성이 진행됨에 따라 점진적으로 발현이 감소한다. 또한, ROR1은 정상 B 세포 성숙 과정의 중간 단계에서 발현이 되기도 하지만 성숙한 B 및 T 세포와 단핵세포 등에서는 발현되지 않는다. 하지만 다양한 종양세포에서 ROR1이 과발현되어 있다는 사실이 알려지면서 악성 종양의 태아성 유전자로 여겨지고 있다. ROR1이 Wnt5a의 수용체로서 작용함에 따라 비표준적 Wnt 신호를 활성화시켜 암세포 증식 및 전이를 초래하는 것으로 보고되어 있다. 이에 따라 ROR1은 항암 항체 치료제의 대표적인 타겟으로 부상하기 시작하였다. 구체적으로, ROR1이 만성 림프구성 백혈병(CLL)에 과발현되어 있다는 사실이 밝혀지면서 다양한 암종에서의 ROR1 과발현 여부를 확인하는 연구가 활발히 진행되었다(Klein et al., 2001, J. Exp. Med 194;1625). 결과적으로, 만성 림프구성 백혈병(CLL) 이외의 다양한 혈액암(급성 골수성 백혈병(AML), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 미만성거대 B세포 림프종(DLBCL)) 뿐만 아니라 유방암, 자궁경부암, 난소암, 폐암, 비소세포 폐암(NSCLC) 및 뇌암 등의 고형암에서도 ROR1 과발현이 확인되었다.
초기에 ROR1이 pseudokinase로 분류되어 과소평가된 부분이 없지 않아 있었지만, 상기 서술된 암종들에서 ROR1의 과발현은 암환자의 생존 및 암 전이와 밀접한 연관성이 있는 것으로 알려져 있으며 그에 따른 효과적인 치료제 개발의 필요성이 대두되고 있다. 국제 특허 WO 2016/172726 A1은 항-ROR1 단클론 항체 및 이의 용도를 명시했다. 이는 ROR1 특이적인 특성을 보이며, ROR1이 과발현 되어있는 CLL세포에 결합하여 사멸시킴으로, ROR1을 선택적으로 인식하는 항체 기반 치료제 개발의 잠재성을 시사한다.
항-ROR1 항체중에서도 각 다른 특성을 가지고 있으므로, 항원이 발현되고 있는 암종에 맞게 다양한 항암항체로 개발 가능하며, CLL과 같이 재발 빈도 수가 높은 암종을 표적 함으로써 항암항체의 미충족 수요를 만족시킬 수 있다(Choi et al., 2018, Cell Stem Cell 22, 951-959). ROR1의 암 특이적 발현은 단순히 암세포를 넘어서, 암 줄기세포나 줄기세포능(stemness)에서도 나타나며, 이는 종양성 전이, 혹은 재발을 억제시키는데 도움이 된다. 이와 같이 다양한 암 관련 세포에서의 발현을 고려하면, 기존 항체를 기반으로 다양한 치료제로의 개발 가능성이 무수하다.
이러한 기술적 배경하에서, ROR1에 특이적인 항체 발굴뿐만 아니라, 특히 환자유래세포 표면의 ROR1을 더욱 선택적으로 인식하는 항체를 선별하고, 기존에 알려진 개발중인 치료제보다 탁월한 항암 효능과 타겟 적중도를 지닌 항체를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 ROR 1(Receptor Tyrosine Kinase Like Orphan Receptor 1)에 대한 신규 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터 또는 상기 재조합 발현벡터로 형질감염된 숙주세포를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 ROR1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중/다중특이적 항체 또는 면역세포 인게이징(immune cell engage) 이중/다중특이적 항체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 약물에 결합된 항체-약물 접합체(ADC)를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체의 scFv를 세포외 도메인의 항원 결합 부위로 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR), 상기 키메라 항원 수용체가 도입되어 있는 면역세포, 상기 면역세포를 포함하는 병용 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 이중 또는 다중특이적 항체, 상기 항체-약물 접합체, 상기 키메라 항원 수용체 또는 상기 면역세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 또는 암 예방 또는 치료방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 예방 또는 치료를 위한 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 이중 또는 다중특이적 항체, 상기 항체-약물 접합체, 상기 키메라 항원 수용체 또는 상기 면역세포의 용도를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 이중 또는 다중특이적 항체, 상기 항체-약물 접합체, 상기 키메라 항원 수용체 또는 상기 면역세포의 사용을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음을 포함하는 ROR 1(Receptor Tyrosine Kinase Like Orphan Receptor 1)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
서열번호 1 내지 서열번호 16으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
서열번호 17 내지 서열번호 41, 서열번호 184 및 서열번호 185로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2,
서열번호 42 내지 서열번호 65로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3,
서열번호 66 내지 서열번호 86으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
서열번호 87 내지 서열번호 102, 서열번호 186 및 서열번호 187로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및
서열번호 103 내지 서열번호 121로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 발현벡터로 형질감염된 숙주세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 숙주세포를 배양하여 항체를 생성하는 단계; 및 생성된 항체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, ROR1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 이중/다중특이적 항체 또는 면역세포 인게이징(immune cell engage) 이중/다중특이적 항체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 약물에 결합된 항체-약물 접합체(ADC)를 제공한다.
본 발명은 또한, 항원 결합 부위를 포함하는 세포외 도메인, 트랜스멤브레인 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)로, 상기 세포외 도메인의 항원 결합 부위는 상기 항체의 scFv인 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 면역세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 이중 또는 다중특이적 항체, 상기 항체-약물 접합체, 상기 키메라 항원 수용체 또는 상기 면역세포를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 암 예방 또는 치료를 위한 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 이중 또는 다중특이적 항체, 상기 항체-약물 접합체, 상기 키메라 항원 수용체 또는 상기 면역세포의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 암 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 이중 또는 다중특이적 항체, 상기 항체-약물 접합체, 상기 키메라 항원 수용체 또는 상기 면역세포의 사용을 제공한다.
도 1은 ELISA를 통해 클론에 따라 ROR1 결합 특성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 항-ROR1 항체는 human ROR1과 mouse ROR1에 교차 결합함을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 ELISA를 통해서 각 도메인에 결합하는 항-ROR1항체 클론을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예에서 사용된 세포들의 ROR1 발현도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예에서 사용된 항체들의 AMB-LC-0003T 폐암환자 유래세포에서 발현하는 ROR1 항원과의 결합능 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예에서 사용된 항체들의 Jeko-1 세포주에서 발현하는 ROR1 항원과의 결합능 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예에서 사용된 항체의 세포내재화 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 항-ROR1 항체-약물 접합체의 구조를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 실시예에서 사용된 항체-약물 접합체의 순도 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 실시예에서 사용된 항체-약물 접합체의 항체 분자 당 약물 분자 평균 접합수 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 실시예에서 사용된 항체-약물 접합체의 ROR1 결합에 대한 ELISA 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 실시예에서 사용된 항체-약물 접합체의 환자 유래 세포에 대한 시험관 내(in vitro) 독성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 실시예에서 사용된 항체-약물 접합체의 환자 유래 세포에 대한 시험관 내(in vitro) 독성 평가 결과를 나타낸 것으로, 기존 항체-약물 접합체 대비 현저히 증가된 효능을 나타냄을 확인한 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
항-ROR1 항체
본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 17 내지 서열번호 41, 서열번호 184 및 서열번호 185로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호 42 내지 서열번호 65로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열번호 66 내지 서열번호 86으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 87 내지 서열번호 102, 서열번호 186 및 서열번호 187로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열번호 103 내지 서열번호 121로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 ROR1(Receptor Tyrosine Kinase Like Orphan Receptor 1)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "항체(antibody)"는 ROR1에 특이적으로 결합하는 항-ROR1 항체를 의미한다. 본 발명의 범위에는 ROR1에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG의 아형(subtype)을 포함하며, 특히 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge-region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다.
Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각에 해당한다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고, 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용하거나(예를 들어, 완전한 형태의 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2를 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 이용하여 제작할 수 있다.
"Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이 결합된 이량체이다.
"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과, 중쇄의 가변 및 제1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 Fab'단편 C-말단에 존재하는 힌지 영역의 시스테인에 의해 공유적으로 연결된 한 쌍의 Fab' 단편을 포함한다.
"단일쇄 Fv(scFv)" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄로 이루어진 구조체이다. scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 폴리펩티드 링커를 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 추가로 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, scFv, Fab 단편, F(ab')2 단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFv) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 2(IgG2), 감마 3(IgG3) 또는 감마 4(IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
상기 단일클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체와는 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.
"에피토프(epitope)"는 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위(determinant)를 의미한다. 에피토프는 통상 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체적 에피토프 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 소실되지 않는 점에서 구별된다.
상기 "인간화" 형태의 비-인간(예: 마우스) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종(공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변영역으로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다.
상기 "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다.
중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체(면역글로불린)뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다.
본 발명에서 사용된 항체의 "가변영역"은 상보성 결정 영역(CDR; 즉 CDR1, CDR2, 및 CDR3) 및 골격 영역(FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 의미한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 의미한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 의미한다.
"상보성 결정 영역(complement determining region, CDR)"은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 의미한다. 각 가변 도메인은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.
서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 17의 중쇄 CDR2 및 서열번호 42의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 66의 경쇄 CDR1, 서열번호 87의 경쇄 CDR2 및 서열번호 103의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 2의 중쇄 CDR1, 서열번호 18의 중쇄 CDR2 및 서열번호 43의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 67의 경쇄 CDR1, 서열번호 88의 경쇄 CDR2 및 서열번호 104의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 19의 중쇄 CDR2 및 서열번호 44의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 67의 경쇄 CDR1, 서열번호 88의 경쇄 CDR2 및 서열번호 104의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 4의 중쇄 CDR1, 서열번호 20의 중쇄 CDR2 및 서열번호 45의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 68의 경쇄 CDR1, 서열번호 89의 경쇄 CDR2 및 서열번호 105의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 2의 중쇄 CDR1, 서열번호 18의 중쇄 CDR2 및 서열번호 43의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 69의 경쇄 CDR1, 서열번호 90의 경쇄 CDR2 및 서열번호 106의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 5의 중쇄 CDR1, 서열번호 21의 중쇄 CDR2 및 서열번호 46의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 67의 경쇄 CDR1, 서열번호 88의 경쇄 CDR2 및 서열번호 104의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 6의 중쇄 CDR1, 서열번호 22의 중쇄 CDR2 및 서열번호 47의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 70의 경쇄 CDR1, 서열번호 91의 경쇄 CDR2 및 서열번호 107의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 5의 중쇄 CDR1, 서열번호 17의 중쇄 CDR2 및 서열번호 48의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 67의 경쇄 CDR1, 서열번호 88의 경쇄 CDR2 및 서열번호 108의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 23의 중쇄 CDR2 및 서열번호 49의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 71의 경쇄 CDR1, 서열번호 92의 경쇄 CDR2 및 서열번호 109의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 24의 중쇄 CDR2 및 서열번호 50의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 72의 경쇄 CDR1, 서열번호 90의 경쇄 CDR2 및 서열번호 109의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 25의 중쇄 CDR2 및 서열번호 47의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 70의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2 및 서열번호 108의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 8의 중쇄 CDR1, 서열번호 26의 중쇄 CDR2 및 서열번호 51의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 73의 경쇄 CDR1, 서열번호 90의 경쇄 CDR2 및 서열번호 110의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 9의 중쇄 CDR1, 서열번호 27의 중쇄 CDR2 및 서열번호 52의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 74의 경쇄 CDR1, 서열번호 94의 경쇄 CDR2 및 서열번호 111의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 28의 중쇄 CDR2 및 서열번호 50의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 75의 경쇄 CDR1, 서열번호 92의 경쇄 CDR2 및 서열번호 112의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 10의 중쇄 CDR1, 서열번호 29의 중쇄 CDR2 및 서열번호 53의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 76의 경쇄 CDR1, 서열번호 91의 경쇄 CDR2 및 서열번호 113의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 11의 중쇄 CDR1, 서열번호 30의 중쇄 CDR2 및 서열번호 54의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 77의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2 및 서열번호 114의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 12의 중쇄 CDR1, 서열번호 31의 중쇄 CDR2 및 서열번호 55의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 78의 경쇄 CDR1, 서열번호 95의 경쇄 CDR2 및 서열번호 115의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 13의 중쇄 CDR1, 서열번호 32의 중쇄 CDR2 및 서열번호 56의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 79의 경쇄 CDR1, 서열번호 96의 경쇄 CDR2 및 서열번호 116의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 3의 중쇄 CDR1, 서열번호 33의 중쇄 CDR2 및 서열번호 57의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 80의 경쇄 CDR1, 서열번호 97의 경쇄 CDR2 및 서열번호 114의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 34의 중쇄 CDR2 및 서열번호 58의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 81의 경쇄 CDR1, 서열번호 98의 경쇄 CDR2 및 서열번호 103의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 14의 중쇄 CDR1, 서열번호 35의 중쇄 CDR2 및 서열번호 59의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 82의 경쇄 CDR1, 서열번호 99의 경쇄 CDR2 및 서열번호 106의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 15의 중쇄 CDR1, 서열번호 36의 중쇄 CDR2 및 서열번호 60의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 76의 경쇄 CDR1, 서열번호 91의 경쇄 CDR2 및 서열번호 117의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 10의 중쇄 CDR1, 서열번호 37의 중쇄 CDR2 및 서열번호 61의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 76의 경쇄 CDR1, 서열번호 93의 경쇄 CDR2 및 서열번호 118의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 23의 중쇄 CDR2 및 서열번호 49의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 71의 경쇄 CDR1, 서열번호 92의 경쇄 CDR2 및 서열번호 109의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 10의 중쇄 CDR1, 서열번호 38의 중쇄 CDR2 및 서열번호 62의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 83의 경쇄 CDR1, 서열번호 100의 경쇄 CDR2 및 서열번호 109의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 23의 중쇄 CDR2 및 서열번호 49의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 71의 경쇄 CDR1, 서열번호 92의 경쇄 CDR2 및 서열번호 109의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 7의 중쇄 CDR1, 서열번호 23의 중쇄 CDR2 및 서열번호 49의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 71의 경쇄 CDR1, 서열번호 92의 경쇄 CDR2 및 서열번호 119의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 10의 중쇄 CDR1, 서열번호 39의 중쇄 CDR2 및 서열번호 63의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 84의 경쇄 CDR1, 서열번호 101의 경쇄 CDR2 및 서열번호 120의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 10의 중쇄 CDR1, 서열번호 39의 중쇄 CDR2 및 서열번호 63의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 84의 경쇄 CDR1, 서열번호 101의 경쇄 CDR2 및 서열번호 109의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 40의 중쇄 CDR2 및 서열번호 64의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 85의 경쇄 CDR1, 서열번호 97의 경쇄 CDR2 및 서열번호 108의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 16의 중쇄 CDR1, 서열번호 41의 중쇄 CDR2 및 서열번호 65의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 86의 경쇄 CDR1, 서열번호 102의 경쇄 CDR2 및 서열번호 121의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 10의 중쇄 CDR1, 서열번호 184의 중쇄 CDR2 및 서열번호 63의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 84의 경쇄 CDR1, 서열번호 101의 경쇄 CDR2 및 서열번호 109의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 10의 중쇄 CDR1, 서열번호 185의 중쇄 CDR2 및 서열번호 63의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 84의 경쇄 CDR1, 서열번호 101의 경쇄 CDR2 및 서열번호 109의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 10의 중쇄 CDR1, 서열번호 39의 중쇄 CDR2 및 서열번호 63의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 84의 경쇄 CDR1, 서열번호 186의 경쇄 CDR2 및 서열번호 109의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 10의 중쇄 CDR1, 서열번호 39의 중쇄 CDR2 및 서열번호 63의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 84의 경쇄 CDR1, 서열번호 187의 경쇄 CDR2 및 서열번호 109의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역,
서열번호 10의 중쇄 CDR1, 서열번호 39의 중쇄 CDR2 및 서열번호 63의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 84의 경쇄 CDR1, 서열번호 101의 경쇄 CDR2 및 서열번호 110의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 또는
서열번호 10의 중쇄 CDR1, 서열번호 185의 중쇄 CDR2 및 서열번호 63의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 84의 경쇄 CDR1, 서열번호 187의 경쇄 CDR2 및 서열번호 110의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역.
