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WO2021248757A1 - 稳定且酶活性高的Phi29 DNA聚合酶及其编码基因与应用 - Google Patents

稳定且酶活性高的Phi29 DNA聚合酶及其编码基因与应用 Download PDF

Info

Publication number
WO2021248757A1
WO2021248757A1 PCT/CN2020/120099 CN2020120099W WO2021248757A1 WO 2021248757 A1 WO2021248757 A1 WO 2021248757A1 CN 2020120099 W CN2020120099 W CN 2020120099W WO 2021248757 A1 WO2021248757 A1 WO 2021248757A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
seq
terminus
substituting
protein obtained
Prior art date
Application number
PCT/CN2020/120099
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
郑越
徐讯
章文蔚
董宇亮
周玉君
Original Assignee
深圳华大生命科学研究院
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 深圳华大生命科学研究院 filed Critical 深圳华大生命科学研究院
Priority to EP20939885.8A priority Critical patent/EP4166659A4/en
Priority to CN202080101598.7A priority patent/CN115698275A/zh
Publication of WO2021248757A1 publication Critical patent/WO2021248757A1/zh

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag

Definitions

  • the invention belongs to the field of biotechnology, and specifically relates to a stable and high enzyme activity Phi29 DNA polymerase and its coding gene and application.
  • Phi29 DNA polymerase is a mesophilic DNA polymerase cloned from the Bacillus subtilis bacteriophage Phi29. It is obtained by using gene recombination technology to express in Escherichia coli and then purify it several times. Due to the unique strand displacement activity, high fidelity and continuous synthesis ability of Phi29 DNA polymerase, it is widely used in different isothermal amplification application scenarios, such as RCA (rolling cycle amplification), MDA (multiple displacement amplification), LAMP (loop -mediated isothermal amplification), etc. In the DNB-SEQ series sequencing platform, phi29 DNA polymerase is mainly used in make DNB and two-strand amplification scenarios.
  • wild-type phi29DNA polymerase and commercial phi29DNA polymerase have poor stability and cannot meet the requirements of the kit (for example, the stability of wild-type phi29DNA polymerase is less than one year; and the reaction rate is slow; used for DNB-SEQ The quality of sequencing is poor. Therefore, it is of great significance to improve the stability and/or enzyme activity of phi29 DNA polymerase.
  • the purpose of the present invention is to provide phi29 DNA polymerase with improved stability and/or enzyme activity (such as specific enzyme activity).
  • the present invention first protects a protein, which can be C1) or C2):
  • C2 A fusion protein obtained by attaching a tag to the N-terminus or/and C-terminus of the protein shown in C1);
  • the amino acid sequence of the phi29 DNA polymerase is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the T at position 17 can be replaced with P.
  • the R at position 96 can be replaced with E, N, S, A, G, or K.
  • the M at position 97 can be replaced with Y, S, R, Q, G, C, P, V, W, N, D, E, or T.
  • the Q at position 99 can be replaced with V, E, or T.
  • the L at position 123 can be replaced with Y, A, C, Q, M, N, or P.
  • the T at position 140 can be replaced with K or H.
  • the Y at position 148 can be replaced with P or E.
  • the I at position 158 can be replaced with P.
  • the T at position 159 can be replaced with A.
  • the Q at position 171 can be replaced with E or K.
  • the T at position 203 can be replaced with E.
  • the T at the 204th position can be replaced with K.
  • the T at the 213th position can be replaced with K.
  • the G at the 217th position can be replaced with K.
  • the Y at position 224 can be replaced with E or K.
  • the V in the 250th position can be replaced with I.
  • the V in the 270th position can be replaced with R.
  • the F in the 309th position can be replaced with S.
  • the Y in the 310th position can be replaced with N or G.
  • the G at position 320 can be replaced with H, E, D or C.
  • the N at position 344 can be replaced with R or K.
  • the V in the 345th position can be replaced with E.
  • the Y in the 347th position can be replaced with G.
  • the Y at position 369 can be replaced with D or N.
  • the K in the 402th position can be replaced with L.
  • the L at position 416 can be replaced with A.
  • the V in the 509th position can be replaced with E.
  • the E at position 515 can be replaced with W, T, S, R, N, I, F, H, Q, or T.
  • the I in the 524th position can be replaced with V.
  • the stability and/or specific enzyme activity of any one of the aforementioned proteins is higher than that of phi29 DNA polymerase.
  • Any of the aforementioned proteins may specifically be phi29 DNA polymerase T213K/L416A/V509E, phi29 DNA polymerase M97T/Y224K/E515S or phi29 DNA polymerase R96S/L123P/Y224K/L416A/E515S.
  • the phi29 DNA polymerase T213K/L416A/V509E can be the replacement of the T at position 213 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with K, the L at position 416 with A, and the V at position 509 with E, The resulting protein.
  • the phi29 DNA polymerase M97T/Y224K/E515S can be the M97T/Y224K/E515S of SEQ ID NO: 2 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 to replace the M at position 97 with T, the Y at position 224 with K, and the E at position 515 with S, The resulting protein.
  • the phi29 DNA polymerase R96S/L123P/Y224K/L416A/E515S can be the R96S/L123P/Y224K/L416A/E515S of SEQ ID NO: 2 is replaced with S at position 96 from the N-terminus, L at position 123 is replaced with P, and Y at position 224 Replaced with K, replaced the L at position 416 with A, and replaced the E at position 515 with S, to obtain a protein.
  • Any one of the aforementioned proteins may specifically be any one of protein a1 to protein a70.
  • the protein a1 is a protein obtained by substituting the T at position 17 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with P.
  • the protein a2 is a protein obtained by substituting M at position 97 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 to Y.
  • the protein a3 is a protein obtained by substituting M at position 97 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 to S.
  • the protein a4 is a protein obtained by substituting M at position 97 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 to R.
  • the protein a5 is a protein obtained by substituting M at position 97 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 to Q.
  • the protein a6 is a protein obtained by substituting M at position 97 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 to G.
  • the protein a7 is a protein obtained by replacing the L at position 123 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with Y.
  • the protein a8 is a protein obtained by substituting K for the 140th T of SEQ ID NO: 2 from the N-terminus.
  • the protein a9 is a protein obtained by replacing the 140th T from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with H.
  • the protein a10 is a protein obtained by substituting P at the 148th position from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 to Y.
  • the protein a11 is a protein obtained by substituting E at position 148 of SEQ ID NO: 2 from the N-terminus.
  • the protein a12 is a protein obtained by substituting the I at the 158th position from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with P.
  • the protein a13 is a protein obtained by replacing the T at position 159 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with A.
  • the protein a14 is a protein obtained by replacing the T at position 203 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with E.
  • the protein a15 is a protein obtained by substituting E at position 224 of SEQ ID NO: 2 from the N-terminus.
  • the protein a16 is a protein obtained by substituting the F at position 309 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 to S.
  • the protein a17 is a protein obtained by substituting N for the 310th Y in SEQ ID NO: 2 from the N-terminus.
  • the protein a18 is a protein obtained by substituting G at the 310th position of SEQ ID NO: 2 from the N-terminus.
  • the protein a19 is a protein obtained by substituting H at position 320 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2.
  • the protein a20 is a protein obtained by substituting G at position 320 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 to E.
  • the protein a21 is a protein obtained by substituting G at position 320 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with D.
  • the protein a22 is a protein obtained by substituting G at position 320 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 to C.
  • the protein a23 is a protein obtained by substituting R for the 344th N of SEQ ID NO: 2 from the N-terminus.
  • the protein a24 is a protein obtained by replacing the V at position 345 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with E.
  • the protein a25 is a protein obtained by substituting G at position 347 of SEQ ID NO: 2 from the N-terminus of Y.
  • the protein a26 is a protein obtained by substituting the V at position 509 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with E.
  • the protein a27 is a protein obtained by replacing the E at position 515 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with W.
  • the protein a28 is a protein obtained by substituting the E at position 515 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with T.
  • the protein a29 is a protein obtained by substituting the E at position 515 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with S.
  • the protein a30 is a protein obtained by substituting the E at position 515 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with R.
  • the protein a31 is a protein obtained by substituting E at position 515 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 to N.
  • the protein a32 is a protein obtained by substituting the E at position 515 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with I.
  • the protein a33 is a protein obtained by replacing the E at position 515 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with F.
  • the protein a34 is a protein obtained by substituting the R at position 96 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with E.
  • the protein a35 is a protein obtained by substituting the R at position 96 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with N.
  • the protein a36 is a protein obtained by substituting the R at position 96 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with S.
  • the protein a37 is a protein obtained by substituting the R at position 96 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with A.
  • the protein a38 is a protein obtained by substituting the R at position 96 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with G.
  • the protein a39 is a protein obtained by substituting the R at position 96 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with K.
  • the protein a40 is a protein obtained by substituting M at position 97 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 to C.
  • the protein a41 is a protein obtained by substituting M at position 97 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 to P.
  • the protein a42 is a protein obtained by substituting the M at position 97 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 to V.
  • the protein a43 is a protein obtained by replacing the M at the 97th position from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with W.
  • the protein a44 is a protein obtained by substituting M at position 97 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 to N.
  • the protein a45 is a protein obtained by substituting M at position 97 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 to D.
  • the protein a46 is a protein obtained by substituting M at position 97 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 to E.
  • the protein a47 is a protein obtained by substituting V at the 99th position of SEQ ID NO: 2 from the N-terminus.
  • the protein a48 is a protein obtained by substituting E at the 99th position of SEQ ID NO: 2 from the N-terminus.
  • the protein a49 is a protein obtained by substituting T for the Q at position 99 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2.
  • the protein a50 is a protein obtained by substituting the L at position 123 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with A.
  • the protein a51 is a protein obtained by substituting the L at position 123 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 to C.
  • the protein a52 is a protein obtained by substituting Q at the 123rd position from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 to L.
  • the protein a53 is a protein obtained by substituting M at the 123rd position from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 to L.
  • the protein a54 is a protein obtained by substituting the L at position 123 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with N.
  • the protein a55 is a protein obtained by substituting E at position 171 of SEQ ID NO: 2 from the N-terminus of Q.
  • the protein a56 is a protein obtained by substituting the Q at position 171 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with K.
  • the protein a57 is a protein obtained by replacing the T at position 204 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with K.
  • the protein a58 is a protein obtained by replacing the T at position 213 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with K.
  • the protein a59 is a protein obtained by substituting the G at position 217 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with K.
  • the protein a60 is a protein obtained by substituting the V at position 250 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with I.
  • the protein a61 is a protein obtained by substituting the V at position 270 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 to R.
  • the protein a62 is a protein obtained by substituting K at the 344th position of SEQ ID NO: 2 from the N-terminus.
  • the protein a63 is a protein obtained by substituting the Y at position 369 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with D.
  • the protein a64 is a protein obtained by substituting the Y at position 369 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 to N.
  • the protein a65 is a protein obtained by replacing the K at position 402 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with L.
  • the protein a66 is a protein obtained by substituting the L at position 416 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 to A.
  • the protein a67 is a protein obtained by replacing the E at position 515 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with H.
  • the protein a68 is a protein obtained by substituting the E at position 515 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with Q.
  • the protein a69 is a protein obtained by replacing the E at position 515 from the N-terminus of SEQ ID NO: 2 with T.
  • the protein a70 is a protein obtained by substituting V at position 524 of SEQ ID NO: 2 from the N-terminus.
  • Any one of the aforementioned proteins may specifically be any one of protein b1 to protein b70.
  • the protein b1 is a protein obtained by substituting the T at position 37 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with P.
  • the protein b2 is a protein obtained by substituting M at position 117 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to Y.
  • the protein b3 is a protein obtained by substituting M at position 117 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to S.
  • the protein b4 is a protein obtained by substituting the M at position 117 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to R.
  • the protein b5 is a protein obtained by substituting M at position 117 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to Q.
  • the protein b6 is a protein obtained by substituting M at position 117 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to G.
  • the protein b7 is a protein obtained by substituting the L at position 143 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to Y.
  • the protein b8 is a protein obtained by substituting K for the 160th T of SEQ ID NO: 4 from the N-terminus.
  • the protein b9 is a protein obtained by replacing the 160th T from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with H.
  • the protein b10 is a protein obtained by replacing the Y at position 168 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with P.
  • the protein b11 is a protein obtained by substituting E at the 168th position from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to E.
  • the protein b12 is a protein obtained by substituting P at position 178 of SEQ ID NO: 4 from the N-terminus.
  • the protein b13 is a protein obtained by replacing the T at position 179 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with A.
  • the protein b14 is a protein obtained by replacing the T at position 223 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with E.
  • the protein b15 is a protein obtained by substituting E at position 244 of SEQ ID NO: 4 from the N-terminus.
  • the protein b16 is a protein obtained by substituting F at position 329 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to S.
  • the protein b17 is a protein obtained by substituting N at the 330th position from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to N.
