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WO2021054473A1 - 鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤 - Google Patents

鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤 Download PDF

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WO2021054473A1
WO2021054473A1 PCT/JP2020/035616 JP2020035616W WO2021054473A1 WO 2021054473 A1 WO2021054473 A1 WO 2021054473A1 JP 2020035616 W JP2020035616 W JP 2020035616W WO 2021054473 A1 WO2021054473 A1 WO 2021054473A1
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WO
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sickle cell
cell disease
ameliorating
scd
sickle
Prior art date
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PCT/JP2020/035616
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English (en)
French (fr)
Inventor
憲三朗 谷
泰 曽田
紀元 廖
将平 宮本
聡史 河田
基康 富岡
健 児玉
Original Assignee
国立大学法人 東京大学
ネオファーマジャパン株式会社
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Publication date
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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Definitions

  • the present invention relates to an ameliorating and / or preventive agent for sickle cell disease, and more particularly, an ameliorating and / or preventive agent for sickle cell disease containing 5-aminolevulinic acid (5-ALA) or a derivative thereof or a salt thereof. And the improvement and / or prevention of sickle cell disease using this. Furthermore, the present invention relates to an ameliorating and / or preventive agent for sickle cell disease containing 5-ALA or a derivative thereof and a metal-containing compound, and an amelioration and / or prevention of sickle cell disease using the same.
  • 5-ALA 5-aminolevulinic acid
  • Sickle cell disease is a hereditary erythrocyte disorder with a one-amino acid mutation in which glutamate is replaced by valine on the ⁇ -chain of hemoglobin S (HbS).
  • HbS hemoglobin S
  • the mutation causes loss of negative charge and enhanced hydrophobicity, resulting in abnormal hemoglobin (Hb) dimer and tetramer formation and induction of HbS polymerization.
  • HbS When HbS is deoxygenated, HbS aggregates form dense polymers, transforming erythrocytes into a "sickle-like" morphology. This deformation of red blood cells is the cause of various symptoms occurring in SCD patients, that is, hemolytic anemia, painful vascular occlusion, organ dysfunction, shortened life span, and the like (Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • sickle cells increase oxidative stress by inducing activation of signal transduction substances. Therefore, sickle-shaped erythrocytes not only adhere to the inner wall of blood vessels, but also induce further vascular infarction by activating leukocytes and platelets circulating in the body, and leukocytes and platelets attached to the inner wall of blood vessels supplement sickle-shaped erythrocytes. Will be done. In addition, attachment of sickle cells to the inner wall of blood vessels induces the expression of adhesion-enhancing proteins and blood coagulation-promoting proteins on the cell surface of blood vessel inner walls. Chronic platelet activation and aggregation have been observed in SCD patients (Non-Patent Document 1).
  • TLR4 Toll-like receptors 4
  • Non-Patent Document 1 The various symptoms caused by these sickle cells cause further deoxidation and polymerization of HbS by causing a decrease in blood flow, resulting in sickle cell sickle, stagnant body fluid flow, release of Hb and free hemoglobin, It causes vascular infarction, inflammatory reaction, etc., and causes multi-organ failure and pain in SCD patients.
  • Non-Patent Document 1 various symptoms in SCD are intricately related to each other.
  • Non-Patent Document 4 As of 2015, 4.4 million people have sickle cell disease, and an additional 400 million have heterozygotes for the sickle cell disease trait, the sickle cell mutation (non-patent literature). 2, 3). And 114,800 people have died from sickle cell disease (Non-Patent Document 4).
  • Non-Patent Document 5 Non-Patent Document 5
  • hematopoietic stem cell transplantation hematopoietic stem cell transplantation
  • gene therapy hematopoietic stem cell transplantation
  • hydroxyurea is used as a drug that enhances the expression of HbF by suppressing the polymerization of HbS.
  • HDAC inhibitors have also been used for similar purposes, but intermittent administration is required to avoid toxicity.
  • carbon monoxide drugs and the like are used as agents that suppress sickle formation by suppressing the deoxidation of HbS and the increase in Hb concentration.
  • Non-Patent Document 1 N-acetylcysteine (NAC) or the like is used as a drug that suppresses ischemia-reperfusion in SCD and ROS production associated therewith.
  • NAC N-acetylcysteine
  • the application of a drug that suppresses the inflammatory reaction, which is an important factor in the spread of tissue damage in SCD is also being investigated.
  • these have not yet been approved as therapeutic agents for SCD (Non-Patent Document 1).
  • An object of the present invention is to provide a new ameliorating and / or preventive agent for sickle cell disease. More specifically, it is to provide an ameliorating and / or preventive agent for sickle cell disease, which comprises 5-ALA or a derivative thereof or a salt thereof.
  • 5-ALA is a common precursor of heme compounds produced in intracellular mitochondria. It has been known that 5-ALA has an anti-inflammatory effect on specific inflammatory diseases, but 5-ALA can directly suppress the increase of sickle cells and improve or prevent the symptoms of SCD. Was not known.
  • the present invention newly provides a drug containing 5-ALA and its use for preventing or ameliorating sickle cell disease.
  • [Item 1] (1) The following formula (I) (In the formula, R 1 represents a hydrogen atom or an acyl group, and R 2 represents a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group, a cycloalkyl group, an aryl group or an aralkyl group.) An ameliorating and / or prophylactic agent for sickle cell disease containing the compound indicated by or a salt thereof. [Item 2] The ameliorating and / or prophylactic agent for sickle cell disease according to item 1, wherein R 1 and R 2 are hydrogen atoms.
  • [Item 3] The ameliorating and / or prophylactic agent for sickle cell disease according to item 1 or 2, which further comprises one or more metal-containing compounds.
  • [Item 4] The ameliorating and / or preventing agent for sickle cell disease according to item 3, wherein the metal-containing compound is a compound containing iron, magnesium, zinc, nickel, vanadium, copper, chromium, molybdenum or cobalt.
  • the metal-containing compound is a compound containing iron, magnesium or zinc.
  • the metal-containing compound is an iron-containing compound.
  • an excellent sickle cell disease improvement / prevention effect can be obtained, and the QOL of the patient can be greatly improved.
  • FIG. 1 is a diagram showing an optical microscope image of a stained specimen showing a sickle cell inhibitory effect by 5-ALA hydrochloride. Arrows indicate sickle cells.
  • FIG. 2 is a graph showing the sickle cell inhibitory effect of the combined use of 5-ALA hydrochloride or 5-ALA hydrochloride and sodium ferrous citrate (Sodium Ferrous Citrate, SFC).
  • FIG. 3 is a diagram showing an outline of an experiment for investigating the effect of the combined use of 5-ALA hydrochloride and SFC on the red blood cell count and hemoglobin level of SCD homomouse (in vivo administration test).
  • FIG. 4 is a diagram showing an optical microscope image of a stained specimen showing a sickle cell inhibitory effect by in vivo administration of 5-ALA hydrochloride and SFC in combination.
  • FIG. 5 is a graph showing the sickle cell suppressive effect by the combined in vivo administration of 5-ALA hydrochloride and SFC.