"골격 영역(FR)"은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4의 4개의 FR을 갖는다.
항-ROR1 항체의 ROR1에 대한 결합 친화성은 10-5M 내지 10-12 M 범위 내에 있다. 예를 들어, 항-ROR1 항체의 ROR1에 대한 결합 친화성은 10-6 M 내지 10-12 M, 10-7 M 내지 10-12 M, 10-8 M 내지 10-12 M, 10-9 M 내지 10-12 M, 10-5 M 내지 10-11 M, 10-6 M 내지 10-11 M, 10-7 M 내지 10-11 M, 10-8 M 내지 10-11 M, 10-9 M 내지 10-11 M, 10-10 M 내지 10-11 M, 10-5 M 내지 10-10 M, 10-6 M 내지 10-10 M, 10-7 M 내지 10-10 M, 10-8 M 내지 10-10 M, 10-9 M 내지 10-10 M, 10-5 M 내지 10-9 M, 10-6 M 내지 10-9 M, 10-7 M 내지 10-9 M, 10-8 M 내지 10-9 M, 10-5 M 내지 10-8 M, 10-6 M 내지 10-8 M, 10-7 M 내지 10-8 M, 10-5 M 내지 10-7 M, 10-6 M 내지 10-7 M 또는 10-5 M 내지 10-6 M이다.
상기 ROR1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 122 내지 서열번호 152 및 서열번호 188 내지 서열번호 193으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 ROR1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 153 내지 서열번호 183 및 서열번호 194 내지 서열번호 199로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 구체적 실시예에서, 다음을 포함할 수 있다:
서열번호 122의 중쇄 가변영역 및 서열번호 153의 경쇄 가변영역;
서열번호 123의 중쇄 가변영역 및 서열번호 154의 경쇄 가변영역;
서열번호 124의 중쇄 가변영역 및 서열번호 155의 경쇄 가변영역;
서열번호 125의 중쇄 가변영역 및 서열번호 156의 경쇄 가변영역;
서열번호 126의 중쇄 가변영역 및 서열번호 157의 경쇄 가변영역;
서열번호 127의 중쇄 가변영역 및 서열번호 158의 경쇄 가변영역;
서열번호 128의 중쇄 가변영역 및 서열번호 159의 경쇄 가변영역;
서열번호 129의 중쇄 가변영역 및 서열번호 160의 경쇄 가변영역;
서열번호 130의 중쇄 가변영역 및 서열번호 161의 경쇄 가변영역;
서열번호 131의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 132의 중쇄 가변영역 및 서열번호 163의 경쇄 가변영역;
서열번호 133의 중쇄 가변영역 및 서열번호 164의 경쇄 가변영역;
서열번호 134의 중쇄 가변영역 및 서열번호 165의 경쇄 가변영역;
서열번호 135의 중쇄 가변영역 및 서열번호 166의 경쇄 가변영역;
서열번호 136의 중쇄 가변영역 및 서열번호 167의 경쇄 가변영역;
서열번호 137의 중쇄 가변영역 및 서열번호 168의 경쇄 가변영역;
서열번호 138의 중쇄 가변영역 및 서열번호 169의 경쇄 가변영역;
서열번호 139의 중쇄 가변영역 및 서열번호 170의 경쇄 가변영역;
서열번호 140의 중쇄 가변영역 및 서열번호 171의 경쇄 가변영역;
서열번호 141의 중쇄 가변영역 및 서열번호 172의 경쇄 가변영역;
서열번호 142의 중쇄 가변영역 및 서열번호 173의 경쇄 가변영역;
서열번호 143의 중쇄 가변영역 및 서열번호 174의 경쇄 가변영역;
서열번호 144의 중쇄 가변영역 및 서열번호 175의 경쇄 가변영역;
서열번호 145의 중쇄 가변영역 및 서열번호 176의 경쇄 가변영역;
서열번호 146의 중쇄 가변영역 및 서열번호 177의 경쇄 가변영역;
서열번호 147의 중쇄 가변영역 및 서열번호 178의 경쇄 가변영역;
서열번호 148의 중쇄 가변영역 및 서열번호 179의 경쇄 가변영역;
서열번호 149의 중쇄 가변영역 및 서열번호 180의 경쇄 가변영역;
서열번호 150의 중쇄 가변영역 및 서열번호 181의 경쇄 가변영역;
서열번호 151의 중쇄 가변영역 및 서열번호 182의 경쇄 가변영역;
서열번호 152의 중쇄 가변영역 및 서열번호 183의 경쇄 가변영역;
서열번호 188의 중쇄 가변영역 및 서열번호 194의 경쇄 가변영역;
서열번호 189의 중쇄 가변영역 및 서열번호 195의 경쇄 가변영역;
서열번호 190의 중쇄 가변영역 및 서열번호 196의 경쇄 가변영역;
서열번호 191의 중쇄 가변영역 및 서열번호 197의 경쇄 가변영역;
서열번호 192의 중쇄 가변영역 및 서열번호 198의 경쇄 가변영역; 또는
서열번호 193의 중쇄 가변영역 및 서열번호 199의 경쇄 가변영역.
scFv
scFv는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄로 이루어진 구조체로, 항체 단편이다. scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 폴리펩티드 링커를 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 추가로 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일쇄 Fv(scFv)에서 VH 및 VL 도메인은 링커를 통해 연결될 수 있다. 서열번호 122 내지 서열번호 152 및 서열번호 188 내지 서열번호 193으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역은 링커를 통해 서열번호 153 내지 서열번호 183 및 서열번호 194 내지 서열번호 199로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역과 연결될 수 있다.
본 발명에 따른 구체적 실시예에서, 다음을 포함할 수 있다:
서열번호 122의 중쇄 가변영역 및 서열번호 153의 경쇄 가변영역;
서열번호 123의 중쇄 가변영역 및 서열번호 154의 경쇄 가변영역;
서열번호 124의 중쇄 가변영역 및 서열번호 155의 경쇄 가변영역;
서열번호 125의 중쇄 가변영역 및 서열번호 156의 경쇄 가변영역;
서열번호 126의 중쇄 가변영역 및 서열번호 157의 경쇄 가변영역;
서열번호 127의 중쇄 가변영역 및 서열번호 158의 경쇄 가변영역;
서열번호 128의 중쇄 가변영역 및 서열번호 159의 경쇄 가변영역;
서열번호 129의 중쇄 가변영역 및 서열번호 160의 경쇄 가변영역;
서열번호 130의 중쇄 가변영역 및 서열번호 161의 경쇄 가변영역;
서열번호 131의 중쇄 가변영역 및 서열번호 162의 경쇄 가변영역;
서열번호 132의 중쇄 가변영역 및 서열번호 163의 경쇄 가변영역;
서열번호 133의 중쇄 가변영역 및 서열번호 164의 경쇄 가변영역;
서열번호 134의 중쇄 가변영역 및 서열번호 165의 경쇄 가변영역;
서열번호 135의 중쇄 가변영역 및 서열번호 166의 경쇄 가변영역;
서열번호 136의 중쇄 가변영역 및 서열번호 167의 경쇄 가변영역;
서열번호 137의 중쇄 가변영역 및 서열번호 168의 경쇄 가변영역;
서열번호 138의 중쇄 가변영역 및 서열번호 169의 경쇄 가변영역;
서열번호 139의 중쇄 가변영역 및 서열번호 170의 경쇄 가변영역;
서열번호 140의 중쇄 가변영역 및 서열번호 171의 경쇄 가변영역;
서열번호 141의 중쇄 가변영역 및 서열번호 172의 경쇄 가변영역;
서열번호 142의 중쇄 가변영역 및 서열번호 173의 경쇄 가변영역;
서열번호 143의 중쇄 가변영역 및 서열번호 174의 경쇄 가변영역;
서열번호 144의 중쇄 가변영역 및 서열번호 175의 경쇄 가변영역;
서열번호 145의 중쇄 가변영역 및 서열번호 176의 경쇄 가변영역;
서열번호 146의 중쇄 가변영역 및 서열번호 177의 경쇄 가변영역;
서열번호 147의 중쇄 가변영역 및 서열번호 178의 경쇄 가변영역;
서열번호 148의 중쇄 가변영역 및 서열번호 179의 경쇄 가변영역;
서열번호 149의 중쇄 가변영역 및 서열번호 180의 경쇄 가변영역;
서열번호 150의 중쇄 가변영역 및 서열번호 181의 경쇄 가변영역;
서열번호 151의 중쇄 가변영역 및 서열번호 182의 경쇄 가변영역;
서열번호 152의 중쇄 가변영역 및 서열번호 183의 경쇄 가변영역;
서열번호 188의 중쇄 가변영역 및 서열번호 194의 경쇄 가변영역;
서열번호 189의 중쇄 가변영역 및 서열번호 195의 경쇄 가변영역;
서열번호 190의 중쇄 가변영역 및 서열번호 196의 경쇄 가변영역;
서열번호 191의 중쇄 가변영역 및 서열번호 197의 경쇄 가변영역;
서열번호 192의 중쇄 가변영역 및 서열번호 198의 경쇄 가변영역; 또는
서열번호 193의 중쇄 가변영역 및 서열번호 199의 경쇄 가변영역.
상기 링커는 펩타이드 링커일 수 있으며, 약 10-25 aa 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 글리신 및/또는 세린과 같은 친수성 아미노산이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 링커는 예를 들어, (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n 또는 (GnS)m (n, m은 각각 1 내지 10)을 포함할 수 있으나, 상기 링커는 예를 들어 (GnS)m (n, m은 각각 1 내지 10)일 수 있다. 구체적으로, 상기 링커는 GGGGS를 포함할 수 있고, 예를 들어 3회 반복된 서열번호 200의 GGGGSGGGGSGGGGS일 수 있다.
"파지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드를 파지, 예를 들어 섬유상 파지 입자의 표면 상에 외피 단백질의 적어도 일부와의 융합 단백질로서 디스플레이하는 기술이다. 파지 디스플레이의 유용성은 무작위화 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 대상으로 하여, 표적 항원과 고친화도로 결합하는 서열을 신속하고도 효율적으로 분류할 수 있다는 사실에 있다. 펩티드 및 단백질 라이브러리를 파지 상에 디스플레이하는 것은 특이적 결합 특성을 지닌 폴리펩티드를 알아보기 위해 수 백만개의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다.
파지 디스플레이 기술은 특정 리간드(예: 항원)와 결합하는 신규 단백질을 생성 및 선별하기 위한 강력한 도구를 제공하였다. 파지 디스플레이 기술을 사용하여, 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 생성시키고, 표적 항원과 고 친화성으로 결합하는 서열을 신속하게 분류할 수 있다. 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 바이러스성 외피 단백질, 예를 들어 유전자 III 단백질 또는 유전자 VIII 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨다. 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 유전자 III 단백질의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨 1가 파지 디스플레이 시스템이 개발되었다. 1가 파지 디스플레이 시스템에서는, 유전자 융합물이 저수준으로 발현되고 야생형 유전자 III 단백질이 또한 발현되어 입자 감염성이 유지된다.
섬유상 파지 표면 상에서의 펩티드의 발현과 E. coli의 주변세포질에서의 기능성 항체 단편의 발현을 입증하는 것이 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 개발하는 데에 있어 중요하다. 항체 또는 항원 결합성 폴리펩티드의 라이브러리는 수 많은 방식, 예를 들어 무작위 DNA 서열을 삽입함으로써 단일 유전자를 변경시키는 방법 또는 관련 유전자 계열을 클로닝하는 방법으로 제조하였다. 라이브러리를 대상으로 하여, 목적하는 특징을 수반한 항체 또는 항원 결합성 단백질의 발현에 관하여 스크리닝할 수 있다.
파지 디스플레이 기술은 목적하는 특징을 지닌 항체를 제조하기 위한 통상적인 하이브리도마 및 재조합 방법에 비해 몇 가지 이점을 지니고 있다. 이러한 기술은 동물을 사용하지 않고서도 짧은 시간에 다양한 서열을 지닌 큰 항체 라이브러리를 생성시킬 수 있도록 한다. 하이브리도마의 제조나 인간화 항체의 제조는 수 개월의 제조기간을 필요로 할 수 있다. 또한, 면역이 전혀 요구되지 않기 때문에, 파지 항체 라이브러리는 독성이거나 항원성이 낮은 항원에 대해서도 항체를 생성시킬 수 있다. 파지 항체 라이브러리를 또한 사용하여 신규한 치료적 항체를 생성 및 확인할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 면역시킨, 비-면역시킨 인간, 생식세포계 서열, 또는 미감작 B 세포 Ig 레퍼토리(repertory)로부터 인간 항체를 생성시키는 기술을 사용할 수 있다. 각종 림프계 조직을 사용하여, 미감작 또는 비면역 항원 결합성 라이브러리를 제조할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리로부터 고친화성 항체를 확인 및 분리할 수 있는 기술은 치료용 신규 항체 분리에 중요하다. 라이브러리로부터 고친화성 항체를 분리하는 것은 라이브러리의 크기, 세균성 세포 중에서의 생산 효율 및 라이브러리의 다양성에 좌우될 수 있다. 라이브러리의 크기는 항체 또는 항원 결합성 단백질의 부적절한 폴딩과 정지 코돈의 존재로 인한 비효율적 생산에 의해 감소된다. 세균성 세포에서의 발현은 항체 또는 항원 결합성 도메인이 적절하게 폴딩되지 않는 경우에는 억제될 수 있다. 발현은 가변/불변 계면의 표면이나 선별된 CDR 잔기에서의 잔기를 교대로 돌연변이 시킴으로써 개선시킬 수 있다. 골격 영역의 서열은 세균성 세포에서 항체 파지 라이브러리를 생성시키는 경우에 적절한 폴딩을 제공하기 위한 하나의 요소이다.
고친화성 항체 분리에서 항체 또는 항원 결합성 단백질의 다양한 라이브러리를 생성시키는 것이 중요하다. CDR3 영역은 이들이 종종 항원 결합에 참여하는 것으로 밝혀졌다. 중쇄 상의 CDR3 영역은 크기, 서열 및 구조적 입체 형태 면에서 상당히 다양하므로, 이를 이용하여 다양한 라이브러리를 제조할 수 있다.
또한, 각 위치에서 20개 아미노산 모두를 사용하여 가변 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역을 무작위화함으로써 다양성을 발생시킬 수 있다. 20개의 모든 아미노산을 사용하면 다양성이 큰 변이체 항체 서열이 생성되고 신규한 항체를 확인할 기회가 증가할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 ROR1를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 항-ROR1 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.html에서 확인할 수 있다.
