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WO2023043232A1 - 항-TNFα 항체를 포함하는 약제학적 조성물 - Google Patents

항-TNFα 항체를 포함하는 약제학적 조성물 Download PDF

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Publication number
WO2023043232A1
WO2023043232A1 PCT/KR2022/013800 KR2022013800W WO2023043232A1 WO 2023043232 A1 WO2023043232 A1 WO 2023043232A1 KR 2022013800 W KR2022013800 W KR 2022013800W WO 2023043232 A1 WO2023043232 A1 WO 2023043232A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mannitol
succinate
formulation
glycine
glycerol
Prior art date
Application number
PCT/KR2022/013800
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
박미정
진석민
Original Assignee
주식회사 에이프로젠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 에이프로젠 filed Critical 주식회사 에이프로젠
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Priority to KR1020247011765A priority patent/KR20240073051A/ko
Priority to AU2022348349A priority patent/AU2022348349A1/en
Publication of WO2023043232A1 publication Critical patent/WO2023043232A1/ko

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    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
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    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Definitions

  • the present application relates to stable pharmaceutical compositions comprising high concentrations of anti-TNFa antibodies.
  • Tumor necrosis factor alpha is a naturally occurring mammalian cytokine produced by various cell types, including monocytes and macrophages, in response to endotoxins or other stimuli. TNF ⁇ is a key mediator of inflammatory, immune, and physiopathological responses.
  • TNF ⁇ is upregulated in a variety of chronic diseases such as rheumatoid arthritis (RA), inflammatory bowel disease including Crohn's disease and ulcerative colitis, sepsis, congestive heart failure, asthma, multiple sclerosis, and the like.
  • RA rheumatoid arthritis
  • inflammatory bowel disease including Crohn's disease and ulcerative colitis
  • sepsis congestive heart failure
  • asthma multiple sclerosis
  • Adalimumab (Humira®, AbbVie, Inc.) is a recombinant human IgG1 monoclonal antibody specific for human TNF ⁇ . This antibody is also known as D2E7. Adalimumab is disclosed and claimed in US Pat. No. 6,090,382. Adalimumab neutralizes the biological function of TNF ⁇ by specifically binding to TNF ⁇ and blocking its interaction with p55 and p75 cell surface TNF ⁇ receptors.
  • the present application provides an aqueous liquid composition for enhancing the stability of a protein drug, specifically an antibody, more specifically an anti-TNF ⁇ antibody.
  • a pharmaceutical composition wherein the pH is between 4 and 7.5.
  • Another example is
  • aqueous liquid composition has a pH of 4 to 7.5.
  • Another example is
  • a method for enhancing the stability of an anti-TNF ⁇ antibody in a liquid formulation wherein the aqueous liquid composition has a pH of 4 to 7.5 is provided.
  • the buffer may be at least one selected from the group consisting of phosphate, succinate, acetate, and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • the excipient may be at least one selected from the group consisting of mannitol, glycerol, glycine, and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • the surfactant may be polysorbate 20.
  • the anti-TNF ⁇ antibody may be adalimumab.
  • the adalimumab may be included at a concentration of 80 mg/ml, 100 mg/ml, 120 mg/ml, 150 mg/ml, or 200 mg/ml, such as 100 mg/ml.
  • the present application provides an aqueous liquid composition (aqueous liquid antibody formulation) with enhanced antibody stability.
  • the aqueous liquid composition may include the ingredients described below and a remaining amount of an aqueous medium (water (purified water), physiological saline, water for injection, etc.).
  • aqueous liquid composition As used herein, the terms “aqueous liquid composition”, “pharmaceutical composition”, “formulation”, “liquid formulation”, and “liquid antibody formulation” all refer to a composition comprising an antibody (eg, adalimumab). So, they can be used interchangeably.
  • an anti-TNF ⁇ antibody refers to an antibody that binds to TNF ⁇ and modulates its biological activity.
  • the anti-TNF ⁇ antibody may be in the form of a full-length antibody or an antibody fragment containing an antigen-binding portion thereof, but is not particularly limited thereto.
  • the anti-TNF ⁇ antibody may be a human immunoglobulin G1 monoclonal antibody, and more specifically, adalimumab (human IgG1 kappa).
  • Adalimumab also called D2E7
  • Humira is sold in a dosage form under the trade name Humira. After obtaining marketing approval as a treatment for rheumatoid arthritis, Humira is used to treat Crohn's disease, ankylosing spondylitis, psoriatic arthritis, and ulcerative colitis. Information on adalimumab is readily available to those skilled in the art in known databases.
  • Adalimumab in the pharmaceutical compositions provided herein can be included in a therapeutically effective amount.
  • the concentration (content) of adalimumab in the pharmaceutical composition is about 80 mg/ml to about 200 mg/ml, about 80 mg/ml to about 150 mg/ml, about 80 mg/ml to about 120 mg /ml, about 80 mg/ml to about 100 mg/ml, about 100 mg/ml to about 200 mg/ml, about 100 mg/ml to about 150 mg/ml, or about 100 mg/ml to about 120 mg/ml ml, such as about 80 mg/ml, about 100 mg/ml, about 120 mg/ml, about 150 mg/ml, or about 200 mg/ml.
  • the pharmaceutical composition provided herein has excellent stability even when the antibody is contained at a relatively high concentration (specifically, 80 mg/ml or more, 100 mg/ml or more, 120 mg/ml or more, or 150 mg/ml or more). characterized by
  • Buffers in antibody formulations may function, such as adjusting the pH of the formulation.
  • Buffers that can be included in the pharmaceutical composition provided herein may include one or more selected from the group consisting of succinate, phosphate, acetate, and pharmaceutically acceptable salts thereof, and may be used in an aqueous solution state.
  • the pharmaceutically acceptable salt may include one or more selected from the group consisting of sodium salt (eg, sodium-phosphate, sodium-succinate, etc.), potassium salt, etc., but is not limited thereto.
  • the buffer includes at least one selected from the group consisting of succinate, phosphate, and pharmaceutically acceptable salts thereof, and is composed of acetate, histidine, citrate, and pharmaceutically acceptable salts thereof. It may be one that does not contain one or more (eg, all of them) selected from the group.
  • the buffer solution contains at least one selected from the group consisting of succinate and pharmaceutically acceptable salts thereof, and the group consisting of phosphate, histidine, acetate, citrate, and pharmaceutically acceptable salts thereof. It may not include one or more (eg, all of them) selected from.
  • the buffer based on the total pharmaceutical composition, about 1 mM to about 50 mM, about 1 mM to about 40 mM, about 1 mM to about 30 mM, about 1 mM to about 20 mM, about 1 mM to about 10 mM , about 3 mM to about 50 mM, about 3 mM to about 40 mM, about 3 mM to about 30 mM, about 3 mM to about 20 mM, about 3 mM to about 10 mM, about 5 mM to about 50 mM, about 5 mM to about 40 mM, about 5 mM to about 30 mM, about 5 mM to about 20 mM, about 5 mM to about 10 mM, about 8 mM to about 50 mM, about 8 mM to about 40 mM, about 8 mM to about 30 mM, about 8 mM to about 20 mM, about 8 mM to about 10 mM, about 10
  • An excipient that can be included in the pharmaceutical composition provided herein may include one or more selected from the group consisting of mannitol, glycerol, glycine, glucose, and glutamic acid. More specifically, the excipient is mannitol alone; At least one selected from the group consisting of mannitol, glycerol, glycine, glucose, and glutamic acid; or mannitol, and at least one selected from the group consisting of glycerol and glycine. In one embodiment, the excipient may include mannitol, a combination of mannitol and glycerol, or a combination of mannitol and glycine.
  • the excipient may include mannitol, a combination of mannitol and glycerol, or a combination of mannitol and glycine, but not glucose.
  • the excipient may include mannitol, a combination of mannitol and glycerol, or a combination of mannitol and glycine, but not glucose and glutamic acid.
  • the excipient is, based on the total pharmaceutical composition, about 5mM to about 350mM, about 5mM to about 300mM, about 5mM to about 270mM, about 10mM to about 350mM, about 10mM to about 300mM, about 10mM to about 270mM, about 20mM to about 20mM About 350 mM, about 20 mM to about 300 mM, about 20 mM to about 270 mM, about 25 mM to about 350 mM, about 25 mM to about 300 mM, about 25 mM to about 270 mM, about 50 mM to about 350 mM, about 50 mM to about 300 mM, about 50 mM to about 270 mM , about 75 mM to about 350 mM, about 75 mM to about 300 mM, about 75 mM to about 270 mM, about 100 mM to about 350 mM, about 100 mM to about 300 mM, or about
  • mannitol is about 5.5 mM to about 55 mM, about 5.5 mM to about 41.25 mM, about 5.5 mM to about 27.5 mM, about 5.5 mM to about 22 mM, about 5.5 mM to about 16.5 mM, based on the total pharmaceutical composition.
  • Glycerol based on the total pharmaceutical composition, is about 162 mM to about 326 mM, about 162 mM to about 300 mM, about 162 mM to about 272 mM, about 162 mM to about 239 mM, about 217 mM to about 326 mM, about 217 mM to about 300 mM, about 217 mM to about 272 mM, about 217 mM to about 239 mM, about 239 mM to about 326 mM, about 239 mM to about 300 mM, about 239 mM to about 272 mM, or about 239 mM (or 1.5% (w/v) to 3% (w/v), 1.5% ( w/v) to 2.75% (w/v), 1.5% (w/v) to 2.5% (w/v), 1.5% (w/v) to 2.2% (w/v), 2% (w/v), 2% (w/v) v) to
  • the pharmaceutical composition as an excipient,
  • the surfactant that can be included in the pharmaceutical composition provided herein may be selected from all pharmaceutically acceptable surfactants that can evenly disperse the protein in the liquid composition medium.
  • the surfactant may be a nonionic surfactant, specifically, polysorbates (e.g., polysorbate 20 (polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate), polysorbate 40 (polyethylene 20 sorbitan monopalmitate), polysorbate 60 (polyethylene 20 sorbitan monostearate), polysorbate 65 (polyethylene 20 sorbitan tristearate), polysorbate 80 (polyethylene 20 sorbitan monooleate), polysorbate 85 (polyethylene 20 sorbitan trioleate) (the number (20) after polyoxyethylene is the total number of oxyethylene groups (-(CH2CH2O)-) It means), polyoxyethylene-polypropylene block copolymers (Polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymers; poloxamers; for example, Poloxamer 188 (
  • the surfactant may include polysorbate 20 or polysorbate 80, more specifically polysorbate 20. More specifically, the surfactant includes polysorbate 20 and includes polysorbate 80. Thus, one or more or all of the surfactants described above may not be included.
  • the surfactant based on the total pharmaceutical composition, 0.001 to 5% (w / v), 0.001 to 3% (w / v), 0.001 to 1% (w / v), 0.001 to 0.5% (w / v) ), 0.001 to 0.3% (w / v), 0.001 to 0.2% (w / v), 0.001 to 0.1% (w / v), 0.001 to 0.05% (w / v), 0.001 to 0.02% (w / v) ), 0.001 to 0.01% (w / v), 0.005 to 5% (w / v), 0.005 to 3% (w / v), 0.005 to 1% (w / v), 0.005 to 0.5% (w / v) ), 0.005 to 0.3% (w / v), 0.005 to 0.2% (w / v), 0.005 to 0.1% (w / v), 0.005 to 0.05% (w /
  • the pharmaceutical composition provided herein may further include a pharmaceutically acceptable carrier and/or diluent.
  • a pharmaceutically acceptable carrier and/or diluent are commonly used, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, poly One selected from the group consisting of vinylpyrrolidone, cellulose, water (eg, purified water), physiological saline, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, etc. It may include the above, but is not limited thereto.
  • a pharmaceutical composition provided herein may not contain one or more or all of the following salts:
  • sodium salts eg sodium chloride, sodium sulfate, etc.
  • ammonium salts eg, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium carbonate, ammonium nitrate, etc.
  • the pharmaceutical composition provided herein has a pH of about 4 to about 7.5, about 4 to about 7, about 4 to about 6.5, about 4 to about 6, about 4 to about 5.5, about 4 to about 5, about 4.5 to about 7.5, about 4.5 to about 7, about 4.5 to about 6.5, about 4.5 to about 6, about 4.5 to about 5.5, about 4.5 to about 5, about 4.7 to about 7.5, about 4.7 to about 7, about 4.7 to about 6.5, about 4.7 to about 6, about 4.7 to about 5.5, about 4.7 to about 5, about 5.0 to about 7.5, about 5.0 to about 7, about 5.0 to about 6.5, about 5.0 to about 6, about 5.0 to about 5.5, About 5.3 to about 7.5, about 5.3 to about 7.2, about 5.3 to about 7, about 5.3 to about 6.8, about 5.3 to about 6.5, about 5.3 to about 5.5, about 5.5 to about 7.5, about 5.5 to about 7.2, about 5.5 to about 7, about 5.5 to about 6.8, about 5.5 to about 6.5, about 5.5 to about
  • the pharmaceutical composition provided herein is characterized by excellent stability.
