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WO2021210539A1 - 発酵乳及びその製造方法、並びに脱リン酸乳 - Google Patents

発酵乳及びその製造方法、並びに脱リン酸乳 Download PDF

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Publication number
WO2021210539A1
WO2021210539A1 PCT/JP2021/015188 JP2021015188W WO2021210539A1 WO 2021210539 A1 WO2021210539 A1 WO 2021210539A1 JP 2021015188 W JP2021015188 W JP 2021015188W WO 2021210539 A1 WO2021210539 A1 WO 2021210539A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
milk
fermented milk
protein
protein phosphatase
casein
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/015188
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
準季 小笠原
和廣 濱口
Original Assignee
合同酒精株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 合同酒精株式会社 filed Critical 合同酒精株式会社
Priority to US17/995,940 priority Critical patent/US20230210122A1/en
Priority to EP21787957.6A priority patent/EP4136979A4/en
Priority to JP2022515374A priority patent/JPWO2021210539A1/ja
Priority to CN202180027811.9A priority patent/CN115397247A/zh
Publication of WO2021210539A1 publication Critical patent/WO2021210539A1/ja

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING OR TREATMENT THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/1203—Addition of, or treatment with, enzymes or microorganisms other than lactobacteriaceae
    • A23C9/1216—Other enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING OR TREATMENT THEREOF
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    • A23C9/1307—Milk products or derivatives; Fruit or vegetable juices; Sugars, sugar alcohols, sweeteners; Oligosaccharides; Organic acids or salts thereof or acidifying agents; Flavours, dyes or pigments; Inert or aerosol gases; Carbonation methods
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    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03002—Acid phosphatase (3.1.3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
    • C12Y207/11001—Non-specific serine/threonine protein kinase (2.7.11.1), i.e. casein kinase or checkpoint kinase

Definitions

  • the present invention relates to fermented milk, a method for producing the same, and dephosphorylated milk.
  • Fermented milk is produced by fermenting raw milk with microorganisms such as lactic acid bacteria.
  • microorganisms such as lactic acid bacteria.
  • EPS extracellular polysaccharides
  • the major protein in milk is casein, and when the pH drops due to fermentation, casein micelles aggregate to form a gel.
  • Casein is mainly classified into four types, ⁇ S1 , ⁇ S2 , ⁇ , and ⁇ , and has phosphoric acid bound to 8, 11, 5, and 1 serine residues, respectively. It is known that the phosphoric acid modification in casein is involved in the hydrophobicity of the casein micelle surface and the hydrophobic core.
  • An object of the present invention is to provide fermented milk of stable quality, a method for producing the same, and dephosphorylated milk.
  • the present inventor focused on casein phosphoserine and studied diligently. As a result, dephosphorylated casein in which phosphoric acid was desorbed from the serine residue of casein was involved in the physical properties of fermented milk and contained a predetermined amount of the dephosphorylated casein. It was found that the fermented milk had suppressed water separation, increased viscosity and breaking stress, and increased production of extracellular polysaccharide (EPS). Further, by fermenting the raw milk in the presence of protein phosphatase or fermenting the raw milk obtained by enzymatically treating with protein phosphatase, the effects of suppressing water separation of the fermented milk and increasing the viscosity and breaking stress are recognized. In addition, they have found that the production of extracellular polysaccharide (EPS) is increased, and completed the present invention.
  • EPS extracellular polysaccharide
  • the present invention provides the following [1] to [6].
  • the present invention also provides the following [7] to [13].
  • a method for producing fermented milk which comprises any of the following steps.
  • Protein phosphatase is a protein phosphatase derived from a microorganism belonging to the genus Trichoderma.
  • a protein having protein phosphatase activity according to any one of the following (i) to (iii).
  • Protein iii) A protein consisting of an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having protein phosphatase activity.
  • the fermented milk of the present invention has a low water separation, a high viscosity and a firm structure. In addition, it contains a large amount of extracellular polysaccharide (EPS) and has excellent physiological functions. Further, according to the method for producing fermented milk of the present invention, it is possible to provide fermented milk having less water separation, a highly viscous and firm structure, and containing a large amount of extracellular polysaccharide (EPS). In addition, the dephosphorylated milk of the present invention changes the mouthfeel by increasing the hydrophobicity of the casein molecule. The same effect can be obtained in dairy products using dephosphorylated milk.
  • fermented milk means fermented milk and lactic acid bacteria beverages defined in the Ordinance of the Ministry of Milk, etc. (Ministry Ordinance on Ingredient Standards of Milk and Milk Products, Ordinance No. 52 of the Ministry of Health and Welfare, 1951). Fermented milk is "milk or milk containing non-fat milk solids equal to or higher than this, fermented with lactic acid bacteria or yeast to make it paste-like or liquid, or frozen", and lactic acid bacteria beverages are "milk, etc.” Beverages (excluding fermented milk) that are processed or used as the main ingredient after being fermented with lactic acid bacteria or yeast.
  • Hard yogurt and soft yogurt are classified as fermented milk classified as “paste-like", yogurt (drink yogurt) as fermented milk classified as “liquefied”, and “frozen”. Frozen yogurt can be mentioned as fermented milk.
  • the fermented milk of the present invention is preferably hard yogurt or soft yogurt from the viewpoint that the effects of the present invention can be easily enjoyed.
  • the fermented milk of the present invention contains 0.8 g / 100 g or more of dephosphorylated casein.
  • Dephosphorylated casein is produced by dephosphorylation of casein serine phosphate in milk.
  • the content of dephosphorylated casein in fermented milk is preferably 0.9 g / 100 g or more from the viewpoint of the effect of suppressing water separation of fermented milk, the effect of increasing viscosity and breaking stress, and the effect of increasing EPS production. , 1.0 g / 100 g or more, more preferably 1.5 g / 100 g or less, more preferably 1.4 g / 100 g or less, and 1.3 g / 100 g or less. Is more preferable.
  • the ratio of dephosphorylated casein in casein is preferably 25 to 45%, more preferably 26 to 43%.
  • the analysis of casein is carried out by subjecting each casein ( ⁇ -casein, ⁇ -casein and ⁇ casein) at known concentrations and a sample to polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and coomassie brilliant blue staining (CBB staining). After that, a calibration line can be created by quantifying the band intensity using image analysis software, and the amount of casein in the sample can be calculated. Further, in the present specification, the analysis of dephosphorylated casein shall follow the method described below.
  • Dephosphorylated casein can be quantified by electrophoresis. In this method, the amounts of phosphorylated casein and dephosphorylated casein are calculated from the electrophoresis results. This will be described with reference to FIG. The electrophoresis method is as described in Examples described later.
  • FIG. 1 is a conceptual representation of an electrophoretogram of bovine milk.
  • the phosphorylated casein has three regions of ⁇ -casein 1, ⁇ -casein 2 and ⁇ casein 3, and the amount of phosphorylated casein can be calculated by integrating these regions. Other phosphorylated casein is also present, but it can be ignored because it is in a trace amount.
  • the total amount of ⁇ s-1 casein, ⁇ s-2 casein, ⁇ casein and ⁇ casein in the total amount of casein in bovine milk is about 97%.
  • Dephosphorylated casein is present adjacent to the band of each casein. Dephosphorylated casein is in a smeared state after electrophoresis due to the varying degrees of dephosphoric acid. Since the concentrations of the phosphorylated casein band and the dephosphorylated casein region are different, they can be visually confirmed.
  • the amount of dephosphorylated casein can be calculated by integrating the dephosphorylated casein regions 11, 21, and 31. The end of the dephosphorylated casein region 31 may be the end after visually confirming the boundary between the stained region and the unstained region.
  • the order of the amount of phosphorylated casein is ⁇ -casein, ⁇ -casein, and ⁇ -casein.
  • the degree of dephosphorylated casein can be measured for milks of different origins by the same method as described above.
  • One or more specific caseins may be selected and measured so as to account for 90% or more of the total amount of casein.
  • the integration end line B is set at a place where the area of the non-band region is visually 50%. , The area of the band area up to that point may be calculated.
  • a graph of the migration pattern may be referred to.
  • the integration start line and the integration end line may be set by the above method, and the concentration in the band region existing between them may be quantified.
  • the concentration of the dephosphoric acid region can be quantified by the same method as described above.
  • the fermented milk of the present invention preferably further contains free phosphoric acid.
  • the content of free phosphoric acid in the fermented milk is preferably 15 mM or more, preferably 15 mM to 40 mM, from the viewpoint of the effect of suppressing water separation of the fermented milk, the effect of increasing the viscosity and breaking stress, and the effect of increasing the EPS production amount. It is more preferable that it is within the range.
  • raw milk which is a raw material of fermented milk
  • the raw milk may be fermented in the presence of protein phosphatase.
  • the raw milk may be treated with protein phosphatase, and the dephosphorylated milk after the treatment may be fermented. That is, the method for producing fermented milk of the present invention is It has any of (a) a step of fermenting raw milk in the presence of protein phosphatase (b) a step of fermenting raw milk obtained by enzymatically treating with protein phosphatase.
  • the raw material milk may contain casein, and a general milk-derived raw material is used.
  • a general milk-derived raw material is used.
  • the amount of casein contained in the raw material milk is not particularly limited, but is preferably 0.01 to 10 g / 100 g, more preferably 0.1 to 8 g / 100 g, and even more preferably 1 to 5 g / 100 g.
  • the pH of the raw material milk is preferably pH 4.0 to 8.0, more preferably pH 4.7 to 7.5, and even more preferably pH 5.3 to 6.8. The same applies to the pH of the raw material milk to which other components other than the following raw material milk are added.
  • the raw material milk may contain other components that can be blended before fermentation and other ingredients that can be blended after fermentation, as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • the other components include sweeteners (monosaccharides, oligosaccharides, sugar alcohols, synthetic sweeteners, etc.), stabilizers (gelatin, pectin, caraginan, xanthan gum, etc.), fruit juices, fruit meats, fragrances, and the like. ..
  • Protein phosphatase is an enzyme that dephosphorylates phosphorylated proteins, and in the present specification, it is sufficient as long as it can desorb casein serine phosphate in raw milk. Protein phosphatase preferably desorbs the serine phosphate of casein in the feedstock during fermentation.
  • the optimum (optimal) pH of protein phosphatase is preferably in the range of 4.0 to 7.5, more preferably 4.5 to 7.0, and even more preferably 5.0 to 6.0.
  • protein phosphatase is gradually inactivated during the production of fermented milk and is inactivated in fermented milk. Specifically, it acts even under weak acidity of pH 5.0 to 6.0, and is preferably inactivated at pH less than 4.5. Phosphoric acid is gradually desorbed from casein during the fermentation process of the raw milk. It is considered that EPS is easily produced in the process in which free phosphoric acid increases in milk and lactic acid bacteria metabolize free phosphoric acid. It is preferable that the protein phosphatase is inactivated after the fermentation is completed, because it is easy to maintain the quality of the fermented milk in a stable manner.
  • the optimum temperature of protein phosphatase is preferably in the range of 1 ° C to 60 ° C, and more preferably in the range of 10 ° C to 55 ° C.
  • the protein phosphatase used in the present invention preferably has the above-mentioned optimum pH and temperature.
  • the type and origin of the protein phosphatase are not limited, but are preferably derived from Trichoderma, Aspergillus, Sccharomyces, Bacillus, and Streptomyces. It is a phosphatase, more preferably a protein phosphatase derived from Trichoderma virens, and even more preferably a virtual protein derived from Trichoderma virens Gv29-8 (XP_013951069.1 hypothetical protein TRIVIDRAFT_87714).
