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WO2020109741A1 - Protéine de légumineuse soluble - Google Patents

Protéine de légumineuse soluble Download PDF

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Publication number
WO2020109741A1
WO2020109741A1 PCT/FR2019/052843 FR2019052843W WO2020109741A1 WO 2020109741 A1 WO2020109741 A1 WO 2020109741A1 FR 2019052843 W FR2019052843 W FR 2019052843W WO 2020109741 A1 WO2020109741 A1 WO 2020109741A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
hydrolysis
legume protein
weight
legume
Prior art date
Application number
PCT/FR2019/052843
Other languages
English (en)
Inventor
Jorge Luis VENTUREIRA
Original Assignee
Roquette Freres
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roquette Freres filed Critical Roquette Freres
Priority to CA3120956A priority Critical patent/CA3120956A1/fr
Priority to US17/296,077 priority patent/US20220007678A1/en
Priority to CN201980075680.4A priority patent/CN113163816A/zh
Priority to JP2021527955A priority patent/JP7510929B2/ja
Priority to EP19835703.0A priority patent/EP3886599A1/fr
Priority to AU2019389833A priority patent/AU2019389833A1/en
Publication of WO2020109741A1 publication Critical patent/WO2020109741A1/fr

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    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/185—Vegetable proteins

Definitions

  • the present invention relates to a legume protein having a low degree of hydrolysis and excellent solubility at acidic pH, its preparation process and the use of this protein, in particular in a food, cosmetic or pharmaceutical composition.
  • animal proteins have many disadvantages, both in terms of their allergenicity, in particular concerning proteins from milk or eggs, and in environmental terms in relation to the harmful effects of intensive farming.
  • peas have been the most developed legume in Europe, mainly in France, as an alternative protein resource to animal proteins intended for animal and human food.
  • the pea contains about 27% by weight of matter protein.
  • the term “pea” is considered here in its broadest sense and includes in particular all wild varieties of "smooth pea”, and all mutant varieties of “smooth pea” and “wrinkled pea” (“Wrinkled pea”), regardless of the uses for which these varieties are generally intended (human food, animal nutrition and / or other uses).
  • Pea protein mainly pea globulin
  • Pea protein extraction process mention may be made of patent EP1400537.
  • the seed is ground in the absence of water (a process known as "dry grinding") in order to obtain a flour.
  • This flour will then be suspended in water to extract the protein.
  • the hydrolysis, acidic and / or enzymatic, of proteins is a well-known process aimed at hydrolyzing peptide bonds and therefore reducing the degree of polymerization of proteins. It is well known to those skilled in the art that the smaller the average size of the proteins, the more their solubility increases. The hydrolysis of a protein therefore makes it possible to increase its solubility. However, with hydrolysis, the protein will also lose other functionalities such as its viscosity or its emulsifying power.
  • a legume protein isolate in particular a pea protein, the degree of hydrolysis of which is low, for example less than 15% , but whose solubility at acidic pH, for example at pH 5, is greater than 80%.
  • the present invention relates firstly to a legume protein containing more than 90% by weight of globulins relative to the total weight of proteins, said legume protein having:
  • solubility at pH 5 greater than 80%, preferably greater than 85%, even more preferably greater than 90%;
  • the present invention secondly relates to a process for preparing the legume protein according to the invention comprising the following steps:
  • the present invention also relates to the use of the legume protein according to the invention for the preparation of a human or animal food composition, a cosmetic composition or a pharmaceutical composition.
  • the legume protein of the present invention may in particular be a composition comprising a mixture of proteins extracted from a legume.
  • the legume protein according to the invention contains more than 90% by weight of globulins relative to the total weight of proteins.
  • protein should be understood in the present application as the macromolecules formed from one or more polypeptide chains consisting of the chain of amino acid residues linked together by peptide bonds.
  • the present invention relates more particularly to globulins (approximately 50-60% of pea proteins) and albumins (20-25%).