  • excellent stability or “remains stable” may mean that the structure, and/or physical, chemical, and/or biological properties of a protein in a composition are maintained during storage (e.g., storage low protein aggregation rate, low protein degradation rate, low foreign particle content (number), high main component content, low charge denaturation rate, etc.).
  • the aggregation rate may refer to a rate (degree) at which the antibody is aggregated to form a high molecular weight (HMW; aggregate) in the formulation.
  • the degradation rate may refer to a rate (degree) at which the antibody is aggregated to form a low molecular weight product (LMW; degradation product) in the formulation.
  • LMW low molecular weight product
  • the foreign particle means an impurity included in the formulation, and may mean a particle having an average particle diameter of about 5 ⁇ m or more.
  • the content of the main component may refer to the content of the antibody in the form of a monomer (not aggregated and degraded) in the formulation.
  • the charge denaturation rate may refer to a rate (degree) at which acidic variants and/or basic variants are generated by denaturing the net charge of the antibody surface in the formulation.
  • composition liquid antibody formulation
  • antibody at a high concentration (specifically, at least 80 mg/ml, at least 100 mg/ml, at least 120 mg/ml, or at least 150 mg/ml; the upper limit may be 200 mg/ml) do,
  • the buffer does not contain at least one selected from the group consisting of succinate, phosphate, acetate, and pharmaceutically acceptable salts thereof (e.g., succinate or pharmaceutically acceptable salts thereof), and/or as an excipient.
  • "stability is improved" e.g., low protein aggregation rate during storage, low protein degradation rate, low foreign particle content (number), high active ingredient content, low denaturation rate, etc.
  • the "stability is improved” means that the composition provided herein,
  • the buffer does not contain at least one selected from the group consisting of succinate, phosphate, acetate, and pharmaceutically acceptable salts thereof (e.g., succinate or pharmaceutically acceptable salts thereof), and/or as an excipient.
  • low protein aggregation rate, low protein degradation rate, low foreign particle content (number), high main component content, and/or low denaturation rate under stress conditions eg, Agitation stress and/or Freeze-thaw stress
  • the pharmaceutical composition provided herein may be isotonic with a living body.
  • the liquid composition has an osmotic pressure of about 200 mOsm/kg to about 550 mOsm/kg, about 200 mOsm/kg to about 500 mOsm/kg, about 200 mOsm/kg to about 400 mOsm/kg, about 250 mOsm/kg to about 400 mOsm/kg, about 200 mOsm/kg to about 350 mOsm/kg, about 250 mOsm/kg to about 350 mOsm/kg, about 200 to about 300 mOsm/kg or about 250 to about 300 mOsm/kg can
  • the pharmaceutical composition provided herein may be administered through an oral or parenteral route.
  • parenteral administration e.g., injection
  • intravenous administration subcutaneous administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, rectal administration, intratumoral administration, etc.
  • the protein when administered orally, since the protein is digestible, it may be formulated to coat the active ingredient protein or to protect it from degradation in the stomach.
  • a formulation containing an antibody at a relatively high concentration (specifically, 80 mg/ml or more, 100 mg/ml or more, 120 mg/ml or more, or 150 mg/ml or more) with excellent stability is provided.
  • Adalimumab anti-TNF ⁇ monoclonal antibody; CAS Registry Number: 331731-18-1; DrugBank Accession Number DB00051 was self-produced and used.
  • Adalimumab light chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 1):
  • Adalimumab heavy chain amino acid sequence (SEQ ID NO: 2):
  • Buffer is 4 types of 10 ⁇ 20mM histidine, phosphate, succinate, and acetate, 10 ⁇ 300mM glucose, glycerol, mannitol, glycine, and ethanol are 5 types of excipients, pH is selected from the range of 4 ⁇ 6.5 did Surfactants were selected through screening for Polysorbate 20 (PS20), Polysorbate 80 (PS80), and Pluronic® F68 (poloxamer 188; F-68) at concentrations of 0.01% to 0.1%. The selected formulation conditions were applied to adalimumab through dialysis or buffer exchange through centrifugation.
  • the concentration of adalimumab in the formulation was adjusted in the range of 1 to 200 mg/mL.
  • Each formulation containing adalimumab at a concentration of 100 mg/mL was stored at -70°C for 3 months, then diluted to a concentration of adalimumab at 1 mg/mL, and changes in charge variants were measured by CEX-HPLC.
  • Tm melting temperature, protein melting point
  • the stability of the formulation was evaluated by measuring the degradation and aggregation characteristics of the antibody in the formulation using SE-HPLC (Size Exclusion High Performance Liquid Chromatography).
  • adalimumab to which each formulation was applied was diluted to a concentration of 1 mg/ml with a mobile phase (50 mM Sodium Phosphate, 0.15 M Sodium Chloride, pH 6.8) containing 0.001% PS80.
  • Adalimumab monomer main peak; %), high molecular weight (HMW; %), low molecular weight ( The change in the amount of low molecular weight (LMW; %) was measured.
  • HMW High molecular weight
  • LMW Low molecular weight
  • main peak ⁇ area of main peak /area of (HMW + main peak + LMW) ⁇ * 100)
  • Insoluble foreign particles in the formulation were identified using MFI (Micro-Flow Imaging) or FlowCAM.
  • adalimumab stock solution or a 1:1 diluted solution was mixed with FlowCAM from Fluid Imaging Technologies or MFI5200 from ProteinSimple to insoluble foreign particles (>5 ⁇ m (more than 5 ⁇ m)) in formulation conditions containing adalimumab. , >10 ⁇ m (greater than 10 ⁇ m), or >25 ⁇ m (greater than 25 ⁇ m)) were measured.
  • Formulation stability was evaluated by measuring the net charge difference characteristic of the surface of the antibody in the formulation using CEX-HPLC (Cation Exchange High Performance Liquid Chromatography; Cation Exchange HPLC).
  • adalimumab to which each formulation was applied was diluted to a concentration of 1 mg/ml with mobile phase A (10 mM Sodium Phosphate, pH 7.0). 20 ul of the diluted adalimumab solution was coupled to a Propac WCX-10 column using an Agilent (1100 or 1260) instrument.
  • Pre-Peaks ⁇ area of Pre-Peaks/area of (Pre-Peaks + Main Peak + Post-Peaks) ⁇ *100)
  • thermo stability of adalimumab was measured for 30 formulation conditions prepared according to Example 1 (see Table 2 below).
  • Buffer was selected from 3 types of 20mM histidine, phosphate, and succinate
  • excipient was selected from 5 types of 200mM glucose, glycerol, mannitol, 100mM glycine, and 6% glycine
  • pH was selected from 2 types of 5 and 6.5, respectively, for a total of 30 formulations. has been prepared.
  • As a control formulation it was prepared by applying the same 42 mg/ml mannitol and 0.1% PS80 conditions as the Humira (AbbVie) formulation to self-produced adalimumab.
  • adalimumab 13 mg was placed in an Amicon Ultra centrifugal filter, diluted 10 to 50 times with solutions of the above 30 formulations and control formulations, and then volumetric Centrifugation was performed at 4000g until the was reduced to 1/10, and this process was repeated a total of 3 times to complete the formulation.
  • Adalimumab was diluted to 1.0 mg/ml using the same formulation solution and thermal stability was evaluated.
  • the thermal stability evaluation was performed by measuring Tm with reference to the method of Reference Example 2.1.
  • a formulation was prepared by combining the buffer conditions and excipient conditions confirmed to have excellent thermal stability in Example 2, and the solubility of adalimumab (soluble aggregate) was tested.
  • a total of 12 formulations were prepared by selecting two types of 20 mM phosphate or succinate as a buffer, three types of glycerol, mannitol, and glycine as excipients, and two types of pH 5 and 6.5 (Table 3 below). reference).
  • As a control formulation 42 mg/ml mannitol, 0.1% PS80, pH 5.2, which are the same conditions as the Humira (AbbVie) formulation, were prepared and compared and evaluated.
  • adalimumab antibody about 120 mg/ml adalimumab, 42 mg/ml mannitol solution
  • adalimumab antibody about 120 mg/ml adalimumab, 42 mg/ml mannitol solution
  • an Amicon Ultra centrifugal filter was put into an Amicon Ultra centrifugal filter and centrifuged at 4000 g until the concentration reached 200 mg/mL.
  • centrifugation was performed at 4000g until the volume decreased to 1/10. This process was repeated a total of three times, and additional centrifugation was performed so that the concentration of adalimumab was 200 mg/mL, thereby obtaining a liquid adalimumab formulation having a desired composition.
  • a surfactant was added to make the final concentration of adalimumab 100 mg/mL.
  • PS20, PS80, and F-68 were used as the surfactants.
  • PS20 and PS80 add 1% (w/v) solution to 0.01% (w/v), and for F-68, 10% (w/v) solution to 0.1% (w/v)
  • the formulation was prepared by adding as much as possible.
  • insoluble foreign particles (the number of particles having an average particle diameter of 5 ⁇ m or more) in the formulation were measured using FlowCAM with reference to the method of Reference Example 2.3.
  • test group using PS20 and PS80 as surfactants had a lower content of insoluble foreign particles compared to the test group using F-68.
  • test group using PS20 had a higher content of insoluble foreign particles. It was lower.
  • the buffer is 3 types of 10mM phosphate, succinate, and histidine
  • the excipient is 5 types of mannitol, glycine, glycerol, glucose, and glutamic acid
  • the pH is selected from 5 points between 4 and 6.2
  • the surfactant is 0.01
  • a total of 12 liquid formulations were prepared by adding % (w/v) PS20 (adalimumab concentration: 100 mg/ml).
  • As a control formulation it was prepared with 42 mg/ml mannitol, 0.1% PS80, pH 5.2, the same conditions as the Humira (AbbVie) formulation, and comparatively evaluated (adalimumab concentration: 100 mg/ml).
  • adalimumab (about 120 mg/ml adalimumab, 42 mg/ml mannitol solution) at a ratio of 1:1000, and then mixed well.
  • adalimumab solution to which PS20 was added dialysis was performed using a solution composed of buffer and excipient to exchange more than 10,000 times, and dilution or centrifugation was performed so that the concentration of adalimumab was 100mg/ml in each formulation condition.
  • a high-concentration adalimumab formulation was prepared.
  • Osmotic pressure (mmol/kg): Using a Model 2020 Freezing point Osmometer (Advanced Instruments), time zero osmotic pressure (mmol/kg) was measured according to the manufacturer's method;
  • Viscosity Inject 130ul of all samples into a glass syringe of m-VROC Rheometer (Rheosense) at a flow rate of 150ul/min and measure at time zero, 25 °C)
  • Main component content (main peak %) according to storage period at 5°C Form. No. 0W 1W 2W 4W 8W One 97.7 97.8 98 97.7 97.7 2 97.3 97.3 97.6 97.2 97.2 3 97.3 97.5 97.6 97.3 97.3 4 97.4 97.4 97.6 97.4 97.3 5 97 97.2 97.3 97 97 6 97 97.1 97.3 96.9 96.9 7 97 97.1 97.3 97 96.9 8 96 96.2 96.4 96 96 9 96.4 96.5 96.7 96.4 96.3 10 96.9 97.1 97.2 96.9 96.7 11 95.9 96.1 96.4 96 95.9 control group 95.1 95.6 95.8 95.3 95.3
  • Main component content (main peak %) according to storage period at 25°C Form. No. 0W 1W 2W 4W 8W One 97.7 97.8 97.9 97.4 97 2 97.3 97.2 97.3 96.6 96.2 3 97.3 97.3 97.3 96.7 96.2 4 97.4 97.2 97.2 96.5 95.8 5 97 96.8 96.8 96.2 95.7 6 97 96.8 96.7 96 95.2 7 97 96.8 96.7 95.7 94.4 8 96 95.8 95.8 94.9 94.3 9 96.4 96.1 96 95 93.3 10 96.9 96.6 96.5 95.3 93.6 11 95.9 95.6 95.4 94 91 control group 95.1 95.2 95.1 94.1 93.6
  • Main component content (main peak %) according to storage period at 40°C Form.
  • No. 0W 1W 2W 4W One 97.7 97.4 96.9 93.3 2 97.3 96.4 95.8 93.5 3 97.3 96.2 94.3 86.1 4 97.4 96 95 91.9 5 97 95.8 94.9 92.6 6 97 95.2 92.3 82.1 7 97 95.3 93.5 88.1 8 96 94.4 93.3 91 9 96.4 93.1 86.7 72.3 10 96.9 94.9 92.6 85.5 11 95.9 90.8 81.2 64.4 control group 95.1 94 92.9 90.8
  • High molecular weight content (HMW %) according to storage period at 5 ° C Form.
