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WO2020144228A1 - Winkelvariable beleuchtung zur phasenkontrast-bildgebung mit absorptionsfilter - Google Patents

Winkelvariable beleuchtung zur phasenkontrast-bildgebung mit absorptionsfilter Download PDF

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Publication number
WO2020144228A1
WO2020144228A1 PCT/EP2020/050307 EP2020050307W WO2020144228A1 WO 2020144228 A1 WO2020144228 A1 WO 2020144228A1 EP 2020050307 W EP2020050307 W EP 2020050307W WO 2020144228 A1 WO2020144228 A1 WO 2020144228A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
illumination
absorption rate
detector
microscope
light
Prior art date
Application number
PCT/EP2020/050307
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Lars STOPPE
Dirk Döring
Thomas Milde
Original Assignee
Carl Zeiss Microscopy Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Carl Zeiss Microscopy Gmbh filed Critical Carl Zeiss Microscopy Gmbh
Priority to CN202080008311.6A priority Critical patent/CN113302538B/zh
Publication of WO2020144228A1 publication Critical patent/WO2020144228A1/de

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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G02B21/08—Condensers
    • G02B21/14—Condensers affording illumination for phase-contrast observation
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
    • G02B21/365—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes
    • G02B21/367—Control or image processing arrangements for digital or video microscopes providing an output produced by processing a plurality of individual source images, e.g. image tiling, montage, composite images, depth sectioning, image comparison
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B27/00—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00
    • G02B27/50—Optics for phase object visualisation
    • G02B27/52—Phase contrast optics
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B5/00—Optical elements other than lenses
    • G02B5/20—Filters
    • G02B5/22—Absorbing filters

Definitions

  • Various examples of the invention generally relate to a system
  • the microscope comprises a microscope and at least one computing unit.
  • the microscope comprises an illumination module which is set up to illuminate a sample object with light from several illumination directions.
  • a digital postprocessing can be carried out in the computing unit in order to obtain a result image with a tailored contrast.
  • the invention relates in particular to the use of an absorption filter which is arranged in an imaging optics of the microscope.
  • phase contrast image In optical imaging of sample objects, it can often be desirable to generate a so-called phase contrast image of the sample object.
  • a phase contrast image at least part of the image contrast is through a
  • Phase shift of the light due to the sample object shown In this way, in particular, those specimen objects with a comparatively high contrast can be imaged which cause no or only a slight attenuation of the amplitude, but a significant phase shift; such specimens are often referred to as phase objects.
  • biological samples as a sample object in a microscope can cause a comparatively larger phase change than a change in the amplitude of the electromagnetic field.
  • phase contrast imaging Various techniques for phase contrast imaging are known, such as dark field illumination, oblique illumination, and differential illumination
  • variable-angle lighting is intended to denote a technique in which the specimen object can be illuminated over its entire area with different lighting geometries, i.e. especially from different
  • An illumination geometry is implemented by one or more directions of illumination.
  • Illumination aperture On the other hand, it may be desirable in connection with high-resolution imaging if a larger numerical detector aperture is used.
  • phase contrast imaging techniques that overcome at least some of the disadvantages and
  • a system includes a microscope.
  • the microscope has an illumination module, a sample holder and a detector.
  • the microscope also has imaging optics that are between the detector and the
  • Sample holder is arranged.
  • the system also includes at least one computing unit.
  • the at least one computing unit is set up to control the lighting module in order to illuminate a sample object with light from a plurality of lighting directions.
  • Computing unit also set up to drive the detector to capture images.
  • the pictures correspond to one of the several items
  • the system also includes an absorption filter. This is arranged in the imaging optics.
  • the absorption filter has a location-dependent absorption rate.
  • An illumination geometry can be formed by one or more illumination directions.
  • variable-angle lighting Such techniques can also be referred to as variable-angle lighting, because different lighting geometries are used to illuminate the entire surface of the sample object or the sample holder.
  • the corresponding images can have different contrasts.
  • the images can have different contrasts. It is then possible to generate a result image with a phase contrast by combining the images.
  • the at least one computing unit could also be set up to receive the images to obtain the result image
  • the result image can have a phase contrast
  • Phase contrasts can be achieved, for example non-quantitative phase contrasts or a Have phase gradient contrast.
  • Corresponding techniques are disclosed, inter alia, in: DE 10 2014 112 242 A1 and DE 10 2017 108 873 A1.
  • phase contrast such as the phase gradient contrast
  • the absorption filter it may also be possible to use a
  • comparatively large numerical detector apertures can be used.
  • the numerical detector aperture could be chosen larger than a numerical illumination aperture of the illumination module. The use of a large numerical detector aperture can result in high quality for the captured images and thus also for the result image.
  • One method includes driving an illumination module of a microscope in order to illuminate a sample object on a sample holder of the microscope with light from multiple illumination directions.
  • the method also includes driving a detector of the microscope to capture images that each correspond to one of the multiple directions of illumination.
  • An absorption filter with a location-dependent absorption rate is arranged in an imaging optics of the microscope.
  • the computer readable storage medium includes program code.
  • the program code can be executed by a computing unit in order to carry out a method.
  • the method comprises driving an illumination module of a microscope in order to illuminate a sample object on a sample holder of the microscope with light from several illumination directions.
  • the method also includes driving a detector of the microscope to capture images that each correspond to one of the multiple directions of illumination.
  • An absorption filter with a location-dependent absorption rate is arranged in an imaging optics of the microscope.
  • FIG. 1 schematically illustrates a system according to various examples, which comprises a microscope and a computing unit.
  • FIG. 2 is a flow diagram of an example method.
  • FIG. 3 schematically illustrates an exemplary illumination module of the microscope, which is set up for the angle-variable illumination.
  • FIG. 4 schematically illustrates a lighting geometry that can be used in connection with variable angle lighting according to various examples.
  • FIG. 5 schematically illustrates the variable-angle illumination of a sample object that does not cause a phase shift, according to various examples.
  • FIG. 6 schematically illustrates the variable-angle illumination of a sample object, which causes a phase shift, according to various examples.
  • FIG. 7 schematically illustrates the variable-angle illumination of a sample object, which causes a phase shift, according to various examples, with FIG.
  • a numerical detector aperture is larger than a numerical one
  • FIG. 8 schematically illustrates the variable-angle illumination of a sample object, which causes a phase shift, according to various examples, with FIG.
  • a numerical detector aperture is larger than a numerical one
  • Illumination aperture and wherein an absorption filter is used in the imaging optics of the microscope.
  • FIG. 9 schematically illustrates the course of an absorption rate of the absorption filter according to various examples.
  • FIG. 10 schematically illustrates the course of an absorption rate of the
  • Units can be implemented as hardware, software, or a combination of hardware and software.
  • the microscope includes an illumination module, a sample holder, imaging optics and a detector.
  • the result image can depict a phase object with a phase contrast.
  • Phase contrast is not necessarily of a quantitative nature, but can generally also be of a qualitative nature. This means that the contrast does not have to represent the phase of the sample object one-to-one. In some for example, a phase gradient contrast could be used, ie the contrast could indicate the change in phase.
  • Sample object are intensity images, which themselves have no phase contrast.
  • the one or more images of the specimen can be associated with different lighting geometries. This means that the one or more images can in each case be captured by a detector when the specimen is simultaneously illuminated by means of an appropriate illumination geometry. This is also known as variable-angle lighting.
  • the different lighting geometries can be associated with different lighting directions, for example.
  • the different lighting geometries or associated different images can be separated from one another by time multiplexing or frequency multiplexing. Separation by means of different polarizations would also be possible.
  • Illumination geometries can have a directional dependency.
  • the lighting geometries can have a gradient of
  • the illuminance could vary in steps along a spatial direction, for example between zero and a finite value or between two different finite values.
  • the sample object can comprise a phase object, for example a cell or a cell culture, etc.
  • the sample object can be unknown a priori, i.e. Different sample objects can be fixed by the sample holder. The specimen could not even for the light used
  • the illumination module and the detector may be translucent. Depending on the type of sample object, it may be desirable to have the illumination module and the detector in incident light geometry or
  • an absorption filter is used to increase the strength of the phase contrast, which is used in the imaging optics of the microscope
  • the absorption filter has a location-dependent absorption rate which varies as a function of the lateral positions perpendicular to the optical axis of the microscope.
  • FIG. 1 illustrates an exemplary optical system 90.
  • the optical system 90 could include a microscope 100, for example a light microscope in transmitted light geometry or else in incident light geometry.
  • microscope 100 it may be possible to display small structures of a measurement object or sample object fixed on a sample holder 113 in enlarged form.
  • the microscope 100 comprises an illumination module 111
  • Illumination module 111 can be set up to illuminate a sample holder 113 over the entire surface, each with different illumination geometries.
  • the full-area lighting can mean that the illuminance in the
  • the area of the sample object or the sample holder 113 does not vary significantly. This distinguishes the techniques described here from a structured one
  • the lighting module 111 has a numerical lighting aperture.