  • FIG. 6 is a diagram showing an outline of an experiment for investigating the effect of the combined use of 5-ALA hydrochloride and SFC on erythrocyte sickle cell formation in vivo due to hypoxic exposure to SCD homomouse.
  • FIG. 7 is a diagram showing that the combined administration of 5-ALA hydrochloride and SFC suppressed hypoxia-induced acute symptoms.
  • FIG. 8 is a diagram showing an optical microscope image of a stained specimen showing that the increase in sickle cells due to hypoxia induction was suppressed by the combined administration of 5-ALA hydrochloride and SFC. Arrows indicate sickle cells.
  • FIG. 5 is a graph showing the sickle cell suppressive effect by the combined in vivo administration of 5-ALA hydrochloride and SFC.
  • FIG. 6 is a diagram showing an outline of an experiment for investigating the effect of the combined use of 5-ALA hydrochloride
  • FIG. 9 is a graph showing that the combined administration of 5-ALA hydrochloride and SFC suppressed the increase in sickle cells due to hypoxia induction.
  • FIG. 10 is a graph showing that the combined administration of 5-ALA hydrochloride and SFC reduces sickle cells under normal oxygen concentration in SCD mice.
  • FIG. 11 is a graph showing that administration of 5-ALA hydrochloride suppressed an increase in blood LDH concentration of SCD homomouse due to hemorrhagic stress due to blood sampling.
  • the active ingredient of the ameliorating and / or preventive agent for sickle cell disease of the present invention is a compound represented by the formula (I) or a salt thereof (hereinafter, these may be collectively referred to as "ALAs").
  • ALAs a compound represented by the formula (I) or a salt thereof
  • 5-ALA which is also called ⁇ -aminolevulinic acid
  • R 1 and R 2 of the formula (I) are both hydrogen atoms, and is one of the amino acids.
  • R 1 of the formula (I) is a hydrogen atom or an acyl group
  • R 2 of the formula (I) is a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group, a cycloalkyl group, an aryl group or an aralkyl.
  • Compounds other than the underlying 5-ALA can be mentioned.
  • acyl group in the formula (I) examples include linear or branched alkanoyl groups having 1 to 8 carbon atoms such as formyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, valeryl, isovaleryl, pivaloyl, hexanoyl, octanoyl and benzylcarbonyl groups. , Benzoyl, 1-naphthoyl, 2-naphthoyl group and other aroyl groups having 7 to 14 carbon atoms can be mentioned.
  • the alkyl group in the formula (I) may be a linear or branched group such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, hexyl, heptyl and octyl groups.
  • Alkyl groups having 1 to 8 carbon atoms can be mentioned.
  • cycloalkyl group in the formula (I) a saturated or partially unsaturated bond such as cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, cyclododecyl, 1-cyclohexenyl group may be present.
  • Cycloalkyl groups having 3 to 8 carbon atoms can be mentioned.
  • Examples of the aryl group in the formula (I) include an aryl group having 6 to 14 carbon atoms such as a phenyl, naphthyl, anthryl, and phenanthryl group.
  • the aryl moiety can be exemplified in the same manner as the above aryl group, and the alkyl moiety can be exemplified in the same manner as the above alkyl group.
  • benzyl, phenethyl, phenylpropyl, phenylbutyl and benzhydryl can be exemplified.
  • Trityl, naphthylmethyl, naphthylethyl group and other aralkyl groups having 7 to 15 carbon atoms can be mentioned.
  • a compound in which R 1 is a formyl, acetyl, propionyl, butyryl group or the like, or a compound in which R 2 is a methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl group or the like is preferable, and the above R Compounds in which the combination of 1 and R 2 is a combination of formyl and methyl, acetyl and methyl, propionyl and methyl, butyryl and methyl, formyl and ethyl, acetyl and ethyl, propionyl and ethyl, and butyryl and ethyl can be preferably mentioned. it can.
  • the 5-ALAs may act as an active ingredient in the state of 5-ALA of the formula (I) or a derivative thereof in vivo, and various salts, esters, etc. for increasing the solubility may be used depending on the form of administration. Alternatively, it may be administered as a prodrug (precursor) that is decomposed by an enzyme in the living body.
  • the salt of 5-ALA and its derivative include a pharmacologically acceptable acid addition salt, metal salt, ammonium salt, organic amine addition salt and the like.
  • Examples of the acid addition salt include hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, phosphate, nitrate, sulfate and other inorganic acid salts, formate, acetate, propionate and toluenesulfonic acid. Salt, succinate, oxalate, lactate, tartrate, glycolate, methanesulfonate, butyrate, valerate, citrate, fumarate, maleate, malate, etc.
  • Organic acid addition salts can be exemplified.
  • Examples of the metal salt include alkali metal salts such as lithium salt, sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as magnesium salt and calcium salt, and metal salts such as aluminum and zinc.
  • ammonium salt examples include alkylammonium salts such as ammonium salt and tetramethylammonium salt.
  • organic amine salt examples include each salt such as triethylamine salt, piperidine salt, morpholine salt, and toluidine salt. These salts can also be used as a solution at the time of use.
  • 5-ALA and various esters such as 5-ALA methyl ester, 5-ALA ethyl ester, 5-ALA propyl ester, 5-ALA butyl ester and 5-ALA pentyl ester.
  • these hydrochlorides, phosphates, sulfates, and ALA hydrochlorides, 5-ALA phosphates can be particularly preferably exemplified.
  • the above ALAs can be produced by any known method of chemical synthesis, production by microorganisms, and production by enzymes.
  • the above ALAs may form a hydrate or a solvate, and either one may be used alone or two or more thereof may be used in combination as appropriate.
  • the ameliorating and / or preventive agent for sickle-like erythrosis of the present invention preferably further contains a metal-containing compound within a range that does not cause excess disease, and the metal portion of the metal-containing compound includes iron, magnesium, and zinc.
  • a metal-containing compound within a range that does not cause excess disease
  • the metal portion of the metal-containing compound includes iron, magnesium, and zinc.
  • Nickel, vanadium, cobalt, copper, chromium, molybdenum, iron, magnesium and zinc are preferable, and iron can be preferably exemplified.
  • the iron compound may be an organic salt or an inorganic salt
  • examples of the inorganic salt include ferric chloride, iron sesquioxide, iron sulfate, and ferrous pyrophosphate
  • examples of the organic salt are carboxylates.
  • magnesium compound examples include magnesium citrate, magnesium benzoate, magnesium acetate, magnesium oxide, magnesium chloride, magnesium hydroxide, magnesium carbonate, magnesium sulfate, magnesium silicate, magnesium nitrate, diethylenetriamine pentamagnesium diammonate, and ethylenediamine tetraacetate.
  • magnesium disodium and magnesium protoporphyrin examples include magnesium disodium and magnesium protoporphyrin.
  • Examples of the zinc compound include zinc chloride, zinc oxide, zinc nitrate, zinc carbonate, zinc sulfate, diethylenetriamine diammonium pentaacetate, disodium ethylenediamine tetraacetate, zinc protoporphyrin, and zinc-containing yeast.