  • Pea globulins are mainly divided into three subfamilies: legumes, vicilins and convicilins.
  • legume in the present application will be understood the family of dicotyledonous plants of the order Fabales. It is one of the most important families of flowering plants, the third after Orchidaceae and Asteraceae by the number of species. It has about 765 genera comprising more than 19,500 species.
  • Several legumes are important cultivated plants including soybeans, beans, peas, chickpeas, faba beans, peanuts, lentils, alfalfa, various clovers, beans, carob, licorice.
  • the proteins extracted from these legumes belong mainly to the subgroups of globulins and albumin.
  • the legume protein is mainly made up of globulins, in particular it contains more than 90% by weight of globulins relative to the total weight of proteins.
  • Globulins can be distinguished from albumin by various methods well known to those skilled in the art, in particular by their solubility in water, the albumin being soluble in pure water whereas the globulin is only soluble in salt water. It is also possible to identify the albumin and globulin present in a mixture by electrophoresis or chromatography. A preferred method is described in the article "Peptide and protein molecular weight determination by electrophoresis using a high-molarity tris buffer System without urea. Fling SP, Gregerson DS, Anal. Biochem. 1986; 155: 83-88.
  • the legume protein according to the invention contains more than 90% by weight of globulins relative to the total weight of the proteins.
  • the legume protein according to the invention has a solubility at pH 5 greater than 80%, preferably greater than 85%, even more preferably greater than 90%.
  • the legume protein according to the invention may also have a solubility at pH 7 greater than 80%, preferably greater than 85%, even more preferably greater than 90%.
  • the solubility can be measured by diluting the legume protein in distilled water, centrifuging the mixture and analyzing the supernatant, according to Test A of solubility described below.
  • the legume protein according to the invention has a degree of hydrolysis of less than 15%, preferably less than 12%.
  • the degree of hydrolysis can be determined by measuring the content of free amino nitrogen relative to the total nitrogen according to Test B of degree of hydrolysis (Test called OPA) described below.
  • the legume protein is a faba bean protein or a pea protein. Pea protein is particularly preferred.
  • pea being here considered in its widest sense and including in particular all varieties of “smooth pea” (“smooth pea”) and “wrinkled pea” (“wrinkled pea”), and all mutant varieties of “smooth pea” and “wrinkled pea”, regardless of the uses for which these varieties are generally intended (human food, animal nutrition and / or other uses).
  • pea in the present application includes varieties of peas belonging to the genus Pisum and more particularly to the sativum and aestivum species. Said mutant varieties are in particular those called “mutants r”, “mutants rb”, “mutants rug 3”, “mutants rug 4”, “mutants rug 5” and “mutants lam” as described in the article by CL HEYDLEY and al. entitled “Developing novel pea starches” Proceedings of the Symposium of the Industrial Biochemistry and Biotechnology Group of the Biochemical Society, 1996, pp. 77-87.
  • the legume protein according to the invention is an isolate whose protein content is greater than 80% by weight relative to the weight of dry matter.
  • isolated in the present application a composition comprising a protein content greater than 80%, preferably greater than 90%, by weight relative to the weight of dry matter of the composition.
  • the protein content is measured by any technique well known to those skilled in the art. Preferably, a total nitrogen dosage is carried out (in% / gross) and the result is multiplied by the coefficient 6.25.
  • This well-known methodology in the field of vegetable proteins is based on the observation that proteins contain an average of 16% nitrogen. Any method of assaying dry matter well known to those skilled in the art can also be used.
  • the legume protein of the present invention can in particular be obtained by a process comprising the following steps: - implementation of a legume protein isolate in aqueous solution;
  • the legume protein isolate is chosen from a faba bean protein isolate or a pea protein isolate.
  • the pea protein isolate is particularly preferred.
  • the legume protein isolate used can come from several sources, whether commercial or custom, but the isolate must not have undergone prior hydrolysis, having reduced the size of its protein molecules constitutive.