  • the protein b18 is a protein obtained by substituting G at the 330th position of SEQ ID NO: 4 from the N-terminus.
  • the protein b19 is a protein obtained by replacing the G at position 340 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with H.
  • the protein b20 is a protein obtained by substituting E at position 340 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to G.
  • the protein b21 is a protein obtained by substituting G at position 340 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to D.
  • the protein b22 is a protein obtained by substituting the G at position 340 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to C.
  • the protein b23 is a protein obtained by substituting R at position 364 from the N-terminus of SEQ ID NO:4.
  • the protein b24 is a protein obtained by substituting E at position 365 of SEQ ID NO: 4 from the N-terminus.
  • the protein b25 is a protein obtained by substituting G at the 367th position from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to Y.
  • the protein b26 is a protein obtained by replacing the V at position 529 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with E.
  • the protein b27 is a protein obtained by replacing the E at the 535th position from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with W.
  • the protein b28 is a protein obtained by substituting the E at the 535th position from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with T.
  • the protein b29 is a protein obtained by substituting the E at position 535 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with S.
  • the protein b30 is a protein obtained by substituting R at the 535th position from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to E.
  • the protein b31 is a protein obtained by substituting the E at the 535th position from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with N.
  • the protein b32 is a protein obtained by substituting I for the E at the 535th position from the N-terminus of SEQ ID NO:4.
  • the protein b33 is a protein obtained by replacing the E at the 535th position from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with F.
  • the protein b34 is a protein obtained by substituting the R at position 116 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with E.
  • the protein b35 is a protein obtained by substituting the R at position 116 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with N.
  • the protein b36 is a protein obtained by substituting the R at position 116 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with S.
  • the protein b37 is a protein obtained by substituting the R at position 116 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with A.
  • the protein b38 is a protein obtained by substituting the R at position 116 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with G.
  • the protein b39 is a protein obtained by substituting the R at position 116 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with K.
  • the protein b40 is a protein obtained by substituting the M at position 117 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to C.
  • the protein b41 is a protein obtained by replacing the M at position 117 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with P.
  • the protein b42 is a protein obtained by substituting the M at position 117 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to V.
  • the protein b43 is a protein obtained by substituting W at position 117 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to M.
  • the protein b44 is a protein obtained by substituting M at position 117 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to N.
  • the protein b45 is a protein obtained by substituting M at position 117 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to D.
  • the protein b46 is a protein obtained by substituting M at position 117 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to E.
  • the protein b47 is a protein obtained by substituting the Q at position 119 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to V.
  • the protein b48 is a protein obtained by substituting E at the 119th position from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to Q.
  • the protein b49 is a protein obtained by substituting the Q at position 119 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with T.
  • the protein b50 is a protein obtained by substituting A at position 143 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to L.
  • the protein b51 is a protein obtained by replacing the L at position 143 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with C.
  • the protein b52 is a protein obtained by replacing the L at position 143 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with Q.
  • the protein b53 is a protein obtained by substituting M at position 143 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to L.
  • the protein b54 is a protein obtained by substituting the L at position 143 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to N.
  • the protein b55 is a protein obtained by substituting E at position 191 of SEQ ID NO: 4 from the N-terminus.
  • the protein b56 is a protein obtained by substituting K at the 191st position of SEQ ID NO: 4 from the N-terminus.
  • the protein b57 is a protein obtained by substituting the T at position 224 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with K.
  • the protein b58 is a protein obtained by replacing the T at position 233 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with K.
  • the protein b59 is a protein obtained by substituting the G at position 237 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to K.
  • the protein b60 is a protein obtained by replacing the V at position 270 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with I.
  • the protein b61 is a protein obtained by replacing the V at position 290 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with R.
  • the protein b62 is a protein obtained by substituting K at position 364 from the N-terminus of SEQ ID NO:4.
  • the protein b63 is a protein obtained by substituting D at position 389 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to Y.
  • the protein b64 is a protein obtained by substituting N at the 389th position from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to N.
  • the protein b65 is a protein obtained by substituting the K at position 422 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to L.
  • the protein b66 is a protein obtained by substituting the L at position 436 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 to A.
  • the protein b67 is a protein obtained by replacing the E at position 535 from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with H.
  • the protein b68 is a protein obtained by substituting the E at the 535th position from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with Q.
  • the protein b69 is a protein obtained by substituting the E at the 535th position from the N-terminus of SEQ ID NO: 4 with T.
  • the protein b70 is a protein obtained by substituting V at position 544 from the N-terminus of SEQ ID NO:4.
  • Expression cassettes, recombinant vectors, recombinant microorganisms or transgenic cell lines containing the nucleic acid molecules also belong to the protection scope of the present invention.
  • the recombinant vector may be a recombinant plasmid obtained by inserting the nucleic acid molecule into an expression vector or a cloning vector.
  • the expression vector may specifically be the vector pET28a(+).
  • the recombinant vector may specifically be the recombinant plasmid pET28a-T17P, the recombinant plasmid pET28a-M97Y, the recombinant plasmid pET28a-M97S, the recombinant plasmid pET28a-M97R, the recombinant plasmid pET28a-M97Q, the recombinant plasmid pET28a-M97G, the recombinant plasmid mentioned in the examples.
  • the recombinant microorganism is a recombinant bacteria obtained by introducing the recombinant vector into a starting microorganism.
  • the starting microorganism may be Escherichia coli.
  • the E. coli may specifically be E. coli BL21 (DE3).
  • the stability and/or specific enzyme activity of the DNA polymerase is higher than that of the phi29 DNA polymerase.
  • the PCR amplification can be two-strand amplification, single cell amplification and/or plasmid amplification.
  • the sequencing may be DNB SEQ sequencing.
  • the product may be a kit.
  • the inventors of the present invention performed site-directed mutations on the existing phi29 DNA polymerase, and also used DNA shuffling and combined mutant construction methods to construct combined mutants, and prepared 73 stable and/or specific enzyme activities significantly improved
  • the recombinant phi29 DNA polymerase These recombinant phi29 DNA polymerases not only improve thermal stability, but also increase polymerization activity and continuous synthesis ability.
  • DNA can be synthesized efficiently and continuously, and the reaction efficiency is high.
  • the invention has important application value.
  • Figure 1 is a schematic diagram of the structure of the vector pET28a(+).
  • test materials used in the following examples are all purchased from conventional biochemical reagent stores.
  • the vector pET28a(+) is a product of Novagen, and its structure diagram is shown in Figure 1.
  • Affinity solution A an aqueous solution containing 20mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 20mM Imidazole and 62.5g/L Glycerol, with a pH of 7.9.
  • Example 1 The recombinant phi29 DNA polymerase in Example 1, Example 2, and Example 3 are all single mutants of phi29 DNA polymerase, and the recombinant phi29 DNA polymerase in Example 4 is a combined mutant of phi29 DNA polymerase.
  • the double-stranded DNA molecule shown in SEQ ID NO: 1 is the coding gene of Phi29 DNA polymerase, and its coding amino acid sequence is as shown in SEQ ID NO: 2 of Phi29 DNA polymerase.
  • the recombinant plasmid pET28a-WT was sequenced.
  • the sequencing results showed that in the recombinant plasmid pET28a-WT, the double-stranded DNA molecule shown in SEQ ID NO:1 was fused with the coding sequence of the His-tag tag (composed of 6 histidine residues) on the vector backbone to form SEQ
  • the fusion gene shown in ID NO: 3 expresses the recombinant Phi29 DNA polymerase shown in SEQ ID NO: 4 (named fusion protein 1), and the fusion protein 1 has a His-tag tag.
  • the PCR reaction system for site-directed mutagenesis is 25 ⁇ L, including 2.5 ⁇ L 10 ⁇ Pfu Reaction Buffer with Mg 2+ , 2 ⁇ L dNTP Mix (the concentration of dATP, dTTP, dGTP and dCTP are 2.5mM), 25ng recombinant plasmid pET28a-WT, 0.5 ⁇ L Pfu DNA Polymerase and mutation primers added to the mutation site.
  • Pfu DNA Polymerase is a product of ThermoFisher, the article number is EP0501. 10 ⁇ Pfu Reaction Buffer with Mg 2+ is a component of Pfu DNA Polymerase.
  • the reaction procedure is: 95°C 3min; 95°C 30s, 53°C 30s, 68°C 8min, 19 cycles; 68°C 10min; 4°C storage.
  • Recombinant plasmid pET28a-Y224E Fusion Protein 16 Replace Y in 244 with E Recombinant plasmid pET28a-F309S Fusion Protein 17
  • Replace the F in the 329th place with S Recombinant plasmid pET28a-Y310N Fusion Protein 18 Replace Y in the 330th position with N Recombinant plasmid pET28a-Y310G Fusion Protein 19
  • Recombinant plasmid pET28a-G320H Fusion protein 20 Replace G at 340th place with H Recombinant plasmid pET28a-G320E Fusion Protein 21
  • Recombinant plasmid pET28a-Q171K Fusion Protein 57 Replace the Q at the 191st place with K Recombinant plasmid pET28a-T204K Fusion protein 58
  • 60 Replace the G at the 237th place with K Recombinant plasmid pET28a-V250I Fusion protein
  • 61 Replace the V in the 270th place with I Recombinant plasmid pET28a-V270R Fusion protein 62
  • Replace the 364th N with K Recombinant plasmid pET28a-Y369D Fusion protein 64 Replace the
  • the preparation method of the crude enzyme of recombinant phi29 DNA polymerase 1 is as follows:
  • step 3 take the bacterial pellet, add affinity A solution to resuspend, incubate on ice for 30 minutes, and then ultrasonically break under ice-water bath conditions (using the ⁇ 6 probe of Ningbo Xinzhi ultrasonic breaker, ultrasonic power 40%, The circulation program is: crushing for 2 seconds, stopping for 3 seconds, 30 minutes in total), then centrifuging at 4°C and 15000 rpm for 30 minutes, and collecting the supernatant.
  • step 4 After completing step 4, take the supernatant, use affinity chromatography for rapid purification, and then dialyze (the solute and concentration of the dialysis buffer are: 200mM KCl, 0.2mM EDTA, 5% Glyecrol and 20mM Tris- HCl; solvent is water; pH value is 7.5; temperature is 25°C), the crude enzyme of recombinant phi29 DNA polymerase 1 is obtained.
  • Example 2 The stability test of the crude enzyme of the recombinant phi29 DNA polymerase prepared in Example 1
  • the protein thermal shift assay kit (Life Technologies) was used to detect the Tm values of the crude enzymes and dialysis buffers of 71 recombinant phi29 DNA polymerases prepared in Example 1. Specifically: follow the protein thermal shift studies user guide to set up the program and configure the reaction buffer; after the program runs, enter the experimental results into the protein thermal shift software for analysis to obtain the Tm value of each sample.
  • Recombinant phi29 DNA polymerase 1 is a positive control.
  • the dialysis buffer is a negative control.
  • Example 3 Detection of the specific enzyme activity of the crude enzyme of the recombinant phi29 DNA polymerase prepared in Example 1
  • the solute and concentration of the dialysis buffer are 20mM Tris-HCl, 200mM KCl, 2mM DTT, 0.2mM EDTA and 5% Glycerol; the solvent is water, and the pH is 7.4.
  • the reaction mixture is 80.8 ⁇ L, consisting of DTT, (NH 4 ) 2 SO 4 , MgCl 2 , dNTP Mixture, RCA Primer (ie Ad153make DNB primer; product of invitrogen company, catalog number R082), 6ng single-stranded circular DNA template 153Ad ssDNA and pH7.5, 50mM Tris-HCl buffer composition.
  • the concentration of DTT is 4 mM
  • the concentration of (NH 4 ) 2 SO 4 is 10 mM
  • the concentration of MgCl 2 is 10 mM
  • the concentration of dNTP Mixture is 50 nM
  • the concentration of RCA Primer is 2 pM.
  • Example 4 Obtainment of combined mutants of phi29 DNA polymerase and detection of stability and specific enzyme activity
  • Example 1 According to the mutation sites provided in Example 1 and the existing mutation sites disclosed in the literature, a DNA shuffling method or a multi-site directed mutagenesis method was used to construct a combined mutant of phi29 DNA polymerase.
  • forward primer is:
  • step 3 recover the digested DNA fragments with M280 magnetic beads, wash them twice with 75% (v/v) ethanol aqueous solution, and then dissolve them with ddH 2 O.
  • step 4 After completing step 3, shuffling the interrupted fragments by PCR.
  • the reaction procedure is: 95°C 3min; 95°C 30s, 65°C 30s, 72°C 1min, 45 cycles; 72°C 7min, 4°C storage.
  • step 4 use the recombined fragment as a template for secondary amplification and enrichment.
  • the reaction procedure is: 95°C for 3min; 94°C for 30s, 60°C for 30s, 72°C for 1min40s, 60 cycles; 72°C for 7min.