  • the metal-containing compound one type or two or more types can be used, respectively, and the dose of the metal-containing compound may be 0 to 100 times the molar ratio of 5-ALA, which is 0. It is preferably 0.01 to 10 times, more preferably 0.1 to 8 times.
  • the ALAs and the metal-containing compound contained in the ameliorating and / or preventive agent for sickle cell disease of the present invention may be a composition containing the ALAs and the metal-containing compound, or a composition containing each of them alone. Can also be administered. When a composition containing ALAs and a metal-containing compound are used alone, they may be administered at the same time or separately. Preferably, the ALAs and the metal-containing compound can be administered in combination so as to have an additive effect, preferably a synergistic effect.
  • the administration intervals thereof are 5 minutes, 10 minutes, 15 minutes, 20 minutes, 30 minutes, 45 minutes, 1 hour and 2 hours. It can be set to 3, 3, 4 hours, 5 hours, 6 hours, 7 hours, 8 hours, 9 hours, 10 hours, 11 hours, 12 hours, etc., but is not limited thereto.
  • the route of administration of the sickle-like erythrosis amelioration and / or preventive agent of the present invention includes oral administration including sublingual administration, intravenous administration by inhalation administration, injection, infusion, etc., suppository, gel agent, lotion agent, etc.
  • oral administration including sublingual administration, intravenous administration by inhalation administration, injection, infusion, etc., suppository, gel agent, lotion agent, etc.
  • Percutaneous administration by suppository parenteral administration such as administration by nasal gastrointestinal tract, nasal intestinal tract, gastric fistula tube or forced enteral nutrition using an intestinal fistula tube can be mentioned.
  • the dosage form of the sickle cell amelioration and / or preventive agent of the present invention can be appropriately determined according to the above-mentioned administration route, but is an injection, a drip, a tablet, a capsule, a fine granule, or a powder. , Liquids, liquids dissolved in syrups, poultices, capsules and the like.
  • Coating agents, lubricants, gliding agents, lubricants, flavoring agents, sweetening agents, solubilizing agents, solvents, gelling agents, nutrients, etc. can be added, and those skilled in the art aim at each specific component. It can be selected accordingly.
  • care must be taken not to make the aqueous solution alkaline in order to prevent decomposition of ALAs, and the aqueous solution becomes alkaline. If it does, it can be prevented from decomposing by removing oxygen.
  • the amount, frequency, and duration of administration of the improvement and / or preventive agent for sickle cell disease of the present invention vary depending on the age, weight, symptom, etc. of the sickle cell disease patient or the person who intends to prevent sickle cell disease.
  • the dose of ALAs is 0.01 mmol to 25 mmol / day, preferably 0.025 mmol to 7.5 mmol / day, and more preferably 0.075 mmol to 5. 5 mmol / day, more preferably 0.2 mmol to 2 mmol / day can be mentioned, and it is desirable to continuously ingest a low dose, particularly when used as a prophylactic agent.
  • the frequency of administration may be exemplified by administration once to a plurality of times a day or continuous administration by infusion or the like.
  • the duration of administration as an ameliorating or prophylactic agent can be determined by methods known to pharmacologists and clinicians in the art based on indicators of the status of sickle cell disease.
  • the red blood cells obtained by repeating this washing operation once more were diluted 200-fold with a cell culture medium (RPMI1640, 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin-Fungison cocktail), and the temperature was 37 ° C., 5% CO 2 , 21%. They were cultured under the conditions of O 2. This erythrocyte culture medium was used in an experiment within 5 days from the start of culturing.
  • a cell culture medium RPMI1640, 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin-Fungison cocktail
  • a smear was prepared by centrifuging 50 ml of the erythrocyte culture medium fixed using a cell collecting centrifuge at 500 rpm for 6 minutes. The smear was soaked in the May fatewald stain for 5 minutes, then soaked in the Giemsa stain for 25 minutes, the excess stain was washed with tap water, and the stain was dried with cold air using a dryer to prepare a May-Giemsa stain.
  • the May-Giemsa-stained specimen was observed at a magnification of 600 using an optical microscope, and the number of sickled red blood cells was counted.
  • the sickle cell formation rates of each group were compared, and the effect of 5-ALA hydrochloride on cultured erythrocyte sickle cell disease due to hypoxic exposure was investigated.
  • FIG. 1 shows a sample obtained by treating erythrocyte cells collected from the same SCD homomouse (No. 72) with 5-ALA hydrochloride at a concentration of 0 ⁇ M (negative control, left panel) or 50 ⁇ M (right panel) for 4 hours. An optical microscope image of a stained specimen obtained from the above is illustrated. Arrows indicate sickle cells. In the sample treated with 50 ⁇ M, a marked decrease in erythrocyte cells showing a sickle-like morphology was observed (Fig. 1).
  • FIG. 2 shows the effect of using 5-ALA hydrochloride and SFC together with respect to the sample collected from the SCD homomouse (No. 72) shown in FIG. It has been shown that the combined use of 0.16 ⁇ M and 0.4 ⁇ M SFC with 10 ⁇ M and 25 ⁇ M 5-ALA hydrochloride resulted in a remarkable enhancement of the sickling inhibitory effect.
  • FIG. 8 shows the SCD homomouse No. 1 to which physiological saline was administered.
  • An optical microscope image of a stained specimen obtained from 85 is illustrated. Arrows indicate sickle cells. The changes in the sickle cell rate of each SCD homomouse obtained from the stained specimens are shown in Table 2 and FIG. 9 below.
  • 5-ALA hydrochloride / SFC 50 / 3.9 mg / kg / day
  • 5-ALA hydrochloride 50 mg / kg / day
  • SFC 3.9 mg / kg / day
  • physiological saline 10 ⁇ l / g / day
  • 30 ⁇ l of blood was collected in the same manner as in Example 1 to prepare a blood smear. All the prepared smear specimens were stained with May-Giemsa in the same manner as in Example 2, and the ratio of sickle cells to total erythrocytes was measured. The sickle cell rate of each group was compared, and the effect of the combined use of 5-ALA hydrochloride and SFC on the sickle cell rate in vivo was examined.
  • Lactate dehydrogenase is one of the major enzymes of anaerobic glycolysis in the cytoplasm, and its blood concentration Is used as a marker of tissue damage.
  • blood LDH levels are known to increase in association with intravascular hemolysis, ischemia-reperfusion injury, and tissue necrosis. It is known that LDH concentration may increase chronically in SCD patients, and that LDH concentration increases remarkably at the time of acute onset of vascular occlusion.
  • Intravascular hemolysis in SCD patients also causes an increase in blood LDH concentration (Clinica Chimica Acta, 2016, vol. 458, pp. 99-102). Using the blood LDH concentration in SCD model mice as an index, the effect of 5-ALA hydrochloride on bleeding stress due to blood sampling in SCD patients was investigated.

