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WO2023228873A1 - 肝細胞の製造方法、肝細胞の接着性改善剤、および肝細胞 - Google Patents

肝細胞の製造方法、肝細胞の接着性改善剤、および肝細胞 Download PDF

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WO2023228873A1
WO2023228873A1 PCT/JP2023/018685 JP2023018685W WO2023228873A1 WO 2023228873 A1 WO2023228873 A1 WO 2023228873A1 JP 2023018685 W JP2023018685 W JP 2023018685W WO 2023228873 A1 WO2023228873 A1 WO 2023228873A1
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WO
WIPO (PCT)
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hepatocytes
elastase
extracellular matrix
liver tissue
hepatocyte
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/018685
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English (en)
French (fr)
Inventor
中村　和昭
理恵子 田中
英憲 阿久津
群生 笠原
明弘 梅澤
Original Assignee
国立研究開発法人国立成育医療研究センター
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Filing date
Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6448—Elastases, e.g. pancreatic elastase (3.4.21.36); leukocyte elastase (3.4.31.37)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing hepatocytes with improved adhesion, an agent for improving adhesion of hepatocytes, and hepatocytes.
  • the liver and hepatocytes have such diverse functions that they are called the chemical factories in the body. For example, more than 90% of serum proteins are produced by hepatocytes. Furthermore, the liver has a detoxification function that metabolizes harmful substances taken into or produced within the body. For this reason, various studies are being conducted in an attempt to culture hepatocytes and utilize the functions of the cells to detect harmful substances (biosensors) and to enable the in vitro production of substances necessary for humans.
  • PHAs primary human hepatocytes isolated from liver tissue are exclusively used. Evaluation systems using human primary cultured hepatocytes are the most useful means for preclinical research, such as examination of drug metabolism and drug toxicity.
  • Another method for obtaining primary cultured human hepatocytes is to separate mature hepatocytes from human liver tissue for each experiment.
  • the circumstances in which human liver tissue can be obtained are limited.
  • the number of cells obtained depends on the individual liver specimens available, and it is difficult to obtain adherent hepatocytes. This will further limit the number. For this reason, efforts are being made to develop methods for freezing liver cells from animals including humans, storing them for long periods of time, and reusing them.
  • one aspect of the present invention aims to provide a novel method for producing hepatocytes with improved adhesive properties.
  • the present invention includes, for example, the following aspects.
  • a method for producing hepatocytes with improved adhesion the method comprising the step of removing at least a portion of the extracellular matrix from the hepatocytes.
  • a hepatocyte adhesion improving agent containing elastase Hepatocytes from which at least a portion of elastin in the extracellular matrix has been removed.
  • hepatocytes with improved adhesiveness can be provided.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of observing the surface structure of non-adhesive human hepatocytes.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of observing the surface structure of human hepatocytes treated with an enzyme according to an example of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing the elastin content per cell (E) and the number of adherent cells per cm 2 (F) of human hepatocytes treated with a 2 U/mL elastase solution according to an example of the present invention.
  • a method for producing hepatocytes according to an embodiment of the present invention includes the step of removing at least a portion of the extracellular matrix from hepatocytes. By this method, hepatocytes with improved adhesiveness can be produced. Moreover, this method can be carried out as a pretreatment operation when hepatocytes are adherently cultured.
  • hepatocytes in this embodiment, as the source hepatocytes, commercially available hepatocytes may be used, or hepatocytes separated from liver tissue by a technique such as collagenase perfusion may be used. When using commercially available hepatocytes as the source hepatocytes, it may be preferable that the commercially available hepatocytes be a non-adherent lot (non-adherent hepatocytes).
  • An example of the original liver cell is at least one of the following conditions: 1) it is a primary cell, 2) it is not associated with cell line formation or canceration, and 3) it is not associated with other diseases or abnormalities. and preferably all conditions 1) to 3).
  • hepatocytes associated with a specific disease may be used.
  • the original hepatocytes do not constitute a tissue, but may be individual cells dispersed or a small number of cells aggregated.
  • the source hepatocytes may be cryopreserved using an appropriate cell cryopreservation solution as necessary.
  • the type of animal from which the original hepatocytes are derived is not particularly limited, but examples include non-human animals such as pigs, cows, sheep, dogs, rabbits, rats, mice, monkeys, or marmosets, and humans, including humans. Primates may be preferred, and humans may be more preferred.
  • the method for removing the extracellular matrix is not particularly limited, but includes, for example, a method of treating the original hepatocytes with a proteolytic enzyme. Treatment with proteolytic enzymes breaks down proteins in the extracellular matrix on the surface of hepatocytes. It may be preferable to focus on and remove elastin among proteins in the extracellular matrix on the surface of hepatocytes. Extracellular matrix removal focusing on elastin results in efficient removal of extracellular matrix.
  • proteolytic enzymes include trypsin, dispase, hyaluronidase, collagenase, and elastase, among which collagenase, elastase, or a mixture of both may be preferred. Only one type of these proteolytic enzymes may be used, or a plurality of types may be used. Among these proteolytic enzymes, it is preferable to use at least elastase, and it may be preferable to use only elastase depending on the type of hepatocytes that are the source.
  • the method for treating hepatocytes with proteases is not particularly limited, and examples thereof include a method of incubating hepatocytes in a protease solution.
  • a protease solution is a balanced salt solution (eg, Hank's solution, etc.) containing a predetermined concentration of protease.
  • the concentration of the protease in the solution is not particularly limited as long as the extracellular matrix can be removed, but is, for example, in the range of 0.1 U/mL to 10 U/mL, preferably 1 U/mL to 3 U/mL. within the range, more preferably within the range of 1 U/mL to 2 U/mL.
  • the conditions for incubating hepatocytes are not particularly limited as long as the extracellular matrix can be removed, but for example, the temperature is within the range of 30°C to 40°C, and the treatment time is within the range of 5 minutes to 30 minutes.
  • concentration of hepatocytes in the protease solution is not particularly limited, but is preferably within the range of 1 ⁇ 10 4 cell/ml to 5 ⁇ 10 6 cell/ml in order to proceed with the treatment smoothly. is within the range of 1 ⁇ 10 4 cell/ml to 1 ⁇ 10 6 cell/ml.
  • a to B indicating a numerical range means a range of A or more and B or less.
  • Removal of at least a portion of the extracellular matrix from the original cells includes, but is not limited to, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more. Refers to removal of more than 90% or more, or substantially all of the extracellular matrix.
  • the source hepatocytes are commercially available hepatocytes or hepatocytes isolated from liver tissue by a method such as collagenase perfusion
  • the component of the extracellular matrix of the source cells may be mainly elastin (as shown in (see also examples).
  • removing at least a portion of the extracellular matrix from the original cells includes, but is not limited to, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, It may refer to removing 80% or more, 90% or more, or substantially all of the extracellular matrix elastin.
  • the expression "improved adhesion of hepatocytes” refers to improved adhesion compared to the original hepatocytes. Specifically, compared to the adhesiveness of the original hepatocytes, 1.2 times or more, 1.3 times or more, 1.4 times or more, 1.5 times or more, 2 times or more, 2.5 times It may be preferable that the adhesiveness is improved by at least 3 times or more.