  • the isolate will be obtained by carrying out the methods described in patents EP1400537 or EP1909593 of the Applicant.
  • the aqueous legume protein solution comprises from 5% to 20%, preferably from 8% to 12% by weight of dry matter relative to the weight of the aqueous solution.
  • proteases By “protease” is meant in the present application an enzyme capable of cleaving proteins or peptides by hydrolyzing their peptide bonds.
  • serine protease By “serine protease” is meant in the present application the proteases having an active site containing a serine residue which plays an essential role in catalysis. The different serine proteases are gathered in the international classification in the family EC 3.4.21
  • the serine protease used in the present invention is chymotrypsin-like.
  • chymotrypsin-like is meant a serine protease having a mode of action characterized in that the cleavage of the peptide bonds is located specifically after aromatic and hydrophobic amino acids such as tyrosine, phenylalanine or even leucine.
  • the amount by weight of enzyme necessary to add to obtain the desired degree of hydrolysis is quantified relative to the weight of proteins in the isolate used in the process according to the invention.
  • the amount of enzyme added is greater than 0.2%, preferably from 0.25% to 0.50%, by weight of enzyme relative to the weight of proteins in the isolate. It is also possible to add an amount of enzyme greater than 0.5%. We will then obtain an identical result but in a shorter time. Those skilled in the art will be able to adjust the amount of enzyme to achieve a desired reaction time.
  • the hydrolysis reaction can be carried out with stirring.
  • the hydrolysis is carried out for a period of 30 min to 2 hours, preferably about one hour. As described above, this time can be reduced by increasing the amount of enzyme. This adjustment will be readily apparent to those skilled in the art.
  • the hydrolysis is carried out at a temperature of 45 to 65 ° C, preferably from 50 to 60 ° C, more preferably around 55 ° C.
  • the heating can be carried out using any installation well known to those skilled in the art such as a submerged heat exchanger.
  • the temperature is adjusted from 45 to 65 ° C before the addition of the enzyme and is then regulated at +/- 2 ° C for the duration of the hydrolysis.
  • the hydrolysis is carried out at a pH of 8 to 10, preferably around 9.
  • the pH can be adjusted by adding acid and / or base, for example sodium hydroxide or hydrochloric acid.
  • acid and / or base for example sodium hydroxide or hydrochloric acid.
  • a buffer solution although not necessary, is possible.
  • the pH is adjusted from 8 to 10 before adding the enzyme and is then regulated to +/- 0.5 pH units during the duration of the hydrolysis.
  • the enzyme can be inhibited.
  • the reaction medium can be adjusted to pH 7 and 90 ° C for 5 min.
  • the hydrolyzed legume protein can be dried by any well-known drying process such as atomization (single or multiple effects) or lyophilization. This drying can optionally be preceded by a filtration step making it possible to remove undesirable solid particles.
  • the legume protein of the invention can be used for the preparation of a human or animal food composition, a cosmetic composition or a pharmaceutical composition.
  • the legume protein according to the invention is used for the preparation of an acidic drink, for example a soda.
  • the incorporation of the protein according to the invention in an acidic drink is particularly advantageous. Indeed, unlike a standard protein, it will remain solubilized and will not tend to precipitate during storage time. Thus the use of the protein according to the invention makes it possible to obtain an acidic drink which is stable on storage.
  • food composition means a composition intended for human or animal consumption.
  • food composition includes food products, food supplements and beverages.
  • cosmetic composition is meant a composition intended for cosmetic use.
  • pharmaceutical composition is meant a composition intended for therapeutic use.
  • Solubility test A In a 400 ml_ beaker, 150 g of distilled water are introduced at a temperature of 20 ° C +/- 2 ° C with stirring with a magnetic bar and precisely 5 g of sample of legume protein are added. to test. If necessary, the pH is adjusted to the desired value with 0.1 N NaOH. The water content is completed to reach 200 g of water. Mix for 30 minutes at 1000 rpm and centrifuge for 15 minutes at 3000 g. 25 g of the supernatant are collected and introduced into a previously dried and tared crystallizer. The crystallizer is placed in an oven at 103 ° C +/- 2 ° C for 1 hour. It is then placed in a desiccator (with dehydrating agent) to cool to room temperature and weighed.