  • Design primers design the mutation site in the middle of the primer, about 15 nt on each side, and a pair of reverse complementary primers at each mutation site.
  • the reaction system is 25 ⁇ L, including 12.5 ⁇ L 2 ⁇ KAPA HiFi HS Ready Mix, 3.5 ⁇ L FW primer with a concentration of 2 ⁇ M (5 in total, 0.7 ⁇ L each), and 3.5 ⁇ L RE primer with a concentration of 2 ⁇ M (5 in total, each 0.7 ⁇ L), 75ng template and water.
  • reaction procedure is: 95°C 3min; 98°C 20s, 65°C 15s, 72°C 7min, 19 cycles; 72°C 10min, 12°C storage.
  • step 3 After completing step 3, add 1 ⁇ L of dpnI enzyme, digest at 37°C for 2h, then transform E. coli DH5a competent cells, spread the plate, and incubate overnight at 37°C. Pick a single colony the next day and extract the plasmid for sequencing.
  • the iCSR (isothermalcompartmentalization self-replication) method was used to perform high-throughput screening of the phi29 DNA polymerase combinatorial mutants constructed in Example 1. Similar to the CSR technology, the strand replacement function of phi29 DNA polymerase is used to complete the replication of its own plasmid, and the difference in the amount of DNA amplification of different mutants is used to characterize the activity of the mutants. After several rounds of screening, it can be achieved. Enrichment of mutants with high activity. Specific steps are as follows:
  • the whole process requires 3 pairs of primers.
  • the primer pair iCSR is used for the amplification in the iCSR process (3' end end thio modification is required to prevent digestion by the exonuclease in the cell), the primer pair Insert and the carrier amplification primer pair Used for template and insert amplification in in-fusion reactions.
  • the primer pair iCSR consists of Primer 1: 5'-TTGAGGCCGTTGAGCACC-3' (3' end thiomodification) and Primer 2: 5’-CCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG-3’ (3’ end thio modification).
  • the primer pair Insert consists of Primer3: 5'-AATGTATAGCTGCGACTTTGAAACCA-3' and Primer4: 5'-TAGAGGCCCCAAGGGGTTAT-3'.
  • the carrier amplification primer pair is composed of Primer5: 5'-ATAACCCCTTGGGGCCTCTA-3' and Primer6: 5'-TGGTTTCAAAGTCGCAGCTATACAT-3'.
  • the reaction buffer is 2mL, including 10 ⁇ phi29 reaction buffer 200 ⁇ L, 500 ⁇ M Exo-resistant primer mix 40 ⁇ L, 10 ⁇ M primer 1 60 ⁇ L, 10 ⁇ M primer 2 60 ⁇ L, 25mM dNTPmix 40 ⁇ L and NFH 2 O 1600 ⁇ L.
  • the volume of a single micro-droplet is 5 pL.
  • the volume of the bacterial channel is 2.5 pL.
  • the diameter of the droplets is controlled at about 20 ⁇ m. Note that the generated droplets need to be collected on ice, about 500 ⁇ L of droplets are collected.
  • the reaction system is 50 ⁇ L, including 5 ⁇ HiFidelity buffer 8 ⁇ L, 10 ⁇ M FW primer 1.5 ⁇ L, 10 ⁇ M RE primer 1.5 ⁇ L, template DNA (taken from tube 3.7) 2 ⁇ L, 10mM dNTP mix 1.5 ⁇ L, NFH 2 O 34.5 ⁇ L and HiFi Enzyme 1 ⁇ L.
  • the amplification of the vector template can be performed normally using ReadyMix.
  • reaction conditions were: 95°C for 3min, 98°C for 20s, 65°C for 15s, 72°C for 2min, 35 cycles; 72°C for 10min; storage at 4°C.
  • the recommended amount is 50-100ng when the insert length is 0.5-10kb, and the recommended amount is 50-100ng when the vector length is less than 10kb.
  • the recommended molar ratio of insert to vector is 2:1. Therefore, the reaction system of the present invention is 10 ⁇ L, including purified PCR fragment 50 ng, linearized vector 78 ng, 5 ⁇ In-fusion HD Enzyme mix 2 ⁇ L and NFH 2 O.
  • the reaction conditions were 50°C for 15 minutes, and then stored at 4°C.
  • phi29 DNA polymerase T213K/L416A/V509E four combined mutants of phi29 DNA polymerase with better activity were obtained, namely phi29 DNA polymerase T213K/L416A/V509E, phi29 DNA polymerase M97T/Y224K/E515S, phi29 DNA polymerase L123Q/T159A/Y347G And phi29 DNA polymerase R96S/L123P/Y224K/L416A/E515S.
  • the only difference between the phi29 DNA polymerase M97T/Y224K/E515S and the Phi29 DNA polymerase shown in SEQ ID NO: 2 is that the M at position 97 is replaced with T, the Y at position 224 is replaced with K, and the one at position 515 E is replaced by S.
  • the only difference between the phi29 DNA polymerase L123Q/T159A/Y347G and the Phi29 DNA polymerase shown in SEQ ID NO: 2 is that the L at position 123 is replaced with Q, the T at position 159 is replaced with A, and the one at position 347 Y is replaced by G.
  • the only difference between the phi29 DNA polymerase R96S/L123P/Y224K/L416A/E515S and the Phi29 DNA polymerase shown in SEQ ID NO: 2 is that the 96th position R is replaced by S, the 123rd position L is replaced by P, The Y at position 224 is replaced with K, the L at position 416 is replaced with A, and the E at position 515 is replaced with S.
  • Phi29 DNA polymerase shown in SEQ ID NO: 2 phi29 DNA polymerase T213K/L416A/V509E, phi29 DNA polymerase M97T/Y224K/E515S, phi29 DNA polymerase L123Q/T159A/Y347G and phi29 DNA polymerase R96S/ L123P/Y224K/L416A/E515S.
  • Example 2 According to the method of Example 2, detect phi29 DNA polymerase T213K/L416A/V509E, phi29 DNA polymerase M97T/Y224K/E515S, phi29 DNA polymerase L123Q/T159A/Y347G and phi29 DNA polymerase R96S/L123P/Y224K/L416A/ Tm value of E515S.
  • test results are shown in Table 8.
  • Table 8 The results show that, compared with the Phi29 DNA polymerase shown in SEQ ID NO: 2, the Tm value of the combined mutants of the three phi29 DNA polymerases all have a significant increase, that is, the stability of the combined mutants of the three phi29 DNA polymerases The performance is significantly improved.
  • Example 3 According to the method of Example 3, detect phi29 DNA polymerase T213K/L416A/V509E, phi29 DNA polymerase M97T/Y224K/E515S, phi29 DNA polymerase L123Q/T159A/Y347G and phi29 DNA polymerase R96S/L123P/Y224K/L416A/ The specific enzyme activity of E515S.
  • the test results are shown in Table 9. The results showed that compared with the Phi29 DNA polymerase shown in SEQ ID NO: 2, the specific enzyme activity of the combined mutants of the two phi29 DNA polymerases was significantly increased, that is, the DNA of the combined mutants of the two phi29 DNA polymerases The polymerase activity was significantly improved.
  • Phi29 DNA polymerase shown in SEQ ID NO: 2 43 phi29 DNA polymerase T213K/L416A/V509E 52 phi29 DNA polymerase M97T/Y224K/E515S 55 phi29 DNA polymerase L123Q/T159A/Y347G 9 phi29 DNA polymerase R96S/L123P/Y224K/L416A/E515S 28
  • phi29 DNA polymerase T213K/L416A/V509E and phi29 DNA polymerase M97T/Y224K/E515S have good stability, higher than enzyme activity, and the best effect; phi29 DNA polymerase R96S/L123P/Y224K/L416A/E515S The stability and specific enzyme activity of phi29 DNA polymerase L123Q/T159A/Y347G are good.
  • the present invention prepares 73 recombinant phi29 DNA polymerases with significantly improved stability and/or specific enzyme activity. These recombinant phi29 DNA polymerases not only improve thermal stability, but also increase polymerization activity and continuous synthesis ability. When the recombinant phi29 DNA polymerase prepared by the present invention is used for amplification or sequencing, DNA can be synthesized efficiently and continuously, and the reaction efficiency is high. The invention has important application value.

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Abstract

提供稳定且酶活性高的Phi29 DNA聚合酶及其编码基因与应用。所述Phi29DNA聚合酶为将SEQ ID NO:2所示的DNA聚合酶的第17位、第96位、第97位、第99位、第123位、第140位、第148位、第158位、第159位、第171位、第203位、第204位、第213位、第217位、第224位、第250位、第270位、第309位、第310位、第320位、第344位、第345位、第347位、第369位、第402位、第416位、第509位、第515位和第524位这29位中至少一位的氨基酸残基进行置换得到的。

Description

稳定且酶活性高的Phi29 DNA聚合酶及其编码基因与应用 技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及稳定且酶活性高的Phi29 DNA聚合酶及其编码基因与应用。
背景技术