  • the numerical illumination aperture defines the area from which light can be radiated onto a sample object.
  • microscope 100 includes imaging optics 112 (sometimes also referred to as an objective or detector optics), which is configured to generate an image of the measurement object on a detector surface of a detector 114.
  • a numerical detector aperture of the imaging optics 112 can enable bright-field imaging and / or dark-field imaging, for example depending on the illumination geometry used.
  • the lighting module 111 is set up to enable angle-variable lighting of the measurement object. This means that the illumination module 111 can be used to implement different illumination geometries of the light used to illuminate the measurement object. The different lighting geometries can each include one or more backlighting directions or lighting angles.
  • Illumination module 111 comprise a plurality of adjustable light sources which are set up to locally modify and / or generate light (in FIG.
  • a computing unit 115 of the optical system 90 can control the lighting module 111 or the light sources.
  • the computing unit 115 could be implemented as a microprocessor or microcontroller.
  • the computing unit 115 could comprise an FPGA or ASIC, for example.
  • the computing unit 115 can also control or read out the sample holder 113, the imaging optics 112 and / or the detector 114.
  • the computing unit 115 can also perform computing operations in connection with the digital postprocessing of images captured by the detector 114
  • the computing unit 115 it is possible for the computing unit 115 to be integrated into a housing of the microscope 100. In other examples, however, it would also be possible for the computing unit 115 to be provided externally by the microscope 100.
  • the computing unit 115 could be replaced by a corresponding one
  • Computer program that is executed on a PC can be implemented.
  • FIG. 2 is a flow diagram of an example method. For example, the method according to FIG. 2 by the computing unit 115 from FIG. 1 run. The method according to FIG. 2 allows you to use a result image Generate phase contrast by using variable-angle lighting.
  • the lighting module 111 is activated in block 9001, so that several lighting geometries are generated. This means that, for example, different light emitting diodes of a light emitting diode matrix can be switched on and off in succession. Several LEDs can also be used
  • Light-emitting diode matrix can be switched on simultaneously to such a
  • a half-room lighting could be implemented in which all light-emitting diodes in a half-room are switched on or off.
  • the detector 114 is then activated in block 9002 in order to acquire a plurality of images.
  • the activation of the lighting module 111 in block 9001 and the activation of the detector 114 in block 9002 take place synchronized, so that the various captured images are each assigned to a corresponding lighting geometry or one or more corresponding lighting directions that form the respective lighting geometry. Time or wavelength or polarization multiplexing can be used.
  • the optional block 9003 then contains the images captured in block 9002
  • This result image has an improved contrast, for example a phase contrast.
  • Phase contrast vary. Corresponding techniques are described for example in: DE 10 2014 112 242 A1 and DE 10 2017 108 873 A1.
  • image processing techniques can also be used in Magnolia 9003, for example on the individual captured images and / or the result image.
  • image processing techniques include: background normalization; Intoxication; Frequency filtering; Frequency manipulation; Etc..
  • FIG. 3 illustrates an exemplary implementation of the lighting module 111.
  • FIG. 3 is an illustration of the lighting module 111, which extends perpendicular to the optical axis 309 in the lateral plane spanned by the X and Y axes.
  • the lighting module 111 comprises a matrix
  • Has light-emitting diodes 121-1, 121 -2 (although other implementations would also be possible).
  • the light-emitting diodes 121 -1 are arranged inside the numerical detector aperture 319 of the imaging optics 112, while the light-emitting diodes 121 -2 are arranged outside the numerical detector aperture 319 of the imaging optics 112. This means that, in particular, bright field imaging as well as dark field imaging can be carried out by means of the illumination module 111.
  • numerical detector aperture 319 is so large that all light-emitting diodes are arranged within the numerical detector aperture 319 of the imaging optics 112. In this case, dark field imaging is not possible.
  • FIG. 4 illustrates aspects in connection with the individual operation of the various light-emitting diodes 121-1, 121-2 of the lighting module 111.
  • FIG. 4 is a sectional view along the axis X-X 'of FIG. 3rd
  • an illumination geometry 700 is achieved by the isolated switching on of the light-emitting diode 121 -1 marked with the arrow.
  • the entire sample object is illuminated from a specific direction of illumination, which is the relative arrangement of the marked light-emitting diode 121-1 to the optical axis Corresponds to 309.
  • Lighting geometry more than one light emitting diode 121-1, 121 -2 is switched on, so that a corresponding lighting geometry is made up of several
  • Lighting directions It would also be possible to use an extensive illuminated area. Different lighting geometries can at least partially have different lighting directions.
  • variable-angle illumination for generating a result image with phase contrast
  • FIG. 5 illustrates aspects of the illumination of a sample object 390, which is arranged in a sample plane 302, wherein the sample object 390 does not
  • Phase shift of the incident light causes.
  • a numerical illumination aperture 301 of the illumination module 111 is shown schematically as a field diaphragm (a focal length also determines the numerical illumination aperture; the focal length is, however, for reasons of the
  • the diameter 305 of an exit pupil defining the illumination aperture 301 is also shown.
  • Illumination directions 381, 382 are also shown. The light of the
  • Illumination geometry 701 falls on sample object 390 from the upper half space; and the light of illumination geometry 702 falls from the bottom
  • Illumination module 111 can be achieved with a matrix of light-emitting diodes 121 -1, 121 -2, all in connection with the illumination geometry 701
  • LEDs 121-1, 121 -2 are switched on above a center line, and in connection with the lighting geometry 702, all LEDs 121 -1, 121 -2 below the center line (see also FIG. 3, where the corresponding center line is shown with a dashed-dotted line).
  • FIG. 5 shows a pair of lenses 311, 312, a conjugate plane (pupil plane) being defined between the lenses 311, 312.
  • the diameter 315 of an entrance pupil of the imaging optics 112 that defines the numerical detector aperture 319 is shown in FIG. 5 also shown (the numerical detector aperture 319 is also determined by the focal length of the imaging optics 112, but the focal length for reasons of
  • FIG. 5 The detector plane 321 on which the light is focused is shown in FIG. 5 illustrated on the far right.
  • FIG. 5 also shows the optical axis 309 (main beam) (dashed-dotted line in FIG. 5).
  • Sample 390 also no change in direction of light. This is in the scenario of FIG. 6 different.
  • FIG. 6 illustrates aspects of the illumination of the specimen 390.
  • the example in FIG. 6 basically the example of FIG. 5.
  • a phase object is used as the sample object 390. This causes the light to be deflected away from the optical axis 309, in the example of FIG. 6 up. Therefore, not all light can pass through the numerical detector aperture 319.
  • a portion of the light (marked with the arrow) associated with the illumination geometry 702 is not directed to that
  • Detector level 321 mapped because it is not within the numerical
  • Detector aperture 319 lies. On the other hand, all light that comes with the
  • Illumination geometry 701 is associated to be focused on the detector plane 321.
  • Combination can take place through addition or difference formation.
  • FIG. 7 illustrates aspects of the illumination of the specimen 390.
  • the example in FIG. 7 basically the example of FIG. 6.
  • an enlarged numerical detector aperture 319 is used, in comparison to the example of FIG. 6.
  • the numerical detector aperture 319 is larger than the numerical illumination aperture 301 (which is shown schematically by a larger diameter 315 compared to the
  • Diameter 305 is illustrated).
  • all light of the illumination geometry 702 also reaches the detector plane 321 (see in particular the light beam which is marked with an arrow in FIG. 7 and compare with FIG. 6).
  • FIG. 7 motivates qualitatively why, according to reference implementations, the numerical detector aperture 319 has to be dimensioned comparatively small, in particular in relation to the numerical illumination aperture 301
  • FIG. 8 illustrates aspects of the illumination of the specimen 390.
  • the example in FIG. 8 basically the example of FIG. 7.
  • the diameter 315 of the entrance pupil associated with the detector aperture 319 is larger than the diameter 305 of the exit pupil associated with the illumination aperture 301.
  • Illumination aperture 301 (this observation takes into account the focal lengths of the illumination and the detector optics, which are not labeled in FIG. 8 for reasons of simplicity).
  • an absorption filter 800 is provided, which in the example of FIG. 8, is provided, which in the example of FIG. 8, is provided, which in the example of FIG. 8, is provided, which in the example of FIG. 8, is provided, which in the example of FIG. 8, is provided, which in the example of FIG. 8, is provided, which in the example of FIG. 8, is provided, which in the example of FIG. 8, is provided, which in the example of FIG. 8, is provided, which in the example of FIG. 8, an absorption filter 800 is provided, which in the
  • Imaging optics 112 is arranged and which has a location-dependent absorption rate (the location-dependent absorption rate is illustrated in FIG. 8 by the non-continuous lines of the absorption filter 800 oriented in the X direction).
  • the absorption rate which depends on the location, is more strongly absorbed due to the phase shift of the sample object 390 in the region of the pupil plane of the imaging optics 112.
  • a combination of the different images that correspond to the different illumination geometries 701, 702 can in turn produce a result image with phase contrast - even though a large numerical detector aperture 319 is used.
