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WO2020256355A1 - 건강한 사람의 면역세포 배양액을 이용한 nk 세포의 함량을 증진시키는 방법 - Google Patents

건강한 사람의 면역세포 배양액을 이용한 nk 세포의 함량을 증진시키는 방법 Download PDF

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Publication number
WO2020256355A1
WO2020256355A1 PCT/KR2020/007660 KR2020007660W WO2020256355A1 WO 2020256355 A1 WO2020256355 A1 WO 2020256355A1 KR 2020007660 W KR2020007660 W KR 2020007660W WO 2020256355 A1 WO2020256355 A1 WO 2020256355A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
immune
cancer
culture
culture medium
Prior art date
Application number
PCT/KR2020/007660
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
라정찬
우상규
최성익
Original Assignee
라정찬
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 라정찬 filed Critical 라정찬
Priority to US17/620,183 priority Critical patent/US20220348873A1/en
Priority to JP2021574934A priority patent/JP7318019B2/ja
Publication of WO2020256355A1 publication Critical patent/WO2020256355A1/ko

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
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    • C12N2506/115—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells from monocytes, from macrophages

Definitions

  • the present invention relates to a culturing method for enhancing the cell content of NK cells, and more particularly, to a method of culturing NK cells comprising culturing the immune cells in a medium containing the immune cell culture medium of a normal person.
  • NK cells natural killer cells
  • NK cells are important factors of natural immunity in the human body and play an important role in removing tumor cells and virus-infected cells. It is known that the proportion of NK cells in the body of a healthy person is about 5-20%. However, it is known that the NK cell ratio of cancer patients is lower than that of healthy people, and the efficiency of NK cells is also low (J. Chen, J et al., Int. J. Clin. Exp. Pathol. 7:8304, 2014 ). In cancer patients, due to this decrease in the number and function of NK cells, the normal immune system is not activated, leading to aggravation of cancer.
  • NK cells in the body exist in an inactivated state from a normal state, but in reality, activated NK cells are required to use NK cells for therapeutic purposes. Research on activating NK cells from patient blood is being actively conducted.
  • NK cells When NK cells are activated in vitro, it was confirmed that NK cells exhibit high cytotoxicity, which confirmed the possibility of immune cell therapy using NK cells. There has been a report confirming the therapeutic effect by administering NK cells activated in vitro after allogeneic bone marrow transplantation to various cancer types, particularly blood cancer patients such as leukemia (Blood Cells Molecules & Disease, 33: p261- 266, 2004).
  • NK cells are not properly proliferated and cultured in vitro (in-vitro). Therefore, interest in technology for amplifying and culturing NK cells at a practically useful level is focused, and although many studies are being conducted, it has not yet reached the level applicable to clinical use.
  • IL-15 J. Immunol ., 167(6):p3129-3138, 2001; Blood , 106(1): p158-166, as well as IL-2 used for conventional T cell proliferation/activation
  • LPS J. Immunol ., 165(1): p139-147, 2000
  • OKT-3 antibody that stimulates CD3
  • Experimental Hematol ., 29(1): p104-113, 2001 has been conducted, but these studies have only found a new proliferative material in a modified and developed form for the use of IL-2, which has been used since the past, and has not been able to suggest a breakthrough proliferation method.
  • NK cell culture using IL-2 or other cytokines and compounds can only increase the number of cells by 3 to 10 times compared to the initial NK cells.
  • the present inventors have made diligent efforts to develop a method of increasing the number of NK cells when culturing NK cells more economically and efficiently.
  • the immune cell culture solution of a healthy person is added during culturing patient-derived immune cells . It was confirmed that the NK cell content was increased, and the present invention was completed.
  • the present invention provides a method for enhancing NK cell content comprising culturing peripheral blood mononuclear cells (PBMC) derived from a cancer patient or a normal person in a medium containing an immune cell culture medium and a CD3 antibody of a normal person. do.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • FIG. 1 is a graph showing the results of a relative comparison of the number of lymphocyte cells in an experimental group of cancer patients cultured with a healthy human immune cell culture medium and a control group (immune cells cultured without adding a healthy human immune cell culture medium).
  • Table 1 shows the FACS results of the immune cell test group and the control group (immune cells cultured without adding the immune cell culture medium of a healthy person) of a cancer patient cultured with a healthy human immune cell culture medium.
  • 3 is a cytotoxicity of an experimental group and a control group in which the immune cells of a cancer patient cultured with the immune cell culture medium of a healthy person were co-cultured with cancer cells (co-cultured immune cells and cancer cells cultured without adding the immune cell culture medium of a healthy person) It shows the result of checking.