  • No. 0W 1W 2W 4W 8W One 2.2 2.1 1.9 2.1 2.1 2 2.6 2.6 2.3 2.6 2.6 3 2.6 2.5 2.3 2.5 2.6 4 2.6 2.5 2.2 2.5 2.5 5 2.9 2.8 2.5 2.8 2.9 6 2.9 2.8 2.6 2.9 2.9 7 2.9 2.8 2.6 2.9 3 8 3.9 3.7 3.5 3.8 3.9 9 3.5 3.4 3.1 3.5 3.5 10 3 2.8 2.7 3 3.1 11 4 3.8 3.5 3.9 4 control group 4.8 4.3 4 4.5 4.5
  • High molecular weight content (HMW %) according to storage period at 25 ° C Form.
  • No. 0W 1W 2W 4W 8W One 2.2 2 1.8 2.2 2.3 2 2.6 2.7 2.5 3.1 3.4 3 2.6 2.6 2.5 3 3.4 4 2.6 2.7 2.6 3.2 3.7 5 2.9 3 3 3.5 4 6 2.9 3.1 3 3.7 4.5 7 2.9 3.1 3.1 4 5.2 8 3.9 4.1 4 4.9 5.4 9 3.5 3.7 3.8 4.7 6.3 10 3 3.2 3.2 4.4 6 11 4 4.2 4.4 5.8 8.6 control group 4.8 4.7 4.7 5.6 6.1
  • High molecular weight content (HMW %) according to storage period at 40 ° C Form.
  • No. 0W 1W 2W 4W One 2.2 1.9 1.6 2.4 2 2.6 3.2 3.5 5.1 3 2.6 3.4 5 12.2 4 2.6 3.6 4.2 6.5 5 2.9 3.9 4.4 6.1 6 2.9 4.4 7 16.6 7 2.9 4.3 5.8 10.4 8 3.9 5.2 6.1 7.9 9 3.5 6.5 12.6 26.2 10 3 4.6 6.6 12.9 11 4 8.8 18 33.8 control group 4.8 5.7 6.5 8
  • MFI analysis was performed by referring to the method of Reference Example 2.3 to measure insoluble foreign particles.
  • Example 6 Evaluation of stability of formulations containing mannitol, glycerol and glycine under stress conditions
  • the buffer is 10mM phosphate, two types of succinate, the excipient is three types of glycerol, mannitol, and glycine, and the surfactant is two types of 0.1% (w / v) PS20 and 0.01% (w / v) PS20.
  • the pH was fixed at 5, and a total of 12 light yellow liquid formulations were prepared.
  • adalimumab 855 mg was placed in an Amicon Ultra centrifugal filter and centrifuged at 4000 g until the concentration reached 200 mg/mL. Thereafter, after diluting 5 times with a solution consisting of buffer and excipient of each formulation condition, centrifugation was performed at 4000g until the volume was reduced to 1/5. This process was repeated a total of three times, and PS20 was added to a concentration of 0.01% and 0.1% to prepare a high-concentration ( ⁇ 200 mg/mL) adalimumab formulation.
  • Formulation stability under stress conditions was tested for the 12 formulations prepared in Example 6.1 and the control formulation.
  • SE-HPLC was performed with reference to the method of Reference Example 2.2 to determine the main component content (main peak %), high molecular weight content (HMW %), and low molecular weight content (HMW %). was measured.
  • the stress was applied by Agitation stress or Freeze-thaw stress.
  • Agitation stress was applied by stirring the prepared formulation at room temperature (25°C) at 600 rpm for 3 days, and stored at 2-8°C for 1-2 days until analysis.
  • Freeze-thaw stress was given by repeating the process of freezing at -75°C for at least 1 hour and then thawing at room temperature (25°C) a total of 5 times, and stored at 2-8°C for 1-2 days until analysis. did
  • main component content main peak %
  • HMW high molecular weight content
  • % HMW low molecular weight content
  • Example 7 Evaluation of long-term freezing stability of formulations containing mannitol, glycerol, and glycine
  • Example 5 Based on the results of Example 5, eight formulations containing mannitol, glycerol, and glycine in various combinations as excipients were prepared.
  • the buffer was 10 mM succinate
  • the surfactant was 0.01% (w/v) PS20 or 0.01% (w/v) PS80
  • the excipient was selected from three types of mannitol, glycine, and glycerol
  • the pH was 5.2.
  • a total of 8 liquid formulations were prepared.
  • As a control formulation it was prepared under the same conditions as the Humira (AbbVie) formulation, 42mg/ml mannitol, 0.1% PS80, pH 5.2, and evaluated for comparison.
  • the long-term freezing stability of the eight formulations and the control formulation prepared in Example 7.1 was evaluated by confirming the difference in net charge on the surface of the antibody in the formulation (Charge variants).
  • the charge variants were identified by performing CEX-HPLC (cation exchange high performance liquid chromatography; Cation Exchange HPLC) with reference to the method described in Reference Example 2.4 to determine the main peak content (%), acid variant content (Acidic Variants, Pre -Peaks; %) and basic variants (Basic Variants, Post-Peaks; %) were measured and performed.
  • formulations 1, 2, 4, and 5, particularly combinations corresponding to formulations 1 and 4 showed relatively excellent stability.
  • Example 7.1 the eight formulations prepared in Example 7.1 and the control formulation were stored at -70 ° C for 3 months and then subjected to MFI (see Reference Example 2.3), and the results (Particles / mL) are shown in Table 19:

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Abstract

항-TNFα 항체를 포함하는 안정한 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 약제학적 조성물은 항-TNFα 항체를 고농도로 포함하면서도 안정한 것을 특징으로 한다.

Description

항-TNFα 항체를 포함하는 약제학적 조성물
관련 출원들과의 상호 인용
본 출원은 2021년 9월 16일자 대한민국 특허출원 제10-2021-0124326호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
본 출원은 항-TNFα 항체를 고농도로 포함하는 안정한 약제학적 조성물에 관한 것이다.
종양 괴사 인자 알파(TNFα)는 내독소 또는 다른 자극에 반응하여 단핵구 및 대식세포를 포함하는 다양한 세포 타입에 의해 생성되는, 자연 발생 포유동물 사이토킨이다. TNFα는 염증, 면역, 및 생리병리학적 반응의 주요 매개자이다.
TNFα의 수준 증가는 다양한 질병과 관련이 있다. 예를 들면, TNFα는 다양한 만성 질환, 예컨대, 류마티스 관절염(RA), 크론병 및 궤양성 대장염을 포함하는 염증성 장질환, 패혈증, 울혈성 심부전, 기천식, 다발성 경화증 등에서 상향조절된다.
한편,　아달리무맙(Humira®, AbbVie, Inc.)은 사람 TNFα에 특이적인 재조합 사람 IgG1 모노클로날 항체이다. 이러한 항체는 또한 D2E7로서 공지되어 있다.　아달리무맙은 미국 등록특허 제6,090,382호에 개시되고 특허청구되어 있다.　아달리무맙은 TNFα에 특이적으로 결합하고, p55 및 p75 세포 표면 TNFα 수용체와 이의 상호작용을 차단하여 TNFα의 생물학적 기능을 중화시킨다.
아달리무맙의 효능의 실질적인 손실 없이 장기간 저장 가능한　안정한 액상 제형의 개발이 필요하다.
본 출원에서는 단백질 약물, 구체적으로 항체, 더욱 구체적으로, 항-TNFα 항체의 안정성을 증진시키기 위한 수성(aqueous) 액상 조성물을 제공한다.
구체적으로, 일 예는
80 mg/ml 내지 200 mg/ml의 항-TNFα 항체;
완충액;
부형제; 및
계면활성제를 포함하고,
pH가 4 내지 7.5인, 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 예는,
80 mg/ml 내지 200 mg/ml의 항-TNFα 항체;
완충액;
부형제; 및
계면활성제
를 혼합하여 수성 액상 조성물을 제조하는 단계를 포함하고,
상기 수성 액상 조성물의 pH가 4 내지 7.5인, 안정한 항-TNFα 항체의 액상 제형의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 예는,
80 mg/ml 내지 200 mg/ml의 항-TNFα 항체;
완충액;
부형제; 및
계면활성제
를 혼합하여 수성 액상 조성물을 제조하는 단계를 포함하고,
상기 수성 액상 조성물의 pH가 4 내지 7.5인, 액상 제형 내 항-TNFα 항체의 안정성 증진 방법을 제공한다.
상기 조성물 및 방법에 있어서, 상기 완충액은 포스페이트, 숙시네이트, 아세테이트, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 조성물 및 방법에 있어서, 상기 부형제는 만니톨, 글리세롤, 글리신, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일수 있다.
상기 조성물 및 방법에 있어서, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트 20일 수 있다.
상기 조성물 및 방법에 있어서, 상기 항-TNFα 항체는 아달리무맙 (adalimumab)일 수 있다. 상기 아달리무맙은 80 mg/ml, 100 mg/ml, 120 mg/ml, 150 mg/ml, 또는 200 mg/ml 농도로 포함될 수 있으며, 예컨대 100 mg/ml 농도로 포함될 수 있다.
본 출원은 항체의 안정성이 증진된 수성(aqueous) 액상 조성물 (수성 액상 항체 제형)이 제공된다. 상기 수성 액상 조성물은 하기 기재된 성분 및 잔량의 수성 매질 (물 (정제수), 생리식염수, 주사 용수 등)을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 “수성의 액상 조성물”, “약제학적 조성물”, “제형”, “액상 제형”, 및 “액상 항체 제형”은 모두 항체(예컨대, 아달리무맙)을 포함하는 조성물을 의미하는 것으로, 상호 호환 사용 가능하다.
이하, 본 출원을 보다 상세히 설명한다.
항-TNFα 항체
본 발명에서 항-TNFα 항체는, TNFα에 결합하여 이의 생물학적 활성을 조절하는 항체를 말한다.
상기 항-TNFα 항체는 전장 항체 또는 이의 항원 결합 부위를 포함하는 항체 단편의 형태일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 상기 항-TNFα 항체는, 인간 면역글로불린 G1 단일클론성 항체일 수 있으며, 보다 구체적으로는 아달리무맙(adalimumab, human IgG1 kappa)일 수 있다.
아달리무맙은 D2E7이라고도 불리며, 휴미라라는 상품명의 제형으로 판매되고 있으며, 휴미라는 류마티스 관절염 치료제로 판매허가를 받은 후 크론병, 강직성 척추염, 건선성 관절염, 궤양성 대장염 등의 치료에 사용되고 있다. 아달리무맙에 대한 정보는 공지의 데이터베이스에서 당업자가 용이하게 입수할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물 내의 아달리무맙은 치료학적 유효량으로 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 약제학적 조성물 내의 아달리무맙의 농도(함량)는 약 80 mg/ml 내지 약 200 mg/ml, 약 80 mg/ml 내지 약 150 mg/ml, 약 80 mg/ml 내지 약 120 mg/ml, 약 80 mg/ml 내지 약 100 mg/ml, 약 100 mg/ml 내지 약 200 mg/ml, 약 100 mg/ml 내지 약 150 mg/ml, 또는 약 100 mg/ml 내지 약 120 mg/ml, 예컨대, 약 80 mg/ml, 약 100 mg/ml, 약 120 mg/ml, 약 150 mg/ml, 또는 약 200 mg/ml일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은 항체를 비교적 고농도(구체적으로, 80 mg/ml 이상, 100 mg/ml 이상, 120 mg/ml 이상, 또는 150 mg/ml 이상)로 함유하는 경우에도 안정성이 우수한 것을 특징으로 한다.
완충액 (Buffer)
항체 제형에서 완충액은 제형의 pH를 조절하는 등의 기능을 할 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물에 포함 가능한 완충액은 숙시네이트, 포스페이트, 아세테이트, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있고, 수용액 상태로 사용될 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 나트륨염(예컨대, sodium-phosphate, sodium-succinate 등), 칼륨염 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예에서, 상기 완충액은 숙시네이트, 포스페이트, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하고, 아세테이트, 히스티딘, 시트레이트, 및 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상(예컨대, 이들 모두)을 포함하지 않는 것일 수 있다. 다른 예에서, 상기 완충액은 숙시네이트 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하고, 포스페이트, 히스티딘, 아세테이트, 시트레이트, 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상(예컨대, 이들 모두)을 포함하지 않는 것일 수 있다.