  • a desiccator with dehydrating agent
  • solubility corresponds to the content of soluble dry matter, expressed in% by weight relative to the weight of the sample.
  • the solubility is calculated with the following formula:
  • m1 weight, in g, of the crystallizer after drying
  • Test B of degree of hydrolysis (Test called OPA)
  • the amino nitrogen content (free NH2) on the protein sample according to the invention is determined with the MEGAZYME kit (reference K-PANOPA).
  • the protein nitrogen content (total nitrogen) of the sample is also determined. We can then calculate the degree of hydrolysis.
  • amino nitrogen groups of the free amino acids in the sample react with N-acetyl-L-cysteine and OPhthaldialdehyde (OPA) to form isoindole derivatives.
  • the amount of isoindole derivative formed during this reaction is stoichiometric with the amount of free amino nitrogen. It is the isoindole derivative which is measured by the increase in absorbance at 340 nm.
  • a P * test portion In a 100 mL beaker, a P * test portion, exactly weighed, is introduced of the sample to be analyzed. This test portion will be 0.5 to 5.0 g depending on the amino nitrogen content of the sample. About 50 ml of distilled water are added, the mixture is homogenized and transferred to a 100 ml volumetric flask. 5 ml of 20% sodium dodecyl sulfate (SDS) are added and the mixture is made up with distilled water to reach a volume of 100 ml. The mixture is stirred for 15 minutes with a magnetic stirrer at 1000 rpm. A solution No. 1 is prepared by dissolving a tablet from the vial 1 of the Megazyme kit in 3 ml of distilled water and the mixture is stirred until complete dissolution. One tablet should be used per test. Solution No. 1 is prepared immediately.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • a blank, a standard and a sample are prepared directly in the spectrophotometer tanks under the following conditions:
  • each cell The contents of each cell are mixed and the absorbance measurement (A1) of the solutions is read after approximately 2 minutes with a spectrophotometer at 340 nm (spectrophotometer equipped with cells with 1.0 cm optical path, capable of measuring at a 340 nm wavelength, and verified according to the procedure described in the relevant manufacturer's technical manual).
  • the reactions are then started immediately by adding 100 mI of solution No. 2 which corresponds to the OPA solution from bottle 2 of the Megazyme kit in each spectrophotometer tank.
  • each tank The contents of each tank are mixed and placed for about 20 minutes in the dark. We then read the absorbance measurement A2 of the blank, the standard and the sample using a spectrophotometer at 340 nm.
  • AAblc Ablc2 - Ablc1
  • Aech2 absorbance of the sample after addition of solution 2
  • the protein nitrogen content is determined according to the DUMAS method according to ISO 16634 (2016). It is expressed as a percentage by weight relative to the weight of the product.
  • the degree of hydrolysis (DH) is calculated with the following formula:
  • Example 1 Production of a protein isolate according to the invention
  • 150 g of this isolate are introduced with 1290 g of drinking water at 20 ° C. into a stirred reactor with a volume of 1.5 liters. Its temperature is adjusted to 55 ° C using a system of internal plunging tubes, connected to a temperature regulation system. The pH is adjusted to 9 using 1 M HCl and NaOH solutions and a suitably calibrated pH meter.
  • Formea® CTL600 enzyme chymotrypsin-like serine protease
  • the reaction is thus controlled for 1 hour, with continuous stirring.
  • the pH is then regulated at 7 and the temperature at 90 ° C for 5 minutes in order to inhibit the enzyme.
  • the product is dried by lyophilization and corresponds to "Product according to the invention No. 1".