  • NK cells of a cancer patient in order to return the NK cells of a cancer patient to the same performance as the NK cells of a healthy person, an attempt was made to develop a method that can increase the content of NK cells in immune cells, and a culture solution obtained by culturing immune cells derived from young healthy individuals When used for culturing immune cells derived from cancer patients, it was confirmed that the number of lymphocyte cells increased and the cell fraction of NK cells in the immune cells increased.
  • the present invention relates to a method for enhancing NK cell content comprising culturing peripheral blood mononuclear cells (PBMC) derived from cancer patients or normal individuals in a culture medium containing a normal person's immune cell culture and a CD3 antibody.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • normal person in the present invention means a healthy person aged 16 to 40 years of age without a diagnosed disease.
  • lymphocyte-based immune cells refers to lymphocyte-based immune cells, and preferably refers to immune cells contained in peripheral blood mononuclear cells (PBMC).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the'immune cells' may be used as immune cells in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are passaged P1 to P3, and preferably, in order to stimulate the proliferation of NK cells, stimulation with NK cell proliferation stimulating substances Immune cells can be used.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • CD3 antibody CD 16 antibody, CD 56 antibody, IL-2, IL-15, LPS, OKT-3 antibody, etc. may be used, but are not limited thereto.
  • the immune cell culture medium of a normal person may be characterized in that it is a culture medium produced by culturing P1 to P3 of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) derived from a normal person, and the culture of the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is CD3, CD16 and It is characterized by adding and culturing an antibody of a cytokine selected from the group consisting of CD56.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the immune cell culture medium is characterized in that the cell-free culture medium.
  • the immune cells may be characterized in that the immune cells derived from cancer patients or normal people.
  • the immune cells may be characterized by culturing peripheral blood mononuclear cells (PBMC) derived from cancer patients or normal individuals in the presence of a CD3 antibody.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the immune cell culture medium of the normal person is characterized in that it is added to the medium at a concentration of 1 to 50%, preferably can be added at a concentration of 5 to 30%, more preferably at a concentration of 10 to 20% Can be added as.
  • the immune cell culture medium of the normal person is added during the culture of the immune cells and the culture of P2.
  • immune cells cultured by adding 10% of a healthy human immune cell culture medium to K562 cells are added in a ratio of 1:3, 1:5, and 1:10, respectively.
  • the mixture was mixed with and co-cultured to confirm the cytotoxicity of immune cells against cancer cells.As a result, K562 cells and immune cells ratios of 1:3, 1:5, and 1:10 for each ratio of K562 It was confirmed that the cytotoxicity of the experimental group to which the immune cell culture medium of a healthy person was added was higher than that of the control group (FIG. 3).
  • NK cells prepared by the method according to the present invention and compositions comprising the same can be used for the treatment of tumors and infectious diseases.
  • NK cells prepared by the method according to the present invention can be applied to all types of tumors, including solid cancer and blood cancer.
  • solid cancer refers to cancer formed by forming a lump in an organ, and cancer that occurs in most organs corresponds to this.
  • the tumor that can be treated using NK cells according to the present invention is not particularly limited, and gastric cancer, liver cancer, lung cancer, colon cancer, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, thyroid cancer, laryngeal cancer, acute myelogenous leukemia, brain tumors, Neuroblastoma, retinoblastoma, head and neck cancer, salivary gland cancer, lymphoma, and the like, but are not limited thereto.
  • infectious disease used in the present invention is a disease caused by infection of a virus or pathogen, and is a concept including all diseases that can be transmitted and infected through respiratory, blood, and skin contact.
  • infectious diseases include hepatitis B and C, human papilloma virus (HPV) infection, cytomegalovirus infection, viral respiratory disease, influenza, coronavirus infection, etc. It is not limited thereto.
  • Example 1 Preparation of a culture medium in which immune cells of a young and healthy person are cultured
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • PBMC cells 50 ml of blood from a healthy 25-year-old person without a diagnosed disease was diluted 1 (blood): 1 (PBS) using DPBS, and 20 ml of the diluted blood was placed in a tube containing 15 ml of Ficoll (GE Healthcare). After the addition, centrifugation was performed at 400 g for 45 minutes to recover the cells distributed in the buffy coat layer, and the recovered cells were mixed with 40 ml of PBS, centrifuged at 400 g for 5 minutes, and the supernatant was removed. The number of isolated PBMC cells was confirmed.
  • P0 culture PBMC isolated in 1-1 were uniformly divided and cultured in two T75 flasks using KBM501 medium (Kohijin bio, cat. No. 1625015), and both flasks were cultured with 0.025% CD3 antibody (BD). Pharmingen, Cat. No 566685) and CD56 antibody (BD Pharmingen, Cat. No 559043) were added, and 0.15% CD16 antibody (BD Pharmingen, Cat. No 555404) was added to one of the flasks (CD16 + flask), and CD16 antibody was further added on the first and third days of culture.
