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WO2021014997A1 - 灌流液および灌流方法 - Google Patents

灌流液および灌流方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2021014997A1
WO2021014997A1 PCT/JP2020/026969 JP2020026969W WO2021014997A1 WO 2021014997 A1 WO2021014997 A1 WO 2021014997A1 JP 2020026969 W JP2020026969 W JP 2020026969W WO 2021014997 A1 WO2021014997 A1 WO 2021014997A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
perfusate
perfusion
solution
liver
organ
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/026969
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
正行 大原
周平 吉本
Original Assignee
株式会社Ｓｃｒｅｅｎホールディングス
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社Ｓｃｒｅｅｎホールディングス filed Critical 株式会社Ｓｃｒｅｅｎホールディングス
Priority to US17/624,760 priority Critical patent/US20220248665A1/en
Priority to EP20842935.7A priority patent/EP4005382A4/en
Publication of WO2021014997A1 publication Critical patent/WO2021014997A1/ja

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/10—Preservation of living parts
    • A01N1/12—Chemical aspects of preservation
    • A01N1/122—Preservation or perfusion media
    • A01N1/126—Physiologically active agents, e.g. antioxidants or nutrients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a perfusion solution used for perfusion treatment of an organ and a method for perfusing an organ using the perfusion solution.
  • a perfusion preservation method in which a perfusate solution (for example, UW solution) is perfused into a vascular network in an organ for the purpose of removing waste products in the organ.
  • a perfusate solution for example, UW solution
  • coagulation factors in the blood act to act as fibrin.
  • a paste-like thrombus containing a protein as a main component, a thrombus associated with platelet aggregation, or the like has already been formed or is newly formed.
  • the formation of a thrombus in a blood vessel increases the non-perfused area where the perfusate is not perfused. In this case, the suitability for the recipient after organ transplantation and the survival rate of the organ may decrease.
  • nattokinase is used to activate plasmin by suppressing the activation of coagulation factors in blood or by the action of a proteolytic enzyme belonging to a fibrinolytic factor.
  • Patent Documents 1 to 3 are premised on oral administration to patients, and are not directly applied to the preservation of organs used for transplantation or the like.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and even when an organ is stored for a long time in vitro or when a considerable amount of time has passed after the blood flow in the living body is stopped. It is an object of the present invention to provide a technique capable of dissolving a thrombus in a blood vessel of an organ or preventing the formation of a new thrombus.
  • the first invention of the present application is a perfusate used for perfusing an organ, which contains a biocompatible solution and a serine protease, and has an osmotic pressure ratio of 1 or more and 5 to physiological saline. It is as follows.
  • the second invention of the present invention is the perfusate of the first invention, wherein the biocompatible solution is at least one of a medium, an L-15 medium, an ETK solution, an HTK solution, a physiological saline solution, an infusion solution, and a UW solution. including.
  • the third invention of the present application is the perfusate of the first or second invention, wherein the serine protease contains at least one of plasmin, thrombin, urokinase, alteplase, streptokinase, granzyme B, and nattokinase as main components. To do.
  • the fourth invention of the present application is the perfusate of any one of the first to third inventions, and the concentration of the serine protease contained in the perfusate is 0.01 mg / mL or more and 100 mg / mL. It is as follows.
  • the fifth invention of the present application is a perfusion method in which a perfusate is perfused into an organ.
  • A) The first perfusate is allowed to flow into a blood vessel of the organ and is discharged to the outside of the organ via the inside of the blood vessel.
  • the second perfusate is allowed to flow into the blood vessel and discharged to the outside of the organ via the inside of the blood vessel.
  • the first perfusate and the second perfusate contain a biocompatible solution and a serine protease, respectively, and have an osmotic pressure ratio of 1 or more with respect to physiological saline. And it is 5 or less, and the concentration of the serine protease contained in the second perfusate is lower than the concentration of the serine protease contained in the first perfusate.
  • the sixth invention of the present application is the perfusion method of the fifth invention, wherein the biocompatible solution is at least one of a medium, an L-15 medium, an ETK solution, an HTK solution, a physiological saline solution, an infusion solution, and a UW solution. including.
  • the seventh invention of the present application is the perfusion method of the fifth or sixth invention, wherein the serine protease contains at least one of plasmin, thrombin, urokinase, alteplase, streptokinase, granzyme B, and nattokinase as a main component. To do.
  • the eighth invention of the present application is the perfusion method of any one of the fifth to seventh inventions, and the concentration of the serine protease contained in the second perfusate is 0.01 mg / mL or more and 100 mg. It is less than / mL.
  • the effect of serine protease can dissolve a thrombus in a blood vessel of an organ or prevent the formation of a new thrombus.
  • This improves adaptability to recipients and organ engraftment rates after organ transplantation.
  • the osmotic pressure of the perfusate becomes excessive and the water in the organ flows out to the outside, or the osmotic pressure of the perfusate becomes too small and the water flows into the organ from the outside, causing damage to the cells in the organ. , Can be suppressed.
  • the "donor” and “recipient” may be humans or non-human animals. That is, in the present application, the "organ” including the “liver” may be a human organ or a non-human animal organ.
  • non-human animals may be rodents including mice and rats, ungulates including pigs, goats, and sheep, non-human primates including chimpanzees, and other non-human mammals, and mammals. It may be an animal other than an animal.
  • the perfusion treatment is performed both when the target organ is in vivo and when it is excised in vitro.
  • FIG. 1 is a schematic view showing the configuration of the perfusion device 100.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of the storage container 10 described later.
  • This perfusion device 100 is a device for perfusing an organ such as a donor's liver before transplanting it to a recipient.
  • the perfusion device 100 supplies the perfusate to the organ for perfusion treatment.
  • the organ to be perfused is the liver 9 for transplantation.
  • the perfusion device 100 has a storage container 10 and a device main body 11.
  • the storage container 10 is an organ container capable of accommodating a storage solution for immersing an organ such as the liver 9 and an organ such as the liver 9 inside.
  • a cup-shaped (bottomed tubular) container is used as the storage container 10.
  • the perfusion device 100 has a reservoir 20, two (two systems) perfusate inflow unit 30, a perfusion fluid outflow unit 40, and a control unit 50.
  • the number of the perfusate inflow portion 30 and the perfusion fluid outflow portion 40 may be one (one system) or two (2), respectively, depending on the type of organ to be perfused and the perfusion conditions. System) may be used.
  • the reservoir 20 is a container for storing the perfusate.
  • a temperature adjusting mechanism 21 and a gas exchange mechanism 22 are provided around the reservoir 20. The composition of the perfusate will be described in detail later.
  • the temperature adjusting mechanism 21 adjusts the temperature of the perfusate stored in the reservoir 20.
  • the gas exchange mechanism 22 supplies a gas such as oxygen to the perfusate liquid stored in the reservoir 20 to dissolve the gas in the perfusate liquid.
  • the gas exchange mechanism 22 may be inserted into the inflow pipe 31 described later in the perfusate inflow unit 30.
  • the perfusate inflow section 30 supplies the perfusate from the reservoir 20 to the liver 9.
  • the two (two systems) perfusate inflow section 30 include an inflow pipe 31, a pump 32, a temperature control unit 33, a degassing unit 34, a pressure gauge 35, an inflow side connection pipe 36, and an inflow side cannula 37, respectively. ..
  • the pump 32, the temperature adjusting unit 33, the degassing unit 34, and the pressure gauge 35 are inserted into the inflow pipe 31.
  • One end of the inflow pipe 31 is connected to the reservoir 20.
  • the other end of the inflow pipe 31 is connected to the blood vessel of the liver 9 via the inflow side connection pipe 36 and the inflow side cannula 37 during the perfusion treatment.
  • the perfusate is supplied from the reservoir 20 to the blood vessels of the liver 9.
  • the pump 32 generates a flow of perfusate from the reservoir 20 to the liver 9 in the inflow pipe 31.
  • the pump 32 for example, a pump equipped with a brushless motor is used.
  • the temperature adjusting unit 33 adjusts the temperature of the perfusate in the inflow pipe 31.
  • the temperature adjusting unit 33 sets the perfusate in the inflow pipe 31 by immersing a part of the inflow pipe 31 in a liquid having a temperature set to, for example, 4 ° C, 20 ° C, 37 ° C, or the like. Adjust to the temperature.
  • the mechanism for adjusting the temperature of the perfusate may not be provided, or may be provided only in either the reservoir 20 or the inflow pipe 31.
  • the degassing unit 34 removes the gas component of the perfusate in the inflow pipe 31.
  • the pressure gauge 35 measures the pressure of the perfusate in the inflow pipe 31.
  • the inflow side connecting pipe 36 is a cylindrical member.
  • the inflow side connecting pipe 36 is fixed to the storage container 10 while penetrating the storage container 10.
  • One end of the inflow side connecting pipe 36 opens inside the storage container 10.
  • the other end of the inflow side connection pipe 36 opens to the outside of the storage container 10.