상기 완충액은, 전체 약제학적 조성물 기준으로, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 약 1 mM 내지 약 40 mM, 약 1 mM 내지 약 30 mM, 약 1 mM 내지 약 20 mM, 약 1 mM 내지 약 10 mM, 약 3 mM 내지 약 50 mM, 약 3 mM 내지 약 40 mM, 약 3 mM 내지 약 30 mM, 약 3 mM 내지 약 20 mM, 약 3 mM 내지 약 10 mM, 약 5 mM 내지 약 50 mM, 약 5 mM 내지 약 40 mM, 약 5 mM 내지 약 30 mM, 약 5 mM 내지 약 20 mM, 약 5 mM 내지 약 10 mM, 약 8 mM 내지 약 50 mM, 약 8 mM 내지 약 40 mM, 약 8 mM 내지 약 30 mM, 약 8 mM 내지 약 20 mM, 약 8 mM 내지 약 10 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 40 mM, 약 10 mM 내지 약 30 mM, 또는 약 10 mM 내지 약 20 mM, 예컨대, 약 10 mM 또는 약 20mM의 농도로 포함될 수 있다.
부형제 (Excipient)
본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물에 포함 가능한 부형제는 만니톨, 글리세롤, 글리신, 글루코스, 및 글루탐산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 부형제는 만니톨 단독; 만니톨과, 글리세롤, 글리신, 글루코스, 및 글루탐산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상; 또는 만니톨과, 글리세롤 및 글리신으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 부형제는 만니톨, 만니톨 및 글리세롤의 조합, 또는 만니톨 및 글리신의 조합을 포함할 수 있다. 이 때, 상기 부형제는 만니톨, 만니톨 및 글리세롤의 조합, 또는 만니톨 및 글리신의 조합을 포함하고, 글루코스를 포함하지 않는 것일 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 부형제는 만니톨, 만니톨 및 글리세롤의 조합, 또는 만니톨 및 글리신의 조합을 포함하고, 글루코스 및 글루탐산을 포함하지 않는 것일 수 있다.
상기 부형제는, 전체 약제학적 조성물 기준으로, 약 5mM 내지 약 350mM, 약 5mM 내지 약 300mM, 약 5mM 내지 약 270mM, 약 10mM 내지 약 350mM, 약 10mM 내지 약 300mM, 약 10mM 내지 약 270mM, 약 20mM 내지 약 350mM, 약 20mM 내지 약 300mM, 약 20mM 내지 약 270mM, 약 25mM 내지 약 350mM, 약 25mM 내지 약 300mM, 약 25mM 내지 약 270mM, 약 50mM 내지 약 350mM, 약 50mM 내지 약 300mM, 약 50mM 내지 약 270mM, 약 75mM 내지 약 350mM, 약 75mM 내지 약 300mM, 약 75mM 내지 약 270mM, 약 100mM 내지 약 350mM, 약 100mM 내지 약 300mM, 또는 약 100mM 내지 약 270mM의 농도로 포함될 수 있다.
예컨대, 만니톨은, 전체 약제학적 조성물 기준으로, 약 5.5mM 내지 약 55mM, 약 5.5mM 내지 약 41.25mM, 약 5.5mM 내지 약 27.5mM, 약 5.5mM 내지 약 22mM, 약 5.5mM 내지 약 16.5mM, 약 5.5mM 내지 약 14mM, 약 8.25mM 내지 약 55mM, 약 8.25mM 내지 약 41.25mM, 약 8.25mM 내지 약 27.5mM, 약 8.25mM 내지 약 22mM, 약 8.25mM 내지 약 16.5mM, 약 8.25mM 내지 약 14mM, 또는 약 11mM (또는 0.1%(w/v) 내지 1%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.75%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.5%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.4%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.3%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.25%(w/v), 0.15%(w/v) 내지 1%(w/v), 0.15%(w/v) 내지 0.75%(w/v), 0.15%(w/v) 내지 0.5%(w/v), 0.15%(w/v) 내지 0.4%(w/v), 0.15%(w/v) 내지 0.3%(w/v), 0.15%(w/v) 내지 0.25%(w/v), 또는 0.2%(w/v))의 농도로 포함될 수 있다.
글리신은, 전체 약제학적 조성물 기준으로, 약 133mM 내지 약 400mM, 약 133mM 내지 약 333mM, 약 133mM 내지 약 293mM, 약 133mM 내지 약 266mM, 약 239mM 내지 약 400mM, 약 239mM 내지 약 333mM, 약 239mM 내지 약 293mM, 약 239mM 내지 약 266mM, 약 266mM 내지 약 400mM, 약 266mM 내지 약 333mM, 약 266mM 내지 약 293mM, 또는 약 266mM (또는 1%(w/v) 내지 3%(w/v), 1%(w/v) 내지 2.5%(w/v), 1%(w/v) 내지 2.2%(w/v), 1%(w/v) 내지 2%(w/v), 1.8%(w/v) 내지 3%(w/v), 1.8%(w/v) 내지 2.5%(w/v), 1.8%(w/v) 내지 2.2%(w/v), 1.8%(w/v) 내지 2%(w/v), 2%(w/v) 내지 3%(w/v), 2%(w/v) 내지 2.5%(w/v), 2%(w/v) 내지 2.2%(w/v), 또는 2%(w/v))의 농도로 포함될 수 있다.
글리세롤은, 전체 약제학적 조성물 기준으로, 약 162mM 내지 약 326mM, 약 162mM 내지 약 300mM, 약 162mM 내지 약 272mM, 약 162mM 내지 약 239mM, 약 217mM 내지 약 326mM, 약 217mM 내지 약 300mM, 약 217mM 내지 약 272mM, 약 217mM 내지 약 239mM, 약 239mM 내지 약 326mM, 약 239mM 내지 약 300mM, 약 239mM 내지 약 272mM, 또는 약 239mM (또는 1.5%(w/v) 내지 3%(w/v), 1.5%(w/v) 내지 2.75%(w/v), 1.5%(w/v) 내지 2.5%(w/v), 1.5%(w/v) 내지 2.2%(w/v), 2%(w/v) 내지 3%(w/v), 2%(w/v) 내지 2.75%(w/v), 2%(w/v) 내지 2.5%(w/v), 2%(w/v) 내지 2.2%(w/v), 2.2%(w/v) 내지 3%(w/v), 2.2%(w/v) 내지 2.75%(w/v), 2.2%(w/v) 내지 2.5%(w/v), 또는 2.2%(w/v))의 농도로 포함될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 약제학적 조성물은, 부형제로서,
(1) 약 5.5mM 내지 약 55mM, 약 5.5mM 내지 약 41.25mM, 약 5.5mM 내지 약 27.5mM, 약 5.5mM 내지 약 22mM, 약 5.5mM 내지 약 16.5mM, 약 5.5mM 내지 약 14mM, 약 8.25mM 내지 약 55mM, 약 8.25mM 내지 약 41.25mM, 약 8.25mM 내지 약 27.5mM, 약 8.25mM 내지 약 22mM, 약 8.25mM 내지 약 16.5mM, 약 8.25mM 내지 약 14mM, 또는 약 11mM (또는 0.1%(w/v) 내지 1%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.75%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.5%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.4%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.3%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.25%(w/v), 0.15%(w/v) 내지 1%(w/v), 0.15%(w/v) 내지 0.75%(w/v), 0.15%(w/v) 내지 0.5%(w/v), 0.15%(w/v) 내지 0.4%(w/v), 0.15%(w/v) 내지 0.3%(w/v), 0.15%(w/v) 내지 0.25%(w/v), 또는 0.2%(w/v))의 만니톨;
(2) (2-1) 약 5.5mM 내지 약 55mM, 약 5.5mM 내지 약 41.25mM, 약 5.5mM 내지 약 27.5mM, 약 5.5mM 내지 약 22mM, 약 5.5mM 내지 약 16.5mM, 약 5.5mM 내지 약 14mM, 약 8.25mM 내지 약 55mM, 약 8.25mM 내지 약 41.25mM, 약 8.25mM 내지 약 27.5mM, 약 8.25mM 내지 약 22mM, 약 8.25mM 내지 약 16.5mM, 약 8.25mM 내지 약 14mM, 또는 약 11mM (또는 0.1%(w/v) 내지 1%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.75%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.5%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.4%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.3%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.25%(w/v), 0.15%(w/v) 내지 1%(w/v), 0.15%(w/v) 내지 0.75%(w/v), 0.15%(w/v) 내지 0.5%(w/v), 0.15%(w/v) 내지 0.4%(w/v), 0.15%(w/v) 내지 0.3%(w/v), 0.15%(w/v) 내지 0.25%(w/v), 또는 0.2%(w/v))의 만니톨, 및 (2-2) 약 130mM 내지 약 400mM, 약 130mM 내지 약 335mM, 약 130mM 내지 약 270mM, 약 240mM 내지 약 400mM, 약 240mM 내지 약 335mM, 약 240mM 내지 약 270mM, 약 260mM 내지 약 400mM, 약 260mM 내지 약 335mM, 약 260mM 내지 약 270mM, 또는 약 266mM (또는 1%(w/v) 내지 3%(w/v), 1%(w/v) 내지 2.5%(w/v), 1%(w/v) 내지 2%(w/v), 1.8%(w/v) 내지 3%(w/v), 1.8%(w/v) 내지 2.5%(w/v), 1.8%(w/v) 내지 2%(w/v), 2%(w/v) 내지 3%(w/v), 2%(w/v) 내지 2.5%(w/v), 또는 2%(w/v))의 글리신; 또는
(3) (3-1) 약 5.5mM 내지 약 55mM, 약 5.5mM 내지 약 41.25mM, 약 5.5mM 내지 약 27.5mM, 약 5.5mM 내지 약 22mM, 약 5.5mM 내지 약 16.5mM, 약 5.5mM 내지 약 14mM, 약 8.25mM 내지 약 55mM, 약 8.25mM 내지 약 41.25mM, 약 8.25mM 내지 약 27.5mM, 약 8.25mM 내지 약 22mM, 약 8.25mM 내지 약 16.5mM, 약 8.25mM 내지 약 14mM, 또는 약 11mM (또는 0.1%(w/v) 내지 1%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.75%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.5%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.4%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.3%(w/v), 0.1%(w/v) 내지 0.25%(w/v), 0.15%(w/v) 내지 1%(w/v), 0.15%(w/v) 내지 0.75%(w/v), 0.15%(w/v) 내지 0.5%(w/v), 0.15%(w/v) 내지 0.4%(w/v), 0.15%(w/v) 내지 0.3%(w/v), 0.15%(w/v) 내지 0.25%(w/v), 또는 0.2%(w/v))의 만니톨, 및 (3-2) 약 162mM 내지 약 326mM, 약 162mM 내지 약 300mM, 약 162mM 내지 약 272mM, 약 218mM 내지 약 326mM, 약 218mM 내지 약 300mM, 약 218mM 내지 약 272mM, 약 239mM 내지 약 326mM, 약 239mM 내지 약 300mM, 약 239mM 내지 약 272mM, 또는 약 239mM (또는 1.5%(w/v) 내지 3%(w/v), 1.5%(w/v) 내지 2.75%(w/v), 1.5%(w/v) 내지 2.5%(w/v), 2%(w/v) 내지 3%(w/v), 2%(w/v) 내지 2.75%(w/v), 2%(w/v) 내지 2.5%(w/v), 2.2%(w/v) 내지 3%(w/v), 2.2%(w/v) 내지 2.75%(w/v), 2.2%(w/v) 내지 2.5%(w/v), 또는 2.2%(w/v))의 글리세롤
을 포함하는 것일 수 있다.
계면활성제 (Surfactant)
본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물에 포함 가능한 계면활성제는 단백질을 액상 조성물 매질에 고르게 분산시킬 수 있는 약학적으로 허용 가능한 모든 계면활성제들로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제일 수 있으며, 구체적으로, 폴리소르베이트류(예컨대, polysorbate 20(polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate), polysorbate 40(polyethylene 20 sorbitan monopalmitate), polysorbate 60(polyethylene 20 sorbitan monostearate), polysorbate 65(polyethylene 20 sorbitan tristearate), polysorbate 80(polyethylene 20 sorbitan monooleate), polysorbate 85(polyethylene 20 sorbitan trioleate)(상기 폴리옥시에틸렌 뒤의 수치 (20)은 옥시에틸렌기(-(CH2CH2O)-)의 총 개수를 의미함), 폴리옥시에틸렌-폴리프로필렌 블록 공중합체류(Polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymers; poloxamers; 예컨대, Poloxamer 188(Pluronic F-68) 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80, 보다 구체적으로 폴리소르베이트 20를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 상기 계면활성제는 폴리소르베이트 20를 포함하고, 폴리소르베이트 80를 포함하여 앞서 기재된 계면활성제 중 하나 이상 또는 모두를 포함하지 않는 것일 수 있다.