  • a method for producing hepatocytes according to an embodiment of the present invention is a method in which at least a portion of elastin contained in the extracellular matrix is removed in the step of separating hepatocytes from liver tissue. Extracellular matrix removal focusing on elastin results in efficient removal of extracellular matrix. By this method, a higher recovery rate of hepatocytes and separation of hepatocytes with excellent adhesiveness can be achieved.
  • liver tissue In this embodiment, the type of animal from which the original liver tissue is derived is determined from [1. This method is similar to that described in [Method for producing hepatocytes with improved adhesiveness].
  • human liver tissue for example, surplus liver tissue generated during living donor liver transplantation (including livers that are incompatible with transplantation), or other surgically removed liver tissue, etc., obtained as medical waste during medical procedures. Things can be mentioned.
  • Human liver tissue may also be liver donated for research due to death due to illness or accident.
  • the source liver tissue is preferably one without any disease or abnormality, but depending on the purpose, liver tissue with a specific disease may be used.
  • the method of separating hepatocytes from liver tissue is not particularly limited, but examples include a method of treating liver tissue with elastase to separate hepatocytes, and treating liver tissue with elastase and collagenase. The method is preferred.
  • An example of a method for treating liver tissue with elastase is a method in which liver tissue is perfused with a solution containing elastase.
  • Examples of methods for treating liver tissue with elastase and collagenase include 1) perfusing the liver tissue with a solution containing elastase and then perfusing the liver tissue with a solution containing collagenase; 2) perfusing the liver tissue with a solution containing collagenase. and 3) a method of perfusing the liver tissue with a solution containing a mixture of elastase and collagenase, including the method of 2) or 3). may be more preferable.
  • perfusion of elastase solution to the liver tissue can be performed according to the method of collagenase perfusion (Reference: Cell Tissue Res. Vol. 218, No. 1, 1981 pp. 13 to 21, Society for In Vitro). Biology. Vol. 18, NO. 5, 1982, pp. 483-491, etc.).
  • a solution used for perfusion of liver tissue is a balanced salt solution (eg, Hank's solution, etc.) containing a predetermined concentration of elastase.
  • concentration of elastase in the solution is not particularly limited as long as the extracellular matrix can be removed, but is, for example, within the range of 0.1 U/mL to 5 U/mL, preferably within the range of 1 U/mL to 3 U/mL. and more preferably within the range of 1 U/mL to 2 U/mL.
  • the concentration of collagenase in the solution is, for example, in the range of 100 U/mL to 500 U/mL.
  • the conditions for perfusing the liver tissue are also not particularly limited as long as the extracellular matrix can be removed, and are, for example, within the temperature range of 30°C to 40°C.
  • any known method may be used to collect the hepatocytes separated from the liver tissue.
  • the liver tissue after perfusion is subjected to a cell filter, and the filtered solution is centrifuged. It can be.
  • hepatocytes isolated from liver tissue in this embodiment has less residual extracellular matrix on the cell surface compared to hepatocytes isolated from liver tissue by conventional procedures (e.g., treatment with collagenase alone). It may be less.
  • the hepatocytes isolated from the liver tissue are not particularly limited, but for example, when compared to hepatocytes isolated by a conventional procedure, the remaining amount of extracellular matrix on the cell surface is 60% or less, 50% or less, 40% or less, 30% or less, 20% or less, or 10% or less, preferably substantially no extracellular matrix remains.
  • the component of the extracellular matrix may be primarily elastin (see also Examples).
  • the remaining amount of extracellular matrix on the cell surface can also be understood as the remaining amount of elastin, which is the extracellular matrix on the cell surface.
  • the number of separated cells may be larger than that of hepatocytes separated from liver tissue by a conventional procedure (for example, treatment with collagenase alone).
  • the hepatocytes isolated from liver tissue are not particularly limited, but for example, compared to hepatocytes isolated by a conventional procedure, the hepatocytes are 1.2 times or more, 1.3 times or more, 1.4 times more.
  • it may be preferable that the number of separated cells is improved by 1.5 times or more, 2 times or more, 2.5 times or more, or 3 times or more.
  • the adhesion of hepatocytes isolated by the method of this embodiment to the culture substrate may be superior to that of hepatocytes isolated by conventional procedures.
  • the hepatocyte adhesion improving agent according to one embodiment of the present invention contains elastase.
  • Specific examples of the adhesion improver include the above [1. Method for producing hepatocytes with improved adhesion], and [2.
  • a balanced salt solution for example, Hank's solution, etc.
  • elastase proteolytic enzyme
  • the adhesion improving agent may be in the form of a kit containing elastase.
  • the kit may include other reagents, solvents, etc. in addition to elastase.
  • kit is intended to refer to a package that includes a container (eg, a bottle, etc.) containing a specific material. Preferably, instructions for using each material are provided.
  • container eg, a bottle, etc.
  • instructions for using each material are provided.
  • “comprising” is intended to mean being included in any of the individual containers constituting the kit.
  • the kit according to the present embodiment may be a package in which a plurality of different compositions are packed together.
  • “Instructions” may be written or printed on paper or other media, or may be affixed to electronic media such as magnetic tape, computer readable disk or tape, CD-ROM, etc. .
  • liver cells In the hepatocytes according to one embodiment of the present invention, at least a portion of elastin in the extracellular matrix has been removed. Examples of such hepatocytes include those described in [1. Method for producing hepatocytes with improved adhesion], and [2. Examples include hepatocytes produced by the production method described in [Separation of hepatocytes from liver tissue].
  • the hepatocytes according to this embodiment have excellent adhesive properties, they are suitable for adhesive culture.
  • adhesive culture methods commonly used for hepatocytes can be directly adopted, and for example, flat culture can be performed using a culture vessel coated with collagen or the like and an appropriate medium.
  • the hepatocytes according to this embodiment are considered to maintain functions similar to in vivo liver functions. Furthermore, these hepatocytes are considered to be superior in terms of survival period in a culture system, activity of various metabolic enzymes, mitochondrial function, etc.
  • the evaluation system using primary cultured hepatocytes obtained in this embodiment can be the most useful means in preclinical research such as examination of drug metabolism and drug toxicity. That is, the present invention can contribute to a stable supply of adherent hepatocytes and, by extension, to a significant cost reduction in drug discovery research.
  • the method for providing hepatocytes according to this embodiment is not particularly limited, they may be provided in a cryopreserved state using an appropriate cell cryopreservation solution as necessary.
  • a method for producing hepatocytes with improved adhesion comprising the step of removing at least a portion of the extracellular matrix from the hepatocytes.
  • the hepatocytes from which at least a portion of the extracellular matrix is removed are commercially available hepatocytes or hepatocytes separated from liver tissue by collagenase perfusion, according to (1) to (3). Any method described.
  • a method for producing hepatocytes in which at least a portion of elastin contained in the extracellular matrix is removed in the step of separating hepatocytes from liver tissue.