Phi29 DNA聚合酶是从Bacillus subtilis噬菌体Phi29中克隆出的嗜温DNA聚合酶，利用基因重组技术，在大肠杆菌中进行表达后经多次纯化分离得到。因Phi29 DNA聚合酶独特的链置换活性、高保真性以及持续合成能力，被广泛应用于不同的等温扩增的应用场景中，如RCA(rolling cycle amplification)、MDA(multiple displacement amplification)、LAMP(loop-mediated isothermal amplification)等。在DNB-SEQ系列测序平台中，phi29 DNA聚合酶主要被应用于make DNB以及二链扩增两个场景中。然而，野生型phi29DNA聚合酶和商品化的phi29DNA聚合酶的稳定性较差，不能满足试剂盒要求(如野生型phi29DNA聚合酶的稳定性不到一年；而且反应速率慢；用于DNB-SEQ时测序质量较差。因此，提高phi29DNA聚合酶的稳定性和/或酶活性，具有重要意义。
发明公开
本发明的目的是提供稳定性和/或酶活性(如比酶活)提高的phi29DNA聚合酶。
本发明首先保护一种蛋白质，可为C1)或C2)：
C1)将phi29DNA聚合酶氨基酸序列中第17位、第96位、第97位、第99位、第123位、第140位、第148位、第158位、第159位、第171位、第203位、第204位、第213位、第217位、第224位、第250位、第270位、第309位、第310位、第320位、第344位、第345位、第347位、第369位、第402位、第416位、第509位、第515位和第524位这29位中至少一位的氨基酸残基进行置换，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白质；
C2)在C1)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述phi29DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
上述蛋白质中，所述第17位的T可置换为了P。所述第96位的R可置换为了E、N、S、A、G或K。所述第97位的M可置换为了Y、S、R、Q、G、C、P、V、W、N、D、E或T。所述第99位的Q可置换为了V、E或T。所述第123位的L可置换为了Y、A、C、Q、M、N或P。所述第140位的T可置换为了K或H。所述第148位的Y可置换为了P或E。所述第158位的I可置换为了P。所述第159位的T可置换为了A。所述第171位的Q可置换为了E或K。所述第203位的T可置换为了E。所述第204位的T可置换为了K。所述第213位的T可置换为了K。所述第217位的G可置换为了K。所述第224位的Y可置换为了E或K。所述第250位的V可置换为了I。所述第270位的V可置换为了R。所述第309位 的F可置换为了S。所述第310位的Y可置换为了N或G。所述第320位的G可置换为了H、E、D或C。所述第344位的N可置换为了R或K。所述第345位的V可置换为了E。所述第347位的Y可置换为了G。所述第369位的Y可置换为了D或N。所述第402位的K可置换为了L。所述第416位的L可置换为了A。所述第509位的V可置换为了E。所述第515位的E可置换为了W、T、S、R、N、I、F、H、Q或T。所述第524位的I可置换为了V。
上述任一所述蛋白质的稳定性和/或比酶活高于phi29DNA聚合酶。
上述任一所述蛋白质具体可为phi29 DNA聚合T213K/L416A/V509E、phi29DNA聚合酶M97T/Y224K/E515S或phi29 DNA聚合酶R96S/L123P/Y224K/L416A/E515S。
所述phi29 DNA聚合酶T213K/L416A/V509E可为将SEQ ID NO：2自N末端起第213位的T置换为了K，第416位的L置换为了A，第509位的V置换为了E，得到的蛋白质。
所述phi29 DNA聚合酶M97T/Y224K/E515S可为将SEQ ID NO：2自N末端起第97位的M置换为了T，第224位的Y置换为了K，第515位的E置换为了S，得到的蛋白质。
所述phi29 DNA聚合酶R96S/L123P/Y224K/L416A/E515S可为将SEQ ID NO：2自N末端起第96位的R置换为了S，第123位的L置换为了P，第224位的Y置换为了K，第416位的L置换为了A，第515位的E置换为了S，得到的蛋白质。
上述任一所述蛋白质具体可为蛋白质a1至蛋白质a70中的任一种。
所述蛋白质a1为将SEQ ID NO：2自N末端起第17位的T置换为了P，得到的蛋白质。所述蛋白质a2为将SEQ ID NO：2自N末端起第97位的M置换为了Y，得到的蛋白质。所述蛋白质a3为将SEQ ID NO：2自N末端起第97位的M置换为了S，得到的蛋白质。所述蛋白质a4为将SEQ ID NO：2自N末端起第97位的M置换为了R，得到的蛋白质。所述蛋白质a5为将SEQ ID NO：2自N末端起第97位的M置换为了Q，得到的蛋白质。所述蛋白质a6为将SEQ ID NO：2自N末端起第97位的M置换为了G，得到的蛋白质。所述蛋白质a7为将SEQ ID NO：2自N末端起第123位的L置换为了Y，得到的蛋白质。所述蛋白质a8为将SEQ ID NO：2自N末端起第140位的T置换为了K，得到的蛋白质。所述蛋白质a9为将SEQ ID NO：2自N末端起第140位的T置换为了H，得到的蛋白质。所述蛋白质a10为将SEQ ID NO：2自N末端起第148位的Y置换为了P，得到的蛋白质。所述蛋白质a11为将SEQ ID NO：2自N末端起第148位的Y置换为了E，得到的蛋白质。所述蛋白质a12为将SEQ ID NO：2自N末端起第158位的I置换为了P，得到的蛋白质。所述蛋白质a13为将SEQ ID NO：2自N末端起第159位的T置换为了A，得到的蛋白质。所述蛋白质a14为将SEQ ID NO：2自N末端起第203位的T置换为了E，得到的蛋白质。所述蛋白质a15为将SEQ  ID NO：2自N末端起第224位的Y置换为了E，得到的蛋白质。所述蛋白质a16为将SEQ ID NO：2自N末端起第309位的F置换为了S，得到的蛋白质。所述蛋白质a17为将SEQ ID NO：2自N末端起第310位的Y置换为了N，得到的蛋白质。所述蛋白质a18为将SEQ ID NO：2自N末端起第310位的Y置换为了G，得到的蛋白质。所述蛋白质a19为将SEQ ID NO：2自N末端起第320位的G置换为了H，得到的蛋白质。所述蛋白质a20为将SEQ ID NO：2自N末端起第320位的G置换为了E，得到的蛋白质。所述蛋白质a21为将SEQ ID NO：2自N末端起第320位的G置换为了D，得到的蛋白质。所述蛋白质a22为将SEQ ID NO：2自N末端起第320位的G置换为了C，得到的蛋白质。所述蛋白质a23为将SEQ ID NO：2自N末端起第344位的N置换为了R，得到的蛋白质。所述蛋白质a24为将SEQ ID NO：2自N末端起第345位的V置换为了E，得到的蛋白质。所述蛋白质a25为将SEQ ID NO：2自N末端起第347位的Y置换为了G，得到的蛋白质。所述蛋白质a26为将SEQ ID NO：2自N末端起第509位的V置换为了E，得到的蛋白质。所述蛋白质a27为将SEQ ID NO：2自N末端起第515位的E置换为了W，得到的蛋白质。所述蛋白质a28为将SEQ ID NO：2自N末端起第515位的E置换为了T，得到的蛋白质。所述蛋白质a29为将SEQ ID NO：2自N末端起第515位的E置换为了S，得到的蛋白质。所述蛋白质a30为将SEQ ID NO：2自N末端起第515位的E置换为了R，得到的蛋白质。所述蛋白质a31为将SEQ ID NO：2自N末端起第515位的E置换为了N，得到的蛋白质。所述蛋白质a32为将SEQ ID NO：2自N末端起第515位的E置换为了I，得到的蛋白质。所述蛋白质a33为将SEQ ID NO：2自N末端起第515位的E置换为了F，得到的蛋白质。所述蛋白质a34为将SEQ ID NO：2自N末端起第96位的R置换为了E，得到的蛋白质。所述蛋白质a35为将SEQ ID NO：2自N末端起第96位的R置换为了N，得到的蛋白质。所述蛋白质a36为将SEQ ID NO：2自N末端起第96位的R置换为了S，得到的蛋白质。所述蛋白质a37为将SEQ ID NO：2自N末端起第96位的R置换为了A，得到的蛋白质。所述蛋白质a38为将SEQ ID NO：2自N末端起第96位的R置换为了G，得到的蛋白质。所述蛋白质a39为将SEQ ID NO：2自N末端起第96位的R置换为了K，得到的蛋白质。所述蛋白质a40为将SEQ ID NO：2自N末端起第97位的M置换为了C，得到的蛋白质。所述蛋白质a41为将SEQ ID NO：2自N末端起第97位的M置换为了P，得到的蛋白质。所述蛋白质a42为将SEQ ID NO：2自N末端起第97位的M置换为了V，得到的蛋白质。所述蛋白质a43为将SEQ ID NO：2自N末端起第97位的M置换为了W，得到的蛋白质。所述蛋白质a44为将SEQ ID NO：2自N末端起第97位的M置换为了N，得到的蛋白质。所述蛋白质a45为将SEQ ID NO：2自N末端起第97位的M置换为了D，得到的蛋白质。所述蛋白质a46为将SEQ ID NO：2自N末端起第97位的M置换为了E，得到的蛋白质。所述蛋白质a47为将SEQ ID NO：2自N末端起第99位的Q置换为了V，得到的蛋白质。所述蛋白质a48为将SEQ  ID NO：2自N末端起第99位的Q置换为了E，得到的蛋白质。所述蛋白质a49为将SEQ ID NO：2自N末端起第99位的Q置换为了T，得到的蛋白质。所述蛋白质a50为将SEQ ID NO：2自N末端起第123位的L置换为了A，得到的蛋白质。所述蛋白质a51为将SEQ ID NO：2自N末端起第123位的L置换为了C，得到的蛋白质。所述蛋白质a52为将SEQ ID NO：2自N末端起第123位的L置换为了Q，得到的蛋白质。所述蛋白质a53为将SEQ ID NO：2自N末端起第123位的L置换为了M，得到的蛋白质。所述蛋白质a54为将SEQ ID NO：2自N末端起第123位的L置换为了N，得到的蛋白质。所述蛋白质a55为将SEQ ID NO：2自N末端起第171位的Q置换为了E，得到的蛋白质。所述蛋白质a56为将SEQ ID NO：2自N末端起第171位的Q置换为了K，得到的蛋白质。所述蛋白质a57为将SEQ ID NO：2自N末端起第204位的T置换为了K，得到的蛋白质。所述蛋白质a58为将SEQ ID NO：2自N末端起第213位的T置换为了K，得到的蛋白质。所述蛋白质a59为将SEQ ID NO：2自N末端起第217位的G置换为了K，得到的蛋白质。所述蛋白质a60为将SEQ ID NO：2自N末端起第250位的V置换为了I，得到的蛋白质。所述蛋白质a61为将SEQ ID NO：2自N末端起第270位的V置换为了R，得到的蛋白质。所述蛋白质a62为将SEQ ID NO：2自N末端起第344位的N置换为了K，得到的蛋白质。所述蛋白质a63为将SEQ ID NO：2自N末端起第369位的Y置换为了D，得到的蛋白质。所述蛋白质a64为将SEQ ID NO：2自N末端起第369位的Y置换为了N，得到的蛋白质。所述蛋白质a65为将SEQ ID NO：2自N末端起第402位的K置换为了L，得到的蛋白质。所述蛋白质a66为将SEQ ID NO：2自N末端起第416位的L置换为了A，得到的蛋白质。所述蛋白质a67为将SEQ ID NO：2自N末端起第515位的E置换为了H，得到的蛋白质。所述蛋白质a68为将SEQ ID NO：2自N末端起第515位的E置换为了Q，得到的蛋白质。所述蛋白质a69为将SEQ ID NO：2自N末端起第515位的E置换为了T，得到的蛋白质。所述蛋白质a70为将SEQ ID NO：2自N末端起第524位的I置换为了V，得到的蛋白质。
上述任一所述蛋白质具体可为蛋白质b1至蛋白质b70中的任一种。
所述蛋白质b1为将SEQ ID NO：4自N末端起第37位的T置换为了P，得到的蛋白质。所述蛋白质b2为将SEQ ID NO：4自N末端起第117位的M置换为了Y，得到的蛋白质。所述蛋白质b3为将SEQ ID NO：4自N末端起第117位的M置换为了S，得到的蛋白质。所述蛋白质b4为将SEQ ID NO：4自N末端起第117位的M置换为了R，得到的蛋白质。所述蛋白质b5为将SEQ ID NO：4自N末端起第117位的M置换为了Q，得到的蛋白质。所述蛋白质b6为将SEQ ID NO：4自N末端起第117位的M置换为了G，得到的蛋白质。所述蛋白质b7为将SEQ ID NO：4自N末端起第143位的L置换为了Y，得到的蛋白质。所述蛋白质b8为将SEQ ID NO：4自N末端起第160位的T置换为了K，得到的蛋白质。所述蛋白质b9为将SEQ ID NO：4自N末端起第160位的T置换为了H，得到的蛋白 质。所述蛋白质b10为将SEQ ID NO：4自N末端起第168位的Y置换为了P，得到的蛋白质。所述蛋白质b11为将SEQ ID NO：4自N末端起第168位的Y置换为了E，得到的蛋白质。所述蛋白质b12为将SEQ ID NO：4自N末端起第178位的I置换为了P，得到的蛋白质。所述蛋白质b13为将SEQ ID NO：4自N末端起第179位的T置换为了A，得到的蛋白质。所述蛋白质b14为将SEQ ID NO：4自N末端起第223位的T置换为了E，得到的蛋白质。所述蛋白质b15为将SEQ ID NO：4自N末端起第244位的Y置换为了E，得到的蛋白质。所述蛋白质b16为将SEQ ID NO：4自N末端起第329位的F置换为了S，得到的蛋白质。所述蛋白质b17为将SEQ ID NO：4自N末端起第330位的Y置换为了N，得到的蛋白质。所述蛋白质b18为将SEQ ID NO：4自N末端起第330位的Y置换为了G，得到的蛋白质。所述蛋白质b19为将SEQ ID NO：4自N末端起第340位的G置换为了H，得到的蛋白质。所述蛋白质b20为将SEQ ID NO：4自N末端起第340位的G置换为了E，得到的蛋白质。所述蛋白质b21为将SEQ ID NO：4自N末端起第340位的G置换为了D，得到的蛋白质。所述蛋白质b22为将SEQ ID NO：4自N末端起第340位的G置换为了C，得到的蛋白质。所述蛋白质b23为将SEQ ID NO：4自N末端起第364位的N置换为了R，得到的蛋白质。所述蛋白质b24为将SEQ ID NO：4自N末端起第365位的V置换为了E，得到的蛋白质。所述蛋白质b25为将SEQ ID NO：4自N末端起第367位的Y置换为了G，得到的蛋白质。所述蛋白质b26为将SEQ ID NO：4自N末端起第529位的V置换为了E，得到的蛋白质。所述蛋白质b27为将SEQ ID NO：4自N末端起第535位的E置换为了W，得到的蛋白质。所述蛋白质b28为将SEQ ID NO：4自N末端起第535位的E置换为了T，得到的蛋白质。所述蛋白质b29为将SEQ ID NO：4自N末端起第535位的E置换为了S，得到的蛋白质。所述蛋白质b30为将SEQ ID NO：4自N末端起第535位的E置换为了R，得到的蛋白质。所述蛋白质b31为将SEQ ID NO：4自N末端起第535位的E置换为了N，得到的蛋白质。所述蛋白质b32为将SEQ ID NO：4自N末端起第535位的E置换为了I，得到的蛋白质。所述蛋白质b33为将SEQ ID NO：4自N末端起第535位的E置换为了F，得到的蛋白质。所述蛋白质b34为将SEQ ID NO：4自N末端起第116位的R置换为了E，得到的蛋白质。所述蛋白质b35为将SEQ ID NO：4自N末端起第116位的R置换为了N，得到的蛋白质。所述蛋白质b36为将SEQ ID NO：4自N末端起第116位的R置换为了S，得到的蛋白质。所述蛋白质b37为将SEQ ID NO：4自N末端起第116位的R置换为了A，得到的蛋白质。所述蛋白质b38为将SEQ ID NO：4自N末端起第116位的R置换为了G，得到的蛋白质。所述蛋白质b39为将SEQ ID NO：4自N末端起第116位的R置换为了K，得到的蛋白质。所述蛋白质b40为将SEQ ID NO：4自N末端起第117位的M置换为了C，得到的蛋白质。所述蛋白质b41为将SEQ ID NO：4自N末端起第117位的M置换为了P，得到的蛋白质。所述蛋白质b42为将SEQ ID NO：4自N末端起第117位的M置换为了V， 得到的蛋白质。所述蛋白质b43为将SEQ ID NO：4自N末端起第117位的M置换为了W，得到的蛋白质。所述蛋白质b44为将SEQ ID NO：4自N末端起第117位的M置换为了N，得到的蛋白质。所述蛋白质b45为将SEQ ID NO：4自N末端起第117位的M置换为了D，得到的蛋白质。所述蛋白质b46为将SEQ ID NO：4自N末端起第117位的M置换为了E，得到的蛋白质。所述蛋白质b47为将SEQ ID NO：4自N末端起第119位的Q置换为了V，得到的蛋白质。所述蛋白质b48为将SEQ ID NO：4自N末端起第119位的Q置换为了E，得到的蛋白质。所述蛋白质b49为将SEQ ID NO：4自N末端起第119位的Q置换为了T，得到的蛋白质。所述蛋白质b50为将SEQ ID NO：4自N末端起第143位的L置换为了A，得到的蛋白质。所述蛋白质b51为将SEQ ID NO：4自N末端起第143位的L置换为了C，得到的蛋白质。所述蛋白质b52为将SEQ ID NO：4自N末端起第143位的L置换为了Q，得到的蛋白质。所述蛋白质b53为将SEQ ID NO：4自N末端起第143位的L置换为了M，得到的蛋白质。所述蛋白质b54为将SEQ ID NO：4自N末端起第143位的L置换为了N，得到的蛋白质。所述蛋白质b55为将SEQ ID NO：4自N末端起第191位的Q置换为了E，得到的蛋白质。所述蛋白质b56为将SEQ ID NO：4自N末端起第191位的Q置换为了K，得到的蛋白质。所述蛋白质b57为将SEQ ID NO：4自N末端起第224位的T置换为了K，得到的蛋白质。所述蛋白质b58为将SEQ ID NO：4自N末端起第233位的T置换为了K，得到的蛋白质。所述蛋白质b59为将SEQ ID NO：4自N末端起第237位的G置换为了K，得到的蛋白质。所述蛋白质b60为将SEQ ID NO：4自N末端起第270位的V置换为了I，得到的蛋白质。所述蛋白质b61为将SEQ ID NO：4自N末端起第290位的V置换为了R，得到的蛋白质。所述蛋白质b62为将SEQ ID NO：4自N末端起第364位的N置换为了K，得到的蛋白质。所述蛋白质b63为将SEQ ID NO：4自N末端起第389位的Y置换为了D，得到的蛋白质。所述蛋白质b64为将SEQ ID NO：4自N末端起第389位的Y置换为了N，得到的蛋白质。所述蛋白质b65为将SEQ ID NO：4自N末端起第422位的K置换为了L，得到的蛋白质。所述蛋白质b66为将SEQ ID NO：4自N末端起第436位的L置换为了A，得到的蛋白质。所述蛋白质b67为将SEQ ID NO：4自N末端起第535位的E置换为了H，得到的蛋白质。所述蛋白质b68为将SEQ ID NO：4自N末端起第535位的E置换为了Q，得到的蛋白质。所述蛋白质b69为将SEQ ID NO：4自N末端起第535位的E置换为了T，得到的蛋白质。所述蛋白质b70为将SEQ ID NO：4自N末端起第544位的I置换为了V，得到的蛋白质。