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Abstract

本発明は５－アミノレブリン酸（ＡＬＡ）若しくはその誘導体又はそれらの塩を含む鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤およびこれを用いた鎌状赤血球症の改善及び／又は予防を提供する。

Description

鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤
　本発明は、鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤に関し、さらに詳しくは、５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）若しくはその誘導体又はそれらの塩を含む鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤およびこれを用いた鎌状赤血球症の改善及び／又は予防に関する。さらに、本発明は、５－ＡＬＡ若しくはその誘導体および金属含有化合物を含む鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤およびこれを用いた鎌状赤血球症の改善及び／又は予防に関する。
　鎌状赤血球症（Ｓｉｃｋｌｅ　Ｃｅｌｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ、ＳＣＤ）は、ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）のβ‐鎖上の、グルタミン酸がバリンに置換される１アミノ酸変異を伴う遺伝性の赤血球障害である。当該変異によって負電荷が失われ、疎水性が増強されることにより、ヘモグロビン（Ｈｂ）の２量体および４量体形成が異常となり、ＨｂＳの重合が誘導される。ＨｂＳが脱酸素化されると、ＨｂＳの凝集体は密度の高い重合体を形成し、赤血球を「鎌状」の形態に変形させる。この赤血球の変形が、ＳＣＤ患者に生じる様々な症状、すなわち、溶血性貧血、痛みを伴う血管閉塞、臓器機能不全および寿命の短縮等の原因である（非特許文献１）。
　例えば、鎌状赤血球が白血球、血小板および血管内皮に付着することにより、毛細血管細静脈における血管閉塞が引き起こされ、低酸素症が発生し、最終的には臓器を障害する。遊離Ｈｂおよびヘム、ハプトグロビンおよびヘモペキシンの捕捉剤が枯渇すると、血管壁内の炎症誘発性、付着促進性および凝固促進性環境が悪化する。最終的には血流が回復する際に虚血再灌流の傷害が起こり、より多くの活性酸素種（ROS）産生が誘導される（非特許文献１）。
　また、鎌状赤血球はシグナル伝達物質の活性化を誘導することで、酸化ストレスを増大させる。したがって、鎌状赤血球は血管内壁に付着するだけでなく、体内を循環する白血球および血小板を活性化することで更なる血管梗塞を誘導し、血管内壁に付着した白血球、血小板が鎌状赤血球を補足することとなる。また、鎌状赤血球の血管内壁への付着は、血管内壁細胞表面の付着性亢進性タンパク質および血液凝固促進性タンパク質の発現を誘導する。ＳＣＤ患者では、慢性的な血小板の活性化と凝集が観察されている（非特許文献１）。
　また、鎌状赤血球由来のヘムは、自然免疫系のＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）を活性化し、オキシダント産生、炎症反応、血管梗塞、虚血、および肺障害等の組織障害を引き起こす（非特許文献１）。
　これら鎌状赤血球の引き起こす様々な症状は、血流の低下を引き起こすことで、ＨｂＳの更なる脱酸素化および重合を引き起こし、赤血球の鎌状化、体液流の停滞、Ｈｂおよび遊離ヘムの放出、血管梗塞、炎症反応等を引き起こし、ＳＣＤ患者における多臓器不全および痛みを引き起こす。このように、ＳＣＤにおける様々な症状は互いに複雑に関連している（非特許文献１）。
　２０１５年時点において、４４０万人が鎌状赤血球症に罹患しており、さらに４億人が鎌状赤血球症の形質、すなわち、鎌状赤血球変異についてヘテロ接合性を有している（非特許文献２、３）。そして、１１４８００人が、鎌状赤血球症により死亡している（非特許文献４）。
　また、ＳＣＤ患者では上記症状に付随して出血が高率で生じることが知られており、脳出血、消化器官出血、眼球血症、肉眼的血尿、鼻出血、月経過多およびその他の出血症状を生じることが知られている。また、ＳＣＤ患者における出血事象は、より高い死亡リスクに関連することも明らかとなっている（非特許文献５）。
　鎌状赤血球症の唯一の根治療法は、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）もしくは遺伝子治療であるが、いずれも受けることができる患者は極めて限定されていることから、症状を改善、及び／又は予防するための様々な治療薬が開発されている。例えば、ＨｂＳの重合を抑制することでＨｂＦの発現を増強させる薬剤としてヒドロキシウレアが用いられている。しかしながら、ヒドロキシウレアの薬効は細胞または患者毎に一定でないため使用の際に慎重な経過観察を要する。同様の目的でＨＤＡＣ阻害剤も用いられているが、毒性を回避するために間欠的な投与が必要とされている。また、ＨｂＳの脱酸素化およびＨｂ濃度上昇を抑制することで鎌状化を抑制する薬剤として、一酸化炭素薬等が使用されている。しかしながら、これらＨｂと酸素の親和性を変更する薬剤には、酸素要求度の高い臓器、例えば脳や腎臓に対する副作用が懸念されている。また、ＳＣＤにおける虚血再灌流とこれに伴うＲＯＳ産生を抑制する薬剤として、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）等が用いられている。また、ＳＣＤにおける組織障害の拡大において重要な因子である炎症反応を抑制する薬剤の適用も検討されている。しかしながら、これらはＳＣＤ治療薬として未だ承認されていない（非特許文献１）。
　したがって、依然として、ＳＣＤの症状改善または予防のために更に有効な治療薬の開発が必要とされている。
Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２０１９，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．２，ｐｐ．１３９－１５８ Ｌａｎｃｅｔ．，２０１６，Ｖｏｌ．３８８，Ｎｏ．１００５３，ｐｐ．１５４５－１６０２ Ｌａｎｃｅｔ．，２０１５，Ｖｏｌ．３８６，Ｎｏ．９９９５，ｐｐ．７４３－８００ Ｌａｎｃｅｔ．，２０１６，Ｖｏｌ．３８８，Ｎｏ．１００５３，ｐｐ．１４５９－１５４４ Ｂｌｏｏｄ　ａｄｖａｎｃｅｓ．，２０２０，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．５，ｐｐ．７９３－８０２
　本発明の課題は、新たな鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤を提供することである。より詳細には、５－ＡＬＡ若しくはその誘導体又はそれらの塩を含む鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤を提供することである。
　本発明者等は、上記課題解決に向けて鋭意研究を重ねた結果、全く意外にも５－ＡＬＡがＳＣＤにおける鎌状赤血球の増加を抑制し、特に、低酸素状態における鎌状赤血球の増加を顕著に抑制することで、鎌状赤血球症を予防または改善することを見いだし、本発明を完成した。
　５－ＡＬＡは、細胞内のミトコンドリア内で産生されるヘム系化合物の共通前駆体である。５－ＡＬＡは特定の炎症性疾患に対して抗炎症作用を示すことなどが知られていたが、５－ＡＬＡが直接鎌状赤血球の増加を抑制し、ＳＣＤの症状を改善または予防し得ることは知られていなかった。