  • a hepatocyte adhesion improving agent containing elastase. Hepatocytes from which at least a portion of elastin in the extracellular matrix has been removed.
  • ⁇ Experimental example 1 Removal of extracellular matrix on the surface of hepatocytes>
  • the present inventors observed the cell surface structure of human hepatocytes commercially available as a non-adhesive lot (trade name: HuHeCS/4+, sold by Cytes Biotechnologies) using an electron microscope. As a result, as shown in FIG. 1, it was confirmed that the cell surface of the hepatocytes was coated with extracellular matrix (hereinafter also referred to as ECM). Furthermore, as a result of analyzing the composition of ECM on the cell surface, it was revealed that while collagen was hardly included, elastin was the main component of ECM.
  • hepatocytes were first suspended in a lysis medium (trade name: Cryopreserved Hepatocyte Recovery Medium (CHRM), sold by Thermo Fisher Scientific), and centrifuged at 100 x g for 10 minutes. . Thereafter, the hepatocytes were treated with each enzyme solution (enzyme concentration is 2 U/mL, a mixture of collagenase and elastase with a concentration ratio of 125:1, and Hanks' Balanced salt solution containing HEPES 10 mmol/L and CaCl 2 5 mM) ( Hanks' solution) was resuspended and incubated at 37°C for 20 minutes.
  • a lysis medium trade name: Cryopreserved Hepatocyte Recovery Medium (CHRM), sold by Thermo Fisher Scientific
  • the concentration of hepatocytes in the enzyme solution was within the range of approximately 1 ⁇ 10 5 cells/ml to 1 ⁇ 10 6 cells/ml.
  • the cell suspension obtained after the incubation was centrifuged at 100 ⁇ g for 5 minutes, and the enzyme-treated hepatocytes were collected.
  • a portion of the hepatocytes treated with each enzyme solution was fixed with glutaraldehyde, and the cell surface was observed using a scanning electron microscope.
  • Figure 2 shows the results of electron microscopic observation of hepatocytes after enzyme treatment.
  • the cell surfaces of hepatocytes that had not been subjected to enzyme treatment were covered with ECM, but at least a portion of the ECM on the cell surfaces of hepatocytes that had been subjected to enzyme treatment had been removed.
  • virtually all ECM on the cell surface of hepatocytes treated with elastase or a collagenase/elastase mixed solution was removed, leaving the microvilli exposed.
  • the remaining cells treated with each enzyme solution were resuspended in a seeding medium (product name: Hepatocyte Plating Medium (MP100), sold by LONZA), seeded in a 12-well plate, and cultured for 24 hours.
  • the number of adherent cells per unit area was measured and used as an evaluation index of cell adhesiveness.
  • human hepatocytes that had not been treated with the enzyme solution were similarly seeded in a 12-well plate, and after culturing for 24 hours, the number of adherent cells per unit area was counted.
  • the 12-well plate was coated with collagen.
  • the number of cells seeded in each well is within a range that can be considered to be substantially equivalent.
  • Figure 3 shows the state of hepatocytes after 24 hours of culture in a 12-well plate and the number of adherent cells per 1 cm2 .
  • the number of adherent cells per 1 cm 2 of hepatocytes treated with elastase or collagenase/elastase mixed solution was about 3 times higher than that of hepatocytes that were not treated with the enzyme.
  • hepatocytes derived from three non-adherent lots (Lot: CyHum17017 (Cytes Biotechnologies), Hu4153, Hu4243 (Thermo Fisher Scientific)) were cultured in a thawing medium (trade name: Cryopreserved Hepatocytes Recovery Medium (CHRM)). ), sold by Thermo Fisher Scientific) and centrifuged at 100 x g for 10 minutes. Hepatocytes were then treated with elastase solution at concentrations of 1 U/mL, 2 U/mL, 4 U/mL and 10 U/mL (Hanks' Balanced salt solution containing HEPES 10 mmol/L and CaCl 2 5 mM, respectively).
  • CHRM Cryopreserved Hepatocytes Recovery Medium
  • human hepatocytes that had not been treated with elastase solution were similarly seeded into 12-well plates, and after culturing for 24 hours, the number of adherent cells per unit area and the elastin content per cell were measured. . Note that the 12-well plate was coated with collagen.
  • Figure 4 shows the state of hepatocytes after 24 hours of culture in a 12-well plate, the number of adherent cells per 1 cm2 , and the elastin content per cell. Compared to hepatocytes that were not treated with elastase, the elastin content per cell was decreased when treated with elastase solution at any concentration. Furthermore, the number of adherent cells per 1 cm 2 of treated hepatocytes was particularly high in elastase solutions with concentrations of 1 U/mL and 2 U/mL. Note that the values in the bar graph indicate the average value at each concentration, and the error bars indicate the standard deviation.
  • Hepatocytes derived from adhesive lots (Lot: LHuf17905B, BHum16029, BHum16059 (Cytes Biotechnologies) were also seeded in 12-well plates, and after culturing for 24 hours, the number of adherent cells and elastin content were measured.
  • Figure 5 shows the elastin content per cell and the number of adherent cells per 1 cm2 after culturing in a 12-well plate for 24 hours.
  • the values in the bar graph are the average values of all lots, and the black dots connected by straight lines indicate the values before and after treatment with elastase solution in each lot.
  • elastin was removed by 65-75% compared to before treatment, and compared to cells derived from adherent lots, the elastin content was equivalent or It has become less.
  • the number of adherent cells was 1.4 to 3 times that before treatment, and there were lots in which the number of adherent cells was higher than that of cells derived from adhesive lots.
  • elastase solution treatment did not affect the function of hepatocytes.
  • ⁇ Experimental example 2 Isolation of hepatocytes from liver tissue> Human hepatocytes are typically isolated from liver tissue by perfusing the liver tissue with collagenase.
  • the separation operation it was investigated whether perfusion with a collagenase/elastase mixed solution would improve the number of separated cells per tissue weight compared to perfusion with a collagenase alone solution. Furthermore, the viability of the separated cells was measured by trypan blue staining. The separated cells were also resuspended in the seeding medium and seeded in a 12-well plate in the same manner as in Experimental Example 1, and after culturing for 24 hours, the number of adherent cells per unit area was counted. Note that the 12-well plate was coated with collagen. Furthermore, the number of cells seeded in each well is within a range that can be considered to be substantially equivalent.
  • human liver tissue derived from a donor for living liver transplantation is used with the donor's consent, and after dividing this human liver tissue into two parts, one part is treated with a collagenase alone solution and the other part is treated with a collagenase/elastase mixed solution.
  • the primary cultured human hepatocytes were isolated.
  • physiological saline was injected through the blood vessel stump exposed in the cross section of the liver tissue, and blood was removed and washed.
  • a perfusion tube was inserted into the portal vein or central vein, and ligated with thread or fixed with adhesive (Aron Alpha).
  • the cells were immersed in a beaker containing a perfusate and perfused while being heated in a 37°C hot bath.
  • the flow rate of the perfusate ranged from 800 to 900 mm H 2 O, and perfusion was performed for 20 minutes.