  • Cultivation was performed in a CO 2 incubator (CO 2 concentration 5.0%) and 37°C, and all subsequent cultivation was performed under the same conditions. On the second day of culture, 10% FBS of the medium was added to each flask, and subculture was performed on the fifth day of culture.
  • P1 culture Cells recovered from P0 culture were added to each T175 flask. At this time, the culture solution was not discarded and put into a T175 flask as it is (Flask 1: CD16 added, Flask 2: CD16 not added). At this time, 0.05% CD3 antibody was additionally added to each flask and cultured using KBM501 medium (Kohijin bio, cat. No. 1625015). On the first day of the P1 culture, CD56 antibody (BD Pharmingen, Cat. No 559043) was added to each flask, and 0.2% CD16 antibody was additionally added to the CD16+ flask. On the second day of culture, medium and 1% FBS were added to each flask.
  • Example 2 NK cell culture of cancer patients
  • 50 ml of blood from a 39-year-old brain tumor diagnosis patient was diluted 1 (blood): 1 (PBS) using DPBS, and 20 ml of the diluted blood was added to a tube containing 15 ml of Ficoll, followed by 400 g for 5 minutes. After centrifugation, cells distributed in the buffy coat layer were recovered, and the recovered cells were mixed with 40 ml of PBS, centrifuged at 400 g for 5 minutes, and the supernatant was removed, and the number of separated PBMC cells was checked. .
  • P0 culture The PBMC isolated in 2-1 were uniformly divided and cultured in two T75 flasks using KBM501 medium (Kohijin bio, cat. No. 1625015), and both flasks were cultured with 0.025% CD3 antibody (BD). Pharmingen, Cat. No 566685) and 0.075% CD56 antibody (BD Pharmingen, Cat. No 559043) were added, and 0.15% CD16 antibody (BD Pharmingen, Cat. No 555404) was added to one flask (CD16 + flask). In addition, 0.015% CD16 antibody was added on the first and third days of culture.
  • Cultivation was performed in a CO 2 incubator (CO 2 concentration 5.0%) and 37°C, and all subsequent cultivation was performed under the same conditions. On the second day of culture, 10% FBS of the medium was added to each flask, and subculture was performed on the fifth day of culture.
  • P1 culture Cells recovered from P0 culture were added to each T175 flask. At this time, the culture solution was not discarded and put into a T175 flask as it is (Flask 1: CD16 added, Flask 2: CD16 not added). At this time, KBM501 medium and 0.05% CD3 antibody were additionally added to each flask and cultured. On the first day of the P1 culture, 0.012% CD56 antibody (BD Pharmingen, Cat. No 559043) was added to each flask, and 0.2% CD16 antibody was additionally added to the CD16+ flask. On the second day of culture, medium and 1% FBS were added to each flask.
  • 0.012% CD56 antibody BD Pharmingen, Cat. No 559043
  • P2 culture The cells and culture medium recovered through P1 culture were put into one KBM502B (KOHJIN BIO, Cat.No1 602502B) as it is.
  • KBM502B KOHJIN BIO, Cat.No1 602502B
  • 10% FBS and the healthy human immune cell culture solution obtained in Example 1 were added at concentrations of 10%, 15%, and 20%, respectively, and the cells were recovered after culturing for 7 days.
  • Example 3 Measurement of total number of immune cells and fraction of NK cells
  • the experimental group was the immune cells cultured by the method of Example 2, and as a control group, immune cells cultured without adding a healthy human immune cell culture solution were used.
  • the number of immune cells derived from cancer patients was measured using a microscope and a Hemocytometer, and the NK cell fraction was confirmed through a FACS assay (BD FACSVerse, BD Bioscience) (FITC-CD3 / PE-CD16,56).
  • NK cell fraction was higher than that of the control group in all of the experimental groups cultured by adding the immune cell culture solution of a healthy person at concentrations of 10%, 15% and 20%, respectively.
  • the experimental group was the immune cells obtained by adding the culture medium of healthy human immune cells cultured by the method of Example 2, and the immune cells cultured without adding the culture medium of healthy human immune cells were used as a control group.
  • Cytotoxicity is a chronic myelogenous leukemia cell line targeting NK cells, K562 cells (Public Health England, 89121407) and immune cells cultured by adding 10% of healthy human immune cell culture medium to 1:3, 1:5, and 1: The mixture was mixed at a ratio of 10, and cytotoxicity to cancer cells was confirmed through co-culture using IMDM (Gibco, 12440053) to which 10% FBS was added for 4 hours.