编码上述任一所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。
含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。
所述重组载体可为向表达载体或克隆载体插入所述核酸分子得到的重组质粒。所述表达载体具体可为载体pET28a(+)。
所述重组载体具体可为实施例中提及的重组质粒pET28a-T17P、重组质粒pET28a-M97Y、重组质粒pET28a-M97S、重组质粒pET28a-M97R、重组质粒pET28a-M97Q、重组质粒pET28a-M97G、重组质粒pET28a-L123Y、重组质粒pET28a-T140K、重组质粒pET28a-T140H、重组质粒pET28a-Y148P、重组质粒pET28a-Y148E、重组质粒pET28a-I158P、重组质粒pET28a-T159A、重组质粒pET28a-T203E、重组质粒pET28a-Y224E、重组质粒pET28a-F309S、重组质粒pET28a-Y310N、重组质粒pET28a-Y310G、重组质粒pET28a-G320H、重组质粒pET28a-G320E、重组质粒pET28a-G320D、重组质粒pET28a-G320C、重组质粒pET28a-N344R、重组质粒pET28a-V345E、重组质粒pET28a-Y347G、重组质粒pET28a-V509E、重组质粒pET28a-E515W、重组质粒pET28a-E515T、重组质粒pET28a-E515S、重组质粒pET28a-E515R、重组质粒pET28a-E515N、重组质粒pET28a-E515I、重组质粒pET28a-E515F、重组质粒pET28a-R96E、重组质粒pET28a-R96N、重组质粒pET28a-R96S、重组质粒pET28a-R96A、重组质粒pET28a-R96G、重组质粒pET28a-R96K、重组质粒pET28a-M97C、重组质粒pET28a-M97P、重组质粒pET28a-M97V、重组质粒pET28a-M97W、重组质粒pET28a-M97N、重组质粒pET28a-M97D、重组质粒pET28a-M97E、重组质粒pET28a-Q99V、重组质粒pET28a-Q99E、重组质粒pET28a-Q99T、重组质粒pET28a-L123A、重组质粒pET28a-L123C、重组质粒pET28a-L123Q、重组质粒pET28a-L123M、重组质粒pET28a-L123N、重组质粒pET28a-Q171E、重组质粒pET28a-Q171K、重组质粒pET28a-T204K、重组质粒pET28a-T213K、重组质粒pET28a-G217K、重组质粒pET28a-V250I、重组质粒pET28a-V270R、重组质粒pET28a-N344K、重组质粒pET28a-Y369D、重组质粒pET28a-Y369N、重组质粒pET28a-K402L、重组质粒pET28a-L416A、重组质粒pET28a-E515H、重组质粒pET28a-E515Q、重组质粒pET28a-E515T或重组质粒pET28a-I524V。
所述重组微生物为将所述重组载体导入出发微生物得到的重组菌。
所述出发微生物可为大肠杆菌。
所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。
上述任一所述蛋白质或上述任一所述核酸分子在制备DNA聚合酶中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述DNA聚合酶的稳定性和/或比酶活高于phi29DNA聚合酶。
上述任一所述蛋白质或上述任一所述核酸分子在PCR扩增或测序中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述PCR扩增可为二链扩增、单细胞扩增和/或质粒扩增。所述测序可为DNB SEQ测序。
上述任一所述蛋白质或上述任一所述核酸分子在制备用于测序的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述产品可为试剂盒。
本发明的发明人经过大量实验，对现有的phi29 DNA聚合酶进行定点突变，还采用DNA shuffling以及组合突变体构建方法构建组合突变体，制备了73个稳定性和/或比酶活明显提高的重组phi29 DNA聚合酶。这些重组phi29 DNA聚合酶不仅热稳定性提高，而且聚合活性和持续合成能力提高。当采用本发明制备的重组phi29 DNA聚合酶进行扩增或测序时，可高效持续合成DNA，反应效率较高。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为载体pET28a(+)的结构示意图。
实施发明的最佳方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
载体pET28a(+)为Novagen公司的产品，其结构示意图见图1。
亲和A液：含20mM Tris-HCl、500mM NaCl、20mM Imidazole和62.5g/L Glycerol的水溶液，pH值为7.9。
实施例1、实施例2、实施例3中的重组phi29 DNA聚合酶均为phi29 DNA聚合酶的单突变体，实施例4中的重组phi29 DNA聚合酶为phi29 DNA聚合酶的组合突变体。
实施例1、重组phi29 DNA聚合酶的粗酶的制备
一、重组质粒pET28a-WT的构建
将载体pET28a(+)的限制性内切酶NdeI和BamHI识别序列间的DNA小片段替换为SEQ ID NO：1所示的双链DNA分子，其它序列均不变，得到重组质粒pET28a-WT。
SEQ ID NO：1所示的双链DNA分子即Phi29 DNA聚合酶的编码基因，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的Phi29 DNA聚合酶。
将重组质粒pET28a-WT进行测序。测序结果表明，重组质粒pET28a-WT中，SEQ ID NO：1所示的双链DNA分子与载体骨架上的His-tag标签(由6个组氨酸残基组成)的编码序列融合，形成SEQ ID NO：3所示的融合基因，表达SEQ ID NO：4所示的重组Phi29 DNA聚合酶(命名为融合蛋白1)，融合蛋白1具有His-tag标签。
二、Phi29 DNA聚合酶的编码基因的定点突变
1、配制定点突变PCR反应体系。定点突变PCR反应体系为25μL，包括2.5μL10×Pfu Reaction Buffer with Mg 2+、2μL dNTP Mix(dATP、dTTP、dGTP和dCTP的浓度均为2.5mM)、25ng重组质粒pET28a-WT、0.5μL Pfu DNA Polymerase和加入突变位点的突变引物。
Pfu DNA Polymerase为ThermoFisher公司的产品，货号为EP0501。10×Pfu Reaction Buffer with Mg 2+为Pfu DNA Polymerase中的组件。
加入突变位点的突变引物见表1。
表1
Figure PCTCN2020120099-appb-000001
Figure PCTCN2020120099-appb-000002
Figure PCTCN2020120099-appb-000003
2、取所述定点突变PCR反应体系，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
反应程序为：95℃3min；95℃30s，53℃30s，68℃8min，19个循环；68℃10min；4℃保存。
3、取所述PCR扩增产物，DpnI消化后，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，之后涂布于含卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜，挑取单克隆并提取质粒。
4、将步骤3提取的质粒分别进行测序。根据测序结果，获得若干Phi29 DNA聚合酶的编码基因发生点突变的重组质粒，分别编码不同的融合蛋白(即重组Phi29 DNA聚合酶)。
部分重组质粒编码的融合蛋白见表2。
表2
重组质粒名称 编码的融合蛋白 与融合蛋白1的不同
重组质粒pET28a-T17P 融合蛋白2 第37位的T置换为了P
重组质粒pET28a-M97Y 融合蛋白3 第117位的M置换为了Y
重组质粒pET28a-M97S 融合蛋白4 第117位的M置换为了S
重组质粒pET28a-M97R 融合蛋白5 第117位的M置换为了R
重组质粒pET28a-M97Q 融合蛋白6 第117位的M置换为了Q
重组质粒pET28a-M97G 融合蛋白7 第117位的M置换为了G
重组质粒pET28a-L123Y 融合蛋白8 第143位的L置换为了Y
重组质粒pET28a-T140K 融合蛋白9 第160位的T置换为了K
重组质粒pET28a-T140H 融合蛋白10 第160位的T置换为了H
重组质粒pET28a-Y148P 融合蛋白11 第168位的Y置换为了P
重组质粒pET28a-Y148E 融合蛋白12 第168位的Y置换为了E
重组质粒pET28a-I158P 融合蛋白13 第178位的I置换为了P
重组质粒pET28a-T159A 融合蛋白14 第179位的T置换为了A
重组质粒pET28a-T203E 融合蛋白15 第223位的T置换为了E
重组质粒pET28a-Y224E 融合蛋白16 第244位的Y置换为了E
重组质粒pET28a-F309S 融合蛋白17 第329位的F置换为了S
重组质粒pET28a-Y310N 融合蛋白18 第330位的Y置换为了N
重组质粒pET28a-Y310G 融合蛋白19 第330位的Y置换为了G
重组质粒pET28a-G320H 融合蛋白20 第340位的G置换为了H
重组质粒pET28a-G320E 融合蛋白21 第340位的G置换为了E
重组质粒pET28a-G320D 融合蛋白22 第340位的G置换为了D
重组质粒pET28a-G320C 融合蛋白23 第340位的G置换为了C
重组质粒pET28a-N344R 融合蛋白24 第364位的N置换为了R
重组质粒pET28a-V345E 融合蛋白25 第365位的V置换为了E
重组质粒pET28a-Y347G 融合蛋白26 第367位的Y置换为了G
重组质粒pET28a-V509E 融合蛋白27 第529位的V置换为了E
重组质粒pET28a-E515W 融合蛋白28 第535位的E置换为了W
重组质粒pET28a-E515T 融合蛋白29 第535位的E置换为了T
重组质粒pET28a-E515S 融合蛋白30 第535位的E置换为了S
重组质粒pET28a-E515R 融合蛋白31 第535位的E置换为了R
重组质粒pET28a-E515N 融合蛋白32 第535位的E置换为了N
重组质粒pET28a-E515I 融合蛋白33 第535位的E置换为了I
重组质粒pET28a-E515F 融合蛋白34 第535位的E置换为了F
重组质粒pET28a-R96E 融合蛋白35 第116位的R置换为了E
重组质粒pET28a-R96N 融合蛋白36 第116位的R置换为了N
重组质粒pET28a-R96S 融合蛋白37 第116位的R置换为了S
重组质粒pET28a-R96A 融合蛋白38 第116位的R置换为了A
重组质粒pET28a-R96G 融合蛋白39 第116位的R置换为了G
重组质粒pET28a-R96K 融合蛋白40 第116位的R置换为了K
重组质粒pET28a-M97C 融合蛋白41 第117位的M置换为了C
重组质粒pET28a-M97P 融合蛋白42 第117位的M置换为了P
重组质粒pET28a-M97V 融合蛋白43 第117位的M置换为了V
重组质粒pET28a-M97W 融合蛋白44 第117位的M置换为了W
重组质粒pET28a-M97N 融合蛋白45 第117位的M置换为了N
重组质粒pET28a-M97D 融合蛋白46 第117位的M置换为了D
重组质粒pET28a-M97E 融合蛋白47 第117位的M置换为了E
重组质粒pET28a-Q99V 融合蛋白48 第119位的Q置换为了V
重组质粒pET28a-Q99E 融合蛋白49 第119位的Q置换为了E
重组质粒pET28a-Q99T 融合蛋白50 第119位的Q置换为了T
重组质粒pET28a-L123A 融合蛋白51 第143位的L置换为了A
重组质粒pET28a-L123C 融合蛋白52 第143位的L置换为了C
重组质粒pET28a-L123Q 融合蛋白53 第143位的L置换为了Q
重组质粒pET28a-L123M 融合蛋白54 第143位的L置换为了M
重组质粒pET28a-L123N 融合蛋白55 第143位的L置换为了N
重组质粒pET28a-Q171E 融合蛋白56 第191位的Q置换为了E
重组质粒pET28a-Q171K 融合蛋白57 第191位的Q置换为了K
重组质粒pET28a-T204K 融合蛋白58 第224位的T置换为了K
重组质粒pET28a-T213K 融合蛋白59 第233位的T置换为了K
重组质粒pET28a-G217K 融合蛋白60 第237位的G置换为了K
重组质粒pET28a-V250I 融合蛋白61 第270位的V置换为了I
重组质粒pET28a-V270R 融合蛋白62 第290位的V置换为了R
重组质粒pET28a-N344K 融合蛋白63 第364位的N置换为了K
重组质粒pET28a-Y369D 融合蛋白64 第389位的Y置换为了D
重组质粒pET28a-Y369N 融合蛋白65 第389位的Y置换为了N
重组质粒pET28a-K402L 融合蛋白66 第422位的K置换为了L
重组质粒pET28a-L416A 融合蛋白67 第436位的L置换为了A
重组质粒pET28a-E515H 融合蛋白68 第535位的E置换为了H
重组质粒pET28a-E515Q 融合蛋白69 第535位的E置换为了Q
重组质粒pET28a-E515T 融合蛋白70 第535位的E置换为了T
重组质粒pET28a-I524V 融合蛋白71 第544位的I置换为了V
三、重组phi29 DNA聚合酶的粗酶的制备
重组phi29 DNA聚合酶1的粗酶的制备方法如下：
1、将重组质粒pET28a-WT转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌，将该重组菌命名为BL21(DE3)－WT。
2、取BL21(DE3)－WT单克隆，接种至5mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃、200rpm振荡培养12h，得到培养菌液。
3、取培养菌液，按体积比为1:100接种至1.5L LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃、200rpm振荡培养至OD 600nm值为0.6，然后加入IPTG并使其浓度为0.5mM，16℃、200rpm振荡培养12h，4℃、8000rpm离心10min，收集菌体沉淀。
4、完成步骤3后，取菌体沉淀，加入亲和A液重悬，冰上孵育30min，然后在冰水浴条件下超声破碎(采用宁波新芝超声波破碎仪的Φ6探头，超声波功率40％，循环程序为：破碎2s，停3s，共30min)，然后4℃、15000rpm离心30min，收集上清液。
5、完成步骤4后，取所述上清液，采用亲和层析法进行快速纯化，之后透析(透析buffer的溶质及其浓度为：200mM KCl、0.2mM EDTA、5％Glyecrol和20mM Tris-HCl；溶剂为水；pH值为7.5；温度为25℃)，获得重组phi29 DNA聚合酶1的粗酶。