  • the virtual protein (XP_013951069.1 hypothetical protein TRIVIDRAFT_87714) has the following properties, whose protein phosphatase activity has been clarified by the present inventor.
  • Metal ion requirement Ca 2+ , Mg 2+ , Mn 2+ , Co of 2.5 to 5.0 mM
  • SEQ ID NO: 1 The nucleotide sequence of the DNA encoding the protein phosphatase (XP_013951069.1 hypothetical protein TRIVIDRAFT_87714) derived from trichoderma virence Gv29-8 activated by a divalent metal cation such as 2+ is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • protein phosphatase is one in which a gene encoding this is expressed in a host such as Escherichia coli, or one in which the gene is modified and expressed by various gene manipulations and has protein phosphatase activity. May be good.
  • the protein phosphatase is preferably any of the following proteins (i) to (iii).
  • the number of amino acid deletions, substitutions or additions in the amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. It is not limited as long as it exhibits an enzymatic activity equivalent to that of protein phosphatase, but 1 to 20 is preferable, 1 to 10 is more preferable, and 1 to 8 is further preferable.
  • the sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, further preferably 95% or more, still more preferably 99% or more. ..
  • the identity percentage of such sequences can be calculated using publicly available or commercially available software with an algorithm that compares the reference sequence as a query sequence.
  • BLAST, FASTA, GENETYX manufactured by Genetics Co., Ltd.
  • GENETYX manufactured by Genetics Co., Ltd.
  • the protein phosphatase used in the present invention is useful as an enzyme agent for fermented milk because it stabilizes the quality of fermented milk and enhances its physiological function.
  • the protein phosphatase may be present at the time of fermentation of the raw material milk, and the timing of adding the protein phosphatase is not particularly limited.
  • the amount of protein phosphatase used in the step (a) may be a concentration capable of eliminating the serine phosphate of casein in the raw material milk. For example, it is preferably 0.1 to 25 U, more preferably 0.5 to 15 U, and even more preferably 1 to 10 U with respect to 1 mL of raw milk.
  • 1U is 1/10 of the amount of 1U per 1 mL of 20 mM MES-NaOH buffer containing 10 mM Tris-HCl at pH 6.0 with respect to the substrate solution in which 20 mg of bovine milk casein is dissolved.
  • the fermentation method in the step (a) conforms to a general method.
  • a fermentation mix prepared by mixing and dissolving raw milk and other raw materials is homogenized, heat-sterilized, cooled, and then a microorganism (starter) and protein phosphatase are added to ferment. After cooling, it may be crushed and homogenized as needed.
  • the fermentation temperature may be any temperature as long as it is the temperature at which the microorganism (starter) grows and the enzyme does not inactivate, and can be appropriately set according to the type, but is preferably 20 ° C. to 45 ° C., preferably 30 ° C. to 37 ° C. Is more preferable.
  • the fermentation time is, for example, preferably 1 to 48 hours, 2 to 24 hours, more preferably 3 to 10 hours, still more preferably 3 to 6 hours, and particularly preferably 3 to 5 hours.
  • the pH of the fermented milk is preferably 4.0 to 5.0.
  • the raw milk (dephosphorylated milk) obtained by enzymatically treating with protein phosphatase to be fermented in the step (b) may be obtained by dephosphorylating the casein in the raw milk by protein phosphatase.
  • the amount of protein phosphatase used in the step (b) may be a concentration capable of eliminating the serine phosphate of casein in the raw material milk. For example, it is preferably 0.1 to 25 U, more preferably 0.5 to 15 U, and even more preferably 1 to 10 U with respect to 1 part by mass of the raw material milk.
  • the enzyme treatment of the raw material milk is preferably carried out at a reaction temperature of 1 ° C. to 60 ° C. for 0.1 hour to 24 hours.
  • the reaction temperature is preferably 10 ° C. to 60 ° C., more preferably 30 ° C. to 55 ° C., and even more preferably 40 ° C. to 50 ° C.
  • the reaction time is preferably 0.3 hours to 12 hours, more preferably 0.5 hours to 5 hours, and particularly preferably 1 hour to 4 hours.
  • the pH of the feedstock may be adjusted prior to enzymatic treatment of the feedstock with protein phosphatase.
  • the raw material milk may be fermented without inactivating the enzyme, or may be fermented after the treatment for inactivating the enzyme by heating or the like. It is preferable to ferment the raw milk without inactivating it. Dephosphorylation of casein gradually progresses even during fermentation.
  • the heating conditions in the treatment for inactivating the enzyme heating at a high temperature for a short time is preferable, and for example, heating at 60 to 100 ° C. for 1 minute to 30 minutes is preferable.
  • the enzyme may be inactivated in the sterilization step of the raw milk.
  • the fermentation method in the step (b) is the same as that in the step (a), and is based on a general method. After cooling, microorganisms (starters) are added and fermented. After cooling, it may be crushed and homogenized as needed.
  • the fermentation temperature can be appropriately set as in the step (a), but is preferably 20 ° C. to 45 ° C., more preferably 30 ° C. to 37 ° C.
  • the fermentation time is, for example, preferably 1 to 48 hours, 2 to 24 hours, more preferably 3 to 10 hours, still more preferably 3 to 6 hours, and particularly preferably 3 to 5 hours.
  • the pH of the fermented milk is preferably 4.0 to 5.0.
  • fermented milk by the step (a) from the viewpoint of easy formation of uniform curls and excellent handleability and cost.
  • casein in the raw milk is dephosphorylated, and dephosphorylated milk containing dephosphorylated casein is obtained.
  • Dephosphorylation of casein increases the hydrophobicity of casein molecules, which changes the mouthfeel of milk.
  • the content of dephosphorylated casein in the dephosphorylated milk of the present invention is preferably 0.8 g / 100 g or more from the viewpoint of improving the mouthfeel and obtaining fermented milk of stable quality, and is 0.
  • the ratio of dephosphorylated casein in casein is preferably 45% to 65%, more preferably 48 to 63%.
  • the dephosphoric acid milk preferably further contains free phosphoric acid, and the content of the free phosphoric acid in the dephosphoric acid milk is from the viewpoint of improving the mouthfeel, and stable quality fermented milk is obtained. From the viewpoint, it is preferably in the range of 1 mM to 100 mM, more preferably in the range of 5 mM to 50 mM, further preferably in the range of 10 mM to 40 mM, and preferably in the range of 12 mM to 30 mM. Even more preferable.
  • a general starter such as lactic acid bacteria or yeast is used for fermentation of raw milk and fermentation of raw milk (dephosphorylated milk) which is enzymatically treated with protein phosphatase.
  • lactic acid bacteria include bacteria of the genus Lactococcus (Lactococcus casei, lactobacillus acidofhilus, etc.), bacteria of the genus Lactococcus (Lactococcus lactis, etc.), bacteria of the genus Leuconostock (Bifidobacterium genus ococcus, etc. Bacteria of the genus Bifidobacterium (Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, etc.) can be mentioned.
  • yeast include yeasts of the genus Saccharomyces (Saccharomyces cerevisiae, etc.).
  • the number of lactic acid bacteria or yeast contained in the starter (live bacteria) is, for example, 10 5 to 10 13 cfu / mL, preferably 10 6 to 10 12 cfu / mL, more preferably 10 7 to 10 11 cfu / mL, and further. It is preferably 10 8 to 10 10 cfu / mL.
  • the amount of the starter used is not particularly limited and can be appropriately set according to the type thereof. For example, it is 0.01 to 10% by mass of raw milk and / or dephosphorylated milk, and 0.1 to 0.1 to 10% by mass is preferable, and 0.5 to 10% by mass is more preferable.
  • the fermented milk of the present invention may contain other components that can be blended before fermentation and other components that can be blended after fermentation, as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • the other components include sweeteners (monosaccharides, oligosaccharides, sugar alcohols, synthetic sweeteners, etc.), stabilizers (gelatin, pectin, caraginan, xanthan gum, etc.), fruit juices, fruit meats, fragrances, and the like.
  • the fermented milk of the present invention has low water separation, high viscosity, and firm hardness.
  • the viscosity of the fermented milk is preferably 3,000 Pa ⁇ s or more when the fermented milk is treated for 30 seconds by the measuring method described later.
  • the upper limit is not particularly limited, but is, for example, 10000 Pa ⁇ s.
  • the hardness of the fermented milk is preferably 0.41N or more, more preferably 0.45N or more, and 0. It is more preferably 5N or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but is, for example, 1.0 N.
  • the fermented milk of the present invention contains many extracellular polysaccharides (EPS).
  • the amount of EPS in the fermented milk may be 40 ⁇ g or more, 60 ⁇ g or more, 80 ⁇ g or more, 110 ⁇ g or more, 180 ⁇ g or more per 1 g of fermented milk.
  • the upper limit is not particularly limited, but is, for example, 300 ⁇ g.
  • Trichoderma-Billence Gv29-8-derived protein phosphatase (hereinafter, "PPase") Trichoderma-bilens NBRC6355 strain was inoculated into potato dextrose agar medium (Eiken) and aerobic at 25 ° C. for 3 days. It was cultured. Colonies of producing bacteria grown on potato dextrose agar medium were cut out together with the agar medium into approximately 5 mm squares, 5.0% sucrose, 2.0% TUBERMINE FV (Rocket Japan), 0.3% calcium chloride, 0.
  • PPase Trichoderma-Billence Gv29-8-derived protein phosphatase
  • the cells were inoculated into a production medium (pH 4.0) composed of 1% magnesium sulfate and 0.001% dipotassium hydrogen phosphate, and cultured with shaking at 27 ° C. and 220 r / min for 4 days.
  • a production medium pH 4.0
  • Approximately 700 mL of the culture solution was added to Advantech No.
  • Solid-liquid separation was performed by suction filtration using 2 filter paper (Advantech) and 3.0% KC-Flock (Nippon Paper Industries), and the obtained filtrate was concentrated to about 1/10 volume by UF (AHP, Asahi Kasei).
  • PEG4000 Nacalai Tesque
  • the mixture was centrifuged (HIMAC CENTRIFUGE CR20B2, HITACHI) for 20 minutes under the conditions of 8000 r / min and 4 ° C., and the supernatant was discarded.
  • the obtained precipitate was dissolved in about 10 mL of 20 mM potassium acetate-potassium acetate buffer (pH 4.8), and the solution was kept warm at 50 ° C. for 1 hour, and then at 14800 r / min at 4 ° C. for 10 minutes. Centrifugation (LEGEND MICRO 21R, Thermo-Fisher Science) was performed, and the supernatant was recovered as a purified protein.
  • the purified protein was identified, it was a virtual protein derived from Trichoderma billence Gv29-8 (XP_013951069.1 hypothetical protein TRIVIDRAFT_87714) from the amino acid sequence information. The function of this protein was unknown.
  • Protein phosphatase activity was confirmed for the purified protein.
  • PPase activity 0.2 g of bovine milk casein (Casein, Bobine Milk, Carbohydrate and Fatty Acid Free, manufactured by CALBIOCHEM) was weighed in a 20 mL beaker, and 2.0 mL of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 9. 0) and a small amount of distilled water were added and dissolved using a magnetic stirrer. Subsequently, 2.0 mL of 0.2 M MES-NaOH buffer (pH 6.0) and about 10 mL of distilled water were added, adjusted to pH 6.0 with 1.0-defined hydrochloric acid, and then set to 20 mL.
  • bovine milk casein Casein, Bobine Milk, Carbohydrate and Fatty Acid Free, manufactured by CALBIOCHEM
  • PPase activity at room temperature (23.5 ° C.), 37 ° C., 43 ° C., 50 ° C., and 60 ° C. was measured.
