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WO2022008825A1 - Procédé pour déterminer le risque de survenue d'une infection associée aux soins chez un patient - Google Patents

Procédé pour déterminer le risque de survenue d'une infection associée aux soins chez un patient Download PDF

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Publication number
WO2022008825A1
WO2022008825A1 PCT/FR2021/051227 FR2021051227W WO2022008825A1 WO 2022008825 A1 WO2022008825 A1 WO 2022008825A1 FR 2021051227 W FR2021051227 W FR 2021051227W WO 2022008825 A1 WO2022008825 A1 WO 2022008825A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
genes
gene selected
expression
gene
patient
Prior art date
Application number
PCT/FR2021/051227
Other languages
English (en)
Inventor
Laurence VACHOT
François Mallet
Guillaume Monneret
Virginie Moucadel
Alexandre Pachot
Estelle PERONNET
Thomas RIMMELÉ
Julien Textoris
Fabienne VENET
Original Assignee
bioMérieux
Bioaster
Hospices Civils De Lyon
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by bioMérieux, Bioaster, Hospices Civils De Lyon filed Critical bioMérieux
Priority to US18/014,878 priority Critical patent/US20230220477A1/en
Priority to EP21748926.9A priority patent/EP4176086A1/fr
Publication of WO2022008825A1 publication Critical patent/WO2022008825A1/fr

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to an in vitro or ex vivo method for determining the risk of occurrence of a healthcare-associated infection in a patient, comprising a step for measuring the expression of TAP2, in a biological sample of said patient.
  • the TAP2 gene encodes a membrane-associated protein of the ABC transporter superfamily (ATP-binding cassette), which is involved in the transport of peptides from the cytoplasm to the endoplasmic reticulum as part of the process of antigen presentation of molecules of class I.
  • ABC transporter superfamily ATP-binding cassette
  • mutations of the TAP2 gene have been associated with certain diseases, such as ankylosing spondylitis.
  • the expression of the transcript of this gene has also been studied in septic patients, in which it has been shown that it makes it possible to identify patients with a particular endotype associated with the occurrence of death at 28 days (Scicluna et al. (2017), Lancet Respir Med 5(10):816-826).
  • the subject of the present invention is an in vitro or ex vivo method for determining the risk of occurrence of a healthcare-associated infection in a patient, comprising a step for measuring the expression of the TAP2 gene, in a biological sample of said patient.
  • the term "patient” designates an individual (human being), who has come into contact with a health professional, such as a doctor (for example, a general practitioner) or a medical structure or a health establishment (for example, a hospital, and more particularly the emergency department, the intensive care unit, an intensive care unit or a continuing care unit, or a medical structure for the elderly, of the EHPAD type).
  • a health professional such as a doctor (for example, a general practitioner) or a medical structure or a health establishment (for example, a hospital, and more particularly the emergency department, the intensive care unit, an intensive care unit or a continuing care unit, or a medical structure for the elderly, of the EHPAD type).
  • the patient may for example be an elderly person, as part of a vaccination protocol (in particular in an EHPAD or even at a general practitioner); an infection is said to be "associated with care", if it occurs during or after treatment (diagnostic, therapeutic, palliative, preventive, educational or operative) of a patient by a healthcare professional, and if it was not present at the start of treatment.
  • Healthcare-associated infections include infections contracted within a healthcare facility (known as nosocomial infections) but also during care delivered outside this setting. When the infectious state at the start of treatment is not precisely known, a delay of at least 48 hours or a delay greater than the incubation period is commonly accepted to define an IAS.
  • infectious disease occurs within 30 days of the operation or, if an implant, prosthesis or prosthetic material is placed, within one year of the operation.
  • the infection can be of bacterial, fungal or even viral origin. It may also involve the reactivation of potentially pathogenic latent viruses, such as herpesviruses, for example CMV; "biological sample” refers to any sample from a patient, and may be of different natures, such as blood or its derivatives, sputum, urine, stool, skin, cerebrospinal fluid , bronchoalveolar lavage fluid, abdominal cavity puncture fluid, saliva, gastric secretions, semen, seminal fluid, tears, spinal cord, trigeminal nerve ganglion, adipose tissue, lymphoid tissue, placental tissue, gastrointestinal tract tissue, genital tract tissue, central nervous system tissue.
  • this sample can be a biological fluid, such as a blood sample or a sample derived from blood, which can in particular be chosen from whole blood (as collected from the venous route, that is to say containing the white and red cells, platelets and plasma), plasma, serum, as well as any type(s) of cells extracted from blood, such as peripheral blood mononuclear cells (or PBMC, containing lymphocytes (B, T and NK cells), dendritic cells and monocytes), subpopulations of B cells, purified monocytes, or neutrophils; by “measurement of the expression of CD177” is meant the measurement of the expression of the CD177 gene, that is to say of the gene encoding the CD177 protein.
  • the patient is a patient within a health establishment, preferably within a hospital, more preferably within the emergency department, the resuscitation department, in intensive care unit or continuing care unit; in a particularly preferred manner, the patient is a patient in a septic state (more particularly, in septic shock), a patient suffering from burns (more particularly, severe burns), a patient suffering from trauma (more particularly, severe trauma), or a patient undergoing surgery (more particularly, major surgery); and the method makes it possible to determine the risk of occurrence of a nosocomial infection in said patient.
  • a septic state more particularly, in septic shock
  • burns more particularly, severe burns
  • trauma more particularly, severe trauma
  • a patient undergoing surgery more particularly, major surgery
  • a sepsis patient (or sepsis patient) is defined as a patient with at least one life-threatening organ failure caused by an inappropriate host response to an infection.
  • septic shock is meant a subtype of sepsis, in which hypotension persists, despite adequate vascular filling.
  • the method according to the invention makes it possible to determine the risk of occurrence of a treatment-associated infection in a patient: - within 30 days from the day of the immuno-inflammatory attack, more preferably within 15 days from the day of the immuno-inflammatory attack (ie the trauma for patients with trauma, the burn for patients with burns, surgery for patients operated by surgery or the diagnosis of sepsis for patients in a septic state), i.e.
  • the taking of the biological sample which may in particular have been performed during the 1 st , 2 nd , 3 rd , 4 th , 5 th , 6 th , 7 th , 8 th , 9 th , 10 th , 11 th , 12 th , 13 th , 14 th or 15 th day from the immuno-inflammatory attack (the 1 st day corresponding here on the day of occurrence of the immuno-inflammatory attack); the taking of the biological sample which may in particular have been performed during the 1 st , 2 nd , 3 rd , 4 th , 5 th , 6 th , 7 th , 8 th , 9 th , 10 th , 11 th , 12 th , the 13th, the 14th or 15th day from the immunoinflammatory aggression, preferably in 1, 2 nd, 3 rd, 4 th, 5 th, 6 th or the 7 th day from the immunoinflammatory aggression, preferably at the 3
  • the method as described above further comprises a step of measuring, in the biological sample from the patient, the expression: of at least one gene selected from the family of genes coding for molecules involved in the innate immune system; and/or of at least one gene selected from the family of genes coding for cell cycle molecules; and/or at least one gene selected from the family of genes coding for cytokines; and/or at least one gene selected from the family of genes coding for anti-inflammatory cytokines; and/or at least one gene selected from the family of genes coding for pro-inflammatory cytokine receptors, located in chromosome 2, in the 2q11-2q12 region; and or at least one gene selected from the family of genes coding for pro-inflammatory cytokines; and/or at least one gene selected from the family of genes coding for molecules involved in the formation of the cytoskeleton; and/or at least one gene selected from the family of genes coding for molecules involved in the expression and/or transcription of genes; and/or at least one gene selected from at least one gene selected from the family of genes
  • the molecules involved in the innate immune system are well known to those skilled in the art.
  • the innate immune system includes all the cells and mechanisms that immediately and non-specifically defend the body against all types of infectious agents.
  • Molecules involved in the innate immune system include anti-microbial peptides, the complement system, interferon l-alpha and l-beta, and acute phase proteins.
  • genes coding for molecules involved in the innate immune system we can cite the following genes: GNLY, S100A9, C3AR1, ADGRE3, CD177, CX3CR1, IFIH1, OAS2, OAS3.
  • Cell cycle molecules are also well known to those skilled in the art. They are involved in the regulation of at least one of the phases of the cell cycle, namely G1 phase, S phase, G2 phase and M phase. Thus, these may be the molecules ensuring the execution and transition of each phase of the cell cycle, such as cyclin-dependent kinases, or molecules monitoring the proper execution of each phase.
  • genes coding for cell cycle molecules we can cite the CCNB1IP1, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2B, CDKN2C and CDKN2D genes.
  • Cytokines are also molecules well known to those skilled in the art. These soluble molecules are synthesized by a large number of cells, in particular lymphocytes and macrophages, and are involved in the development and regulation of immune responses. There are different types of cytokines, including chemokines, interferons, interleukins (pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokine), lymphokines and tumor necrosis factor (TNF). As examples of genes coding for cytokines, we can cite the following genes: IL15, IL2, MCP1 (CCL2), CXCL10. As examples of genes coding for anti-inflammatory cytokines, we can cite the genes following: IL10, IL1RN.
  • genes encoding pro-inflammatory cytokine receptors located in chromosome 2, at the level of the 2q11-2q12 region, we can cite the following genes: IL18R1, IL1R2, IL1R1 and IL18RAP.
  • genes encoding pro-inflammatory cytokines we can cite the following genes: IFNG, IL1B, IL17A, IL18, IL6, TNF.
  • the molecules involved in the formation of the cytoskeleton are also well known to those skilled in the art. These include molecules involved in obtaining the protein filaments that make up the cytoskeleton, namely actin microfilaments, microtubules and intermediate filaments.
  • genes coding for molecules involved in the formation of the cytoskeleton we can cite the following genes: ARL14EP, GSN.
  • the molecules involved in the expression and/or transcription of genes are well known to those skilled in the art. These molecules enable gene activity and define the extent to which a gene is expressed.
  • genes coding for molecules involved in the expression and/or transcription of genes we can cite the following genes: CIITA, DYRK2, GATA3, MDC1, NFKB1, RORC, STAT4, TBX21, TDRD9.
  • Growth factors are well known to those skilled in the art. These are the molecules that promote or inhibit cell growth, proliferation or differentiation. By way of example of a gene coding for growth factors, we can cite the CSF2 gene.
  • Metabolism molecules are well known to those skilled in the art. These are the molecules involved in the catabolism or anabolism of cells. By way of examples of genes encoding metabolic molecules, we can cite the following genes: ALOX5, BPGM, TRAP1.
  • Adaptive (or acquired) immunity is one of the mechanisms of action of the immune system.
  • the adaptive immune system is made up of specialized cells and systemic processes that specifically eliminate each pathogen or prevent its development.
  • adaptive immunity creates immunological memory after an initial response to a specific pathogen, then leading to an enhanced response in future encounters with that pathogen.
  • genes coding for molecules involved in the adaptive immune system we can cite the following genes: CD40LG, CD3D, BT LA, CD274, CTL A4, ICOS, PDCD1, TNFSF4, CD74, FCGR1A, LILRB2.
  • the molecules involved in signal transduction are also molecules well known to those skilled in the art.
  • Transduction is the second step in the signaling cascade that follows an extracellular signal and precedes the internal or external cellular response.
  • genes coding for molecules involved in signal transduction we can cite the following genes: FLT1, HAVCR2, IL7R, ZAP70.