  • the perfusate (collagenase/elastase mixed solution) was Hanks' Balanced salt solution containing 10 mmol/L of HEPES, 5 mM of CaCl 2 , 250 U/mL of collagenase, and 2 U/mL of elastase.
  • the perfusion solution (collagenase alone solution) has the same composition as the perfusion solution (collagenase/elastase mixed solution) except that it does not contain elastase.
  • Table 1 shows the results of the study on two donors. Separation by perfusion with a collagenase/elastase mixed solution resulted in significantly higher numbers of separated cells per tissue weight and adherent cells per unit area than perfusion with a collagenase alone solution.
  • the present invention can be utilized in the adhesive culture of human hepatocytes in the medical field or research, and is expected to contribute to the stable supply of adherent hepatocytes.

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Abstract

接着性が改善された肝細胞を提供するために、本発明の一形態は、接着性が改善された肝細胞の製造方法であって、肝細胞から、細胞外マトリックスの少なくとも一部を除去する工程を含む、方法である。

Description

肝細胞の製造方法、肝細胞の接着性改善剤、および肝細胞
　本発明は、接着性の改善された肝細胞の製造方法、肝細胞の接着性改善剤、および肝細胞に関する。
　肝臓および肝細胞は体内における化学工場と言われるほど多様な機能を持っている。例えば、血清タンパク質の９０％以上は肝細胞が産生している。また、肝臓は、体内に取り込まれたり体内で産生された有害物質を代謝する解毒機能を有している。かかる理由から、肝細胞を培養し、当該細胞の機能を利用して有害物質の検出（バイオセンサー）、およびヒトに必要な物質の体外生産を可能にしようと、様々な研究がなされている。
　しかしながら、現在のところ、ｉｎ　ｖｉｖｏと同等の肝細胞機能を保持している細胞株は存在していない。そのため、肝組織から分離されたヒト初代培養肝細胞（Primary human hepatocyte,ＰＨＨｓ）が専ら利用されている。ヒト初代培養肝細胞を用いた評価系は、薬物代謝および薬物毒性の検討など、前臨床研究において最も有用な手段である。
　ヒト肝細胞の平面培養では、コラーゲンをコートした培養容器を使用する培養法が一般的である。この培養容器中のコラーゲンコート上に接着する肝細胞が、接着性肝細胞として扱われている。例えば海外で市販されているヒト初代培養肝細胞にも接着ロットと非接着ロットとが存在しているが、一般的に接着ロットの方がｉｎ　ｖｉｖｏにおける肝機能により近い機能を保持している。また培養系での生存期間、各種代謝酵素の活性、およびミトコンドリア機能等についても、接着ロットの方が非接着ロットよりも優れている。細胞の接着性に関しては、例えば非特許文献１および２にも記載がある。
伊藤広治、野本洋一、赤池敏宏、基質設計による肝細胞の接着制御―ポリリジン誘導体の構造・機能創刊―、人工臓器 20(2), 470-473(1991) 小林明、小林一清、赤池敏宏、細胞接着システムの新展開、化学と生物Vol.32, No.4, 260-268，1994
　ヒト初代培養肝細胞の接着ロットは上記のとおり、非接着ロットと比して優れている点が多いため、特に高価格で市販され、創薬等の研究において大きなコストとなっている。また、接着ロットの供給量は、非接着ロットの供給量と比較して、極めて少量にとどまっている。
　ヒト初代培養肝細胞を入手する他の方法としては、実験毎に、ヒト肝組織から成熟肝細胞を分離する方法もある。一方で、そもそもヒト肝組織を入手できる環境は限定されている。また、機能を維持したまま、成熟肝細胞を増殖させる方法は十分に確立していないため、得られる細胞数は入手できる個々の肝検体に依存しており、接着性の肝細胞を得ようとするとさらに数が限られることになる。このことから、ヒトを含めた動物の肝細胞を凍結し、長期保存し、再び使用する方法の開発も進められている。
　しかしながら現状では、凍結保存後解凍した接着ロット肝細胞について、培養皿上に接着するものの、培養期間中に肝機能が急速に低下することが報告されているにすぎない。なおかつ当該報告においては、解凍された肝細胞はほとんど増殖能を有せず、短期間に死滅している。また、出願人はこれまでに、生体肝移植の健常ドナーの余剰肝から、コラゲナーゼ灌流によるヒト初代培養肝細胞の分離を行い、凍結保存を行っているが、分離したヒト初代培養肝細胞の接着率は１０％を下回ることがほとんどである。
　すなわち、接着性肝細胞の安定供給のニーズが高いにも関わらず、そのニーズが満たされていない。また、非接着性の肝細胞の利用に関しても、細胞の培養条件の最適化、および接着対象となる基材側の最適化等の検討がなされているものの、これらの検討が充分な効果を上げているとは言い難い。現状では、肝細胞の接着性を決定する要因は明らかとなっておらず、肝細胞そのものの接着性を画期的に改善するような研究報告もなされていない。
　本発明の一態様は、上記の課題に鑑み、接着性が改善された肝細胞を製造する新規な方法等を提供することを目的とする。
　上記の課題を解決するために、本願発明者らが鋭意検討を重ねた結果、肝細胞の接着性の主要な制御要因の一つが細胞外マトリックスであることを解明し、本願発明に想到するに至った。本願発明には、例えば、以下のような態様が含まれる。
（１）接着性が改善された肝細胞の製造方法であって、肝細胞から、細胞外マトリックスの少なくとも一部を除去する工程を含む、製造方法。
（２）肝細胞の製造方法であって、肝組織から肝細胞を分離する工程において、細胞外マトリックスに含まれるエラスチンの少なくとも一部を除去する、製造方法。
（３）エラスターゼを含む、肝細胞の接着性改善剤。
（４）細胞外マトリックスのエラスチンの少なくとも一部が除去されてなる、肝細胞。
　本発明の一態様によれば、接着性が改善された肝細胞を提供することができる。