  • Illumination geometries - an increased phase contrast is achieved.
  • FIG. 9 and FIG. 10 illustrate aspects in connection with the absorption filter 800.
  • FIG. 9 and FIG. 10 the location dependency of the
  • the absorption rate 810 assumes larger values for larger distances to the optical axis 309 (i.e. in the lateral direction, in FIG. 5-8 in the X direction).
  • FIG. 9 shows a step-shaped radial course; and in the implementation of FIG. 10 a gradual radial course.
  • the location dependency of the absorption rate 810 could be rotationally symmetrical with respect to the optical axis 390 in the lateral plane (spanned by the X-axis and Y-axis).
  • a non-rotationally symmetrical design would also be possible: In the examples in FIG. 9 and FIG. 10 are namely
  • the absorption rate 810 can also be locally non-monotonic (e.g. along the X-axis or along the Y-axis), provided the integral remains monotonic over the area. It should apply here that the integral of the light decreases monotonically over the surface (in the XY plane, perpendicular to the optical axis 309) of the illumination geometry for greater distances from the optical axis 309.
  • the absorption rate 810 could increase monotonically as a function of the distance to the optical axis 309.
  • FIG. 9 and FIG. 10 also shows an inner region 801 adjacent to the optical axis 309 and an outer region 802 which surrounds the inner region 801 offset in the lateral direction.
  • the Absorption rate 810 is greater in the outer area 802 than in the inner area 801. It has been observed in various tests that a comparatively large difference between the absorption rate 810 in the outer area 802 and the absorption rate 810 in the inner area 801 can be desirable. For example, it would be possible that the absorption rate 810 in the inner region 801 is not greater than 10% and the absorption rate in the outer region is> 50%. It can thereby be achieved that light which is near the optical axis 309 through the
  • Imaging optics 112 and in particular the pupil plane runs is not or not significantly attenuated, so that the images have a strong signal.
  • the absorption rate 810 in the outer area 802 of greater than 0%, for example in the range from 10% to 50%, it can be achieved that the result image has a phase contrast, but at the same time also a high resolution.
  • a dimensioning of the absorption rate 810 in the outer area 802 in the range from 10% to 20% could also enable a combination with fluorescence imaging (where there is typically comparatively low light intensity). If the absorption rates are too high, there is one
  • Attenuation of the high spatial frequencies by the absorption rate 810 dimensioned as above does not, or does not significantly, limit the overall quality of the various captured images.
  • the inner region 801 has a diameter which is approximately the same size as the diameter 305
  • the inner region 801 it would be possible for the inner region 801 to have a diameter which is in the range from 80% to 120% of the diameter 305 of the
  • Illumination module 111 is, optionally in the range from 80% to 100%. also is in connection with the FIG. 9 and 10 also show that both the inner region 801 and the outer region 802 each have a diameter which is smaller than the diameter 315.
  • numerical illumination aperture 301 of the illumination module 111 is dimensioned smaller than the numerical detector aperture 319 of the imaging optics 112; at the same time, a result image with phase contrast can still be obtained.
  • a result image with a particularly large phase contrast can be obtained by combining the individual images.
  • this is accomplished by maximizing the difference between two images that correspond to different lighting geometries even with small deflections by a non-zero phase gradient. This is achieved in particular by weakening a light beam which is deflected away from the optical axis by the phase object.
  • an absorption filter is used, which reduces the light intensity of this light beam.
  • the absorption filter can e.g. be a gradient filter or a step-like absorption filter. By using the absorption filter there are differences not equal to 0 even for a small phase shift. These differences are proportional (at least piece by piece) to the gradient of the phase.
  • Embodiments and aspects of the invention are combined with one another.
  • the features can be used not only in the combinations described, but also in other combinations or on their own, without leaving the field of the invention.
  • the captured (raw) images are combined in order to obtain the result image. It is in the In general, it is possible for the captured images to be post-processed, for example by using filters in the frequency domain. These digital filters can be selected depending on the absorption filter used. This is based on the knowledge that the low spatial frequencies or the small phase gradients are only weakly transmitted when the filter has low absorption rates. It is then possible to use (digital) frequency filters that cover the frequency range of the one or more raw images and / or
  • Result image which corresponds to the zone of weakening.
  • the range of frequencies can be multiplied by a factor while all

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Abstract

Ein System (90) umfasst ein Mikroskop (100) mit einem Beleuchtungsmodul (111), einem Probenhalter (113), einem Detektor (114) und einer zwischen dem Probenhalter (113) und dem Detektor (114) angeordneten Abbildungsoptik (112). Das System umfasst auch mindestens eine Recheneinheit (115), die eingerichtet ist, um das Beleuchtungsmodul (111) anzusteuern, um ein Probenobjekt (390) mit Licht aus mehreren Beleuchtungsrichtungen (700-703, 381, 382) zu beleuchten, und um den Detektor (114) anzusteuern, um Bilder zu erfassen, die jeweils einer der mehreren Beleuchtungsrichtungen (700-703, 381, 382)entsprechen. Das System umfasst ferner einen Absorptionsfilter (800), der in der Abbildungsoptik (112) angeordnet ist und der eine ortsabhängige Absorptionsrate (810) aufweist.

Description

Winkelvariable Beleuchtung zur Phasenkontrast-Bildgebung mit
Absorptionsfilter
TECHNISCHES GEBIET
Verschiedene Beispiele der Erfindung betreffen im Allgemeinen ein System
umfassend ein Mikroskop und mindestens eine Recheneinheit. Dabei umfasst das Mikroskop ein Beleuchtungsmodul, welches eingerichtet ist, um ein Probenobjekt mit Licht aus mehreren Beleuchtungsrichtungen zu beleuchten. Mittels der
Recheneinheit kann eine digitale Nachbearbeitung durchgeführt werden, um ein Ergebnisbild mit maßgeschneidertem Kontrast zu erhalten. Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung eines Absorptionsfilters, der in einer Abbildungsoptik des Mikroskops angeordnet ist.
HINTERGRUND
In der optischen Bildgebung von Probenobjekten kann es häufig erstrebenswert sein, ein sogenanntes Phasenkontrastbild des Probenobjekts zu erzeugen. In einem Phasenkontrastbild ist zumindest ein Teil des Bildkontrasts durch eine
Phasenverschiebung des Lichts durch das abgebildete Probenobjekt bedingt. Damit können insbesondere solche Probenobjekte mit vergleichsweise hohem Kontrast abgebildet werden, die keine oder nur eine geringe Schwächung der Amplitude bewirken, jedoch eine signifikante Phasenverschiebung; solche Probenobjekte werden oftmals auch als Phasenobjekte bezeichnet. Typischerweise können biologische Proben als Probenobjekt in einem Mikroskop eine vergleichsweise größere Phasenänderung als Amplitudenänderung des elektromagnetischen Felds bewirken.
Es sind verschiedene Techniken zur Phasenkontrast-Bildgebung bekannt, etwa die Dunkelfeldbeleuchtung, die schiefe Beleuchtung, der differenzielle
Interferenzkontrast (DIC) oder auch der Zernike-Phasenkontrast.
Solche vorgenannten Techniken weisen diverse Nachteile oder Einschränkungen auf. Oftmals kann es erforderlich sein, zusätzliche optische Elemente zwischen Probe und Detektor im Bereich der sogenannten Abbildungsoptik bereitzustellen, um die Phasenkontrast-Bildgebung zu ermöglichen. Daraus können konstruktive
Einschränkungen resultieren. Weiterhin können applikative Einschränkungen bestehen: Zum Beispiel kann die Fluoreszenz-Bildgebung durch Vorsehen der zusätzlichen optischen Elemente erschwert werden.
Es sind auch Techniken bekannt, bei denen mittels sog. winkelvariabler Beleuchtung ein Phasenkontrast erzielt werden kann. Dabei soll winkelvariable Beleuchtung im Zusammenhang mit der vorliegenden Offenbarung eine Technik bezeichnen, bei der das Probenobjekt vollflächig mit unterschiedlichen Beleuchtungsgeometrien beleuchtet werden kann, d.h. insbesondere aus unterschiedlichen
Beleuchtungsrichtungen. Eine Beleuchtungsgeometrie wird durch ein oder mehrere Beleuchtungsrichtungen implementiert.
Ein erstes Beispiel von Techniken, die mittels winkelvariabler Beleuchtung ein Bild mit Phasenkontrast erzielen können, ist in DE 10 2014 112 242 A1 offenbart. Siehe auch: Tian, Lei, and Laura Waller. "3D intensity and phase imaging from light field measurements in an LED array microscope." optica 2.2 (2015): 104-111. Solche Techniken weisen jedoch bestimmte Einschränkungen auf. Beispielsweise wurde es beobachtet, dass bei solchen Techniken die Stärke des Phasenkontrasts abnimmt, wenn die numerische Detektorapertur größer ist, als die numerische
Beleuchtungsapertur. Andererseits kann es aber im Zusammenhang mit der hochauflösenden Bildgebung erstrebenswert sein, wenn eine größere numerische Detektorapertur verwendet wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Deshalb besteht ein Bedarf für verbesserte Techniken zur Phasenkontrast- Bildgebung. Insbesondere besteht ein Bedarf für Techniken zur Phasenkontrast- Bildgebung, die zumindest einige der oben genannten Nachteile und
Beschränkungen beheben.