  • the molecules involved in the modulation of the acute phase are also well known to those skilled in the art.
  • the acute phase is an innate defense of the body in response to inflammation, characterized by the stimulation or inhibition of the synthesis and/or secretion of blood proteins called acute phase proteins.
  • acute phase proteins As an example of a gene coding for molecules involved in the modulation of the acute phase, we can cite the HP gene.
  • the method as described previously comprises, in addition to the step of measuring the expression of TAP2, a step of measuring, in the biological sample of the patient, the expression: of at least one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine gene(s) selected from the following genes: GNLY, S100A9, C3AR1, ADGRE3, CD177, CX3CR1, IFIH1, OAS2 and OAS3; and/or at least one, two, three, four, five, six, seven gene(s) selected from the following genes: CCNB1IP1, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2B, CDKN2C and CDKN2D; and/or at least one, two, three, four gene(s) selected from the following genes: IL15, IL2, MCP1(CCL2) and CXCL10; and/or at least one or two gene(s) selected from the following genes: IL10 and IL1RN;
  • the method as described previously comprises, in addition to the step of measuring the expression of TAP2, a step of measuring, in the biological sample of the patient, the expression at least one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten, eleven, twelve, thirteen, fourteen, fifteen, sixteen, seventeen, eighteen, nineteen, twenty, twenty-one, twenty-two, twenty-three, twenty-four, twenty-five, twenty-six gene(s) selected from the following genes: GNLY, S100A9, C3AR1, ADGRE3, CD177, CX3CR1, OAS2, CCNB1IP1, IL10, IL1RN, IL1R2, IFNG, TNF, ARL14EP, CIITA, GATA3, MDC1, TDRD9, BPGM, CD3D, CD274, CTL A4, CD74, IL7R, ZAP70 and HP.
  • GNLY S100A9, C3AR1, ADGRE3, CD177, CX3CR1, OAS2, CCNB1IP
  • the method as described previously comprises, in addition to the step of measuring the expression of TAP2, a step of measuring, in the biological sample of the patient, the expression at least one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten, eleven gene(s) selected from the following genes: S100A9, C3AR1, CD177, CX3CR1, IL1R2, IFNG, CIITA, CD3D, CTLA4, CD74 and HP.
  • Table 3 List of preferred combinations of 1 to 11 other gene(s), the expression of which can be measured in combination with the expression of TAP2.
  • the biological sample is a blood sample, preferably a whole blood sample or a sample derived from blood (eg PBMCs, which can be obtained by the Ficoll method, well known to those skilled in the art, or purified monocytes).
  • PBMCs a sample derived from blood
  • the measurement of the expression (or of the level of expression) of a gene consists in quantifying at least one expression product of the gene.
  • the expression product of a gene within the meaning of the present invention, is any biological molecule resulting from the expression of said gene. More particularly, the gene expression product can be an RNA transcript.
  • transcript we mean the RNAs, and in particular the messenger RNAs (mRNAs), resulting from the transcription of the gene. More precisely, the transcripts are the RNAs produced by the transcription of a gene followed by the post-transcriptional modifications of the pre-RNA forms.
  • the measurement of the level of expression of one or more RNA transcripts of the same gene can be carried out.
  • the expression of the gene(s) ie the expression of TAP2, and optionally of one or more other genes of interest, as previously described
  • the expression of the gene(s) is measured at the RNA or mRNA transcribed level.
  • the detection can be carried out by a direct method, by any method known to those skilled in the art making it possible to determine the presence of said transcript in the sample, or by indirect detection of the transcript after transformation of the latter into DNA, or after amplification of said transcript or after amplification of the DNA obtained after transformation of said transcript into DNA.
  • Many methods exist for the detection of nucleic acids see for example Kricka et al., Clinical Chemistry, 1999, n° 45(4), p.453-458; Relier GH et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 and 6, p.173-249).
  • genes can in particular be measured by Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction or RT-PCR, preferably by quantitative RT-PCR or RT-qPCR (for example using FilmArray ® technology or the BiomarkTM platform from Fluidigm), by sequencing (from preferably by high-throughput sequencing) or by hybridization techniques (for example with hybridization microchips or by techniques of the NanoString ® nCounter ® type ).
  • the measurement of the level of expression of a gene makes it possible in particular to determine the quantity of one or more transcripts present in the biological sample or to give a derived value therefrom.
  • a value derived from the quantity can for example be the absolute concentration, calculated using a calibration curve obtained from successive dilutions of a solution of amplicons of known concentration. It can also correspond to the value of the standardized and calibrated quantity, such as the CNRQ.
  • housekeeping genes include the DECRI, HPRT1, PPIB, RPLP0, PPIA, GLYR1, RANBP3, 18S, GAPDH and ACTB genes.
  • the expression of the gene(s) of interest is normalized with respect to the expression of one or more housekeeping genes (or reference genes), as known to those skilled in the art; more preferably using one or more of the following housekeeping genes: DECRI (chromosomal location of the gene according to GRCh38/hg38: chr8:90, 001, 352-90, 053, 633), HPRT1 (chromosomal location of the gene according to GRCh38 /hg38: chrX:134, 452, 842-134, 520, 513) and PPIB (chromosomal location of the gene according to GRCh38/hg38: chrl5:64, 155, 812-64, 163, 205).
  • DECRI chromosomal location of the gene according to GRCh38/hg38: chr8:90, 001, 352-90, 053, 633
  • HPRT1 chromosomal location of the gene according to GRCh38 /hg38:
  • the expression of the gene(s) of interest (preferably, the normalized expression) in the patient's biological sample is compared to a value of reference or to the expression of the same gene(s) of interest (preferably, the normalized expression) in a biological reference sample (these data being used for the calculation of the CNRQ, as mentioned above).
  • the reference sample can be for example a sample from a volunteer (healthy individual), from a patient, or a mixture of samples from several volunteers (on the one hand) or from several patients (on the other hand ).
  • the reference sample can also be a sample taken from a volunteer (or a mixture of samples taken from several volunteers) then treated ex vivo with an immune system stimulating agent (such as LPS or lipopolysaccharide).
  • an immune system stimulating agent such as LPS or lipopolysaccharide.
  • the reference sample can also be a mixture of untreated sample(s) and of samples treated ex vivo with an immune system stimulating agent.
  • the method for determining the risk of occurrence of a healthcare-associated infection can further comprise the steps consisting in :
  • the determination of a reference value is widely known to those skilled in the art in that it involves routine experimentation. This determination consists in particular in implementing an identical assay method, or at least comparable, to that implemented in the method of the invention, in a biological sample from a subject or a group of subjects considered ( s) as not being likely to suffer from a healthcare-associated infection. Also, said determination of a reference value may consist of the implementation of said assay method in biological samples of the two populations studied, and in the determination of the value of the test (quantity) making it possible to discriminate between these two populations, in the present case between that which will become complicated (risk of occurrence of a healthcare-associated infection) and that which will not become complicated (little or no risk of occurrence of a healthcare-associated infection).
  • the predetermined reference value used to compare the quantity measured in the context of the invention, will be determined from the same expression product(s) of the TAP2 gene as those or that quantified in the biological sample to be tested. .
  • reference samples are advantageously of the same nature as that of the biological sample to be tested or at least of a compatible nature to constitute a reference when quantification of TAP2 expression product(s).
  • the reference sample(s) used are preferably from people with the same characteristics or a majority of common characteristics, in particular of the same sex and/or of a similar or identical age and/or of the same ethnic origin, with those of the patient for whom the risk of complication is to be assessed.
  • the reference sample(s) used are preferentially taken from patients in a septic state (more particularly, in septic shock), from patients suffering from burns (more particularly, from severe burns), from patients suffering from trauma (more particularly, from severe trauma ), or patients undergoing surgery (more particularly, major surgery).
  • the determination of the reference value, or value of the test (quantity), making it possible to discriminate between these two populations, can in particular be calculated using the ROC curve (Receiver Operating Characteristic Curve), as illustrated in the embodiments below. -below.
  • the patient when the value of the quantity of the TAP2 expression product is lower than the reference value, then the patient presents an increased risk of occurrence of an infection associated with care, preferably a nosocomial infection .
  • the method for determining the risk of occurrence of a healthcare-associated infection also comprises a healthcare management step to reduce the risk of occurrence of a healthcare-associated infection.
  • a patient identified as being at increased risk of developing a healthcare-associated infection can have appropriate health care management with the aim of reducing the risk of developing a healthcare-associated infection and, for example, in order to reduce the risk of developing sepsis, septic shock or the risk of death.
  • Examples of care management include an immunomodulatory treatment adapted to the patient or a prophylactic antibiotic treatment, the two treatments can be combined and/or refer to a continuing care or resuscitation service in order to reduce the risk occurrence of a treatment-associated infection, for example reducing the risk of developing sepsis, septic shock or even the risk of death in the days following the measurement of the expression of the biomarker(s).
  • the immunomodulatory treatment is an immunostimulatory treatment, if the individual is determined to have an immunosuppressed status, or an anti-inflammatory treatment, if the individual is determined to have an inflammatory status. .
  • immunostimulant treatments which can be selected, mention may be made by way of examples of the group of interleukins, in particular IL-7, IL-15 or IL-3, growth factors, in particular GM-CSF, interferons, in particular IFNy, Toll agonists, antibodies, in particular anti-PDl, anti-PDLl, anti-LAG3, anti-TIM3, anti-IL-10 or anti-CTLA4 antibodies , transferrins and molecules that inhibit apoptosis, FLT3L, Thymosin al, adrenergic antagonists.
  • interleukins in particular IL-7, IL-15 or IL-3
  • growth factors in particular GM-CSF
  • interferons in particular IFNy
  • Toll agonists antibodies, in particular anti-PDl, anti-PDLl, anti-LAG3, anti-TIM3, anti-IL-10 or anti-CTLA4 antibodies , transferrins and molecules that inhibit apoptosis, FLT3L, Thymosin al, a
  • anti-inflammatory treatments particular mention may be made of the group of glucocorticoids, cytostatic agents, molecules acting on immunophilins and cytokines, molecules blocking the IL-1 receptor and anti-TNF treatments.
  • glucocorticoids particularly mention may be made of the group of glucocorticoids, cytostatic agents, molecules acting on immunophilins and cytokines, molecules blocking the IL-1 receptor and anti-TNF treatments.
  • prophylactic antibiotic treatments to prevent pneumonia are described in particular in the Annales conses d'Anesthésie et de Réanimation (30; 2011; 168-190).
  • a patient who does not present a risk of occurrence of a healthcare-associated infection can be quickly referred to a day hospital service, for example an infectiology service, rather than remaining in a service with close monitoring. which he won't need.
  • the invention also relates to a kit comprising means for amplifying (eg primers) and/or means for detecting (eg probes) the expression of TAP2 and of one or more other gene(s) , as indicated previously, in all the embodiments (and, in a particularly preferred manner, one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten or eleven genes, selected from the group consisting of: CD74 , CIITA, IFNG, IL1R2, C3AR1, CD177, HP, CX3R1, S100A9, CTLA4 and CD3D); said kit being characterized in that all of the amplification and/or detection means of said kit allow the detection and/or amplification of at most 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40,
  • biomarker is meant an objectively measurable biological characteristic which represents an indicator of normal or pathological biological processes or of pharmacological response to a therapeutic intervention. This biomarker can in particular be detectable at the mRNA level. More particularly, the biomarker can be an endogenous biomarker or loci (such as a gene or a HERV / Human Endogenous RetroVirus, which is found in the chromosomal material of an individual) or an exogenous biomarker (such as a virus).