　したがって、本発明は新たに、鎌状赤血球症を予防または改善するための、５－ＡＬＡを含有する医薬およびその使用を提供するものである。
　すなわち、本発明は以下を提供する。
[項目１]
（１）下記式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 （式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す。）
で示される化合物又はその塩を含有する鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤。
[項目２]
　Ｒ１及びＲ２が水素原子であることを特徴とする、項目１に記載の鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤。
[項目３]
　さらに、一種又は二種以上の金属含有化合物を含有することを特徴とする項目１又は２記載の鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤。
[項目４]
　金属含有化合物が、鉄、マグネシウム、亜鉛、ニッケル、バナジウム、銅、クロム、モリブデン又はコバルトを含有する化合物であることを特徴とする項目３記載の鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤。
[項目５]
　金属含有化合物が、鉄、マグネシウム又は亜鉛を含有する化合物であることを特徴とする項目３記載の鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤。
[項目６]
　金属含有化合物が、鉄を含有する化合物であることを特徴とする項目３記載の鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤。
[項目７]
（１）下記式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す。）
で示される化合物又はその塩を、薬学的許容される賦形剤と共に投与することを含む、鎌状赤血球症の改善及び／又は予防方法。
　本発明の鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤によると、優れた鎌状赤血球症改善／予防効果を得ることができ、患者のＱＯＬを大きく改善することができる。
図１は、５－ＡＬＡ塩酸塩による、鎌状赤血球抑制効果を示す染色標本の光学顕微鏡像を示す図である。矢印は鎌状赤血球を示す。 図２は、５－ＡＬＡ塩酸塩または５－ＡＬＡ塩酸塩とクエン酸第一鉄ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ　Ｆｅｒｒｏｕｓ　Ｃｉｔｒａｔｅ、ＳＦＣ）の併用による、鎌状赤血球抑制効果を示すグラフである。 図３は、ＳＣＤホモマウスの赤血球数、ヘモグロビン値に対して５－ＡＬＡ塩酸塩とＳＦＣの併用が及ぼす影響（ｉｎ　ｖｉｖｏ投与試験）を調査する実験の概要を示す図である。 図４は、５－ＡＬＡ塩酸塩とＳＦＣの併用ｉｎ　ｖｉｖｏ投与による、鎌状赤血球抑制効果を示す染色標本の光学顕微鏡像を示す図である。矢印は鎌状赤血球を示す。 図５は、５－ＡＬＡ塩酸塩とＳＦＣの併用ｉｎ　ｖｉｖｏ投与による、鎌状赤血球抑制効果を示すグラフである。 図６は、ＳＣＤホモマウスへの低酸素暴露による生体内での赤血球鎌状化に対して５－ＡＬＡ塩酸塩とＳＦＣの併用が及ぼす影響を調査する実験の概要を示す図である。 図７は、５－ＡＬＡ塩酸塩とＳＦＣの併用投与により、低酸素誘発急性症状が抑制されたことを示す図である。 図８は、５－ＡＬＡ塩酸塩とＳＦＣの併用投与により、低酸素誘発による鎌状赤血球増加が抑制されたことを示す染色標本の光学顕微鏡像を示す図である。矢印は鎌状赤血球を示す。 図９は、５－ＡＬＡ塩酸塩とＳＦＣの併用投与により、低酸素誘発による鎌状赤血球増加が抑制されたことを示すグラフである。 図１０は、５－ＡＬＡ塩酸塩とＳＦＣの併用投与により、ＳＣＤマウスにおいて、通常酸素濃度状態における鎌状赤血球が減少することを示すグラフである。 図１１は、５－ＡＬＡ塩酸塩の投与により、採血による出血ストレスによるＳＣＤホモマウスの血中ＬＤＨ濃度上昇が抑制されたことを示すグラフである。
　（定義）
　本明細書において、複数の数値の範囲が示された場合、それら複数の範囲の任意の下限値および上限値の組み合わせからなる範囲も同様に意味する。
　（本発明の鎌形赤血球症の改善及び／又は予防剤の有効成分）
　本発明の鎌形赤血球症の改善及び／又は予防剤の有効成分として用いられる化合物は、式（Ｉ）で示される化合物又はその塩（以下、これらを総称して「ＡＬＡ類」ということもある）として例示することができる。δ－アミノレブリン酸とも呼ばれる５－ＡＬＡは、式（Ｉ）のＲ１及びＲ２が共に水素原子の場合であり、アミノ酸の１種である。５－ＡＬＡ誘導体としては、式（Ｉ）のＲ１が水素原子又はアシル基であり、式（Ｉ）のＲ２が水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基である、５－ＡＬＡ以外の化合物を挙げることができる。
　式（Ｉ）におけるアシル基としては、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル、オクタノイル、ベンジルカルボニル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１～８のアルカノイル基や、ベンゾイル、１－ナフトイル、２－ナフトイル基等の炭素数７～１４のアロイル基を挙げることができる。
　式（Ｉ）におけるアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１～８のアルキル基を挙げることができる。
　式（Ｉ）におけるシクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロドデシル、１－シクロヘキセニル基等の飽和、又は一部不飽和結合が存在してもよい、炭素数３～８のシクロアルキル基を挙げることができる。
　式（Ｉ）におけるアリール基としては、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル基等の炭素数６～１４のアリール基を挙げることができる。
　式（Ｉ）におけるアラルキル基としては、アリール部分は上記アリール基と同じ例示ができ、アルキル部分は上記アルキル基と同じ例示ができ、具体的には、ベンジル、フェネチル、フェニルプロピル、フェニルブチル、ベンズヒドリル、トリチル、ナフチルメチル、ナフチルエチル基等の炭素数７～１５のアラルキル基を挙げることができる。
　上記５－ＡＬＡ誘導体としては、Ｒ１が、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル基等である化合物や、上記Ｒ２が、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル基等である化合物が好ましく、上記Ｒ１とＲ２の組合せが、ホルミルとメチル、アセチルとメチル、プロピオニルとメチル、ブチリルとメチル、ホルミルとエチル、アセチルとエチル、プロピオニルとエチル、ブチリルとエチルの組合せである化合物などを好ましく挙げることができる。