Diese Aufgabe wird von den Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche gelöst. Die Merkmale der abhängigen Patentansprüche definieren Ausführungsformen. In einem Beispiel umfasst ein System ein Mikroskop. Das Mikroskop weist ein Beleuchtungsmodul, einen Probenhalter und einen Detektor auf. Das Mikroskop weist auch eine Abbildungsoptik auf, die zwischen dem Detektor und dem
Probenhalter angeordnet ist. Außerdem umfasst das System auch mindestens eine Recheneinheit. Dabei ist die mindestens eine Recheneinheit eingerichtet, um das Beleuchtungsmodul anzusteuern, um ein Probenobjekt mit Licht aus mehreren Beleuchtungsrichtungen zu beleuchten. Außerdem ist die mindestens eine
Recheneinheit auch eingerichtet, um den Detektor anzusteuern, um Bilder zu erfassen. Dabei entsprechen die Bilder jeweils einer der mehreren
Beleuchtungsrichtungen. Das System umfasst ferner einen Absorptionsfilter. Dieser ist in der Abbildungsoptik angeordnet. Der Absorptionsfilter weist eine ortsabhängige Absorptionsrate auf.
Es ist möglich, dass die Beleuchtungsrichtungen unterschiedliche
Beleuchtungsgeometrien implementieren. Dabei kann eine Beleuchtungsgeometrie jeweils durch ein oder mehrere Beleuchtungsrichtungen ausgebildet sein.
Solche Techniken können entsprechend auch als winkelvariable Beleuchtung bezeichnet werden, weil jeweils unterschiedliche Beleuchtungsgeometrien zur vollflächigen Beleuchtung des Probenobjekts bzw. des Probenhalters eingesetzt werden.
Durch die Verwendung unterschiedlicher Beleuchtungsrichtungen bzw.
unterschiedlicher Beleuchtungsgeometrien können die entsprechenden Bilder unterschiedliche Kontraste aufweisen. Insbesondere können bei Phasenobjekten die Bilder unterschiedliche Kontraste aufweisen. Dann ist es möglich, durch Kombination der Bilder ein Ergebnisbild mit einem Phasenkontrast zu erzeugen.
Beispielsweise könnte in diesem Zusammenhang die mindestens eine Recheneinheit weiterhin eingerichtet sein, um die Bilder zum Erhalten des Ergebnisbilds
miteinander zu kombinieren. Das Ergebnisbild kann einen Phasenkontrast
aufweisen. Dabei können - je nach Art der Kombination - unterschiedliche
Phasenkontraste erzielt werden, z.B. nicht-quantitative Phasenkontraste oder ein Phasengradientenkontrast aufweisen. Entsprechende Techniken sind unter anderem offenbart in: DE 10 2014 112 242 A1 und DE 10 2017 108 873 A1.
Durch die Verwendung des Absorptionsfilters kann eine besonders hohe Bildqualität erzielt werden. Zum Beispiel kann in manchen Beispielen der Phasenkontrast, wie beispielsweise der Phasengradienten-Kontrast, besonders stark ausgebildet werden. Dies bedeutet, dass auch ein kleiner Phasenversatz durch das Probenobjekt einen großen Wert für den Phasenkontrast im Ergebnisbild bewirken kann. Durch die Verwendung des Absorptionsfilters kann es außerdem möglich sein, eine
numerische Detektorapertur der Abbildungsoptik flexibel zu dimensionieren.
Insbesondere können vergleichsweise große numerische Detektoraperturen verwendet werden. Insbesondere könnte die numerische Detektorapertur größer gewählt werden als eine numerische Beleuchtungsapertur des Beleuchtungsmoduls. Dabei kann die Verwendung einer großen numerischen Detektorapertur eine hohe Qualität für die erfassten Bilder und damit auch für das Ergebnisbild bewirken.
Ein Verfahren umfasst das Ansteuern eines Beleuchtungsmodulseines Mikroskops, um ein Probenobjekt auf einem Probenhalter des Mikroskops mit Licht aus mehreren Beleuchtungsrichtungen zu beleuchten. Das Verfahren umfasst außerdem das Ansteuern eines Detektors des Mikroskops, um Bilder zu erfassen, die jeweils einer der mehreren Beleuchtungsrichtungen entsprechen. Ein Absorptionsfilter mit einer ortsabhängigen Absorptionsrate ist in einer Abbildungsoptik des Mikroskops angeordnet.
Ein Computer-Programm oder ein Com puter-Programm produkt oder ein
computerlesbares Speichermedium umfasst Programmcode. Der Programmcode kann von einer Recheneinheit ausgeführt werden, um ein Verfahren auszuführen. Das Verfahren umfasst das Ansteuern eines Beleuchtungsmodulseines Mikroskops, um ein Probenobjekt auf einem Probenhalter des Mikroskops mit Licht aus mehreren Beleuchtungsrichtungen zu beleuchten. Das Verfahren umfasst außerdem das Ansteuern eines Detektors des Mikroskops, um Bilder zu erfassen, die jeweils einer der mehreren Beleuchtungsrichtungen entsprechen. Ein Absorptionsfilter mit einer ortsabhängigen Absorptionsrate ist in einer Abbildungsoptik des Mikroskops angeordnet. KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
FIG. 1 illustriert schematisch ein System gemäß verschiedener Beispiele, welches ein Mikroskop sowie eine Recheneinheit umfasst.
FIG. 2 ist ein Flussdiagramm eines beispielhaften Verfahrens.
FIG. 3 illustriert schematisch ein beispielhaftes Beleuchtungsmodul des Mikroskops, welches für die winkelvariable Beleuchtung eingerichtet ist.
FIG. 4 illustriert schematisch eine Beleuchtungsgeometrie, die gemäß verschiedener Beispiele im Zusammenhang mit der winkelvariablen Beleuchtung verwendet werden kann.
FIG. 5 illustriert schematisch die winkelvariable Beleuchtung eines Probenobjekts, welches keinen Phasenversatz bewirkt, gemäß verschiedener Beispiele.
FIG. 6 illustriert schematisch die winkelvariable Beleuchtung eines Probenobjekts, welches einen Phasenversatz bewirkt, gemäß verschiedener Beispiele.
FIG. 7 illustriert schematisch die winkelvariable Beleuchtung eines Probenobjekts, welches einen Phasenversatz bewirkt, gemäß verschiedener Beispiele, wobei in FIG.
7 eine numerische Detektorapertur größer ist als eine numerische
Beleuchtungsapertur.
FIG. 8 illustriert schematisch die winkelvariable Beleuchtung eines Probenobjekts, welches einen Phasenversatz bewirkt, gemäß verschiedener Beispiele, wobei in FIG.
8 eine numerische Detektorapertur größer ist als eine numerische
Beleuchtungsapertur und wobei ein Absorptionsfilter in der Abbildungsoptik des Mikroskops verwendet wird.
FIG. 9 illustriert schematisch den Verlauf einer Absorptionsrate des Absorptionsfilters gemäß verschiedener Beispiele. FIG. 10 illustriert schematisch den Verlauf einer Absorptionsrate des
Absorptionsfilters gemäß verschiedener Beispiele.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG VON AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die oben beschriebenen Eigenschaften, Merkmale und Vorteile dieser Erfindung sowie die Art und Weise, wie diese erreicht werden, werden klarer und deutlicher verständlich im Zusammenhang mit der folgenden Beschreibung der
Ausführungsbeispiele, die im Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden.
In den Figuren bezeichnen gleiche Bezugszeichen gleiche oder ähnliche Elemente. Die Figuren sind schematische Repräsentationen verschiedener Ausführungsformen der Erfindung. In den Figuren dargestellte Elemente sind nicht notwendigerweise maßstabsgetreu dargestellt. Vielmehr sind die verschiedenen in den Figuren dargestellten Elemente derart wiedergegeben, dass ihre Funktion und genereller Zweck dem Fachmann verständlich wird. In den Figuren dargestellte Verbindungen und Kopplungen zwischen funktionellen Einheiten und Elementen können auch als indirekte Verbindung oder Kopplung implementiert werden. Eine Verbindung oder Kopplung kann drahtgebunden oder drahtlos implementiert sein. Funktionale
Einheiten können als Hardware, Software oder eine Kombination aus Hardware und Software implementiert werden.
Nachfolgend werden Techniken beschrieben, um Bilder mittels eines Mikroskops zu erfassen. Dabei umfasst das Mikroskop ein Beleuchtungsmodul, einen Probenhalter, eine Abbildungsoptik sowie einen Detektor.