  • endogenous biomarker or loci such as a gene or a HERV / Human Endogenous RetroVirus, which is found in the chromosomal material of an individual
  • exogenous biomarker such as a virus
  • said kit can for example also comprise means for amplifying and/or detecting one or more housekeeping genes (preferably selected from the list consisting of: DECRI, HPRT1 and PPIB).
  • the kit can also comprise positive control means making it possible to qualify the quality of the extraction of the RNA, the quality of any process of amplification and/or hybridization.
  • the kit according to the invention comprises means for amplifying (eg primers) and/or means for detecting (eg probes) the expression of TAP2 and of at least one or more other genes selected from the following genes: GNLY, S100A9, C3AR1, ADGRE3, CD177, CX3CR1, IFIH1, OAS2, OAS3, CCNB1IP1, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2B, CDKN2C, CDKN2D, IL15, IL2, MCP1(CCL2), CXCL10, IL10 , IL1RN, IL18R1, IL1R2, IL1R1, IL18RAP, IFNG, IL1B, IL17A, IL18, IL6, TNF, ARL14EP, GSN, CIITA, DYRK2, GATA3, MDC1, NFKB1, RORC, STAT4, TBX21, TDRD9, C
  • primer or “amplification primer” is understood to mean a nucleotide fragment which may consist of 5 to 100 nucleotides, preferably of 15 to 30 nucleotides, and possessing a specificity of hybridization with a target nucleotide sequence, under conditions determined for the initiation of an enzymatic polymerization, for example in an enzymatic amplification reaction of the target nucleotide sequence.
  • primers consisting of two primers.
  • probe or “hybridization probe” is understood to mean a nucleotide fragment typically consisting of 5 to 100 nucleotides, preferably of 15 to 90 nucleotides, even more preferably of 15 to 35 nucleotides, possessing a hybridization specificity under determined conditions to form a hybridization complex with a target nucleotide sequence.
  • the probe also comprises a reporter (such as a fluorophore, an enzyme or any other detection system), which will allow the detection of the target nucleotide sequence.
  • the target nucleotide sequence can be a nucleotide sequence included in a messenger RNA (mRNA) or a nucleotide sequence included in a complementary DNA (cDNA) obtained by reverse transcription of said mRNA.
  • mRNA messenger RNA
  • cDNA complementary DNA
  • probes are preferably used, each preferably having a capacity to hybridize specifically with a different biomarker.
  • hybridization is meant the process during which, under appropriate conditions, two nucleotide fragments, such as for example a hybridization probe and a target nucleotide fragment, having sufficiently complementary sequences, are capable of forming a double strand with stable and specific hydrogen bonds.
  • a nucleotide fragment "capable of hybridizing" with a polynucleotide is a fragment capable of hybridizing with said polynucleotide under hybridization conditions, which can be determined in each case in a known manner.
  • the hybridization conditions are determined by the stringency, that is to say the rigor of the operating conditions.
  • the hybridization is all the more specific as it is carried out at higher stringency.
  • Stringency is defined in particular according to the base composition of a probe/target duplex, as well as by the degree of mismatch between two nucleic acids.
  • the stringency can also be a function of the reaction parameters, such as the concentration and the type of ionic species present in the hybridization solution, the nature and the concentration of denaturing agents and/or the hybridization temperature.
  • the stringency of the conditions under which a hybridization reaction must be carried out will mainly depend on the hybridization probes used. All of these data are well known and the appropriate conditions can be determined by those skilled in the art. In general, depending on the length of the hybridization probes used, the temperature for the hybridization reaction is between about 20 and 70°C, in particular between 35 and 65°C in a saline solution at a concentration of about 0 .5 to 1 M. A step of detecting the hybridization reaction is then carried out.
  • enzyme amplification reaction is meant a process generating multiple copies of a target nucleotide fragment, by the action of at least one enzyme.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • LCR Liigase Chain Reaction
  • RCR Repair Chain Reaction
  • 3SR Self Sustained Sequence Replication
  • NASBA Nucleic Acid Sequence-Based Amplification
  • TMA Transcription Mediated Amplification
  • US-A-5,399,491 and LAMP (Loop mediated isothermal amplification) with patent US6410278.
  • RT-PCR reverse transcription
  • mRNA messenger RNA
  • cDNA complementary DNA
  • a subject of the invention is also the use: of means for amplifying (eg primers) and/or means for detecting (eg probes) the expression of TAP2, and optionally also the expression of one or more other gene(s), as indicated previously, in all the embodiments (and, in a particularly preferred manner, one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten or eleven genes, selected from the group consisting of: CD74, CIITA, IFNG, IL1R2, C3AR1, CD177, HP, CX3R1, S100A9, CTLA4 and CD3D); or of a kit comprising such amplification and/or detection means, and preferably all of the amplification and/or detection means of said kit allow the detection and/or amplification of at most 100 , 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 , 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 biomarkers, in total, and optionally said kit
  • Example 1 The measurement of the expression of TAP2 makes it possible to predict the risk of occurrence of a healthcare-associated infection in a patient
  • - Patients in a septic state/in septic shock according to the first clinical protocol. only patients in septic shock were included, on the basis of a suspicion of an infectious focus, a start of treatment with catecholamines within 48 hours of admission to intensive care and treatment with catecholamines (noradrenaline) > 0.25 pg /kg/min for at least 2 hours.
  • day 1 corresponds to the day of diagnosis of sepsis or septic shock
  • pancreatectomy total or caudal
  • neuroendocrine tumors to the right side
  • hepatectomy on the right side
  • extended colectomy laparotomy
  • abdoperineal resection nephrectomy (laparotomy, PKD)
  • ilio-femoral bypass Scarpa
  • day 1 corresponds to day admission to the intensive care unit or intensive care unit ( ⁇ day of the burn).
  • the exclusion criteria essentially related to factors that could have impacted the immune status and biased the results (for example: severe neutropenia, corticosteroid treatments, onco-haematological pathology, etc.).
  • Each event leading to a suspicion of healthcare-associated infection occurring in the hospital before D30 was independently reviewed by three physicians not involved in patient recruitment. Twenty-six percent of patients developed at least one healthcare-associated infection before D30, or before discharge from hospital.
  • TAP2 The expression level of TAP2 was measured in these samples by RT-qPCR.
  • a volume of 100 pL of blood collected in the PAXgene ® tubes was directly injected into a FilmArray ® bag optimized to detect a panel of genes involved in the host response, including TAP2, by nested PCR.
  • the nucleic acid extraction, reverse-transcription and qPCR steps were carried out sequentially and automatically by the Filmarray ® instrument without external intervention.
  • the threshold cycles (or Ct) determined by the instrument were normalized with respect to the expression of 3 reference genes (DECRI, HPRT1 and PPIB).
  • the association between the expression of TAP2 and the occurrence of a healthcare-associated infection was evaluated for different time intervals of onset of the infection (ie time between sample collection and the 1 st occurrence of an infection).
  • the different time periods considered were: healthcare-associated infection within 4 days and within 7 days after sample collection, regardless of when the sample was collected.
  • the sample considered corresponds to the closest sample taken before the occurrence of the first episode of healthcare-associated infection.
  • the prediction models showed that the expression of TAP2 at the mRNA level, measured at D3/4 or at D5/7 from inclusion in the cohort, made it possible to predict the occurrence of an infection associated care before D15 from inclusion in the cohort (Table 4).
  • Prediction models also showed that expression of TAP2 at the mRNA level predicted the occurrence of healthcare-associated infection within 4 days or within 7 days of sample collection (Table 5). .
  • results obtained show that the measurement of the expression of TAP2 alone makes it possible to predict the occurrence of infection(s) associated with care within 15 days from the immuno-inflammatory attack, within 4 days of sample collection or within 7 days of sample collection.
  • Example 2 The measurement of the expression of one or more other gene(s), in combination with the measurement of the expression of TAP2, makes it possible to improve the predictive performance of the risk of occurrence of an infection associated with care
  • the expression level of TAP2 was measured by RT-qPCR. Multivariate logistic regressions (combination of the measurement of the expression of TAP2 and of one or more other gene(s)) were then carried out.
  • the measurement of the expression of one or more of these other genes, in addition to the measurement of the expression of TAP2, makes it possible to improve the predictive performance (compared to the measurement of the expression of TAP2 alone) of the risk of occurrence of a healthcare-associated infection, whether before D15 from inclusion in the cohort (Table 6) or within 4 days or within 7 days of sample collection (Table 7).
  • TAP2 in combination with one or more other biomarker(s) (multivariate analysis), measured on D3/4 or D5/7 from inclusion in the cohort, for the prediction of the occurrence of an infection associated with care before D15 from inclusion in the cohort, in patients in a septic state/in septic shock, with severe trauma, or hospitalized after major surgery.
  • biomarker(s) multivariate analysis

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Abstract

La présente invention concerne un procédé in vitro ou ex vivo pour déterminer le risque de survenue d'une infection associée aux soins chez un patient, comprenant une étape de mesure de l'expression de TAP2, dans un échantillon biologique dudit patient.

Description

DESCRIPTION
Titre : Procédé pour déterminer le risque de survenue d'une infection associée aux soins chez un patient
La présente invention concerne un procédé in vitro ou ex vivo pour déterminer le risque de survenue d'une infection associée aux soins chez un patient, comprenant une étape de mesure de l'expression de TAP2, dans un échantillon biologique dudit patient.
Le développement d'infections associées aux soins est une complication importante liée aux soins médicaux, en particulier dans les structures de soins médicalisées comme les hôpitaux (où l'on parlera plus précisément d'infections nosocomiales). Il a été montré que les infections nosocomiales en unités de soins intensifs, qui surviennent chez 20 à 40% des patients, étaient associées à une morbidité et une mortalité accrues, une durée plus longue du besoin en soins de suppléance aux défaillances d'organe(s), une durée de séjour plus longue à l'hôpital, des coûts de santé plus importants, et une utilisation plus importante d'antibiotiques, contribuant à la résistance antimicrobienne. L'occurrence des infections associées aux soins est particulièrement exacerbée depuis quelques années, de par l'augmentation des pathogènes multirésistants. L'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) estime à environ 5 millions le nombre d'infections nosocomiales dans les hôpitaux en Europe, conduisant à environ 50 000 morts et un surcoût annuel de 13 à 24 milliards d'euros. De nombreux facteurs influent sur la survenue et le développement des infections associées aux soins, comme l'état général de santé du patient, mais également des facteurs liés à la prise en charge du patient (e.g. l'administration d'antibiotiques et/ou l'utilisation de dispositifs médicaux invasifs), des facteurs liés à l'environnement hospitalier (e.g. le ratio du nombre d'infirmières par rapport au nombre de patients), et l'utilisation variable des techniques aseptiques par le personnel hospitalier. Des recommandations ont été publiées, et la mise en place de programmes de contrôle des infections a été encouragée, en particulier par le U. S. Department of Health and Human Services, le Centre européen pour la prévention et le contrôle des maladies, l'OMS et les agences nationales, pour lesquels la prévention et la réduction des infections associées aux soins sont devenues une priorité majeure. Il a été montré que les programmes de contrôle des infections associées aux soins se révèlent particulièrement efficaces pour réduire les infections sévères. Cependant, il a été estimé qu'un maximum de 65 à 70% des cas d'infections du sang et des voies urinaires, liées à la pose de cathéters, et de 55% des cas de pneumonie associées à la ventilation mécanique et d'infections au niveau du site chirurgical, pourraient être évités. Par ailleurs, l'observance et l'application des procédures selon les recommandations peuvent être compliquées dans certains hôpitaux, particulièrement dans les pays à faibles ou moyens revenus. L'identification précoce des patients à risque de développer une infection associée aux soins serait une étape-clé dans la prévention de ces infections et la prise en charge de ces patients. D'après certaines modélisations, un biomarqueur qui réduirait le temps d'identification des infections associées aux soins chez une population à haut risque, permettrait de réduire la mortalité chez ces patients, avec un bon rapport coût/efficacité. Cependant, il n'existe actuellement pas en clinique de test de diagnostic in vitro permettant d'identifier les patients à haut risque de contracter une infection associée aux soins.