  • the PPase sample is kept warm for 2 hours at each temperature of 4 ° C., 25 ° C., 37 ° C., 43 ° C., 50 ° C., and 60 ° C., centrifuged at 15000 r / min, 4 ° C., and then centrifuged. The residual activity of Qing was measured.
  • d pH stability is 0.2M acetic acid-potassium acetate buffer (pH 3.6, 4.2, 4, 7, 5.6, 6.0), MES-NaOH buffer (pH 5.3, 6.0). , 6.8), Tris-HCl buffer (pH 7.5, 8.0, 9.0) diluted 10-fold and allowed to stand at 4 ° C. for 6 hours, after which each sample remained. The activity was measured.
  • chloride salts of sodium, potassium, lithium, calcium, cobalt, and manganese and an aqueous solution of EDTA / 2 sodium are added in the reaction solution so as to be 2.5 mM, 5 mM, and 10 mM, and at that time. PPase activity was measured.
  • PPase maintained an optimum temperature of 50 ° C. and an optimum pH of pH 5.42, and maintained a residual activity of 80% or more at 43 ° C. for 2 hours and pH 4.7 to 6.8 hours. Further, from FIG. 4, PPase was activated by divalent metal cations such as Ca 2+ , Mg 2+ , Mn 2+ , and Co 2+ of 2.5 to 5.0 mM.
  • Example 1 (1) Preparation of fermented milk 2% skim milk (manufactured by Morinaga Milk Industry) was added to delicious milk (manufactured by Meiji), shaken well to dissolve, and sterilized in boiling water with stirring for 20 minutes. After sterilizing the raw milk at 43 ° C. for about 30 minutes, starter L812 (manufactured by Chr. Hansen) and PPase or 20 mM acetate-potassium acetate buffer (pH 5.2) shown in Table 1 are used to terminate the enzymatic activity. The mixture was added to a concentration of 0 to 10 U / mL-milk and fermented at 43 ° C. for 4.5 hours to obtain fermented milk. The PPase used was appropriately diluted with a 20 mM acetic acid-potassium acetate buffer (pH 5.2). The amount of casein in the fermented milk of Example 1 was 3.3 g / 100 g.
  • Table 2 shows the measurement results of dephosphorylated casein. The measurement result of the free phosphoric acid concentration is shown in FIG.
  • Example 2 (1) Preparation of dephosphorylated milk To delicious milk (manufactured by Meiji) whose pH was adjusted to 5.9 using 1N HCl, 300 U / mL PPase was added in the amount shown in Table 3 and at 43 ° C. for 4 hours. It was allowed to stand to obtain dephosphorylated milk. The amount of casein in the dephosphorylated milk of Example 2 was 2.5 g / 100 g.
  • Example 3 Preparation of fermented milk Weigh 392 g of pasteurized milk (manufactured by Takanashi Milk Products Co., Ltd.) and 8 g of skim milk (manufactured by Morinaga Milk Products Co., Ltd.) into a 500 mL medium bottle, shake well to dissolve, and sterilize while stirring in boiling water for 20 minutes. .. The raw milk after sterilization was kept warm at 43 ° C. for about 30 minutes, and then starter L812 (manufactured by Chr. Hansen, the same applies hereinafter) was added at 0.01 g / mL, and the mixture was gently inverted and mixed about 10 times.
  • starter L812 manufactured by Chr. Hansen, the same applies hereinafter
  • Example 4 Preparation of fermented milk Weigh 392 g of pasteurized milk (manufactured by Takanashi Milk Products Co., Ltd.) and 8 g of skim milk (manufactured by Morinaga Milk Products Co., Ltd.) into a 500 mL medium bottle, shake well to dissolve, and heat sterilize in boiling water for 20 minutes. , 43 ° C. for about 30 minutes. 40 mg of Starter L812 was added thereto, and the mixture was gently mixed by inversion 10 times.
  • the total sugar content was measured by the phenol-sulfuric acid method using the remaining 200 ⁇ L. By subtracting monosaccharides and disaccharides from the total sugar amount, the amount of exopolysaccharide of 3 sugars or more was calculated.
  • Viscosity measurement The fermented milk sample was homogenized by vigorously shaking, and 13.5 g was dispensed into a disposable sample chamber (made of aluminum) for a viscometer (DV-I Prime, BROOK FIELD). The spindle was SC4-29, measured at 10 r / min, and the viscosity was read and recorded every 30 seconds. All operations were performed in an environment of 10 ° C.
  • Breaking strength analysis A creep meter RE2-3305C (manufactured by Sanyo Electric Railway) was used as the apparatus, and the plunger was No. 3 was used. The measurement was performed by load cell 0.01, amplifier magnification 0.1, storage pitch 0.07 seconds, measurement distortion rate 60%, measurement speed 1 mm / sec, and automatic sample thickness measurement.
  • Example 5 Preparation of fermented milk 147 g of pasteurized milk (manufactured by Takanashi Milk Products Co., Ltd.) and 3 g of skim milk (manufactured by Morinaga Milk Products Co., Ltd.) were weighed into five 250 mL medium bottles and shaken well to dissolve them. Then, it was sterilized by heating in boiling water for 20 minutes, and then kept warm at 43 ° C. for about 30 minutes. Various starters shown in Table 6 (all manufactured by Chr. Hansen) were added thereto, and the mixture was gently mixed by inversion 10 times.
  • Table 6 all manufactured by Chr. Hansen
  • Example 6 (1) Preparation of fermented milk Weigh 392 g of pasteurized milk (manufactured by Takanashi Milk Products Co., Ltd.) and 8 g of skim milk (manufactured by Morinaga Milk Products Co., Ltd.) into a 500 mL medium bottle, shake well to dissolve, and heat in boiling water for 20 minutes. After sterilization, it was kept warm at 43 ° C. for about 30 minutes. 40 mg of Starter L812 was added thereto, and the mixture was gently mixed by inversion 10 times.
  • pasteurized milk manufactured by Takanashi Milk Products Co., Ltd.
  • skim milk manufactured by Morinaga Milk Products Co., Ltd.
  • Viscosity measurement The fermented milk sample was homogenized by vigorously shaking, and 13.5 g was dispensed into a disposable sample chamber (made of aluminum) for a viscometer (DV-I Prime, BROOK FIELD). The spindle was SC4-29, measured at 10 r / min, and the viscosity was read and recorded every 30 seconds. All operations were performed in an environment of 10 ° C.
  • Breaking strength analysis A creep meter RE2-3305C (manufactured by Sanyo Electric Railway) was used as the apparatus, and the plunger was No. 3 was used. The measurement was performed by load cell 0.01, amplifier magnification 0.1, storage pitch 0.07 seconds, measurement distortion rate 60%, measurement speed 1 mm / sec, and automatic sample thickness measurement.
  • Example 7 (enzyme treatment of raw milk) (1) Preparation of fermented milk Weigh 392 g of ultra-high temperature instant sterilized milk (made by Meiji) or low temperature sterilized milk (made by Takanashi Milk Products) and 8 g of skim milk (made by Morinaga Milk Products) into a 500 mL medium bottle and shake well. Dissolved. To this, 2 mL of purified PPase (700 U / mL, Final 23.3 U / mL-milk) or 20 mM acetic acid-K acetate buffer (pH 5.2) was added, and the mixture was mixed by inversion 5 times.
  • purified PPase 700 U / mL, Final 23.3 U / mL-milk
  • 20 mM acetic acid-K acetate buffer pH 5.2
  • Example 8 (1) Preparation of fermented milk Weigh 392 g of ultra-high temperature instant pasteurized milk (made by Meiji) and 8 g of skim milk (made by Morinaga Dairy) into a 500 mL medium bottle, shake well to dissolve, and stir in boiling water for 20 minutes. While sterilized. After sterilizing the raw milk at 43 ° C. for about 30 minutes, 0.571 mL of purified PPase (350 U / mL, Final 1 U / mL-milk) or 20 mM acetic acid-potassium acetate buffer (pH 4.5) and starter L812 20 mg was added, and the mixture was gently overturned and mixed about 10 times.
  • purified PPase 350 U / mL, Final 1 U / mL-milk
  • 20 mM acetic acid-potassium acetate buffer pH 4.5
  • Example 9 Adjust the fermentation time so that the pH after fermentation is adjusted to about 4.5
  • Fermented milk was prepared in the same manner as in Example 8 except that the fermentation time of the added system was 3.5 hours.
  • the pH of the fermented milk was measured with a pH meter (manufactured by Thermo Fisher, ORION 3 STAR).