  • the portal vein is a large vein that supplies nutrient-rich venous blood to the liver 9 after circulating in the intestine and spleen.
  • the hepatic artery supplies oxygen-rich arterial blood from the aorta to the liver 9. These bloods merge in the liver 9, flow through the capillaries in the liver 9, and then return to the heart via the upper hepatic inferior vena cava (SH-IVC).
  • the inflow side cannula 37 is connected to each of the portal vein and hepatic artery of the donor liver 9. Further, the other end of each inflow side cannula 37 is connected to one end of the inflow side connection pipe 36 inside the storage container 10. Further, the inflow pipe 31 is connected to the reservoir 20 and the other end of the inflow side connection pipe 36 outside the storage container 10. It is also possible to directly connect the inflow pipe 31 of the present embodiment to the inflow side cannula 37 without passing through the inflow side connection pipe 36.
  • the perfusate is supplied to the liver 9 from the perfusate inflow section 30 of the two systems, one of the two inflow pipes 31 is connected to the portal vein of the liver 9, and the other.
  • the inflow pipe 31 is connected to the hepatic artery of the liver 9.
  • the hepatic artery is an arterial system, and the pressure of blood in the hepatic artery is high.
  • the portal vein is a venous system, and the pressure of blood in the portal vein is much smaller than the pressure of blood in the hepatic artery.
  • the pressure of the perfusate supplied to the hepatic artery and the pressure of the perfusate supplied to the portal vein can be individually set even during the perfusion treatment.
  • the perfusate outflow section 40 drains the perfusate from the liver 9.
  • the perfusate outflow section 40 includes an outflow pipe 41, an outflow side connection pipe 42, and an outflow side cannula 43.
  • One end of the outflow pipe 41 is connected to the reservoir 20.
  • the other end of the outflow pipe 41 is connected to the blood vessel of the liver 9 via the outflow side connecting pipe 42 and the outflow side cannula 43 during the perfusion treatment.
  • the outflow side connecting pipe 42 is a cylindrical member.
  • the outflow side connecting pipe 42 is fixed to the storage container 10 while penetrating the storage container 10.
  • One end of the outflow side connecting pipe 42 opens inside the storage container 10.
  • the other end of the outflow side connection pipe 42 opens to the outside of the storage container 10.
  • a cylindrical outflow side cannula 43 is connected to the subhepatic inferior vena cava (SH-IVC) or the inferior vena cava (IH-IVC) of the donor liver 9. Further, the other end of the outflow side cannula 43 is connected to one end of the outflow side connection pipe 42 inside the storage container 10. Further, the outflow pipe 41 is connected to the reservoir 20 and the other end of the outflow side connection pipe 42 outside the storage container 10. As a result, the perfusate discharged from the inferior vena cava (SH-IVC) or the inferior vena cava (IH-IVC) of the liver 9 is returned to the reservoir 20. It is also possible to directly connect the outflow pipe 41 of the present embodiment to the outflow side cannula 43 without going through the outflow side connection pipe 42.
  • the perfusate stored in the reservoir 20 is supplied to the portal vein and hepatic artery of the liver 9 via the perfusate inflow portion 30 by the power of the pump 32, and merges in the liver 9 to enter the liver 9. After flowing through the capillaries of the liver, it is discharged from the inferior vena cava (SH-IVC) or the inferior vena cava (IH-IVC), and is returned to the reservoir 20 via the perfusate outflow section 40.
  • the outflow pipe 41 may be further provided with a pump for generating a flow of perfusate from the liver 9 to the reservoir 20.
  • the perfusion device 100 of the present embodiment has a configuration in which the perfusate discharged from the liver 9 is refluxed to the reservoir 20, but the present invention is not limited to this.
  • the perfusate drained from the liver 9 may not be refluxed to the reservoir 20 and may be discarded or stored in another container.
  • Each part of the reservoir 20, the perfusate inflow part 30, and the perfusate outflow part 40 may be appropriately provided with a measuring unit for detecting pH and a specific component. Further, a flow meter, an electromagnetic valve for controlling communication, or the like may be inserted in the inflow pipe 31 and the outflow pipe 41.
  • the control unit 50 is a part for controlling the operation of each part in the perfusion device 100.
  • the control unit 50 is composed of, for example, a computer having an arithmetic processing unit 51 such as a CPU, a memory 52 such as a RAM, and a storage unit 53 such as a hard disk drive.
  • composition of perfusate Next, the composition of the perfusion solution used for the perfusion treatment according to the embodiment of the present invention will be described in detail.
  • the perfusate according to one embodiment of the present invention is mainly prepared by adding a serine protease to a physiologically active or biocompatible aqueous solution or electrolyte solution.
  • a physiologically active or biocompatible aqueous solution or electrolyte solution will be referred to as a "biocompatible solution”.
  • the biocompatible solution for example, a commercially available L-15 medium is used.
  • a medium, an ETK solution, an HTK solution, a physiological saline solution, an infusion solution, a UW solution, or a combination thereof may be used.
  • Nattokinase is used as the main component of the serine protease of this embodiment.
  • Bacillus natto which is a type of Bacillus subtilis present in natto, is known to produce nattokinase, which is a proteolytic enzyme.
  • nattokinase has an effect of decomposing fibrin, which is a main component of thrombus, in the living body, and that ingestion of nattokinase improves blood circulation in the living body.
  • nattokinase is derived from food and is easy to extract, it can be introduced at low cost.
  • serine protease may be plasmin, thrombin, urokinase, alteplase, streptokinase, granzyme B, or a mixture thereof. That is, the serine protease may be mainly composed of at least one of plasmin, thrombin, urokinase,reteplase, streptokinase, granzyme B, and nattokinase.
  • oxygen carrier to the perfusate.
  • oxygen carriers that can be used in the present invention include erythrocytes or artificial erythrocytes.
  • the erythrocytes added to the perfusate of the present invention are preferably erythrocytes of a blood type that can be transfused to the donor or recipient, and more preferably erythrocytes derived from the donor or recipient.
  • the artificial erythrocyte to be added to the perfusate of the present invention may be a molecule having a function of carrying oxygen, and examples thereof include perfluorocarbon and hemoglobin endoplasmic reticulum.
  • plasma or serum may be added to the perfusate.
  • the osmotic pressure ratio of the perfusate of the present embodiment to the physiological saline is adjusted to be 1 or more and 5 or less.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of verifying the effect of using such a perfusate.
  • a perfusate prepared by adding nattokinase and "12.5% human serum albumin" to L-15 medium, which is a biocompatible solution is contained in blood taken from the body of a pig.
  • the results of verifying the solubility of the thrombus when added to the thrombus are shown.
  • the horizontal axis shows the time elapsed from the time when the perfusate was added to the thrombus
  • the vertical axis shows the dissolution rate of the thrombus.
  • the concentration of nattokinase contained in the perfusate is verified by selecting 7 patterns from the range of 0.025 to 250 mg / mL.
  • the osmotic pressure ratio of the perfusate to physiological saline (osmotic pressure is 280 to 299 mmol / kg) is about 3.
  • the dissolution rate of the thrombus increases as time passes from the time when the perfusate is added to the thrombus, and reaches about 60% when 60 minutes have passed. Was confirmed. It is considered that this is because serine proteases such as nattokinase act to selectively hydrolyze (cleave) peptide bonds in which a large number of amino acids are condensed with each other in a protein which is a main component of thrombus.
  • FIGS. 4 and 5 are graphs showing the results of verifying the relationship between the concentration of serine protease contained in the above-mentioned perfusate and the lysis rate of thrombus, respectively.
  • the results of verifying the solubilization rate of the thrombus when added to each of the thrombi contained in the blood taken out from the pig's body are shown. In the graphs of FIGS.
  • FIG. 4 shows the horizontal axis shows the concentration of serine protease contained in the perfusate, and the vertical axis shows the lysis rate of thrombus. Further, in FIG. 5, the verification results of FIG. 4 are displayed so that the memories on the horizontal axis are evenly spaced.
  • the osmotic pressure ratio of the perfusate to physiological saline (osmotic pressure is 280 to 299 mmol / kg) is about 3.
  • FIGS. 4 and 5 show the results of verifying the solubilization rate of the thrombus 15 minutes after each of the seven types of perfusate was added to the thrombus.
  • the concentration of nattokinase contained in the perfusate is about 100 mg / mL or less, the lysis rate of thrombus generally increases as the concentration of nattokinase increases, and the concentration of nattokinase is 100 mg. It was confirmed that when it exceeds about / mL, the solubilization rate of thrombus decreases. On the other hand, it was confirmed that the solubilization rate of thrombus was maintained to some extent even when the concentration of nattokinase contained in the perfusate was as low as about 0.01 mg / mL to about 0.1 mg / mL. That is, it is desirable that the concentration of serine protease contained in the perfusate is set to about 0.01 mg / mL or more and about 100 mg / mL or less.
  • FIG. 6 is a flowchart showing the flow of the liver 9 excision operation and the perfusion treatment step.