상기 계면활성제는, 전체 약제학적 조성물 기준으로, 0.001 내지 5%(w/v), 0.001 내지 3%(w/v), 0.001 내지 1%(w/v), 0.001 내지 0.5%(w/v), 0.001 내지 0.3%(w/v), 0.001 내지 0.2%(w/v), 0.001 내지 0.1%(w/v), 0.001 내지 0.05%(w/v), 0.001 내지 0.02%(w/v), 0.001 내지 0.01%(w/v), 0.005 내지 5%(w/v), 0.005 내지 3%(w/v), 0.005 내지 1%(w/v), 0.005 내지 0.5%(w/v), 0.005 내지 0.3%(w/v), 0.005 내지 0.2%(w/v), 0.005 내지 0.1%(w/v), 0.005 내지 0.05%(w/v), 0.005 내지 0.02%(w/v), 0.005 내지 0.01%(w/v), 0.01 내지 5%(w/v), 0.01 내지 3%(w/v), 0.01 내지 1%(w/v), 0.01 내지 0.5%(w/v), 0.01 내지 0.3%(w/v), 0.01 내지 0.2%(w/v), 0.01 내지 0.1%(w/v), 0.01 내지 0.05%(w/v), 0.01 내지 0.02%(w/v), 0.05 내지 5%(w/v), 0.05 내지 3%(w/v), 0.05 내지 1%(w/v), 0.05 내지 0.5%(w/v), 0.05 내지 0.3%(w/v), 0.05 내지 0.2%(w/v), 0.05 내지 0.1%(w/v), 예컨대, 약 0.01%(w/v) 또는 약 0.1%(w/v)의 농도로 포함될 수 있다.
기타 첨가제
본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 및/또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제는 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 슈크로오스, 솔비톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물(예컨대, 정제수), 생리식염수, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은 다음의 염 중 선택된 1종 이상 또는 모두를 포함하지 않을 수 있다:
- 나트륨염 (예컨대, 염화나트륨, 황산나트륨 등),
- 칼륨염 (예컨대, 염화칼륨, 수산화칼륨 등),
- 암모늄염 (예컨대, 염화암모늄, 황산암모늄, 탄산암모늄, 질산암모늄 등), 및
- 에틸렌다이아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)
pH
본 명세서에서 제공되는 상기 약제학적 조성물은 pH가 약 4 내지 약 7.5, 약 4 내지 약 7, 약 4 내지 약 6.5, 약 4 내지 약 6, 약 4 내지 약 5.5, 약 4 내지 약 5, 약 4.5 내지 약 7.5, 약 4.5 내지 약 7, 약 4.5 내지 약 6.5, 약 4.5 내지 약 6, 약 4.5 내지 약 5.5, 약 4.5 내지 약 5, 약 4.7 내지 약 7.5, 약 4.7 내지 약 7, 약 4.7 내지 약 6.5, 약 4.7 내지 약 6, 약 4.7 내지 약 5.5, 약 4.7 내지 약 5, 약 5.0 내지 약 7.5, 약 5.0 내지 약 7, 약 5.0 내지 약 6.5, 약 5.0 내지 약 6, 약 5.0 내지 약 5.5, 약 5.3 내지 약 7.5, 약 5.3 내지 약 7.2, 약 5.3 내지 약 7, 약 5.3 내지 약 6.8, 약 5.3 내지 약 6.5, 약 5.3 내지 약 5.5, 약 5.5 내지 약 7.5, 약 5.5 내지 약 7.2, 약 5.5 내지 약 7, 약 5.5 내지 약 6.8, 약 5.5 내지 약 6.5, 약 5.5 내지 약 6, 약 6.0 내지 약 7.5, 약 6.0 내지 약 7.2, 약 6.0 내지 약 7, 약 6.0 내지 약 6.8, 약 6.0 내지 약 6.5, 약 6.4 내지 약 7.5, 약 6.4 내지 약 7.2, 약 6.4 내지 약 7, 약 6.4 내지 약 6.8, 또는 약 6.4 내지 약 6.6, 예컨대, 약 4.0, 약 4.7, 약 5.0, 약 5.2, 또는 약 6.5인 것일 수 있다.
안정성
본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은 안정성이 우수한 것을 특징으로 한다. 본 명세서에서 "안정성이 우수하다" 또는 "안정하게 유지된다" 함은 보관 시에 조성물 내의 단백질의 구조, 및/또는 물리적, 화학적, 및/또는 생물학적 특성이 유지됨을 의미할 수 있다(예컨대, 보관 중의 낮은 단백질 응집률, 낮은 단백질 분해율, 낮은 이물입자 함량(개수), 높은 주성분 함량, 낮은 전하 변성률 등).
상기 응집률은 제형 내에서 항체가 응집되어 고분자 생성물(High Molecular Weight; HMW; 응집체(aggregate))을 형성하는 비율(정도)를 의미할 수 있다.
상기 분해율은 제형 내에서 항체가 응집되어 저분자 생성물(Low Molecular Weight; LMW; 분해물)을 형성하는 비율(정도)를 의미할 수 있다.
상기 이물입자는 제형 내에 포함된 불순물을 의미하는 것으로, 평균 입경이 약 5um 이상인 입자를 의미할 수 있다.
상기 주성분 함량은 제형 내의 모노머(응집 및 분해되지 않은) 형태의 항체 함량을 의미하는 것일 수 있다.
상기 전하 변성률은 제형 내 항체 표면의 순전하가 변성되어 산성 변형체(Acidic Variants) 및/또는 염기성 변형체(Basic Variants)가 생성되는 비율(정도)를 의미하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 조성물(액상 항체 제형)은,
항체 (항-TNFα 항체)를 고농도(구체적으로, 80 mg/ml 이상, 100 mg/ml 이상, 120 mg/ml 이상, 또는 150 mg/ml 이상; 상한값은 200 mg/ml일 수 있음)로 포함하고,
완충액으로 숙시네이트, 포스페이트, 아세테이트, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상(예컨대, 숙시네이트 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염)을 포함하지 않거나, 및/또는 부형제로서 만니톨 단독, 만니톨과, 글리세롤, 글리신, 글루코스, 및 글루탐산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 또는 만니톨과, 글리세롤 및 글리신으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하지 않거나, 및/또는 계면활성제로서 폴리소르베이트 20을 포함하지 않는 경우와 비교하여, “안정성이 증진된 것”(예컨대, 보관 중의 낮은 단백질 응집률, 낮은 단백질 분해율, 낮은 이물입자 함량(개수), 높은 주성분 함량, 낮은 변성률 등)일 수 있다.
예컨대, 상기 “안정성이 증진된 것”이라 함은, 본 명세서에서 제공되는 조성물이,
완충액으로 숙시네이트, 포스페이트, 아세테이트, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상(예컨대, 숙시네이트 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염)을 포함하지 않거나, 및/또는 부형제로서 만니톨 단독, 만니톨과, 글리세롤, 글리신, 글루코스, 및 글루탐산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 또는 만니톨과, 글리세롤 및 글리신으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하지 않거나, 및/또는 계면활성제로서 폴리소르베이트 20을 포함하지 않는 경우와 비교하여,
(1) 5℃ 내지 40℃ (예컨대, 5℃, 25℃, 및/또는 40℃)에서 1 내지 8주일 보관 시, 낮은 단백질 응집률, 낮은 단백질 분해율, 낮은 이물입자 함량(개수), 높은 주성분 함량, 및/또는 낮은 변성률을 나타내거나, 및/또는
(2) 스트레스 (예컨대, 교반 (Agitation) 스트레스 및/또는 Freeze-thaw 스트레스) 조건에서 낮은 단백질 응집률, 낮은 단백질 분해율, 낮은 이물입자 함량(개수), 높은 주성분 함량, 및/또는 낮은 변성률을 나타내거나, 및/또는
(3) 냉동 보관 (예컨대, -70℃ 조건에서 3개월간 저장) 후의 산성 변형체 및/또는 염기성 변형체의 함량이 낮은 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
삼투압
본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은 생체와 등장성인 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 액상 조성물은 삼투압이 약 200 mOsm/kg 내지 약 550 mOsm/kg, 약 200 mOsm/kg 내지 약 500 mOsm/kg, 약 200 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 약 250 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg, 약 200 mOsm/kg 내지 약 350 mOsm/kg, 약 250 mOsm/kg 내지 약 350 mOsm/kg, 약 200 내지 약 300 mOsm/kg 또는 약 250 내지 약 300 mOsm/kg 인 것일 수 있다.
투여경로
본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구적 경로로 투여되는 것일 수 있다. 비경구 투여 (예컨대, 주사)인 경우에는 정맥내 투여, 피하 투여, 근육 투여, 복강내 투여, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 종양내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질이 소화될 수 있기 때문에, 활성 성분인 단백질을 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 수 있다.
본 명세서에서는 항체를 비교적 고농도(구체적으로, 80 mg/ml 이상, 100 mg/ml 이상, 120 mg/ml 이상, 또는 150 mg/ml 이상)로 함유하면서도 안정성이 우수한 제형을 제공한다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다.
실시예 1. 항체 및 제형의 준비
항체의 화학적, 물리적 안정성이 우수한 제형 선정을 위하여, 다음과 같은 후보 제형들을 준비하였다.
항체로서 아달리무맙 (Adalimumab; anti-TNFα monoclonal antibody; CAS Registry Number: 331731-18-1; DrugBank Accession Number DB00051)은 자체 제작하여 사용하였다.
아달리무맙 경쇄 아미노산 서열 (서열번호 1):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
아달리무맙 중쇄 아미노산 서열 (서열번호 2):
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
버퍼는 10~20mM의 histidine, phosphate, succinate, 및 acetate의 4종류, 부형제(Excipient)는 10~300mM의 glucose, glycerol, mannitol, glycine, 및 ethanol의 5종류, pH는 4~6.5의 범위 중에서 선정하였다. 계면활성제(Surfactant)는 0.01%~0.1% 농도의 Polysorbate 20 (PS20), Polysorbate 80 (PS80), 및 Pluronic®　F68　(poloxamer 188; F-68)에 대하여 스크리닝을 통하여 선정하였다. 선정된 제형 조건들을 Dialysis 또는 원심분리를 통한 버퍼 교환을 통하여 아달리무맙에 적용하였다.
제형 내 아달리무맙 농도는 1~200mg/mL 범위에서 조절하였다.
아달리무맙 제형의 버퍼, 부형제, 및 계면활성제 조건을 하기의 표 1에 정리하였다:
Buffer Excipient Surfactant
Acetate Mannitol Polysorbate 20 (PS20)
Succinic Acid Glycine Polysorbate 80 (PS80)
Sodium Phosphate Glycerol Poloxamer 188 (F-68)
L-Histidine Dextrose(Glucose) 　
　 Ethanol 　
참고예 1. 스트레스 조건에서의 항체의 물성 시험
1.1. 아달리무맙 1mg/ml이 포함된 조건에서 20°C에서 95°C로의 온도변화를 적용시 아달리무맙의 구조적 변화를 DSF로 측정하였다.
1.2. 제형 조건에서 아달리무맙의 농도를 200mg/mL까지 농축하면서 아달리무맙 단량체 양의 변화를 SE-HPLC로 측정하였다.
1.3. 아달리무맙 100mg/ml이 포함된 조건에서 8주간 5°C, 25°C, 또는 40°C에서 보관시 아달리무맙 단량체 양의 변화를 SE-HPLC로 측정하고 MFI로 불용성 이물 입자의 개수를 측정하였다.
1.4. ~200mg/mL 농도의 아달리무맙이 포함된 조건에 PS20 첨가 후, 각각 3일간의 600rpm agitation 스트레스와 5번의 Freeze-Thaw 스트레스 부여하고, 아달리무맙 농도를 1mg/mL로 희석하여 단량체량의 변화를 SE-HPLC로 측정하였다.
1.5. 100mg/mL 농도의 아달리무맙을 포함하는 각 제형을 -70℃ 조건에서 3개월간 저장한 후, 아달리무맙 농도 1mg/mL로 희석하여 Charge variants 변화를 CEX-HPLC로 측정하였다.
참고예 2. 항체의 물성 시험 방법
상기 실시예 1에서 준비된 제형 내에서의 아달리무맙의 화학적, 물리적 안정성을 평가하였다.
2.1. 열안정성 평가
열안정성 평가를 위하여 버퍼 교환된 아달리무맙 1mg/ml 8.8ul를 UNChained Labs사의 UNCLE 장비를 사용하여 DSF (Differential scanning fluorimetry)로 Tm (melting temperature, 단백질의 녹는점)값을 측정하였다. DSF로 20°C에서 95°C로의 온도변화를 시간당 60°C의 스캔 속도로 확인하여 열에 의한 아달리무맙의 구조변화가 일어나는 온도를 확인하였다.