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Abstract

安定的な品質の発酵乳及びその製造方法、並びに脱リン酸乳の提供。　脱リン酸化カゼインを０．８ｇ／１００ｇ以上含有する発酵乳。

Description

発酵乳及びその製造方法、並びに脱リン酸乳
　本発明は、発酵乳及びその製造方法、並びに脱リン酸乳に関する。
　発酵乳は、原料の乳を乳酸菌等の微生物で発酵させることにより製造される。近年は、発酵時に乳酸菌が菌体外に産生する菌体外多糖（ＥＰＳ）の生理機能が注目されている。
　乳の主要なタンパク質はカゼインであり、発酵によりｐＨが低下すると、カゼインミセルは凝集し、ゲルを形成する。カゼインは主にαＳ１、αＳ２、β、κの４種類に分類され、それぞれ８個、１１個、５個、１個のセリン残基に結合したリン酸を有している。このカゼインにおけるリン酸修飾は、カゼインミセル表面や疎水性コアの疎水度に関与することが知られている。
　発酵乳の組織（物性）は経時的に変化し、そのなかでも保存中の離水（乳清の分離）は商品価値を下げる要因の一つである。そこで、これまでに、離水防止等を目的にペクチン等の安定剤や、乳タンパク質濃縮物等の機能性乳原料が利用されている。また、酵素の利用についても検討が行われ、例えば、トランスグルタミナーゼ等の凝乳活性を有する酵素、グルコースオキシダーゼ等を利用する方法が報告されている（例えば、特許文献１）。
　しかしながら、カゼインのホスホセリンに作用する酵素を利用した乳及び発酵乳の製造については知られていない。
国際公開第２０１５／０４１１９４号
　本発明の課題は、安定的な品質の発酵乳及びその製造方法、並びに脱リン酸乳を提供することにある。
　本発明者は、カゼインのホスホセリンに着目し、鋭意検討したところ、カゼインのセリン残基からリン酸が脱離した脱リン酸化カゼインが発酵乳の物性に関わり、当該脱リン酸化カゼインを所定量含む発酵乳は離水が抑制され、粘度及び破断応力の上昇が見られること、また、菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生量が増加していることを見出した。また、プロテインホスファターゼの存在下に原料乳を発酵させるか、或いはプロテインホスファターゼで酵素処理してなる原料乳を発酵させることにより、発酵乳の離水の抑制、粘度及び破断応力の上昇の効果が認められること、また、菌体外多糖（ＥＰＳ）の産生が増加することを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、以下の〔１〕～〔６〕を提供するものである。
〔１〕脱リン酸化カゼインを０．８ｇ／１００ｇ以上含有する発酵乳。
〔２〕脱リン酸化カゼインの含有量が０．８～１．５ｇ／１００ｇである〔１〕記載の発酵乳。
〔３〕遊離のリン酸の含有量が１５ｍＭ以上である〔１〕又は〔２〕記載の発酵乳。
〔４〕ヨーグルトである〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の発酵乳。
〔５〕脱リン酸化カゼインを含有する脱リン酸乳。
〔６〕脱リン酸化カゼインの含有量が０．８ｇ／１００ｇ以上である〔５〕記載の脱リン酸乳。
　また、本発明は、以下の〔７〕～〔１３〕を提供するものである。
〔７〕以下のいずれかの工程を含む、発酵乳の製造方法。
（ａ）プロテインホスファターゼの存在下で、原料乳を発酵させる工程
（ｂ）プロテインホスファターゼで酵素処理してなる原料乳を発酵させる工程
〔８〕プロテインホスファターゼが、トリコデルマ属に属する微生物由来のプロテインホスファターゼである〔７〕記載の発酵乳の製造方法。
〔９〕トリコデルマ属に属する微生物がトリコデルマ・ビレンスである〔８〕記載の発酵乳の製造方法。
〔１０〕プロテインホスファターゼが、下記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかである〔７〕～〔９〕のいずれか記載の発酵乳の製造方法。
（ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、プロテインホスファターゼ活性を有するタンパク質
（ｉｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、プロテインホスファターゼ活性を有するタンパク質
〔１１〕発酵乳がヨーグルトである〔７〕～〔１０〕のいずれか記載の発酵乳の製造方法。
〔１２〕プロテインホスファターゼを含有する発酵乳用酵素剤。
〔１３〕下記（ｉ）～(iii)のいずれかであるプロテインホスファターゼ活性を有するタンパク質。
（ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、プロテインホスファターゼ活性を有するタンパク質
（iii)配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、プロテインホスファターゼ活性を有するタンパク質
　本発明の発酵乳は、離水が少なく、粘性が高くしっかりした組織を有する。また、多くの菌体外多糖（ＥＰＳ）を含有し生理機能に優れるものである。
　また、本発明の発酵乳の製造方法によれば、離水が少なく、粘性が高くしっかりした組織で、かつ多くの菌体外多糖（ＥＰＳ）を含有する発酵乳を提供することができる。
　また、本発明の脱リン酸乳は、カゼイン分子の疎水度が上昇することにより、口当たりを変化させる。当該効果は、脱リン酸乳を使用した乳製品でも同様に得られる。
ウシ乳の電気泳動図を概念的に示した図である。 リン酸化カゼイン及び脱リン酸化カゼインを測定する方法を示す図である。 トリコデルマ・ビレンスＧｖ２９－８由来プロテインホスファターゼのａ．温度依存性、ｂ．温度安定性、ｃ．ｐＨ依存性、ｄ．ｐＨ安定性を示す図である。 トリコデルマ・ビレンス　Ｇｖ２９－８由来プロテインホスファターゼの金属イオン要求性を示す図である。 実施例１の発酵乳中の遊離リン酸濃度を示す図である。 実施例２の脱リン酸乳中の遊離リン酸濃度を示す図である。 トリコデルマ・ビレンス　Ｇｖ２９－８由来プロテインホスファターゼ添加発酵乳の離水率（％）、遊離リン酸濃度（ｍＭ）及びｐＨを示す図である。 トリコデルマ・ビレンス　Ｇｖ２９－８由来プロテインホスファターゼ添加発酵乳の離水率（％）、遊離リン酸濃度（ｍＭ）及びｐＨを示す図である。 トリコデルマ・ビレンス　Ｇｖ２９－８由来プロテインホスファターゼ添加発酵乳の菌体外多糖（ＥＰＳ）量（μｇ／ｇ－発酵乳）を示す図である。 トリコデルマ・ビレンス　Ｇｖ２９－８由来プロテインホスファターゼ添加発酵乳の粘度（ｃｐ）を示す図である。 トリコデルマ・ビレンス　Ｇｖ２９－８由来プロテインホスファターゼ添加発酵乳の破断強度解析結果を示す図である。 トリコデルマ・ビレンス　Ｇｖ２９－８由来プロテインホスファターゼ添加発酵乳の離水率（％）、遊離リン酸濃度（ｍＭ）及びｐＨを示す図である。 トリコデルマ・ビレンス　Ｇｖ２９－８由来プロテインホスファターゼ添加発酵乳の菌体外多糖（ＥＰＳ）量（μｇ／ｇ－発酵乳）を示す図である。 トリコデルマ・ビレンス　Ｇｖ２９－８由来プロテインホスファターゼ添加発酵乳の粘度（ｃｐ）を示す図である。 トリコデルマ・ビレンス　Ｇｖ２９－８由来プロテインホスファターゼ添加発酵乳の破断強度解析結果を示す図である。 トリコデルマ・ビレンス　Ｇｖ２９－８由来プロテインホスファターゼ添加発酵乳の離水率（％）、遊離リン酸濃度（ｍＭ）及びｐＨを示す図である。 トリコデルマ・ビレンス　Ｇｖ２９－８由来プロテインホスファターゼ添加発酵乳の菌体外多糖（ＥＰＳ）量（μｇ／ｇ－発酵乳）を示す図である。 トリコデルマ・ビレンス　Ｇｖ２９－８由来プロテインホスファターゼ添加発酵乳の粘度（ｃｐ）を示す図である。 トリコデルマ・ビレンス　Ｇｖ２９－８由来プロテインホスファターゼ添加発酵乳の破断強度解析結果を示す図である。 トリコデルマ・ビレンス　Ｇｖ２９－８由来プロテインホスファターゼ処理原料乳を発酵させた発酵乳の離水率（％）、遊離リン酸濃度（ｍＭ）及びｐＨを示す図である。 トリコデルマ・ビレンス　Ｇｖ２９－８由来プロテインホスファターゼ添加発酵乳のｐＨの推移を示す図である。 トリコデルマ・ビレンス　Ｇｖ２９－８由来プロテインホスファターゼ添加発酵乳の離水率（％）、遊離リン酸濃度（ｍＭ）及びｐＨを示す図である。 トリコデルマ・ビレンス　Ｇｖ２９－８由来プロテインホスファターゼ処理による原料乳中の遊離リン酸濃度とカルシウムイオン濃度の推移を示す図である。
　本明細書において、発酵乳は、乳等省令（乳及び乳製品の成分規格等に関する省令、昭和２６年厚生省令第５２号）において定義された発酵乳及び乳酸菌飲料を意味する。発酵乳は「乳又はこれと同等以上の無脂乳固形分を含む乳等を乳酸菌又は酵母で発酵させ、糊状又は液状にしたもの又はこれらを凍結したもの」、乳酸菌飲料は「乳等を乳酸菌又は酵母で発酵させたものを加工し、又は主要原料とした飲料（発酵乳を除く。）」と定義されている。
　上記「糊状にしたもの」に分類される発酵乳としてハードヨーグルト、ソフトヨーグルト、「液状にしたもの」に分類される発酵乳として飲むヨーグルト（ドリンクヨーグルト）、「凍結したもの」に分類される発酵乳としてフローズンヨーグルトが挙げられる。本発明の発酵乳は、本発明の効果を享受し易い点から、ハードヨーグルト、ソフトヨーグルトが好ましい。
　本発明の発酵乳は、脱リン酸化カゼインを０．８ｇ／１００ｇ以上含有する。脱リン酸化カゼインは、乳中のカゼインのセリンリン酸が脱離して生成する。
　発酵乳中の脱リン酸化カゼインの含有量は、発酵乳の離水抑制効果、粘度及び破断応力の上昇効果、並びにＥＰＳ産生量の増大効果の観点から、０．９ｇ／１００ｇ以上であることが好ましく、１．０ｇ／１００ｇ以上であることがより好ましく、また、１．５ｇ／１００ｇ以下であることが好ましく、１．４ｇ／１００ｇ以下であることがより好ましく、１．３ｇ／１００ｇ以下であることが更に好ましい。
　本発明の発酵乳において、カゼイン中の脱リン酸化カゼインの割合としては、好ましくは２５～４５％、より好ましくは２６～４３％である。
　本明細書において、カゼインの分析は、既知濃度の各カゼイン（αカゼイン、βカゼイン及びκカゼイン）と試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に供し、クマシーブリリアントブルー染色（ＣＢＢ染色）したのち、画像解析ソフトを使用してバンドの強度を数値化することで検量線を作成し、試料中のカゼイン量を算出することができる。
　また、本明細書において、脱リン酸化カゼインの分析は、以下に記載の方法に従うものとする。
　脱リン酸化カゼインは電気泳動方法で定量することができる。この方法はリン酸化カゼインと脱リン酸化カゼイン量を電気泳動結果から算出する。図１を用いて説明する。なお、電気泳動方法は、後掲の実施例に記載のとおりである。
　図１はウシ乳の電気泳動図を概念的に示したものである。リン酸化されているカゼインはαカゼイン１、βカゼイン２及びκカゼイン３の３領域があり、これらを積算することでリン酸化カゼイン量を算出することができる。それ以外のリン酸化カゼインも存在するが、微量であるため無視できる。なお、ウシの乳中の全カゼイン量に占めるαｓ－１カゼイン、αｓ－２カゼイン、βカゼイン及びκカゼインの総和は約９７％である。
　脱リン酸化カゼインは、各カゼインのバンドに隣接して存在する。脱リン酸化カゼインは、脱リン酸の程度がさまざまであることから、電気泳動後においてスメアな状態になる。リン酸化カゼインバンドと脱リン酸化カゼイン領域は、濃度が異なるため、目視で確認することができる。各脱リン酸化カゼイン領域１１、２１、３１を積算することで、脱リン酸化カゼイン量を算出することができる。脱リン酸化カゼイン領域３１の終端は、染色領域と非染色領域の境目を目視で確認し、終端とすればよい。