  • FIG. 7 is a schematic view showing the configuration of the simple perfusion device 90 described later.
  • FIG. 8 is a flowchart showing the flow of the liver 9 transplant operation and the perfusion treatment step. As shown below, the perfusion treatment is roughly classified into a "cleaning step (flash)", a "perfusion preservation step” and a "rinsing step".
  • first perfusate and second perfusate are used as the perfusate.
  • the first perfusate and the second perfusate each contain a biocompatible solution and a serine protease, and are adjusted so that the osmotic pressure ratio to physiological saline is 1 or more and 5 or less, respectively.
  • the concentration of serine protease contained in the second perfusate is adjusted to be 0.01 mg / mL or more and 100 mg / mL or less, and lower than the concentration of serine protease contained in the first perfusate. ing.
  • the concentration of serine protease contained in the first perfusate may be slightly higher than 100 mg / mL.
  • the portal vein and the hepatic artery of the liver 9 are cut in the abdominal cavity of the donor, and one end of the inflow side cannula 37 is connected to each. Further, in the abdominal cavity of the donor, the inferior vena cava (SH-IVC) or the inferior vena cava (IH-IVC) of the liver 9 is cut and one end of the outflow side cannula 43 is connected (step S101).
  • SH-IVC superior vena cava
  • IH-IVC inferior vena cava
  • the perfusion device 100 is driven while storing the first perfusate in the reservoir 20, so that the first perfusate flows into the portal vein and the hepatic artery of the liver 9.
  • the first perfusate supplied to the portal vein and hepatic artery merges in the liver 9 and flows through the capillaries in the liver 9, and then the inferior vena cava (SH-IVC) or the inferior vena cava.
  • step S102 It is discharged from the large vein (IH-IVC) and returned to the reservoir 20 via the perfusate outflow section 40 (step S102).
  • This process is commonly referred to as a "cleaning process (flash)".
  • flash cleaning process
  • the first perfusate having a high concentration of serine protease flows in the blood vessel, so that waste products and the like in the blood vessel are sufficiently removed and washed, and the thrombus already formed in the blood vessel is dissolved. The formation of new blood clots is prevented.
  • the first perfusate discharged from the inferior vena cava (SH-IVC) or the inferior vena cava (IH-IVC) is discarded at the tip via the outflow side cannula 43 and the outflow pipe 41.
  • it may be stored in another container.
  • it is desirable to discard the first perfusate immediately after it begins to be excreted from the inferior vena cava (SH-IVC) or the inferior vena cava (IH-IVC).
  • step S104 the drive of the perfusion device 100 and the supply of the first perfusion solution are stopped, and the "cleaning step (flash)" is completed. Then, the connection between the inflow side cannula 37 and the inflow pipe 31 and the connection between the outflow side cannula 43 and the outflow pipe 41 are disconnected, and the liver 9 is housed in the storage container 10 (step S104).
  • the inflow side cannula 37 is connected to one end of the inflow side connection pipe 36 fixed to the storage container 10, and the other end of the inflow side connection pipe 36 is connected to the inflow pipe 31.
  • the outflow side cannula 43 is connected to one end of the outflow side connection pipe 42 fixed to the storage container 10, and the other end of the outflow side connection pipe 42 is connected to the outflow side pipe 41.
  • the perfusion device 100 is driven while storing the second perfusate in the reservoir 20, so that the second perfusate flows into the portal vein and the hepatic artery of the liver 9.
  • the second perfusate supplied to the portal vein and hepatic artery merges in the liver 9 and flows through the capillaries in the liver 9, and then the inferior vena cava (SH-IVC) or the inferior vena cava. It is drained from the large vein (IH-IVC) and returned to the reservoir 20 via the perfusate outflow section 40 (step S105). This step is commonly referred to as the "perfusion preservation step".
  • the second perfusate flows in the blood vessel, so that the thrombus already formed in the blood vessel is dissolved and the formation of a new thrombus is prevented.
  • the suitability and engraftment rate of liver 9 after transplantation to the recipient are improved. This completes the surgery to remove the liver 9 from the donor.
  • the procedure normally performed in the procedure for removing the liver 9 for transplantation from the donor can be appropriately performed by the surgeon or the like as necessary.
  • Treatment and the like can be appropriately performed as needed.
  • components other than the above may be added to the first perfusate and the second perfusate, respectively.
  • nutrients for activating cells in the liver 9 may be further added to the second perfusate.
  • perfusion is performed by the perfusion device 100 until the start of transportation to the recipient side. After that, when transporting to the recipient side, the liver 9 can be transported while simply perfusing using the simple perfusion device 90 as shown in FIG. 7. In this way, the thrombus in the blood vessel of the liver 9 can be dissolved and the formation of a new thrombus can be prevented even during transportation. In addition, if there is time after the liver 9 arrives at the hospital or operating room on the recipient side until the transplant operation to the recipient, or if it is necessary to restore the function of the liver 9 by perfusion, the perfusion device 100 is again used. Perfusion by.
  • the simple perfusion device 90 includes a bag reservoir 91, an inflow pipe 92 connecting the bag reservoir 91 and the inflow side connection pipe 36, an air trap 93, a pressure gauge 94, and a flow meter. It has 95, a waste liquid tank 96, and a discharge pipe 97 that connects the outflow side connection pipe 42 and the waste liquid tank 96.
  • the air trap 93, the pressure gauge 94, and the flow meter 95 are inserted in the inflow pipe 92.
  • the bag reservoir 91 is a drip bag type container filled with a perfusate (second perfusate).
  • a perfusate second perfusate
  • the second perfusate that has flowed into the liver 9 from the inflow side cannula 37 also passes through the liver 9 and from the outflow side cannula 43 via the outflow side connection pipe 42 and the discharge pipe 97 to the waste liquid tank 96. Is discharged to.
  • the waste liquid tank 96 is preferably arranged below the storage container 10.
  • the flow of the liver 9 transplant operation and the perfusion treatment step will be described with reference to FIG. As shown in FIG. 8, first, the supply of the second perfusion solution is stopped, and the "perfusion preservation step" is completed. Then, the connection between the inflow side cannula 37 and the inflow side connection pipe 36 and the connection between the outflow side cannula 43 and the outflow side connection pipe 42 are disconnected, and the liver 9 is taken out from the storage container 10 and moved to the transplantation position of the recipient. (Step S201).
  • the inflow side cannula 37 and the inflow pipe 31 are directly connected. Further, the outflow side cannula 43 and the outflow pipe 41 are directly connected. Then, the perfusion device 100 is driven while storing the rinse solution in the reservoir 20 to allow the rinse solution to flow into the portal vein and the hepatic artery of the liver 9 (step S202).
  • This process is commonly referred to as the "rinse process".
  • the rinse solution is different from the above-mentioned first perfusate and second perfusate.
  • the rinsing liquid a liquid to which no proteolytic enzyme is added or to which an enzyme inactivating agent is added is used.
  • a perfusate containing no serine protease is used as the rinse solution.
  • a reducing agent for reducing damage to vascular endothelial cells may be added to the rinse solution.
  • the rinse fluid supplied to the portal vein and hepatic artery merges in the liver 9 and flows through the capillaries in the liver 9, and then the inferior vena cava (SH-IVC) or the inferior vena cava (IH-). It is discharged from IVC) and returned to the reservoir 20 via the perfusate outflow section 40.
  • the first perfusate and the second perfusate remaining in the blood vessel are removed.
  • liver 9's suitability for recipients and engraftment rate are further improved.
  • the "rinse step" may be omitted.
  • each blood vessel of the liver 9 in which the inflow side cannula 37 and the outflow side cannula 43 are not inserted is anastomosed with the corresponding blood vessel of the recipient (step S203).
  • the drive of the perfusion device 100 and the supply of the rinsing liquid are stopped, and the "rinsing process" is completed.
  • the inflow side cannula 37 and the outflow side cannula 43 are removed from the liver 9 (step S204).
  • the blood vessels to which the inflow side cannula 37 and the outflow side cannula 43 are connected are anastomosed with the corresponding blood vessels of the recipient (step S205). This completes the liver 9 transplant operation to the recipient.
  • the procedure normally performed in the procedure for transplanting the liver 9 for transplantation to the recipient can be appropriately performed by the surgeon or the like as necessary.
  • connective tissue removal, vascular detachment, temporary ligation or clamping of blood vessels for vascular amputation, blockage and cleavage of bile ducts, application of blood anticoagulants to liver 9 for transplantation, hemostasis at surgical sites. Etc. can be appropriately performed as needed.
  • the perfusate was supplied from both the portal vein and the hepatic artery.
  • the inflow blood flow into the liver 9 is about 30% in the hepatic artery, which is a feeding blood vessel of the liver 9, and about 70% in the portal vein, which is a functional blood vessel of the liver 9.
  • the perfusate is supplied only to the hepatic artery, the flow rate of the perfusate that can be supplied to the liver 9 is reduced, and a thrombus is likely to occur on the portal vein side.