  • Example 2 Production of a second protein isolate according to the invention
  • Example 3 Production of protein isolate outside the invention for comparative purposes
  • Example 1 The hydrolysis protocols of this example are derived from Example 1 above. The modifications compared to the example are detailed in the table below. The amount of enzyme is expressed as a percentage by weight relative to the weight of proteins in the isolate. [Table 1]
  • enzymes used in this comparative example are not chymotrypsin-like serine proteases.
  • the degree of hydrolysis (DH), the solubility at pH 5 and the solubility at pH 7 are measured according to the tests described above.

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Abstract

La présente invention concerne une protéine de légumineuse ayant un faible degré d'hydrolyse et une excellente solubilité à pH acide, son procédé de préparation ainsi que l'utilisation de cette protéine, notamment dans une composition alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique.

Description

Description
Titre : Protéine de légumineuse soluble
Domaine technique
[0001] La présente invention concerne une protéine de légumineuse ayant un faible degré d’hydrolyse et une excellente solubilité à pH acide, son procédé de préparation ainsi que l’utilisation de cette protéine, notamment dans une composition alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique.
Technique antérieure
[0002] Les besoins quotidiens humains en protéines sont compris entre 12 et 20% de la ration alimentaire. Ces protéines sont fournies aussi bien par des produits d'origine animale (viandes, poissons, œufs, produits laitiers) que par des aliments végétaux (céréales, légumineuses, algues).
[0003] Cependant, dans les pays industrialisés, les apports en protéines sont majoritairement sous la forme de protéines d'origine animale. Or, de nombreuses études démontrent qu'une consommation excessive de protéines d'origine animale au détriment des protéines végétales est une des causes d'augmentation de cancers et maladies cardio-vasculaires.
[0004] Par ailleurs, les protéines animales présentent beaucoup de désavantages, tant sur le plan de leur allergénicité, concernant notamment les protéines issues du lait ou des oeufs, que sur le plan environnemental en relation avec les méfaits de l'élevage intensif.
[0005] Ainsi, il existe une demande croissante des industriels pour des composés d'origine végétale possédant des propriétés nutritionnelles et fonctionnelles intéressantes sans pour autant présenter les inconvénients de composés d'origine animale.
[0006] Depuis les années 70, le pois est la légumineuse à graines qui s’est le plus développée en Europe, majoritairement en France, comme ressource protéique alternative aux protéines animales à destination de l’alimentation animale et humaine. Le pois contient environ 27 % en poids de matières protéiques. Le terme « pois » est ici considéré dans son acception la plus large et inclut en particulier toutes les variétés sauvages de « pois lisse » (« smooth pea »), et toutes les variétés mutantes de « pois lisse » et de « pois ridé » (« wrinkled pea »), et ce quelles que soient les utilisations auxquelles on destine généralement lesdites variétés (alimentation humaine, nutrition animale et/ou autres utilisations).
[0007] La protéine de pois, majoritairement de la globuline de pois, est extraite et valorisée industriellement depuis bon nombre d’années. On peut citer comme exemple de procédé d’extraction de la protéine de pois le brevet EP1400537. Dans ce procédé, la graine est broyée en absence d’eau (procédé dit de « broyage à sec ») afin d’obtenir une farine. Cette farine sera ensuite mise en suspension dans de l’eau afin d’en extraire la protéine.
[0008] Hélas, cette protéine est connue pour être peu soluble, en particulier à pH acide. Par exemple, l’article A. C. Y. Lam, A. Can Karaca, R. T. Tyler & M. T. Nickerson (2018) « Pea protein isolâtes: Structure, extraction, and functionality, », Food Reviews International, 34:2, 126-147décrit que la solubilité d’isolats de protéines de pois est minimale autour de son pH isoélectrique, situé autour de 4,5. Les solubilités d’isolats de protéines de pois commerciaux ne dépassent pas 20% entre pH 4 et pH 5.