　ウシ由来の乳を使用すると、リン酸化カゼイン量が多い順に、αカゼイン、βカゼイン及びκカゼインの順となる。由来が異なる乳についても上記と同様の方法で脱リン酸化カゼインの程度を測定することができる。全カゼイン量の９０％以上を占めるよう、特定のカゼインを一以上選択して測定すればよい。
　図１には良好なバンドの形を示したが、実際には各種条件を揃えてもバンドの形が歪むことが多い。このときのリン酸化カゼイン及び脱リン酸化カゼインを測定する方法を図２で説明する。
　図２のバンド先端１００（泳動開始側）とバンド先端の基端１１０の間に非バンド領域が存在する場合、非バンド領域の面積が目視で５０％になるところに積算開始線Ａを設定し、そこからバンド領域の面積を算出すればよい。積算開始線Ａを設定するにあたり、泳動パターンをグラフ化したものを参考にしても良い。
　図２のバンド先端２００（泳動終了側）とバンド先端の基端２１０の間に非バンド領域が存在する場合、非バンド領域の面積が目視で５０％になるところに積算終了線Ｂを設定し、そこまでのバンド領域の面積を算出すればよい。積算終了線Ｂを設定するにあたり、泳動パターンをグラフ化したものを参考にしても良い。
　上記の方法で積算開始線と積算終了線を設定し、それらの間に存在するバンド領域における濃度を定量すればよい。
　上記と同様の方法で脱リン酸領域の濃度を定量することができる。
　本発明の発酵乳は、さらに、遊離リン酸を含有することが好ましい。
　発酵乳中の遊離リン酸の含有量は、発酵乳の離水抑制効果、粘度及び破断応力の上昇効果、並びにＥＰＳ産生量の増大効果の観点から、１５ｍＭ以上であることが好ましく、１５ｍＭ～４０ｍＭの範囲内にあることがより好ましい。
　脱リン酸化カゼインを発酵乳に含有させるには、例えば、プロテインホスファターゼの存在下に発酵乳の原料である原料乳を発酵させればよい。また、原料乳の発酵前に、原料乳をプロテインホスファターゼ処理し、当該処理後の脱リン酸乳を発酵させればよい。
　すなわち、本発明の発酵乳の製造方法は、
（ａ）プロテインホスファターゼの存在下で、原料乳を発酵させる工程
（ｂ）プロテインホスファターゼで酵素処理してなる原料乳を発酵させる工程
のいずれかの工程を有する。
　原料乳は、カゼインを含有すればよく、一般的な乳由来の原料が用いられる。例えば、生乳、牛乳、特別牛乳、生山羊乳、殺菌山羊乳、生めん羊乳、成分調整牛乳、低脂肪牛乳、無脂肪牛乳、加工乳、クリーム、バター、バターオイル、チーズ、濃縮ホエイ、アイスクリーム類、濃縮乳、脱脂濃縮乳、無糖練乳、無糖脱脂練乳、加糖練乳、加糖脱脂練乳、全粉乳、脱脂粉乳、クリームパウダー、ホエイパウダー、たんぱく質濃縮ホエイパウダー、バターミルクパウダー等が挙げられる。
　原料乳に含まれるカゼインの量は、特に限定されないが、０．０１～１０ｇ／１００ｇが好ましく、０．１～８ｇ／１００ｇがより好ましく、１～５ｇ／１００ｇがさらに好ましい。
　原料乳のｐＨは、ｐＨ４．０～８．０が好ましく、ｐＨ４．７～７．５がより好ましく、ｐＨ５．３～６．８がさらに好ましい。下記原料乳以外の他の成分を添加した原料乳のｐＨも同様である。
　原料乳には、必要に応じて、本発明の効果を損なわない範囲において、発酵の前に配合し得る他の成分や、発酵の後に配合し得る他の成分を含有させてもよい。当該他の成分としては、例えば、甘味料（単糖、少糖、糖アルコール、合成甘味料等）、安定剤（ゼラチン、ペクチン、カラギナン、キサンタンガム等）、果汁、果肉、香料等が挙げられる。　　　　
　プロテインホスファターゼは、リン酸化タンパク質を脱リン酸化する酵素であり、本明細書においては原料乳中のカゼインのセリンリン酸を脱離できるものであればよい。プロテインホスファターゼは発酵中に原料乳のカゼインのセリンリン酸を脱離することが好ましい。
　プロテインホスファターゼの最適（至適）ｐＨは４．０～７．５の範囲にあることが好ましく、４．５～７．０がより好ましく、５．０～６．０がさらに好ましい。
　プロテインホスファターゼは発酵乳の製造中に徐々に失活し、発酵乳中では失活していることが好ましい。具体的には、ｐＨ５．０～６．０の弱酸性下でも作用し、ｐＨ４．５未満で失活することが好ましい。原料乳の発酵過程において、徐々にカゼインからリン酸が脱離することになる。遊離リン酸が乳中で増加し、乳酸菌が遊離リン酸を代謝する過程で、ＥＰＳが生成されやすくなると考えられる。発酵終了後にプロテインホスファターゼが失活していることで、発酵乳の品質を安定的に保ちやすくなり好ましい。
　プロテインホスファターゼの最適温度は１℃～６０℃の範囲にあることが好ましく、１０℃～５５℃の範囲にあることがより好ましい。
　本発明で使用するプロテインホスファターゼは、上記の最適ｐＨ及び最適温度を有することが好ましい。プロテインホスファターゼの種類及び起源は問わないが、好ましくはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロマイセス属（Ｓｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に属する微生物由来のプロテインホスファターゼであり、より好ましくはトリコデルマ・ビレンス（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｅｎｓ）由来のプロテインホスファターゼであり、さらに好ましくはトリコデルマ・ビレンス　Ｇｖ２９－８由来の仮想タンパク質（ＸＰ＿０１３９５１０６９．１　ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＴＲＩＶＩＤＲＡＦＴ＿８７７１４）である。当該仮想タンパク質（ＸＰ＿０１３９５１０６９．１　ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＴＲＩＶＩＤＲＡＦＴ＿８７７１４）は、本発明者によってプロテインホスファターゼ活性が明らかにされ、下記の性質を有する。
（ａ）最適温度：５０℃
（ｂ）温度安定性：４３℃、２時間で８０％以上の残存活性
（ｃ）最適ｐＨ：ｐＨ５．４２
（ｄ）ｐＨ安定性：ｐＨ４．７～６．８、６時間で８０％以上の残存活性
（ｅ）金属イオン要求性：２．５～５．０ｍＭのＣａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋等の２価金属陽イオンで活性化する
　トリコデルマ・ビレンス　Ｇｖ２９－８由来のプロテインホスファターゼ（ＸＰ＿０１３９５１０６９．１　ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＴＲＩＶＩＤＲＡＦＴ＿８７７１４）をコードするＤＮＡの塩基配列は配列表の配列番号１に示され、アミノ酸配列は配列表の配列番号２に示される。
　プロテインホスファターゼは、野生型の他、これをコードする遺伝子を大腸菌等の宿主で発現させたものや当該遺伝子を各種遺伝子操作によって改変、発現させたものであってプロテインホスファターゼ活性を有するものであってもよい。
　プロテインホスファターゼは、好ましくは下記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかのタンパク質である。
（ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、プロテインホスファターゼ活性を有するタンパク質
（ｉｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、プロテインホスファターゼ活性を有するタンパク質
　配列番号２で示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列における、アミノ酸の欠失、置換又は付加の数は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるプロテインホスファターゼと同等の酵素活性を示すものであれば限定されないが、１～２０個が好ましく、１～１０個がさらに好ましく、１～８個がさらに好ましい。
　また、配列番号２で示されるアミノ酸配列との配列同一性は、８０％以上であり、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９９％以上がよりさらに好ましい。このような配列の同一性パーセンテージは、基準配列を照会配列として比較するアルゴリズムをもった公開又は市販されているソフトウエアを用いて計算することができる。例として、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ又はＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社製）等を用いることができる。
　本発明で用いられるプロテインホスファターゼは、発酵乳の品質を安定化させ、またその生理機能を増強することから、発酵乳用の酵素剤として有用である。
　工程（ａ）では、プロテインホスファターゼは、原料乳の発酵時に存在していればよく、これを添加するタイミングは特に制限されない。
　工程（ａ）でのプロテインホスファターゼの使用量は、原料乳中のカゼインのセリンリン酸を脱離できる濃度であればよい。例えば、原料乳１ｍＬに対して０．１～２５Ｕであることが好ましく、０．５～１５Ｕであることがより好ましく、１～１０Ｕであることが更に好ましい。ここで、本明細書において、１Ｕとは、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌを含むｐＨ６．０の２０ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液１ｍＬあたり、２０ｍｇのウシミルクカゼインを溶解した基質液に対し、１／１０量の酵素液を添加し、３７℃で反応させ、等量の反応停止液を添加する条件において、１分間あたり１μｍｏｌのリン酸を遊離する酵素量をいう。
　工程（ａ）での発酵方法は、一般的な方法に準じる。例えば、原料乳及びその他の原材料を混合、溶解して調製した発酵ミックスを均質化、加熱殺菌、冷却後、微生物（スターター）及びプロテインホスファターゼを添加し、発酵させる。冷却後は、必要に応じて破砕、均質化してもよい。
　発酵温度は、微生物（スターター）が生育する温度かつ酵素が失活しない温度であればよく、その種類に応じて適宜設定することができるが、２０℃～４５℃が好ましく、３０℃～３７℃がより好ましい。
　発酵時間は、例えば１～４８時間、２～２４時間が好ましく、３～１０時間がより好ましく、３～６時間がさらに好ましく、３～５時間が特に好ましい。
　発酵乳のｐＨは、４．０～５．０が好ましい。
　工程（ｂ）で発酵に供するプロテインホスファターゼで酵素処理してなる原料乳（脱リン酸乳）は、プロテインホスファターゼにより原料乳中のカゼインが脱リン酸化されていればよい。予め原料乳をプロテインホスファターゼで酵素処理すると、より多くのカゼインを脱リン酸化することができ、また、カゼインの脱リン酸化度合を制御し易い。
　工程（ｂ）でのプロテインホスファターゼの使用量は、原料乳中のカゼインのセリンリン酸を脱離できる濃度であればよい。例えば、原料乳１質量部に対して０．１～２５Ｕであることが好ましく、０．５～１５Ｕであることがより好ましく、１～１０Ｕであることが更に好ましい。
　原料乳の酵素処理は、１℃～６０℃の反応温度にて、０．１時間～２４時間反応を行うことが好ましい。反応温度は１０℃～６０℃であることが好ましく、３０℃～５５℃であることがより好ましく、４０℃～５０℃であることがさらに好ましい。反応時間は０．３時間～１２時間であることが好ましく、０．５時間～５時間であることがより好ましく、１時間～４時間であることが特に好ましい。
　原料乳をプロテインホスファターゼで酵素処理する前に、原料乳のｐＨを調整してもよい。