2.2. soluble aggregate 확인
SE-HPLC (크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피; Size Exclusion HPLC)를 사용하여 제형 내 항체의 분해, 응집 특성을 측정하여 제형 안정성을 평가하였다.
구체적으로, 각 제형이 적용된 아달리무맙을 0.001% PS80이 포함된 이동상 (50 mM Sodium Phosphate, 0.15 M Sodium Chloride, pH 6.8)으로 1mg/ml의 농도로 희석하였다. 희석된 아달리무맙 용액 20ul를 Agilent (1100 또는 1260) 장비와 TSK gel G3000SWXL 컬럼을 이용하여 아달리무맙의 단량체(main peak; %), 고분자성분(high molecular weight, HMW; %), 저분자성분 (low molecular weight, LMW; %)의 양의 변화를 측정하였다.
- High molecular weight (HMW; %) = {area of HMW/area of (HMW + monomer + LMW)}*100)
- Low molecular weight (LMW; %) = {area of LMW/area of (HMW + monomer + LMW)}*100)
- Monomer (main peak; %) = {area of main peak /area of (HMW + main peak + LMW)}*100)
2.3. 불용성 이물입자 확인
MFI(Micro-Flow Imaging) 또는 FlowCAM을 사용하여 제형 내 불용성 이물입자를 확인하였다.
구체적으로, 아달리무맙 원액 또는 1:1로 희석한 용액 0.5ml을 Fluid Imaging Technologies사의 FlowCAM 또는ProteinSimple사의 MFI5200 장비를 사용하여 아달리무맙을 포함하는 제형 조건 내의 불용성 이물 입자 (>5μm(5μm 초과), >10μm(10μm 초과), 또는 >25μm(25μm 초과))의 개수를 측정하였다.
2.4. Charge variants 확인 (장기 냉동 안정성 평가)
CEX-HPLC (양이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피; Cation Exchange HPLC)를 사용하여 제형 내 항체의 표면의 순전하 차이 특성을 측정하여 제형 안정성을 평가하였다.
구체적으로, 각 제형이 적용된 아달리무맙을 이동상 A (10 mM Sodium Phosphate, pH 7.0) 로 1mg/ml의 농도로 희석하였다. 희석된 아달리무맙 용액 20ul를 Agilent (1100 또는 1260) 장비를 이용하여 Propac WCX-10 컬럼에 결합시켰다. 이동상 B (10 mM Sodium Phosphate, 0.5 M Sodium Chloride, pH 7.0)의 농도 구배를 통한 염농도 증가로 인해 용출되는 아달리무맙의 주피크 (main peak; %), 산성 변형체 (Acidic Variants, Pre-Peaks; %), 염기성 변형체 (Basic Variants, Post-Peaks; %)의 양의 변화를 다음과 같이 측정하였다:
- Main peak (Main Peak; %) = {area of Main Peak/area of (Pre-Peaks + Main Peak + Post-Peaks)}*100)
- Acidic Variants (Pre-Peaks; %) = {area of Pre-Peaks/area of (Pre-Peaks + Main Peak + Post-Peaks)}*100)
- Basic Variants (Post-Peaks; %) = {area of Post-Peaks/area of (Pre-Peaks + Main Peak + Post-Peaks)}*100)
실시예 2. 버퍼 및 부형제 선정 (열안정성 평가)
실시예 1에 따라서 준비한 30가지 제형 조건 (하기의 표 2 참조)에 대하여 아달리무맙의 열 안정성을 측정하였다.
Buffer는 20mM의 histidine, phosphate, succinate의 3종류, excipient는 200mM의 glucose, glycerol, mannitol, 100mM glycine, 6% glycine의 5종류, 및 pH는 5와 6.5의 2종류 중에서 각각 선정하여 총 30개의 제형을 마련하였다. 대조군 제형으로, 휴미라 (Humira; AbbVie) 제형과 동일한 42mg/ml mannitol, 0.1% PS80 조건을 자체 생산한 아달리무맙에 적용하여 준비하였다.
구체적으로, 자체 제작한 아달리무맙 13mg(약 130mg/ml 아달리무맙, 42mg/ml mannitol 용액)을 Amicon Ultra 원심 필터에 넣고 상기 30가지 제형 및 대조군 제형의 용액으로 10~50배 희석한 후 부피가 10분의 1로 감소할 때까지 4000g로 원심분리를 수행하였으며 이 과정을 총 3회 반복하여 제형이 완성되도록 하였다. 동일한 제형 용액을 이용하여 아달리무맙이 1.0mg/ml이 되도록 희석하였으며 열 안정성을 평가하였다.
상기 열안정성 평가는 참고예 2.1의 방법을 참조하여 Tm을 측정하여 수행하였다.
본 실시예에서 제조 및 시험된 30종 제형의 조건 및 평균 Tm값을 아래의 표 2에 정리하였다:
제형 No. Buffer pH Excipient Surfactant Average Tm
1 20 mM Histidine 5 200 mM Mannitol - 65.5
2 20 mM Histidine 5 100 mM Glycine - 68.7
3 20 mM Histidine 5 200 mM Glucose - 65.5
4 20 mM Histidine 5 200 mM Glycerol - 68.3
5 20 mM Histidine 5 6 % Ethanol - 64.4
6 20 mM Histidine 6.5 200 mM Mannitol - 64.6
7 20 mM Histidine 6.5 100 mM Glycine - 64.4
8 20 mM Histidine 6.5 200 mM Glucose - 65.7
9 20 mM Histidine 6.5 200 mM Glycerol - 70.9
10 20 mM Histidine 6.5 6 % Ethanol - 68.1
11 20 mM Phosphate 5 200 mM Mannitol - 71
12 20 mM Phosphate 5 100 mM Glycine - 70.4
13 20 mM Phosphate 5 200 mM Glucose - 70.2
14 20 mM Phosphate 5 200 mM Glycerol - 70
15 20 mM Phosphate 5 6 % Ethanol - 65.4
16 20 mM Phosphate 6.5 200 mM Mannitol - 70.1
17 20 mM Phosphate 6.5 100 mM Glycine - 70.4
18 20 mM Phosphate 6.5 200 mM Glucose - 70.5
19 20 mM Phosphate 6.5 200 mM Glycerol - 70.2
20 20 mM Phosphate 6.5 6 % Ethanol - 65.7
21 20 mM Succinate 5 200 mM Mannitol - 70.7
22 20 mM Succinate 5 100 mM Glycine - 70.2
23 20 mM Succinate 5 200 mM Glucose - 69.3
24 20 mM Succinate 5 200 mM Glycerol - 68.7
25 20 mM Succinate 5 6 % Ethanol - 62.1
26 20 mM Succinate 6.5 200 mM Mannitol - 65.2
27 20 mM Succinate 6.5 100 mM Glycine - 70.9
28 20 mM Succinate 6.5 200 mM Glucose - 70.7
29 20 mM Succinate 6.5 200 mM Glycerol - 70.6
30 20 mM Succinate 6.5 6 % Ethanol - 65.1
표 2에 나타난 바와 같이, 버퍼로서 phosphate 또는 succinate를 사용한 시험군의 열 안정성이 histidine을 사용한 시험군보다 우수한 것으로 확인되었다. 또한, 부형제 (Excipient)로서 에탄올을 사용한 시험군의 열 안정성이 다른 시험군과 비교하여 낮은 것으로 확인되었다.
실시예 3. 버퍼 및 부형제의 물성 확인 (soluble aggregate)
실시예 2에서 열 안정성이 우수한 것으로 확인된 버퍼 조건 및 부형제 조건을 조합하여 제형을 준비하고, 아달리무맙의 용해도(soluble aggregate)를 시험하였다.
보다 구체적으로, 버퍼로서 20mM의 phosphate 또는 succinate의 2종류, 부형제로서 glycerol, mannitol, 및 glycine의 3종류, 및 pH는 5와 6.5의 2종류를 선정하여 총 12개의 제형을 마련하였다 (하기 표 3 참조). 대조군 제형으로, 휴미라 (Humira; AbbVie) 제형과 동일한 조건인 42mg/ml mannitol, 0.1% PS80, pH5.2로 준비하여 비교평가 하였다.
구체적으로, 자체 제작한 아달리무맙 항체 155mg(약 120mg/ml 아달리무맙, 42mg/ml mannitol 용액)을 Amicon Ultra 원심 필터에 넣고 농도가 200mg/mL가 될 때까지 4000g로 원심분리를 수행하였다. 이후 buffer, excipient가 포함된 12가지 조건의 제형 용액 및 대조군 제형으로 10배 희석한 후 부피가 10분의 1로 감소할 때까지 4000g로 원심분리를 수행하였다. 이 과정을 총 3회 반복하고 아달리무맙의 농도가 200mg/mL가 되도록 추가적으로 원심분리를 수행하여 원하는 조성의 액상의 아달리무맙 제형을 수득하였다.
상기 수득한 각 제형에 대하여 참고예 2.2의 방법을 참조하여 SEC-HPLC를 수행하여, 주성분(main peak), 고분자량, 및 저분자량 함량을 측정하였다.
본 실시예에서 제조 및 시험된 12종 제형의 조건 및 SEC-HPLC 수행 결과를 아래의 표 3에 정리하였다:
Form. No. Buffer pH Excipient Surfactant Main Peak Area % [%] HMW Area % [%] LMW Area %[%]
1 20 mM Succinate 5 75mM mannitol - 99.27 0.6 0.13
2 20 mM Succinate 5 100 mM Glycine, 100 mM mannitol - 99.26 0.57 0.17
3 20 mM Succinate 5 150 mM Glycerol, 25mM mannitol - 99.22 0.62 0.16
4 20 mM Succinate 6.5 75mM mannitol, 150mM mannitol - 99.18 0.69 0.13
5 20 mM Succinate 6.5 100 mM Glycine, 25mM mannitol - 99.23 1.01 0.13
6 20 mM Succinate 6.5 150 mM Glycerol, 100mM mannitol - 99.15 0.64 0.13
7 20 mM Phosphate 5 150mM mannitol - 99.28 0.56 0.16
8 20 mM Phosphate 5 100 mM Glycine, 100 mM mannitol - 99.29 0.54 0.17
9 20 mM Phosphate 5 150 mM Glycerol, 25mM mannitol - 99.21 0.61 0.18
10 20 mM Phosphate 6.5 75mM mannitol - 99.13 0.68 0.19
11 20 mM Phosphate 6.5 25mM Glycine, 25mM mannitol - 99.18 0.65 0.17
12 20 mM Phosphate 6.5 100mM Glycerol, 100mM mannitol - 99.12 0.72 0.16
대조군 No buffer 5.2 42mg/ml(231mM) Mannitol 0.1% PS80 98.94 0.87 0.19
표 3에서 보여지는 바와 같이, 시험된 12종 제형 모두 대조군 대비 높은 purity (main peak%) 및 등등 이하의 HMW% (고분자량 성분 함량) 및 LMW% (저분자량 성분 함량)를 보이는 것으로 나타나서, 12종 제형 모두 대조군 대비 동등 이상의 안정성을 가지는 것을 확인하였다. 특히, 버퍼로서 phosphate와 succinate를 사용한 시험군 모두에서, pH 6.5보다 pH 5에서 높은 purity (main peak%)와 낮은 HMW%(고분자량 성분 함량)를 보이는 것을 확인하였다.
실시예 4. 계면활성제의 선정 (불용성 이물입자 확인)
자체 제작한 아달리무맙을 101mg/mL(42mg/mL mannitol)의 농도로 준비한 후, 계면활성제를 추가하여 아달리무맙의 최종 농도가 100mg/mL가 되도록 하였다.
상기 계면활성제로서 PS20, PS80, 및 F-68를 사용하였다. PS20과 PS80의 경우, 1%(w/v) 용액을 0.01%(w/v)가 되도록 추가하고, F-68의 경우에는 10%(w/v) 용액을 0.1%(w/v)가 되도록 추가하여 제형을 준비하였다.
상기 준비된 제형을 실온에서 1,000 rpm로 4시간 agitation을 한 후, 참고예 2.3의 방법을 참조하여 FlowCAM을 사용하여, 제형 내 불용성 이물입자(평균 입경 5 μm이상 입자 개수)를 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 표 4에 나타내었다:
입자크기 >5μm >10 >25μm
Water 0 0 0
No Surfactant 631 321 65
0.01% PS20 12 3 0
0.01% PS80 15 3 0
0.1% F-68 58 15 0
표 4에 나타난 바와 같이, 계면활성제로서 PS20 및 PS80를 사용한 시험군이 F-68을 사용한 시험군과 비교하여 불용성 이물입자 함량이 낮았으며, 특히, PS20를 사용한 시험군이 불용성 이물입자 함량이 보다 더 낮았다.