　５－ＡＬＡ類は、生体内で式（Ｉ）の５－ＡＬＡ又はその誘導体の状態で有効成分として作用すればよく、投与する形態に応じて、溶解性を上げるための各種の塩、エステル、または生体内の酵素で分解されるプロドラッグ（前駆体）として投与すればよい。例えば、５－ＡＬＡ及びその誘導体の塩としては、薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩等を挙げることができる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩等の各無機酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の各有機酸付加塩を例示することができる。金属塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の各アルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等の各アルカリ土類金属塩、アルミニウム、亜鉛等の各金属塩を例示することができる。アンモニウム塩としては、アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等のアルキルアンモニウム塩等を例示することができる。有機アミン塩としては、トリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩、トルイジン塩等の各塩を例示することができる。なお、これらの塩は使用時において溶液としても用いることができる。
　以上のＡＬＡ類のうち、望ましいものは、５－ＡＬＡ、及び５－ＡＬＡメチルエステル、５－ＡＬＡエチルエステル、５－ＡＬＡプロピルエステル、５－ＡＬＡブチルエステル、５－ＡＬＡペンチルエステル等の各種エステル類、並びに、これらの塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩であり、ＡＬＡ塩酸塩、５－ＡＬＡリン酸塩を特に好適に例示することができる。
　上記ＡＬＡ類は、化学合成、微生物による生産、酵素による生産のいずれの公知の方法によって製造することができる。また、上記ＡＬＡ類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、またいずれかを単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
　本発明の鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤は、過剰症を生じない範囲で、さらに金属含有化合物を含有するものが好ましく、かかる金属含有化合物の金属部分としては、鉄、マグネシウム、亜鉛、ニッケル、バナジウム、コバルト、銅、クロム、モリブデンを挙げることができるが、鉄、マグネシウム、亜鉛が好ましく、中でも鉄を好適に例示することができる。
　上記ＡＬＡ類と金属含有化合物を併用することで、より低濃度のＡＬＡ類の使用でも、優れた鎌状赤血球症の改善及び／又は予防効果を得ることができる。
　上記鉄化合物としては、有機塩でも無機塩でもよく、無機塩としては、塩化第二鉄、三二酸化鉄、硫酸鉄、ピロリン酸第一鉄を挙げることができ、有機塩としては、カルボン酸塩、例えばヒドロキシカルボン酸塩である、クエン酸第一鉄、クエン酸鉄ナトリウム、クエン酸第一鉄ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ　Ｆｅｒｒｏｕｓ　Ｃｉｔｒａｔｅ、ＳＦＣ）、クエン酸鉄アンモニウム等のクエン酸塩や、ピロリン酸第二鉄、ヘム鉄、デキストラン鉄、乳酸鉄、グルコン酸第一鉄、ジエチレントリアミン五酢酸鉄ナトリウム、ジエチレントリアミン五酢酸鉄アンモニウム、エチレンジアミン四酢酸鉄ナトリウム、エチレンジアミン五酢酸鉄アンモニウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄ナトリウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄アンモニウム、フマル酸第一鉄、酢酸鉄、シュウ酸鉄、コハク酸第一鉄、コハク酸クエン酸鉄ナトリウム等の有機酸塩や、トリエチレンテトラアミン鉄、ラクトフェリン鉄、トランスフェリン鉄、鉄クロロフィリンナトリウム、フェリチン鉄、含糖酸化鉄、グリシン第一鉄硫酸塩を挙げることができる。
　上記マグネシウム化合物としては、クエン酸マグネシウム、安息香酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、酸化マグネシウム、塩化マグネシウム、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、ジエチレントリアミン五酢酸マグネシウムジアンモニウム、エチレンジアミン四酢酸マグネシウムジナトリウム、マグネシウムプロトポルフィリンを挙げることができる。
　上記亜鉛化合物としては、塩化亜鉛、酸化亜鉛、硝酸亜鉛、炭酸亜鉛、硫酸亜鉛、ジエチレントリアミン五酢酸亜鉛ジアンモニウム、エチレンジアミン四酢酸亜鉛ジナトリウム、亜鉛プロトポルフィリン、亜鉛含有酵母を挙げることができる。
　上記金属含有化合物は、それぞれ１種類又は２種類以上を用いることができ、金属含有化合物の投与量としては、５－ＡＬＡの投与量に対してモル比で０～１００倍であればよく、０．０１倍～１０倍が望ましく、０．１倍～８倍がより望ましい。
（本発明の改善及び／又は予防剤の投与方法）
　本発明の鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤に含有されるＡＬＡ類と金属含有化合物は、ＡＬＡ類と金属含有化合物とを含む組成物としても、あるいは、それぞれを単独で含む組成物としても投与することできる。ＡＬＡ類と金属含有化合物とをそれぞれ単独で含む組成物を用いる場合、これらを同時に投与してもよく、また、別々に投与してもよい。好ましくは、ＡＬＡ類と金属含有化合物との投与が相加的効果、好ましくは相乗的効果を奏することができるように組み合わせて投与することができる。ＡＬＡ類と金属含有化合物とをそれぞれ単独で含む組成物を別々に投与する場合、それらの投与間隔は、５分、１０分、１５分、２０分、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間等に設定できるが、これらに限定されない。
　本発明の鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤の投与経路としては、舌下投与も含む経口投与、あるいは吸入投与、注射、点滴等による静脈内投与、パップ剤、ゲル剤、ローション剤等による経皮投与、座薬、又は経鼻胃管、経鼻腸管、胃ろうチューブ若しくは腸ろうチューブを用いる強制的経腸栄養法による投与等の非経口投与などを挙げることができる。
（本発明の改善及び／又は予防剤の剤型）
　本発明の鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤の剤型としては、上記投与経路に応じて適宜決定することができるが、注射剤、点滴剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、散剤、液剤、シロップ等に溶解した水剤、パップ剤、座薬剤等を挙げることができる。
　本発明の鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤を調製するために、必要に応じて、薬理学的に許容し得る担体、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑走剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤、溶剤、ゲル化剤、栄養剤等を添加することができ、当業者は各具体的な成分を目的に応じて選択することができる。なお、本発明の鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤を水溶液として調製する場合には、ＡＬＡ類の分解を防ぐため、水溶液がアルカリ性とならないように留意する必要があり、アルカリ性となってしまう場合は、酸素を除去することによって分解を防ぐこともできる。