Le gène TAP2 code pour une protéine associée aux membranes de la superfamille des transporteurs ABC (ATP-binding cassette), qui est impliquée dans le transport de peptides du cytoplasme au réticulum endoplasmique dans le cadre du processus de présentation de l'antigène des molécules de classe I. Dans la littérature, des mutations du gène TAP2 ont été associées avec certaines maladies, comme la spondylarthrite ankylosante. L'expression du transcrit de ce gène a par ailleurs été étudiée chez des patients septiques, chez lesquels il a été montré qu'elle permettait d'identifier des patients avec un endotype particulier associé à la survenue de décès à 28 jours (Scicluna et al (2017), Lancet Respir Med 5(10) : 816-826).
Or, il a à présent été découvert que, de façon tout-à-fait surprenante, la mesure de l'expression du gène TAP2 permettait de déterminer le risque de survenue d'une infection associée aux soins chez un patient. Cela n'avait jamais été montré ou suggéré dans la littérature. Les patients ayant un risque élevé de contracter une infection associée aux soins pourraient avantageusement bénéficier d'une prise en charge individualisée.
Ainsi, la présente invention a pour objet un procédé in vitro ou ex vivo pour déterminer le risque de survenue d'une infection associée aux soins chez un patient, comprenant une étape de mesure de l'expression du gène TAP2, dans un échantillon biologique dudit patient.
Dans le cadre de la présente invention : le terme « patient » désigne un individu (être humain), qui est entré en contact avec un professionnel de santé, tel qu'un médecin (par exemple, un médecin généraliste) ou une structure médicale ou un établissement de santé (par exemple, un hôpital, et plus particulièrement le service des urgences, le service de réanimation, une unité de soins intensifs ou une unité de soins continus, ou une structure médicalisée pour personnes âgées, de type EHPAD). Le patient peut par exemple être une personne âgée, dans le cadre d'un protocole de vaccination (notamment en EHPAD ou encore chez un médecin généraliste) ; une infection est dite « associée aux soins », si elle survient au cours ou au décours d'une prise en charge (diagnostique, thérapeutique, palliative, préventive, éducative ou opératoire) d'un patient par un professionnel de santé, et si elle n'était pas présente au début de la prise en charge. Les infections associées aux soins (IAS) comprennent les infections contractées au sein d'un établissement de santé (dites infections nosocomiales) mais aussi lors de soins délivrés hors de ce cadre. Lorsque l'état infectieux au début de la prise en charge n'est pas connu précisément, un délai d'au moins 48 heures ou un délai supérieur à la période d'incubation est couramment accepté pour définir une IAS. Pour les infections du site opératoire, on considère habituellement comme associées aux soins les infections survenant dans les 30 jours suivant l'intervention ou, s'il y a mise en place d'un implant, d'une prothèse ou d'un matériel prothétique dans l'année qui suit l'intervention. L'infection peut être d'origine bactérienne, fongique ou encore virale. Il peut s'agir également de la réactivation de virus latents potentiellement pathogènes, tels les virus d'herpes, par exemple le CMV ; par « échantillon biologique », on se réfère à tout échantillon provenant d'un patient, et pouvant être de différentes natures, comme le sang ou ses dérivés, les expectorations, l'urine, les selles, la peau, le liquide céphalo-rachidien, le liquide de lavage broncho-alvéolaire, le liquide de ponction de la cavité abdominale, la salive, les sécrétions gastriques, le sperme, le liquide séminal, les larmes, la moelle épinière, ganglion du nerf trijumeau, tissu adipeux, tissu lymphoïde, tissu placentaire, tissu du tractus gastro-intestinal, tissu du tractus génital, tissu du système nerveux central. En particulier, cet échantillon peut être un fluide biologique, comme un échantillon de sang ou un échantillon dérivé du sang, qui peut notamment être choisi parmi le sang total (tel que collecté de la voie veineuse, c'est-à-dire contenant les cellules blanches et rouges, les plaquettes et le plasma), le plasma, le sérum, ainsi que tout(tous) type(s) de cellules extraites à partir du sang, telles que les cellules mononuclées sanguines périphériques (ou PBMC, contenant les lymphocytes (B, T et cellules NK), les cellules dendritiques et les monocytes), des sous-populations de cellules B, des monocytes purifiés, ou des neutrophiles ; par « mesure de l'expression de CD177 » on désigne la mesure de l'expression du gène CD177, c'est-à-dire du gène codant la protéine CD177.
De préférence, dans le procédé tel que décrit précédemment : le patient est un patient au sein d'un établissement de santé, de préférence au sein d'un hôpital, de préférence encore au sein du service des urgences, du service de réanimation, en unité de soins intensifs ou en unité de soins continus ; de manière particulièrement préférée, le patient est un patient en état septique (plus particulièrement, en choc septique), un patient atteint de brûlures (plus particulièrement, de brûlures graves), un patient atteint de traumatismes (plus particulièrement, de traumatismes graves), ou un patient opéré par chirurgie (plus particulièrement, une chirurgie lourde) ; et le procédé permet de déterminer le risque de survenue d'une infection nosocomiale chez ledit patient.
Dans le cas d'un patient en état septique (déjà atteint d'une première infection), le procédé selon l'invention permet de déterminer le risque de survenue d'une infection secondaire. Par patient en état septique (ou patient atteint de sepsis), on entend un patient présentant au moins une défaillance d'organe menaçant le pronostic vital et causé par une réponse inappropriée de l'hôte à une infection. Par choc septique, on entend un sous-type de sepsis, dans lequel une hypotension persiste, malgré un remplissage vasculaire adéquat.
De préférence, le procédé selon l'invention, tel que décrit précédemment, dans tous ses modes de réalisation, permet de déterminer le risque de survenue d'une infection associée aux soins chez un patient : - dans les 30 jours à partir du jour de l'agression immuno-inflammatoire, de préférence encore dans les 15 jours à partir du jour de l'agression immuno- inflammatoire (i.e. le traumatisme pour les patients atteints de traumatismes, la brûlure pour les patients atteints de brûlures, la chirurgie pour les patients opérés par chirurgie ou le diagnostic de sepsis pour les patients en état septique), c'est-à-dire au cours du 1er, du 2ème, du 3ème, du 4ème, du 5ème, du 6ème, du 7ème, du 8ème, du 9ème, du 10ème, du 11ème, du 12ème, du 13ème, du 14ème ou du 15ème jour à partir de l'agression immuno-inflammatoire (le 1er jour correspondant ici au jour de survenue de l'agression immuno-inflammatoire) ; le prélèvement de l'échantillon biologique pouvant en particulier avoir été effectué au cours du 1er, du 2ème, du 3ème, du 4ème, du 5ème, du 6ème, du 7ème, du 8ème, du 9ème, du 10ème, du 11ème, du 12ème, du 13ème, du 14ème ou du 15ème jour à partir de l'agression immuno-inflammatoire, de préférence au cours du 1er, du 2ème, du 3ème, du 4ème, du 5ème, du 6ème ou du 7ème jour à partir de l'agression immuno-inflammatoire, de préférence encore au cours du 3ème, du 4ème, du 5ème, du 6ème ou du 7ème jour à partir de l'agression immuno-inflammatoire ; et/ou dans les 7 jours, dans les 6 jours, dans les 5 jours ou dans les 4 jours suivant le jour où le prélèvement de l'échantillon biologique a été effectué (quel que soit le jour où ce prélèvement a été effectué), c'est-à-dire au cours du 1er, du 2ème, du 3ème, du 4ème, du 5ème, du 6ème ou du 7ème jour suivant le jour où le prélèvement de l'échantillon biologique a été effectué (le 1er jour correspondant ici au lendemain du jour où le prélèvement de l'échantillon biologique a été effectué).
De préférence, le procédé tel que décrit précédemment, dans tous ses modes de réalisation, comprend en outre une étape de mesure, dans l'échantillon biologique du patient, de l'expression : d'au moins un gène sélectionné parmi la famille des gènes codant pour des molécules impliquées dans le système immunitaire inné ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi la famille des gènes codant pour des molécules du cycle cellulaire ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi la famille des gènes codant pour des cytokines ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi la famille des gènes codant pour des cytokines anti-inflammatoires ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi la famille des gènes codant pour des récepteurs à cytokines pro-inflammatoires, localisés dans le chromosome 2, au niveau de la région 2q11-2q12 ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi la famille des gènes codant pour des cytokines pro-inflammatoires ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi la famille des gènes codant pour des molécules impliquées dans la formation du cytosquelette ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi la famille des gènes codant pour des molécules impliquées dans l'expression et/ou la transcription de gènes ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi la famille des gènes codant pour des facteurs de croissance ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi la famille des gènes codant pour des molécules du métabolisme ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi la famille des gènes codant pour des molécules impliquées dans le système immunitaire adaptatif ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi la famille des gènes codant pour des molécules impliquées dans la transduction du signal ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi la famille des gènes codant pour des molécules impliquées dans la modulation de la phase aigüe.
Les molécules impliquées dans le système immunitaire inné sont bien connues de l'homme du métier. Le système immunitaire inné comprend l'ensemble des cellules et mécanismes permettant de façon immédiate et non spécifique la défense de l'organisme contre tout type d'agents infectieux. Les molécules impliquées dans le système immunitaire innée sont notamment les peptides anti-microbiens, le système du complément, l'interféron l-alpha et l-beta, et les protéines de la phase aiguë. A titre d'exemples de gènes codant pour des molécules impliquées dans le système immunitaire inné, nous pouvons citer les gènes suivants : GNLY, S100A9, C3AR1, ADGRE3, CD177, CX3CR1, IFIH1, OAS2, OAS3.
Les molécules du cycle cellulaire sont également bien connues de l'homme du métier. Elles sont impliquées dans la régulation d'au moins une des phases du cycle cellulaire, à savoir la phase Gl, la phase S, la phase G2 et la phase M. Ainsi, il peut s'agir des molécules assurant l'exécution et la transition de chaque phase du cycle cellulaire, telles que les kinases cycline-dépendantes, ou des molécules assurant la surveillance de la bonne exécution de chaque phase. A titre d'exemples de gènes codants pour des molécules du cycle cellulaire, nous pouvons citer les gènes CCNB1IP1, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2B, CDKN2C et CDKN2D.