  • IMDM Gibco, 12440053
  • NK cells of not only cancer patients, but also people who are genetically susceptible to cancer or the elderly, and increase the NK cell fraction and cell killing ability.

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Abstract

본 발명은 NK 세포의 세포 함량을 증진하기 위한 배양방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 암 환자뿐만 아니라, 유전적으로 암에 취약한 사람 또는 노인의 NK 세포를 포함한 면역세포 증식률을 높일 수 있으며, NK 세포 분율 및 세포살해능도 높일 수 있다.

Description

건강한 사람의 면역세포 배양액을 이용한 NK 세포의 함량을 증진시키는 방법
본 발명은 NK 세포의 세포 함량을 증진하기 위한 배양방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 면역세포를 정상인의 면역세포 배양액을 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 NK 세포의 배양방법에 관한 것이다.
사람의 몸에서는 하루에도 수많은 암세포가 생성되고 있으며, 생성된 암세포는 체내의 면역시스템에 의해 사멸된다. 이러한 면역시스템에서 가장 큰 역할을 하는 세포가 바로 자연살해세포(Natural Killer cell, 이하, 'NK 세포'라 함)이다.
NK 세포는 인체에서 자연면역의 중요인자로서 주로 종양세포 및 바이러스에 감염된 세포를 제거하는 중요한 역할을 지니고 있다. 건강한 사람의 체내에 존재하는 NK 세포비율을 약 5~20%로 알려져 있다. 하지만, 암 환자들의 NK 세포 비율은 건강한 사람에 비해 낮으며 더불어 NK 세포의 효율이 떨어져 있다고 알려져 있다(J. Chen, J et al., Int. J. Clin. Exp. Pathol. 7:8304, 2014). 암환자에서 이러한 NK 세포 수 및 기능의 저하로 인해 정상적인 면역시스템이 활성화되지 않아 암으로 악화가 된다.
체내에 존재하는 대부분의 NK 세포는 정상상태에서 비활성화상태(inactivated state)로 존재하지만, 실제로 NK 세포를 치료용도로 이용하기 위해서는 활성화된 NK 세포가 필요하기 때문에, 정상혈액으로부터 혹은 NK 세포가 비활성화된 환자 혈액으로부터 NK 세포를 활성화시키는 연구가 활발히 진행되고 있다.
체외에서 NK 세포를 활성화시키는 경우, NK 세포는 높은 세포독성(cytotoxicity)을 나타내는 것으로 확인되었고, 이는 NK 세포를 이용한 면역세포 치료 가능성을 확인시켜주었다. 체외에서 활성화된 NK 세포를 다양한 암 종류, 특히 백혈병과 같은 혈액암(blood cancer) 환자를 대상으로 동종 골수이식 후에 투여하여 그 치료효과를 확인한 보고가 있다(Blood Cells Molecules & Disease, 33: p261-266, 2004).
한편, 상기와 같은 NK 세포의 치료제로서의 가능성에도 불구하고 체내에 존재하는 NK 세포의 수는 많지 않으므로, NK 세포를 치료용도로 사용할 수 있을 정도로 충분한 효능을 유지하면서 대량으로 생산하는 기술이 필수적이다. 그러나, NK 세포는 시험관 내에서(in-vitro) 대량 증식 및 배양이 제대로 이루어지지 않는다. 따라서 실제 유용한 수준으로 NK 세포를 증폭, 배양하는 기술에 대한 관심이 집중되고 있으며, 많은 연구가 진행되고 있지만, 아직 임상에 적용 가능한 수준에는 미치지 못하고 있다.
NK 세포의 배양에는 기존 T 세포 증식/활성에 사용하였던 IL-2 뿐만 아니라 IL-15(J. Immunol., 167(6):p3129-3138, 2001; Blood, 106(1): p158-166, 2005, 대한민국공개특허공보 제2009-0121694호), LPS (J. Immunol.,165(1): p139-147, 2000), CD3을 자극하는 OKT-3 항체(Experimental Hematol., 29(1): p104-113, 2001)를 이용하는 연구가 진행되어 왔으나, 이러한 연구는 예전부터 사용되어 오던 IL-2 사용에 대한 변형 및 발전형태로 새로운 증식 물질을 찾은 것일뿐, 획기적인 증식 방법을 제시하지 못하고 있다. 일반적으로 IL-2 혹은 그 밖의 사이토카인 및 화합물(chemical)을 이용한 NK 세포 배양을 통해서는 초기 NK 세포에 비해 3~10 배 정도 밖에 세포수를 증가시키지 못하는 것으로 알려져 있다.