Nachfolgend werden Techniken beschrieben, um ein Ergebnisbild mit
maßgeschneidertem Kontrast zu bestimmen. Beispielsweise kann das Ergebnisbild ein Phasenobjekt mit einem Phasenkontrast abbilden. Dabei muss der
Phasenkontrast nicht notwendigerweise quantitativ ausgebildet sein, sondern kann im Allgemeinen auch qualitativ ausgebildet sein. Dies bedeutet, dass der Kontrast nicht eins zu eins die Phase des Probenobjekts wiedergeben muss. In manchen Beispielen könnte zum Beispiel ein Phasengradientenkontrast verwendet werden, d. h. der Kontrast könnte die Änderung der Phase indizieren.
Die hierin beschriebenen Techniken ermöglichen es, das Ergebnisbild durch digitale Nachbearbeitung von ein oder mehreren Bildern eines Probenobjekts zu bestimmen. Beispielsweise wäre es möglich, dass das eine oder die mehreren Bilder des
Probenobjekts Intensitätsbilder sind, die selbst keinen Phasenkontrast aufweisen.
Das eine oder die mehreren Bilder des Probenobjekts können mit unterschiedlichen Beleuchtungsgeometrien assoziiert sein. Dies bedeutet, dass das eine oder die mehreren Bilder jeweils bei gleichzeitiger Beleuchtung des Probenobjekts mittels einer entsprechenden Beleuchtungsgeometrie durch einen Detektor erfasst werden können. Dies wird auch als winkelvariable Beleuchtung bezeichnet.
Die unterschiedlichen Beleuchtungsgeometrien können beispielsweise mit unterschiedlichen Beleuchtungsrichtungen assoziiert sein. Die unterschiedlichen Beleuchtungsgeometrien bzw. assoziierte unterschiedliche Bilder können durch Zeit- Multiplexen oder Frequenz-Multiplexen voneinander getrennt werden. Es wäre auch eine Trennung mittels unterschiedlicher Polarisationen möglich. Die
Beleuchtungsgeometrien können eine Richtungsabhängigkeit aufweisen.
Beispielsweise können die Beleuchtungsgeometrien einen Gradienten der
Beleuchtungsstärke entlang einer oder mehrerer Raumrichtungen aufweisen. Zum Beispiel könnte die Beleuchtungsstärke stufenförmig entlang einer Raumrichtung variieren, etwa zwischen Null und einem endlichen Wert oder zwischen zwei unterschiedlichen endlichen Werten.
Beispielsweise kann das Probenobjekt ein Phasenobjekt umfassen, beispielsweise eine Zelle oder eine Zellkultur, etc. Das Probenobjekt kann a-priori unbekannt sein, d.h. es können unterschiedliche Probenobjekte durch den Probenhalter fixiert werden. Das Probenobjekt könnte auch für das verwendete Licht nicht
lichtdurchlässig sein. Je nach Art des Probenobjekts kann es erstrebenswert sein, das Beleuchtungsmodul und den Detektor in Auflichtgeometrie oder
Durchlichtgeometrie zu betreiben. Gemäß verschiedener Beispiele wird zur Steigerung der Stärke des Phasenkontrasts ein Absorptionsfilter verwendet, der in der Abbildungsoptik des Mikroskops
angeordnet ist. Der Absorptionsfilter weist dazu eine ortsabhängige Absorptionsrate auf, die als Funktion der lateralen Positionen senkrecht zur optischen Achse des Mikroskops variiert.
FIG. 1 illustriert ein beispielhaftes optisches System 90. Beispielsweise könnte das optische System 90 ein Mikroskop 100 umfassen, zum Beispiel ein Lichtmikroskop in Durchlichtgeometrie oder aber in Auflichtgeometrie.
Mittels des Mikroskops 100 kann es möglich sein, kleine Strukturen eines auf einem Probenhalter 113 fixierten Messobjekts bzw. Probenobjekts vergrößert darzustellen.
Das Mikroskop 100 umfasst dazu ein Beleuchtungsmodul 111. Das
Beleuchtungsmodul 111 kann eingerichtet sein, um einen Probenhalter 113 vollflächig zu beleuchten, jeweils mit unterschiedlichen Beleuchtungsgeometrien.
Die vollflächige Beleuchtung kann bedeuten, dass die Beleuchtungsstärke im
Bereich des Probenobjekts bzw. der Probenhalter 113 nicht signifikant variiert. Dies unterscheidet die hierin beschriebenen Techniken von einer strukturierten
Beleuchtung mit einem Beleuchtungsmuster.
Das Beleuchtungsmodul 111 weist eine numerische Beleuchtungsapertur auf. Die numerische Beleuchtungsapertur definiert denjenigen Bereich, aus welchem Licht auf ein Probenobjekt eingestrahlt werden kann.
Außerdem umfasst das Mikroskop 100 eine Abbildungsoptik 112 (manchmal auch als Objektiv oder Detektoroptik bezeichnet), die eingerichtet ist, um ein Abbild des Messobjekts auf einer Detektorfläche eines Detektors 114 zu erzeugen. Eine numerische Detektorapertur der Abbildungsoptik 112 kann eine Hellfeld-Bildgebung und/oder eine Dunkelfeld-Bildgebung ermöglichen, zum Beispiel je nach verwendeter Beleuchtungsgeometrie. Im Beispiel der FIG. 1 ist das Beleuchtungsmodul 111 eingerichtet, um eine winkelvariable Beleuchtung des Messobjekts zu ermöglichen. Dies bedeutet, dass mittels des Beleuchtungsmoduls 111 unterschiedliche Beleuchtungsgeometrien des zur Beleuchtung des Messobjekts verwendeten Lichts implementiert werden können. Die unterschiedlichen Beleuchtungsgeometrien können jeweils eine oder mehrere Rückbeleuchtungsrichtungen bzw. Beleuchtungswinkel umfassen.
Dabei sind in den verschiedenen hierin beschriebenen Beispielen unterschiedliche Hardware-Implementierungen möglich, um die unterschiedlichen
Beleuchtungsgeometrien bereitzustellen. Beispielsweise könnte das
Beleuchtungsmodul 111 mehrere einstellbare Lichtquellen umfassen, die eingerichtet sind, um lokal Licht zu modifizieren und/oder zu erzeugen (in FIG. 1 sind die
Lichtquellen nicht dargestellt).
Eine Recheneinheit 115 des optischen Systems 90 kann das Beleuchtungsmodul 111 bzw. die Lichtquellen ansteuern. Beispielsweise könnte die Recheneinheit 115 als Mikroprozessor oder Mikrocontroller implementiert sein. Alternativ oder zusätzlich könnte die Recheneinheit 115 beispielsweise einen FPGA oder ASIC umfassen. Die Recheneinheit 115 kann alternativ oder zusätzlich auch der Probenhalter 113, die Abbildungsoptik 112 und/oder den Detektor 114 ansteuern bzw. auslesen. Die Recheneinheit 115 kann auch Rechenoperationen im Zusammenhang mit der digitalen Nachbearbeitung von mittels des Detektors 114 erfassten Bildern
durchführen.
In manchen Beispielen ist es möglich, dass die Recheneinheit 115 in ein Gehäuse des Mikroskops 100 integriert ist. In anderen Beispielen wäre es aber auch möglich, dass die Recheneinheit 115 extern vom Mikroskop 100 vorgesehen ist.
Beispielsweise könnte die Recheneinheit 115 durch ein entsprechendes
Computerprogramm, das auf einem PC ausgeführt wird, implementiert sein.
FIG. 2 ist ein Flussdiagramm eines beispielhaften Verfahrens. Beispielsweise könnte das Verfahren gemäß FIG. 2 von der Recheneinheit 115 aus FIG. 1 ausgeführt werden. Das Verfahren nach FIG. 2 ermöglicht es, ein Ergebnisbild mit Phasenkontrast zu erzeugen, indem eine winkelvariable Beleuchtung verwendet wird.
Zunächst wird in Block 9001 das Beleuchtungsmodul 111 angesteuert, sodass mehrere Beleuchtungsgeometrien erzeugt werden. Dies bedeutet, dass zum Beispiel nacheinander unterschiedliche Leuchtdioden einer Leuchtdioden-Matrix an- und ausgeschaltet werden können. Es können auch mehrere Leuchtdioden der
Leuchtdioden-Matrix gleichzeitig angeschaltet werden, um derart eine
Beleuchtungsgeometrie mittels gleichzeitiger Beleuchtung aus mehreren
Beleuchtungsrichtungen zu implementieren. Beispielweise könnte eine Halbraum- Beleuchtung umgesetzt werden, bei der alle Leuchtdioden eines Halbraums an- bzw. ausgeschaltet werden.
Dann erfolgt in Block 9002 das Ansteuern des Detektors 114, um mehrere Bilder zu erfassen. Dabei erfolgen das Ansteuern des Beleuchtungsmoduls 111 in Block 9001 und das Ansteuern des Detektors 114 in Block 9002 synchronisiert, sodass die verschiedenen erfassten Bilder jeweils einer entsprechenden Beleuchtungsgeometrie bzw. ein oder mehreren entsprechenden Beleuchtungsrichtungen, die die jeweilige Beleuchtungsgeometrie ausbilden, zugeordnet sind. Zeit- oder Wellenlängen- oder Polarisations-Multiplexen kann verwendet werden.