Les cytokines sont également des molécules bien connues de l'homme du métier. Ces molécules solubles sont synthétisées par un grand nombre de cellules, en particulier les lymphocytes et les macrophages, et sont impliquées dans le développement et la régulation des réponses immunitaires. Il existe différent types de cytokines, notamment les chimiokines, les interférons, les interleukines (cytokine pro-inflammatoire et anti inflammatoire), les lymphokines et le facteur de nécrose tumorale (TNF). A titre d'exemples de gènes codant pour des cytokines, nous pouvons citer les gènes suivants : IL15, IL2, MCP1(CCL2), CXCL10.A titre d'exemples de gènes codant pour des cytokines anti-inflammatoires, nous pouvons citer les gènes suivants : IL10, IL1RN. A titre d'exemples de gènes codant pour des récepteurs à cytokines pro-inflammatoires, localisés dans le chromosome 2, au niveau de la région 2q11-2q12, nous pouvons citer les gènes suivants : IL18R1, IL1R2, IL1R1 et IL18RAP. A titre d'exemples de gènes codant pour des cytokines pro-inflammatoires, nous pouvons citer les gènes suivants : IFNG, IL1B, IL17A, IL18, IL6, TNF.
Les molécules impliquées dans la formation du cytosquelette sont également bien connues de l'homme du métier. Il s'agit notamment des molécules impliquées dans l'obtention des filaments protéiques constitutifs du cytosquelette, à savoir les microfilaments d'actine, les microtubules et les filaments intermédiaires. A titre d'exemples de gènes codant pour des molécules impliquées dans la formation du cytosquelette, nous pouvons citer les gènes suivants : ARL14EP, GSN. Les molécules impliquées dans l'expression et/ou la transcription des gènes sont bien connues de l'homme du métier. Ces molécules permettent l'activité des gènes et définissent dans quelle mesure un gène est exprimé. A titre d'exemples de gènes codant pour des molécules impliquées dans l'expression et/ou la transcription de gènes, nous pouvons citer les gènes suivants : CIITA, DYRK2, GATA3, MDC1, NFKB1, RORC, STAT4, TBX21, TDRD9.
Les facteurs de croissance sont bien connus de l'homme du métier. Ce sont les molécules favorisant ou inhibant la croissance, la prolifération ou encore la différenciation des cellules. A titre d'exemple de gène codant pour des facteurs de croissance, nous pouvons citer le gène CSF2.
Les molécules du métabolisme sont bien connues de l'homme du métier. Il s'agit des molécules impliquées dans le catabolisme ou l'anabolisme des cellules. A titre d'exemples de gènes codant pour des molécules du métabolisme, nous pouvons citer les gènes suivants : ALOX5, BPGM, TRAP1.
Les molécules impliquées dans le système immunitaire adaptatif sont également des molécules bien connues de l'homme du métier. L'immunité adaptative (ou acquise) est un des mécanismes d'action du système immunitaire. Le système immunitaire adaptatif est composé de cellules et de processus systémiques spécialisés qui éliminent spécifiquement chaque agent pathogène ou empêchent son développement. En particulier, l'immunité adaptative crée une mémoire immunologique après une réponse initiale à un pathogène spécifique, conduisant alors à une réponse renforcée lors de futures rencontres avec ce pathogène. A titre d'exemples de gènes codant pour des molécules impliquées dans le système immunitaire adaptatif, nous pouvons citer les gènes suivants : CD40LG, CD3D, BT LA, CD274, CTL A4, ICOS, PDCD1, TNFSF4, CD74, FCGR1A, LILRB2. Les molécules impliquées dans la transduction du signal sont aussi des molécules bien connues de l'homme du métier. La transduction est la deuxième étape de la cascade de signalisation qui fait suite à un signal extracellulaire et précède la réponse cellulaire interne ou externe. A titre d'exemples de gènes codant pour des molécules impliquées dans la transduction du signal, nous pouvons citer les gènes suivants : FLT1, HAVCR2, IL7R, ZAP70.
Les molécules impliquées dans la modulation de la phase aigüe sont également bien connues de l'homme du métier. La phase aigüe est une défense innée de l'organisme en réponse à une inflammation, caractérisée par la stimulation ou l'inhibition de la synthèse et/ou de la sécrétion de protéines sanguines appelées protéines de la phase aiguë. A titre d'exemple de gène codant pour des molécules impliquées dans la modulation de la phase aigüe, nous pouvons citer le gène HP.
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Tableau 1. Localisation chromosomique du gène TAP2 et des autres gènes dont l'expression peut être mesurée en combinaison avec celle de TAP2
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Tableau 2. Classification des biomarqueurs pouvant être utilisés en combinaison avec TAP2, en familles et selon leur fonction immunitaire. Le lieu d'expression (type cellulaire sanguin) et la localisation sont également indiqués.
Aussi, de préférence, le procédé tel que décrit précédemment, dans tous ses modes de réalisation, comprend, outre l'étape de mesure de l'expression de TAP2, une étape de mesure, dans l'échantillon biologique du patient, de l'expression : d'au moins un, deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf gène(s) sélectionné(s) parmi les gènes suivants : GNLY, S100A9, C3AR1, ADGRE3, CD177, CX3CR1, IFIH1, OAS2 et OAS3 ; et/ou d'au moins un, deux, trois, quatre, cinq, six, sept gène(s) sélectionné(s) parmi les gènes suivants : CCNB1IP1, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2B, CDKN2C et CDKN2D ; et/ou d'au moins un, deux, trois, quatre gène(s) sélectionné(s) parmi les gènes suivants : IL15, IL2, MCP1(CCL2) et CXCL10 ; et/ou d'au moins un, deux gène(s) sélectionnés parmi les gènes suivants : IL10 et IL1RN ; et/ou d'au moins un, deux, trois, quatre gène (s) sélectionné(s) parmi les gènes suivants : IL18R1, IL1R2, IL1R1 et IL18RAP ; et/ou d'au moins un, deux, trois, quatre, cinq, six gène(s) sélectionné(s) parmi les gènes suivants : IFNG, IL1B, IL17A, IL18, IL6 et TNF ; et/ou d'au moins un, deux gène(s) sélectionné(s) parmi les gènes suivants : ARL14EP et GSN ; et/ou d'au moins un, deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf gène(s) sélectionné(s parmi les gènes suivants : CIITA, DYRK2, GATA3, MDC1, NFKB1, RORC, STAT4, TBX21 et TDRD9 ; et/ou du gène CSF2 ; et/ou d'au moins un, deux, trois, quatre, cinq gène(s) sélectionné(s) parmi les gènes suivants : ALOX5, BPGM et TRAP1 ; et/ou d'au moins un, deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, dix, onze gène(s) sélectionné(s) parmi les gènes suivants : CD40LG, CD3D, BTLA, CD274, CTLA4, ICOS, PDCD1, TNFSF4, CD74, FCGR1A et LILRB2 ; et/ou d'au moins un, deux, trois, quatre gène(s) sélectionné(s) parmi les gènes suivants : FLT1, HAVCR2, IL7R et ZAP70 ; et/ou du gène HP.
De préférence encore, le procédé tel que décrit précédemment, dans tous ses modes de réalisation, comprend, outre l'étape de mesure de l'expression de TAP2, une étape de mesure, dans l'échantillon biologique du patient, de l'expression d'au moins un, deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, dix, onze, douze, treize, quatorze, quinze, seize, dix-sept, dix-huit, dix-neuf, vingt, vingt-et-un, vingt-deux, vingt-trois, vingt- quatre, vingt-cinq, vingt-six gène(s) sélectionné(s) parmi les gènes suivants : GNLY, S100A9, C3AR1, ADGRE3, CD177, CX3CR1, OAS2, CCNB1IP1, IL10, IL1RN, IL1R2, IFNG, TNF, ARL14EP, CIITA, GATA3, MDC1, TDRD9, BPGM, CD3D, CD274, CTL A4, CD74, IL7R, ZAP70 et HP.
De préférence encore, le procédé tel que décrit précédemment, dans tous ses modes de réalisation, comprend, outre l'étape de mesure de l'expression de TAP2, une étape de mesure, dans l'échantillon biologique du patient, de l'expression d'au moins un, deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, dix, onze gène(s) sélectionné(s) parmi les gènes suivants : S100A9, C3AR1, CD177, CX3CR1, IL1R2, IFNG, CIITA, CD3D, CTLA4, CD74 et HP.
Des combinaisons particulièrement préférées d'un ou plusieurs autre(s) gène(s), dont l'expression peut être mesurée en combinaison avec l'expression de TAP2, sont présentées dans le tableau 3.
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Tableau 3. Liste de combinaisons préférées de 1 à 11 autre(s) gène(s), dont l'expression peut être mesurée en combinaison avec l'expression de TAP2.
Conjointement à la mesure de l'expression de TAP2, et comme démontré dans les exemples de réalisation, la mesure de l'expression d'au moins un autre gène ou d'une combinaison d'autres gènes, telle que définie précédemment, permet d'améliorer la spécificité et la sensibilité du procédé d'évaluation du risque de survenue d'une infection associée aux soins. De préférence, dans le procédé tel que décrit précédemment, dans tous ses modes de réalisation, l'échantillon biologique est un échantillon de sang, de préférence un échantillon de sang total ou un échantillon dérivé du sang (e.g. des PBMC, qui peuvent être obtenues par la méthode Ficoll, bien connue de l'homme du métier, ou des monocytes purifiés).
La mesure de l'expression (ou du niveau d'expression) d'un gène consiste à quantifier au moins un produit d'expression du gène. Le produit d'expression d'un gène, au sens de la présente invention, est toute molécule biologique issue de l'expression dudit gène. Plus particulièrement, le produit d'expression du gène peut être un transcrit ARN.
Par « transcrit », on entend les ARN, et en particulier les ARN messagers (ARNm), issus de la transcription du gène. Plus précisément, les transcrits sont les ARN produits par la transcription d'un gène suivi des modifications post-transcriptionnelles des formes pré- ARN. Dans le cadre de la présente invention, la mesure du niveau d'expression d'un ou plusieurs transcrits ARN du même gène peut être effectuée. Ainsi, de préférence, dans le procédé tel que décrit précédemment, dans tous ses modes de réalisation, l'expression du(des) gène(s) (i.e. l'expression de TAP2, et éventuellement d'un ou plusieurs autres gènes d'intérêt, tels que décrits précédemment) est mesurée au niveau transcrit ARN ou ARNm.
Dans le cas d'un transcrit ARNm, la détection peut être réalisée par une méthode directe, par tout procédé connu de l'homme du métier permettant de déterminer la présence dudit transcrit dans l'échantillon, ou par détection indirecte du transcrit après transformation de ce dernier en ADN, ou après amplification dudit transcrit ou après amplification de l'ADN obtenu après transformation dudit transcrit en ADN. De nombreuses méthodes existent pour la détection des acides nucléiques (voir par exemple Kricka et al., Clinical Chemistry, 1999, n° 45(4), p.453-458 ; Relier G. H. et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 et 6, p.173-249). L'expression des gènes peut notamment être mesurée par Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction ou RT-PCR, de préférence par RT-PCR quantitative ou RT-qPCR (par exemple en utilisant la technologie FilmArray® ou la plateforme Biomark™ de Fluidigm), par séquençage (de préférence par séquençage haut débit) ou par des techniques d'hybridation (par exemple avec des micropuces d'hybridation ou par des techniques du type NanoString® nCounter®).