[0009] Il est du mérite de la Demanderesse d’avoir déjà précédemment proposé une solution pour améliorer cette solubilité par la demande de brevet WO2011124862. Celle-ci propose de réaliser un traitement thermique précis permettant d’améliorer les propriétés fonctionnelles des protéines végétales, en particulier la solubilité. Cependant, cette solubilité est mesurée à pH neutre (7,5) et celle-ci est toujours inférieure à 20% à pH acide (entre 4 et 5).
[0010] L’hydrolyse, acide et/ou enzymatique, des protéines est un procédé bien connu visant à hydrolyser les liaisons peptidiques et donc réduire le degré de polymérisation des protéines. Il est bien connu de l’homme du métier que plus la taille moyenne des protéines est faible, plus leur solubilité augmente. L’hydrolyse d’une protéine permet donc d’augmenter sa solubilité. Cependant, avec l’hydrolyse, la protéine va également perdre d’autres fonctionnalités telles que sa viscosité ou bien son pouvoir émulsifiant. L’article Poonam R. Bajaj, Kanishka Bhunia, Leslie Kleiner, Helen S. Joyner (Melito), Denise Smith, Girish Ganjyal & Shyam S. Sablani (2017) Improving functional properties of pea protein isolate for microencapsulation of flaxseed oil, Journal of Microencapsulation, 34:2, 218-230, décrit des hydrolyses enzymatiques réalisées avec différentes protéases sur un isolat de protéines de pois commercial. Cet article confirme que l’hydrolyse permet d’augmenter la solubilité. Cependant, à l’instar de WO2011124862, celle-ci est mesurée à pH neutre (7,4 qui est le pH de l’hydrolyse). En revanche, la solubilité à pH acide reste inférieure à 30%.
[0011] Il est possible d’envisager l’utilisation d’autres fractions protéiques telles les albumines. Cependant, si celles-ci sont effectivement plus solubles à pH acide, elles possèdent également des propriétés fonctionnelles, en particulier un pouvoir moussant très important, qui peuvent être indésirables dans certaines applications industrielles.
[0012] Il est donc toujours d’intérêt pour l’homme de l’art d’obtenir un isolat de protéine de légumineuse, en particulier une protéine de pois, dont le degré d’hydrolyse est faible, par exemple inférieur à 15%, mais dont la solubilité à pH acide, par exemple à pH 5, est supérieure à 80%.
[0013] Il est du mérite de la Demanderesse d’avoir mis au point une protéine de légumineuse répondant à ces critères.
Exposé de l’invention
[0014] La présente invention concerne en premier lieu une protéine de légumineuse contenant plus de 90% en poids de globulines par rapport au poids total de protéines, ladite protéine de légumineuse présentant :
- une solubilité à pH 5 supérieure à 80%, préférentiellement supérieure à 85%, encore plus préférentiellement supérieure à 90% ; et
- un degré d’hydrolyse inférieur à 15%, préférentiellement inférieur à 12%.
[0015] La présente invention concerne en second lieu un procédé de préparation de la protéine de légumineuse selon l’invention comprenant les étapes suivantes :
- mise en œuvre d’un isolat de protéine de légumineuse en solution aqueuse ;
- hydrolyse de l’isolat par ajout d’une enzyme sérine protéase chymotrypsin-like de manière à obtenir une protéine de légumineuse hydrolysée présentant un degré d’hydrolyse inférieur à 15%, préférentiellement inférieur à 12% ; - optionnellement inhibition de l’enzyme ;
- optionnellement séchage de la protéine de légumineuse hydrolysée.
[0016] Enfin, la présente invention concerne également l’utilisation de la protéine de légumineuse selon l’invention pour la préparation d’une composition alimentaire humaine ou animale, d’une composition cosmétique ou d’une composition pharmaceutique.
[0017] L’invention sera mieux comprise avec la description détaillée décrite ci- après.
Description détaillée de l’invention
[0018] La protéine de légumineuse de la présente invention peut notamment être une composition comprenant un mélange de protéines extraites d’une légumineuse.
[0019] La protéine de légumineuse selon l’invention contient plus de 90% en poids de globulines par rapport au poids total des protéines.