이에 기초하여, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 명세서에 기재된 명시된 서열 또는 전체와 비교하여 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(즉, BLAST 또는 BLAST 2.0), 수동 정렬, 육안 검사를 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 퍼센트 서열 상동성을 결정할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 분리하여 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 재조합적으로 생산할 수 있다.
"핵산"은 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 분자생물학적 수법을 사용하여 (예를 들어, 항체와 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리코뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성할 수 있으며, 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나(DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 벡터의 성분으로는 일반적으로 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 항생제 내성 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 전사 종결 서열. 항체를 코딩하는 핵산은 프로모터 및 전사 종결 서열 등과 같이 작동적으로 연결되어 있다.
"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 따라 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 발현 벡터로 형질감염된 숙주세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 숙주세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilus 및 바실러스 투링기엔시스(Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.
다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 숙주세포를 배양하여 항체를 생성하는 단계; 및 생성된 항체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, ROR1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법에 관한 것이다.
상기 숙주세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
이중 또는 다중특이적 항체
본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체에 관한 것이다.
이중특이적(bispecific) 항체는 하나 이상의 타겟에 결합능 또는 길항능을 가지는 항체를 의미하며, 2개의 서로 다른 타겟에 대한 결합능 또는 길항능을 가지는 항체가 결합된 형태 또는 한 타겟에 대한 결합능을 가지는 항체와 다른 타겟에 대한 길항능을 가지는 물질이 결합되어 있는 항체를 의미한다.
다중특이적(multi-specific) 항체는 적어도 3 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 가지는 항체를 의미한다. 다중특이적 항체는 삼중특이적(Tri-specific) 이상의 항체, 예를 들어 삼중특이적(Tri-specific) 항체, 사중특이적(Tetra-specific) 항체 또는 그 이상의 타겟을 표적하는 항체를 포함할 수 있다.
이중특이적 또는 다중특이적 항체에 속하는 항체들은 scFv 기반 항체, Fab 기반 항체 및 IgG 기반 항체 등으로 구분할 수 있다. 이중특이적 또는 다중특이적 항체의 경우 두 개 이상의 신호를 동시에 억제 또는 증폭시킬 수 있기 때문에 하나의 신호를 억제/증폭하는 경우보다 더욱 효과적일 수 있으며, 각각의 신호를 각각의 신호억제제로 처리했을 경우와 비교하면, 저용량 투약이 가능하며, 동일한 시간 및 공간에서의 두 개 이상의 신호를 억제/증폭시킬 수 있다.
이중특이적 또는 다중특이적 항체의 제조 방법은 널리 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 두 개 이상의 중쇄가 상이한 특이성을 가지는 조건에서 두 개 이상의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동 발현을 근간으로 한다.
scFv를 기반으로 하는 이중특이적 또는 다중특이적 항체의 경우, 상이한 scFv들의 VL과 VH를 각기 서로 조합하여 혼성 scFv를 heterodimeric 형태로 제조하여 디아바디(diabody)를 만들 수 있고, 상이한 scFv를 서로 연결해서 tendem ScFv를 제조할 수 있으며, Fab의 CH1과 CL을 각각의 scFv의 말단에 발현시켜 heterodimeric 미니항체(miniantibody)를 제조할 수 있고, Fc의 homodimeric 도메인인 CH3 도메인의 일부 아미노산을 치환하여 'knob into hole' 형태의 heterodimeric 구조로 변경시켜, 이들 변경된 CH3 도메인을 상이한 각각의 scFv 말단에 발현시킴으로써 heterodimeric scFv 형태의 미니바디(minibody)를 제조할 수 있다.
Fab을 기반으로 하는 이중특이적 또는 다중특이적 항체의 경우, 특정 항원에 대한 개별 Fab'를 이황화결합 또는 매개체를 이용해서 서로 조합하여 heterodimeric Fab 형태로 제조할 수 있고, 특정 Fab의 중쇄 또는 경쇄의 말단에 상이한 항원에 대한 scFv를 발현시킴으로써 항원 결합가(valency)를 2개로 하거나, Fab과 scFv 사이에 경첩부위(hinge region)를 둠으로써 homodimeric 형태로 4개의 항원결합가를 가지도록 제조할 수 있다. 또한, Fab의 경쇄 말단과 중쇄 말단에 상이한 항원에 대한 scFv를 융합시킴으로써 항원에 대한 결합가를 3개로 만든 이중표적 바이바디(bibody), Fab의 경쇄 말단과 중쇄 말단에 상이한 scFv를 각각 융합시킴으로써 항원에 대한 결합가를 3개로 가지도록 한 삼중표적 바이바디, 상이한 Fab 3개를 화학적으로 접합시킴으로써 수득할 수 있다.
IgG를 기반으로 하는 이중특이적 또는 다중특이적 항체의 경우, 트리온파마(Trion Pharma)사에 의해 마우스와 렛트 하이브리도마를 다시 교잡함으로써, 하이브리드 하이브리도마, 일명 쿼드로마(quadromas)를 제조하여 이중특이적 항체를 생산하는 방법이 알려져 있다. 또한, 경쇄부분은 공유하면서, 상이한 중쇄에 대해서 Fc의 CH3 homodimeric 도메인의 일부 아미노산을 변형시켜 heterodimeric 형태로 제작한 이른 바 'Holes and Knob' 형태로 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. heterodimeric 형태의 이중특이적 항체 이외에, 상이한 2종의 scFv를 IgG의 경쇄와 중쇄의 가변 도메인 대신 constant 도메인에 각각 융합 발현시켜 homodimeric 형태의 (scFv)4-IgG로 제조할 수 있다. 또한, 임클론(ImClone)사는 인간 VEGFR-2에 대한 키메릭 단클론항체인 IMC-1C11을 기반으로하여, 이 항체의 경쇄 아미노 말단에 마우스 혈소판유도성장인자수용체-알파(Platelet-derived Growth Factor Receptor-α)에 대한 single variable domain만을 융합시켜 이중특이적 항체를 제작하여 보고하였다. 또한, 단백질 카이네이즈 A(protein kinase A, PKA) R 서브유닛의 dimerization and docking domain(DDD)과 PKA의 anchoring domain을 이용한 이른 바 'dock and lock(DNL)' 방법을 통해서 CD20에 대한 다수의 항원결합가를 지니는 항체로 제작할 수 있다.
매우 다양한 재조합 항체 포맷, 예를 들면, 2가 이상, 3가 이상 또는 4가 이상의 이중특이적 또는 다중특이적 항체가 개발되었다. 예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO2001/077342호, 제WO2009/080251호, 제WO2009/080252호, 제WO2009/080253호, 제WO2009/080254호, 제WO2010/112193호, 제WO2010/115589호, 제WO2010/136172호, 제WO2010/145792호, 제WO2010/145793호 및 제WO2011/117330호에 기재된 2가 이상, 3가 이상 또는 4가 이상의 항체도 포함한다. 2가 이상, 3가 이상 또는 4가 이상의 항체는 각각 2개 이상의 결합 도메인, 3개 이상의 결합 도메인 또는 4개 이상의 결합 도메인이 항체 분자에 존재한다는 것을 표시한다.
구체적 실시예에서, 본 발명에 따른 이중 또는 다중특이적 항체는 상기 항-ROR1 항체 또는 항원 결합 단편을 구체적으로 IgG 완전한 항체 또는 이의 단편 형태 예를 들어 단일쇄 Fv, VH 도메인 및/또는 VL 도메인, Fab 또는 (Fab)2의 형태로 포함할 수 있다.
또한, 상기 ROR1을 타겟으로 하는 항체와 다른 타겟에 결합하는 항체 예를 들어, PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137(4-1BB), VISTA, CD258(LIGHT), TIGIT, CD134(OX40), CD28, CD278(ICOS), CD27, CD154(CD40L), CD357(GITR), CD30, DR3, CD226(DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1, MARCO으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 타겟하는 항체 구체적으로 IgG 완전한 항체 또는 이의 단편 형태 예를 들어 단일쇄 Fv, VH 도메인 및/또는 VL 도메인, Fab 또는 (Fab)2의 형태로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 이중 또는 다중특이적 항체를 통해 ROR1 이외에, 다른 타겟에 의해 유도되거나 매개된 추가적 결합 특이성을 확보할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 ROR1과 PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137(4-1BB), VISTA, CD258(LIGHT), TIGIT, CD134(OX40), CD28, CD278(ICOS), CD27, CD154(CD40L), CD357(GITR), CD30, DR3, CD226(DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1, MARCO으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 동시에 타겟으로 할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 ROR1과 PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137(4-1BB), VISTA, CD258(LIGHT), TIGIT, CD134(OX40), CD28, CD278(ICOS), CD27, CD154(CD40L), CD357(GITR), CD30, DR3, CD226(DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1, MARCO으로 구성된 군에서 선택된 둘 이상을 동시에 타겟으로 할 수 있다.
면역세포 인게이징(immune cell engage) 이중특이적 또는 다중특이적 항체
본 발명은 또 다른 관점에서 항체의 scFv 및 면역세포 활성화 항원에 결합하는 항체의 scFv를 하나 이상 포함하는 제2결합 도메인으로 구성된 scFv를 포함하는, 면역세포 인게이징(immune cell engage) 이중특이적 또는 다중특이적 항체에 관한 것이다.
상기 면역세포 인게이징 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 통해 세포독성 T 세포와 암 타겟 세포 사이의 세포 용해성 시냅스를 일시적으로 유도하여 독성물을 방출하도록 한다.
하나의 실시예에서, 상기 면역세포는 T 세포, NK 세포, 사이토카인 유도 살해세포(Cytokine Induced Killer cell, CIK), 활성화 세포독성 T 림프구(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL), 마크로파지, 종양 조직 내 침투 T 세포 (Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TIL), 수지상세포로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 면역세포 활성화 항원은 예를 들어 다음에서 선택될 수 있으며, 이에 결합하는 항체가 면역세포 인게이징(immune cell engage) 역할을 할 수 있다:
T 세포 활성화 항원은 CD3, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRξ, ICOS, CD28, CD27, HVEM, LIGHT, CD40, 4-1BB, OX40, DR3, GITR, CD30, TIM1, SLAM, CD2, 또는 CD226;
NK세포 활성화 항원은 NKp30, NKp40, NKp44, NKp46, NKG2D, DNAM1, DAP10, CD16 (e.g., CD16a, CD16b), CRTAM, CD27, PSGL1, CD96, CD100 (SEMA4D), NKp80, CD244 (SLAMF4 또는 2B4), SLAMF6, SLAMF7, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR3DS1, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR2DS1, CD94, NKG2C, NKG2E 또는 CD160;
B세포 활성화 항원은 OX40, CD40 또는 CD70;
대식세포 활성화 항원은 CD2 아고니스트, CD40, CD70, TCR (Toll-like Receptor) 아고니스트, CD47, STING 또는 OX40L; 또는
수지상세포 활성화 항원은 CD2 아고니스트, OX40, OX40L, 41BB 아고니스트, TCR 아고니스트, CD47 아고니스트, 또는 STING 아고니스트.
면역세포 인게이저(immune cell engager)는 미국특허출원공개 제2017/0368169호에 구체적으로 기재되어 있으며, 본 발명에 참조로서 도입될 수 있다.
구체적으로, 상기 면역세포 인게이징 이중특이적 또는 다중특이적 항체는 직렬 scFv를 포함하고, 다음의 항원 및 암세포 상의 표면 항원에 결합할 수 있다. 상기 암세포 상의 표면 항원은 본 발명에 따른 항체가 표적하는 ROR1이다:
CD3, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRξ, ICOS, CD28, CD27, HVEM, LIGHT, CD40, 4-1BB, OX40, DR3, GITR, CD30, TIM1, SLAM, CD2, 또는 CD226;
NKp30, NKp40, NKp44, NKp46, NKG2D, DNAM1, DAP10, CD16 (e.g., CD16a, CD16b), CRTAM, CD27, PSGL1, CD96, CD100 (SEMA4D), NKp80, CD244 (SLAMF4 또는 2B4), SLAMF6, SLAMF7, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR3DS1, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR2DS1, CD94, NKG2C, NKG2E 또는 CD160;
OX40, CD40 또는 CD70;
CD2 아고니스트, CD40, CD70, TCR (Toll-like Receptor) 아고니스트, CD47, STING 또는 OX40L; 또는
CD2 아고니스트, OX40, OX40L, 41BB 아고니스트, TCR 아고니스트, CD47 아고니스트, 또는 STING 아고니스트.
상기 면역세포 인게이징 이중특이적 또는 다중특이적 항체는 예를 들어, VL(ROR1)-VH(ROR1)-VH(CD3 또는 CD16A)-VL(CD3 또는 CD16A), VH(ROR1)-VL(ROR1)-VH(CD3 또는 CD16A)-VL(CD3 또는 CD16A), VH(CD3 또는 CD16A)-VL(CD3 또는 CD16A)-VH(ROR1)-VL(ROR1) 또는 VH(CD3 또는 CD16A)-VL(CD3 또는 CD16A)-VL(ROR1)-VH(ROR1) 형태의 구조를 포함할 수 있다.
상기 scFv는 예를 들어, 서열번호 122 내지 서열번호 152 및 서열번호 188 내지 서열번호 193으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 153 내지 서열번호 183 및 서열번호 194 내지 서열번호 199로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역은 링커로 연결될 수 있다.
상기 링커는 펩타이드 링커일 수 있으며, 약 10-25 aa 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 글리신 및/또는 세린과 같은 친수성 아미노산이 포함될 수 있다.
상기 링커는 예를 들어, (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n 또는 (GnS)m (n, m은 각각 1 내지 10)을 포함할 수 있으나, 상기 링커는 예를 들어 (GnS)m (n, m은 각각 1 내지 10)일 수 있다. 구체적으로, 상기 링커는 GGGGS를 포함할 수 있고, 예를 들어 3회 반복된 서열번호 200의 GGGGSGGGGSGGGGS일 수 있다.
상기 면역세포 인게이징 이중특이적 또는 다중특이적 항체의 예시로, CD3 및 CD19에 결합하는 블리나투모마브(blinatumomab)(Amgen); CD3 및 EpCAM에 결합하는 솔리토마브(solitomab)(Amgen); CD3 및 CEA에 결합하는 MEDI 565(MedImmune, Amgen); 및 CD3 및 PSMA에 결합하는 BAY2010112(Bayer, Amgen)를 포함한다. 예시적인 DART는 CD3 및 CD123에 결합하는 MGD006(Macrogenics); 및 CD3 및 gpA33에 결합하는 MGD007(Macrogenics)를 포함한다. 예시적인 TandAbs는 CD3 및 CD19에 결합하는 AFM11(Affimed Therapeutics); 및 CD30 및 CD16A에 결합하는 AFM13(Affimed Therapeutics)을 포함할 수 있다.
항체-약물 접합체(ADC)
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 약물에 결합된 항체-약물 접합체(ADC)에 관한 것이다.
항체-약물 접합체는 타겟 암세포로 항암 약물을 전달하기 전까지 항암 약물이 항체에 안정적으로 결합되어 있어야 한다. 타겟으로 전달된 약물은 항체로부터 유리되어 타겟 세포의 사멸을 유도해야 한다. 이를 위해서는 약물이 항체에 안정적으로 결합함과 동시에 타겟 세포에서 유리될 때는 타겟 세포의 사멸을 유도할 충분한 세포독성을 가져야 한다.