非接着性のヒト肝細胞の表面構造を観察した結果を示す図である。 本発明の実施例に係る、酵素で処理したヒト肝細胞の、表面構造を観察した結果を示す図である。 本発明の実施例に係る、エラスターゼ溶液、コラゲナーゼ溶液、コラゲナーゼ・エラスターゼ混合溶液で処理したヒト肝細胞の培養後の状態（左）、及び、１ｃｍ２あたりの接着細胞数（右）を示す図である。 本発明の実施例に係る、種々の濃度のエラスターゼ溶液で処理したヒト肝細胞の培養後の状態（Ａ）、１ｃｍ２あたりの接着細胞数（Ｂ）、及び細胞あたりのエラスチン含量（Ｃ）を示す図である。 本発明の実施例に係る、２Ｕ／ｍＬエラスターゼ溶液で処理したヒト肝細胞の細胞あたりのエラスチン含量（Ｅ）、及び１ｃｍ２あたりの接着細胞数（Ｆ）を示す図である。
　以下、本発明の実施形態について、詳細に説明する。
　〔１．接着性が改善された肝細胞の製造方法〕
　（概要）
　本発明の一実施形態に係る肝細胞の製造方法は、肝細胞から、細胞外マトリックスの少なくとも一部を除去する工程を含んでいる。この方法によって、接着性が改善された肝細胞を製造することができる。また、この方法は、肝細胞を接着培養する際の前処理操作としても実施することができる。
　（肝細胞）
　本実施形態において、元となる肝細胞は、市販の肝細胞を用いてもよいし、又は、コラゲナーゼ灌流などの手法で肝組織から分離した肝細胞を用いてもよい。元となる肝細胞として、市販の肝細胞を用いる場合、当該市販の肝細胞は非接着性ロット（非接着性の肝細胞）であることが好ましい場合がある。
　元となる肝細胞の一例は、１）初代細胞である、２）株化、またはがん化等を伴っていない、および、３）その他の疾患または異常を伴っていない、の少なくとも一つの条件を満たし、好ましくは１）～３）の全ての条件を満たしている。但し、目的に応じて、特定の疾患を伴った肝細胞を用いてもよい。
　ある態様では、元となる肝細胞は、組織を構成していないものであるが、一つ一つの細胞が分散したものであってもよく、少数の細胞が集合したものであってもよい。元となる肝細胞は、必要に応じて適切な細胞凍結保存液を用いて、凍結保存されているものであってもよい。
　元となる肝細胞が由来する動物の種類は特に限定されないが、ブタ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ウサギ、ラット、マウス、サル、もしくはマーモセット等の非ヒト動物、またはヒトが挙げられ、ヒトを含む霊長類が好ましい場合があり、ヒトがより好ましい場合がある。
　（細胞外マトリックスの少なくとも一部を除去する工程）
　細胞外マトリックスの少なくとも一部を除去する工程において、細胞外マトリックスの除去方法は特に限定されないが、例えば、元となる肝細胞をタンパク質分解酵素で処理する方法が挙げられる。タンパク質分解酵素で処理することで、肝細胞の表面にある細胞外マトリックス中のタンパク質が分解される。肝細胞の表面にある細胞外マトリックス中のタンパク質のうちエラスチンに着目して除去することが好ましい場合がある。エラスチンに着目した細胞外マトリックスの除去は、細胞外マトリックスの効率的な除去をもたらす。
　タンパク質分解酵素としては、例えば、トリプシン、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼ、コラゲナーゼ、又はエラスターゼなどが挙げられ、中でもコラゲナーゼ、エラスターゼ、又は両者の混合物が好ましい場合がある。タンパク質分解酵素は、これらの一種類のみを用いてもよく、複数種類を用いてもよい。これらタンパク質分解酵素の中では、少なくともエラスターゼを用いることが好ましく、元となる肝細胞の種類によってはエラスターゼのみを用いることが好ましい場合がある。
　タンパク質分解酵素で肝細胞を処理する方法は特に限定されないが、例えば、タンパク質分解酵素溶液中で肝細胞をインキュベートする方法が挙げられる。タンパク質分解酵素溶液の一例は、所定の濃度のタンパク質分解酵素を含む、平衡塩溶液（例えば、ハンクス液等）である。溶液中のタンパク質分解酵素の濃度は、細胞外マトリックスの除去が可能な限り特に限定されないが、例えば０．１Ｕ／ｍＬ～１０Ｕ／ｍＬの範囲内であり、好ましくは１Ｕ／ｍＬ～３Ｕ／ｍｌの範囲内であり、より好ましくは１Ｕ／ｍＬ～２Ｕ／ｍｌの範囲内である。肝細胞をインキュベートする条件も、細胞外マトリックスの除去が可能な限り特に限定されないが、例えば、３０℃～４０℃の温度範囲内であり、５分～３０分の範囲内の処理時間である。なお、タンパク質分解酵素溶液中の肝細胞の濃度も特に限定されないが、処理を円滑に進める上では、例えば、１×１０４ｃｅｌｌ／ｍｌ～５×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌの範囲内であり、好ましくは１×１０４ｃｅｌｌ／ｍｌ～１×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌの範囲内である。なお、本明細書において数値範囲を示す「Ａ～Ｂ」は、Ａ以上でＢ以下の範囲内を意味する。
　元となる細胞から細胞外マトリックスの少なくとも一部を除去するとは、特に限定されないが例えば、４０％かそれ以上、５０％かそれ以上、６０％かそれ以上、７０％かそれ以上、８０％かそれ以上、９０％かそれ以上、又は、実質的に全て、の細胞外マトリックスを除去することを指す。なお、元となる肝細胞が、市販の肝細胞やコラゲナーゼ灌流などの手法で肝組織から分離した肝細胞の場合、元となる細胞が持つ細胞外マトリックスの成分は主にエラスチンでありうる（実施例も参照）。この場合、元となる細胞から細胞外マトリックスの少なくとも一部を除去するとは、特に限定されないが例えば、４０％かそれ以上、５０％かそれ以上、６０％かそれ以上、７０％かそれ以上、８０％かそれ以上、９０％かそれ以上、又は、実質的に全て、の細胞外マトリックスたるエラスチンを除去することを指す場合がある。
　元となる肝細胞から細胞外マトリックスの少なくとも一部を除去することにより、当該細胞の細胞膜および細胞膜上の接着因子が露出した状態となる。これによって、処理後の肝細胞の培養基材への接着性が顕著に改善する。なお、本明細書において、肝細胞の接着性が改善されるとは、元となる肝細胞との比較で接着性が向上することを指す。具体的には、元となる肝細胞の接着性との比較で、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、又は３倍以上、接着性が向上していることが好ましい場合がある。
　〔２．肝組織からの肝細胞の分離〕
　（概要）
　本発明の一実施形態に係る肝細胞の製造方法は、肝組織から肝細胞を分離する工程において、細胞外マトリックスに含まれるエラスチンの少なくとも一部を除去する方法である。エラスチンに着目した細胞外マトリックスの除去は、細胞外マトリックスの効率的な除去をもたらす。この方法によって、より高い肝細胞回収率と、接着性に優れた肝細胞の分離とを実現することができる。
　（肝組織）
　本実施形態において、元となる肝組織が由来する動物の種類は、上記の〔１．接着性が改善された肝細胞の製造方法〕で説明したものと同様である。ヒト肝組織を用いる場合は、例えば、生体肝移植の際に生じた余剰肝組織（移植不適合肝等も含む）、またはその他の手術摘出肝など、医療行為の際に医療廃棄物として得られたものが挙げられる。ヒト肝組織は、病死あるいは事故死により研究用として提供される肝臓の場合もある。元となる肝組織は、疾患または異常を伴っていないものが好ましいが、目的に応じて、特定の疾患を伴った肝組織を用いてもよい。