Im optionalen Block 9003 werden dann die in Block 9002 erfassten Bilder
miteinander kombiniert, um derart ein Ergebnisbild zu erhalten. Dieses Ergebnisbild weist einen verbesserten Kontrast auf, zum Beispiel einen Phasenkontrast.
Es können in Block 9003 ganz unterschiedliche Techniken zur Kombination der erfassten Bilder miteinander eingesetzt werden. Je nach Kombination, zum Beispiel mit oder ohne Normierung oder mit oder ohne Betragsbildung usw., kann der
Phasenkontrast variieren. Entsprechende Techniken sind zum Beispiel beschrieben in: DE 10 2014 112 242 A1 und DE 10 2017 108 873 A1.
Optional können in Blick 9003 auch bildverarbeitende Techniken angewendet werden, z.B. auf die einzelnen erfassten Bilder und/oder das Ergebnisbild. Beispiele für bildverarbeitende Techniken umfassen: Hintergrund-Normalisierung; Entrauschung; Frequenzfilterung; Frequenzmanipulation; etc..
Durch die Verwendung eines Absorptionsfilter im Strahlengang kann insbesondere ein besonders homogen ausgebildeter Phasenkontrast mit allen relevanten
Raumfrequenzen der Phase erzielt werden. Dies wird nachfolgend näher erläutert.
FIG. 3 illustriert eine beispielhafte Implementierung des Beleuchtungsmoduls 111. FIG. 3 ist eine Darstellung des Beleuchtungsmoduls 111 , das sich senkrecht zur optischen Achse 309 in der durch die X- und Y-Achse aufgespannten lateralen Ebene erstreckt.
Aus FIG. 3 ist ersichtlich, dass das Beleuchtungsmodul 111 eine Matrix aus
Leuchtdioden 121-1 , 121 -2 aufweist (wobei aber auch andere Implementierungen möglich wären). Dabei sind die Leuchtdioden 121 -1 innerhalb der numerischen Detektorapertur 319 der Abbildungsoptik 112 angeordnet, während die Leuchtdioden 121 -2 außerhalb der numerischen Detektorapertur 319 der Abbildungsoptik 112 angeordnet sind. Dies bedeutet, dass mittels des Beleuchtungsmoduls 111 insbesondere eine Hellfeld-Bildgebung, wie auch eine Dunkelfeld-Bildgebung erfolgen kann.
In verschiedenen hierin beschriebenen Beispielen ist es möglich, dass die
numerische Detektorapertur 319 so groß ist, dass alle Leuchtdioden innerhalb der numerischen Detektorapertur 319 der Abbildungsoptik 112 angeordnet sind. In diesem Fall ist keine Dunkelfeld-Bildgebung möglich.
FIG. 4 illustriert Aspekte im Zusammenhang mit dem individuellen Betreiben der verschiedenen Leuchtdioden 121-1 , 121 -2 des Beleuchtungsmoduls 111. FIG. 4 ist eine Schnittansicht entlang der Achse X-X‘ aus FIG. 3.
In dem Beispiel der FIG. 4 wird eine Beleuchtungsgeometrie 700 durch das isolierte Anschalten der mit dem Pfeil markierten Leuchtdiode 121 -1 erreicht. Dadurch wird das Probenobjekt vollflächig aus einer bestimmten Beleuchtungsrichtung beleuchtet, die der relativen Anordnung der markierten Leuchtdiode 121 -1 zur optischen Achse 309 entspricht. Im Allgemeinen wäre es aber auch möglich, dass pro
Beleuchtungsgeometrie mehr als eine Leuchtdiode 121-1 , 121 -2 angeschaltet wird, sodass sich eine entsprechende Beleuchtungsgeometrie aus mehreren
Beleuchtungsrichtungen zusammensetzt. Es wäre auch möglich, eine ausgedehnte Leuchtfläche zu verwenden. Unterschiedliche Beleuchtungsgeometrien können dabei zumindest teilweise verschiedene Beleuchtungsrichtungen aufweisen.
Im Zusammenhang mit den FIG. 5 - 7 wird nachfolgend die Funktionsweise der winkelvariablen Beleuchtung zur Erzeugung eines Ergebnisbilds mit Phasenkontrast beschrieben.
FIG. 5 illustriert dabei Aspekte der Beleuchtung eines Probenobjekts 390, das in einer Probenebene 302 angeordnet ist, wobei das Probenobjekt 390 keinen
Phasenversatz des einfallenden Lichts bewirkt.
In FIG. 5 ist eine numerische Beleuchtungsapertur 301 des Beleuchtungsmoduls 111 schematisch als Feldblende dargestellt (außerdem bestimmt eine Brennweite die numerische Beleuchtungsapertur; die Brennweite ist aber aus Gründen der
Einfachheit in FIG. 5 nicht gesondert beschriftet). Der Durchmesser 305 einer die Beleuchtungsapertur 301 definierenden Austrittspupille ist auch dargestellt. Der Durchmesser 305 definiert, zusammen mit der Brennweite, die numerische Apertur.
In FIG. 5 werden zwei Beleuchtungsgeometrien 701 (durchgezogene Linien) und 702 (gestrichelte Linien) verwendet. Die entsprechenden mittleren
Beleuchtungsrichtungen 381 , 382 sind auch dargestellt. Das Licht der
Beleuchtungsgeometrie 701 fällt aus dem oberen Halbraum auf das Probenobjekt 390 ein; und das Licht der Beleuchtungsgeometrie 702 fällt aus dem unteren
Halbraum auf das Probenobjekt 390 ein. Eine beispielhafte Implementierung der Beleuchtungsgeometrien 701 , 702 könnte zum Beispiel durch ein
Beleuchtungsmodul 111 mit einer Matrix aus Leuchtdioden 121 -1 , 121 -2 erreicht werden, wobei im Zusammenhang mit der Beleuchtungsgeometrie 701 alle
Leuchtdioden 121-1 , 121 -2 oberhalb einer Mittellinie eingeschaltet werden und wobei im Zusammenhang mit der Beleuchtungsgeometrie 702 alle Leuchtdioden 121 -1 , 121 -2 unterhalb von der Mittellinie eingeschaltet werden (vergleiche auch FIG. 3, wo die entsprechende Mittellinie mit einer gestrichelt-gepunkteten Linie dargestellt ist).
Die Abbildungsoptik 112 umfasst im Beispiel der FIG. 5 ein Linsenpaar 311 , 312, wobei zwischen den Linsen 311 , 312 eine konjugierte Ebene (Pupillenebene) definiert ist. Der Durchmesser 315 einer die numerische Detektorapertur 319 definierende Eintrittspupille der Abbildungsoptik 112 ist in FIG. 5 auch dargestellt (die numerische Detektorapertur 319 wird außerdem noch durch die Brennweite der Abbildungsoptik 112 bestimmt, wobei aber die Brennweite aus Gründen der
Einfachheit in FIG. 5 nicht dargestellt ist).
Die Detektorebene 321 , auf welche das Licht fokussiert wird, ist in FIG. 5 ganz rechts illustriert. Außerdem ist in FIG. 5 auch noch die optische Achse 309 (Hauptstrahl) dargestellt (gestrichelt-gepunktete Linie in FIG. 5).
Weil das Probenobjekt 390 in FIG. 5 ein Amplitudenobjekt ist und keinen
Phasenversatz des einfallenden Lichts bewirkt, erfolgt beim Durchlaufen des
Probenobjekts 390 auch keine Richtungsänderung des Lichts. Dies ist im Szenario der FIG. 6 anders.
FIG. 6 illustriert Aspekte der Beleuchtung des Probenobjekts 390. Dabei entspricht das Beispiel der FIG. 6 grundsätzlich dem Beispiel der FIG. 5. Im Beispiel der FIG. 6 wird aber ein Phasenobjekt als Probenobjekt 390 verwendet. Dieses bewirkt eine Ablenkung des Lichts weg von der optischen Achse 309, im Beispiel der FIG. 6 nach oben. Deshalb kann nicht alles Licht durch die numerische Detektorapertur 319 hindurch treten. Insbesondere wird ein Teil des Lichts (mit dem Pfeil markiert), welches mit der Beleuchtungsgeometrie 702 assoziiert ist, nicht auf die
Detektorebene 321 abgebildet, weil es nicht innerhalb der numerischen
Detektorapertur 319 liegt. Hingegen kann alles Licht, welches mit der
Beleuchtungsgeometrie 701 assoziiert ist, auf die Detektorebene 321 fokussiert werden.
Deshalb liegt eine Asymmetrie zwischen den mit den Beleuchtungsgeometrien 701 , 702 assoziierten Bildern vor. Dieses Modell plausibilisiert qualitativ das Vorliegen eines Phasenkontrasts in einem Ergebnisbild, welches durch Kombination der Bilder, die den Beleuchtungsgeometrien 701 , 702 entsprechen, erhalten wird. Die
Kombination kann durch Addition oder Differenzbildung erfolgen.