  • the perfusate it is preferable to supply the perfusate to both the hepatic artery and the portal vein during the perfusion treatment. Therefore, the condition of the liver 9 can be improved by supplying the perfusate to the liver 9 through the two perfusate inflow routes as in the above-described embodiment.
  • oxygen is added to at least the perfusate supplied to the hepatic artery.
  • the reservoir 20 is provided with the gas exchange mechanism 22 as in the above-described embodiment (see FIG. 1), oxygen can be added to the perfusate in the reservoir 20. Therefore, by preparing two perfusate inflow routes as in the example of FIG. 1, oxygenated perfusate is supplied to both the hepatic artery and the portal vein.
  • the present invention is not limited to this.
  • the reservoir 20 may not have a gas exchange mechanism and may have a mechanism for adding oxygen in the middle of the perfusate inflow route connected to each of the hepatic artery and the portal vein.
  • the mechanism for adding oxygen to the perfusate may be provided in only one of the perfusate inflow route connected to the hepatic artery and the perfusate inflow route connected to the portal vein, or both. May be provided.
  • the perfusate having the same amount of oxygen added is supplied to the hepatic artery and the portal vein.
  • a mechanism for adding oxygen is provided in the middle of the perfusate inflow route, the amount of oxygen added to the perfusate supplied to the hepatic artery and the amount of oxygen added to the perfusate supplied to the portal vein are set separately. It becomes possible.
  • the size of the entire perfusion device increases. Therefore, in the example of FIG. 1, there is only one perfusate outflow route.
  • the blood vessels that connect to the perfusate outflow pathway are the inferior vena cava (SH-IVC) or the inferior vena cava (IH-IVC). Since these veins are part of the same vein, even if only one of them is connected to the perfusate outflow pathway, the efficiency of perfusate drainage is lower than when both are connected to the perfusate outflow pathway. Is few. Therefore, as in the example of FIG.
  • the condition of the liver 9 is improved.
  • the perfusate inflow route and the perfusate outflow route may be one or two, respectively.
  • the perfusate inflow route and the perfusate outflow route may be three or more, respectively.
  • the organ to be preserved is the liver, but the present invention is not limited to this.
  • the organ to be preserved may be another organ such as a kidney.
  • the present invention relates to a perfusate used for organ perfusion, as long as the perfusate contains a biocompatible solution and a serine protease and has an osmotic pressure ratio of 1 or more and 5 or less to saline. Good.
  • the present invention relates to a perfusion method for perfusing an organ with a perfusate
  • the perfusion method a) causes the first perfusate to flow into the blood vessel of the organ and is discharged to the outside of the organ via the inside of the blood vessel.
  • the second perfusate is allowed to flow into the blood vessel and discharged to the outside of the organ via the inside of the blood vessel, and the organ is preserved.
  • the first perfusate and the second perfusate contain a biocompatible solution and a serine protease, respectively, and have an osmotic pressure ratio of 1 or more and 5 or less with respect to physiological saline, respectively. 2
  • the concentration of the serine protease contained in the perfusate may be set lower than the concentration of the serine protease contained in the first perfusate.

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Abstract

この灌流方法は、ａ）臓器の血管内へ第１灌流液を流入させ、血管内を経由して臓器の外部へ排出させることにより、血管内を洗浄する洗浄工程と、ｂ）工程ａ）の後、血管内へ第２灌流液を流入させ、血管内を経由して臓器の外部へ排出させつつ、臓器を保存する保存工程とを有する。第１灌流液および第２灌流液はそれぞれ、生体適合性溶液と、セリンプロテアーゼとを含み、生理食塩水に対する浸透圧比が１以上かつ５以下である。また、第２灌流液に含まれるセリンプロテアーゼの濃度は、第１灌流液に含まれるセリンプロテアーゼの濃度よりも低く、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上かつ１００ｍｇ／ｍＬ以下である。これにより、臓器の灌流処理時に、臓器の血管内の血栓を溶解し、または新たな血栓の形成を予防できる。

Description

灌流液および灌流方法
　本発明は、臓器の灌流処理に用いられる灌流液と、当該灌流液を用いた臓器の灌流方法とに関する。