암환자의 NK 세포를 건강한 사람의 NK 세포와 같은 성능으로 되돌리는 연구 및 건강한 Donor의 면역세포를 사용(타가)하고자 하는 연구가 진행 중이나(J. Chen, J et al., Int. J. Clin. Exp. Pathol. 7:8304, 2014; E. G. Iliopoulou et al., Cancer Immunol. Immunother. doi:10.1007/s00262-010-0904-3, 2010; S. R. Yoon et al., Bone Marrow Transplant., doi:10.1038/bmt.2009.304, 2010), 하지만, 이러한 면역세포 치료제의 제조 시 많은 종류의 인터루킨의 첨가 및 PBMC단계에서의 NK 세포 선택적인 분류 등 번거로움이 존재한다
이에, 본 발명자들은 보다 경제적이고, 효율적으로 NK 세포 배양시에 NK 세포 수를 증가시키는 방법을 하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 건강한 사람의 면역세포 배양액을 환자 유래 면역세포 배양 시에 첨가하는 경우, NK 세포함량이 증가하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 NK 세포의 세포 함량을 증진하기 위한 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 암환자 또는 정상인 유래 말초혈액 단핵구(PBMC)를 정상인의 면역세포 배양액 및 CD3 항체를 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 NK 세포 함량을 증진시키는 방법을 제공한다.
도 1은 건강한 사람의 면역세포 배양액으로 배양된 암환자의 면역세포 실험군과 대조군(건강한 사람의 면역세포 배양액을 첨가하지 않고 배양한 면역세포)의 임파구 세포 수를 상대비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2, 표 1는 건강한 사람의 면역세포 배양액으로 배양된 암환자의 면역세포 실험군과 대조군(건강한 사람의 면역세포 배양액을 첨가하지 않고 배양한 면역세포)의 FACS 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 건강한 사람의 면역세포 배양액으로 배양된 암환자의 면역세포를 암세포와 공배양한 실험군과 대조군(건강한 사람의 면역세포 배양액을 첨가하지 않고 배양한 면역세포와 암세포를 공배양)의 세포독성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 암환자의 NK 세포를 건강한 사람의 NK 세포와 같은 성능으로 되돌리기 위하여, 면역세포에서 NK 세포의 함량을 증진할 수 있는 방법을 개발하고자 하였으며, 젊은 건강인 유래 면역세포를 배양한 배양액을 암환자 유래의 면역세포를 배양하는데 사용하는 경우, 임파구 세포의 세포수가 증가되고, 면역세포에서 NK 세포의 세포분율이 높아지는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 암환자 또는 정상인 유래 말초혈액 단핵구(PBMC)를 정상인의 면역세포 배양액 및 CD3 항체를 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 NK 세포 함량을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 본 발명에서 '정상인'은 만 16~40세의 진단받은 질병이 없는 건강한 사람을 의미한다.
본 발명에 있어서, '면역세포'는 림프구계 면역세포를 의미하며, 바람직하게는 말초혈액 단핵구(PBMC)에 포함되어 있는 면역세포를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 '면역세포'는 말초혈액 단핵구(PBMC)를 P1~P3 계대 배양한 면역세포를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 NK 세포의 증식을 자극하기 위하여, NK 세포 증식 자극물질로 자극된 면역세포를 사용할 수 있다.
상기 'NK 세포 증식 자극물질'로는 CD3 항체, CD 16항체, CD 56항체, IL-2, IL-15, LPS, OKT-3 항체 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 정상인의 면역세포 배양액은 정상인 유래 말초혈액 단핵구(PBMC)를 P1~P3 배양하여 생성된 배양액인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 말초혈액 단핵구(PBMC)의 배양은 CD3, CD16 및 CD56으로 구성되는 군에서 선택되는 싸이토카인의 항체를 추가하여 배양하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 면역세포 배양액은 세포가 제거된(cell-free) 배양액인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 면역세포는 암환자 또는 정상인 유래 면역세포인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 면역세포는 암환자 또는 정상인 유래 말초혈액 단핵구(PBMC)를 CD3 항체 존재 하에 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 정상인의 면역세포 배양액은 배지에 1~50% 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 5~30% 농도로 첨가할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 10~20% 농도로 첨가될 수 있다.
본 발명에서, 면역세포 배양 시, P2 배양 시에 상기 정상인의 면역세포 배양액을 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서는 NK 세포의 표적이되는 만성골수성백혈병 세포주인 K562 세포와 건강한 사람의 면역세포 배양액을 10% 첨가하여 배양한 면역세포를 각각 1:3, 1:5 및 1:10의 비율로 섞어, 공배양하여, 암세포에 대한 면역세포의 세포독성(Cytotoxicity)을 확인하였으며, 그 결과, K562 세포와 면역세포 비율 1:3, 1:5 및 1:10 각각의 비율에 대해 K562에 대한 건강한 사람의 면역세포 배양액을 첨가한 실험군의 세포독성(Cytotoxicity)이 대조군의 세포독성(Cytotoxicity)보다 높다는 사실을 확인하였다(도 3).