Für kleine Phasengradienten ist die Differenz der Bilder, die den
Beleuchtungsgeometrien 701 , 702, gleich oder in etwa gleich Null: dies ist der Fall, da das Licht aus beiden Beleuchtungshälften (oben und unten in FIG. 6) trotz der Verschiebung durch den (kleinen) Phasengradienten ungehindert das System durchlaufen kann und auf den Detektor trifft. Dies trifft insbesondere zu, wenn die numerische Detektorapertur 319 vergleichsweise groß ist und daher das Licht aus beiden Beleuchtungshälften innerhalb der numerischen Detektorapertur 319 liegt. Dieser Befund wird im Zusammenhang mit FIG. 7 erläutert.
FIG. 7 illustriert Aspekte der Beleuchtung des Probenobjekts 390. Dabei entspricht das Beispiel der FIG. 7 grundsätzlich dem Beispiel der FIG. 6. Im Beispiel der FIG. 7 wird aber eine vergrößerte numerische Detektorapertur 319 verwendet, im Vergleich zu dem Beispiel der FIG. 6. Insbesondere ist dem Beispiel der FIG. 7 die numerische Detektorapertur 319 größer als die numerische Beleuchtungsapertur 301 (was schematisch durch einen größeren Durchmesser 315, im Vergleich zum
Durchmesser 305, illustriert ist).
In einem solchen Szenario, wie es in FIG. 7 dargestellt ist, erreicht auch alles Licht der Beleuchtungsgeometrie 702 die Detektorebene 321 (siehe insbesondere den Lichtstrahl, der mit einem Pfeil in FIG. 7 markiert ist und vergleiche mit FIG. 6).
FIG. 7 motiviert qualitativ, wieso gemäß Referenzimplementierungen die numerische Detektorapertur 319 vergleichsweise klein dimensioniert werden muss, insbesondere in Bezug auf die numerische Beleuchtungsapertur 301. Nachfolgend werden
Techniken beschrieben, welche es ermöglichen, eine große numerische
Detektorapertur 319 zu verwenden, ohne die Möglichkeit zu verlieren, auch ein Ergebnisbild ein Phasenkontrast zu erhalten. Die Verwendung einer großen numerischen Detektorapertur 319 ermöglicht es grundsätzlich, Bilder mit einer großen Auflösung zu erfassen. FIG. 8 illustriert Aspekte der Beleuchtung des Probenobjekts 390. Dabei entspricht das Beispiel der FIG. 8 grundsätzlich dem Beispiel der FIG. 7. Insbesondere ist auch im Beispiel der FIG. 8 - wie schon voranstehend im Zusammenhang mit FIG. 7 erläutert - der Durchmesser 315 der Eintrittspupille, der mit der Detektorapertur 319 assoziiert ist, größer als der Durchmesser 305 der Austrittspupille, der mit der Beleuchtungsapertur 301 assoziiert ist. Dies soll schematisch illustrieren, dass die numerische Detektorapertur 319 größer sein kann, als die numerische
Beleuchtungsapertur 301 (wobei bei dieser Betrachtung die Brennweiten der Beleuchtung und der Detektoroptik berücksichtigt werden, die in FIG. 8 aus Gründen der Einfachheit nicht beschriftet sind).
Im Beispiel der FIG. 8 ist ein Absorptionsfilter 800 vorgesehen, der in der
Abbildungsoptik 112 angeordnet ist und der eine ortsabhängige Absorptionsrate aufweist (die ortsabhängige Absorptionsrate ist in FIG. 8 durch die in X-Richtung orientierten, nicht durchgezogenen Linien des Absorptionsfilters 800 illustriert).
Durch die Verwendung eines solchen Absorptionsfilters 800 mit einer
Ortsabhängigkeit der Absorptionsrate kann erreicht werden, dass Licht, welches aufgrund des Phasenversatzes des Probenobjekts 390 im Bereich der Pupillenebene der Abbildungsoptik 112 einen großen lateralen Abstand zur optischen Achse 309 aufweist, stärker absorbiert wird. Dadurch kann wiederum, durch Kombination der verschiedenen Bilder, die den unterschiedlichen Beleuchtungsgeometrien 701 , 702 entsprechen, ein Ergebnisbild mit Phasenkontrast erzielt werden - obwohl eine große numerische Detektorapertur 319 verwendet wird.
Durch geeignete Dimensionierung der Ortsabhängigkeit der Absorptionsrate kann gleichermaßen erreicht werden, dass auch für weniger verschiedene
Beleuchtungsgeometrien - zum Beispiel durch Verwendung von nah
beieinanderliegenden Leuchtdioden 121-1 , 121 -2 zur Implementierung der
Beleuchtungsgeometrien - ein verstärkter Phasenkontrast erzielt wird.
Details im Zusammenhang mit der Ortsabhängigkeit der Absorptionsrate des
Absorptionsfilter 800 sind nachfolgend im Zusammenhang mit den FIG. 9 und 10 beschrieben. FIG. 9 und FIG. 10 illustrierten Aspekte im Zusammenhang mit dem Absorptionsfilter 800. Insbesondere illustrieren FIG. 9 und FIG. 10 die Ortsabhängigkeit der
Absorptionsrate 810 des Absorptionsfilters.
In den Beispielen der FIG. 9 und FIG. 10 nimmt die Absorptionsrate 810 für größere Abstände zur optischen Achse 309 (d. h. in lateraler Richtung, in FIG. 5-8 in X- Richtung) größere Werte an. Dabei weist die Absorptionsrate 810 in der
beispielhaften Implementierung der FIG. 9 einen stufenförmigen radialen Verlauf auf; und in der Implementierung der FIG. 10 einen graduellen radialen Verlauf.
Die Ortsabhängigkeit der Absorptionsrate 810 könnte rotationssymmetrisch in Bezug auf die optische Achse 390 in der lateralen Ebene (durch X-Achse und Y-Achse aufgespannt) ausgebildet sein. Es wäre aber auch eine nicht rotationssymmetrische Ausbildung möglich: In den Beispielen der FIG. 9 und FIG. 10 sind nämlich
monotone Verläufe der Absorptionsrate 810 dargestellt. In manchen Beispielen kann die Absorptionsrate 810 auch lokal nicht-monoton ausgebildet sein (z.B. entlang der X-Achse oder entlang der Y-Achse), sofern das Integral über die Fläche monoton verbleibt. Hier soll gelten, dass das Integral des Lichts über die Fläche (in der XY- Ebene, senkrecht zur optischen Achse 309) der Beleuchtungsgeometrie für größere Abstände zur optischen Achse 309 monoton abnimmt.
Die Absorptionsrate 810 könnte als Funktion des Abstands zur optischen Achse 309 monoton zunehmen.
Durch eine solche Ausbildung der Ortsabhängigkeit der Absorptionsrate 810 kann der im Zusammenhang mit den FIG. 5-8 voranstehend beschriebene Effekt der stärkeren Abschwächung von Lichtstrahlen, die einen größeren lateralen Abstand zur optischen Achse 309 aufweisen, erzielt werden - und damit die Verstärkung des Phasenkontrasts im Ergebnisbild erreicht werden.
In den Beispielen der FIG. 9 und FIG. 10 ist außerdem noch ein innerer Bereich 801 angrenzend an die optische Achse 309 und ein äußerer Bereich 802, der den inneren Bereich 801 in lateraler Richtung versetzt umgibt, dargestellt. Die Absorptionsrate 810 ist im äußeren Bereich 802 größer als im inneren Bereich 801. Dabei wurde in verschiedenen Tests beobachtet, dass ein vergleichsweise großer Unterschied zwischen der Absorptionsrate 810 im äußeren Bereich 802 und der Absorptionsrate 810 im inneren Bereich 801 erstrebenswert sein kann. Zum Beispiel wäre es möglich, dass die Absorptionsrate 810 im inneren Bereich 801 nicht größer als 10 % ist, und die Absorptionsrate im äußeren Bereich >50 % ist. Dadurch kann erreicht werden, dass Licht, welches nahe der optischen Achse 309 durch die
Abbildungsoptik 112 und insbesondere die Pupillenebene verläuft, nicht oder nicht signifikant abgeschwächt wird, sodass die Bilder ein starkes Signal aufweisen.
Andererseits kann durch die Dimensionierung der Absorptionsrate 810 im äußeren Bereich 802 von größer 0 %, zum Beispiel im Bereich von 10 % bis 50 %, erreicht werden, dass das Ergebnisbild einen Phasenkontrast aufweist, gleichzeitig, aber auch eine hohe Auflösung.
Beispielsweise könnte bei einer Dimensionierung der Absorptionsrate 810 im äußeren Bereich 802 im Bereich von 10% bis 20% auch eine Kombination mit Fluoreszenz-Bildgebung ermöglicht werden (wo typischerweise vergleichsweise geringe Lichtintensität vorliegt). Bei zu großen Absorptionsraten besteht eine
Tendenz hin zu sinkenden Auflösungen.