하나의 실시예에서, 상기 항체는 링커를 통하여 약물에 결합될 수 있다. 상기 링커는 항-ROR1 항체와 약물 사이를 연결하는 부위로, 세포내 조건에서 절단 가능한 형태 즉, 세포 내 환경에서 항체에서 약물이 방출될 수 있도록 하며, 항체의 긴 반감기를 반영하여 항체가 전신 순환 중에는 안정하고, 링커와 약물의 결합이 항체의 안정성 및 약물 동태에 영향을 주지 않아야 한다.
상기 링커는 예를 들어 절단성 링커 또는 비절단성 링커를 포함할 수 있다. 절단성 링커의 경우 펩타이드 링커와 같이 세포 내 펩티다아제 또는 프로테아제 효소 예를 들어 리소좀 또는 엔도좀 프로테아제에 의해 절단될 수 있고, 비절단성 링커의 경우 예를 들어 티오에테르 링커는 항체가 세포내 가수분해에 의해 비선택적으로 분해된 후에 약물이 방출될 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 절단성 링커는 펩타이드 링커를 포함할 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 적어도 2개 이상의 아미노산 길이를 가진다. 예를 들어, Val-Cit, Val-Ala, 또는 Val-Cit의 디펩티드 또는 Phe-Leu 또는 Gly-Phe-Leu-Gly가 포함될 수 있다. 링커의 예시는 국제특허출원공개 제WO2004/010957호에 구체적으로 기재되어 있으며, 본 발명에 참조로서 도입될 수 있다.
상기 항체-약물 접합체는 표적 암세포의 항원에 ADC의 항체영역이 결합하여 ADC-항원 복합체를 형성한 후 엔도좀-리소좀 경로로 암세포 내부로 내포화 된다. 이 경우 세포 독성 약물의 세포 내 방출은 엔도솜/리소좀의 내부 환경에 의해 조절된다.
하나의 실시예에서, 상기 절단성 링커는 pH 민감성으로, 특정 pH 값에서 가수분해에 민감할 수 있다. 일반적으로, pH 민감성 링커는 산성 조건에서 가수분해될 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, 리소좀에서 가수분해될 수 있는 산성 불안정 링커 예를 들어, 하이드라존, 세미카바존, 티오세미카바존, 시스-아코니틱 아마이드(cis-aconitic amide), 오르쏘에스테르, 아세탈, 케탈 등일 수 있다.
다른 실시예에서, 상기 링커는 환원 조건에서 절단될 수도 있으며, 예를 들어 이황화 링커가 이에 해당할 수 있다. SATA(N-succinimidyl-S-acetylthioacetate), SPDP(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate), SPDB(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)butyrate) 및 SMPT(N-succinimidyl-oxycarbonyl-alpha-methyl-alpha-(2-pyridyl-dithio)toluene)를 사용하여 다양한 이황화 결합이 형성될 수 있다. 이러한 이황화 링커는 세포내 글루타치온의 티올과 이황화 교환에 의해 분해될 수 있다.
상기 약물 및/또는 약물-링커는 항체의 라이신을 통해 무작위로 접합되거나, 이황화 결합 사슬을 환원하였을 때 노출되는 시스테인을 통해 접합될 수 있다. 경우에 따라서, 유전공학적으로 제작된 태그 예를 들어, 펩타이드 또는 단백질에 존재하는 시스테인을 통해 링커-약물이 결합될 수 있다. 상기 유전공학적으로 제작된 태그 예를 들어, 펩타이드 또는 단백질은 예를 들어, 이소프레노이드 트랜스퍼라제에 의하여 인식될 수 있는 아미노산 모티프를 포함할 수 있다. 상기 펩타이드 또는 단백질은 펩타이드 또는 단백질의 카복시 말단에서 결실(deletion)을 가지거나, 펩타이드 또는 단백질의 카복시(C) 말단에 스페이서 유닛의 공유결합을 통한 부가를 갖는다.
상기 펩타이드 또는 단백질은 아미노산 모티프와 바로 공유결합되거나 스페이서 유닛과 공유결합되어 아미노산 모티프와 연결될 수 있다. 상기 아미노산 스페이서 유닛은 1 내지 20개의 아미노산으로 구성되며, 그 중에서 글리신(Glycine) 유닛이 바람직하다.
상기 이소프레노이드 트랜스퍼라제는 예를 들어, 파네실트랜스퍼라제(FTase, farnesyl protein transferase) 또는 게라닐게라닐트랜스퍼라제(GGTase, geranylgeranyl transferase)일 수 있고, FTase 및 GGTase I은 앞서 언급한 화학식 1 중 CAAX 모티프를 인식할 수 있고, GGTase II는 XXCC, XCXC 또는 CXX 모티프(여기서 C는 시스테인이고, A는 지방족 아미노산이고, X는 이소프레노이드 트랜스퍼라제의 기질 특이성을 결정하는 아미노산이다)를 인식할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 상기 링커는 리소좀에서 다수 존재하거나, 또는 몇몇 종양세포에서 과발현되는 베타-글루쿠로니데이즈(β-glucuronidase)에 의해 인식되어 가수분해 되는 베타-글루쿠로나이드 링커를 포함할 수 있다. 펩타이드 링커와는 달리 친수성(hydrophilicity)이 커서 소수성의 성질이 높은 약물과 결합시 항체-약물 복합체의 용해도를 증가시킬 수 있는 장점을 지닌다.
이와 관련하여, 국제특허출원공개 제WO2015/182984호에 개시된 베타-글루쿠로나이드 링커, 예를 들어 자가-희생기(self-immolative group)를 포함하는 베타-글루쿠로나이드 링커를 사용할 수 있으며, 위 문헌은 참조로 도입된다.
경우에 따라서, 상기 링커는 예를 들어 비절단성 링커일 수 있으며, 세포 내에서 항체 가수분해 한 단계만을 통해 약물이 방출되어, 예를 들어 아미노산-링커-약물 복합체를 생산한다. 이러한 유형의 링커는 티오에테르기 또는 말레이미도카프로일기(maleimidocaproyl)일 수 있고, 혈액 내 안정성을 유지할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 항체의 이황화 결합 사슬을 환원하였을 때 노출되는 시스테인을 통해 링커-약물이 무작위 결합 또는 서열 GGGGGGGCVIM을 가지는 항체 말단 결합 펩타이드를 도입하여 링커-약물이 결합될 수 있다.
상기 약물(화학식 (1)의 D 포함)은 약리학적 효과를 나타내는 제제로 항체에 결합될 수 있으며, 구체적으로 화학요법제, 독소, 마이크로 RNA(miRNA), siRNA, shRNA 또는 방사성 동위원소일 수 있다. 상기 화학요법제는 예를 들어, 세포독성 제제 또는 면역억제제일 수 있다. 구체적으로 마이크로투불린 억제제, 유사분열 억제제, 토포이소머라아제 억제제, 또는 DNA 인터컬레이터로서 기능할 수 있는 화학요법제를 포함할 수 있다. 또한, 면역조절 화합물, 항암제, 항바이러스제, 항박테리아제, 항진균제, 구충제 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
이러한 약물에는 예를 들어, 마이탄시노이드, 오리스타틴(MMAE, MMAF 포함), 아미노프테린, 악티노마이신, 블레오마이신, 탈리소마이신, 캄프토쎄신, N8-아세틸 스퍼미딘, 1-(2 클로로에틸)-1,2-다이메틸 술포닐 하이드라자이드, 에스퍼라마이신, 에토포사이드, 6-머캅토퓨린, 돌라스타틴, 트리코테센, 칼리케아미신, 탁솔(taxol), 탁산, 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 A, 미토마이신 C, 클로람부실, 듀오카마이신, L-아스파라기나제(L-asparaginase), 머캡토퓨린(mercaptopurine), 티오구아닌(thioguanine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 시타라빈(cytarabine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 니트로소우레아(nitrosourea), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 미토마이신(mitomycin), 다카바진(dacarbazine), 프로카바진(procarbazine), 토포테칸(topotecan), 질소 머스터드(nitrogen mustard), 사이톡산(cytoxan), 에토포시드(etoposide), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), CNU(bischloroethylnitrosourea), 이리노테칸(irinotecan), 캄포토테신(camptothecin), 블레오마이신(bleomycin), 이다루비신(idarubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 닥티노마이신(dactinomycin), 플리카마이신(plicamycin), 미톡산트론(mitoxantrone), 아스파라기나제(asparaginase), 비노렐빈(vinorelbine), 클로로람부실(chlorambucil), 멜파란(melphalan), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 부설판(busuLfan), 트레오설판(treosulfan), 데카바진(decarbazine), 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 토포테칸(topotecan), 9-아미노캠프토테신(9-aminocamptothecin), 크리스나톨(crisnatol), 미토마이신 C(mitomycin C), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 티아조퓨린(tiazofurin), 리바비린(ribavirin), EICAR(5-ethynyl-1-beta-Dribofuranosylimidazole-4-carboxamide), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 데프록사민(deferoxamine), 플룩수리딘(floxuridine), 독시플루리딘(doxifluridine), 랄티트렉세드(raltitrexed), 시타라빈(cytarabine(ara C)), 시토신 아라비노시드(cytosine arabinoside), 플루다라빈(fludarabine), 타목시펜(tamoxifen), 라록시펜(raloxifene), 메게스트롤(megestrol), 고세렐린(goserelin), 류프롤리드 아세테이트(leuprolide acetate), 플루타미드(flutamide), 바이칼루타마이드(bicalutamide), EB1089, CB1093, KH1060, 베르테포르핀(verteporfin), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 광감작제 Pe4(photosensitizer Pe4), 데메톡시-하이포크레린 A(demethoxy-hypocrellin A), 인터페론-α(Interferon-α), 인터페론-γ(Interferon-γ), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor), 겜사이타빈(Gemcitabine), 벨케이드(velcade), 레발미드(revamid), 탈라미드(thalamid), 로바스타틴(lovastatin), 1-메틸-4-페닐피리디늄 이온(1-methyl-4-phenylpyridiniumion), 스타우로스포린(staurosporine), 악티노마이신 D(actinomycin D), 닥티노마이신(dactinomycin), 블레오마이신 A2(bleomycin A2), 블레오마이신 B2(bleomycinB2), 페플로마이신(peplomycin), 에피루비신(epirubicin), 피라루비신(pirarubicin), 조루비신(zorubicin), 마이토산트론(mitoxantrone), 베라파밀(verapamil) 및 탑시가르긴(thapsigargin), 핵산 분해 효소 및 세균이나 동식물 유래의 독소로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
경우에 따라서, 상기 약물은 링커 및 링커 시약 상의 친전자성 기와 공유결합을 형성하기 위해 반응할 수 있는 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드기로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 친핵기를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 구체적 실시예에서 MC-vc-PAB 링커를 통해, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 약물 예를 들어, 오리스타틴(MMAE)과 연결한 ADC를 제작하였다. 이러한 ADC는 목적하는 세포독성을 나타냄을 확인하였다.
키메라 항원 수용체(CAR)
본 발명은 다른 관점에서, 항원 결합 부위를 포함하는 세포외 도메인, 트랜스멤브레인 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)로, 상기 세포외 도메인의 항원 결합 부위는 상기 항체의 scFv인 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체에 관한 것이다.
키메라 항원 수용체(CAR)는 표적 항원 및 해당 항원을 발현하는 세포에 대하여 면역반응을 유도할 수 있도록 설계된 합성 컨스트럭트이다. CAR는 세포외 도메인, 트랜스멤브레인 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 암세포의 표면에 특이적으로 발현되는 암세포 표면 항원을 인식하는 수용체를 코딩하는 유전자를 면역세포에 도입하여, 암세포를 사멸시킬 수 있다. 암세포에서 특이적으로 발현하는 항원과 결합하는 수용체를 포함하는 면역세포를 통해, 암세포만 표적하여 면역반응을 일으킬 수 있다. 상기 CAR는 본 발명에 따른 항-ROR1 항체의 scFv를 세포외 도메인의 항원 인식 부위로 포함한다.
1세대 CAR에서는 암세포에서 특이적으로 발현하는 항원 인식 부위를 포함하는 세포외 도메인, 트랜스멤브레인 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하고, 신호전달 도메인으로서 CD3ζ만을 이용하였는데, 암에 대한 치료 효과가 미미하였고, 지속시간이 짧다는 문제가 있었다. 이러한 1세대 CAR는 미국등록특허 제6,319,494호에 구체적으로 기재되어 있으며, 본 발명에 참조로서 도입된다.
면역세포에 대한 반응성 향상을 위하여 보조 자극 도메인(CD28 또는 CD137/4-1BB)과 CD3ζ를 결합한 2세대 CAR가 제조되었는데 1세대 CAR와 비교하여 체내에 잔존하는 CAR 포함 면역세포의 수가 현저히 증가하였다. 2세대 CAR는 한 가지의 보조 자극 도메인을 이용한 것에 반해, 3세대 CAR에서는 두 가지 이상의 보조 자극 도메인을 이용하였다. 생체 내 CAR를 포함하는 면역세포의 확장 및 지속성 달성을 위해 보조 자극 도메인을 4-1BB, CD28 또는 OX40 등과 결합시킬 수 있다. 2세대 CAR는 미국등록특허 제7,741,465호, 제7,446,190호 또는 제9,212,229호에 구체적으로 기재되어 있고 3세대 CAR는 미국등록특허 제8,822,647호에 구체적으로 기재되어 있으며, 본 발명에 참조로서 도입된다.
4세대 CAR에서는 IL-12 또는 IL-15와 같은 사이토카인을 암호화하는 추가 유전자를 포함하여, 사이토카인의 CAR 기반 면역단백질이 추가로 발현될 수 있도록 하고, 5세대 CAR는 면역세포 강화를 위해 인터루킨 리셉터 체인 예를 들어, IL-2Rβ를 추가로 포함한다. 4세대 CAR는 미국등록특허 제10,316,102호, 5세대 CAR는 미국등록특허 제10,336,810호에 구체적으로 기재되어 있으며, 본 발명에 참조로서 도입된다.
하나의 실시예에서, 상기 세포외 도메인의 항원 결합 부위는 항체의 scFv이다. 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 scFv에서 VH 및 VL 도메인은 링커를 통해 연결될 수 있다. 서열번호 122 내지 서열번호 152 및 서열번호 188 내지 서열번호 193으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역은 링커를 통해 서열번호 153 내지 서열번호 183 및 서열번호 194 내지 서열번호 199로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역과 연결될 수 있다.
상기 링커는 펩타이드 링커일 수 있으며, 약 10-25 aa 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 글리신 및/또는 세린과 같은 친수성 아미노산이 포함될 수 있다.
상기 링커는 예를 들어, (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n 또는 (GnS)m (n, m은 각각 1 내지 10)을 포함할 수 있으나, 상기 링커는 예를 들어 (GnS)m (n, m은 각각 1 내지 10)일 수 있다. 구체적으로, 상기 링커는 GGGGS를 포함할 수 있고, 예를 들어 3회 반복된 서열번호 200의 GGGGSGGGGSGGGGS일 수 있다.
상기 트랜스멤브레인 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 임의의 막 결합된 단백질 또는 트랜스멤브레인 단백질로부터 유래될 수 있다. 상기 트랜스멤브레인 도메인은 T-세포 수용체, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, ICOS의 알파, 베타 또는 제타 쇄를 포함할 수 있다. 상기 트랜스멤브레인 도메인을 합성하는 경우 류신과 발린과 같은 소수성 잔기를 포함하거나, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린 포함 펩타이드를 각 말단에 포함할 수 있다. 2개 내지 10개 아미노산 길이인 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커가 트랜스멤브레인 도메인과 CAR의 세포질 신호전달 도메인 사이에 결합을 형성할 수 있다. 글리신-세린 펩타이드를 링커로 이용할 수 있다.