본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 NK 세포 및 이를 포함하는 조성물은 종양 및 감염성 질환의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 방법으로 제조된 NK 세포는 고형암(solid cancer) 및 혈액암을 포함한 모든 종류의 종양에 적용이 가능하다. 고형암이란 혈액암과는 달리 장기(organ)에서 덩어리를 이루어 형성된 암을 의미하며, 대부분의 장기에서 발생하는 암이 이에 해당된다. 본 발명에 따른 NK 세포를 이용하여 치료가능한 종양은 특별한 제한은 없으며, 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막모세포종, 두경부암, 침샘암, 림프종 등일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 감염성 질환은 바이러스 또는 병원균의 감염에 의해 발생하는 질환으로, 호흡기 및 혈액, 피부접촉 등을 통해 전염되어 감염될 수 있는 질환을 모두 포함하는 개념이다. 이러한 감염성 질환의 비제한적인 예로서는 B형 및 C형 간염, 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus:HPV) 감염, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 감염, 바이러스성 호흡기 질환, 인플루엔자, 코로나바이러스 감염 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 젊고 건강한 사람의 면역세포를 배양한 배양액의 제조
1-1: PBMC(말초혈액단핵구) 분리
25세의 진단된 질병이 없는 건강한 사람의 혈액 50ml을 DPBS를 사용하여 1(혈액):1(PBS)로 희석하고, 희석한 혈액 20㎖를 15㎖의 Ficoll(GE Healthcare)이 담겨 있는 Tube에 첨가한 후, 400g에서 45분간 원심분리하여, Buffy coat층에 분포되어 있는 세포를 회수하고, 회수한 세포를 40㎖의 PBS 혼합한 후, 400g 5분간 원심분리를 실시하고, 상등액을 제거 후, 분리한 PBMC 세포 수를 확인하였다.
1-2: 면역세포 배양액의 제조
P0 배양: 1-1에서 분리한 PBMC를 균일하게 나누어 2개의 T75플라스크에서 KBM501 배지(Kohijin bio, cat. No. 1625015)를 사용하여 배양하였으며, 배양 시에 2개 플라스크 모두 0.025% CD3 항체(BD Pharmingen,Cat.No 566685) 와 CD56 항체(BD Pharmingen,Cat.No 559043)를 첨가하였으며, 그 중 한 개의 플라스크(CD16+플라스크)에는 0.15% CD16 항체(BD Pharmingen,Cat.No 555404)를 첨가하였으며, 배양 1일째 및 3일째에 CD16 항체를 추가로 첨가하였다.
배양은 CO2 incubator(CO2농도 5.0%), 37℃조건에서 배양하였으며, 이후 배양은 모두 동일한 조건에서 수행하였다. 배양 2일째에 각각의 플라스크에 배지 10% FBS를 첨가하였으며, 배양 5일째에 계대배양을 실시하였다.
P1 배양: P0 배양에서 회수한 세포를 각각의 T175플라스크에 추가하였다. 이때, 배양액은 버리지 않고 그대로 T175 플라스크에 넣어주었다 (플라스크1: CD16첨가용, 플라스크2: CD16미첨가용). 이 때 각각의 플라스크에 0.05% CD3 항체를 추가적으로 첨가하여 KBM501 배지(Kohijin bio, cat. No. 1625015)를 사용하여 배양하였다. P1 배양 1일째에 각각의 플라스크에 CD56 항체(BD Pharmingen, Cat. No 559043)를 첨가하고, CD16+플라스크에 0.2% CD16항체를 추가적으로 첨가하였다. 배양 2일째에 각각의 플라스크에 배지와 1% FBS를 추가하였다. 배양 3일째에 각각의 플라스크에 0.12% CD56 추가적으로 첨가하고, CD16+플라스크에 0.2% CD16 항체를 추가로 첨가하였다. 배양 4일째에 각각의 플라스크에 배지와 1% FBS를 추가로 첨가하였으며, 배양 8일째에 두 개 플라스크의 배양액을 회수하여 합친 후, NK 세포 배양에 사용하였다.