La mesure du niveau d'expression d'un gène permet en particulier de déterminer la quantité d'un ou plusieurs transcrits présents dans l'échantillon biologique ou d'en donner une valeur dérivée. Une valeur dérivée de la quantité peut par exemple être la concentration absolue, calculée grâce à une courbe de calibration obtenue à partir de dilutions successives d'une solution d'amplicons de concentration connue. Elle peut également correspondre à la valeur de la quantité normalisée et calibrée, comme le CNRQ. ( Calibrated Normalized Relative Quantity, (Hellemans et al (2007), Genome biology 8(2):R19), qui intègre les valeurs d'un échantillon de référence (ou d'un calibrateur) et d'un ou plusieurs gènes de ménage (appelés également gènes de référence). A titre d'exemples de gènes de ménage, on peut citer les gènes DECRI, HPRT1, PPIB, RPLP0, PPIA, GLYR1, RANBP3, 18S, GAPDH et ACTB.
Ainsi, de préférence, dans le procédé tel que décrit précédemment, dans tous ses modes de réalisation, l'expression du(des) gène(s) d'intérêt est normalisée par rapport à l'expression d'un ou plusieurs gènes de ménage (ou gènes de référence), comme cela est connu de l'homme du métier ; de préférence encore en utilisant un ou plusieurs des gènes de ménage suivants : DECRI (localisation chromosomique du gène selon le GRCh38/hg38 : chr8:90, 001, 352-90, 053, 633), HPRT1 (localisation chromosomique du gène selon le GRCh38/hg38 : chrX:134, 452, 842-134, 520, 513) et PPIB (localisation chromosomique du gène selon le GRCh38/hg38 : chrl5:64, 155, 812-64, 163, 205). De préférence, dans le procédé tel que décrit précédemment, dans tous ses modes de réalisation, l'expression du(des) gènes d'intérêt (de préférence, l'expression normalisée) dans l'échantillon biologique du patient est comparée à une valeur de référence ou à l'expression du(des) mêmes gènes d'intérêt (de préférence, l'expression normalisée) dans un échantillon biologique de référence (ces données étant utilisées pour le calcul du CNRQ, comme mentionné plus haut). L'échantillon de référence peut être par exemple un échantillon provenant d'un volontaire (individu sain), d'un patient, ou un mélange d'échantillons de plusieurs volontaires (d'une part) ou de plusieurs patients (d'autre part). L'échantillon de référence peut aussi être un échantillon prélevé d'un volontaire (ou un mélange d'échantillons prélevés sur plusieurs volontaires) puis traité ex vivo par un agent stimulant du système immunitaire (tel que le LPS ou lipopolysaccharide). L'échantillon de référence peut également être un mélange d'échantillon(s) non traités et d'échantillons traité(s) ex vivo par un agent stimulant du système immunitaire.
Ainsi, le procédé pour déterminer le risque de survenue d'une infection associée aux soins, tel que décrit précédemment et comprenant une étape de mesure de l'expression de TAP2 dans l'échantillon biologique du patient, peut en outre comprendre les étapes consistant à :
- comparer l'expression de TAP2 ou une valeur dérivée de cette expression, à une valeur de référence prédéterminée ; et
- établir une conclusion quant au risque de survenue d'une infection associée aux soins.
La détermination d'une valeur de référence est largement connue de l'homme du métier en ce qu'il s'agit d'une expérimentation de routine. Cette déterminationconsiste notamment à mettre en œuvre une méthode de dosage identique, ou pour le moins comparable, à celle mise en œuvre dans le procédé de l'invention, dans un échantillon biologique issu d'un sujet ou d'un groupe de sujets considéré(s) comme n'étant pas susceptible de souffrir d'une infection associée aux soins. Aussi, ladite détermination d'une valeur de référence peut consister en la mise en œuvre de ladite méthode de dosage dans des échantillons biologiques des deux populations étudiées, et en la détermination delà valeur du test (quantité) permettant de faire une discrimination entre ces deux populations, dans le cas présent entre celle qui va se compliquer (risque de survenue d'une infection associée aux soins)et celle qui ne va pas se compliquer (peu ou pas de risque de survenue d'une infection associée aux soins).
La valeur de référence prédéterminée, utilisée pour comparer la quantité mesurée dans le cadre de l'invention, sera déterminée à partir du ou des mêmes produits d'expression du gène TAP2 que ceux ou celui quantifié(s) dans l'échantillon biologique à tester.
Les échantillons à partir desquels sont déterminées les valeurs de référence, encore nommés « échantillons de référence », sont avantageusement de même nature que celle de l'échantillon biologiques à tester ou tout du moins, d'une nature compatible pour constituer une référence quand à la quantification du ou des produits d'expression de TAP2.
Le ou les échantillons de référence utilisés sont, de préférence, issus de personnes ayant les mêmes caractéristiques ou une majorité de caractéristiques communes, notamment du même sexe et/ou d'un âge similaire ou identique et/ou de même origine ethnique, avec celles du patient pour lequel on souhaite évaluer le risque de complication. Le ou les échantillons de référence utilisés sont préférentiellement issus de patients en état septique (plus particulièrement, en choc septique), de patients atteints de brûlures (plus particulièrement, de brûlures graves), de patients atteints de traumatismes (plus particulièrement, de traumatismes graves), ou de patients opérés par chirurgie (plus particulièrement, une chirurgie lourde). La détermination de la valeur de référence, ou valeur du test (quantité), permettant de faire une discrimination entre ces deux populations, peut notamment être calculée grâce à la courbe ROC (Receiver Operating Characteristic Curve), comme illustré dans les exemples de réalisation ci-dessous.
Selon un mode de réalisation particulier, lorsque la valeur de la quantité du produit d'expression de TAP2 est inférieure à la valeur de référence, alors le patient présente un risque accru de survenue d'une infection associée aux soins, de préférence une infection nosocomiale.
De préférence, le procédé pour déterminer le risque de survenue d'une infection associée aux soins, tel que décrit précédemment, dans tous ses modes de réalisation, comprend également une étape de gestion des soins de santé pour réduire le risque de survenue d'une infection associée aux soins. Un patient identifié comme étant à risque accru de survenue d'une infection associée aux soins peut avoir une gestion des soins de santé adaptée dans le but de réduire le risque de survenue d'une infection associée aux soins et, par exemple, afin de réduire le risque de développer un sepsis, un choc septique ou encore le risque de décès. A titre d'exemples de gestion des soins, on peut citer un traitement immunomodulateur adapté au patient ou encore un traitement antibiotique prophylactique, les deux traitements pouvant être associés et/ou orienter vers un service de soins continus ou de réanimation afin de réduire le risque de survenue d'une infection associée aux soins, par exemple réduire le risque de développer un sepsis, un choc septique ou même le risque de décès dans les jours qui suivent la mesure de l'expression du ou des biomarqueur(s). De manière préférée, le traitement immunomodulateur est un traitement immunostimulant, s'il est déterminé que l'individu a un statut d'immunosuppression, ou un traitement anti-inflammatoire, s'il est déterminé que l'individu a un statut d'inflammation. Parmi les traitements immunostimulants qui peuvent être sélectionnés, on peut citer à titre d'exemples le groupe des interleukines, en particulier IL-7, IL-15 ou IL-3, des facteurs de croissance, en particulier le GM-CSF, des interférons, en particulier IFNy, des Toll agonistes, des anticorps, en particulier des anticorps anti-PDl, anti-PDLl, anti-LAG3, anti-TIM3, anti- IL-10 ou anti-CTLA4, des transferrines et des molécules inhibitrices de l'apoptose, FLT3L, Thymosin al, des antagonistes adrénergiques. Parmi les traitements anti- inflammatoires, on peut citer notamment le groupe des glucocorticoïdes, des agents cytostatiques, des molécules agissant sur les immunophilines et les cytokines, des molécules bloquant le récepteur à l'IL-l et des traitements anti-TNF. Des exemples de traitements antibiotiques prophylactiques appropriés pour prévenir la pneumonie sont décrits en particulier dans les Annales Françaises d'Anesthésie et de Réanimation (30 ; 2011 ; 168-190). Inversement, un patient ne présentant pas de risque de survenue d'une infection associée aux soins pourra être orienté rapidement vers un service d'hospitalisation de jour, par exemple un service d'infectiologie, plutôt que de rester dans un service avec un monitoring rapproché dont il n'aura pas besoin.
L'invention a également pour objet un kit comprenant des moyens d'amplification (e.g. amorces) et/ou des moyens de détection (e.g. sondes) de l'expression de TAP2 et d'un ou plusieurs autre(s) gène(s), comme indiqué précédemment, dans tous les modes de réalisation (et, de manière particulièrement préférée, un, deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, dix ou onze gènes, sélectionnés dans le groupe constitué par : CD74, CIITA, IFNG, IL1R2, C3AR1, CD177, HP, CX3R1, S100A9, CTLA4 et CD3D) ; ledit kit étant caractérisé en ce que l'ensemble des moyens d'amplification et/ou de détection dudit kit permettent la détection et/ou l'amplification d'au plus 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40,
30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6,
5, 4, 3, 2 biomarqueurs, au total. Par « biomarqueur » (ou « marqueur »), on entend une caractéristique biologique mesurable objectivement qui représente un indicateur des processus biologiques normaux ou pathologiques ou de réponse pharmacologique à une intervention thérapeutique. Ce biomarqueur peut en particulier être détectable au niveau ARNm. Plus particulièrement, le biomarqueur peut être un biomarqueur endogène ou loci (tel qu'un gène ou un HERV / Human Endogenous RetroVirus, qui se retrouvent dans le matériel chromosomique d'un individu) ou un biomarqueur exogène (tel qu'un virus).
Tous les éléments et modes de réalisation décrits précédemment pour le procédé in vitro ou ex vivo selon l'invention s'appliquent également au kit objet de l'invention.
Ainsi, ledit kit peut par exemple comprendre également des moyens d'amplification et/ou de détection d'un ou plusieurs gènes de ménage (de préférence sélectionnés dans la liste constituée par : DECRI, HPRT1 et PPIB). Le kit peut également comprendre des moyens de contrôle positif permettant de qualifier la qualité de l'extraction de l'ARN, la qualité de tout procédé d'amplification et/ou d'hybridation.
Selon un mode de réalisation particulier, le kit selon l'invention comprend des moyens d'amplification (e.g. amorces) et/ou des moyens de détection (e.g. sondes) de l'expression de TAP2 et d'au moins un ou plusieurs autres gènes sélectionnés parmi les gènes suivants : GNLY, S100A9, C3AR1, ADGRE3, CD177, CX3CR1, IFIH1, OAS2, OAS3, CCNB1IP1, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2B, CDKN2C, CDKN2D, IL15, IL2, MCP1(CCL2), CXCL10, IL10, IL1RN, IL18R1, IL1R2, IL1R1, IL18RAP, IFNG, IL1B, IL17A, IL18, IL6, TNF, ARL14EP, GSN, CIITA, DYRK2, GATA3, MDC1, NFKB1, RORC, STAT4, TBX21, TDRD9, CSF2, ALOX5, BPGM, TRAP1,CD40LG, CD3D, BT LA, CD274, CTLA4, ICOS, PDCD1, TNFSF4, CD74, FCGR1A, LILRB2, FLT1, HAVCR2, IL7R, ZAP70, HP et leurs combinaisons ; de préférence au moins un ou plusieurs autres gènes sélectionnés parmi les gènes suivants : GNLY, S100A9, C3AR1, ADGRE3, CD177, CX3CR1, OAS2, CCNB1IP1, IL10, IL1RN, IL1R2, IFNG, TNF, ARL14EP, CIITA, GATA3, MDC1, TDRD9, BPGM, CD3D, CD274, CTLA4, CD74, IL7R, ZAP70, HP et leurs combinaisons ; et de préférence encore au moins un ou plusieurs autres gènes sélectionnés parmi les gènes suivants : S100A9, C3AR1, CD177, CX3CR1, IL1R2, IFNG, CIITA, CD3D, CTLA4, CD74, HP et leurs combinaisons. Selon ce mode de réalisation, l'ensemble des moyens d'amplification et/ou de détection dudit kit permettent la détection et/ou l'amplification d'au plus 100, 90, 80,
70, 60, 50, 40, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11,
10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 biomarqueurs, au total.