　酵素処理後は、酵素を失活させることなく原料乳を発酵させてもよく、或いは加熱等により酵素を失活させる処理を行った後に発酵させてもよい。好ましくは失活させることなく原料乳を発酵させることである。発酵時においても徐々にカゼインの脱リン酸化が進行する。
　酵素を失活させる処理における加熱の条件は、高温短時間の加熱が好ましく、例えば、６０～１００℃で１分間～３０分間加熱するのが好ましい。原料乳の殺菌工程前に酵素処理した後、原料乳の殺菌工程において酵素を失活させてもよい。
　工程（ｂ）での発酵方法は、工程（ａ）と同様、一般的な方法に準じ、例えば、プロテインホスファターゼで酵素処理してなる原料乳及びその他の原材料を含む発酵ミックスを均質化、加熱殺菌、冷却後、微生物（スターター）を添加し、発酵させる。また、冷却後は、必要に応じて破砕、均質化してもよい。
　発酵温度は、工程（ａ）と同様、適宜設定することができるが、２０℃～４５℃が好ましく、３０℃～３７℃がより好ましい。
　発酵時間は、例えば１～４８時間、２～２４時間が好ましく、３～１０時間がより好ましく、３～６時間がさらに好ましく、３～５時間が特に好ましい。
　発酵乳のｐＨは、４．０～５．０が好ましい。
　本発明では、均一なカードを形成し易く、また、ハンドリング性及びコスト面で優れる観点から、工程（ａ）により発酵乳を製造することが好ましい。
　原料乳をプロテインホスファターゼ処理することによって、原料乳中のカゼインが脱リン酸化され、脱リン酸化カゼインを含有する脱リン酸乳が得られる。カゼインの脱リン酸化でカゼイン分子の疎水度が上昇することにより、乳の口当たりは変化する。この口当たりの変化を生かして、本発明の脱リン酸乳は、原料乳と同様に、発酵乳以外にも、様々な乳製品に使用することができる。
　本発明の脱リン酸乳中の脱リン酸化カゼインの含有量は、口当たりを良好とする観点、安定的な品質の発酵乳を得る観点から、０．８ｇ／１００ｇ以上であることが好ましく、０．９ｇ／１００ｇ以上であることがより好ましく、１．０ｇ／１００ｇ以上であることが更に好ましく、また、１．５ｇ／１００ｇ以下であることが好ましく、１．４ｇ／１００ｇ以下であることがより好ましい。
　本発明の脱リン酸乳において、カゼイン中の脱リン酸化カゼインの割合としては、好ましくは４５％～６５％、より好ましくは４８～６３％である。
　また、脱リン酸乳は、さらに、遊離リン酸を含有することが好ましく、脱リン酸乳中の遊離リン酸の含有量は、口当たりを良好とする観点、安定的な品質の発酵乳を得る観点から、１ｍＭ～１００ｍＭの範囲内にあることが好ましく５ｍＭ～５０ｍＭの範囲内にあることがより好ましく、１０ｍＭ～４０ｍＭの範囲内にあることがさらに好ましく、１２ｍＭ～３０ｍＭの範囲内にあることがよりさらに好ましい。
　原料乳の発酵、及びプロテインホスファターゼで酵素処理してなる原料乳（脱リン酸乳）の発酵には、一般的な乳酸菌や酵母等のスターターが用いられる。
　乳酸菌としては、例えば、ラクトバチルス属細菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ等）、ラクトコッカス属細菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ等）、ロイコノストック属細菌（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ等）、エンテロコッカス属細菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ等）、ビフィドバクテリウム属細菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ等）が挙げられる。
　酵母としては、例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等）の酵母が挙げられる。
　スターターに含まれる乳酸菌または酵母の菌数（生菌）は、例えば１０５～１０１３ｃｆｕ／ｍＬ、好ましくは１０６～１０１２ｃｆｕ／ｍＬ、より好ましくは１０７～１０１１ｃｆｕ／ｍＬ、さらに好ましくは１０８～１０１０ｃｆｕ／ｍＬである。
　スターターの使用量は、特に限定されず、その種類に応じて適宜設定することができるが、例えば、原料乳及び／又は脱リン酸乳の０．０１～１０質量％であり、０．１～１０質量％が好ましく、０．５～１０質量％がより好ましい。
　本発明の発酵乳は、必要に応じて、本発明の効果を損なわない範囲において、発酵の前に配合し得る他の成分や、発酵の後に配合し得る他の成分を含有してもよい。当該他の成分としては、例えば、甘味料（単糖、少糖、糖アルコール、合成甘味料等）、安定剤（ゼラチン、ペクチン、カラギナン、キサンタンガム等）、果汁、果肉、香料等が挙げられる。
　後掲の実施例に示すとおり、本発明の発酵乳は、離水が少なく、粘性が高くしっかりした固さを有する。
　発酵乳の粘度は、後述する測定方法で発酵乳を３０秒間処理したときの粘度が３，０００Ｐａ・ｓ以上であることが好ましい。上限値は特に限定されないが、例えば、１００００Ｐａ・ｓである。
　また、発酵乳の固さは、後掲の実施例に記載の破断強度解析の値として、破断荷重が０．４１Ｎ以上であることが好ましく、０．４５Ｎ以上であることがより好ましく、０．５Ｎ以上であることがさらに好ましい。上限値は特に限定されないが、例えば、１．０Ｎである。
　また、本発明の発酵乳は、多くの菌体外多糖（ＥＰＳ）を含む。発酵乳中のＥＰＳ量は、発酵乳１ｇあたり、４０μｇ以上、６０μｇ以上、８０μｇ以上、１１０μｇ以上、１８０μｇ以上であっても良い。上限値は特に限定されないが、例えば３００μｇである。
　次に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
製造例１　トリコデルマ・ビレンス　Ｇｖ２９－８由来プロテインホスファターゼ（以下、「ＰＰａｓｅ」）の精製
　トリコデルマ・ビレンス（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｅｎｓ）ＮＢＲＣ６３５５株をポテトデキストロース寒天培地（栄研）に接種し、２５℃で３日間好気性培養した。ポテトデキストロース寒天培地上に生育した生産菌のコロニーを、約５ｍｍ角に寒天培地ごと切出し、５．０％スクロース、２．０％ＴＵＢＥＲＭＩＮＥ　ＦＶ（ロケット・ジャパン）、０．３％塩化カルシウム、０．１％硫酸マグネシウム、０．００１％リン酸水素二カリウムから成る生産培地（ｐＨ４．０）へ植菌し、２７℃、２２０ｒ／ｍｉｎの条件で４日間旋回振とう培養した。
　約７００ｍＬの培養液をアドバンテックＮｏ．２ろ紙（アドバンテック）及び３．０％ＫＣ－フロック（日本製紙）を用いた吸引ろ過によって固液分離し、得られたろ液をＵＦ（ＡＨＰ、旭化成）によって約１／１０量まで濃縮後した。次いでＰＥＧ４０００（ナカライテクス）を終濃度１５％となるように濃縮液へ添加し、溶解したのち、４℃にて一晩静置した。その後、８０００ｒ／ｍｉｎ、４℃の条件で２０分間遠心分離（ＨＩＭＡＣ　ＣＥＮＴＲＩＦＵＧＥ　ＣＲ２０Ｂ２、ＨＩＴＡＣＨＩ）し、上清を廃棄した。得られた沈殿を、約１０ｍＬの２０ｍＭ　酢酸‐酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ４．８）にて溶解し、その液を５０℃にて１時間保温したのち、１４８００ｒ／ｍｉｎ、４℃の条件で１０分間遠心分離（ＬＥＧＥＮＤ　ＭＩＣＲＯ　２１Ｒ、サーモフィッシャーサイエンス）し、その上清を精製タンパク質として回収した。
　精製したタンパク質を同定したところ、アミノ酸配列情報から、トリコデルマ・ビレンス　Ｇｖ２９－８由来の仮想タンパク質（ＸＰ＿０１３９５１０６９．１　ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＴＲＩＶＩＤＲＡＦＴ＿８７７１４）であった。このタンパク質は機能未知であった。
　精製タンパク質について、プロテインホスファターゼ（ＰＰａｓｅ）活性が確認された。
１）ＰＰａｓｅ活性測定
　０．２ｇのウシミルクカゼイン（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ製、Ｃａｓｅｉｎ，Ｂｏｖｉｎｅ　Ｍｉｌｋ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　ａｎｄ　Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄ　Ｆｒｅｅ）を２０ｍＬ容ビーカーに量り取り、２．０ｍＬの０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）と少量の蒸留水を添加し、マグネチックスターラーを用いて溶解した。続いて、２．０ｍＬの０．２Ｍ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．０）と約１０ｍＬの蒸留水を添加し、１．０規定の塩酸を用いてｐＨ６．０に調整したのち、２０ｍＬに定容した。これを基質液とした。１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブに、基質液を４５０μＬ分注し、酵素サンプルを５０μＬ加え、正確に２０分間反応した。反応後、１Ｌあたり１８．０ｇ　トリクロロ酢酸、１８．０ｇ　無水酢酸ナトリウム、１９．８ｇ　酢酸からなる反応停止液を５００μＬ添加し、激しく撹拌し、１５０００ｒ／ｍｉｎ、４℃の条件で５分間遠心分離した。その上清の適宜希釈液２００μＬを、８００μＬの蒸留水へ添加し、次いで２Ｍ硫酸及び４０ｇ／Ｌモリブデン酸アンモニウム水溶液を３０μＬ添加し、よく撹拌した。そこへ、０．１Ｍアスコルビン酸ナトリウム水溶液を５０μＬ添加し、再度撹拌したのち、４０℃で２０分間保温した。その後、分光光度計（ＵＶ－１２４０、島津製作所製）を用いて８８０ｎｍにおける吸光度を測定し、リン酸二水素カリウムを用いてあらかじめ作成した検量線によってリン酸濃度（μＭ）を算出した。活性値は、下記の式で算出した。
　活性値（Ｕ／ｍＬ）＝リン酸濃度（μＭ）×反応液量（Ｌ）／反応時間（分）／酵素量（ｍＬ）×希釈率
　ａ　温度依存性は、室温（２３．５℃）、３７℃、４３℃、５０℃、６０℃の各温度におけるＰＰａｓｅ活性を測定した。
　ｂ　温度安定性は、４℃、２５℃、３７℃、４３℃、５０℃、６０℃の各温度でＰＰａｓｅサンプルを２時間保温し、１５０００ｒ／ｍｉｎ、４℃の条件で遠心分離し、その上清の残存活性を測定した。
　ｃ　ｐＨ依存性は、カゼイン濃度を３倍にした基質液を、０．２Ｍ　酢酸－酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ３．６、４．２、４，７、５．２、５．６）、ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．３、６．０、６．８）、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０、７．５、８．０、９．０）の各緩衝液にて３倍希釈し、４℃にて６時間静置したのち、各サンプルの残存活性を測定した。なお、基質を各緩衝液で希釈したのちのｐＨを測定し、その値を反応時のｐＨとした。
　ｄ　ｐＨ安定性は、０．２Ｍ　酢酸－酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ３．６、４．２、４，７、５．６、６．０）、ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．３、６．０、６．８）、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５、８．０、９．０）の各緩衝液にて１０倍希釈し、４℃にて６時間静置したのち、各サンプルの残存活性を測定した。