[0020] Le terme « protéine » doit se comprendre dans la présente demande comme les macromolécules formées d'une ou de plusieurs chaînes polypeptidiques constituées de l'enchaînement de résidus d'acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques. Dans le cadre particulier des protéines de pois, la présente invention concerne plus particulièrement les globulines (environ 50-60% des protéines du pois) et les albumines (20-25%). Les globulines de pois se subdivisent principalement en trois sous-familles : les légumines, les vicilines et les convicilines.
[0021] Par « légumineuse », on comprendra dans la présente demande la famille de plantes dicotylédones de l'ordre des Fabales. C'est l'une des plus importantes familles de plantes à fleurs, la troisième après les Orchidaceae et les Asteraceae par le nombre d'espèces. Elle compte environ 765 genres regroupant plus de 19 500 espèces. Plusieurs légumineuses sont d'importantes plantes cultivées parmi lesquelles le soja, les haricots, les pois, le pois chiche, la féverole, l'arachide, la lentille cultivée, la luzerne cultivée, différents trèfles, les fèves, le caroubier, la réglisse. [0022] Les protéines extraites de ces légumineuses appartiennent majoritairement aux sous-groupes des globulines et des albumines. Dans la présente invention, la protéine de légumineuse est majoritairement constituée de globulines, en particulier elle contient plus de 90% en poids de globulines par rapport au poids total des protéines. Les globulines peuvent être distinguées des albumines par diverses méthodes bien connues de l’homme du métier, notamment par leur solubilité dans l’eau, les albumines étant solubles dans l’eau pure alors que les globulines sont uniquement solubles dans l’eau salée. On peut également identifier les albumines et globulines présentes dans un mélange par électrophorèse ou chromatographie. Une méthode préférée est décrite dans l’article « Peptide and protein molecular weight détermination by electrophoresis using a high-molarity tris buffer System without urea. » Fling SP, Gregerson DS, Anal. Biochem. 1986;155:83-88. La protéine de légumineuse selon l’invention contient plus de 90% en poids de globulines par rapport au poids total des protéines.
[0023] La protéine de légumineuse selon l’invention présente une solubilité à pH 5 supérieure à 80%, préférentiellement supérieure à 85%, encore plus préférentiellement supérieure à 90%.
[0024] Selon un mode de réalisation particulier, la protéine de légumineuse selon l’invention peut également présenter une solubilité à pH 7 supérieure à 80%, préférentiellement supérieure à 85%, encore plus préférentiellement supérieure à 90%.
[0025] La solubilité peut être mesurée par dilution de la protéine de légumineuse dans de l’eau distillée, la centrifugation du mélange et l’analyse du surnageant, selon le Test A de solubilité décrit ci-après.
[0026] La protéine de légumineuse selon l’invention présente un degré d’hydrolyse inférieur à 15%, préférentiellement inférieur à 12%.
[0027] Le degré d’hydrolyse peut être déterminé en mesurant la teneur en azote aminé libre par rapport à l’azote total selon le Test B de degré d’hydrolyse (Test dit OPA) décrit ci-après. [0028] De manière préférée, la protéine de légumineuse est une protéine de féverole ou une protéine de pois. La protéine de pois est particulièrement préférée.
[0029] Le terme « pois » étant ici considéré dans son acception la plus large et incluant en particulier toutes les variétés de « pois lisse » (« smooth pea ») et « de pois ridés » (« wrinkled pea »), et toutes les variétés mutantes de « pois lisse » et de « pois ridé » et ce, quelles que soient les utilisations auxquelles on destine généralement lesdites variétés (alimentation humaine, nutrition animale et/ou autres utilisations).
[0030] Le terme « pois » dans la présente demande inclut les variétés de pois appartenant au genre Pisum et plus particulièrement aux espèces sativum et aestivum. Lesdites variétés mutantes sont notamment celles dénommées « mutants r », « mutants rb », « mutants rug 3 », « mutants rug 4 », « mutants rug 5 » et « mutants lam » tels que décrits dans l’article de C-L HEYDLEY et al. intitulé « Developing novel pea starches » Proceedings of the Symposium of the Industrial Biochemistry and Biotechnology Group of the Biochemical Society, 1996, pp. 77- 87.