On entend par « amorce » ou « amorce d'amplification », un fragment nucléotidique pouvant être constitué de 5 à 100 nucléotides, de préférence de 15 à 30 nucléotides, et possédant une spécificité d'hybridation avec une séquence nucléotidique cible, dans des conditions déterminées pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une réaction d'amplification enzymatique de la séquence nucléotidique cible. Généralement, on utilise des « couples d'amorces », constitués de deux amorces. Lorsque l'on souhaite réaliser l'amplification de plusieurs biomarqueurs (e.g des gènes) différents, plusieurs couples d'amorces différents sont de préférence utilisés, ayant préférentiellement chacun une capacité à s'hybrider spécifiquement avec un biomarqueur différent.
On entend par « sonde » ou « sonde d'hybridation », un fragment nucléotidique constitué typiquement de 5 à 100 nucléotides, de préférence de 15 à 90 nucléotides, de manière encore plus préférée de 15 à 35 nucléotides, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec une séquence nucléotidique cible. La sonde comporte également un rapporteur (tel qu'un fluorophore, une enzyme ou tout autre système de détection), qui va permettre la détection de la séquence nucléotidique cible. Dans la présente invention, la séquence nucléotidique cible peut être une séquence nucléotidique comprise dans un ARN messager (ARNm) ou une séquence nucléotidique comprise dans un ADN complémentaire (ADNc) obtenu par transcription inverse dudit ARNm. Lorsque l'on souhaite cibler plusieurs biomarqueurs (e.g. des gènes) différents, plusieurs sondes différentes sont de préférence utilisées, ayant préférentiellement chacune une capacité à s'hybrider spécifiquement avec un biomarqueur différent. Par « hybridation », on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux fragments nucléotidiques, tels que par exemple une sonde d'hybridation et un fragment nucléotidique cible, ayant des séquences suffisamment complémentaires, sont susceptibles de former un double brin avec des liaisons hydrogènes stables et spécifiques. Un fragment nucléotidique "capable de s'hybrider" avec un polynucléotide est un fragment pouvant s'hybrider avec ledit polynucléotide dans des conditions d'hybridation, qui peuvent être déterminées dans chaque cas de façon connue. Les conditions d'hybridation sont déterminées par la stringence, c'est-à- dire la rigueur des conditions opératoires. L'hybridation est d'autant plus spécifique qu'elle est effectuée à plus forte stringence. La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases d'un duplex sonde/cible, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux acides nucléiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. La stringence des conditions dans lesquelles une réaction d'hybridation doit être réalisée dépendra principalement des sondes d'hybridation utilisées. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. En général, selon la longueur des sondes d'hybridation utilisées, la température pour la réaction d'hybridation est comprise entre environ 20 et 70°C, en particulier entre 35 et 65°C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M. On réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation. Par « réaction d'amplification enzymatique », on entend un processus générant de multiples copies d'un fragment nucléotidique cible, par l'action d'au moins une enzyme. De telles réactions d'amplification sont bien connues de l'homme du métier et on peut citer notamment les techniques suivantes : PCR (Polymerase Chain Reaction), LCR (Ligase Chain Reaction), RCR (Repair Chain Reaction), 3SR (Self Sustained Séquence Réplication) avec la demande de brevet WO-A-90/06995, NASBA ( Nucleic Acid Sequence-Based Amplification), TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US-A-5,399,491, et LAMP (Loop mediated isothermal amplification) avec le brevet US6410278. Lorsque la réaction d'amplification enzymatique est une PCR, on parlera plus particulièrement de RT-PCR (RT pour « reverse transcription »), lorsque l'étape d'amplification est précédée d'une étape de réverse-transcription d'ARN messager (ARNm) en ADN complémentaire (ADNc), et de qPCR ou RT-qPCR lorsque la PCR est quantitative.
L'invention a également pour objet l'utilisation : de moyens d'amplification (e.g. amorces) et/ou de moyens de détection (e.g. sondes) de l'expression de TAP2, et optionnellement également de l'expression d'un ou plusieurs autre(s) gène(s), comme indiqué précédemment, dans tous les modes de réalisation (et, de manière particulièrement préférée, un, deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, dix ou onze gènes, sélectionnés dans le groupe constitué par : CD74, CIITA, IFNG, IL1R2, C3AR1, CD177, HP, CX3R1, S100A9, CTLA4 et CD3D) ; ou d'un kit comprenant de tels moyens d'amplification et/ou de détection, et de préférence l'ensemble des moyens d'amplification et/ou de détection dudit kit permettent la détection et/ou l'amplification d'au plus 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 biomarqueurs, au total, et optionnellement ledit kit comprend également des moyens d'amplification et/ou de détection de l'expression d'un ou plusieurs gènes de ménage (de préférence sélectionnés dans la liste constituée par : DECRI, HPRT1 et PPIB), pour déterminer le risque de survenue d'une infection associée aux soins, de préférence d'une infection nosocomiale, chez un patient, de préférence un patient au sein d'un établissement de santé, de préférence encore au sein d'un hôpital, de préférence encore au sein du service des urgences, du service de réanimation, en unité de soins intensifs ou en unité de soins continus ; de manière particulièrement préférée, le patient est un patient en état septique (plus particulièrement en choc septique), un patient atteint de brûlures (plus particulièrement, de brûlures graves), un patient atteint de traumatismes (plus particulièrement, de traumatismes graves), ou un patient opéré par chirurgie (plus particulièrement, une chirurgie lourde).
La présente invention est illustrée de manière non limitative par les exemples suivants.
Exemple 1 : La mesure de l'expression de TAP2 permet de prédire le risque de survenue d'une infection associée aux soins chez un patient
Matériels et Méthodes
Une étude clinique observationnelle prospective, longitudinale et monocentrique a été réalisée à l'Hôpital Edouard Herriot (Lyon, France). Le design de cette étude clinique a été publié dans Roi et al (2017), BMJ Open 7(6) : e015734. L'étude clinique a été approuvée par l'Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM) en novembre 2015 et le Comité de Protection des Personnes Sud-Est II en décembre 2015. Des amendements au protocole ont été effectués en juillet 2016, puis en janvier 2017. Brièvement, un total de 377 patients, en état septique (n=35) ou en choc septique (n=72), atteints de brûlures graves (n=24), de traumatismes graves (n=137) ou hospitalisés dans un service de réanimation ou une unité de soins intensifs après une chirurgie majeure (n=109), et 175 volontaires sains ont été inclus entre décembre 2015 et mars 2018. - Patients en état septique/en choc septique : selon le premier protocole clinique. seuls les patients en choc septique étaient inclus, sur la base d'une suspicion d'un foyer infectieux, un début de traitement par catécholamines dans les 48h suivant l'admission en réanimation et d'un traitement au catécholamines (noradrénaline) > 0.25 pg/kg/min pendant au moins 2 heures. Ensuite, les critères d'éligibilité ont été modifiés en août 2016, suite à la publication d'une nouvelle définition du choc septique, Sepsis 3 (Singer et al (2016), JAMA 810-801:(8)315). Les patients en choc septique étaient donc inclus sur la base d'une suspicion d'un foyer infectieux, un début de traitement par catécholamines dans les 48h suivant l'admission en réanimation et d'une thérapie vasopressive nécessaire pour maintenir une pression artérielle > 65 mm Hg et concentration en lactate > 2 mmol/L (18 mg/dL), malgré la correction d'une hypovolémie. En 2017, a été ajoutée la possibilité d'inclure des patients en état septique (selon la définition Sepsis 3), à savoir la suspicion d'un foyer infectieux et l'augmentation du score SOFA > 2 points par rapport au SOFA de base dans les 48h qui suivent l'admission en réanimation. Pour cette population, le jour 1 correspond au jour du diagnostic du sepsis ou du choc septique ;
- Traumatismes graves : dans le premier protocole, seuls les patients avec un traumatisme grave ont été inclus (Injury Severity Score (ISS) > 25). En août 2016, a été ajoutée la possibilité d'inclure également des traumatismes moins graves (16 < ISS < 24). Pour cette population, le jour 1 correspond au jour d'admission en en service de réanimation ou unité de soins intensifs (~jour du traumatisme) ;
- Chirurgie majeure : dans le premier protocole, seules une œsogastrectomie, une résection de la vessie de type Bricker, une duodénopancréatectomie céphalique et chirurgie de l'aorte abdominale par laparotomie ont été considérées. D'autres types de chirurgie à haut risque de complication ont été ajoutés en janvier 2017 : une pancréatectomie (totale ou caudale), des tumeurs neuroendocrines, une hépatectomie (sur le côté droit), une colectomie étendue (laparotomie), une résection abdopérinéale, une néphrectomie (laparotomie, PKD), un pontage ilio- fémoral (Scarpa). Pour cette population, le jour 1 correspond au jour de la chirurgie ;
- Brûlures graves : les patients ont été sélectionnés sur la base d'une surface totale de brûlures supérieure à 30%. Pour cette population, le jour 1 correspond au jour d'admission en service de réanimation ou unité de soins intensifs (~ jour de la brûlure).
Les critères d'exclusion portaient essentiellement sur des facteurs qui auraient pu impacter le statut immunitaire et biaiser les résultats (par exemple : une neutropénie sévère, des traitements corticostéroïdes, une pathologie onco-hématologique...). Chaque événement conduisant à une suspection d'infection associée aux soins, survenant au sein de l'hôpital avant le J30 a été revu indépendamment par trois médecins non impliqués dans le recrutement des patients. Vingt-six pourcents des patients ont développé au moins une infection associée aux soins avant le J30, ou avant la sortie de l'hôpital.
Des échantillons de sang ont été collectés dans des tubes PAXgene® (ref. 762165, PreAnalytiX GmbH Hombrechtikon Switzerland), une fois pour les volontaires sains, et plusieurs fois pour une sous-cohorte de 242 patients (i.e. 82 patients en état septique/en choc septique, 83 patients atteints de traumatismes graves, 61 patients hospitalisés dans un service de réanimation ou une unité de soins intensifs après une chirurgie majeure et 16 patients atteints de brûlures graves), i.e. 3-4 fois la première semaine (aux jours 1 ou 2 : Jl/2, aux jours 3 ou 4 : J3/4 et aux jours 5, 6 ou 7 : J5/7), puis 3 fois à des temps plus tardifs (autour du J14, du J28 et du J60).