상기 신호 전달 도메인은 CAR이 위치된 면역세포의 정상 효과기 기능에 대한 활성화를 유도할 수 있다. 예를 들어 사이토카인의 분비를 통해 세포용해 활성화 또는 헬퍼 활성화를 유도할 수 있다. 상기 신호 전달 도메인은 효과기 기능 신호를 형질도입하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 절단된 단편을 포함할 수 있다.
상기 신호 전달 도메인으로 항원 수용체 관여 후 신호 전달을 개시하기 위해 협력하여 작용하는 T 세포 수용체(TCR) 및 공동-수용체의 세포질이 포함될 수 있다.
TCR 단독을 통해 생성된 신호는 T 세포의 완전한 활성화를 위해 불충분하고 공동-자극 신호가 필요하다는 것이 또한 알려져 있다. 따라서, T 세포 활성화에 TCR을 통해 항원-의존성 일차 활성화를 개시하는 것 및 이차 또는 공동-자극 신호를 제공하도록 항원-의존성 방식으로 작용하는 것이 관여할 수 있다. 일차 세포질 신호전달 서열은 자극성 방식으로, 또는 억제성 방식으로 TCR 복합체의 일차 활성화를 조절한다. 자극성 방식으로 작용하는 일차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 서 공지된 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 일차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예로는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d를 포함할 수 있다.
경우에 따라서, CAR의 세포질 도메인은 CD3 제타쇄 부분 및 공동자극 신호전달 영역을 포함할 수 있다. 공동자극 신호전달 영역은 공동자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 일 부분을 의미한다. 예를 들어, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련된 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등이 포함될 수 있다. CAR의 세포질 신호전달 부분 내의 세포질 신호전달 서열은 2개 내지 10개 아미노산 예를 들어, 글리신-세린 포함 펩타이드 링커를 통해 연결될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 키메라 항원 수용체(CAR)가 도입된 면역세포에 관한 것이다.
상기 면역세포는 면역을 유도하여 목적하는 암 치료 효과를 유발할 수 있는 것으로, 예를 들어, T 세포, NK 세포, 사이토카인 유도 살해세포(Cytokine Induced Killer cell, CIK), 활성화 세포독성 T 림프구(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL), 마크로파지, 종양 조직 내 침투 T 세포(Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TIL), 수지상세포로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항체 이외의 항체는 예를 들어 PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137(4-1BB), VISTA, CD258(LIGHT), TIGIT, CD134(OX40), CD28, CD278(ICOS), CD27, CD154(CD40L), CD357(GITR), CD30, DR3, CD226(DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1, MARCO으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 타겟하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
치료용 조성물
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체 또는 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 면역세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 예를 들어, (a) 본 발명에 따른 ROR1에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체 또는 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 면역세포의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다. 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 ROR1에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체 또는 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 면역세포를 암 환자에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법일 수 있다.
"예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 암의 성장을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 암 발전의 억제, 종양의 경감 또는 암의 제거를 의미한다.
상기 암은 예를 들어, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종(예컨대, B 세포 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 외투세포 림프종, 변연구역 B 세포 림프종, 버킷 림프종, 림프형질세포 림프종, 모상 세포 백혈병), 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수형성이상 증후군, 다발성 골수종, 또는 급성 림프구성 백혈병을 포함한다.
상기 암은 예를 들어, 난소암, 직장암, 위암, 고환암, 항문 부위 암, 자궁암, 결장암, 직장암, 신장 세포 암종, 간암, 폐의 비-소세포 암종, 소장 암, 식도암, 흑색종, 카포시 육종, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선 암, 부신암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 뇌줄기 신경아교종, 뇌하수체 선암, 표피모양 암, 자궁경부 편평세포 암의 암종, 난관 암종, 자궁내막 암종, 질 암종, 연조직 육종, 요도암, 외음부 암종, 음경암, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신우 암종, 척추 종양, 중추신경계(CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 상기 암들의 전이 병변, 또는 상기 암의 조합을 포함한다.
상기 암은 예를 들어, 교모세포종, 폐암, 방광암, 구강암, 두경부 편평세포암, 담낭암 또는 자궁경부암일 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다.
경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 약제학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 암 또는 자가면역질환의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
치료방법
본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 항체-약물 접합체, 키메라 항원 수용체 또는 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 면역세포를 포함하는, 암 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 항체-약물 접합체, 키메라 항원 수용체 또는 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 면역세포를 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 암 예방 또는 치료를 위한 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 항체-약물 접합체, 키메라 항원 수용체 또는 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 면역세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 암 예방 또는 치료용 약제 제조를 위한 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 항체-약물 접합체, 키메라 항원 수용체 또는 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 면역세포의 사용에 관한 것이다.
병용치료
본 발명은 면역세포 및 항-ROR1 항체 이외의 약물을 포함하는 병용 치료용 조성에 관한 것이다.
하나의 실시예에서, 상기 항-ROR1 항체 이외의 약물은 화학요법제 또는 항-ROR1 항체 이외의 항체를 포함할 수 있다.
상기 약물은 마이탄시노이드, 오리스타틴(MMAE, MMAF 포함), 아미노프테린, 악티노마이신, 블레오마이신, 탈리소마이신, 캄프토쎄신, N8-아세틸 스퍼미딘, 1-(2 클로로에틸)-1,2-다이메틸 술포닐 하이드라자이드, 에스퍼라마이신, 에토포사이드, 6-머캅토퓨린, 돌라스타틴, 트리코테센, 칼리케아미신, 탁솔(taxol), 탁산, 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 A, 미토마이신 C, 클로람부실, 듀오카마이신, L-아스파라기나제(L-asparaginase), 머캡토퓨린(mercaptopurine), 티오구아닌(thioguanine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 시타라빈(cytarabine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 니트로소우레아(nitrosourea), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 미토마이신(mitomycin), 다카바진(dacarbazine), 프로카바진(procarbazine), 토포테칸(topotecan), 질소 머스터드(nitrogen mustard), 사이톡산(cytoxan), 에토포시드(etoposide), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), CNU(bischloroethylnitrosourea), 이리노테칸(irinotecan), 캄포토테신(camptothecin), 블레오마이신(bleomycin), 이다루비신(idarubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 닥티노마이신(dactinomycin), 플리카마이신(plicamycin), 미톡산트론(mitoxantrone), 아스파라기나제(asparaginase), 비노렐빈(vinorelbine), 클로로람부실(chlorambucil), 멜파란(melphalan), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 부설판(busuLfan), 트레오설판(treosulfan), 데카바진(decarbazine), 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 토포테칸(topotecan), 9-아미노캠프토테신(9-aminocamptothecin), 크리스나톨(crisnatol), 미토마이신 C(mitomycin C), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 티아조퓨린(tiazofurin), 리바비린(ribavirin), EICAR(5-ethynyl-1-beta-Dribofuranosylimidazole-4-carboxamide), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 데프록사민(deferoxamine), 플룩수리딘(floxuridine), 독시플루리딘(doxifluridine), 랄티트렉세드(raltitrexed), 시타라빈(cytarabine(ara C)), 시토신 아라비노시드(cytosine arabinoside), 플루다라빈(fludarabine), 타목시펜(tamoxifen), 라록시펜(raloxifene), 메게스트롤(megestrol), 고세렐린(goserelin), 류프롤리드 아세테이트(leuprolide acetate), 플루타미드(flutamide), 바이칼루타마이드(bicalutamide), EB1089, CB1093, KH1060, 베르테포르핀(verteporfin), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 광감작제 Pe4(photosensitizer Pe4), 데메톡시-하이포크레린 A(demethoxy-hypocrellin A), 인터페론-α(Interferon-α), 인터페론-γ(Interferon-γ), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor), 겜사이타빈(Gemcitabine), 벨케이드(velcade), 레발미드(revamid), 탈라미드(thalamid), 로바스타틴(lovastatin), 1-메틸-4-페닐피리디늄 이온(1-methyl-4-phenylpyridiniumion), 스타우로스포린(staurosporine), 악티노마이신 D(actinomycin D), 닥티노마이신(dactinomycin), 블레오마이신 A2(bleomycin A2), 블레오마이신 B2(bleomycinB2), 페플로마이신(peplomycin), 에피루비신(epirubicin), 피라루비신(pirarubicin), 조루비신(zorubicin), 마이토산트론(mitoxantrone), 베라파밀(verapamil) 및 탑시가르긴(thapsigargin), 핵산 분해 효소 및 세균이나 동식물 유래의 독소로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 항-ROR1 항체 이외의 항체는 예를 들어 PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137(4-1BB), VISTA, CD258(LIGHT), TIGIT, CD134(OX40), CD28, CD278(ICOS), CD27, CD154(CD40L), CD357(GITR), CD30, DR3, CD226(DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1, MARCO으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 타겟하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 다음으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 병용 치료용 조성물에 관한 것이다.
(i) 면역세포;
(ii) 항-ROR1 항체 이외의 항체에 대한 scFv를 세포외 도메인으로 포함하는 항원 수용체(CAR)를 포함하는 면역세포; 및
(iii) 면역관문억제제(Immune checkpoint inhibitor).
또한, 본 발명은 상기 면역세포 인게이징(immune cell engage) 이중특이적 또는 다중특이적 항체 및 다음으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 병용 치료용 조성물에 관한 것이다:
(i) 면역세포;
(ii) 항-ROR1 항체 이외의 항체에 대한 scFv 단편을 세포외 도메인으로 포함하는 항원 수용체(CAR)를 포함하는 면역세포; 및
(iii) 면역관문억제제(Immune checkpoint inhibitor).
상기 면역세포는 면역 치료 예를 들어 면역을 유도하여 목적하는 암 치료 효과를 유발할 수 있는 것으로, 예를 들어, T 세포, NK 세포, 사이토카인 유도 살해세포(Cytokine Induced Killer cell, CIK), 활성화 세포독성 T 림프구(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL), 마크로파지, 종양 조직 내 침투 T 세포(Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TIL), 수지상세포로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항-ROR1 항체 이외의 항체는 ROR1 이외의 표적을 타겟하는 항체로, 예를 들어 LAG3, TIM3, CD137(4-1BB), VISTA, CD258(LIGHT), TIGIT, CD134(OX40), CD28, CD278(ICOS), CD27, CD154(CD40L), CD357(GITR), CD30, DR3, CD226(DNAM1), CD96, CD200, CD200R, Transferrin receptor, c-Met, EGFR, HER2, KDR, PDGFRa, NRP1, 또는 MARCO에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 면역관문억제제는 항원 제시 세포(APC, antigen presenting cell)와 면역세포 예를 들어 T세포가 만나는 부위로 T세포 억제 신호를 차단하여, T 세포 활성화를 유도할 수 있는 제제를 의미한다. 상기 면역관문억제제는 예를 들어, PD-1, PD-L1, BTLA, CTLA-4, VISTA, LAG3, TIM3, CD137(4-1BB), CD258(LIGHT), TIGIT, CD134(OX40), CD28, CD278(ICOS), CD27, CD154(CD40L), CD357(GITR), CD30, DR3, CD226(DNAM1), CD96, CD200, 또는 CD200R를 타겟으로 하는 약물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 병용 투여 대상 제1성분 및 제2성분 각각은 동시에 투여될 수 있다. 또한, 상기 병용 투여 대상 제1성분 및 제2성분 각각은 일정 시간 간격을 두고 별도로 투여할 수도 있다. 상기 병용 투여 대상 중 제1성분 투여 전 또는 후 제2성분이 별도로 투여될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 파지 라이브러리(Phage library, scFv)의 준비
기존에 제작된 인간 유래 합성 scFv 라이브러리 유전자를 가진 파지미드(phagemid) 벡터를 파지(phage) 형태로 회수하기 위해 6개의 하위 라이브러리 ((1)Bai, Xuelian & Kim, Jihye & Kang, Seungmin & Kim, Wankyu & Shim, Hyunbo. (2015). A Novel Human scFv Library with Non-Combinatorial Synthetic CDR Diversity. PloS one. 10. e0141045. 10.1371/journal.pone.0141045., (2) Yang, Hye & Kang, Kyung & TCW, Julia & Shim, Hyunbo. (2009). Construction of a large synthetic human scFv library with six diversified CDRs and high functional diversity. Molecules and cells. 27. 225-35. 10.1007/s10059-009-0028-9.) 샘플을 각 400㎖의 배양배지(SB/ampicillin/2% glucose)에서 2시간 동안 배양하였다. O.D600에서 흡광도가 0.5-0.7로 되면 5000 g에서 20분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 후 400㎖의 2차 배양배지(SB/ampicillin) 내에 1012 pfu(plaque forming unit)의 helper phage(VCSM13)를 첨가하여 1시간 동안 재배양하였다. 이후 kanamycin 항생제(helper phage 내 도입된 항생제 유전자)를 70 ㎍/㎖ 농도로 첨가한 후 30℃, 250rpm에서 16시간 동안 진탕 배양하여 파지 라이브러리가 숙주세포 외로 생산될 수 있도록 하였다. 이후 배양물을 원심분리 시킨 상층액에 PEG 8000(polyethylene glycol 8000)과 NaCl을 첨가하여 4℃에서 2시간 교반하며 재조합 파지를 침전시켰다. 10000g, 4℃로 30분 동안 원심분리하여 침전된 펠렛에 PBS를 첨가하여 현탁한 다음 15000g, 4℃로 30분 원심분리하여 침전된 파지 펠렛에 PBS를 첨가하여 파지 라이브러리를 회수하였다. 증폭된 하위 라이브러리의 농도는 회수된 파지를 희석한 다음 TG1세포에 감염시켜 LB/ampicillin 고체배양배지에 배양하여 발생되는 콜로니 수로 계산하였다.
실시예 2: 바이오패닝을 이용한 항-ROR1 특이적 항체(scFv) 선별
ROR1에 특이적으로 결합하는 인간 항체를 선별을 위한 패닝을 실시하였다. ROR1-Fc, ROR1-His 단백질 및 환자 유래세포를 이용하여 다음과 같이 바이오패닝을 진행하였다. 재조합 항원은 Human ROR1 Fc protein(R&D systems, 9490-RO, Recombinant Human ROR1 Fc Chimera Protein, CF)과 human ROR1 His protein(Sino Biological, 13968-H08H, ROR1 Protein, Human, Recombinant(ECD, His Tag)을 사용하였고, 환자 유래세포는 에임드바이오에서 보유하고 있는 ROR1이 과발현되는 LC-074T를 사용하였다.
항원 고정 바이오패닝: 5~10㎍/㎖ 농도의 human ROR1 Fc protein과 negative Fc protein을 96-well 플레이트에 4℃에서 16시간동안 코팅을 하고, 3% 탈지분유(skim milk)를 이용하여 블로킹하였다. 플레이트를 비운 후 라이브러리를 (약 2.0x1013 pfu) negative Fc protein이 코팅되어 있는 플레이트에 넣고 상온에서 30분간 반응시켰다. 이는 항체 파지 라이브러리에서 human ROR1을 제외한 다른 단백질에 결합하는 파지들을 제거하여 ROR1외에 비특이적인 결합을 방지하는 단계이다. negative Fc protein에 비결합된 파지들을 회수하여 human ROR1 Fc가 코팅된 플레이트에 1시간 결합시켰다. PBST(Phosphate buffered saline-0.05% Tween 20)용액을 이용하여 5-9회 세척하여 비특이적인 결합을 제거한 후, IgG Elution Buffer(Thermo Scientific, 21028, Pierce™ IgG Elution Buffer, pH 2.0)를 이용하여 human ROR1에 특이적인 파지항체를 회수하였다. 총 3회차까지 진행되었으며, 항원 고정 바이오 패닝 결과를 표 1에 나타내었다.