（本発明の改善及び／又は予防剤の投与量）
　本発明の鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤の投与の量・頻度・期間としては、鎌状赤血球症患者や鎌状赤血球症を予防しようとする者の年齢、体重、症状等により異なるが、ＡＬＡ類の投与量としては、５－ＡＬＡモル換算で、成人一人当たり、０．０１ｍｍｏｌ～２５ｍｍｏｌ／日、好ましくは０．０２５ｍｍｏｌ～７．５ｍｍｏｌ／日、より好ましくは０．０７５ｍｍｏｌ～５．５ｍｍｏｌ／日、さらに好ましくは０．２ｍｍｏｌ～２ｍｍｏｌ／日を挙げることができ、特に予防剤として用いる場合は、低容量を継続して摂取することが望ましい。投与頻度としては、一日一回～複数回の投与又は点滴等による連続的投与を例示することができる。改善剤または予防剤としての投与期間は、鎌状赤血球症の状態を示す指標に基づいて当該技術分野の薬理学者や臨床医が既知の方法により決定することができる。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
　ＳＣＤモデルマウスから採取した赤血球の培養
　８－２０週齢のＳＣＤモデルマウスを使用した。このマウスでは、ヒトＨＢＡ遺伝子、及びヒトＨＢＢ遺伝子がそれぞれマウスＨＢＡ遺伝子座位、マウスＨＢＢ遺伝子座位にノックインされており、ヒトＨＢＢ遺伝子にはＳＣＤの原因となるアミノ酸置換（Ｖａｌ６Ｇｌｕ）を引き起こす遺伝子変異（βＳ変異）が導入されている。更に、ヒトＨＢＧ遺伝子が導入されており、出生後のγグロビンからβグロビンへの発現切り替えがヒトと同様に起こるよう設計されている。そのため、βＳ変異をホモで持つＳＣＤモデルマウス（ＳＣＤホモマウス）はヒトＳＣＤと類似した症状を呈する。ＳＣＤホモマウスをイソフルランで麻酔した後、アニマルランセットを用いて顎骨後方の静脈から１００μｌの血液をＥＤＴＡ－２Ｎａコート済みの採血用チューブに回収した。チューブを軽くタッピングすることで凝固を防止した。回収した血液を１．５ｍｌチューブに移し、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間遠心した。上清を除去した後、沈殿している赤血球に１ｍｌのＰＢＳを加えて転倒混和し、細胞を洗浄した。この洗浄操作をもう１度繰り返して得られた赤血球を細胞培養液（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン－ファンギソンカクテル）で２００倍希釈し、３７℃、５％ＣＯ２、２１％Ｏ２の条件で培養した。この赤血球培養液を培養開始から５日以内に実験で使用した。
　ＳＣＤホモマウスから採取し、培養した赤血球の低酸素暴露による鎌状化に対して５－ＡＬＡ塩酸塩が及ぼす影響
　実施例１の赤血球培養液に５－ＡＬＡ塩酸塩を０、１０、２５、５０μＭとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２、２１％Ｏ２の条件で４時間培養した。その後、３７℃、５％ＣＯ２、４％Ｏ２の条件で１．５時間培養して赤血球の鎌状化を誘導した。培養終了後、パラホルムアルデヒドを終濃度が２％となるよう添加し、３７℃、５％ＣＯ２、４％Ｏ２の条件で１０分静置して赤血球を固定した。集細胞遠心装置を用いて固定した赤血球培養液５０ｍｌを５００ｒｐｍで６分間遠心し、塗抹標本を作製した。塗抹標本をメイグリュンワルド染色液に５分浸し、次にギムザ染色液に２５分浸した後、水道水で余分な染色液を洗浄し、ドライヤーで冷風乾燥させてメイ－ギムザ染色標本を作製した。光学顕微鏡を用いて６００倍でメイ－ギムザ染色標本を観察し、鎌状化している赤血球の数を計測した。各群の鎌状化率を比較し、低酸素暴露による培養赤血球鎌状化に対して５－ＡＬＡ塩酸塩が及ぼす影響を検討した。
　その結果、５－ＡＬＡ塩酸塩処理により鎌状形態を示す赤血球数の顕著な減少が観察された。図１に、同一のＳＣＤホモマウス（Ｎｏ．７２）から採取した赤血球細胞に対して、濃度０μＭ（陰性コントロール、左パネル）または５０μＭ（右パネル）の５－ＡＬＡ塩酸塩にて４時間処理した試料から得た染色標本の光学顕微鏡像を例示する。矢印は鎌状赤血球を示す。５０μＭで処理したサンプルでは、鎌状形態を示す赤血球細胞の顕著な減少が観察された（図１）。
　鎌状化している赤血球の数を計測して得られた各群の鎌状化率を算出したところ、５－ＡＬＡ塩酸塩で処理しなかった試料（０μＭ）に対して、それぞれ１０、２５、５０μＭの５－ＡＬＡ塩酸塩処理により、濃度依存的な鎌状化率の減少が観察された。図１で示したＳＣＤホモマウス（Ｎｏ．７２）から採取した試料から得られた鎌状化率データを図２に示す。ＳＦＣはクエン酸第一鉄ナトリウムを表すが、５－ＡＬＡ塩酸塩のみの処理によって、濃度依存的な鎌状化率の減少が得られた（図２）。
　ＳＣＤホモマウスから採取し、培養した赤血球の低酸素暴露による鎌状化に対して５－ＡＬＡ塩酸塩とクエン酸第一鉄ナトリウム（ＳＦＣ）の併用が及ぼす影響
　実施例１の赤血球培養液に５－ＡＬＡ塩酸塩／ＳＦＣを１０／０．０８、２５／０．２μＭとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２、２１％Ｏ２の条件で４時間培養した。その後、３７℃、５％ＣＯ２、４％Ｏ２の条件で１．５時間培養して赤血球の鎌状化を誘導した。培養終了後、実施例２と同様の方法で赤血球固定、メイ－ギムザ染色、および鎌状化赤血球数計測を実施した。各群の鎌状化率を比較し、低酸素暴露による培養赤血球鎌状化に対して５－ＡＬＡ塩酸塩とＳＦＣの併用が及ぼす影響を検討した。
　その結果、５－ＡＬＡ塩酸塩とＳＦＣを併用することにより、より低濃度の５－ＡＬＡ塩酸塩処理で優れた鎌状化抑制作用が得られることが観察された。図１で示したＳＣＤホモマウス（Ｎｏ．７２）から採取した試料に対して、５－ＡＬＡ塩酸塩とＳＦＣを併称した場合の効果を図２に示す。１０μＭ、２５μＭの５－ＡＬＡ塩酸塩に対して、それぞれ０．１６μＭ、０．４μＭのＳＦＣを併用することにより、顕著な鎌状化抑制作用の増強が得られたことが示されている。
　ＳＣＤホモマウスの赤血球数、ヘモグロビン値に対して５－ＡＬＡ塩酸塩とＳＦＣの併用が及ぼす影響（ｉｎ　ｖｉｖｏ投与試験）
　実施例１と同様の方法で８週齢のＳＣＤホモマウスから３０μｌの血液を採取し、自動血球計数装置を用いて赤血球数とヘモグロビン値を測定した。採血後、５－ＡＬＡ塩酸塩／ＳＦＣ　（２００／３１．４ｍｇ／ｋｇ／日）、または生理食塩水（１０μｌ／ｇ／日）を４週間投与した。投与終了後、実施例１と同様の方法で３０μｌの血液を採取し、自動血球計数装置を用いて赤血球数とヘモグロビン値を測定した。各群の投与前後の測定値を比較し、ＳＣＤホモマウスの赤血球数、ヘモグロビン値に対して５－ＡＬＡ塩酸塩とＳＦＣの併用投与が及ぼす影響を検討した。実験の概要を図３に図示する。
　実験の結果、５－ＡＬＡ塩酸塩とＳＦＣを４週間併用投与することにより、ＳＣＤホモマウスにおける赤血球数およびヘモグロビン値の減少が抑制され、逆にこれらの値の増加が観察されるとともに、鎌状細胞の割合の増加が抑制された。染色標本の光学顕微鏡像を図４に示す。矢印は鎌状赤血球を示す。また、赤血球数およびヘモグロビン値の変化を下記表１に、鎌状細胞の割合の変化を図５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ＳＣＤホモマウスの低酸素暴露による生体内赤血球鎌状化に対して５－ＡＬＡ塩酸塩とＳＦＣの併用が及ぼす影響