　（肝組織から肝細胞を分離する工程）
　本実施形態において、肝組織から肝細胞を分離する方法は特に限定しないが、例えばエラスターゼで肝組織を処理して、肝細胞を分離する方法が挙げられ、エラスターゼとコラゲナーゼとで肝組織を処理する方法が好ましい。エラスターゼで肝組織を処理する方法の一例としては、エラスターゼを含む溶液を肝組織に灌流させる方法が挙げられる。エラスターゼとコラゲナーゼとで肝組織を処理する方法の一例として、１）エラスターゼを含む溶液を肝組織に灌流させ、次いでコラゲナーゼを含む溶液を肝組織に灌流させる方法、２）コラゲナーゼを含む溶液を肝組織に灌流させ、次いでエラスターゼを含む溶液を肝組織に灌流させる方法、または、３）エラスターゼとコラゲナーゼとを混合して含む溶液を肝組織に灌流させる方法が挙げられるが、２）または３）の方法がより好ましい場合がある。なお、エラスターゼ溶液の肝組織への灌流は、コラゲナーゼ灌流の手法に準じて行うことができる（参考文献：Cell Tissue Res. Vol.218, No.1, 1981 13頁～21頁, Society for In Vitro Biology. Vol.18, NO.5, 1982,483頁～491頁など）。
　肝組織の灌流に使用される溶液の一例は、所定の濃度のエラスターゼを含む、平衡塩溶液（例えば、ハンクス液等）である。溶液中のエラスターゼの濃度は、細胞外マトリックスの除去が可能な限り特に限定されないが、例えば０．１Ｕ／ｍＬ～５Ｕ／ｍＬの範囲内であり、好ましくは１Ｕ／ｍＬ～３Ｕ／ｍｌの範囲内であり、より好ましくは１Ｕ／ｍＬ～２Ｕ／ｍＬの範囲内である。溶液中にエラスターゼに加えてコラゲナーゼも含まれている場合、溶液中のコラゲナーゼの濃度は、例えば、１００Ｕ／ｍＬ～５００Ｕ／ｍＬの範囲内である。肝組織を灌流する条件も、細胞外マトリックスの除去が可能な限り特に限定されないが、例えば、３０℃～４０℃の温度範囲内である。
　肝組織から分離した肝細胞を回収する方法は公知の方法であればよく、例えば前記肝組織の灌流においては、灌流後の肝組織を細胞濾過器に供し、濾過した溶液を遠心分離する方法などであり得る。
　本実施形態において肝組織から分離された肝細胞の一例では、慣用の手順（例えば、コラゲナーゼ単独の処理）で肝組織から分離された肝細胞と比較して、細胞表面の細胞外マトリックスの残存がより少ない場合がある。本実施形態において肝組織から分離された肝細胞は、特に限定されないが例えば、慣用の手順で分離された肝細胞との比較で、細胞表面の細胞外マトリックスの残存量が６０％かそれ以下、５０％かそれ以下、４０％かそれ以下、３０％かそれ以下、２０％かそれ以下、又は１０％かそれ以下であり、好ましくは実質的に細胞外マトリックスが残存していない。なお、慣用の手順（例えば、コラゲナーゼ単独の処理）で分離された肝細胞では、細胞外マトリックスの成分は主にエラスチンでありうる（実施例も参照）。この場合、細胞表面の細胞外マトリックスの残存量とは、細胞表面の細胞外マトリックスであるエラスチンの残存量と解することも出来る。
　本実施形態において肝組織から分離された肝細胞の一例では、慣用の手順（例えば、コラゲナーゼ単独の処理）で肝組織から分離された肝細胞と比較して、分離細胞数が多い場合がある。本実施形態において肝組織から分離された肝細胞は、特に限定されないが例えば、慣用の手順で分離された肝細胞との比較で、１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、又は３倍以上、分離細胞数が向上していることが好ましい場合がある。
　以上のように分離された肝細胞は、細胞外マトリックスの残存が少ないため、当該細胞の細胞膜および細胞膜上の接着因子が露出した状態となる。そのため、本実施形態の方法で分離された肝細胞の培養基材への接着性は、慣用の手順で分離された肝細胞と比較して優れている場合がある。
　〔３．接着性改善剤〕
　本発明の一実施形態に係る肝細胞の接着性改善剤は、エラスターゼを含んでいる。接着性改善剤の具体例としては、上記の〔１．接着性が改善された肝細胞の製造方法〕、および〔２．肝組織からの肝細胞の分離〕に記載した、所定の濃度のタンパク質分解酵素（エラスターゼ）を含む、平衡塩溶液（例えば、ハンクス液等）が挙げられる。
　接着性改善剤は、エラスターゼを備えたキットの形態であってもよい。キットとしては、エラスターゼの他に、他の試薬、溶媒、等を備えていてもよい。
　なお、本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル等）を備えた包装が意図される。好ましくは各材料を使用するための指示書を備える。本明細書中においてキットの局面において使用される場合、「備えた（備える）」は、キットを構成する個々の容器の何れかの中に内包されている状態が意図される。また、本実施の形態に係るキットは、複数の異なる組成物を１つに梱包した包装であり得る。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ－ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。
　〔４．肝細胞〕
　本発明の一実施形態に係る肝細胞は、細胞外マトリックスのエラスチンの少なくとも一部が除去されてなる。このような肝細胞としては、例えば、上記の〔１．接着性が改善された肝細胞の製造方法〕、および〔２．肝組織からの肝細胞の分離〕に記載した製造方法によって製造された肝細胞が挙げられる。
　本実施形態に係る肝細胞は接着性に優れているので、接着培養に適している。接着培養は、肝細胞で慣用されている方法をそのまま採用でき、例えばコラーゲン等をコートした培養容器を用い、適切な培地を用いて平面培養を行うことができる。本実施形態に係る肝細胞は、ｉｎ　ｖｉｖｏの肝機能に近い機能を保持していると考えられる。また、この肝細胞は、培養系での生存期間、各種代謝酵素の活性、およびミトコンドリア機能等についても優れていると考えられる。特に本実施形態で得られる初代培養肝細胞を用いた評価系は、薬物代謝および薬物毒性の検討など、前臨床研究において最も有用な手段になりうる。すなわち、本発明は、接着性肝細胞の安定供給、ひいては創薬研究の大幅なコスト削減等に寄与するという一面を持ちうる。
　本実施形態に係る肝細胞の提供方法は特に限定されないが、必要に応じて適切な細胞凍結保存液を用いて、凍結保存されている状態で提供され得る。
　〔５．その他の態様〕
　なお、上記の〔１．接着性が改善された肝細胞の製造方法〕～〔４．肝細胞〕で記載した事項は、肝細胞を他の細胞に置き換えて読み替えることによって、その細胞外マトリックスにエラスチンが比較的多く含まれる他の細胞にも適用することができる。他の細胞の例としては、肺組織を構成する個々の細胞、消化管を構成する個々の細胞、血管を構成する個々の細胞等が挙げられる。
　（まとめ）
　以上の実施形態をまとめると、本発明は以下のように要約され得る。
（１）接着性が改善された肝細胞の製造方法であって、肝細胞から、細胞外マトリックスの少なくとも一部を除去する工程を含む、製造方法。
（２）前記細胞外マトリックスの少なくとも一部を除去する工程では、細胞外マトリックス中のエラスチンの少なくとも一部を除去する、（１）に記載の方法。