　ｅ　金属イオン要求性は、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、コバルト、マンガンの塩化物塩及びＥＤＴＡ・２ナトリウム水溶液を、反応液内で２．５ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭとなるように添加し、その時のＰＰａｓｅ活性を測定した。
　ＰＰａｓｅの温度依存性を図３ａに、温度安定性を図３ｂに、ｐＨ依存性を図３ｃに、ｐＨ安定性を図３ｄに、金属イオン要求性を図４にそれぞれ示す。図３ａ～ｄより、ＰＰａｓｅは、最適温度は５０℃、最適ｐＨはｐＨ５．４２にあり、４３℃　２時間、及びｐＨ４．７～６．８　６時間で８０％以上の残存活性を維持した。
　また、図４より、ＰＰａｓｅは、２．５～５．０ｍＭのＣａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋等の２価金属陽イオンで活性化した。
実施例１
（１）発酵乳の調製
　おいしい牛乳（明治製）へ２％のスキムミルク（森永乳業製）を添加し、良く振り混ぜて溶解させ、沸騰水中で２０分間撹拌しながら殺菌した。殺菌後の原料乳を４３℃で約３０分間保温したのち、スターターＬ８１２（Ｃｈｒ．Ｈａｎｓｅｎ社製）と表１に示したＰＰａｓｅまたは２０ｍＭ　酢酸－酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．２）を酵素活性の終濃度が０～１０Ｕ／ｍＬ－ｍｉｌｋになるよう添加し、４３℃にて４．５時間発酵させ、発酵乳を得た。
なお、ＰＰａｓｅは２０ｍＭ酢酸－酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．２）で適宜希釈したものを用いた。実施例１の発酵乳中のカゼイン量は３．３ｇ／１００ｇであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（２）脱リン酸化カゼインの測定
　発酵乳を蒸留水にて５０倍希釈し、×２サンプルバッファーと等倍混合し、沸騰水中で５分間加熱し、測定サンプルとした。ＳｕｐｅｒＳｅｐＴＭ　Ｐｈｏｓ－ｔａｇ（１２．５％、富士フィルム和光純薬）へ、測定サンプル１０μＬをアプライし、２５ｍＭの定電流で泳動した。泳動後のゲルを染色・脱色したのち、画像処理ソフト（Ｉｍａｇｅ　Ｊ）を用いて泳動パターンをグラフ化した。次いで、リン酸修飾の有無により変動する領域を設定し、各エリア面積を算出したのち、各酵素量における脱リン酸化カゼインの割合と脱リン酸化カゼイン量（絶対量）を算出した。
（３）遊離リン酸濃度（ｍＭ）の測定
　上記（１）で調製した発酵乳を激しく振り混ぜることでカードを均一化した。カードを均一化した発酵乳を１．５ｍＬ容エッペンチューブへ１ｍＬ分注し、１５０００ｒ／ｍｉｎ、４℃の条件で１０分間遠心分離した。その上清の適宜希釈液２００μＬを、８００μＬの蒸留水へ添加し、次いで２Ｍ硫酸及び４０ｇ／Ｌモリブデン酸アンモニウム水溶液を３０μＬ添加し、よく撹拌した。そこへ、０．１Ｍアスコルビン酸ナトリウム水溶液を５０μＬ添加し、再度撹拌したのち、４０℃で２０分間保温した。その後、分光光度計（ＵＶ－１２４０、島津製作所製）を用いて８８０ｎｍにおける吸光度を測定し、リン酸二水素カリウムを用いてあらかじめ作成した検量線によってリン酸濃度（ｍＭ）を算出した。
（４）結果
　脱リン酸化カゼインの測定結果を表２に示す。遊離リン酸濃度の測定結果を図５に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例２
（１）脱リン酸乳の調製
　１Ｎ　ＨＣｌを用いてｐＨ５．９に調整したおいしい牛乳（明治製）へ、３００Ｕ／ｍＬのＰＰａｓｅを表３に示した量を添加し、４３℃にて４時間静置し脱リン酸乳を得た。実施例２の脱リン酸乳中のカゼイン量は２．５ｇ／１００ｇであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（２）脱リン酸化カゼインの測定
　ＰＰａｓｅを作用させた脱リン酸乳を用いた以外は、実施例１と同様の方法で脱リン酸化カゼインを測定した。
（３）遊離リン酸濃度（ｍＭ）の測定
　ＰＰａｓｅを作用させた脱リン酸乳を用いた以外は、実施例１と同様の方法で遊離リン酸濃度を測定した。
（４）結果
　脱リン酸化カゼインの測定結果を表４に示す。遊離リン酸濃度の測定結果を図６に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例３
（１）発酵乳の調製
　５００ｍＬ容メヂューム瓶へ低温殺菌牛乳（タカナシ乳業製）３９２ｇとスキムミルク（森永乳業製）８ｇを量り取り、良く振り混ぜて溶解させ、沸騰水中で２０分間撹拌しながら殺菌した。殺菌後の原料乳を４３℃で約３０分間保温したのち、スターターＬ８１２（Ｃｈｒ．Ｈａｎｓｅｎ社製、以下同じ）を０．０１ｇ／ｍＬになるように添加し、１０回程度穏やかに転倒混和した。その後、表５のサンプルをあらかじめ添加した１５ｍＬ容スクリューキャップチューブへ、スターターを添加した原料乳を１０ｍＬずつ分注し、フタをして２～３回穏やかに転倒混和したのち、４３℃にて５時間発酵した。発酵後、４℃で一晩冷却して発酵乳を得た。発酵乳のｐＨをｐＨメーター（Ｆ７２－Ｓ、ＨＯＲＩＢＡ）で測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（２）離水率の測定
　上記（１）で調製した発酵乳サンプルを激しく振り混ぜることでカードを均一化し、約５ｍＬを１５ｍＬ容目盛り付きスクリューキャップチューブへ分注したのち、３０００ｒ／ｍｉｎ（ＫＯＫＵＳＡＮ製、Ｈ－１９Ｆ　ＭＲ）、８℃の条件で１０分間遠心分離した。その後、サンプル全量と固形分の体積を読み取り、次式で離水率を算出した。
　離水率（％）＝１００－（（固形分体積／サンプル体積）×１００）
（３）遊離リン酸濃度（ｍＭ）の測定
　カードを均一化した発酵乳サンプルを１．５ｍＬ容エッペンチューブへ１ｍＬ分注し、１５０００ｒ／ｍｉｎ（ＴＯＭＹ製、微量高速冷却遠心機　ＭＲＸ－１５０）、４℃の条件で１０分間遠心分離した。その上清の適宜希釈液２００μＬを、８００μＬの蒸留水へ添加し、次いで２Ｍ硫酸及び４０ｇ／Ｌモリブデン酸アンモニウム水溶液を３０μＬ添加し、よく撹拌した。そこへ、０．１Ｍアスコルビン酸ナトリウム水溶液を５０μＬ添加し、再度撹拌したのち、４０℃で２０分間保温した。その後、分光光度計（ＵＶ－１２４０、島津製作所製）を用いて８８０ｎｍにおける吸光度を測定し、リン酸二水素カリウムを用いてあらかじめ作成した検量線によってリン酸濃度（ｍＭ）を算出した。
（４）結果
　結果を図７に示す。図７より、ＰＰａｓｅを加えた発酵乳は無添加（Ｂｌａｎｋ）と比べて離水率が低かった。他方、ＰＰａｓｅの反応生成物であるリン酸を含有するが脱リン酸化カゼインを含有しない発酵乳は離水抑制されなかった。
　また、図７より、発酵時のＰＰａｓｅの添加によって、無添加（Ｂｌａｎｋ）と比べて離水抑制の効果が認められた。他方、ＰＰａｓｅの反応生成物であるリン酸を添加しても離水は抑制されなかった。
実施例４
（１）発酵乳の調製
　５００ｍＬ容メヂューム瓶へ低温殺菌牛乳（タカナシ乳業製）を３９２ｇとスキムミルク（森永乳業製）を８ｇ量り取り、良く振り混ぜて溶解し、沸騰水中で２０分間加熱殺菌したのち、４３℃で約３０分間保温した。そこへ、スターターＬ８１２を４０ｍｇ添加し、穏やかに１０回転倒混和した。その後、１．４６ｍＬの適宜希釈した精製ＰＰａｓｅ（１．０Ｕ／ｍＬ－ｍｉｌｋ又は３．０Ｕ／ｍＬ－ｍｉｌｋ）又は２０ｍＭ酢酸－酢酸Ｋ緩衝液（ｐＨ５．２）をあらかじめ分注したジャム瓶へ原料乳を６０ｇずつ量り入れ、５回転倒混和したのち、４３℃で４．５時間発酵した。発酵後、４℃で一晩冷却して発酵乳を得た。発酵乳のｐＨをｐＨメーター（サーモフィッシャー製、ＯＲＩＯＮ　３　ＳＴＡＲ）で測定した。
（２）離水率の測定
　実施例３と同様の方法で測定した。
（３）遊離リン酸濃度（ｍＭ）の測定
　実施例３と同様の方法で測定した。
（４）ＥＰＳ測定
　発酵乳サンプルを０．４ｇ秤量し、１００％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ溶液を２００μＬ添加して転倒混和し、１５０００ｒ／ｍｉｎ（ＴＯＭＹ製、微量高速冷却遠心機　ＭＲＸ－１５０、以下同じ）、４℃の条件で１０分間遠心分離した。その上清全量を新しいエッペンチューブへ回収し、アセトンを５００μＬ添加し、４℃で一晩静置した。その後、１５０００ｒ／ｍｉｎ、４℃の条件で１０分間遠心分離し、上清を廃棄したのち、沈殿したペレットを４００μＬのＭｉｌｌｉＱ水で溶解し、次いでアセトンを４００μＬ添加して転倒混和し４℃で一晩静置した。その後、１５０００ｒ／ｍｉｎ、４℃の条件で１０分間遠心分離し、上清を廃棄したのち、沈殿物を３００μＬのＭｉｌｌｉＱ水に溶解した。その溶解液を１５０００ｒ／ｍｉｎ、４℃の条件で１０分間遠心分離し、上清を回収した。そのうち１００μＬを用いてＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）により単糖及び二糖量を測定した。さらに残りの２００μＬを用いてフェノール硫酸法によって全糖量を測定した。全糖量から単糖及び二糖を差し引くことで、３糖以上の菌体外多糖量を算出した。
（５）粘度測定
　発酵乳サンプルを激しく振り混ぜることで均一化し、粘度計（ＤＶ－Ｉ　Ｐｒｉｍｅ、ＢＲＯＯＫ　ＦＩＥＲＤ）用使い捨てサンプルチャンバー（アルミ製）へ１３．５ｇ分注した。スピンドルはＳＣ４－２９を用い、１０ｒ／ｍｉｎにて測定し、３０秒毎に粘度を読み取り、記録した。なお、すべての操作は１０℃環境下で行った。
（６）破断強度解析
　装置はクリープメーターＲＥ２－３３００５Ｃ（山電製）を用い、プランジャーはＮｏ．３を用いた。
　測定は、ロードセル０．０１、アンプ倍率０．１、格納ピッチ０．０７秒、測定歪率６０％、測定速度１ｍｍ／秒、サンプル厚さ自動測定で行った。
（７）結果
　離水率、遊離リン酸濃度及び発酵後ｐＨの測定結果を図８に、ＥＰＳ濃度を図９に、粘度の測定結果を図１０に、破断強度解析結果を図１１にそれぞれ示す。
　脱リン酸化カゼインを含有する発酵乳は、無添加（Ｂｌａｎｋ）と比べて、離水率が低く（図８）、菌体外多糖（ＥＰＳ）量は多かった（図９）。当該発酵乳の粘度は、無添加より１０００ｃＰ以上高かった（図１０）。また、当該発酵乳の破断応力は、無添加に比べて高く、破断後の応力の低下（＝もろさ）が減少した（図１１）。
実施例５
（１）発酵乳の調製
　２５０ｍＬ容メヂューム瓶５本へ低温殺菌牛乳（タカナシ乳業製）を１４７ｇとスキムミルク（森永乳業製）を３ｇ量り取り、よく振り混ぜて溶解した。その後、沸騰水中で２０分間加熱殺菌したのち、４３℃で約３０分間保温した。そこへ、表６に示した各種スターター（すべてＣｈｒ．ｈａｎｓｅｎ社製）を添加し、穏やかに１０回転倒混和した。その後、０．４８８ｍＬの１２３Ｕ／ｍＬの精製ＰＰａｓｅ（Ｆｉｎａｌ　１．０Ｕ／ｍＬ－ｍｉｌｋ）又は２０ｍＭ酢酸－酢酸Ｋ緩衝液（ｐＨ５．２）をあらかじめ分注したジャム瓶へ原料乳を６０ｇずつ量り入れ、５回転倒混和したのち、４３℃で４．５時間発酵した。発酵後、４℃で一晩冷却して発酵乳を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（２）脱リン酸化カゼインの測定、（３）離水率の測定、（４）遊離リン酸濃度（ｍＭ）の測定、（５）ＥＰＳ測定、（６）粘度測定、（７）破断強度解析
　上記実施例４と同様の方法により測定した。
（８）結果
　離水率、遊離リン酸濃度及び発酵後ｐＨの測定結果を図１２に、ＥＰＳ濃度を図１３に、粘度の測定結果を図１４に、破断強度解析結果を図１５にそれぞれ示す。