　肝臓移植等の移植手術では、ドナーの臓器をレシピエントへ移植するまでの間、一時的に臓器を保存する。臓器を移植可能な状態で保存するため、種々の方法が開発されている。例えば、臓器内の老廃物の除去を目的として、臓器内血管網に灌流液（例えばＵＷ液等）を灌流させる灌流保存法が知られている。
　しかしながら、生体外で臓器を長時間保存する場合や、生体内での血流が停止した後に相当の時間が経過してしまっている場合には、血液中の凝固系因子が作用し、フィブリンと呼ばれるタンパク質を主成分とする糊状の血栓または血小板の凝集に伴う血栓等が既に形成され、または新たに形成される虞がある。血管内に血栓が形成されると、灌流液が灌流されない不灌流領域が増加する。この場合、臓器移植後のレシピエントへの適合性および臓器の生着率が低下する虞がある。
　一方、例えば、特許文献１～３には、ナットウキナーゼを用いて、血液中の凝固系因子の活性化を抑制することによって、または線溶系因子に属するタンパク質分解酵素の作用によりプラスミンを活性化させることによって、血栓を溶解し、または新たな血栓の形成を予防する技術が開示されている。
特開２０１６－０１３９７６号公報 特開２０１６－５０４２８７号公報 特開２０１７－１１９６８３号公報
　しかしながら、特許文献１～３に開示された方法は、患者に対する経口投与を前提としているものであり、移植等に用いる臓器の保存に直接適用されるものではない。
　本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、生体外で臓器を長時間保存する場合や、生体内での血流が停止した後に相当の時間が経過してしまっている場合でも、臓器の血管内の血栓を溶解し、または新たな血栓の形成を予防できる技術を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するため、本願の第１発明は、臓器の灌流に用いられる灌流液であって、生体適合性溶液と、セリンプロテアーゼと、を含み、生理食塩水に対する浸透圧比が１以上かつ５以下である。
　本願の第２発明は、第１発明の灌流液であって、前記生体適合性溶液は、培地、Ｌ－１５培地、ＥＴＫ液、ＨＴＫ液、生理食塩水、輸液、およびＵＷ液の少なくとも１つを含む。
　本願の第３発明は、第１発明または第２発明の灌流液であって、前記セリンプロテアーゼは、プラスミン、トロンビン、ウロキナーゼ、アルテプラーゼ、ストレプトキナーゼ、グランザイムＢ、およびナットウキナーゼの少なくとも１つを主成分とする。
　本願の第４発明は、第１発明から第３発明までのいずれか１発明の灌流液であって、前記灌流液に含まれる前記セリンプロテアーゼの濃度は、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上かつ１００ｍｇ／ｍＬ以下である。
　本願の第５発明は、臓器に灌流液を灌流させる灌流方法であって、ａ）前記臓器の血管内へ第１灌流液を流入させ、前記血管内を経由して前記臓器の外部へ排出させることにより、前記血管内を洗浄する洗浄工程と、ｂ）前記工程ａ）の後、前記血管内へ前記第２灌流液を流入させ、前記血管内を経由して前記臓器の外部へ排出させつつ、前記臓器を保存する保存工程と、を有し、前記第１灌流液および前記第２灌流液は、それぞれ生体適合性溶液と、セリンプロテアーゼと、を含み、生理食塩水に対する浸透圧比が１以上かつ５以下であり、かつ、前記第２灌流液に含まれる前記セリンプロテアーゼの濃度は、前記第１灌流液に含まれる前記セリンプロテアーゼの濃度よりも低い。
　本願の第６発明は、第５発明の灌流方法であって、前記生体適合性溶液は、培地、Ｌ－１５培地、ＥＴＫ液、ＨＴＫ液、生理食塩水、輸液、およびＵＷ液の少なくとも１つを含む。
　本願の第７発明は、第５発明または第６発明の灌流方法であって、前記セリンプロテアーゼは、プラスミン、トロンビン、ウロキナーゼ、アルテプラーゼ、ストレプトキナーゼ、グランザイムＢ、およびナットウキナーゼの少なくとも１つを主成分とする。
　本願の第８発明は、第５発明から第７発明までのいずれか１発明の灌流方法であって、　前記第２灌流液に含まれる前記セリンプロテアーゼの濃度は、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上かつ１００ｍｇ／ｍＬ以下である。
　本願の第１発明から第８発明によれば、セリンプロテアーゼの効果により、臓器の血管内の血栓を溶解し、または新たな血栓の形成を予防することができる。これにより、臓器移植後のレシピエントへの適合性および臓器の生着率が向上する。また、灌流液の浸透圧が過大となり臓器内の水分が外部へ流出することによる、または灌流液の浸透圧が過小となり臓器内へ水分が外部から流入することによる、臓器内の細胞の損傷を、抑制することができる。
灌流装置の構成を示した概略図である。 保存容器の横断面図である。 灌流液を用いることによる効果を検証した結果を示すグラフである。 灌流液に含まれるセリンプロテアーゼの濃度と血栓の溶解率との関係を検証した結果を示すグラフである。 灌流液に含まれるセリンプロテアーゼの濃度と血栓の溶解率との関係を検証した結果を示すグラフである。 肝臓の摘出手術の流れおよび灌流処理工程を示したフローチャートである。 簡易灌流装置の構成を示した概略図である。 肝臓の移植手術の流れおよび灌流処理工程を示したフローチャートである。
　以下、本発明の一実施形態として、ドナーの肝臓等の臓器を、レシピエントへ移植するまでの間に行う灌流処理を例にあげて、図面を参照しつつ説明する。なお、本願において「ドナー」および「レシピエント」は、ヒトであってもよいし、非ヒト動物であってもよい。すなわち、本願において、「肝臓」を含む「臓器」は、ヒトの臓器であってもよいし、非ヒト動物の臓器であってもよい。また、非ヒト動物は、マウスおよびラットを含む齧歯類、ブタ、ヤギ、およびヒツジを含む有蹄類、チンパンジーを含む非ヒト霊長類、その他の非ヒトほ乳動物であってもよいし、ほ乳動物以外の動物であってもよい。また、以下において灌流処理は、対象とする臓器が生体内にある場合、および生体外に摘出された場合の双方で行われる。
　＜１．一実施形態＞
　＜１－１．灌流装置の構成＞
　まず、本発明の一実施形態に係る灌流処理に用いられる灌流装置１００について、図１を参照しつつ説明する。図１は、灌流装置１００の構成を示した概略図である。図２は、後述する保存容器１０の断面図である。
　この灌流装置１００は、ドナーの肝臓等の臓器を、レシピエントへ移植するまでの間に灌流処理するための装置である。灌流装置１００は、当該臓器に灌流液を供給して灌流処理する。以下では、灌流処理の対象となる臓器が移植用の肝臓９である場合について、説明を行う。
　図１に示すように、灌流装置１００は、保存容器１０と、装置本体１１とを有する。
　灌流装置１００によって灌流処理が行われる際に、肝臓９は、保存容器１０内に収容される。保存容器１０は、肝臓９等の臓器を浸漬するための保存液と、肝臓９等の臓器とを内部に収容することができる臓器収容器である。保存容器１０には、例えば、カップ状（有底筒状）の容器が用いられる。
　図１に示すように、灌流装置１００は、リザーバ２０、２つ（２系統）の灌流液流入部３０、灌流液流出部４０、および制御部５０を有する。なお、灌流液流入部３０および灌流液流出部４０の数はそれぞれ、灌流対象となる臓器の種類や、灌流条件に応じて、１つ（１系統）であってもよいし、２つ（２系統）であってもよい。
　リザーバ２０は、灌流液を貯留する容器である。リザーバ２０の周囲には、温度調整機構２１およびガス交換機構２２が備えられる。灌流液の構成については、詳細を後述する。
　温度調整機構２１は、リザーバ２０内に貯留される灌流液の温度を調整する。ガス交換機構２２は、リザーバ２０に貯留される灌流液に、酸素等の気体を供給して、当該気体を灌流液に溶解させる。なお、ガス交換機構２２は、灌流液流入部３０の後述する流入用配管３１に介挿されてもよい。
　灌流液流入部３０は、リザーバ２０から肝臓９へと灌流液を供給する。２つ（２系統）の灌流液流入部３０はそれぞれ、流入用配管３１、ポンプ３２、温度調整ユニット３３、脱気ユニット３４、圧力計３５、流入側接続配管３６、および流入側カニューレ３７を含む。ポンプ３２、温度調整ユニット３３、脱気ユニット３４、および圧力計３５は、流入用配管３１に介挿される。
　流入用配管３１の一端は、リザーバ２０に接続される。流入用配管３１の他端は、灌流処理時には、肝臓９が有する血管に、流入側接続配管３６および流入側カニューレ３７を介して接続される。これにより、リザーバ２０から肝臓９の血管へと灌流液が供給される。
　ポンプ３２は、流入用配管３１内に、リザーバ２０から肝臓９へと向かう灌流液の流れを発生させる。ポンプ３２には、例えば、ブラシレスモータを搭載したポンプが用いられる。温度調整ユニット３３は、流入用配管３１内の灌流液の温度を調整する。温度調整ユニット３３は、例えば、４℃、２０℃、３７℃等に設定された温度の液体内に、流入用配管３１の一部を浸すことにより、流入用配管３１内の灌流液を設定された温度に調整する。ただし、灌流液の温度を調整するための機構は、設けられていなくてもよいし、リザーバ２０および流入用配管３１のいずれか一方のみに設けられていてもよい。脱気ユニット３４は、流入用配管３１内の灌流液の気体成分を除去する。圧力計３５は、流入用配管３１内の灌流液の圧力を計測する。
　図２に示すように、流入側接続配管３６は、円筒状の部材である。流入側接続配管３６は、保存容器１０を貫通しつつ、保存容器１０に固定されている。流入側接続配管３６の一端は、保存容器１０の内部に開口する。流入側接続配管３６の他端は、保存容器１０の外部に開口する。