비드 기반 바이오 패닝: 비오틴화된(Biotinylated) human ROR1 protein에 마그네틱 비드를 부착하여 반복 회차 비드 패닝을 실시하였다. 스트렙타비딘이 결합된 마그네틱 비드(Invitrogen, 11206D, Dynabeads™ M-280 Streptavidin)를 사용하였고, Biotinylation Kit(abcam, ab201795, Biotin Conjugation Kit(Fast, Type A) - Lightning-Link®)를 이용하여 human ROR1 protein을 비오틴화시켰다. Dynabeads™ M-280 Streptavidin 비드 100 ㎕를 magnetic bead separator를 이용하여 PBST(Phosphate buffered saline-0.1% Tween 20)용액과 PBS용액으로 세척한 후, 비오틴화된 50~100nM human ROR1 protein을 상온에서 30분 반응시켰다. 이후, 라이브러리를 약 1.0x1013 pfu 수준이 되도록 취합한 후, 3% 탈지분유(skim milk)를 이용하여 블로킹하였다. 블로킹된 라이브러리와 미리 반응된 비오틴화 human ROR1-비드 접합체를 혼합하여 2시간동안 상온에서 반응시켰다. 이후, human ROR1 비드와 결합된 라이브러리를 magnetic bead separator를 이용하여 회수하고, PBST(Phosphate buffered saline-0.1% Tween 20) 용액과 PBS용액으로 7-12회 세척한 후 IgG Elution Buffer(Thermo Scientific, 21028, Pierce™ IgG Elution Buffer, pH 2.0)를 이용하여 비오틴화 human ROR1-비드에 결합된 파지 항체를 용출하였다. 총 3회차까지 진행되었으며, 비드 기반 바이오 패닝 결과를 표 2에 나타내었다.
환자 유래세포를 이용한 바이오 패닝: 항원 고정 바이오 패닝과 비드 기반 바이오 패닝에서 얻어진 파지 항체를 Jurkat세포에 처리하여 4℃에서 1시간 결합시키고, ROR1 과발현 환자 유래 세포에는 결합하지 않는 상층액을 회수하였다. 이는 파지 항체에서 ROR1을 제외한 다른 세포 막단백질에 결합하는 파지들을 제거하여 ROR1외 비특이적인 결합을 방지하는 단계이다. 회수한 상층액을 ROR1 환자 유래 세포인 LC-074T(1.5X10^6)에 처리하여 4℃에서 1시간 결합시켰다. 이후, 환자 유래 세포에 결합하지 않은 파지들을 제거하기 위해 15㎖ 튜브(conical tube)로 옮긴 후 1,000 g에서 3분간 원심분리시켜 세포를 분리시킨 후, 차가운 PBS 3㎖을 넣어 세척 과정을 3-5회 수행하였다. 이후, IgG Elution Buffer(Thermo Scientific, 21028, Pierce™ IgG Elution Buffer, pH 2.0)를 이용하여 ice에서 10분간 두어 세포 표면에 있는 파지들을 세포 표면으로부터 분리시켰다. 그 다음, 1,000 g에서 3분간 원심분리 시켜 세포에 50㎕ lysis 버퍼를 넣고 ice에서 10분간 두어 세포를 용해시켰다. 12,000 rpm에서 5분간 원심 분리시키고 세포 찌꺼기를 분리하여 세포 안에 있는 파지 입자들이 있는 상층액과 세포 표면으로부터 분리시킨 파지들을 미리 키워 놓은 TG1이 들어있는 배양배지(SB)에 넣고, 37℃에서 120 rpm으로 1시간 동안 배양하여 파지입자들을 TG1세포에 감염시켰다. 이후 LB/ampicillin 고체배지에 도말하고, 남은 용액은 4,000 rpm으로 10분간 원심분리시켜 가라앉은 TG1을 15cm LB/ampicillin 고체배지에 도말하여 배양 후 5㎖의 SB 배양배지(50% glycerol)를 첨가하여 콜로니들을 회수 및 보관(-80℃)하였다. 이어 반복 패닝 회차를 진행하기 위해 보관된 전 회차 파지 용액 중 50㎕를 취해 파지 입자 증폭 작업을 수행하였다. 배양 후 helper phage를 첨가하여 회수된 파지입자들은 PEG 침전을 통해 분리하였고, 이를 다음 회차 패닝 때도 동일하게 사용하였다. 총 2회차까지 진행되었으며, 환자 유래세포를 이용한 바이오 패닝 결과를 표 3에 나타내었다. 환자 유래세포로 얻어진 파지 항체를 재조합 단백질로 3회차 진행되었으며, 이 결과를 표 4에 나타내었다. 회차가 거듭될수록 패닝 전 대비 후의 파지입자의 비율이 증가됨을 확인하였다.
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실시예 3: 항-ROR1 특이적 항체(scFv)의 친화도 ELISA 스크리닝 및 서열 분석
최종 회차 패닝을 통해 회수된 파지로부터 ROR1에 특이적으로 결합하는 monoclonal antibody를 선별하기 위해 scFv 스크리닝을 수행하였다. 최종 회차 패닝의 콜로니들을 취하여 200㎕ SB/ampicillin 배양배지가 담긴 96-well 플레이트에 접종 후 37℃ 2-3시간 동안 배양하였다. 이후, scFv-pⅢ 단백질 발현 유도를 위해 각 well에 최종농도 1 mM의 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 처리하고 30℃에서 밤샘 배양하였다. 배양한 플레이트는 3,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 상층액을 제거한 후 파지입자를 회수하기 위해 각 well 당 40 ㎕의 TES(50 mM Tris, 1 mM EDTA, 20% Sucrose, pH 8.0) 용액을 넣고, 상온에서 30분 동안 세포를 용해시켰다. 이후 60 ㎕의 0.2X TES 용액을 처리하여 4℃에서 2시간 동안 두어 세포를 분해시킨 다음, 플레이트를 3,000 rpm 15분간 원심분리시켜 상층액을 회수하였다.
Human ROR1, mouse ROR1, negative Fc protein이 코팅된 96-well 플레이트에 상층액을 각 해당 well에 첨가한 후 2시간 동안 상온에서 결합시킨 다음, PBST와 증류수를 이용해 4회 세척하였다. 이후, HA tag에 결합할 수 있는 HRP가 결합된 항-HA 항체를 이용해 1시간 동안 상온에서 결합시킨 후, 다시 PBST와 증류수를 이용하여 6회 세척하였다. TMB Substrate 용액(Thermo Scientific, 34029, 1-Step™ Ultra TMB-ELISA Substrate Solution)을 넣어 발색한 후 stop solution(Invitrogen, SS04, ELISA Stop Solution) 으로 발색반응을 멈추고, O.D 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. ELISA를 통해서 human ROR1 또는 mouse ROR1에 결합하는 30개 항체 클론을 선별하였으며, 상기 각 항체의 CDR 서열을 표 5, 중쇄 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 표 6에 나타내었다.
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실시예 4: 항-ROR1 특이적 항체(scFv)의 결합 도메인 분석
상기 기술된 선별된 30개 항체 클론의 scFv를 이용하여 도메인을 분석하기 위해 ELISA를 수행하였다. 상기 결합 도메인 분석을 위한 항원으로 도메인을 발현할 수 있는 발현 벡터를 제작 및 단백질을 발현, 정제하였다. 제조를 위해 UniProt ID: Q01973로 표시되는 ROR1 아미노산 서열의 1번 ~ 542번 또는 서열 165번~395번 아미노산에 해당하는 잔기를 이용하였다. ROR1의 세포외 도메인을 코딩하는 유전자 블럭을 제작하였다. 유전자의 3' 말단에는 His tag으로 접합되도록 하였다. 상기 유전자를 pcDNA3.3 벡터에 도입하여 벡터를 확보하였다. 형질 감염(transient transfection)을 이용하여 단백질을 발현 및 정제하였다. 8% CO2, 37℃, 130 rpm에서5일 동안 배양 후 세포 배양 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 배양액을 컬럼(GE healthcare, 17-5438-01, MabSelect™ SuRe)에 통과하여 발현된 항체가 컬럼에 결합하도록 하였다. 이 후, IgG Elution Buffer(Thermo Scientific, 21028, Pierce™ IgG Elution Buffer, pH 2.0)용액으로 용출시킨 후, 용출된 항체 분획은 Amicon Ultra 30kDa tube(Merck Millipore, UFC903024, Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Unit)를 사용하여 PBS(pH7.4)로 완충액을 교환하며 농축을 진행하였다. 정제된 도메인은 280nm 파장에서 흡광도와 흡광계수를 이용하여 정량하였다.
human ROR1의 면역글로불린-도메인(Human ROR1-Immunoglobulin domain, Acrobiosystems, RO1-H5221, Human / Cynomolgus / Rhesus macaque ROR1(39-151, Ig-like domain) Protein, His Tag), human ROR1의 프리즐드 도메인(human ROR1-Frizzled domain, Acrobiosystems, RO1-H5222, Human / Cynomolgus / Rhesus macaque ROR1(165-305, Frizzled domain) Protein, His Tag), human ROR1의 크링글 도메인(human ROR1-Krigle, Acrobiosystems, RO1-H5223, Human / Cynomolgus / Rhesus macaque ROR1(308-395, Kringle domain) Protein, His Tag), human ROR1의 면역글로불린 및 프리즐드 도메인(human ROR1- Immunoglobulin-Frizzled domain), human ROR1의 프리즐드 및 크링글 도메인(human ROR1-Frizzled-Kringle domain)을 각각96-well 플레이트에 2 ug/mL의 농도로 4℃에서 16시간동안 코팅하고, 3% 탈지분유(skim milk)를 이용하여 블로킹하였다. 이후 각 scFv를 처리하여 2시간 동안 반응시키고, PBST와 증류수를 이용해 4회 세척하였다. 이후, HA tag에 결합할 수 있는 HRP가 결합된 항-HA 항체(Roche, 12013819001, Anti-HA-Peroxidase, High Affinity)를 이용해 1시간 동안 상온에서 결합시킨 후, 다시 PBST와 증류수를 이용하여 6회 세척하였다. TMB Substrate 용액(Thermo Scientific, 34029, 1-Step™ Ultra TMB-ELISA Substrate Solution)을 넣어 발색한 후 stop solution(Invitrogen, SS04, ELISA Stop Solution)으로 발색반응을 멈추고, O.D 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. ELISA를 통해서 각 도메인에 결합하는 scFv를 분석하였다. 각 클론에 따라 에피토프 도메인과 결합특성이 달리 분석되었으며, 도 1과 같이 분석되었다.
실시예 5: 항-ROR1 항체의 포유동물 세포 발현 및 정제
실시예에서 확보한 각 클론을 완전한 이뮤노글로불린(IgG) 형태의 단일클론항체 형태로 생산하기 위해 클로닝과 생산을 수행하였다. 중쇄 발현벡터를 구축하기 위해 중쇄가변영역과 불변영역을 포함하는 중쇄를 코딩하는 DNA를 각각pOptivec 벡터에 클로닝하였다. 또한 경쇄를 발현하는 벡터를 구축하기 위해 경쇄가변영역과 경쇄불변영역을 포함하는 경쇄를 코딩하는 DNA를 pcDNA3.3벡터에 클로닝하였다.
상기 경쇄, 중쇄 발현 벡터를 일시적 트랜스펙션(transient transfection)을 이용하여 단백질을 발현 및 정제하였다. Expi293 Expression 배지(Gibco, A1435101, Expi293™ Expression Medium)에서 부유 성장하는 Expi293F suspension세포(Gibco, A14527, Expi293F™ Cells)를 플라스미드 및 Opti-MEMⅠ(Gibco, 31985070, Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium), ExpiFectamine293(Gibco, 100014995, ExpiFectamine™293)의 혼합물로 트랜스펙션하였다. 8% CO2, 37℃, 130 rpm에서5일 동안 배양 후 세포 배양 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 배양액을 컬럼(GE healthcare, 17-5438-01, MabSelect™ SuRe)에 통과하여 발현된 항체가 컬럼에 결합하도록 하였다. 이 후, IgG Elution Buffer(Thermo Scientific, 21028, Pierce™ IgG Elution Buffer, pH 2.0)용액으로 용출시킨 후, 용출된 항체 분획은 Amicon Ultra 30kDa tube(Merck Millipore, UFC903024, Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter Unit)를 사용하여 PBS(pH7.4)로 완충액을 교환하며 농축을 진행하였다. 정제된 항-ROR1 항체는 280nm 파장에서 흡광도와 흡광계수를 이용하여 정량하였다.
실시예 6: 항-ROR1 항체에 대한 생물 물리적 특성 개선 엔지니어링
상기 실시예에서 확보한 항체의 원치 않는 PTM site 제거를 위해 항체 최적화를 진행하였다. 상기 in vitro 실험 결과에서 우수한 효능을 보인 P015042v1 항체 서열을 기반으로 최적화를 진행하였다. 항체 서열 중 원치 않는 PTM으로 인해 생산과정 및 생산 후의 stressed condition에서 deamidation 및 isomerization이 발생할 우려가 있는 서열을 찾았다: HC 55G, LC S51, 그리고 LC G95A. 기존의 논문에서 알려진 바에 따르면 deamidation과 isomerzation의 우려가 있는 서열 중 N 혹은 D를 치환하는 것이 항체의 친화력을 상당히 손상시킨다고 한다(Patel, C. N., Bauer, S. P., Davies, J., Durbin, J. D., Shiyanova, T. L., Zhang, K., & Tang, J. X. (2016). N+1 engineering of an aspartate isomerization hotspot in the complementarity-determining region of a monoclonal antibody. Journal of Pharmaceutical Sciences, 105(2), 512-518. https://doi.org/10.1016/s0022-3549(15)00185-9). 그러므로 서열 중 N 혹은 D 이후에 오는 서열을 치환하여 최적화를 진행하였다.
Rational design을 통하여 위의 언급된 서열을 각각 치환하여 항체의 친화력을 측정하였다. 먼저 HC G55를 V(P015042v1-1)와 K(P015042v1-2)로 치환하였다. 그리고 LC S51를 A(P015042v1-3)와 K(P015042v1-4)로 치환하였고 LC G95를 A(P015042v1-5)로 치환하였다. 새로운 variant들(P015042v1-1 내지 P015042v1-5)을 생산하여 친화력을 측정한 결과, HC G55 서열은 K로, LC S51과 LC G95는 각각 K와 A로 치환하는 것이 가장 좋은 것으로 판단하였다. 그러므로 이 세 가지의 서열 변형을 모두 가지고 있는 P015042v1-6를 제작하였다.
각 변형 항체의 CDR 및 중쇄, 경쇄 가변영역 서열을 표 7 및 표 8에 나타내었다.
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실시예 7: 항-ROR1 항체의 ROR1 특이적 결합능 분석(ELISA)
상기 실시예에서 선별된 각 클론의 IgG 항체를 이용하여 항원에 대한 특이적 결합능을 분석하기 위해 ELISA를 수행하였다.