按照上述步骤，将重组质粒pET28a-WT分别替换为重组质粒pET28a-T17P、重组质粒pET28a-M97Y、重组质粒pET28a-M97S、重组质粒pET28a-M97R、重组质粒pET28a-M97Q、重组质粒pET28a-M97G、重组质粒pET28a-L123Y、重组质粒pET28a-T140K、重组质粒pET28a-T140H、重组质粒pET28a-Y148P、重组质粒pET28a-Y148E、重组质粒pET28a-I158P、重组质粒pET28a-T159A、重组质粒pET28a-T203E、重组质粒pET28a-Y224E、重组质粒pET28a-F309S、重组质粒 pET28a-Y310N、重组质粒pET28a-Y310G、重组质粒pET28a-G320H、重组质粒pET28a-G320E、重组质粒pET28a-G320D、重组质粒pET28a-G320C、重组质粒pET28a-N344R、重组质粒pET28a-V345E、重组质粒pET28a-Y347G、重组质粒pET28a-V509E、重组质粒pET28a-E515W、重组质粒pET28a-E515T、重组质粒pET28a-E515S、重组质粒pET28a-E515R、重组质粒pET28a-E515N、重组质粒pET28a-E515I、重组质粒pET28a-E515F、重组质粒pET28a-R96E、重组质粒pET28a-R96N、重组质粒pET28a-R96S、重组质粒pET28a-R96A、重组质粒pET28a-R96G、重组质粒pET28a-R96K、重组质粒pET28a-M97C、重组质粒pET28a-M97P、重组质粒pET28a-M97V、重组质粒pET28a-M97W、重组质粒pET28a-M97N、重组质粒pET28a-M97D、重组质粒pET28a-M97E、重组质粒pET28a-Q99V、重组质粒pET28a-Q99E、重组质粒pET28a-Q99T、重组质粒pET28a-L123A、重组质粒pET28a-L123C、重组质粒pET28a-L123Q、重组质粒pET28a-L123M、重组质粒pET28a-L123N、重组质粒pET28a-Q171E、重组质粒pET28a-Q171K、重组质粒pET28a-T204K、重组质粒pET28a-T213K、重组质粒pET28a-G217K、重组质粒pET28a-V250I、重组质粒pET28a-V270R、重组质粒pET28a-N344K、重组质粒pET28a-Y369D、重组质粒pET28a-Y369N、重组质粒pET28a-K402L、重组质粒pET28a-L416A、重组质粒pET28a-E515H、重组质粒pET28a-E515Q、重组质粒pET28a-E515T和重组质粒pET28a-I524V，其它步骤均不变，依次得到重组phi29 DNA聚合酶2的粗酶—重组phi29 DNA聚合酶71的粗酶。
实施例2、实施例1制备的重组phi29 DNA聚合酶的粗酶的稳定性检测
采用protein thermal shift assay kit(Life Technologies)分别检测实施例1制备的71个重组phi29 DNA聚合酶的粗酶和透析buffer的Tm值。具体为：按照protein thermal shift studies user guide的指导设置程序、配置反应buffer；程序运行完成后，将实验结果输入protein thermal shift software进行分析，获得每个样品的Tm值。
重组phi29 DNA聚合酶1为阳性对照。
透析buffer为阴性对照。
每个样品重复4次取平均值。部分结果见表3。结果表明，与重组phi29 DNA聚合酶1的粗酶相比，重组phi29 DNA聚合酶2的粗酶—重组phi29 DNA聚合酶34的粗酶的Tm值均有一定程度的增加，即重组phi29 DNA聚合酶2的粗酶—重组phi29 DNA聚合酶34的粗酶的稳定性均有一定的提高。
表3
Figure PCTCN2020120099-appb-000004
Figure PCTCN2020120099-appb-000005
实施例3、实施例1制备的重组phi29 DNA聚合酶的粗酶的比酶活检测
每个实施例1制备的71个重组phi29 DNA聚合酶的粗酶进行比酶活检测：
1、取重组phi29 DNA聚合酶的粗酶，使用BCA kit测定蛋白浓度；然后用透析缓冲液稀释，得到浓度为5μg/mL的重组phi29 DNA聚合酶稀释液。
透析缓冲液的溶质及其浓度为20mM Tris-HCl，200mM KCl，2mM DTT，0.2mM EDTA和5％Glycerol；溶剂为水，pH值为7.4。
2、配制反应混合液。反应混合液为80.8μL，由DTT、(NH 4) 2SO 4、MgCl 2、dNTP Mixture、RCA Primer(即Ad153make DNB引物；invitrogen公司的产品，货号 为R082)、6ng单链环状DNA模板153Ad ssDNA和pH7.5、50mM Tris-HCl缓冲液组成。反应混合液中，DTT的浓度为4mM，(NH 4) 2SO 4的浓度为10mM，MgCl 2的浓度为10mM、dNTP Mixture的浓度为50nM、RCA Primer的浓度为2pM。
3、将所述反应混合液置于PCR仪上进行引物模板杂交，程序如下：95℃1min，65℃1min，40℃1min，热盖温度设置为102℃。当温度达到4℃时取出PCR管置于冰上，加入1μL重组phi29 DNA聚合酶稀释液，使用漩涡振荡器震荡混匀，短暂离心机离心5s后置于PCR仪中反应，反应条件为：30℃60min，热盖温度设置为65℃。反应完成后加入5μL浓度为0.5M的EDTA溶液终止反应，震荡混匀，得到反应产物。
4、按照Qubit ssDNA assay kit说明书操作，使用Qubit fluorometer3.0检测步骤3得到的反应产物的浓度。将1U酶活定义为在30℃反应60min条件下加入10nmol dNTP至DNB所需酶量。进一步获得重组phi29 DNA聚合酶的粗酶的比酶活。
部分结果见表4。结果表明，与重组phi29 DNA聚合酶1的粗酶相比，重组phi29DNA聚合酶3的粗酶、重组phi29 DNA聚合酶4的粗酶、重组phi29 DNA聚合酶5的粗酶、重组phi29 DNA聚合酶34的粗酶—重组phi29 DNA聚合酶71的粗酶的比酶活均有一定程度的增加，即重组phi29 DNA聚合酶3的粗酶、重组phi29 DNA聚合酶4的粗酶、重组phi29 DNA聚合酶5的粗酶、重组phi29 DNA聚合酶34的粗酶—重组phi29 DNA聚合酶71的粗酶的DNA聚合酶活性均有一定的提高。
表4
Figure PCTCN2020120099-appb-000006
Figure PCTCN2020120099-appb-000007
实施例4、phi29 DNA聚合酶的组合突变体的获得及稳定性和比酶活的检测
一、重组phi29 DNA聚合酶(即phi29 DNA聚合酶的组合突变体)的构建
根据实施例1提供的突变位点和文献中公开的已有突变位点，使用DNA shuffling方法或multi-site directed mutagenesis方法构建phi29 DNA聚合酶的组合突变体。
DNA shuffling方法的具体步骤如下：
1、将要shuffling的模板进行PCR扩增(正向引物为：
5’-CTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATG-3’，反向引物为：
5’-CTCGAATTCGGATCCTCACTTGA-3’)，然后进行切胶回收。
2、按照表5的步骤进行DNase I消化反应。
表5
Figure PCTCN2020120099-appb-000008
Figure PCTCN2020120099-appb-000009
3、完成步骤2后，用M280磁珠回收消化后的DNA片段，用75％(v/v)乙醇水溶液清洗2次，之后用ddH 2O溶解。
4、完成步骤3后，将打断后的片段用PCR方法进行shuffling重组。
反应体系如表6所示。
表6
试剂 体积(μL)
ddH 2O (21.5-DNA)
DNA 0.25/0.5/1.0
10×pfu buffer 2.5
10mM dNTP 0.5
Pfu polymerase 0.5
反应程序为：95℃3min；95℃30s，65℃30s，72℃1min，45个循环；72℃7min，4℃保存。
5、完成步骤4后，以重组好的片段为模板进行二次扩增富集。
反应体系如表7所示。
表7
试剂 体积(μL)
DNA 2.5
ddH 2O 18.0
10×pfu buffer 2.5
10mM dNTP 0.5
10μM Primer 1(表2中正向引物混合而成) 0.5
10μM Primer 2(表2中反向引物混合而成) 0.5
2.5U/μLPfu polymerase 0.5
反应程序为：95℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃1min40s，60个循环；72℃7min。
以5个突变位点的突变体的构建为例，multi-site directed mutagenesis方法的具体步骤如下：
1、进行引物设计：将突变位点设计在引物的中间，两侧各15nt左右，一个突变位点有一对反向互补的引物。
2、配制反应体系。反应体系为25μL，包括12.5μL 2×KAPA HiFi HS Ready Mix、3.5μL浓度为2μM的FW primer(共5条，每条0.7μL)、3.5μL浓度为2μM的RE  primer(共5条，每条0.7μL)、75ng模板和水。
3、取所述反应体系，进行PCR扩增反应。
反应程序为：95℃3min；98℃20s，65℃15s，72℃7min，19个循环；72℃10min，12℃保存。
4、完成步骤3后，加入1μLdpnI酶，37℃消化2h，然后转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂平板，37℃过夜培养，第二天挑取单菌落，提取质粒测序。
二、实施例1构建的phi29 DNA聚合酶的组合突变体的高通量筛选
采用iCSR(isothermal compartmentalization self-replication)方法对实施例1构建的phi29 DNA聚合酶的组合突变体进行高通量筛选。和CSR技术类似，利用phi29DNA聚合酶的链置换功能来完成对其自身质粒的复制，通过不同突变体的DNA扩增量的区别来表征突变体活性的强弱，通过几轮筛选，可以实现对活性高的突变体的富集。具体步骤如下：
1、引物设计
整个过程需要3对引物，引物对iCSR用于iCSR过程中的扩增(需要进行3’端末尾硫代修饰，以防止被细胞内的外切酶消化)，引物对Insert和载体扩增引物对用于in-fusion反应中模板和insert的扩增。
引物对iCSR由Primer 1：5’-TTGAGGCCGTTGAGCACC-3’(3'端末尾硫代修饰)和Primer 2：5’-CCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG-3’(3’端末尾硫代修饰)组成。
引物对Insert由Primer3：5’-AATGTATAGCTGCGACTTTGAAACCA-3’和Primer4：5’-TAGAGGCCCCAAGGGGTTAT-3’组成。
载体扩增引物对由Primer5：5’-ATAACCCCTTGGGGCCTCTA-3’和Primer6：5’-TGGTTTCAAAGTCGCAGCTATACAT-3’组成。
2、细胞转化及蛋白表达
将已构建好的突变体库转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，不涂板，直接将37℃孵育培养的细胞转入2mL含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养。第2天1：200再次转入含卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养3h，之后加入终浓度为0.5mM的IPTG，16℃过夜诱导。
3、iCSR反应体系配制
1)配制反应buffer。反应buffer为2mL，包括10×phi29 reaction buffer200μL、500μM Exo-resistant primer mix 40μL、10μM primer 1 60μL、10μM primer 2 60μL、25mM dNTPmix 40μL和NFH 2O 1600μL。
2)细胞准备
a、将0.45mL 1×phi29 reaction buffer和0.05mL10mg/mL溶菌酶混合，然后置于30℃金属浴中预热，得到细胞裂解buffer。
b、OD值测定及最终稀释体积计算
测试大肠杆菌OD值，按照OD为1时浓度8×10 8cells/mL估计，则细胞个数＝OD×8×10 8×2＝16×OD×10 8个，设稀释体积为VmL。
假设生成的微液滴直径为21μm左右，则单个微液滴的体积为5pL，其中按细菌通道和buffer通道的流速一致，则细菌通道的体积为2.5pL。
λ＝16×OD×10 8个/VmL×2.5pL＝16×2.5×OD×10 8×10 -9/V＝4×OD/V
若λ＝0.2，则只有1％的是双包，16％的是单包，则V＝20×OD
c、细胞处理
取诱导后的大肠杆菌细胞，12000rpm离心1min，弃上清，用1mL 1×phi29 reaction buffer重悬清洗两次，然后12000rpm离心1min，用0.5mL细胞裂解buffer重悬，30℃300rpm孵育5min。12000rpm离心1min回收细胞，然后用V体积的1×phi29 reaction buffer重悬稀释。置于冰上放置。
4、微液滴制备
液滴直径控制在20μm左右，注意生成的液滴需要置于冰上收集，大概收集500μL左右液滴。
5、iCSR反应
在冰上将液滴分为30μL/管，置于PCR管中。本次实验中利用PCR仪的梯度温度设置，考查&筛选可以在高温下反应的突变体。实验条件设置为37℃-55℃反应2h/16h，然后85℃15min热失活phi29 DNA聚合酶。
6、破乳
(1)取相同数量的phaseLock管，16000g离心30s进行预处理。
(2)向反应完的PCR管中加入等体积的PFO破乳剂，充分混匀后移入1.5mLEP管中，14000rpm离心10min，然后将液体全部转入phaseLock管中，16000g离心5min，取上层液体，转入新的PCR八联管中。
7、酶切及qubit定量
取9μL iCSR产物于新的PCR八联管中，向其中直接加入0.5μLdpnI(消化模板质粒)以及0.5μL XbaI(将扩增产物切成单拷贝)，37℃消化2h。然后使用qubit dsDNA HS assay kit进行定量(取1μL定量)。
8、二次扩增
使用KAPA HiFi HotStart PCR Kit进行扩增，注意因为没有经过纯化步骤，所以前面步骤中已经积累了Mg 2+，因此要调整反应buffer的量，注意不要使用readymix。
反应体系为50μL，包括5×HiFidelity buffer 8μL、10μM FW primer 1.5μL、10μM RE primer 1.5μL、template DNA(从3.7的管中取)2μL、10mM dNTP mix 1.5μL、NFH 2O 34.5μL和HiFi Enzyme 1μL。
另外，载体模板的扩增可使用ReadyMix正常进行。
反应条件为：95℃3min，98℃20s，65℃15s，72℃2min，35个循环；72℃10min；4℃保存。
9、胶回收
向PCR产物中加入6×loading dye，然后进行琼脂糖凝胶电泳。切胶后按照gel extraction kit的操作步骤进行切胶回收。将回收产物进行定量。
10、in-fusion reaction
按照In-Fusion HD Cloning Kit的说明，insert长度在0.5-10kb时推荐投入量为50-100ng，vector长度小于10kb时推荐投入量为50-100ng。而只有一个insert时，推荐insert和vector的投入摩尔比为2：1。因此本发明的反应体系为10μL，包括purified PCR fragment 50ng、linearized vector 78ng、5×In-fusion HD Enzyme mix 2μL和NFH 2O。
反应条件为50℃15min，然后4℃保存。
11、转化及测序
将in-fusion产物直接转化进KRX/BL21感受态中(如果想要高转化率，也可以 转DH5a，提质粒后，再转进BL21)，直接转进含卡那霉素的LB液体培养基中。第2天，取菌液准备诱导表达进行下一轮的筛选。待第二轮筛选完成后，再送平板进行测序。
经过上述步骤，获得4个活性较好的phi29 DNA聚合酶的组合突变体，分别为phi29 DNA聚合酶T213K/L416A/V509E、phi29 DNA聚合酶M97T/Y224K/E515S、phi29DNA聚合酶L123Q/T159A/Y347G和phi29 DNA聚合酶R96S/L123P/Y224K/L416A/E515S。
phi29 DNA聚合酶T213K/L416A/V509E与SEQ ID NO：2所示的Phi29 DNA聚合酶的唯一不同在于后者第213位的T置换为了K，第416位的L置换为了A，第509位的V置换为了E。
phi29 DNA聚合酶M97T/Y224K/E515S与SEQ ID NO：2所示的Phi29 DNA聚合酶的唯一不同在于后者第97位的M置换为了T，第224位的Y置换为了K，第515位的E置换为了S。
phi29 DNA聚合酶L123Q/T159A/Y347G与SEQ ID NO：2所示的Phi29 DNA聚合酶的唯一不同在于后者第123位的L置换为了Q，第159位的T置换为了A，第347位的Y置换为了G。
phi29 DNA聚合酶R96S/L123P/Y224K/L416A/E515S与SEQ ID NO：2所示的Phi29DNA聚合酶的唯一不同在于后者第96位的R置换为了S、第123位的L置换为了P、第224位的Y置换为了K、第416位的L置换为了A、第515位的E置换为了S。
三、phi29 DNA聚合酶的组合突变体的获得
制备SEQ ID NO：2所示的Phi29 DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶T213K/L416A/V509E、phi29 DNA聚合酶M97T/Y224K/E515S、phi29 DNA聚合酶L123Q/T159A/Y347G和phi29 DNA聚合酶R96S/L123P/Y224K/L416A/E515S。