　ここで、生体内の肝臓９においては、通常、血液は門脈と肝動脈とから供給される。門脈は太い静脈であり、腸や脾臓を循環した後の栄養分を多く含んだ静脈血を肝臓９へ供給する。肝動脈は、大動脈から酸素を多く含んだ動脈血を肝臓９へ供給する。これらの血液は、肝臓９内で合流し、肝臓９内の毛細血管を流れた後、肝上部下大静脈（ＳＨ－ＩＶＣ）を介して心臓へ戻る。
　灌流処理時には、ドナーの肝臓９の門脈および肝動脈のそれぞれに、流入側カニューレ３７が接続される。また、各流入側カニューレ３７の他端は、保存容器１０の内部において、流入側接続配管３６の一端に接続される。さらに、流入用配管３１は、保存容器１０の外部において、リザーバ２０と、流入側接続配管３６の他端とに接続される。なお、本実施形態の流入用配管３１を、流入側接続配管３６を介することなく、流入側カニューレ３７に直接的に接続することも可能となっている。
　上述のように、本実施形態では、２系統の灌流液流入部３０から肝臓９に灌流液が供給され、２系統のうち一方の流入用配管３１が肝臓９の門脈に接続され、他方の流入用配管３１が肝臓９の肝動脈に接続される。生体内の肝臓９では、肝動脈は動脈系であり、肝動脈内の血液の圧力は大きい。これに対し、門脈は静脈系であり、門脈内の血液の圧力は、肝動脈内の血液の圧力に比べて非常に小さい。本実施形態では、上述の構成を有することにより、灌流処理時においても、肝動脈に供給する灌流液の圧力と門脈に供給する灌流液の圧力とを個別に設定することができる。
　灌流液流出部４０は、肝臓９から灌流液を排出させる。灌流液流出部４０は、流出用配管４１、流出側接続配管４２、および流出側カニューレ４３を含む。
　流出用配管４１の一端は、リザーバ２０に接続される。流出用配管４１の他端は、灌流処理時には、肝臓９が有する血管に、流出側接続配管４２および流出側カニューレ４３を介して接続される。
　流出側接続配管４２は、円筒状の部材である。流出側接続配管４２は、保存容器１０を貫通しつつ、保存容器１０に固定されている。流出側接続配管４２の一端は、保存容器１０の内部に開口する。流出側接続配管４２の他端は、保存容器１０の外部に開口する。
　灌流処理時には、ドナーの肝臓９の肝上部下大静脈（ＳＨ－ＩＶＣ）または肝下部下大静脈（ＩＨ－ＩＶＣ）に、円筒状の流出側カニューレ４３が接続される。また、流出側カニューレ４３の他端は、保存容器１０の内部において、流出側接続配管４２の一端に接続される。さらに、流出用配管４１は、保存容器１０の外部において、リザーバ２０と、流出側接続配管４２の他端とに接続される。これにより、肝臓９の肝上部下大静脈（ＳＨ－ＩＶＣ）または肝下部下大静脈（ＩＨ－ＩＶＣ）から排出される灌流液が、リザーバ２０へと還流される。なお、本実施形態の流出用配管４１を、流出側接続配管４２を介することなく、流出側カニューレ４３に直接的に接続することも可能となっている。
　上述のように、リザーバ２０に貯留された灌流液は、ポンプ３２の動力によって灌流液流入部３０を介して肝臓９の門脈および肝動脈に供給され、肝臓９内で合流して肝臓９内の毛細血管を流れた後、肝上部下大静脈（ＳＨ－ＩＶＣ）または肝下部下大静脈（ＩＨ－ＩＶＣ）から排出され、灌流液流出部４０を介してリザーバ２０へと還流される。なお、流出用配管４１には、肝臓９からリザーバ２０へと向かう灌流液の流れを発生させるポンプがさらに設けられていてもよい。
　なお、本実施形態の灌流装置１００は、肝臓９から排出された灌流液をリザーバ２０へと還流させる構成であったが、本発明はこれに限られない。肝臓９から排出された灌流液は、リザーバ２０へと還流されず、廃棄され、または他の容器に貯留されてもよい。
　なお、リザーバ２０、灌流液流入部３０、および灌流液流出部４０の各部には、ｐＨや、特定の成分を検出するための計測ユニットが適宜備えられていてもよい。また、流入用配管３１および流出用配管４１には、流量計や、連通を制御する電磁弁等が介挿されていてもよい。
　制御部５０は、灌流装置１００内の各部を動作制御するための部位である。図１中に概念的に示したように、制御部５０は、例えば、ＣＰＵ等の演算処理部５１、ＲＡＭ等のメモリ５２、およびハードディスクドライブ等の記憶部５３を有するコンピュータにより構成される。
　このような灌流装置１００を用いて灌流処理を行う際、ドナーの肝臓９等の臓器を、生体外で長時間処理する場合や、生体内での血流が停止してから相当の時間が経過した後に処理を開始する場合がある。この場合、臓器内の血液中の凝固系因子が作用し、フィブリンと呼ばれるタンパク質を主成分とする糊状の血栓または血小板の凝集に伴う血栓等が既に形成され、または新たに形成される虞がある。
　＜１－２．灌流液の構成＞
　次に、本発明の一実施形態に係る灌流処理に用いられる灌流液の構成について、詳細を説明する。
　本発明の一実施形態に係る灌流液は、主に生理活性または生体適合性のある水溶液または電解質液に、セリンプロテアーゼを添加することによって、作成される。以下、当該生理活性または生体適合性のある水溶液または電解質液を、「生体適合性溶液」と称する。生体適合性溶液としては、例えば、市販のＬ－１５培地が用いられる。ただし、生体適合性溶液として、培地、ＥＴＫ液、ＨＴＫ液、生理食塩水、輸液、ＵＷ液、またはこれらの組み合わせが用いられてもよい。
　本実施形態のセリンプロテアーゼには、主成分としてナットウキナーゼが用いられる。一般に、納豆に存在する枯草菌の一種である納豆菌は、タンパク質分解酵素であるナットウキナーゼを産生することが知られている。また、生体内において、ナットウキナーゼは、血栓の主成分であるフィブリンを分解する効果があり、経口摂取することによって生体内の血行が改善することが従来から報告されている。さらに、ナットウキナーゼは食品由来であり、かつ、抽出が容易であることから低コストに導入可能である。
　ただし、セリンプロテアーゼの主成分は、プラスミン、トロンビン、ウロキナーゼ、アルテプラーゼ、ストレプトキナーゼ、グランザイムＢ、またはこれらの混合物であってもよい。すなわち、セリンプロテアーゼは、プラスミン、トロンビン、ウロキナーゼ、アルテプラーゼ、ストレプトキナーゼ、グランザイムＢ、およびナットウキナーゼの少なくとも１つを主成分とするものであればよい。
　さらに、灌流液には、酸素運搬体が添加されることが好ましい。灌流液中に酸素運搬体が含まれることにより、移植用の肝臓９の障害を抑えることができ、肝臓移植の成功率を向上させることができる。本発明に用いることができる酸素運搬体の例としては、赤血球または人工赤血球を挙げることができる。本発明の灌流液に添加する赤血球は、ドナーまたはレシピエントに輸血可能な血液型の赤血球であることが好ましく、ドナーまたはレシピエント由来の赤血球であることがさらに好ましい。また、本発明の灌流液に添加する人工赤血球は、酸素を運搬する機能を有する分子であればよく、例えば、パーフルオロカーボン、またはヘモグロビン小胞体等を例示することができる。さらに、灌流液には、血漿や血清が添加されてもよい。
　また、本実施形態の灌流液の、生理食塩水に対する浸透圧比は、１以上かつ５以下となるように調整されている。これにより、灌流液の浸透圧が過大となることによって、肝臓９内の水分が外部へ流出することによる、肝臓９内の細胞の損傷を、抑制することができる。また、灌流液の浸透圧が過小となることによって、肝臓９内へ水分が外部から流入することによる、肝臓９内の細胞の損傷を、抑制することができる。
　図３は、このような灌流液を用いることによる効果を検証した結果を示すグラフである。具体的には、生体適合性溶液であるＬ－１５培地に、ナットウキナーゼ、および「１２．５％人血清アルブミン」を添加することによって作成した灌流液を、豚の体内から取り出した血液中に含まれる血栓に添加した場合の、血栓の溶解率を検証した結果を示している。図３のグラフにおいて、横軸は灌流液を血栓に添加した時点から経過した時間を示し、縦軸は血栓の溶解率を示す。また、灌流液に含まれるナットウキナーゼの濃度は０．０２５～２５０ｍｇ／ｍＬの範囲から７パターンを選択して検証を行っている。また、灌流液の、生理食塩水（浸透圧は２８０～２９９ｍｍｏｌ／ｋｇ）に対する浸透圧比は、３程度である。
　図３に示すように、上述の灌流液を用いることによって、灌流液を血栓に添加した時点から時間が経過するにつれて血栓の溶解率が上昇し、６０分経過した時点で６０％程度に達することが確認された。これは、ナットウキナーゼ等のセリンプロテアーゼは、血栓の主成分であるタンパク質中で、多数のアミノ酸が互いに縮合したペプチド結合を選択的に加水分解（切断）するように働くためであると考えられる。
　図４および図５はそれぞれ、上述の灌流液に含まれるセリンプロテアーゼの濃度と血栓の溶解率との関係を検証した結果を示すグラフである。具体的には、生体適合性溶液であるＬ－１５培地に、ナットウキナーゼ、および「１２．５％人血清アルブミン」を、ナットウキナーゼの量を変えながら添加することによって作成した７種類の灌流液を、豚の体内から取り出した血液中に含まれる血栓にそれぞれ添加した場合の、血栓の溶解率を検証した結果を示している。図４および図５のグラフにおいて、横軸は灌流液に含まれるセリンプロテアーゼの濃度を示し、縦軸は血栓の溶解率を示す。さらに、図５では、図４の検証結果を、横軸のメモリが不等間隔になるようにしつつ表示している。灌流液の、生理食塩水（浸透圧は２８０～２９９ｍｍｏｌ／ｋｇ）に対する浸透圧比は、３程度である。また、図４および図５はそれぞれ、７種類の灌流液をそれぞれ血栓に添加した時点から１５分経過した後の、血栓の溶解率を検証した結果を示している。