　脱リン酸化カゼインを含有する発酵乳は、無添加（Ｂｌａｎｋ）と比べて、離水率が低く（図１２）、菌体外多糖（ＥＰＳ）量は多かった（図１３）。当該発酵乳の粘度は、無添加より１０００～２０００ｃＰ高かった（図１４）。また、当該発酵乳の破断応力は、無添加に比べて高かった（図１５）。
　また、ＰＰａｓｅの添加により、無添加（Ｂｌａｎｋ）と比べて、すべてのスターターで離水抑制、遊離リン酸量増加、ｐＨの低下が見られた（図１２）。菌体外多糖（ＥＰＳ）量は、すべてのスターターで無添加より増加した（図１３）。発酵乳の粘度測定の結果、粘度は１０００～２０００ｃＰ上昇した（図１４）。また、発酵乳の破断強度解析を実施した結果、すべてのスターターで破断応力の上昇を確認した（図１５）。
実施例６（１）発酵乳の調製
　５００ｍＬ容メヂューム瓶へ低温殺菌牛乳（タカナシ乳業製）を３９２ｇとスキムミルク（森永乳業製）を８ｇ量り取り、良く振り混ぜて溶解し、沸騰水中で２０分間加熱殺菌したのち、４３℃で約３０分間保温した。そこへ、スターターＬ８１２を４０ｍｇ添加し、穏やかに１０回転倒混和した。その後、１．４６ｍＬの適宜希釈した精製ＰＰａｓｅまたは２０ｍＭ酢酸－酢酸Ｋ緩衝液（ｐＨ５．２）をあらかじめ分注したジャム瓶へ原料乳を６０ｇずつ量り入れ、５回転倒混和したのち、４３℃で４．５時間発酵した。発酵後、４℃で一晩冷却して発酵乳を得た。発酵乳のｐＨをｐＨメーター（サーモフィッシャー製、ＯＲＩＯＮ　３　ＳＴＡＲ）で測定した。
（２）離水率の測定、（３）遊離リン酸濃度（ｍＭ）の測定、（４）ＥＰＳ測定
　上記実施例４と同様の方法により測定した。
（５）粘度測定
　発酵乳サンプルを激しく振り混ぜることで均一化し、粘度計（ＤＶ－Ｉ　Ｐｒｉｍｅ、ＢＲＯＯＫ　ＦＩＥＲＤ）用使い捨てサンプルチャンバー（アルミ製）へ１３．５ｇ分注した。スピンドルはＳＣ４－２９を用い、１０ｒ／ｍｉｎにて測定し、３０秒毎に粘度を読み取り、記録した。なお、すべての操作は１０℃環境下で行った。
（６）破断強度解析
　装置はクリープメーターＲＥ２－３３００５Ｃ（山電製）を用い、プランジャーはＮｏ．３を用いた。測定は、ロードセル０．０１、アンプ倍率０．１、格納ピッチ０．０７秒、測定歪率６０％、測定速度１ｍｍ／秒、サンプル厚さ自動測定で行った。
（７）結果
　離水率、遊離リン酸濃度及び発酵後ｐＨの測定結果を図１６に、ＥＰＳ濃度を図１７に、粘度の測定結果を図１８に、破断強度解析結果を図１９にそれぞれ示す。発酵乳に０．１～３．０Ｕ／ｍＬ－ｍｉｌｋの範囲でＰＰａｓｅを添加したところ、無添加（Ｂｌａｎｋ）と比べて、離水抑制、遊離リン酸量増加、ｐＨの低下が見られた（図１６）。菌体外多糖（ＥＰＳ）量は、１．０及び３．０Ｕ／ｍＬ－ｍｉｌｋのＰＰａｓｅ添加において、無添加より増加した（図１７）。ＰＰａｓｅを添加した発酵乳の粘度を測定した結果、０．１～０．５Ｕ／ｍＬ－ｍｉｌｋのＰＰａｓｅ添加で、無添加より１０００ｃＰ程度上昇し、１．０及び３．０Ｕ／ｍＬ－ｍｉｌｋのＰＰａｓｅ添加でさらに上昇した（図１８）。また、ＰＰａｓｅを添加した発酵乳の破断強度解析を実施した結果、濃度依存性は見られなかったものの、無添加に比べて破断応力が増加した。また、０．５Ｕ／ｍＬ－ｍｉｌｋ以上のＰＰａｓｅ添加では、破断後の応力の低下（＝もろさ）が減少した（図１９）。
実施例７（原料乳の酵素処理）
（１）発酵乳の調製
　５００ｍＬ容メヂューム瓶へ超高温瞬間殺菌牛乳（明治製　おいしい牛乳）または低温殺菌牛乳（タカナシ乳業製）を３９２ｇとスキムミルク（森永乳業製）を８ｇ量り取り、良く振り混ぜて溶解した。そこへ、２ｍＬの精製ＰＰａｓｅ（７００Ｕ／ｍＬ、Ｆｉｎａｌ　２３．３Ｕ／ｍＬ－ｍｉｌｋ）または２０ｍＭ酢酸－酢酸Ｋ緩衝液（ｐＨ５．２）を添加し、５回転倒混和した。次いで、６０ｇずつジャム瓶へ量り入れ、５回転倒混和したのち、３７℃で３時間静置し、酵素処理乳を得た。各ジャム瓶を沸騰水中で２０分間煮沸することでＰＰａｓｅを失活させた。次いで、室温まで冷却後、各ジャム瓶にスターターＬ８１２を２０ｍｇ添加し、穏やかに１０回転倒混和し、４３℃で４．５時間発酵させた。発酵後、４℃で一晩冷却して発酵乳を得た。発酵乳のｐＨをｐＨメーター（サーモフィッシャー製、ＯＲＩＯＮ　３　ＳＴＡＲ）で測定した。
（２）離水率の測定、（３）遊離リン酸濃度（ｍＭ）の測定
　上記実施例４と同様の方法により測定した。
（４）結果
　離水率、遊離リン酸濃度及び発酵後ｐＨの測定結果を図２０に示す。ＰＰａｓｅ処理原料乳の発酵により、無添加（Ｂｌａｎｋ）と比べて、離水抑制、遊離リン酸量増加、ｐＨの低下が見られた（図２０）。この結果は、乳に含まれるカゼインが脱リン酸化されていれば良く、発酵中または発酵乳中においてＰＰａｓｅが活性状態で存在する必要は必ずしもないことが示唆された。
　実施例８
（１）発酵乳の調製
　５００ｍＬ容メヂューム瓶へ超高温瞬間殺菌牛乳（明治製　おいしい牛乳）３９２ｇとスキムミルク（森永乳業製）８ｇを量り取り、良く振り混ぜて溶解させ、沸騰水中で２０分間撹拌しながら殺菌した。殺菌後の原料乳を４３℃で約３０分間保温したのち、０．５７１ｍＬの精製ＰＰａｓｅ（３５０Ｕ／ｍＬ、Ｆｉｎａｌ　１Ｕ／ｍＬ－ｍｉｌｋ）または２０ｍＭ酢酸－酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ４．５）とスターターＬ８１２を２０ｍｇ添加し、１０回程度穏やかに転倒混和した。１５ｍＬ容スクリューキャップチューブへ１０ｇずつ８本分注し、フタをして２～３回穏やかに転倒混和したのち、４３℃にて５時間発酵した。発酵後、４℃で一晩冷却して発酵乳を得た。発酵前、発酵開始から２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間のｐＨをｐＨメーター（サーモフィッシャー製、ＯＲＩＯＮ　３　ＳＴＡＲ）で測定した。
（２）結果
　結果を図２１に示す。酢酸－酢酸カリウム緩衝液を加えた無添加（Ｂｌａｎｋ）に対して、ＰＰａｓｅを添加したものはｐＨの低下が早くなることを確認した。ＰＰａｓｅによりリン酸が増大したものと推測される。また、ＰＰａｓｅを添加したものは凝乳が早くなることも確認した。
　実施例９（発酵後のｐＨを約４．５に合わせるように発酵時間を調整）
（１）発酵乳の調製
　１５ｍＬ容スクリューキャップチューブのかわりにジャム瓶へ６０ｇ分注したこと、発酵後のｐＨを合わせるために、緩衝液を添加した系の発酵時間を４．７５時間、ＰＰａｓｅを添加した系の発酵時間を３．５時間としたこと以外は実施例８と同様にして発酵乳を調製した。発酵乳のｐＨをｐＨメーター（サーモフィッシャー製、ＯＲＩＯＮ　３　ＳＴＡＲ）で測定した。
（２）離水率の測定、（３）遊離リン酸濃度（ｍＭ）の測定
　上記実施例４と同様の方法により測定した。
（４）結果
　結果を図２２に示す。発酵後のｐＨが約４．５と同じにもかかわらず、無添加（Ｂｌａｎｋ）と比べて、発酵時のＰＰａｓｅの添加によって離水抑制、遊離リン酸量増加が見られた。このことから、離水率の減少や遊離リン酸量増加は、発酵後のｐＨによる影響ではなく、ＰＰａｓｅの作用によって得られることが示唆された。
参考例（酵素処理乳における遊離リン酸濃度及びカルシウムイオン濃度）
（１）酵素処理乳の調製
　超高温瞬間殺菌牛乳（明治製　おいしい牛乳　ｐＨ６．７６）０．４５ｍＬまたは当該牛乳に１Ｍ塩酸を加えてｐＨ５．４８に調整した乳に、精製ＰＰａｓｅ０．０５ｍＬ（７００Ｕ／ｍＬ）を添加し、３７℃で所定時間反応させたのち、１８％トリクロロ酢酸を０．５ｍＬ添加し混合して反応を停止させ、酵素処理乳を得た。
（２）遊離リン酸濃度の測定
　酵素処理前後の遊離リン酸濃度（ｍＭ）を、上記実施例３と同様の方法により測定した。
（３）カルシウムイオン濃度の測定　カルシウムイオンセンサー（堀場製作所製　ＬＡＱＵＡ　ｔｗｉｎ）に酵素処理前後の乳を無希釈で乗せ測定した。
（４）結果
　結果を図２３に示した。ｐＨ５．４８に調整した乳は、ｐＨ６．７６の乳よりもＰＰａｓｅの反応性が高く、遊離リン酸濃度が一時的に上昇したが、一定値に収束した。ｐＨ６．７６の乳は経時的に上昇し、一定値に収束した。ＰＰａｓｅを添加したいずれの乳においても遊離リン酸濃度は一定値に収束した。酵素反応に伴い、カルシウムイオン濃度も変化するため、乳中にリン酸カルシウムが生成しており、一定の濃度で平衡状態となっていることが示唆された。

Claims (16)

  1. 　脱リン酸化カゼインを０．８ｇ／１００ｇ以上含有する発酵乳。
  2. 　脱リン酸化カゼインの含有量が０．８～１．５ｇ／１００ｇである請求項１記載の発酵乳。
  3. 　遊離リン酸の含有量が１５ｍＭ以上である請求項１又は２記載の発酵乳。
  4. 　ヨーグルトである請求項１～３のいずれか１項記載の発酵乳。
  5. 　脱リン酸化カゼインを含有する脱リン酸乳。
  6. 　脱リン酸化カゼインの含有量が０．８ｇ／１００ｇ以上である請求項５記載の脱リン酸乳。
  7. 　以下のいずれかの工程を含む、発酵乳の製造方法。
    （ａ）プロテインホスファターゼの存在下で、原料乳を発酵させる工程
    （ｂ）プロテインホスファターゼで酵素処理してなる原料乳を発酵させる工程
  8. 　プロテインホスファターゼが、トリコデルマ属に属する微生物由来のプロテインホスファターゼである請求項７記載の発酵乳の製造方法。
  9. 　トリコデルマ属に属する微生物がトリコデルマ・ビレンスである請求項８記載の発酵乳の製造方法。
  10. 　プロテインホスファターゼが、下記（ｉ）～(iii)のいずれかである請求項７～９のいずれか１項記載の発酵乳の製造方法。
    （ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
    （ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、プロテインホスファターゼ活性を有するタンパク質
    （iii)配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、プロテインホスファターゼ活性を有するタンパク質
  11. 　発酵乳がヨーグルトである請求項７～１０のいずれか１項記載の発酵乳の製造方法。
  12. 　プロテインホスファターゼを含有する発酵乳用酵素剤。
  13. 　プロテインホスファターゼが、トリコデルマ属に属する微生物由来のプロテインホスファターゼである請求項１２記載の発酵乳用酵素剤。
  14. 　トリコデルマ属に属する微生物がトリコデルマ・ビレンスである請求項１３記載の発酵乳用酵素剤。
  15. 　プロテインホスファターゼが、下記（ｉ）～(iii)のいずれかである請求項１２～１４のいずれか１項記載の発酵乳用酵素剤。
    （ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
    （ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、プロテインホスファターゼ活性を有するタンパク質
    （iii)配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、プロテインホスファターゼ活性を有するタンパク質
  16. 　下記（ｉ）～(iii)のいずれかであるプロテインホスファターゼ活性を有するタンパク質。
    （ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
    （ii）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、プロテインホスファターゼ活性を有するタンパク質
    （iii)配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、プロテインホスファターゼ活性を有するタンパク質
     
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