四、phi29 DNA聚合酶的组合突变体的稳定性检测
按照实施例2的方法，检测phi29 DNA聚合酶T213K/L416A/V509E、phi29 DNA聚合酶M97T/Y224K/E515S、phi29 DNA聚合酶L123Q/T159A/Y347G和phi29 DNA聚合酶R96S/L123P/Y224K/L416A/E515S的Tm值。
检测结果见表8。结果表明，与SEQ ID NO：2所示的Phi29 DNA聚合酶相比，3个phi29 DNA聚合酶的组合突变体的Tm值均有显著增加，即3个phi29 DNA聚合酶的组合突变体的稳定性均显著提高。
表8
  Tm(℃)
SEQ ID NO：2所示的Phi29 DNA聚合酶 48.5
phi29 DNA聚合酶T213K/L416A/V509E 49.4
phi29 DNA聚合酶M97T/Y224K/E515S 50.8
phi29 DNA聚合酶L123Q/T159A/Y347G 46.1
phi29 DNA聚合酶R96S/L123P/Y224K/L416A/E515S 51.6
五、phi29 DNA聚合酶的组合突变体的比酶活检测
按照实施例3的方法，检测phi29 DNA聚合酶T213K/L416A/V509E、phi29 DNA聚合酶M97T/Y224K/E515S、phi29 DNA聚合酶L123Q/T159A/Y347G和phi29 DNA聚合酶R96S/L123P/Y224K/L416A/E515S的比酶活。
检测结果见表9。结果表明，与SEQ ID NO：2所示的Phi29 DNA聚合酶相比，2 个phi29 DNA聚合酶的组合突变体的比酶活均显著增加，即2个phi29 DNA聚合酶的组合突变体的DNA聚合酶活性均显著提高。
表9
  比酶活(U/μg)
SEQ ID NO：2所示的Phi29 DNA聚合酶 43
phi29 DNA聚合酶T213K/L416A/V509E 52
phi29 DNA聚合酶M97T/Y224K/E515S 55
phi29 DNA聚合酶L123Q/T159A/Y347G 9
phi29 DNA聚合酶R96S/L123P/Y224K/L416A/E515S 28
由此可见，phi29 DNA聚合酶T213K/L416A/V509E和phi29 DNA聚合酶M97T/Y224K/E515S的稳定性好、比酶活高，效果最好；phi29 DNA聚合酶R96S/L123P/Y224K/L416A/E515S的稳定性好但比酶活略差；phi29 DNA聚合酶L123Q/T159A/Y347G的稳定性和比酶活均较差。
工业应用
与现有phi29 DNA聚合酶相比，本发明制备了73个稳定性和/或比酶活明显提高的重组phi29 DNA聚合酶。这些重组phi29 DNA聚合酶不仅热稳定性提高，而且聚合活性和持续合成能力提高。当采用本发明制备的重组phi29 DNA聚合酶进行扩增或测序时，可高效持续合成DNA，反应效率较高。本发明具有重要的应用价值。

Claims (15)

  1. 蛋白质，为C1)或C2)：
    C1)将phi29 DNA聚合酶氨基酸序列中第17位、第96位、第97位、第99位、第123位、第140位、第148位、第158位、第159位、第171位、第203位、第204位、第213位、第217位、第224位、第250位、第270位、第309位、第310位、第320位、第344位、第345位、第347位、第369位、第402位、第416位、第509位、第515位和第524位这29位中至少一位的氨基酸残基进行置换，得到具有DNA聚合酶活性的蛋白质；
    C2)在C1)所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
    所述phi29DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
  2. 如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：
    第17位的T置换为了P；
    第96位的R置换为了E、N、S、A、G或K；
    第97位的M置换为了Y、S、R、Q、G、C、P、V、W、N、D、E或T；
    第99位的Q置换为了V、E或T；
    第123位的L置换为了Y、A、C、Q、M、N或P；
    第140位的T置换为了K或H；
    第148位的Y置换为了P或E；
    第158位的I置换为了P；
    第159位的T置换为了A；
    第171位的Q置换为了E或K；
    第203位的T置换为了E；
    第204位的T置换为了K；
    第213位的T置换为了K；
    第217位的G置换为了K；
    第224位的Y置换为了E或K；
    第250位的V置换为了I；
    第270位的V置换为了R；
    第309位的F置换为了S；
    第310位的Y置换为了N或G；
    第320位的G置换为了H、E、D或C；
    第344位的N置换为了R或K；
    第345位的V置换为了E；
    第347位的Y置换为了G；
    第369位的Y置换为了D或N；
    第402位的K置换为了L；
    第416位的L置换为了A；
    第509位的V置换为了E；
    第515位的E置换为了W、T、S、R、N、I、F、H、Q或T；
    第524位的I置换为了V。
  3. 如权利要求1或2所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质的稳定性和/或比酶活高于phi29 DNA聚合酶。
  4. 如权利要求3所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为phi29 DNA聚合T213K/L416A/V509E、phi29 DNA聚合酶M97T/Y224K/E515S或phi29 DNA聚合酶R96S/L123P/Y224K/L416A/E515S；
    phi29 DNA聚合酶T213K/L416A/V509E为将SEQ ID NO：2自N末端起第213位的T置换为了K，第416位的L置换为了A，第509位的V置换为了E，得到的蛋白质；
    phi29 DNA聚合酶M97T/Y224K/E515S为将SEQ ID NO：2自N末端起第97位的M置换为了T，第224位的Y置换为了K，第515位的E置换为了S，得到的蛋白质；
    phi29 DNA聚合酶R96S/L123P/Y224K/L416A/E515S为将SEQ ID NO：2自N末端起第96位的R置换为了S，第123位的L置换为了P，第224位的Y置换为了K，第416位的L置换为了A，第515位的E置换为了S，得到的蛋白质。
  5. 如权利要求3所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为蛋白质a1至蛋白质a70中的任一种；
    所述蛋白质a1为将SEQ ID NO：2自N末端起第17位的T置换为了P，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a2为将SEQ ID NO：2自N末端起第97位的M置换为了Y，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a3为将SEQ ID NO：2自N末端起第97位的M置换为了S，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a4为将SEQ ID NO：2自N末端起第97位的M置换为了R，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a5为将SEQ ID NO：2自N末端起第97位的M置换为了Q，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a6为将SEQ ID NO：2自N末端起第97位的M置换为了G，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a7为将SEQ ID NO：2自N末端起第123位的L置换为了Y，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a8为将SEQ ID NO：2自N末端起第140位的T置换为了K，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a9为将SEQ ID NO：2自N末端起第140位的T置换为了H，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a10为将SEQ ID NO：2自N末端起第148位的Y置换为了P，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a11为将SEQ ID NO：2自N末端起第148位的Y置换为了E，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a12为将SEQ ID NO：2自N末端起第158位的I置换为了P，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a13为将SEQ ID NO：2自N末端起第159位的T置换为了A，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a14为将SEQ ID NO：2自N末端起第203位的T置换为了E，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a15为将SEQ ID NO：2自N末端起第224位的Y置换为了E，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a16为将SEQ ID NO：2自N末端起第309位的F置换为了S，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a17为将SEQ ID NO：2自N末端起第310位的Y置换为了N，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a18为将SEQ ID NO：2自N末端起第310位的Y置换为了G，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a19为将SEQ ID NO：2自N末端起第320位的G置换为了H，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a20为将SEQ ID NO：2自N末端起第320位的G置换为了E，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a21为将SEQ ID NO：2自N末端起第320位的G置换为了D，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a22为将SEQ ID NO：2自N末端起第320位的G置换为了C，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a23为将SEQ ID NO：2自N末端起第344位的N置换为了R，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a24为将SEQ ID NO：2自N末端起第345位的V置换为了E，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a25为将SEQ ID NO：2自N末端起第347位的Y置换为了G，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a26为将SEQ ID NO：2自N末端起第509位的V置换为了E，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a27为将SEQ ID NO：2自N末端起第515位的E置换为了W，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a28为将SEQ ID NO：2自N末端起第515位的E置换为了T， 得到的蛋白质；
    所述蛋白质a29为将SEQ ID NO：2自N末端起第515位的E置换为了S，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a30为将SEQ ID NO：2自N末端起第515位的E置换为了R，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a31为将SEQ ID NO：2自N末端起第515位的E置换为了N，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a32为将SEQ ID NO：2自N末端起第515位的E置换为了I，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a33为将SEQ ID NO：2自N末端起第515位的E置换为了F，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a34为将SEQ ID NO：2自N末端起第96位的R置换为了E，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a35为将SEQ ID NO：2自N末端起第96位的R置换为了N，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a36为将SEQ ID NO：2自N末端起第96位的R置换为了S，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a37为将SEQ ID NO：2自N末端起第96位的R置换为了A，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a38为将SEQ ID NO：2自N末端起第96位的R置换为了G，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a39为将SEQ ID NO：2自N末端起第96位的R置换为了K，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a40为将SEQ ID NO：2自N末端起第97位的M置换为了C，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a41为将SEQ ID NO：2自N末端起第97位的M置换为了P，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a42为将SEQ ID NO：2自N末端起第97位的M置换为了V，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a43为将SEQ ID NO：2自N末端起第97位的M置换为了W，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a44为将SEQ ID NO：2自N末端起第97位的M置换为了N，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a45为将SEQ ID NO：2自N末端起第97位的M置换为了D，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a46为将SEQ ID NO：2自N末端起第97位的M置换为了E，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a47为将SEQ ID NO：2自N末端起第99位的Q置换为了V，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a48为将SEQ ID NO：2自N末端起第99位的Q置换为了E，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a49为将SEQ ID NO：2自N末端起第99位的Q置换为了T，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a50为将SEQ ID NO：2自N末端起第123位的L置换为了A，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a51为将SEQ ID NO：2自N末端起第123位的L置换为了C，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a52为将SEQ ID NO：2自N末端起第123位的L置换为了Q，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a53为将SEQ ID NO：2自N末端起第123位的L置换为了M，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a54为将SEQ ID NO：2自N末端起第123位的L置换为了N，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a55为将SEQ ID NO：2自N末端起第171位的Q置换为了E，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a56为将SEQ ID NO：2自N末端起第171位的Q置换为了K，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a57为将SEQ ID NO：2自N末端起第204位的T置换为了K，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a58为将SEQ ID NO：2自N末端起第213位的T置换为了K，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a59为将SEQ ID NO：2自N末端起第217位的G置换为了K，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a60为将SEQ ID NO：2自N末端起第250位的V置换为了I，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a61为将SEQ ID NO：2自N末端起第270位的V置换为了R，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a62为将SEQ ID NO：2自N末端起第344位的N置换为了K，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a63为将SEQ ID NO：2自N末端起第369位的Y置换为了D，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a64为将SEQ ID NO：2自N末端起第369位的Y置换为了N，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a65为将SEQ ID NO：2自N末端起第402位的K置换为了L， 得到的蛋白质；