（３）前記細胞外マトリックスの少なくとも一部を除去する工程は、肝細胞をエラスターゼで処理することによって行われる、（２）に記載の方法。
（４）細胞外マトリックスの少なくとも一部が除去される上記肝細胞は、市販の肝細胞であるか、又は、コラゲナーゼ灌流で肝組織から分離した肝細胞である、（１）から（３）の何れかに記載の方法。
（５）肝細胞の製造方法であって、肝組織から肝細胞を分離する工程において、細胞外マトリックスに含まれるエラスチンの少なくとも一部を除去する、製造方法。
（６）前記肝組織から肝細胞を分離する工程は、肝組織をエラスターゼで処理することによって行われる、（５）に記載の方法。
（７）前記肝組織はコラゲナーゼでも処理される、（６）に記載の方法。
（８）エラスターゼを含む、肝細胞の接着性改善剤。
（９）細胞外マトリックスのエラスチンの少なくとも一部が除去されてなる、肝細胞。
（１０）上記の（１）から（７）の何れかに記載の方法によって製造されてなる、（９）に記載の肝細胞。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　＜実験例１：肝細胞表面の細胞外マトリックスの除去＞
　本願発明者らは、非接着性ロットとして市販されているヒトの肝細胞（商品名：HuHeCS/4+、販売社：Cytes Biotechnologies社）の細胞表面構造を電子顕微鏡によって観察した。その結果、図１に示すとおり、肝細胞はその細胞表面が細胞外マトリックス（以下、ＥＣＭとも称する）で被覆されている状態であることを確認した。また、細胞表面のＥＣＭの組成を分析した結果、コラーゲンはほぼ含まれていない一方で、エラスチンがＥＣＭの主たる成分となっていることが明らかとなった。
　［１－１：種々のタンパク質分解酵素による処理］
　本願発明者らは、ＥＣＭの存在が、肝細胞の接着性に関係していると推測した。ＥＣＭの除去について検討すべく、播種前の上記の肝細胞に対して、トリプシン単独、ディスパーゼ単独、コラゲナーゼ単独、エラスターゼ単独、およびコラゲナーゼ・エラスターゼの混合物によるタンパク質分解酵素処理を行った。
　具体的には、まず上記の肝細胞を融解培地（商品名：Cryopreserved Hepatocytes Recovery Medium（CHRM）、販売社：Thermo Fisher Scientific社）に懸濁して、１００×ｇで１０分間の遠心分離を行った。その後、肝細胞を、各酵素溶液（酵素濃度は２Ｕ／ｍＬ。コラゲナーゼ・エラスターゼの混合物は両者の濃度比が１２５：１、その他、ＨＥＰＥＳ １０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＣａＣｌ２ ５ｍＭを含むHanks' Balanced salt solution（ハンクス液））によって再懸濁し、３７℃で２０分インキュベーションした。酵素溶液中の肝細胞の濃度は、凡そ１×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌ～１×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌの範囲内であった。インキュベーション後に得られた細胞の懸濁液を１００×ｇで５分間の遠心分離を行い、酵素処理後の肝細胞を回収した。
　各酵素溶液で処理した肝細胞の一部をグルタルアルデヒドで固定し、走査型電子顕微鏡で細胞表面を観察した。
　酵素処理後の肝細胞の電子顕微鏡観察の結果を図２に示す。酵素処理を行っていない肝細胞の細胞表面はＥＣＭで覆われているが、酵素処理後の肝細胞の細胞表面のＥＣＭは少なくともその一部が除去されていた。特にエラスターゼまたはコラゲナーゼ・エラスターゼ混合溶液で処理した肝細胞の細胞表面のＥＣＭは実質的にほぼ全て除去され、微絨毛が露出した状態となっていた。
　また、各酵素溶液で処理した細胞の残りを、播種培地（商品名：Hepatocyte Plating Medium（MP100）、販売社：LONZA社）に再懸濁して１２穴プレートに播種し、２４時間培養した後に、単位面積あたりの接着細胞数を計測して、細胞の接着性の評価指標とした。また、比較のため、酵素溶液で処理をしていないヒト肝細胞も同様にして１２穴プレートに播種し、２４時間培養した後に、単位面積あたりの接着細胞数を計測した。なお、１２穴プレートはコラーゲンコートが施されていた。また、各穴に播種された細胞数は、実質的に同等と見做せる範囲内である。
　いずれの酵素処理においても細胞表面のＥＣＭは除去され肝細胞の接着性が向上したが、特にエラスターゼ単独またはコラゲナーゼ・エラスターゼ混合溶液による処理は、トリプシン単独による処理、およびディスパーゼ単独による処理に比して、肝細胞の接着性の向上が顕著であり、培養２４時間以降の細胞生存率の顕著な向上につながった。
　１２穴プレートで２４時間培養した後の肝細胞の状態、及び、１ｃｍ２あたりの接着細胞数を図３に示す。エラスターゼまたはコラゲナーゼ・エラスターゼ混合溶液で処理した肝細胞の１ｃｍ２あたりの接着細胞数は、酵素処理を行わなかった肝細胞と比して約３倍前後増加していた。
　［１－２：種々の濃度のエラスターゼ溶液による比較］
　肝細胞の接着性の改善にあたって好ましいタンパク質分解酵素の濃度について検討すべく、種々の濃度のエラスターゼ単独溶液によるタンパク質分解酵素処理を行った。
　具体的には、３種の非接着性ロット由来の肝細胞（Lot：CyHum17017（Cytes Biotechnologies社）、Hu4153、Hu4243（Thermo Fisher Scientific社））を、融解培地（商品名：Cryopreserved Hepatocytes Recovery Medium（CHRM）、販売社：Thermo Fisher Scientific社）に懸濁して、１００×ｇで１０分間の遠心分離を行った。その後、肝細胞を、１Ｕ／ｍＬ、２Ｕ／ｍＬ、４Ｕ／ｍＬおよび１０Ｕ／ｍＬの濃度のエラスターゼ溶液（それぞれ、ＨＥＰＥＳ １０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＣａＣｌ２ ５ｍＭを含むHanks' Balanced salt solution（ハンクス液））によって再懸濁し、３７℃で１０分インキュベーションした。１×１０６個の肝細胞に対して、各濃度のエラスターゼ溶液は５ｍＬ加えられた。インキュベーション後に得られた細胞の懸濁液を１００×ｇで５分間の遠心分離を行い、エラスターゼ処理後の肝細胞を回収した。回収した細胞を、播種培地（商品名：Hepatocyte Plating Medium（MP100）、販売社：LONZA社）に再懸濁して１２穴プレートに播種し、２４時間培養した後に、単位面積あたりの接着細胞数及び細胞あたりのエラスチン含量を計測して、細胞の接着性の評価指標とした。また、比較のため、エラスターゼ溶液で処理をしていないヒト肝細胞も同様にして１２穴プレートに播種し、２４時間培養した後に、単位面積あたりの接着細胞数及び細胞あたりのエラスチン含量を計測した。なお、１２穴プレートはコラーゲンコートが施されていた。