실시예 2: 암환자의 NK 세포 배양
2-1: PBMC(말초혈액단핵구) 분리
만 39세의 뇌종양 진단 환자의 혈액 50ml을 DPBS를 사용하여 1(혈액):1(PBS)로 희석하고, 희석한 혈액 20㎖를 15㎖의 Ficoll이 담겨 있는 Tube에 첨가한 후, 400g 5분간 원심분리하여, Buffy coat층에 분포되어 있는 세포를 회수하고, 회수한 세포를 40㎖의 PBS 혼합한 후, 400g 5분간 원심분리를 실시하고, 상등액을 제거 후, 분리한 PBMC 세포 수를 확인하였다.
2-2: NK 세포 배양
P0 배양: 2-1에서 분리한 PBMC를 균일하게 나누어 2개의 T75플라스크에서 KBM501 배지(Kohijin bio, cat. No. 1625015)를 사용하여 배양하였으며, 배양 시에 2개 플라스크 모두 0.025% CD3 항체(BD Pharmingen,Cat.No 566685) 및 0.075% CD56 항체(BD Pharmingen,Cat.No 559043) 를 첨가하였으며, 그 중 한 개의 플라스크(CD16+플라스크)에는 0.15% CD16 항체(BD Pharmingen,Cat.No 555404)를 첨가하였으며, 배양 1일째 및 3일째에 0.015% CD16 항체를 추가로 첨가하였다.
배양은 CO2 incubator(CO2농도 5.0%), 37℃조건에서 배양하였으며, 이후 배양은 모두 동일한 조건에서 수행하였다. 배양 2일째에 각각의 플라스크에 배지 10% FBS를 첨가하였으며, 배양 5일째에 계대배양을 실시하였다.
P1 배양: P0 배양에서 회수한 세포를 각각의 T175플라스크에 추가하였다. 이때, 배양액은 버리지 않고 그대로 T175 플라스크에 넣어주었다 (플라스크1: CD16첨가용, 플라스크2: CD16미첨가용). 이 때 각각의 플라스크에 KBM501 배지와 0.05% CD3 항체를 추가적으로 첨가하여 배양하였다. P1 배양 1일째에 각각의 플라스크에 0.012% CD56 항체(BD Pharmingen, Cat.No 559043)를 첨가하고, CD16+플라스크에 0.2% CD16 항체를 추가적으로 첨가하였다. 배양 2일째에 각각의 플라스크에 배지와 1% FBS를 추가하였다. 배양 3일째에 각각의 플라스크에 0.12% CD56 항체 추가적으로 첨가하고, CD16+플라스크에 CD16 항체를 추가로 첨가하였다. 배양 4일째에 각각의 플라스크에 배지와 1% FBS를 추가로 첨가하였으며, 배양 5일째에 계대배양을 실시하였다.
P2 배양: P1 배양을 통해 회수한 세포 및 배양액을 그대로 하나의 KBM502B(KOHJIN BIO, Cat.No1 602502B)에 넣어주었다. 여기에 10% FBS 및 실시예 1에서 수득한 건강한 사람의 면역세포 배양액을 각각 10%, 15% 및 20% 농도로 추가하여 7일간 배양 후 세포를 회수하였다.
실시예 3: 총 면역세포 수 및 NK세포 분율 측정
실험군은 실시예 2의 방법으로 배양한 면역세포이며, 대조군으로는 건강한 사람의 면역세포 배양액을 첨가하지 않고 배양한 면역세포를 사용하였다.
암환자 유래 면역세포 수를 현미경과 Hemocytometer를 사용하여 측정하였으며, NK 세포분율을 FACS 어세이(BD FACSVerse, BD Bioscience)를 통해 확인하였다(FITC-CD3 / PE- CD16,56).
그 결과, 도 1 및 표 1에 나타난 바와 같이, 건강한 사람의 면역세포 배양액을 10%, 15% 및 20% 농도로 각각 첨가하여 배양한 실험군 모두에서 세포수가 대조군보다 높은 것을 확인하였다.
Figure PCTKR2020007660-appb-T000001
아울러, 도 2 및 표 2에 나타난 바와 같이, 건강한 사람의 면역세포 배양액을 10%, 15% 및 20% 농도로 각각 첨가하여 배양한 실험군 모두에서 NK 세포분율이 대조군보다 높은 것을 확인하였다.
Figure PCTKR2020007660-appb-T000002
실시예 4: 암세포에 대한 Cytotoxicity 측정
실험군은 실시예 2의 방법으로 배양한 건강한 사람의 면역세포 배양액을 첨가하여 얻어진 면역세포이며, 대조군으로는 건강한 사람의 면역세포 배양액을 첨가하지 않고 배양한 면역세포를 사용하였다.