실시예 5. 선정된 제형의 스트레스 조건에서의 안정성 평가
5.1. 제형의 준비
상기 실시예 4의 결과를 기반으로, 계면활성제로서 0.01%(w/v) PS20을 포함하는 12종의 제형을 준비하였다.
보다 구체적으로, 버퍼는 10mM의 phosphate, succinate, histidine의 3종류, 부형제는 mannitol, glycine, glycerol, glucose, glutamic acid의 5종류, pH는 4~6.2 사이의 5 point 중에서 선정하고, 계면활성제로서 0.01%(w/v) PS20를 첨가하여, 총 12개의 액상 제형을 준비하였다 (아달리무맙 농도: 100mg/ml). 대조군 제형으로, 휴미라 (Humira; AbbVie) 제형과 동일한 조건인 42mg/ml mannitol, 0.1% PS80, pH5.2로 준비하여 비교평가 하였다 (아달리무맙 농도: 100mg/ml).
구체적으로, 자체 제작한 아달리무맙(약 120mg/ml 아달리무맙, 42mg/ml mannitol 용액)에 10% PS20을 1:1000의 비율로 희석되게끔 추가한 후 잘 섞어주었다. PS20이 첨가된 아달리무맙 용액에, buffer와 excipient로 이루어진 용액을 이용하여 10,000배 이상 교환이 되도록 dialysis를 수행하였으며 각 제형 조건에서 아달리무맙의 농도가 100mg/ml이 되도록 희석이나 원심분리를 수행하여 고농도 아달리무맙 제형을 마련하였다.
상기 준비된 12종의 제형의 조건을 하기의 표 5에 정리하였다:
Form. No. Buffer pH Excipient Surfactant 삼투압 Viscosity at 25°C (cP)
1 10 mM succinate 4 11mM(0.2%) Mannitol, 266mM(2%) Glycine 0.01% PS20 313 3.31
2 10 mM succinate 4.7 11mM(0.2%) Mannitol, 239mM(2.2%) Glycerol 0.01% PS20 297 3.62
3 10 mM succinate 4.7 11mM(0.2%) Mannitol, 278mM(5%) Glucose 0.01% PS20 343 4.32
4 10 mM succinate 5.2 11mM(0.2%) Mannitol, 266mM(2%) Glycine 0.01% PS20 320 4.84
5 10 mM succinate 5.2 11mM(0.2%) Mannitol, 239mM(2.2%) Glycerol 0.01% PS20 299 4.1
6 10 mM succinate 5.2 11mM(0.2%) Mannitol, 278mM(5%) Glucose 0.01% PS20 348 5.23
7 10mM phosphate 5.7 11mM(0.2%) Mannitol, 266mM(2%) Glycine 0.01% PS20 321 3.71
8 10mM phosphate 5.7 11mM(0.2%) Mannitol, 239mM(2.2%) Glycerol 0.01% PS20 317 3.84
9 10mM phosphate 5.7 11mM(0.2%) Mannitol, 278mM(5%) Glucose 0.01% PS20 382 4.36
10 10mM phosphate 6.2 11mM(0.2%) Mannitol, 266mM(2%) Glycine 0.01% PS20 310 3.01
11 10mM phosphate 6.2 11mM(0.2%) Mannitol, 278mM(5%) Glucose 0.01% PS20 370 4.87
대조군 No buffer 5.2 42 mg/mL mannitol 0.1% PS80 277 4.18
(상기 표 5에서, “%”: %(w/v);
삼투압(mmol/kg): Model 2020 Freezing point Osmometer(Advanced Instruments)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 time zero의 삼투압(mmol/kg)을 측정함;
점도: 모든 시료를 150ul/min의 유량으로 m-VROC Rheometer(Rheosense)의 유리 주사기에 130ul를 주입하여, time zero, 25 ℃에서 측정함)
5.2. 온도에 따른 제형 안정성 시험 (SE-HPLC)
상기 실시예 5.1에서 준비된 12종의 제형 및 대조군 제형에 대하여 저장 온도 및 기간에 따른 제형 안정성을 시험하였다.
보다 구체적으로, 상기 준비된 제형을 일반적인 저장 조건인 5℃ 및 25℃에서 각각 0~8주차까지 보관하거나, 가혹 조건인 40℃에서 0~4주차까지 보관한 후, 참고예 2.2의 방법을 참조하여 SE-HPLC를 수행하여 주성분 함량 (main peak %) 및 고분자량 함량 (HMW %)을 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 표 6 내지 표 11에 나타내었다:
5℃ 조건에서의 저장 기간에 따른 주성분 함량 (main peak %)
Form. No. 0W 1W 2W 4W 8W
1 97.7 97.8 98 97.7 97.7
2 97.3 97.3 97.6 97.2 97.2
3 97.3 97.5 97.6 97.3 97.3
4 97.4 97.4 97.6 97.4 97.3
5 97 97.2 97.3 97 97
6 97 97.1 97.3 96.9 96.9
7 97 97.1 97.3 97 96.9
8 96 96.2 96.4 96 96
9 96.4 96.5 96.7 96.4 96.3
10 96.9 97.1 97.2 96.9 96.7
11 95.9 96.1 96.4 96 95.9
대조군 95.1 95.6 95.8 95.3 95.3
25℃ 조건에서의 저장 기간에 따른 주성분 함량 (main peak %)
Form. No. 0W 1W 2W 4W 8W
1 97.7 97.8 97.9 97.4 97
2 97.3 97.2 97.3 96.6 96.2
3 97.3 97.3 97.3 96.7 96.2
4 97.4 97.2 97.2 96.5 95.8
5 97 96.8 96.8 96.2 95.7
6 97 96.8 96.7 96 95.2
7 97 96.8 96.7 95.7 94.4
8 96 95.8 95.8 94.9 94.3
9 96.4 96.1 96 95 93.3
10 96.9 96.6 96.5 95.3 93.6
11 95.9 95.6 95.4 94 91
대조군 95.1 95.2 95.1 94.1 93.6
40℃ 조건에서의 저장 기간에 따른 주성분 함량 (main peak %)
Form. No. 0W 1W 2W 4W
1 97.7 97.4 96.9 93.3
2 97.3 96.4 95.8 93.5
3 97.3 96.2 94.3 86.1
4 97.4 96 95 91.9
5 97 95.8 94.9 92.6
6 97 95.2 92.3 82.1
7 97 95.3 93.5 88.1
8 96 94.4 93.3 91
9 96.4 93.1 86.7 72.3
10 96.9 94.9 92.6 85.5
11 95.9 90.8 81.2 64.4
대조군 95.1 94 92.9 90.8
5℃ 조건에서의 저장 기간에 따른 고분자량 함량 (HMW %)
Form. No. 0W 1W 2W 4W 8W
1 2.2 2.1 1.9 2.1 2.1
2 2.6 2.6 2.3 2.6 2.6
3 2.6 2.5 2.3 2.5 2.6
4 2.6 2.5 2.2 2.5 2.5
5 2.9 2.8 2.5 2.8 2.9
6 2.9 2.8 2.6 2.9 2.9
7 2.9 2.8 2.6 2.9 3
8 3.9 3.7 3.5 3.8 3.9
9 3.5 3.4 3.1 3.5 3.5
10 3 2.8 2.7 3 3.1
11 4 3.8 3.5 3.9 4
대조군 4.8 4.3 4 4.5 4.5
25℃ 조건에서의 저장 기간에 따른 고분자량 함량 (HMW %)
Form. No. 0W 1W 2W 4W 8W
1 2.2 2 1.8 2.2 2.3
2 2.6 2.7 2.5 3.1 3.4
3 2.6 2.6 2.5 3 3.4
4 2.6 2.7 2.6 3.2 3.7
5 2.9 3 3 3.5 4
6 2.9 3.1 3 3.7 4.5
7 2.9 3.1 3.1 4 5.2
8 3.9 4.1 4 4.9 5.4
9 3.5 3.7 3.8 4.7 6.3
10 3 3.2 3.2 4.4 6
11 4 4.2 4.4 5.8 8.6
대조군 4.8 4.7 4.7 5.6 6.1
40℃ 조건에서의 저장 기간에 따른 고분자량 함량 (HMW %)
Form. No. 0W 1W 2W 4W
1 2.2 1.9 1.6 2.4
2 2.6 3.2 3.5 5.1
3 2.6 3.4 5 12.2
4 2.6 3.6 4.2 6.5
5 2.9 3.9 4.4 6.1
6 2.9 4.4 7 16.6
7 2.9 4.3 5.8 10.4
8 3.9 5.2 6.1 7.9
9 3.5 6.5 12.6 26.2
10 3 4.6 6.6 12.9
11 4 8.8 18 33.8
대조군 4.8 5.7 6.5 8
상기 표 6 내지 11에 있어서, 시험 제형들, 특히 1, 2, 4, 및 5번 제형 모두, 대조군 제형과 비교하여, 초기 (0주차)의 주성분 함량이 높고 고분자 함량이 낮으며, 모든 온도 조건에서 장기간 (~8주) 저장 동안의 모든 시험 구간에서 주성분 함량이 높거나 및/또는 고분자 함량이 낮게 나타나서, 대조군 제형 대비 초기 제형 안정성 및 저장 안정성이 개선된 것을 확인할 수 있다.
5.3. 저장 기간에 따른 제형 안정성 시험 (MFI 분석)
상기 실시예 5.1에서 준비된 12종의 제형 및 대조군 제형에 대하여 저장 기간에 따른 제형 안정성을 시험하였다.
보다 구체적으로, 상기 준비된 제형을 5℃, 25℃ 또는 40℃에서 0~8주차까지 보관한 후, 참고예 2.3의 방법을 참조하여 MFI 분석을 수행하여 불용성 이물입자를 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 표 12에 나타내었다:
No. 0 Weeks 8 Weeks (5℃) 8 Weeks (25℃) 8 Weeks (40℃)
>10 μm >25 μm >10 μm >25 μm >10 μm >25 μm >10 μm >25 μm
1 173 18 82 12 9 0 127 9
2 61 0 70 0 112 6 153 0
3 533 55 3 0 245 33 388 15
4 136 3 3 0 9 0 130 12
5 40 6 48 3 45 0 61 0
6 209 27 12 3 103 9 12 0
7 91 12 21 3 91 6 976 87
8 407 31 158 21 203 15 439 61
9 236 27 158 18 97 9 139 6
10 512 59 309 45 279 30 427 24
11 470 24 82 12 267 39 473 18
대조군 297 3 100 21 1354 58 248 24
표 12에서 확인되는 바와 같이, 시험된 12종 제형 중 다수 제형의 불용성 이물입자 수가 시험된 저장 기간 및 온도 조건에서 대조군보다 적었다. 특히 succinate 완충액과, 만니톨 및 글리신 또는 만니톨 및 글리세롤을 포함하는 제형(1번, 2번, 4번 및 5번 제형)에서의 불용성 이물입자 수가 비교적 적은 것으로 관찰되어, 이들 제형의 안정성이 특히 우수한 것으로 확인되었다.
실시예 6. 만니톨, 글리세롤, 글리신을 포함하는 제형의 스트레스 조건에서의 안정성 평가
6.1. 제형의 준비
상기 실시예 5의 결과를 기반으로, 부형제로서 만니톨, 글리세롤, 및 글리신을 다양한 조합으로 포함하는 12종의 제형을 준비하였다.
보다 구체적으로, 버퍼는 10mM의 phosphate, succinate의 2종류, 부형제는 glycerol, mannitol, glycine의 3종류, 계면활성제는 0.1%(w/v) PS20, 0.01%(w/v) PS20의 2종류 중에서 각각 선정하고, pH는 5로 고정하여, 총 12개의 연한 노란색의 액상 제형을 준비하였다. 대조군 제형으로, 휴미라 (Humira; AbbVie) 제형과 동일한 조건인 42mg/ml mannitol, 0.1% PS80, pH5.2로 준비하여 비교평가 하였다.
구체적으로, 자체 제작한 아달리무맙 855mg을 Amicon Ultra 원심 필터에 넣고 농도가 200mg/mL가 될때까지 4000g로 원심분리를 수행하였다. 이후 각 제형 조건의 buffer와 excipient로 이루어진 용액으로 5배 희석한 후 부피가 5분의 1로 줄때까지 4000g로 원심분리를 수행하였다. 이 과정을 총 3회 반복하고 PS20을 0.01%와 0.1% 농도가 되도록 추가하여 고농도(~200mg/mL) 아달리무맙 제형을 마련하였다.