Human ROR1, mouse ROR1 protein을 각각 96-well 플레이트에 2 μg/mL의 농도로 4℃에서 16시간동안 코팅하고, 3% 탈지분유(skim milk)를 이용하여 블로킹하였다. 이후 각 항체를 300nM, 60nM, 12nM, 2.4nM, 0.48nM, 0.096nM, 0.0192nM 농도로 처리하여 1시간 동안 반응시켰다. PBST와 증류수를 이용해 세척한 후, 염소유래 HRP가 접합된 항-인간 항체(Invitrogen, 31482, Goat anti-Human IgG F(ab')2 Secondary Antibody, HRP)를 이용해 1시간 동안 상온에서 결합시킨 후, 다시 PBST와 증류수를 이용하여 세척하였다. TMB Substrate 용액(Thermo Scientific, 34029, 1-Step™ Ultra TMB-ELISA Substrate Solution)을 넣어 발색한 후 stop solution(Invitrogen, SS04, ELISA Stop Solution)으로 발색반응을 멈추고, O.D 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 본원의 항-ROR1 항체와 이의 생물, 물리적 특성이 개선된 변형 항체는 human ROR1과 mouse ROR1에 교차 결합함을 확인하였다(도 2).
실시예 8: 항-ROR1 항체의 ROR1 특이적 결합능 분석(SPR)
ROR1에 대한 항-ROR1 항체의 결합력을 더 정량적으로 분석하기 위하여 SPR(Surface plasmon resonance)을 수행하였다. Biacore 3000 기기(GE healthcare)를 이용하였다.
아민 커플링 방식을 이용하여, human ROR1 또는 mouse ROR1을 10 mM Sodium acetate, pH 4.5에 희석하여 CM5 센서칩(GE healthcare)에 300 response units(RU) 고정화하였다. 센서칩 표면에 남아있는 활성화 부분은 1 M ethanolamine-HCl(pH 8.5)을 첨가하여 비활성화시켰다. CM5 센서칩에 고정화된 항체 단백질에 본원의 항-ROR1 항체를 300, 150, 75, 37.5, 18.75, 9.375, 4.6875 nM의 농도로 180초 동안 주입하였으며(Ka), 그 다음 180초 동안은 동일한 유속으로 분리 단계(Kd)를 통해, KD 결합 센서그램을 조사하였다. 그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 항-ROR1 항체는 human ROR1과 mouse ROR1에 특이적으로 결합하는 센서그램을 보여주었고, Ka와 Kd 값을 통한 최종적인 KD 값을 (1:1 Langmuir 1:1 kinetics) 표 9 및 표 10에 나타내었다.
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실시예 9: 항-ROR1 항체의 ROR1 도메인 맵핑
상기 선별된 클론의 IgG 항체를 이용하여 결합 도메인을 분석하기 위해 ELISA를 수행하였다.
human ROR1의 면역글로불린-도메인(Human ROR1-Immunoglobulin domain, Acrobiosystems, RO1-H5221, Human / Cynomolgus / Rhesus macaque ROR1(39-151, Ig-like domain) Protein, His Tag), human ROR1의 프리즐드 도메인(human ROR1-Frizzled domain, Acrobiosystems, RO1-H5222, Human / Cynomolgus / Rhesus macaque ROR1(165-305, Frizzled domain) Protein, His Tag), human ROR1의 크링글 도메인(human ROR1-Krigle, Acrobiosystems, RO1-H5223, Human / Cynomolgus / Rhesus macaque ROR1(308-395, Kringle domain) Protein, His Tag), human ROR1의 면역글로불린 및 프리즐드 도메인(human ROR1- Immunoglobulin-Frizzled domain), human ROR1의 프리즐드 및 크링글 도메인(human ROR1-Frizzled-Kringle domain)을 각각 96-well 플레이트에 2 μg/mL의 농도로 4℃에서 16시간동안 코팅하고, 3% 탈지분유(skim milk)를 이용하여 블로킹하였다. 이후 각 항체를 300nM, 60nM, 12nM, 2.4nM, 0.48nM, 0.096nM, 0.0192nM 농도로 처리하여 1시간 동안 반응시켰다. PBST와 증류수를 이용해 세척한 후, 염소유래 HRP가 접합된 항-인간 항체(Invitrogen, 31482, Goat anti-Human IgG F(ab')2 Secondary Antibody, HRP)를 이용해 1시간 동안 상온에서 결합시킨 후, 다시 PBST와 증류수를 이용하여 세척하였다. TMB Substrate 용액(Thermo Scientific, 34029, 1-Step™ Ultra TMB-ELISA Substrate Solution)을 넣어 발색한 후 stop solution(Invitrogen, SS04, ELISA Stop Solution) 으로 발색반응을 멈추고, O.D 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. ELISA를 통해서 각 도메인에 결합하는 항-ROR1항체 클론을 분석하였다(도 3).
실시예 10: 세포 종류별 ROR1 수용체 발현도 정량분석
T-47D, Jeko-1(이상 세포주), AMB-BT-0024T, AMB-BT-0016T, AMB-BT-0013T, AMB-LC-0002T, AMB-LC-0003T, KUC-OC21-025T(이상 환자유래세포)를 각각 이중으로 2 x 105 세포씩 96웰 플레이트에 분주했다. Mouse IgG1-PE isotype(Invitrogen, 12-4714-82)와 ROR1-2A2-PE(Biolegend, 357804)를 각각 웰 당 100 nM씩 분주한다. 30분 동안 4℃에서 인큐베이션 하고, 도중에 Quantibrite PE beads(BD, 340495)를 0.5 mL PBS에 넣어서 BD FACSAria Flow Cytometer로 유세포분석을 진행한다. Beads로 ROR1 발현도 기준점을 잡고, 마우스 isotype과 ROR1-2A2-PE 항체처리를 한 세포들에서 나온 ROR1 발현량을 bead 대비 분석을 하면서 세포 별 발현하는 ROR1 수용체 수를 정량화 하였다.
인간 림프종 세포주인 Jeko-1이 높은 ROR1 발현도를 보였으며, 환자 유래세포(PDXC)에서는 폐암유래세포인 AMB-LC-0003T에서 제일 높은 ROR1 발현도를 보였다(도 4).
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실시예 11: 항-ROR1 항체들의 세포 표면 발현 ROR1에 대한 특이적 결합능 측정
항-ROR1 항체들이 치료용으로 쓰이기 전에, 먼저 세포 표면에 발현하는 항원과 결합하는지 확인하는 것은 매우 중요하다. ROR1 발현이 높게 확인된 Jeko-1 세포주와 AMB-LC-0003T 환자유래세포에서 본 발명자들이 개발한 항-ROR1 항체들의 세포 결합능을 FACS를 이용하여 측정하였다. 각 세포를 96 웰 플레이트에 각 웰당 1 x 105 cells/100 μl FACS 완충용액으로 맞춰서 분주 하였다.
항-ROR1 후보 항체 P015004, P015042, P015043, P015044 및 생물, 물리학적 특성을 개선을 통해 확보한 P015042v1, 그리고 이의 변형 물질 중 하나인 P015042v1-6으로 세포 결합능 분석을 진행하였으며, 각 항체를 100nM 부터 10배씩 희석하여 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM, 1 pM까지 세포들에 처리하였다. 이를 4℃에 30분간 반응시키고 난 후에는 2회 세척하였다. PE 표지된 Goat anti-human IgG Fc PE(Thermofisher; 12-4998-82)는 이차항체로써 FACS용 완충 용액에 1:100 비율로 희석하고, 각 웰에 100 μl씩 분주 하였다. 다시 한번 4℃에 30분간 반응시키고, 2회 세척하였다. 마지막으로 각 웰당 100 μl FACS용 완충 용액을 분주하여 피펫으로 잘 섞어준 다음에 NovoCyte Flow Cytometer(Agilent)를 이용하여 유세포분석을 진행하였다. GraphPad Prism 9.3.1을 사용하여 분석하였으며, log(agonist) vs. response - Variable slope 비선형그래프 모델을 사용하여 EC50 값을 도출해냈다.
세포 결합능 결과를 보면 ROR1 발현도가 제일 높았던 AMB-LC-0003T 환자유래세포에서 Jeko-1 세포주보다 더 높은 MFI(Mean Fluorescence Intensity)를 보였다. 두 세포종에서 모두 나노몰 이하의 EC50를 보인 항체로는 P015042와 이의 서열을 추가로 변형 시킨 P015042v1, P015042v1-6이 있으며, P015044 역시 나노몰 수준의 EC50값을 보였다. 그 외의 항-ROR1 클론들인 P015004, P015043도 < 10 nM 수준의 EC50를 보여서 모두 좋은 세포 결합능을 보였다(도 5 및 도 6).
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실시예 12: 항-ROR1 항체들의 세포내재화 분석
항체-약물 접합체로 개발하기 위해서는 항-ROR1 항체가 세포에 있는 ROR1 항원들과 결합하는 뿐만 아니라, 세포내재화를 해야 접합체의 약물이 세포 안에 침투하여 반응을 일으킨다. 이를 분석하기 위해 다양한 시점에서 세포 표면에 남아있는 ROR1 항원을 검출하므로 내재화를 확인하였다. Jeko-1 세포를 이중으로 웰당 1 x 105 cells/100 μl에 분주하였으며, 각 시점별로 플레이트를 준비하였다: 세포내재화 시작 0분, 10분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간 후 항체에 의해 내재화 되지 않고 세포 표면에 남은 ROR1 수용체를 확인했다. 세포들을 각 항체로 1 nM씩 처리한 후에, 30분동안 4℃에서 반응시켰다. 1100g에서 2분간 원심분리를 하여 두 번 세척해주고, 0분째 플레이트를 제외한 나머지 플레이트는 100 μl FACS용 완충 용액에 세포를 섞어주고 37℃, 5% CO2 에서 반응시켰다. 0분째 플레이트는 바로 Goat anti-human IgG Fc PE(Thermofisher, 12-4998-82)를 1:100 비율로 희석하여 웰당 100 μl씩 분주해서 30분가량 4℃에서 반응시켰다. 두 번 세척해 준 후에 Novocyte Flow Cytometer(Agilent)를 사용해서 유세포분석을 진행했고, 다른 플레이트도 시간이 되면 같은 방식으로 하여 Jeko-1 세포에 남아있는 ROR1 발현을 확인했다. 0분째 확인된 ROR1 발현도를 기준으로 값들을 표준화했으며, GraphPad Prism 9.3.1에 있는 [Inhibitor] vs. normalized response - Variable slope 비선형그래프 모델을 사용하여 분석했다.
각 항체 클론별로 다르게 세포내재화 하는 것을 보였으며, 대부분의 항체들은 4시간 후에도 지속적으로 항체가 내재화 되는 것을 확인할 수 있었다. P015042 항체의 생물, 물리적 특성을 개선시켜 엔지니어링한 P015042v1-6은 세포내재화가 제일 잘되었던 머크의 UC-961 항체와 유사한 수준을 보였다(도 7).
실시예 13: 항-ROR1 항체-약물 접합체의 제조
본 발명의 항체 약물 접합체 또는 이의 생성 중간체의 일반적 생성 방법에 대해 설명한다. 각 반응식에 포함된 화합물의 명칭과 대체기호를 기재하여 설명한다(도 8).
티오에테르를 통해 항체 (Y)와 약물-링커 (LP) 구조가 연결되는, 식 (1)으로 나타내는 항체-약물 접합체는, 예를 들어 하기 방법에 의해 생성될 수 있다.
[식 (1)]
X (1) + LP (2) → X-LP (3)
예시에 사용된 약물-링커 (LP)는 maleimidocaproyl-valine-citruline-p-aminobenzyloxycabonyl monomethylauristatin E(vc-PAB-MMAE; CCC(C)C(C(CC(=O)N1CCCC1C(C(C)C(=O)NC(C)C(C2=CC=CC=C2)O)OC)OC)N(C)C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)OCC3=CC=C(C=C3)NC(=O)C(CCCNC(=O)N)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)CCCCCN4C(=O)C=CC4=O) 이며, X는 술프히드릴기를 갖는 IgG1 형태의 단일 클론 항체이다.
LP의 말레이미딜기와 X의 술프히드릴기 간의 반응을 통해 항체-약물 접합체를 생성할 수 있다.
술프히드릴기를 가진 항체 (X)는 후술한 방법에 따라 수득할 수 있다. 항체를 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드(TCEP)와 같은 환원제와 반응시켜 항체 내 힌지 부분의 디술피드 결합을 환원시켜 술프히드릴기를 형성시킬 수 있다.
구체적으로, 항체 내부의 디술피드 당 환원제로서 2 내지 20 몰 당량의 5mM TCEP을 사용하고, 대표적인 킬레이트제인 5mM Ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)를 포함하는 완충액에서 항체 (Y)와 반응시켜 항체 내부의 디술피드가 부분적으로 혹은 완전히 환원된 술프히드릴기를 지닌 항체 (X)를 생성할 수 있다. 상술된 항체 내 디술피드 환원 반응은 37°C에서 2시간 동안 진행되었다. 해당 예시에서 사용된 완충액은 항체 생성 시에 동일하게 사용된 식염수를 포함한 인산완충용액(pH 7.4)이다. 상술된 항체 내 디술피드 환원 반응은 37°C에서 2 시간 동안 진행되었다.
반응이 끝난 후에 남아 있는 TCEP 및 EDTA와 같은 불순물을 제거하기 위해 Amicon Ultra(30kDa, Millipore Co.) 용기 내에 술프히드릴기를 갖는 항체 (X) 용액을 첨가하고, 원심분리기(Eppendorf centrifuge 5810 R)를 사용하여 원심분리(3950G에서 10 내지 20분 동안 원심부분리)하여 식염수를 포함한 인산완충용액(pH 7.4)으로 완충액 교환을 진행하였다. 해당 과정은 총 3회 반복되었다.
완충액 교환을 통해 불순물을 제거한 술프히드릴기를 갖는 항체 (X)를 Amicon Ultra(30kDa, Millipore Co.) 용기에서 회수하여 5 내지 15 몰 당량의 10mM 약물-링커 (LP)와 상온에서 2시간 동안 반응시킨다. 약물-링커 (LP)가 빛에 의해 변형이 될 수 있기에 본 반응은 암막상태로 진행되었다. 화합물의 용해도를 높이기 위하여 약물-링커 (LP)를 대표적 유기용매인 디메틸아세트아미드(DMA)에 용해시켰다. 술프히드릴기를 지닌 항체 (X)를 포함한 완충액에 10 내지 20% v/v 정도의 DMA를 첨가하였다.
항체-약물 접합반응은, 미반응한 약물-링커 (LP)의 반응성을 티올-함유 시약으로 불활성화시켜 종료 시킬 수 있다. 본 예시에 사용된 티올-함유 시약은 N-아세틸-L-시스테인(NAC)이다. 구체적으로, 항체-약물 접합 반응액에 5 몰 당량의 NAC를 첨가하고, 실온에서 30 분 동안 보관함으로써 반응을 종료하였다.
잔존하는 약물-링커 및 NAC를 제거하기 위해 Amicon Ultra(30kDa, Millipore Co.) 용기 내에 항체-약물 반응액을 첨가하고, 원심분리기(Eppendorf centrifuge 5810 R)를 사용하여 원심분리(3950G에서 10 내지 20분 동안 원심부분리) 하여 식염수를 포함한 인산완충용액(pH 7.4)으로 완충액 교환을 진행하였다. 해당 과정은 총 3회 반복되었다. 최종적으로, 항체-약물 접합체를 Amicon Ultra(30kDa, Millipore Co.) 용기의 여과막으로부터 회수하였다.
실시예 14: 항-ROR1 항체-약물 접합체 농도 분석
항체-약물 접합체에 있어서의 항체 농도는 분광광도계(Thermofisher Scientific NanoDrop 8000)를 사용하여 측정하였다.