Cytotoxicity는 NK 세포의 표적이되는 만성골수성백혈병 세포주인 K562 세포(Public Health England, 89121407)와 건강한 사람의 면역세포 배양액을 10% 첨가하여 배양한 면역세포를 각각 1:3, 1:5 및 1:10의 비율로 섞어, 4시간 동안 10%의 FBS가 첨가된 IMDM(Gibco, 12440053)를 사용하여 공배양을 통해 암세포에 대한 세포독성(Cytotoxicity)을 확인하였다.
7-AAD/CFSE Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Kit (Cayman, 600120)의 구성품 중 하나인 CFSE Solution를 사용하여 암 세포만을 염색 후, 각각의 비율에 따라 세포를 섞은 뒤, V-bottom 96-well plate(Nunc, 249935)를 사용하여 공배양을 진행하였다. 4시간동안 공배양 후, Kit 구성품인 7-AAD Solution을 사용하여 죽은 세포를 표시하였다. 결과분석은, FACS 기기(BD FACSVerse, BD Bioscience)를 사용하여 CFSE 염색이 된 암세포 중 7-AAD가 염색된 죽은 세포를 확인하여 그 분율을 확인하였다.
키트를 사용한 Cytotoxicity 분석은 Kit 제조사가 추천하는 프로토콜을 기본적으로 준수하였다.
그 결과, 도 3과 표 3에 나타난 바와 같이, K562 세포와 면역세포 비율 1:3, 1:5 및 1:10 각각의 비율에 대해 K562에 대하여, 건강한 사람의 면역세포 배양액을 첨가하여 배양한 면역세포(실험군)의 세포독성(Cytotoxicity)이 건강한 사람의 면역세포 배양액을 첨가하지 않고 배양한 면역세포(대조군)의 세포독성(Cytotoxicity)보다 높다는 사실을 확인하였다.
Figure PCTKR2020007660-appb-T000003
본 발명에 따르면, 암 환자뿐만 아니라, 유전적으로 암에 취약한 사람 또는 노인의 NK 세포를 포함한 면역세포 증식률을 높일 수 있으며, NK 세포 분율 및 세포살해능도 높일 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (5)

  1. 암환자 또는 정상인 유래 말초혈액 단핵구(PBMC)를 정상인의 면역세포 배양액 및 CD3 항체를 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 NK 세포 함량을 증진시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 정상인은 만 16~40세의 질병이 없는 상태의 사람인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 정상인의 면역세포 배양액은 정상인 유래 말초혈액 단핵구(PBMC)를 P1~P3로 배양하고 세포를 제거한 것임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 말초혈액 단핵구(PBMC)는 CD3, CD16 및 CD56으로 구성되는 군에서 선택되는 싸이토카인 항체 함유 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 배지에서 정상인의 면역세포 배양액의 함량은 1~50% (v/v)로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160063114A (ko) * 2014-11-26 2016-06-03 주식회사 녹십자랩셀 T 세포를 이용한 자연살해세포의 배양방법
KR20160066837A (ko) * 2014-12-03 2016-06-13 주식회사 녹십자랩셀 안정성 높은 자연살해세포의 효율적인 제조방법
KR101760764B1 (ko) * 2017-02-10 2017-07-24 케이셀바이오뱅킹 주식회사 Nk세포의 대량 증식을 위한 배양방법
KR20180026905A (ko) * 2016-09-05 2018-03-14 주식회사 제넨셀 말초혈액단핵구 유래 항암 활성화 림프구 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 항암 활성화 림프구 배양방법
KR20180034795A (ko) * 2016-09-28 2018-04-05 한국원자력의학원 방사선 조사된 말초혈액단핵구를 이용한 고효율 자연살상세포의 제조방법 및 이를 이용한 항암 면역 세포치료제 조성물

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012099093A1 (ja) * 2011-01-21 2012-07-26 株式会社日本バイオセラピー研究所 Nk細胞強化型血液製剤の製造方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160063114A (ko) * 2014-11-26 2016-06-03 주식회사 녹십자랩셀 T 세포를 이용한 자연살해세포의 배양방법
KR20160066837A (ko) * 2014-12-03 2016-06-13 주식회사 녹십자랩셀 안정성 높은 자연살해세포의 효율적인 제조방법
KR20180026905A (ko) * 2016-09-05 2018-03-14 주식회사 제넨셀 말초혈액단핵구 유래 항암 활성화 림프구 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 항암 활성화 림프구 배양방법
KR20180034795A (ko) * 2016-09-28 2018-04-05 한국원자력의학원 방사선 조사된 말초혈액단핵구를 이용한 고효율 자연살상세포의 제조방법 및 이를 이용한 항암 면역 세포치료제 조성물
KR101760764B1 (ko) * 2017-02-10 2017-07-24 케이셀바이오뱅킹 주식회사 Nk세포의 대량 증식을 위한 배양방법

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