Le niveau d'expression de TAP2 a été mesuré dans ces échantillons par RT-qPCR. Un volume de 100 pL de sang collecté dans les tubes PAXgene® a été directement injecté dans une poche FilmArray® optimisée pour détecter un panel de gènes impliqués dans la réponse de l'hôte, dont TAP2, par nested PCR. Les étapes d'extraction des acides nucléiques, de reverse-transcription et de qPCR ont été réalisées de manière séquentielle et automatique par l'instrument Filmarray® sans intervention extérieure. Les cycles seuils (ou Ct) déterminés par l'instrument ont été normalisés par rapport à l'expression de 3 gènes de référence (DECRI, HPRT1 et PPIB). En ce qui concerne l'analyse des données, les associations entre l'expression de TAP2, mesurée à différents temps durant la première semaine, et la survenue d'une infection associée aux soins avant le J30 à partir de l'inclusion dans l'étude ont été évaluées. Les résultats ont été calculés sous la forme d ’Hazard Ratios exprimés en distance inter- quartile avec l'intervalle de confiance à 95% associé (HR IQ.R). Ensuite, des régressions logistiques univariées ont été implémentées pour prédire le risque d'occurrence d'une infection associée aux soins avant le J15. La puissance des valeurs prédites par la régression logistique pour discriminer entre infection associée aux soins et absence d'infection associée aux soins a été quantifiée par l'aire sous la courbe (AUC) de la courbe ROC (Receiver Operating Characteristic), et des intervalles de confiance à 95% ont été estimés.
Ensuite, l'association entre l'expression de TAP2 et l'occurrence d'une infection associée aux soins a été évaluée pour différents intervalles de temps de survenue de l'infection (i.e. délais entre le prélèvement d'échantillon et la lère survenue d'une infection). Les différents délais considérés étaient : une infection associée aux soins dans les 4 jours et dans les 7 jours après le prélèvement d'échantillon, quel que soit le moment où l'échantillon a été prélevé. Pour chaque patient ayant développé une infection associée aux soins, l'échantillon considéré correspond au plus proche prélèvement avant la survenue du premier épisode d'infection associée aux soins.
Pour les patients n'ayant pas développé d'infection associée aux soins (i.e. patients contrôles), une méthode d'appariement a été utilisée pour sélectionner pour chaque cas, un patient contrôle ayant le même jour de prélèvement de l'échantillon, et des scores SOFA et Charlson proches. Finalement, un unique contrôle a été sélectionné pour chaque cas unique. Des régressions logistiques univariées ont été implémentées. La puissance des valeurs prédites par la régression logistique pour discriminer entre infection associée aux soins et absence d'infection associée aux soins a été quantifiée par l'aire sous la courbe (AUC) de la courbe ROC, et des intervalles de confiance à 95% ont été estimés.
Résultats Une diminution de l'expression de TAP2 au niveau ARNm, mesurée à J5/7 à partir de l'inclusion dans la cohorte, était associée avec un risque plus élevé d'occurrence d'une infection associée aux soins avant le J30 dans la population globale des patients (analyse univariée : HR IQ.R=0,39 [0,24-0,63], p=0,0002). Cette association était toujours significative après ajustement avec les scores SOFA et Charlson (analyse multivariée : HR IQR=0,40 [0,24-0,67], p=0,0005).
Par ailleurs, les modèles de prédiction ont montré que l'expression de TAP2 au niveau ARNm, mesurée à J3/4 ou à J5/7 à partir de l'inclusion dans la cohorte, permettait de prédire l'occurrence d'une infection associée aux soins avant le J15 à partir de l'inclusion dans la cohorte (Tableau 4).
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Tableau 4. Performance (AUC et intervalles de confiance à 95%, avec les bornes AUC.2.5 et AUC.97.5) de la mesure de l'expression de TAP2, mesurée à J3/4 ou à J5/7 à partir de l'inclusion dans la cohorte, pour la prédiction de survenue d'une infection associée aux soins avant le J15 à partir de l'inclusion dans la cohorte, chez des patients en état septique/en choc septique, atteints de traumatismes graves, ou hospitalisés après une chirurgie majeure.
Les modèles de prédiction ont également montré que l'expression de TAP2 au niveau ARNm, permettait de prédire l'occurrence d'une infection associée aux soins dans les 4 jours ou dans les 7 jours suivant le prélèvement de l'échantillon (Tableau 5).
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Tableau 5. Performance (AUC et intervalles de confiance à 95%, avec les bornes AUC.2.5 et AUC.97.5) de la mesure de l'expression de TAP2, pour la prédiction de survenue d'une infection associée aux soins dans les 4 jours ou dans les 7 jours suivant le prélèvement d'échantillon.
Ainsi, les résultats obtenus montrent que la mesure de l'expression de TAP2 seul permet de prédire la survenue d'infection(s) associée(s) aux soins dans les 15 jours à partir de l'agression immuno-inflammatoire, dans les 4 jours suivant le prélèvement de l'échantillon ou dans les 7 jours suivant le prélèvement de l'échantillon.
Exemple 2 : La mesure de l'expression d'un ou plusieurs autre(s) gène(s), en combinaison avec la mesure de l'expression de TAP2, permet d'améliorer la performance prédictive du risque de survenue d'une infection associée aux soins
Dans cet exemple, le niveau d'expression de TAP2, mais également d'autres gènes, a été mesuré par RT-qPCR. Des régressions logistiques multivariées (combinaison de la mesure de l'expression de TAP2 et d'un ou plusieurs autre(s) gène(s)) ont ensuite été effectuées. La mesure de l'expression d'un ou plusieurs de ces autres gènes, en plus de la mesure de l'expression de TAP2, permet d'améliorer la performance prédictive (par rapport à la mesure de l'expression de TAP2 seul) du risque de survenue d'une infection associée aux soins, que ce soit avant le J15 à partir de l'inclusion dans la cohorte (Tableau 6) ou dans les 4 jours ou dans les 7 jours suivant le prélèvement de l'échantillon (Tableau 7).
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TAP2, en combinaison avec un ou plusieurs autre(s) biomarqueur(s) (analyse multivariée), mesurée à J3/4 ou à J5/7 à partir de l'inclusion dans la cohorte, pour la prédiction de survenue d'une infection associée aux soins avant le J15 à partir de l'inclusion dans la cohorte, chez des patients en état septique/en choc septique, atteints de traumatismes graves, ou hospitalisés après une chirurgie majeure.
[Tableau 7]
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Tableau 7. Performance (AUC et intervalle de confiance à 95%, avec les bornes AUC.2.5 et AUC.97.5) de la mesure de l'expression de TAP2, en combinaison avec un ou plusieurs autre(s) biomarqueur(s) (analyse multivariée), pour la prédiction de survenue d'une infection associée aux soins dans les 4 jours ou dans les 7 jours suivant le prélèvement d'échantillon.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé in vitro ou ex vivo pour déterminer le risque de survenue d'une infection associée aux soins, de préférence une infection nosocomiale, chez un patient, de préférence un patient au sein d'un établissement de santé, comprenant une étape de mesure de l'expression de TAP2, dans un échantillon biologique dudit patient.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de mesure, dans l'échantillon biologique du patient, de l'expression : d'au moins un gène sélectionné parmi la famille des gènes codant pour des molécules impliquées dans le système immunitaire inné ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi la famille des gènes codant pour des molécules du cycle cellulaire ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi la famille des gènes codant pour des cytokines ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi la famille des gènes codant pour des cytokines anti-inflammatoires ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi la famille des gènes codant pour des récepteurs à cytokines pro-inflammatoires, localisés dans le chromosome 2, au niveau de la région 2q11-2q12 ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi la famille des gènes codant pour des cytokines pro-inflammatoires ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi la famille des gènes codant pour des molécules impliquées dans la formation du cytosquelette ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi la famille des gènes codant pour des molécules impliquées dans l'expression et/ou la transcription de gènes ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi la famille des gènes codant pour des facteurs de croissance ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi la famille des gènes codant pour des molécules du métabolisme ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi la famille des gènes codant pour des molécules impliquées dans le système immunitaire adaptatif ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi la famille des gènes codant pour des molécules impliquées dans la transduction du signal ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi la famille des gènes codant pour des molécules impliquées dans la modulation de la phase aigüe.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mesure, dans l'échantillon biologique du patient, de l'expression : d'au moins un gène sélectionné parmi les gènes suivants : GNLY, S100A9, C3AR1, ADGRE3, CD177, CX3CR1, IFIH1, OAS2 et OAS3 ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi les gènes suivants : CCNB1IP1, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2B, CDKN2C et CDKN2D ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi les gènes suivants : IL15, IL2, MCP1(CCL2) et CXCL10 ; et/ou - d'au moins un gène sélectionné parmi les gènes suivants : IL10 et IL1RN ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi les gènes suivants : IL18R1, IL1R2, IL1R1 et IL18RAP ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi les gènes suivants : IFNG, IL1B, IL17A, IL18, IL6 et TNF ; et/ou - d'au moins un gène sélectionné parmi les gènes suivants : ARL14EP et GSN ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi les gènes suivants : CIITA, DYRK2, GATA3, MDC1, NFKB1, RORC, STAT4, TBX21 et TDRD9 ; et/ou du gène CSF2 ; et/ou - d'au moins un gène sélectionné parmi les gènes suivants : ALOX5, BPGM et
TRAP1 ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi les gènes suivants : CD40LG, CD3D, BTLA, CD274, CTLA4, ICOS, PDCD1, TNFSF4, CD74, FCGR1A et LILRB2 ; et/ou d'au moins un gène sélectionné parmi les gènes suivants : FLT1, HAVCR2, IL7R et ZAP70 ; et/ou du gène HP.
4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mesure, dans l'échantillon biologique du patient, de l'expression d'au moins un gène sélectionné parmi les gènes suivants : GNLY, S100A9, C3AR1, ADGRE3, CD177, CX3CR1, OAS2, CCNB1IP1, IL10, IL1RN, IL1R2, IFNG, TNF, ARL14EP, CIITA, GATA3, MDC1, TDRD9, BPGM, CD3D, CD274, CTLA4, CD74, IL7R, ZAP70 et HP.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mesure, dans l'échantillon biologique du patient, de l'expression d'au moins un gène sélectionné parmi les gènes suivants : S100A9, C3AR1, CD177, CX3CR1, IL1R2, IFNG, CIITA, CD3D, CTL A4, CD74 et HP.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est un échantillon de sang, de préférence un échantillon de sang total.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'expression est mesurée au niveau ARN messager (ARNm).
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'expression est mesurée par RT-PCR, de préférence par RT-qPCR.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'expression est mesurée par séquençage.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'expression est mesurée par hybridation.
11. Procédé selon l'une des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que l'expression est normalisée par rapport à l'expression d'un ou plusieurs gènes de ménage.
12. Kit comprenant des moyens d'amplification et/ou des moyens de détection de l'expression de TAP2 et d'au moins un autre gène, sélectionné(s) parmi les gènes de la revendication 2, de préférence parmi les gènes de la revendication 3, de préférence encore parmi les gènes de la revendication 4, de préférence encore parmi les gènes de la revendication 5 ; ledit kit étant caractérisé en ce que l'ensemble des moyens d'amplification et/ou de détection dudit kit permettent la détection et/ou l'amplification d'au plus 100 biomarqueurs, au total.
13. Utilisation in vitro ou ex vivo : de moyens d'amplification et/ou de moyens de détection de l'expression de TAP2, ou - d'un kit comprenant de tels moyens d'amplification et/ou de détection, pour déterminer le risque de survenue d'une infection associée aux soins chez un patient.
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