실시예 15: 항-ROR1 항체-약물 접합체의 순도 분석
항체-약물 접합체의 순도는 하기에 서술된 방법을 차용하는 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC) 분석을 통해 측정하였다. 항체-약물 접합체 시료의 전처리는 농도 0.5 mg/ml, 총량은 25 μL로 맞춰 준비한다. SEC-HPLC 분석은 하기 조건에 따라 실시한다.
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항체-약물 접합체 크로마토그램에 나타나는 각 피크의 유지 시간을 사이즈 마커(Gel filtration standard, Bio-Rad, 1511901)의 각 피크 별 유지 시간과 비교 및 대조하여 항체-약물 접합체의 순도를 측정하였다. 크기 배제 크로마토그래피는 사이즈가 큰 분자가 먼저 검출됨으로, 항체 피크(150 kDa) 기준으로 먼저 나오는 피크는 약물의 소수성에 의해 생성될 수 있는 고분자 응집체이고, 이후에 나오는 피크는 접합되었다가 떨어져 나간 약물로 분석하였다. 항체-약물 접합체 자체의 순도는 전체 크로마토그램에서 150kDa에 해당하는 피크의 면적을 백분율로 환산하여 계산하였다.
실시예 16: 항-ROR1 항체-약물 접합체의 항체 분자 당 약물 분자 평균 접합수 분석(DAR분석)
항체-약물 접합체의 항체 분자 당 약물 분자 평균 접합수(Drug-to-Antibody Ratio, DAR)는 하기에 서술된 방법을 차용하는 소수성 상호작용 고성능 액체 크로마토그래피(HIC-HPLC) 분석을 통해 측정하였다. HIC-HPLC 분석을 위한 전처리로서 분석에 사용할 항체-약물 접합체 시료의 농도는 0.5 mg/ml, 총량은 30 μL로 맞춰 준비한다. HIC-HPLC 분석은 하기 조건에 따라 실시하였다.
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Figure PCTKR2023010847-appb-img-000023
약물 미접합 동일 항체와 비교하여 항체-약물 접합체는 접합된 약물 분자의 수에 비례하여 더 높은 소수성을 띄게 되며, 따라서 더 긴 유지 시간을 갖게 된다. 항체 내부에는 총 4 개의 디술피드 결합이 존재하고, 각 디술피드 결합 당 2 개의 약물이 접합될 수 있다. 따라서 항체-약물 접합체의 HIC-HPLC 크로마토그램에서 최대 5개의 피크(DAR 0, DAR 2, DAR 4, DAR 6, DAR 8)를 관찰할 수 있다. 약물 미접합 항체(DAR 0)의 유지 시간 대비 순차적으로 나타나는 피크에 대해서는 앞서 서술한 DAR 2, DAR 4, DAR 6, DAR 8의 순으로 지정하였다. 이를 통해 각 피크에 대한 DAR 배정이 완료되면, 하기 수식에 따라 항체 분자 당 약물 분자 평균 접합수를 계산하였다.
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실시예 17: 항-ROR1 항체-약물 접합체의 항원 결합능 분석
항체-약물 접합체의 친화도 분석은 모항체와의 동등성을 평가함과 동시에, 술프히드릴기를 가지는 항체를 생성시키기 위한 디술피드 결합 환원 및 약물-링커 접합 등의 제조 과정으로부터 야기될 수 있는 잠재적 친화도 훼손 여부를 판단하기 위함이다. 해당 분석은 하기 서술된 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 통해 진행되었다.
2 μg/ml 인간 및 마우스 유래 ROR1 항원(Sino Biological)을 96 웰 플레이트(Costar 3590, Corning) 에 각 웰당 50 μL를 분주하여 코팅한다. 코팅된 ROR1 항원을 털어버린 후에 3% 스킴 밀크로 코팅된 각 웰에 200 μL씩 분주하여 블로킹한다. 1시간 이후 3% 스킴 밀크를 털어버린 후에 모항체와 항체-약물 접합체를 최고 농도 300 nM로부터 1/5배씩 7번의 연속 희석을 시켜 지정된 웰에 50 μL 만큼 분주한다. 1차 항원-항체 결합을 1시간 동안 진행한 이후, 0.05% v/v 계면활성제(PBST)와 증류수로 플레이트를 씻어준다(각 3회씩). 이후 1:3000 비율로 Fab-HRP를 3% 스킴 밀크에 희석시켜 각 웰에 50 μL 만큼 분주한다. 1 시간 동안 2차 결합 반응을 진행시킨 이후, 0.05% PBST 와 3차 증류수로 플레이트를 씻어준다(각 3회씩). 플레이트에 남은 물기를 제거한 후에 TMB(34029, Thermofisher)를 각 웰에 50 μL 만큼 분주하고 3 내지 5분 동안 반응시킨다. 최종적으로, 반응을 종료시키기 위하여 Stop solution(SS04, Thermofisher)을 각 웰에 50 μL 만큼 분주한다.
Figure PCTKR2023010847-appb-img-000025
항체-약물 접합체의 항원 결합력이 단일클론항체 대비 80% 이상이면 항체-약물 접합체의 항원 결합능이 유사하다고 판단하였다.
위와 같이 생성된 항-ROR1 항체-약물 접합체 3 종(P015004-vc-PAB-MMAE, P015042-vc-PAB-MMAE, P015044-vc-PAB-MMAE)을 상기 명시된 항체-약물 접합체 분석 및 QC 방법에 따라 평가한 결과를 아래 표 18과 같이 정리한다.
Figure PCTKR2023010847-appb-img-000026
도 9에 본 발명의 실시예에서 사용된 항체-약물 접합체의 순도 분석 결과, 도 10에 본 발명의 실시예에서 사용된 항체-약물 접합체의 항체 분자 당 약물 분자 평균 접합수 분석 결과 및 도 11에 본 발명의 실시예에서 사용된 항체-약물 접합체의 ROR1 결합에 대한 ELISA 분석 결과를 나타내었다.
실시예 18: 항-ROR1 항체-약물 접합체의 시험관 내(in vitro) 세포 독성 평가
ROR1 발현도가 높은 폐암 환자유래세포로 알려진 AMB-LC-0003T와 ROR1 발현이 매우 낮은 AMB-LC-0002T에서 상기 언급된 항-ROR1 후보 항체-약물 접합체를 항암 약물로써의 독성 평가를 진행하였다.
각 Ultra-low attachment, U bottom 384웰 투명 플레이트(S-bio, #MS-9384UZ)에 폐암환자 유래세포인 AMB-LC-0003T와 AMB-LC-0002T 세포를 웰 당 500개씩 40 μl M10018(Aimedbio) 미디어에 삼중으로 분주한다. 250g에 2분동안 원심 분리를 시킨 후에, 37℃, 5% CO2 조건으로 24시간 동안 반응시켰다. 반응 이후에 각 항체-약물 접합체를 500 nM부터 3배씩 희석하여 0.314 pM까지 처리하였다. 플레이트를 다시 37℃, 5% CO2 조건에서 6일동안 반응시켰다.
총 7일간의 반응 후, 세포들이 384웰 플레이트에서 스페로이드를 형성하므로, 고함량 스크리닝 방식인 Operetta CLS(PerkinElmer) 장비를 이용해 각 웰에 있는 스페로이드 이미지를 캡쳐하였다. 각 웰에 있는 세포들의 스페로이드 형태를 유지하기 위해서, 분석하기 전에 세척은 하지 않는다. 캡쳐된 이미지는 추가 분석을 통하여 부피로 환산하였으며, 제일 낮은 농도의 약물이 처리된 스페로이드를 기준으로 하여, 농도 별 스페로이드 부피 값을 표준화시켰다. GraphPad Prism 9.3.1를 이용해서 log(inhibitor) vs normalized response - Variable slope로 그래프를 만들고, IC50 값을 도출해냈다(도 12).
Figure PCTKR2023010847-appb-img-000027
Figure PCTKR2023010847-appb-img-000028
상기 서술된 P015042-vc-PAB-MMAE 항체-약물 접합체는 ROR1 발현이 높은 AMB-LC-0003T에서 우월한 IC50(2.30 nM) 값을 보이고, ROR1 발현이 낮은 환자유래세포인 AMB-LC-0002T에서는 100 nM 이상의 IC50 값을 가지면서, ROR1 특이적인 효과만 보이는 것을 확인하였다. 미국 특허 US 10,335,496 B2의 항체-약물 접합체인 UC961-vc-PAB-MMAE와 비교했을 때, 약 8배 relative potency를 보이면서 항체-약물 접합체로써의 ROR1 특이적인 항암 효능을 기대할 수 있게끔 해주었다(도 13).
본 발명에 따른 항-ROR1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 기존의 항-ROR1 항체보다 ROR1에 대한 우수한 결합력을 나타내며, 목적하는 종양 또는 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (24)

  1. 다음을 포함하는 ROR 1(Receptor Tyrosine Kinase Like Orphan Receptor 1)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    서열번호 1 내지 서열번호 16으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
    서열번호 17 내지 서열번호 41, 서열번호 184 및 서열번호 185로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2,
    서열번호 42 내지 서열번호 65로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3,
    서열번호 66 내지 서열번호 86으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
    서열번호 87 내지 서열번호 102, 서열번호 186 및 서열번호 187로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및
    서열번호 103 내지 서열번호 121로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 122 내지 서열번호 152 및 서열번호 188 내지 서열번호 193으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 153 내지 서열번호 183 및 서열번호 194 내지 서열번호 199로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 단쇄 Fvs(scFv), 단쇄 항체, Fab, F(ab'), 다이설파이드-결합 Fvs(sdFv)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제4항에 있어서, 상기 scFv는 서열번호 122 내지 서열번호 152 및 서열번호 188 내지 서열번호 193으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 153 내지 서열번호 183 및 서열번호 194 내지 서열번호 199로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역이 링커를 통해 연결된 것을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제5항에 있어서, 상기 링커는 (GnS)m (n, m은 각각 1 내지 10)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산.
  8. 제7항의 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터.
  9. 제8항의 재조합 발현벡터로 형질감염된 숙주세포.
  10. 제9항에 있어서, COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080인 숙주세포.
  11. 제9항의 숙주세포를 배양하여 항체를 생성하는 단계; 및 생성된 항체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, ROR1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 항체.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체의 scFv 및 면역세포 활성화 항원에 결합하는 항체의 scFv를 하나 이상 포함하는 제2결합 도메인으로 구성된 scFv를 포함하는, 면역세포 인게이징(immune cell engage) 이중특이적 또는 다중특이적 항체.
  14. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 약물에 결합된 항체-약물 접합체(ADC).
  15. 제14항에 있어서, 상기 약물은 마이탄시노이드, 오리스타틴(MMAE, MMAF 포함), 아미노프테린, 악티노마이신, 블레오마이신, 탈리소마이신, 캄프토쎄신, N8-아세틸 스퍼미딘, 1-(2 클로로에틸)-1,2-다이메틸 술포닐 하이드라자이드, 에스퍼라마이신, 에토포사이드, 6-머캅토퓨린, 돌라스타틴, 트리코테센, 칼리케아미신, 탁솔(taxol), 탁산, 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 A, 미토마이신 C, 클로람부실, 듀오카마이신, L-아스파라기나제(L-asparaginase), 머캡토퓨린(mercaptopurine), 티오구아닌(thioguanine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 시타라빈(cytarabine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 니트로소우레아(nitrosourea), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 미토마이신(mitomycin), 다카바진(dacarbazine), 프로카바진(procarbazine), 토포테칸(topotecan), 질소 머스터드(nitrogen mustard), 사이톡산(cytoxan), 에토포시드(etoposide), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), CNU(bischloroethylnitrosourea), 이리노테칸(irinotecan), 캄포토테신(camptothecin), 블레오마이신(bleomycin), 이다루비신(idarubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 닥티노마이신(dactinomycin), 플리카마이신(plicamycin), 미톡산트론(mitoxantrone), 아스파라기나제(asparaginase), 비노렐빈(vinorelbine), 클로로람부실(chlorambucil), 멜파란(melphalan), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 부설판(busuLfan), 트레오설판(treosulfan), 데카바진(decarbazine), 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 토포테칸(topotecan), 9-아미노캠프토테신(9-aminocamptothecin), 크리스나톨(crisnatol), 미토마이신 C(mitomycin C), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 티아조퓨린(tiazofurin), 리바비린(ribavirin), EICAR(5-ethynyl-1-beta-Dribofuranosylimidazole-4-carboxamide), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 데프록사민(deferoxamine), 플룩수리딘(floxuridine), 독시플루리딘(doxifluridine), 랄티트렉세드(raltitrexed), 시타라빈(cytarabine(ara C)), 시토신 아라비노시드(cytosine arabinoside), 플루다라빈(fludarabine), 타목시펜(tamoxifen), 라록시펜(raloxifene), 메게스트롤(megestrol), 고세렐린(goserelin), 류프롤리드 아세테이트(leuprolide acetate), 플루타미드(flutamide), 바이칼루타마이드(bicalutamide), EB1089, CB1093, KH1060, 베르테포르핀(verteporfin), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 광감작제 Pe4(photosensitizer Pe4), 데메톡시-하이포크레린 A(demethoxy-hypocrellin A), 인터페론-α(Interferon-α), 인터페론-γ(Interferon-γ), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor), 겜사이타빈(Gemcitabine), 벨케이드(velcade), 레발미드(revamid), 탈라미드(thalamid), 로바스타틴(lovastatin), 1-메틸-4-페닐피리디늄 이온(1-methyl-4-phenylpyridiniumion), 스타우로스포린(staurosporine), 악티노마이신 D(actinomycin D), 닥티노마이신(dactinomycin), 블레오마이신 A2(bleomycin A2), 블레오마이신 B2(bleomycinB2), 페플로마이신(peplomycin), 에피루비신(epirubicin), 피라루비신(pirarubicin), 조루비신(zorubicin), 마이토산트론(mitoxantrone), 베라파밀(verapamil) 및 탑시가르긴(thapsigargin), 핵산 분해 효소 및 세균이나 동식물 유래의 독소로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체.
  16. 제14항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 약물과 링커를 통하여 결합되는 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 링커는 절단성 링커 또는 비절단성 링커인 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 절단성 링커는 산성 불안정 링커(acid-labile linker), 이황화 링커, 펩타이드 링커, 또는 베타-글루쿠로나이드(beta-glucuronide) 링커이고, 또는 상기 비절단성 링커는 티오에테르기 또는 말레이미도카프로일기를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체.
  19. 제16항에 있어서, 상기 링커는 항체의 이황화 결합 환원시 노출되는 시스테인 잔기 또는 항체에 결합된 태그에 존재하는 시스테인 잔기에 결합되는 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체.
  20. 항원 결합 부위를 포함하는 세포외 도메인, 트랜스멤브레인 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)로, 상기 세포외 도메인의 항원 결합 부위는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체의 scFv인 것을 특징으로 하는 키메라 항원 수용체.
  21. 제20항에 따른 키메라 항원 수용체(CAR)가 도입되어 있는 면역세포.
  22. 제21항에 있어서, T 세포, NK 세포, 사이토카인 유도 살해세포(Cytokine Induced Killer cell, CIK), 활성화 세포독성 T 림프구(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL), 마크로파지, 종양 조직 내 침투 T 세포(Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TIL), 수지상세포로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 면역세포.
  23. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체 또는 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 면역세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물.
  24. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체 또는 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 면역세포를 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료방법.
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