　図４および図５に示すように、灌流液に含まれるナットウキナーゼの濃度が１００ｍｇ／ｍＬ程度以下にある場合は、ナットウキナーゼの濃度が高くなるにつれて血栓の溶解率が概ね上昇し、ナットウキナーゼの濃度が１００ｍｇ／ｍＬ程度を超えると、逆に血栓の溶解率が下降することが確認された。一方、灌流液に含まれるナットウキナーゼの濃度が０．０１ｍｇ／ｍＬ程度～０．１ｍｇ／ｍＬ程度の低い値であっても、血栓の溶解率がある程度維持されることが確認された。すなわち、灌流液に含まれるセリンプロテアーゼの濃度は、０．０１ｍｇ／ｍＬ程度以上かつ１００ｍｇ／ｍＬ程度以下に設定することが望ましい。
　＜１－３．灌流処理の流れ＞
　続いて、本実施形態の肝臓９の摘出手術および移植手術の流れと、摘出手術時および移植手術時に行う灌流処理について、図６～図８を参照しつつ説明する。図６は、肝臓９の摘出手術の流れおよび灌流処理工程を示したフローチャートである。図７は、後述する簡易灌流装置９０の構成を示した概略図である。図８は、肝臓９の移植手術の流れおよび灌流処理工程を示したフローチャートである。以下に示すように、灌流処理は、「洗浄工程（フラッシュ）」と「灌流保存工程」と「リンス工程」とに大別される。
　また、灌流液として、２種類の第１灌流液および第２灌流液が用いられる。第１灌流液および第２灌流液はそれぞれ、生体適合性溶液と、セリンプロテアーゼとを含み、生理食塩水に対する浸透圧比が１以上かつ５以下となるように調整されている。また、第２灌流液に含まれるセリンプロテアーゼの濃度は、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上かつ１００ｍｇ／ｍＬ以下であり、かつ、第１灌流液に含まれるセリンプロテアーゼの濃度よりも低くなるように調整されている。ただし、第１灌流液に含まれるセリンプロテアーゼの濃度は、１００ｍｇ／ｍＬよりもやや高くてもよい。
　図６に示すように、摘出手術時には、まず、ドナーの腹腔内において、肝臓９の門脈および肝動脈を切断し、それぞれに流入側カニューレ３７の一端を接続する。また、ドナーの腹腔内において、肝臓９の肝上部下大静脈（ＳＨ－ＩＶＣ）または肝下部下大静脈（ＩＨ－ＩＶＣ）を切断し、流出側カニューレ４３の一端を接続する（ステップＳ１０１）。
　次に、上述の灌流装置１００を用いつつ、流入側カニューレ３７の他端と、流入用配管３１とを直接接続する。また、流出側カニューレ４３の他端と、流出用配管４１とを直接接続する。そして、リザーバ２０内に第１灌流液を貯留させつつ灌流装置１００を駆動させて、肝臓９の門脈内および肝動脈内へ第１灌流液を流入させる。これにより、門脈および肝動脈に供給された第１灌流液が、肝臓９内で合流して肝臓９内の毛細血管を流れた後、肝上部下大静脈（ＳＨ－ＩＶＣ）または肝下部下大静脈（ＩＨ－ＩＶＣ）から排出され、灌流液流出部４０を介してリザーバ２０へと還流される（ステップＳ１０２）。この工程は、一般に「洗浄工程（フラッシュ）」と呼ばれる。この時、セリンプロテアーゼの濃度が高い第１灌流液が血管内を流れることによって、血管内の老廃物等が十分に除去されて洗浄されるとともに、血管内に既に形成された血栓が溶解され、新たな血栓の形成が予防される。
　ただし、「洗浄工程（フラッシュ）」においては、流出用配管４１とリザーバ２０とを接続しなくてもよい。すなわち、肝上部下大静脈（ＳＨ－ＩＶＣ）または肝下部下大静脈（ＩＨ－ＩＶＣ）から排出された第１灌流液を、流出側カニューレ４３および流出用配管４１を介した先で廃棄し、または他の容器に貯留してもよい。特に、肝上部下大静脈（ＳＨ－ＩＶＣ）または肝下部下大静脈（ＩＨ－ＩＶＣ）から排出され始めた直後の第１灌流液は、廃棄することが望ましい。
　次に、肝臓９から延びる他の血管を切断し、ドナーから肝臓９を摘出する（ステップＳ１０３）。
　その後、灌流装置１００の駆動および第１灌流液の供給を停止し、「洗浄工程（フラッシュ）」を終了する。そして、流入側カニューレ３７と流入用配管３１との接続、および流出側カニューレ４３および流出用配管４１との接続をそれぞれ解除し、肝臓９を保存容器１０内へと収容する（ステップＳ１０４）。
　続いて、流入側カニューレ３７を保存容器１０に固定された流入側接続配管３６の一端に接続するとともに、流入側接続配管３６の他端を流入用配管３１と接続する。また、流出側カニューレ４３を保存容器１０に固定された流出側接続配管４２の一端に接続するとともに、流出側接続配管４２の他端を流出用配管４１と接続する。そして、リザーバ２０内に第２灌流液を貯留させつつ灌流装置１００を駆動させて、肝臓９の門脈内および肝動脈内へ第２灌流液を流入させる。これにより、門脈および肝動脈に供給された第２灌流液が、肝臓９内で合流して肝臓９内の毛細血管を流れた後、肝上部下大静脈（ＳＨ－ＩＶＣ）または肝下部下大静脈（ＩＨ－ＩＶＣ）から排出され、灌流液流出部４０を介してリザーバ２０へと還流される（ステップＳ１０５）。この工程は、一般に「灌流保存工程」と呼ばれる。この時、第２灌流液が血管内を流れることによって、血管内に既に形成された血栓が溶解され、新たな血栓の形成が予防される。この結果、移植後の肝臓９のレシピエントへの適合性および生着率が向上する。以上により、ドナーからの肝臓９の摘出手術が完了する。
　なお、上述のステップＳ１０１～Ｓ１０５において、ドナーからの移植用の肝臓９の摘出手順において通常実施される処置は、執刀者等が必要に応じて適宜行うことができる。例えば、結合組織の除去、血管の剥離、血管切断のための血管の一時的な結紮またはクランプ、胆管の遮断および切断、移植用の肝臓９への血液抗凝固剤の適用、または手術部位の止血処置等は、必要に応じて適宜行うことができる。さらに、第１灌流液および第２灌流液にはそれぞれ、上記以外の成分が添加されてもよい。例えば、第２灌流液に、肝臓９中の細胞を活性化させるための栄養素がさらに添加されてもよい。
　ドナーからの肝臓９の摘出が完了した後、レシピエント側への輸送開始まで灌流装置１００による灌流が行われる。その後、レシピエント側への輸送の際には、図７に示すような簡易灌流装置９０を用いて簡易的に灌流を行いながら、肝臓９を輸送することができる。このようにすれば、輸送中にも、肝臓９の血管内の血栓を溶解し、新たな血栓の形成を予防できる。また、肝臓９がレシピエント側の病院あるいは手術室へ到着した後、レシピエントへの移植手術まで時間がある場合や、灌流による肝臓９の機能の回復の必要がある場合は、再び灌流装置１００による灌流を行う。
　なお、図７に示すように、簡易灌流装置９０は、バッグリザーバ９１と、バッグリザーバ９１と流入側接続配管３６とを繋ぐ流入用配管９２と、エアトラップ９３と、圧力計９４と、流量計９５と、廃液タンク９６と、流出側接続配管４２と廃液タンク９６とを繋ぐ排出用配管９７とを有する。なお、エアトラップ９３、圧力計９４、および流量計９５は、流入用配管９２に介挿される。
　バッグリザーバ９１は、点滴バッグ型の容器に灌流液（第２灌流液）が充填されたものである。バッグリザーバ９１を保存容器１０よりも上方に配置することにより、点滴と同様に、バッグリザーバ９１から流入用配管９２、流入側接続配管３６、および流入側カニューレ３７を介して肝臓９へと第２灌流液が流入する。
　一方、流入側カニューレ３７から肝臓９へと流入された第２灌流液は、同様に肝臓９内を通って、流出側カニューレ４３から流出側接続配管４２および排出用配管９７を介して廃液タンク９６へと排出される。なお、廃液タンク９６は、保存容器１０よりも下方に配置することが好ましい。
　このような簡易灌流装置９０を用いれば、ドナーからの摘出手術を行った場所から、レシピエントへの移植手術を行う場所まで輸送する際に、簡易的に肝臓９を灌流処理することが可能となる。これにより、輸送中にも、肝臓９の血管内の血栓を溶解し、新たな血栓の形成を予防できる。
　続いて、肝臓９の移植手術の流れおよび灌流処理工程について、図８を参照しつつ説明する。図８に示すように、まず、第２灌流液の供給を停止し、「灌流保存工程」を終了する。そして、流入側カニューレ３７と流入側接続配管３６との接続、および流出側カニューレ４３と流出側接続配管４２との接続をそれぞれ解除し、肝臓９を保存容器１０から取り出し、レシピエントの移植位置へと配置する（ステップＳ２０１）。
　次に、上述の灌流装置１００を用いつつ、流入側カニューレ３７と、流入用配管３１とを直接接続する。また、流出側カニューレ４３と、流出用配管４１とを直接接続する。そして、リザーバ２０内にリンス液を貯留させつつ灌流装置１００を駆動させて、肝臓９の門脈内および肝動脈内へ、リンス液を流入させる（ステップＳ２０２）。この工程は、一般に「リンス工程」と呼ばれる。ここで、当該リンス液は、上述の第１灌流液および第２灌流液とは異なる。また、リンス液には、タンパク質分解酵素が添加されていないか、または酵素不活性化剤が添加された液体が用いられる。例えば、リンス液には、セリンプロテアーゼを含まない灌流液が用いられる。さらに、リンス液に、血管内皮細胞の損傷を低減するための還元剤が添加されていてもよい。門脈および肝動脈に供給されたリンス液は、肝臓９内で合流して肝臓９内の毛細血管を流れた後、肝上部下大静脈（ＳＨ－ＩＶＣ）または肝下部下大静脈（ＩＨ－ＩＶＣ）から排出され、灌流液流出部４０を介してリザーバ２０へと還流される。これにより、血管内に残存している第１灌流液および第２灌流液が除去される。その結果、肝臓９のレシピエントへの適合性および生着率がより向上する。ただし、「リンス工程」は省略してもよい。