    所述蛋白质a66为将SEQ ID NO：2自N末端起第416位的L置换为了A，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a67为将SEQ ID NO：2自N末端起第515位的E置换为了H，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a68为将SEQ ID NO：2自N末端起第515位的E置换为了Q，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a69为将SEQ ID NO：2自N末端起第515位的E置换为了T，得到的蛋白质；
    所述蛋白质a70为将SEQ ID NO：2自N末端起第524位的I置换为了V，得到的蛋白质。
  6. 如权利要求3所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为蛋白质b1至蛋白质b70中的任一种；
    所述蛋白质b1为将SEQ ID NO：4自N末端起第37位的T置换为了P，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b2为将SEQ ID NO：4自N末端起第117位的M置换为了Y，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b3为将SEQ ID NO：4自N末端起第117位的M置换为了S，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b4为将SEQ ID NO：4自N末端起第117位的M置换为了R，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b5为将SEQ ID NO：4自N末端起第117位的M置换为了Q，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b6为将SEQ ID NO：4自N末端起第117位的M置换为了G，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b7为将SEQ ID NO：4自N末端起第143位的L置换为了Y，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b8为将SEQ ID NO：4自N末端起第160位的T置换为了K，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b9为将SEQ ID NO：4自N末端起第160位的T置换为了H，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b10为将SEQ ID NO：4自N末端起第168位的Y置换为了P，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b11为将SEQ ID NO：4自N末端起第168位的Y置换为了E，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b12为将SEQ ID NO：4自N末端起第178位的I置换为了P，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b13为将SEQ ID NO：4自N末端起第179位的T置换为了A，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b14为将SEQ ID NO：4自N末端起第223位的T置换为了E，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b15为将SEQ ID NO：4自N末端起第244位的Y置换为了E，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b16为将SEQ ID NO：4自N末端起第329位的F置换为了S，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b17为将SEQ ID NO：4自N末端起第330位的Y置换为了N，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b18为将SEQ ID NO：4自N末端起第330位的Y置换为了G，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b19为将SEQ ID NO：4自N末端起第340位的G置换为了H，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b20为将SEQ ID NO：4自N末端起第340位的G置换为了E，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b21为将SEQ ID NO：4自N末端起第340位的G置换为了D，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b22为将SEQ ID NO：4自N末端起第340位的G置换为了C，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b23为将SEQ ID NO：4自N末端起第364位的N置换为了R，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b24为将SEQ ID NO：4自N末端起第365位的V置换为了E，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b25为将SEQ ID NO：4自N末端起第367位的Y置换为了G，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b26为将SEQ ID NO：4自N末端起第529位的V置换为了E，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b27为将SEQ ID NO：4自N末端起第535位的E置换为了W，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b28为将SEQ ID NO：4自N末端起第535位的E置换为了T，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b29为将SEQ ID NO：4自N末端起第535位的E置换为了S，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b30为将SEQ ID NO：4自N末端起第535位的E置换为了R，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b31为将SEQ ID NO：4自N末端起第535位的E置换为了N， 得到的蛋白质；
    所述蛋白质b32为将SEQ ID NO：4自N末端起第535位的E置换为了I，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b33为将SEQ ID NO：4自N末端起第535位的E置换为了F，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b34为将SEQ ID NO：4自N末端起第116位的R置换为了E，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b35为将SEQ ID NO：4自N末端起第116位的R置换为了N，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b36为将SEQ ID NO：4自N末端起第116位的R置换为了S，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b37为将SEQ ID NO：4自N末端起第116位的R置换为了A，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b38为将SEQ ID NO：4自N末端起第116位的R置换为了G，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b39为将SEQ ID NO：4自N末端起第116位的R置换为了K，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b40为将SEQ ID NO：4自N末端起第117位的M置换为了C，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b41为将SEQ ID NO：4自N末端起第117位的M置换为了P，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b42为将SEQ ID NO：4自N末端起第117位的M置换为了V，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b43为将SEQ ID NO：4自N末端起第117位的M置换为了W，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b44为将SEQ ID NO：4自N末端起第117位的M置换为了N，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b45为将SEQ ID NO：4自N末端起第117位的M置换为了D，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b46为将SEQ ID NO：4自N末端起第117位的M置换为了E，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b47为将SEQ ID NO：4自N末端起第119位的Q置换为了V，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b48为将SEQ ID NO：4自N末端起第119位的Q置换为了E，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b49为将SEQ ID NO：4自N末端起第119位的Q置换为了T，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b50为将SEQ ID NO：4自N末端起第143位的L置换为了A，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b51为将SEQ ID NO：4自N末端起第143位的L置换为了C，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b52为将SEQ ID NO：4自N末端起第143位的L置换为了Q，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b53为将SEQ ID NO：4自N末端起第143位的L置换为了M，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b54为将SEQ ID NO：4自N末端起第143位的L置换为了N，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b55为将SEQ ID NO：4自N末端起第191位的Q置换为了E，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b56为将SEQ ID NO：4自N末端起第191位的Q置换为了K，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b57为将SEQ ID NO：4自N末端起第224位的T置换为了K，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b58为将SEQ ID NO：4自N末端起第233位的T置换为了K，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b59为将SEQ ID NO：4自N末端起第237位的G置换为了K，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b60为将SEQ ID NO：4自N末端起第270位的V置换为了I，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b61为将SEQ ID NO：4自N末端起第290位的V置换为了R，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b62为将SEQ ID NO：4自N末端起第364位的N置换为了K，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b63为将SEQ ID NO：4自N末端起第389位的Y置换为了D，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b64为将SEQ ID NO：4自N末端起第389位的Y置换为了N，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b65为将SEQ ID NO：4自N末端起第422位的K置换为了L，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b66为将SEQ ID NO：4自N末端起第436位的L置换为了A，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b67为将SEQ ID NO：4自N末端起第535位的E置换为了H，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b68为将SEQ ID NO：4自N末端起第535位的E置换为了Q， 得到的蛋白质；
    所述蛋白质b69为将SEQ ID NO：4自N末端起第535位的E置换为了T，得到的蛋白质；
    所述蛋白质b70为将SEQ ID NO：4自N末端起第544位的I置换为了V，得到的蛋白质。
  7. 编码权利要求1至6任一所述蛋白质的核酸分子。
  8. 含有权利要求7所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
  9. 如权利要求8所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为向表达载体或克隆载体插入所述核酸分子得到的重组质粒。
  10. 如权利要求8所述的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物为将权利要求8或9所述重组载体导入出发微生物得到的重组菌。
  11. 权利要求1至6任一所述蛋白质或权利要求7所述核酸分子在制备DNA聚合酶中的应用。
  12. 如权利要求11所述的应用，其特征在于：所述DNA聚合酶的稳定性和/或比酶活高于phi29DNA聚合酶。
  13. 权利要求1至6任一所述蛋白质或权利要求7所述核酸分子在PCR扩增或测序中的应用。
  14. 如权利要求13所述的应用，其特征在于：
    所述PCR扩增为二链扩增、单细胞扩增和/或质粒扩增；
    所述测序为DNB SEQ测序。
  15. 权利要求1至6任一所述蛋白质或权利要求7所述核酸分子在制备用于测序的产品中的应用。
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