　１２穴プレートで２４時間培養した後の肝細胞の状態、１ｃｍ２あたりの接着細胞数、及び細胞あたりのエラスチン含量を図４に示す。エラスターゼ処理を行わなかった肝細胞と比して、細胞あたりのエラスチン含量は、いずれの濃度のエラスターゼ溶液処理においても減少した。また、処理した肝細胞の１ｃｍ２あたりの接着細胞数が特に多かったのは、濃度が１Ｕ／ｍＬ、２Ｕ／ｍＬのエラスターゼ溶液であった。なお、棒グラフの値は各濃度における平均値を、エラーバーは標準偏差を示す。
　また、単位面積あたりの接着細胞数が特に多かった２Ｕ／ｍＬエラスターゼ溶液を用いて、さらに５種の非接着性ロット由来の肝細胞（Lot：CyHum17009、CyHum17017、CyHum17020、CyHuf20001、CHf2006（Cytes Biotechnologies社）に対しても、上記と同様のタンパク質分解酵素処理を行い、１２穴プレートに播種し、２４時間培養した後に、単位面積あたりの接着細胞数及び細胞あたりのエラスチン含量を計測した。この際、接着性ロット由来の肝細胞（Lot：LHuf17905B、BHum16029、BHum16059（Cytes Biotechnologies社））についても１２穴プレートに播種し、２４時間培養した後に、接着細胞数とエラスチン含量の計測を行った。
　１２穴プレートで２４時間培養した後の細胞あたりのエラスチン含量、及び１ｃｍ２あたりの接着細胞数を図５に示す。棒グラフの値は全ロットの平均値を、直線で結ばれた黒点は各ロットにおけるエラスターゼ溶液処理前及び処理後の値を示す。エラスターゼ溶液処理後の非接着性ロット由来の肝細胞について、エラスチンは処理前と比較して６５～７５％除去されており、また接着性ロット由来の細胞と比較して、エラスチン含量が同等かまたは少なくなった。また接着細胞数は処理前と比較して１．４～３倍となり、接着性ロット由来の細胞と比較して接着細胞数が多くなったロットが存在した。
　なお、エラスターゼ処理による肝細胞機能への影響を検討すべく、エラスターゼ溶液による処理前および処理後の肝細胞からトータルＲＮＡを抽出してマイクロアレイ分析を行った。その結果、エラスターゼ処理前と処理後で発現数が変化する遺伝子は少なく、すなわち肝細胞の特性はエラスターゼ処理前と処理後でほとんど変わらなかった。これにより、エラスターゼ溶液処理は肝細胞の機能には影響しないことが示唆された。
　＜実験例２：肝組織からの肝細胞の分離＞
　ヒト肝細胞は通常、肝組織にコラゲナーゼを灌流させることによって、肝組織から分離される。本実験例では分離操作において、コラゲナーゼ・エラスターゼ混合溶液で灌流する事により、コラゲナーゼ単独溶液による灌流と比して組織重量あたりの分離細胞数が向上するか検討した。また、トリパンブルー染色により、分離した細胞の生存率を計測した。分離した細胞についても実験例１と同様に、播種培地に再懸濁して１２穴プレートに播種し、２４時間培養した後に、単位面積あたりの接着細胞数を計測した。なお、１２穴プレートはコラーゲンコートが施されていた。また、各穴に播種された細胞数は、実質的に同等と見做せる範囲内である。
　具体的には、生体肝移植のドナー由来のヒト肝組織を、ドナーの同意を得て利用し、このヒト肝組織を２分割した後、一方をコラゲナーゼ単独溶液で、他方をコラゲナーゼ・エラスターゼ混合溶液で灌流し、ヒト初代培養肝細胞を分離した。
　灌流の手法の概要を後述する。まず肝組織断面に露出している血管断端より生理食塩水を注入し、脱血・洗浄処置を行った。門脈または中心静脈に灌流用のチューブを挿入し、糸にて結紮または接着剤（アロンアルファ）で固定した。灌流液を入れたビーカーに浸漬し、３７℃の温浴槽で加温しながら灌流した。灌流液の流速は８００～９００ｍｍＨ２Ｏの範囲であり、灌流は２０分間行った。灌流液（コラゲナーゼ・エラスターゼ混合溶液）はＨＥＰＥＳ　１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＣａＣｌ２　５ｍＭ、コラゲナーゼ２５０Ｕ／ｍＬ、エラスターゼ２Ｕ／ｍＬ、を含むHanks' Balanced salt solution（ハンクス液）であった。なお、灌流液（コラゲナーゼ単独溶液）は、エラスターゼを含まないこと以外は、灌流液（コラゲナーゼ・エラスターゼ混合溶液）と同じ組成である。
　２例のドナーについて検討を行った結果を表１に示す。コラゲナーゼ・エラスターゼ混合溶液の灌流による分離は、組織重量あたりの分離細胞数および単位面積あたり接着細胞数について、ともにコラゲナーゼ単独溶液の灌流よりも顕著に高かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明は、医療分野あるいは研究において、ヒト肝細胞を接着培養する際に利用することができ、接着性肝細胞の安定的な供給に寄与するものと期待される。

 

Claims (10)

  1. 　接着性が改善された肝細胞の製造方法であって、
    　肝細胞から、細胞外マトリックスの少なくとも一部を除去する工程を含む、製造方法。
  2. 　前記細胞外マトリックスの少なくとも一部を除去する工程では、細胞外マトリックス中のエラスチンの少なくとも一部を除去する、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記細胞外マトリックスの少なくとも一部を除去する工程は、肝細胞をエラスターゼで処理することによって行われる、請求項２に記載の方法。
  4. 　細胞外マトリックスの少なくとも一部が除去される上記肝細胞は、市販の肝細胞であるか、又は、コラゲナーゼ灌流で肝組織から分離した肝細胞である、請求項１に記載の方法。
  5. 　肝細胞の製造方法であって、
    　肝組織から肝細胞を分離する工程において、細胞外マトリックスに含まれるエラスチンの少なくとも一部を除去する、製造方法。
  6. 　前記肝組織から肝細胞を分離する工程は、肝組織をエラスターゼで処理することによって行われる、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記肝組織はコラゲナーゼでも処理される、請求項６に記載の方法。
  8. 　エラスターゼを含む、肝細胞の接着性改善剤。
  9. 　細胞外マトリックスのエラスチンの少なくとも一部が除去されてなる、肝細胞。
  10. 　請求項１又は５に記載の方法によって製造されてなる、請求項９に記載の肝細胞。
PCT/JP2023/018685 2022-05-24 2023-05-19 肝細胞の製造方法、肝細胞の接着性改善剤、および肝細胞 WO2023228873A1 (ja)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JPH11501517A (ja) * 1995-03-16 1999-02-09 クノル アクチエンゲゼルシャフト 細胞を製出するためおよび創傷治療用の定義された新規酵素混合物
JP2006506971A (ja) * 2002-07-19 2006-03-02 ヴェスタ セラピューティクス，インコーポレーテッド 肝性幹／前駆細胞を含む生存能のあるヒト肝臓細胞を得る方法
CN102061284A (zh) * 2010-06-13 2011-05-18 南方医科大学珠江医院 人原代肝细胞分离培养方法

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