상기 준비된 12종의 제형의 조건을 하기의 표 13에 정리하였다:
Form. No. Buffer pH Excipient Surfactant
1 10 mM Succinate 5 150 mM Glycerol, 50mM mannitol 0.1% PS20
2 10 mM Succinate 5 100 mM Glycine, 50mM mannitol 0.1% PS20
3 10 mM Succinate 5 250mM mannitol 0.1% PS20
4 10 mM Succinate 5 150 mM Glycerol, 50mM mannitol 0.01% PS20
5 10 mM Succinate 5 100 mM Glycine, 50mM mannitol 0.01% PS20
6 10 mM Succinate 5 250mM mannitol 0.01% PS20
7 10 mM Acetate 5 150 mM Glycerol, 50mM mannitol 0.1% PS20
8 10 mM Acetate 5 100 mM Glycine, 50mM mannitol 0.1% PS20
9 10 mM Acetate 5 250mM mannitol 0.1% PS20
10 10 mM Acetate 5 150 mM Glycerol, 50mM mannitol 0.01% PS20
11 10 mM Acetate 5 100 mM Glycine, 50mM mannitol 0.01% PS20
12 10 mM Acetate 5 250mM mannitol 0.01% PS20
대조군 No buffer 5.2 42mg/ml(231mM) Mannitol 0.1% PS80
6.2. 스트레스 조건에서의 제형 안정성 시험 (SE-HPLC)
상기 실시예 6.1에서 준비된 12종의 제형 및 대조군 제형에 대하여 스트레스 조건에서의 제형 안정성을 시험하였다.
보다 구체적으로, 상기 준비된 제형에 스트레스 부여한 후, 참고예 2.2의 방법을 참조하여 SE-HPLC를 수행하여 주성분 함량 (main peak %), 고분자량 함량 (HMW %), 및 저분자량 함량 (HMW %)을 측정하였다.
상기 스트레스 부여는, 교반 (Agitation) 스트레스 또는 Freeze-thaw 스트레스로 수행하였다. Agitation 스트레스는 상기 준비된 제형을 실온(25°C)에서 600rpm으로 3일간 교반하여 부여하였으며, 분석시까지 2-8°C에서 1~2일 동안 보관하였다. Freeze-thaw 스트레스는 -75°C에서 최소 1시간 냉동한 후 실온(25°C)에서 해동시키는 과정을 총 5회 반복하여 부여하였으며, 분석시까지 2-8°C에서 1~2일 동안 보관하였다.
비교를 위하여, 일반 조건 (control; 별도의 스트레스 부여하지 않고 제형 제조 후 2-8°C에서 1-2일 보관)에서도 동일하게 주성분 함량 (main peak %), 고분자량 함량 (HMW %), 및 저분자량 함량 (HMW %)을 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 표 14 내지 표 16에 나타내었다:
주성분 함량 (main peak %)
Form. No. Control Agitation Freeze-thaw
1 99.1 98.9 98.9
2 99.1 99 99.1
3 99 99 99
4 99.1 99 99.1
5 99 99.1 99.2
6 98.9 98.9 99
7 98.9 98.8 99
8 98.9 98.9 99
9 98.8 98.9 98.8
10 98.8 98.8 98.8
11 98.9 98.9 99
12 98.9 98.7 98.8
대조군 98.7 99.1 98.9
고분자량 함량 (HMW %)
Form. No. Control Agitation Freeze-thaw
1 0.7 0.9 0.7
2 0.8 0.7 0.6
3 0.9 0.8 0.8
4 0.7 0.8 0.7
5 0.7 0.7 0.7
6 0.8 0.8 0.8
7 0.9 1 0.9
8 0.9 0.9 0.8
9 1 1 1
10 1 0.9 1
11 0.9 0.8 0.8
12 1 1 1
대조군 0.9 0.8 0.9
저분자량 함량 (LMW %)
Form. No. Control Agitation Freeze-thaw
1 0.2 0.3 0.4
2 0.2 0.3 0.2
3 0.1 0.2 0.3
4 0.2 0.2 0.2
5 0.3 0.2 0.2
6 0.3 0.3 0.3
7 0.2 0.3 0.2
8 0.3 0.2 0.2
9 0.3 0.2 0.2
10 0.3 0.3 0.2
11 0.2 0.3 0.2
12 0.2 0.3 0.2
대조군 0.3 0.1 0.3
표 14 내지 표 16에 나타난 바와 같이, 실험된 모든 조건에서 acetate 완충액을 사용한 제형(7~12)보다 succinate 완충액을 사용한 제형 (1-6)의 안정성이 전반적으로 높은 것으로 확인되었다. 또한, PS20을 0.01% 또는 0.1% 사용한 경우 안정성은 서로 유사한 것으로 확인되었다. 또한, 일반 조건(control)에서, 부형제로서 만니톨을 단독으로 포함하는 제형(3, 6, 9, 12)과 비교하여, 글리신 또는 글리세롤을 추가로 포함하는 제형 (1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11)의 안정성이 다소 우수한 것으로 확인되었다.
실시예 7. 만니톨, 글리세롤, 글리신을 포함하는 제형의 장기 냉동 안정성 평가
7.1. 제형의 준비
상기 실시예 5의 결과를 기반으로, 부형제로서 만니톨, 글리세롤, 및 글리신을 다양한 조합으로 포함하는 8종의 제형을 준비하였다.
구체적으로, 버퍼는 10mM의 숙시네이트, 계면활성제는 0.01%(w/v) PS20 또는 0.01%(w/v) PS80로 하고, 부형제는 만니톨, 글리신, 글리세롤의 3종류 중에서 선정하였으며, pH는 5.2로 고정하여, 총 8개의 액상 제형을 준비하였다. 대조군 제형으로, 휴미라 (Humira; AbbVie) 제형과 동일한 조건인 42mg/ml mannitol, 0.1% PS80, pH 5.2로 준비하여 비교평가 하였다.
자체 제작한 아달리무맙을 이용하여 아래의 표 17의 제형 조성에 따라 준비하였다 (제형 내 아달리무맙 농도: 100mg/ml).
상기 준비된 8종의 제형의 조건을 하기의 표 17에 정리하였다:
Form. No. Buffer pH Excipient Surfactant
1 10 mM succinate 5.2 11mM(0.2%) Mannitol, 266mM(2%) Glycine 0.01% PS20
2 10 mM succinate 5.2 55mM(1%) Mannitol, 222mM(1.67%) Glycine 0.01% PS20
3 10 mM succinate 5.2 277mM(2.08%) Glycine 0.01% PS20
4 10 mM succinate 5.2 11mM(0.2%) Mannitol, 239mM(2.2%) Glycerol 0.01% PS20
5 10 mM succinate 5.2 55mM(1%) Mannitol, 195mM(1.8%) Glycerol 0.01% PS20
6 10 mM succinate 5.2 250mM(2.3%) Glycerol 0.01% PS20
7 10 mM succinate 5.2 11mM(0.2%) Mannitol, 266mM(2%) Glycine 0.01% PS80
8 10 mM succinate 5.2 11mM(0.2%) Mannitol, 239mM(2.2%) Glycerol 0.01% PS80
대조군 No buffer 5.2 42 mg/mL mannitol 0.1% PS80
(“%”: %(w/v))
7.2. 장기 냉동 안정성 평가
상기 실시예 7.1에서 준비된 8종의 제형 및 대조군 제형의 장기 냉동 안정성을 제형 내 항체의 표면의 순전하 차이 특성 (Charge variants)를 확인하여 평가하였다. 상기 Charge variants 확인은 참고예 2.4에 기재된 방법을 참조하여 CEX-HPLC (양이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피; Cation Exchange HPLC)를 수행하여 주피크 함량 (main peak; %), 산성 변형체 함량 (Acidic Variants, Pre-Peaks; %) 및 염기성 변형체 함량 (Basic Variants, Post-Peaks; %)의 변화를 측정하여 수행하였다.
상기 실시예 7.1에서 준비된 8종의 제형 및 대조군 제형을 -70℃ 조건에서 3개월간 저장한 후, 아달리무맙 농도 1mg/mL로 희석하여 CEX-HPLC를 수행하여 Charge variants를 확인하였다. 상기 얻어진 결과를 표 18에 기재하였다:
Form. No. T=0 T=3month
Pre-Peaks Main Peak Post-Peaks Pre-Peaks Main Peak Post-Peaks
1 18.1 65.6 16.3 17.8 64.9 17.2
2 18 65.5 16.4 18.6 64.2 17.2
3 18.1 65.5 16.4 18.6 64.2 17.2
4 17.7 66 16.3 17.9 64.9 17.2
5 18 65.6 16.4 18.2 64.6 17.3
6 17.8 65.7 16.5 18.5 64.5 17.1
7 18.1 65.6 16.4 18.8 64 17.2
8 17.6 65.8 16.4 18.8 64 17.2
대조군 17.9 65.7 16.4 18.3 64.7 17.1
상기 장기 안정성을 확인한 결과에서 보여지는 바와 같이, 1번, 2번, 4번 및 5번, 특히 1번 및 4번 제형에 해당하는 조합에서 비교적 우수한 안정성을 나타내었다.
또한, 상기 실시예 7.1에서 준비된 8종의 제형 및 대조군 제형을 -70℃ 조건에서 3개월간 저장한 후 MFI(참고예 2.3 참조)를 수행하여 얻어진 결과(Particles/mL)를 표 19에 나타내었다:
Form. No. 1 2 3 4 5 6 7 8 대조군
>5 μm 128 106 114 106 1382 473 608 123 117
>10 μm 27 23 18 17 334 101 43 25 35
>25 μm 0 0 0 0 21 8 0 8 4
표 19에서 보여지는 바와 같이, PS80를 첨가한 군(7,8번 제형)보다 PS20을 첨가한 군(1 내지 4번, 특히 1번, 4번)에서 우수한 결과를 나타내었다.

Claims (15)

  1. 80 mg/ml 내지 200 mg/ml의 항-TNFα 항체;
    완충액;
    부형제; 및
    계면활성제를 포함하고,
    pH가 4 내지 7.5이며,
    상기 완충액은 숙시네이트, 포스페이트, 아세테이트, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하고,
    상기 부형제는 만니톨, 글리세롤, 글리신, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하고.
    상기 계면활성제는 폴리소르베이트 20를 포함하는 것인,
    약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 완충액은 숙시네이트, 포스페이트, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 완충액은 숙시네이트를, 전체 조성물 기준으로, 10 mM 또는 20mM의 농도로 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 부형제는 만니톨, 만니톨 및 글리세롤의 조합, 또는 만니톨 및 글리신의 조합을 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 부형제는, 전체 조성물 기준으로,
    8.25mM 내지 14mM의 만니톨 및 239mM 내지 293mM의 글리신; 또는
    8.25mM 내지 14mM의 만니톨 및 217mM 내지 272mM의 글리세롤
    을 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트 20을 전체 조성물을 기준으로 0.01 내지 0.1%(w/v)의 농도로 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-TNFα 항체는 아달리무맙인, 약제학적 조성물.
  8. 80 mg/ml 내지 200 mg/ml의 항-TNFα 항체;
    완충액;
    부형제; 및
    계면활성제
    를 혼합하여 수성 액상 조성물을 제조하는 단계를 포함하고,
    상기 완충액은 숙시네이트, 포스페이트, 아세테이트, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하고,
    상기 부형제는 만니톨, 글리세롤, 글리신, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하고.
    상기 계면활성제는 폴리소르베이트 20를 포함하고,
    상기 수성 액상 조성물의 pH가 4 내지 7.5인,
    안정한 항-TNFα 항체의 액상 제형의 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 완충액은 숙시네이트, 포스페이트, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인, 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 완충액은 숙시네이트를, 전체 조성물 기준으로, 10 mM 또는 20mM의 농도로 포함하는 것인, 제조 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 부형제는 만니톨, 만니톨 및 글리세롤의 조합, 또는 만니톨 및 글리신의 조합을 포함하는 것인, 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 부형제는, 전체 조성물 기준으로,
    8.25mM 내지 14mM의 만니톨 및 239mM 내지 293mM의 글리신; 또는
    8.25mM 내지 14mM의 만니톨 및 217mM 내지 272mM의 글리세롤
    을 포함하는 것인, 제조 방법.
  13. 제8항에 있어서, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트 20을 전체 조성물을 기준으로 0.01 내지 0.1%(w/v)의 농도로 포함하는 것인, 제조 방법.
  14. 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-TNFα 항체는 아달리무맙인, 제조 방법.
  15. 80 mg/ml 내지 200 mg/ml의 항-TNFα 항체;
    완충액;
    부형제; 및
    계면활성제
    를 혼합하여 수성 액상 조성물을 제조하는 단계를 포함하고,
    상기 완충액은 숙시네이트, 포스페이트, 아세테이트, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하고,
    상기 부형제는 만니톨, 글리세롤, 글리신, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하고.
    상기 계면활성제는 폴리소르베이트 20를 포함하고,
    상기 수성 액상 조성물의 pH가 4 내지 7.5인,
    액상 제형 내 항-TNFα 항체의 안정성 증진 방법.
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