　８－１２週齢のＳＣＤホモマウスに５－ＡＬＡ塩酸塩／ＳＦＣ（２００／３１．４ｍｇ／ｋｇ／日）、または生理食塩水（１０μｌ／ｇ／日）を１５日間投与した。最終投与の直前に実施例１と同様の方法で３０μｌの血液を採取し、血液塗抹標本を作製した。最終投与の１時間後、各ＳＣＤホモマウスを６％Ｏ２に８時間暴露した。低酸素暴露後、直ちに実施例１と同様の方法で３０μｌの血液を採取し、血液塗抹標本を作製した。作製した塗抹標本は全て実施例２と同様の方法でメイ－ギムザ染色し、鎌状化赤血球数を計測した。各群の低酸素暴露前後の鎌状化率を比較し、低酸素暴露による生体内での赤血球鎌状化に対して５－ＡＬＡ塩酸塩とＳＦＣの併用が及ぼす影響を検討した。実験の概要を図６に図示する。
　実験の結果、５－ＡＬＡ塩酸塩とＳＦＣを１５日間併用投与することにより、ＳＣＤホモマウスを低酸素誘発処理した際の鎌状赤血球増加が大幅に抑制され、低酸素誘発急性症状が抑制されることが観察された。図７に示すように、生理食塩水投与群では、低酸素誘発後の８時間以内に３匹中２匹のＳＣＤホモマウス（Ｎｏ．１２および３０）が肺梗塞および急性腸管出血といった低酸素誘発急性症状を発症したのに対して、５－ＡＬＡ塩酸塩とＳＦＣを投与した群では、いずれのＳＣＤホモマウスも低酸素誘発急性症状を発症しなかった。各ＳＣＤホモマウスからの染色標本の光学顕微鏡像から、生理食塩水を投与したＳＣＤホモマウスにおける、低酸素誘発後の鎌状赤血球の大幅な増加が、５－ＡＬＡ塩酸塩とＳＦＣの併用投与によって顕著に抑制されていることが観察された。図８に生理食塩水を投与したＳＣＤホモマウスＮｏ．３０および５－ＡＬＡ塩酸塩とＳＦＣを併用投与したＳＣＤホモマウスＮｏ．８５から得た染色標本の光学顕微鏡像を例示する。矢印は鎌状赤血球を示す。染色標本から得られた各ＳＣＤホモマウスの鎌状細胞率の変化を下記表２および図９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　また、表２に示されるように、Ｎｏ．１２および３０は鎌状細胞率が大幅に上昇しており、５－ＡＬＡ塩酸塩とＳＦＣの併用投与は、低酸素状態による赤血球鎌状化を抑制することで、低酸素誘発急性症状を効果的に抑制することが判明した。
　通常酸素濃度におけるＳＣＤホモマウスの血中鎌状赤血球数に対する５－ＡＬＡ塩酸塩とＳＦＣの併用が及ぼす影響
　ＳＣＤホモマウスを用いて、通常酸素濃度における血中鎌状赤血球数に対して、５－ＡＬＡ塩酸塩とＳＦＣが及ぼす影響を試験した。
　１０－１６週齢のＳＣＤホモマウスに５－ＡＬＡ塩酸塩／ＳＦＣ（５０／３．９ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）、５－ＡＬＡ塩酸塩（５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）、ＳＦＣ（３．９ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）、または生理食塩水（１０μｌ／ｇ／ｄａｙ）を４週間投与した。最終投与日の翌日に実施例１と同様の方法で３０μｌの血液を採取し、血液塗抹標本を作製した。作製した塗抹標本は全て実施例２と同様の方法でメイ－ギムザ染色し、全赤血球に対する鎌状赤血球の割合を計測した。各群の鎌状赤血球率を比較し、生体内の鎌状赤血球率に対して５－ＡＬＡ塩酸塩とＳＦＣの併用が及ぼす影響を検討した。
　実験の結果、５－ＡＬＡ塩酸塩を投与した群では、生理食塩水を投与した群に比して、生体内の鎌状赤血球率が若干低下することが確認された。ＳＦＣを単独投与した群では、生体内の鎌状赤血球率にほとんど影響はなかった。一方、５－ＡＬＡ塩酸塩とＳＦＣを併用投与した群では、生体内の鎌状赤血球率の大幅な低下が観察され、生理食塩水を投与した群に比して統計学的に有意（Ｐ＜０．０５）な鎌状赤血球率低下作用が確認された（図１０）。
　ＳＣＤモデルマウスへの採血による出血ストレスに対して５－ＡＬＡ塩酸塩が及ぼす影響
　乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は細胞質における嫌気的解糖系の主要な酵素の一つであるが、その血中濃度は組織損傷のマーカーとして用いられている。ＳＣＤ患者では、血管内溶血、虚血再灌流による損傷、組織壊死などと関連して、血中ＬＤＨ濃度が上昇することが知られている。ＳＣＤ患者では慢性的にＬＤＨ濃度が上昇している場合がある他、血管閉塞の急性発症などの際にＬＤＨ濃度が著明に上昇することが知られている。また、ＳＣＤ患者における血管内溶血も、血中ＬＤＨ濃度の上昇を引き起こす（Ｃｌｉｎｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ，　２０１６，　ｖｏｌ．　４５８，　ｐｐ．９９－１０２）。ＳＣＤモデルマウスにおける血中ＬＤＨ濃度を指標とし、ＳＣＤ患者における採血による出血ストレスに対して５－ＡＬＡ塩酸塩が及ぼす影響を検討した。
　実施例１と同様の方法で９週齢のＳＣＤモデルマウスから２００μｌの血液を採取した直後に、５－ＡＬＡ塩酸塩／ＳＦＣ（５０／３．９ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水（１０μｌ／ｇ）を投与した。投与の３時間後に再び実施例１と同様の方法で５０μｌの血液を採取した。投与前と投与後に採取した血液中のＬＤＨ濃度を測定し、採血による出血ストレスに対して５－ＡＬＡ塩酸塩とＳＦＣの併用が及ぼす影響を評価した。
　実験の結果、生理食塩水を投与した野生型マウスおよびＳＣＤヘテロマウスでは、最初の血液採取で得られた血液（採血１）と、その３時間後の血液採取で得られた血液（採血２）におけるＬＤＨの濃度を比較すると、採血２の方がやや低いＬＤＨ濃度を有していた。これに対して、生理食塩水を投与したＳＣＤホモマウスでは、採血２において、ＬＤＨ濃度の著明な上昇が確認された。そして、当該ＬＤＨ濃度の著明な上昇は、５－ＡＬＡ塩酸塩、特に５－ＡＬＡ塩酸塩／ＳＦＣ（５０／３．９ｍｇ／ｋｇ）の投与により著明に抑制された（図１０）。
　本実験により、５－ＡＬＡ塩酸塩の投与により、ＳＣＤ患者における急性の採血による出血ストレスが抑制されることが判明した。５－ＡＬＡ塩酸塩、特に５－ＡＬＡ塩酸塩／ＳＦＣの投与により、ＳＣＤ患者における血管閉塞の急性発症や血管内溶血または出血ストレスによる組織損傷が抑制されると考えられる。

Claims (6)

  1. （１）下記式（Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す。）
    で示される化合物又はその塩を含有する鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤。
  2. 　Ｒ１及びＲ２が水素原子であることを特徴とする、請求項１に記載の鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤。
  3. 　さらに、一種又は二種以上の金属含有化合物を含有することを特徴とする請求項１又は２記載の鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤。
  4. 　金属含有化合物が、鉄、マグネシウム、亜鉛、ニッケル、バナジウム、銅、クロム、モリブデン又はコバルトを含有する化合物であることを特徴とする請求項３記載の鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤。
  5. 　金属含有化合物が、鉄、マグネシウム又は亜鉛を含有する化合物であることを特徴とする請求項３記載の鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤。
  6. 　金属含有化合物が、鉄を含有する化合物であることを特徴とする請求項３記載の鎌状赤血球症の改善及び／又は予防剤。
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