　続いて、流入側カニューレ３７および流出側カニューレ４３が挿入されていない肝臓９の各血管を、レシピエントの対応する血管と吻合する（ステップＳ２０３）。
　その後、灌流装置１００の駆動およびリンス液の供給を停止し、「リンス工程」を終了する。次に、肝臓９から流入側カニューレ３７および流出側カニューレ４３を除去する（ステップＳ２０４）。そして、流入側カニューレ３７および流出側カニューレ４３が接続されていた血管をそれぞれ、レシピエントの対応する血管と吻合する（ステップＳ２０５）。以上により、レシピエントへの肝臓９の移植手術が完了する。
　なお、上述のステップＳ２０１～Ｓ２０５において、移植用の肝臓９のレシピエントへの移植手順において通常実施される処置は、執刀者等が必要に応じて適宜行うことができる。例えば、結合組織の除去、血管の剥離、血管切断のための血管の一時的な結紮またはクランプ、胆管の遮断および切断、移植用の肝臓９への血液抗凝固剤の適用、手術部位の止血処置等は、必要に応じて適宜行うことができる。
　＜２．変形例＞
　以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明は、上述の実施形態に限定されるものではない。
　上述の実施形態では、門脈および肝動脈の双方から灌流液を供給していた。通常、肝臓９への流入血流量は、肝臓９の栄養血管である肝動脈が約３割、肝臓９の機能血管である門脈が約７割となっている。灌流処理時に肝臓９を状態良く保存するためには、栄養血管である肝動脈に酸素を付加した灌流液を供給することが好ましい。しかしながら、肝動脈のみに灌流液を供給すると、肝臓９へ供給可能な灌流液の流量が少なくなるとともに、門脈側に血栓が生じやすくなる。そこで、灌流処理の際には、肝動脈と門脈との双方に灌流液を供給することが好ましい。したがって、上述の実施形態のように、２つの灌流液流入経路により肝臓９へ灌流液を供給することにより、肝臓９の状態をより良好なものとすることができる。
　上述の通り、少なくとも肝動脈に供給される灌流液に酸素が付加されることが好ましい。上述の実施形態（図１参照）のように、リザーバ２０にガス交換機構２２が備えられる場合には、リザーバ２０内の灌流液に酸素を付加することができる。したがって、図１の例のように２つの灌流液流入経路を用意することにより、肝動脈と門脈との双方に、酸素が付加された灌流液が供給される。しかしながら、本発明はこれに限られない。例えば、リザーバ２０がガス交換機構を備えておらず、肝動脈および門脈のそれぞれに接続される灌流液流入経路の途中に酸素を付加する機構を備えていてもよい。なお、灌流液に酸素を付加する機構は、肝動脈に接続される灌流液流入経路と、門脈に接続される灌流液流入経路とのいずれか一方のみに備えられてもよいし、両方に備えられてもよい。
　上述の実施形態のように、リザーバ２０にガス交換機構２２が備えられている場合、肝動脈と門脈とに、酸素付加量が同じ灌流液が供給される。これに対し、灌流液流入経路の途中に酸素を付加する機構を設けると、肝動脈へ供給する灌流液の酸素付加量と、門脈へ供給する灌流液の酸素付加量とを別々に設定することが可能となる。
　上述の実施形態（図１参照）のように、灌流液流入経路および灌流液流出経路の数が増えると、一方で、灌流装置全体の大きさが大きくなる。そこで、図１の例では、灌流液流出経路は１つとしている。肝臓９において灌流液流出経路と接続する血管は肝上部下大静脈（ＳＨ－ＩＶＣ）または肝下部下大静脈（ＩＨ－ＩＶＣ）である。これらの静脈は同じ静脈の一部であるため、いずれか一方のみを灌流液流出経路と接続したとしても、両方を灌流液流出経路と接続した場合と比べても、灌流液の排出効率の低下は僅かである。このため、図１の例のように、肝動脈と門脈とにそれぞれ接続される２つの灌流液流入経路と、１つの灌流液流出経路とを有することにより、肝臓９の状態をより良好なものとしつつ、灌流装置１００の体格が大きくなるのをなるべく抑制できる。ただし、灌流液流入経路および灌流液流出経路はそれぞれ１つであってもよいし、２つであってもよい。また、灌流液流入経路および灌流液流出経路はそれぞれ、３つ以上であってもよい。
　また、上述の実施形態および変形例では、「洗浄工程（フラッシュ）」および「灌流保存工程」において、血栓の有無にかかわらず、タンパク質分解酵素であるセリンプロテアーゼを含む灌流液を灌流させていた。しかしながら、血管内に血栓が形成されておらず、これらの灌流液が行き届いていない不灌流領域が見当たらない場合には、門脈および肝動脈の圧力を抑えながら灌流液の流量を最大化するため、セリンプロテアーゼを含まないか、または極めて低濃度のセリンプロテアーゼを含む灌流液を灌流させてもよい。例えば、門脈の圧力を１０ｍｍＨｇ以下、および肝動脈の圧力を１００ｍｍＨｇ以下に抑えながら、灌流液の流量を最大化するため、セリンプロテアーゼを含まないか、または極めて低濃度のセリンプロテアーゼを含む灌流液を灌流させてもよい。
　また、上述の実施形態および変形例では、保存対象の臓器が肝臓であったが、本発明はこれに限られない。保存対象の臓器は、腎臓等のその他の臓器であってもよい。
　すなわち、本発明は、臓器の灌流に用いられる灌流液に係り、当該灌流液は、生体適合性溶液と、セリンプロテアーゼと、を含み、生理食塩水に対する浸透圧比が１以上かつ５以下であればよい。
　また、本発明は、臓器に灌流液を灌流させる灌流方法に係り、当該灌流方法は、ａ）臓器の血管内へ第１灌流液を流入させ、血管内を経由して臓器の外部へ排出させることにより、血管内を洗浄する洗浄工程と、ｂ）工程ａ）の後、血管内へ第２灌流液を流入させ、血管内を経由して臓器の外部へ排出させつつ、臓器を保存する保存工程と、を有し、第１灌流液および第２灌流液は、それぞれ生体適合性溶液と、セリンプロテアーゼと、を含み、生理食塩水に対する浸透圧比が１以上かつ５以下であり、かつ、第２灌流液に含まれるセリンプロテアーゼの濃度は、第１灌流液に含まれるセリンプロテアーゼの濃度よりも低く設定されていればよい。
　また、上述の実施形態や変形例に登場した各要素を、矛盾が生じない範囲で、適宜に組み合わせてもよい。
　９　肝臓
　１０　保存容器
　１１　装置本体
　２０　リザーバ
　２１　温度調整機構
　２２　ガス交換機構
　３０　灌流液流入部
　３１　流入用配管
　３２　ポンプ
　３６　流入側接続配管
　３７　流入側カニューレ
　４０　灌流液流出部
　４１　流出用配管
　４２　流出側接続配管
　４３　流出側カニューレ
　５０　制御部
　９０　簡易灌流装置
　９１　バッグリザーバ
　９２　流入用配管
　９６　廃液タンク
　９７　排出用配管
　１００　灌流装置

 

Claims (8)

  1. 　臓器の灌流に用いられる灌流液であって、
    　生体適合性溶液と、
    　セリンプロテアーゼと、
    を含み、
    　生理食塩水に対する浸透圧比が１以上かつ５以下である、灌流液。
  2. 　請求項１に記載の灌流液であって、
    　前記生体適合性溶液は、培地、Ｌ－１５培地、ＥＴＫ液、ＨＴＫ液、生理食塩水、輸液、およびＵＷ液の少なくとも１つを含む、灌流液。
  3. 　請求項１または請求項２に記載の灌流液であって、
    　前記セリンプロテアーゼは、プラスミン、トロンビン、ウロキナーゼ、アルテプラーゼ、ストレプトキナーゼ、グランザイムＢ、およびナットウキナーゼの少なくとも１つを主成分とする、灌流液。
  4. 　請求項１から請求項３までのいずれか１項に記載の灌流液であって、
    　前記灌流液に含まれる前記セリンプロテアーゼの濃度は、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上かつ１００ｍｇ／ｍＬ以下である、灌流液。
  5. 　臓器に灌流液を灌流させる灌流方法であって、
    　ａ）前記臓器の血管内へ第１灌流液を流入させ、前記血管内を経由して前記臓器の外部へ排出させることにより、前記血管内を洗浄する洗浄工程と、
    　ｂ）前記工程ａ）の後、前記血管内へ第２灌流液を流入させ、前記血管内を経由して前記臓器の外部へ排出させつつ、前記臓器を保存する保存工程と、
    を有し、
    　前記第１灌流液および前記第２灌流液は、それぞれ
    　生体適合性溶液と、
    　セリンプロテアーゼと、
    を含み、
    　生理食塩水に対する浸透圧比が１以上かつ５以下であり、かつ、
    　前記第２灌流液に含まれる前記セリンプロテアーゼの濃度は、前記第１灌流液に含まれる前記セリンプロテアーゼの濃度よりも低い、灌流方法。
  6. 　請求項５に記載の灌流方法であって、
    　前記生体適合性溶液は、培地、Ｌ－１５培地、ＥＴＫ液、ＨＴＫ液、生理食塩水、輸液、およびＵＷ液の少なくとも１つを含む、灌流方法。
  7. 　請求項５または請求項６に記載の灌流方法であって、
    　前記セリンプロテアーゼは、プラスミン、トロンビン、ウロキナーゼ、アルテプラーゼ、ストレプトキナーゼ、グランザイムＢ、およびナットウキナーゼの少なくとも１つを主成分とする、灌流方法。
  8. 　請求項５から請求項７までのいずれか１項に記載の灌流方法であって、
    　前記第２灌流液に含まれる前記セリンプロテアーゼの濃度は、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上かつ１００ｍｇ／ｍＬ以下である、灌流方法。
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