In der Pupillenebene entsprechen Lichtstrahlen, die einen großen Abstand zur optischen Achse 309 aufweisen, hohen Ortsfrequenzen. Durch die begrenzte
Dämpfung der hohen Ortsfrequenzen durch die wie oben stehend dimensionierte Absorptionsrate 810 wird die Gesamtqualität der verschiedenen erfassten Bilder nicht oder nicht signifikant eingeschränkt.
In den FIG. 9 und 10 ist außerdem auch noch der Durchmesser 305 bzw. der
Durchmesser 315 dargestellt. Dies ermöglicht, eine relative quantitative
Dimensionierung der Ortsabhängigkeit der Absorptionsrate 810 anzugeben. Aus FIG. 9 und FIG. 10 ist beispielsweise ersichtlich, dass der innere Bereich 801 einen Durchmesser aufweist, der etwa gleich groß ist, wie der Durchmesser 305. Im
Allgemeinen wäre es möglich, dass der innere Bereich 801 einen Durchmesser aufweist, der im Bereich von 80 % bis 120 % des Durchmessers 305 des
Beleuchtungsmoduls 111 liegt, optional im Bereich von 80 % bis 100 %. Außerdem ist im Zusammenhang mit den FIG. 9 und 10 auch ersichtlich, dass sowohl der innere Bereich 801 , als auch der äußere Bereich 802 jeweils einen Durchmesser aufweisen, der kleiner ist als der Durchmesser 315.
Dadurch wird, wie obenstehend bereits beschrieben, ermöglicht, dass die
numerische Beleuchtungsapertur 301 des Beleuchtungsmoduls 111 kleiner dimensioniert ist, als die numerische Detektorapertur 319 der Abbildungsoptik 112; gleichzeitig kann trotzdem ein Ergebnisbild mit Phasenkontrast erhalten werden.
Zusammenfassend wurden voranstehend Techniken beschrieben, die es
ermöglichen, auch kleine Phaseninformation (beispielsweise
Phasengradienteninformation) bei der Beleuchtung mittels winkelvariabler
Beleuchtung zu übertragen. Dadurch kann ein Ergebnisbild mit besonders großem Phasenkontrast durch Kombination der Einzelbilder erhalten werden. In den verschiedenen hierin beschriebenen Techniken wird dies dadurch erreicht, dass die Differenz zwischen zwei Bildern, die unterschiedlichen Beleuchtungsgeometrien entsprechen, bereits bei kleinen Ablenkungen durch einen Phasengradienten ungleich Null maximiert werden. Dies wird insbesondere durch die Abschwächung eines Lichtstrahls erreicht, der durch das Phasenobjekt von der optischen Achse weggelenkt wird. Dazu wird ein Absorptionsfilter verwendet, der die Lichtintensität dieses Lichtstrahls reduziert. Der Absorptionsfilter kann z.B. ein Verlaufsfilter sein oder ein stufenartig ausgeführter Absorptionsfilter. Durch die Verwendung des Absorptionsfilters ergeben sich Differenzen ungleich 0 auch für einen kleinen Phasenversatz. Diese Differenzen sind (mindestens stückweise) proportional zum Gradienten der Phase.
Selbstverständlich können die Merkmale der vorab beschriebenen
Ausführungsformen und Aspekte der Erfindung miteinander kombiniert werden. Insbesondere können die Merkmale nicht nur in den beschriebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder für sich genommen verwendet werden, ohne das Gebiet der Erfindung zu verlassen.
Beispielsweise wurden voranstehend Techniken beschrieben, in denen die erfassten (Roh-)Bilder kombiniert werden, um das Ergebnisbild zu erhalten. Dabei ist es im Allgemeinen möglich, dass die erfassten Bilder nachbearbeitet werden, beispielsweise durch Anwendung von Filtern im Frequenzraum. Diese digitalen Filter können in Abhängigkeit vom verwendeten Absorptionsfilter ausgewählt werden. Dies beruht auf der Erkenntnis, dass bei schwachen Absorptionsraten des Filters die niedrigen Ortsfrequenzen bzw. die kleinen Phasengradienten nur schwach übertragen werden. Es ist dann möglich, (digitale) Frequenzfilter zu verwenden, die den Frequenzbereich der ein oder mehreren Roh-bildes und/oder des
Ergebnisbildes, der der Zone der Abschwächung entspricht, verstärkt. Z.B. kann der Bereich der Frequenzen mit einem Faktor multipliziert werden, während alle
Frequenzen außerhalb des Bereichs unverändert bleiben.
Es wären auch andere klassische Bildverarbeitungstechniken anwendbar.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. System (90), das umfasst:
- ein Mikroskop (100) mit einem Beleuchtungsmodul (111 ), einem
Probenhalter (113), einem Detektor (114) und einer zwischen dem Probenhalter (113) und dem Detektor (114) angeordneten Abbildungsoptik (112),
- mindestens eine Recheneinheit (115), die eingerichtet ist, um das
Beleuchtungsmodul (111 ) anzusteuern, um ein Probenobjekt (390) auf dem
Probenhalter (113) mit Licht aus mehreren Beleuchtungsrichtungen (700-703, 381 , 382) zu beleuchten, und um den Detektor (114) anzusteuern, um Bilder zu erfassen, die jeweils einer der mehreren Beleuchtungsrichtungen (700-703, 381 , 382) entsprechen,
- einen Absorptionsfilter (800), der in der Abbildungsoptik (112) angeordnet ist und der eine ortsabhängige Absorptionsrate (810) aufweist.
2. System (90) nach Anspruch 1 ,
wobei die Absorptionsrate (810) für größere Abstände zu einer optischen Achse (309) des Mikroskops (100) größere Werte annimmt.
3. System (90) nach Anspruch 1 oder 2,
wobei die Absorptionsrate (810) einen radialen Verlauf aufweist, der graduell oder stufenförmig ist.
4. System (90) nach einem der voranstehenden Ansprüche,
wobei der Absorptionsfilter (800) einen inneren Bereich (801 ) aufweist, der eine erste Absorptionsrate (810) aufweist,
wobei der Absorptionsfilter (800) einen den inneren Bereich umgebenden äußeren Bereich (802) aufweist, der eine zweite Absorptionsrate (810) aufweist, wobei die zweite Absorptionsrate (810) größer ist, als die erste
Absorptionsrate (810).
5. System (90) nach Anspruch 4,
wobei die Absorptionsrate (810) des inneren Bereichs (801 ) nicht größer als 10 % ist, und/oder wobei die Absorptionsrate (810) des äußeren Bereichs (802) größer als 50 % ist.
6. System (90) nach Anspruch 4 oder 5,
wobei der innere Bereich (801 ) einen Durchmesser aufweist, der im Bereich von 80 % bis 120 % eines Durchmessers (305) einer Austrittspupille liegt, wobei die Austrittspupille mit einer Beleuchtungsapertur (301 ) des Beleuchtungsmoduls (111 ) assoziiert ist.
7. System (90) nach einem der Ansprüche 4 bis 6,
wobei der innere Bereich (801 ) und der äußere Bereich (802) jeweils einen Durchmesser aufweisen, der kleiner ist als ein Durchmesser (315) einer
Eintrittspupille, die mit einer Detektorapertur (319) der Abbildungsoptik (112) assoziiert ist.
8. System (90) nach einem der voranstehenden Ansprüche,
wobei eine numerische Beleuchtungsapertur (301 ) des Beleuchtungsmoduls
(111 ) kleiner ist als eine numerische Detektorapertur (319) der Abbildungsoptik
(1 12).
9. System (90) nach einem der voranstehenden Ansprüche,
wobei der Absorptionsfilter (800) in einer Pupillenebene der Abbildungsoptik (112) angeordnet ist.
10. System (90) nach einem der voranstehenden Ansprüche,
wobei die mindestens eine Recheneinheit (115) weiterhin eingerichtet ist, um die Bilder zum Erhalten eines Ergebnisbilds miteinander zu kombinieren, wobei das Ergebnisbild einen Phasenkontrast aufweist.
11. Verfahren, das umfasst:
- Ansteuern eines Beleuchtungsmoduls (111 ) eines Mikroskops (100), um ein Probenobjekt (390) auf einem Probenhalter (113) des Mikroskops (100) mit Licht aus mehreren Beleuchtungsrichtungen (700-703, 381 , 382) zu beleuchten, - Ansteuern eines Detektors (114) des Mikroskops (100), um Bilder zu erfassen, die jeweils einer der mehreren Beleuchtungsrichtungen (700-703, 381 , 382) entsprechen,
wobei ein Absorptionsfilter (800) mit einer ortsabhängigen Absorptionsrate (810) in einer Abbildungsoptik (112) des Mikroskops angeordnet ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , wobei das Verfahren von der Recheneinheit (115) des Systems (90) nach einem der Ansprüche 1 bis 10 ausgeführt wird.
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