[0031] De manière encore plus préférée, la protéine de légumineuse selon l’invention est un isolat dont la teneur en protéines est supérieure à 80% en poids par rapport au poids de matière sèche.
[0032] Par « isolat », on entend dans la présente demande une composition comprenant une teneur en protéines supérieure à 80%, préférentiellement supérieure à 90%, en poids par rapport au poids de matière sèche de la composition.
[0033] La teneur en protéine est mesurée par toute technique bien connue de l’homme du métier. De préférence, on réalise un dosage de l’azote total (en %/brut) et on multiplie le résultat par le coefficient 6,25. Cette méthodologie bien connue dans le domaine des protéines végétales se base sur le constat que les protéines contiennent en moyenne 16% d’azote. Toute méthode de dosage de la matière sèche bien connue de l’homme du métier peut être également utilisée.
[0034] La protéine de légumineuse de la présent invention peut notamment être obtenue par un procédé comprenant les étapes suivantes : - mise en œuvre d’un isolat de protéine de légumineuse en solution aqueuse ;
- hydrolyse de l’isolat par ajout d’une enzyme sérine protéase chymotrypsin-like de manière à obtenir un degré d’hydrolyse inférieur à 15%, préférentiellement inférieur à 12% ;
- optionnellement inhibition de l’enzyme ;
- optionnellement séchage de la protéine de légumineuse hydrolysée.
[0035] Selon un mode de réalisation préféré, l’isolat de protéine de légumineuse est choisi entre un isolat de protéine de féverole ou un isolat de protéine de pois. L’isolat de protéine de pois est particulièrement préféré.
[0036] L’isolat de protéine de légumineuse mis en œuvre peut provenir de plusieurs sources, qu’elles soient commerciales ou à façon, mais l’isolat ne doit pas avoir subi d’hydrolyse préalable, ayant réduit la taille de ses molécules protéiques constitutives. De manière préférée, l’isolat sera obtenu en réalisant les procédés décrits dans les brevets EP1400537 ou EP1909593 de la Demanderesse.
[0037] De manière préférée, la solution aqueuse de protéine de légumineuse comprend de 5% à 20%, préférentiellement de 8% à 12% en poids de matière sèche par rapport au poids de la solution aqueuse.
[0038] On ajoute ensuite à la solution ainsi préparée une enzyme de type sérine protéase chymotrypsin-like de manière à obtenir une protéine de légumineuse hydrolysée présentant un degré d’hydrolyse inférieur à 15%, préférentiellement inférieur à 12%.
[0039] Par « protéase », on entend dans la présente demande une enzyme apte à cliver des protéines ou des peptides en hydrolysant leurs liaisons peptidiques. Par « sérine protéase », on entend dans la présente demande les protéases ayant un site actif contenant un résidu de sérine qui joue un rôle essentiel dans la catalyse. Les différentes sérines protéases sont rassemblées dans la classification internationale dans la famille EC 3.4.21
[0040] La serine protéase utilisée dans la présente invention est chymotrypsin- like. Par « chymotrypsin-like », on entend une sérine protéase présentant un mode d’action caractérisé en ce que le clivage des liaisons peptidiques se situe spécifiquement après les acides aminés aromatiques et hydrophobes tels que la tyrosine, la phénylalanine ou encore la leucine.
[0041] La quantité en poids d’enzyme nécessaire à ajouter pour obtenir le degré d’hydrolyse souhaitée est quantifiée par rapport au poids de protéines dans l’isolat mis en œuvre dans le procédé selon l’invention. Selon un mode de réalisation particulier, la quantité d’enzyme ajoutée est supérieure à 0,2%, préférentiellement de 0,25% à 0,50%, en poids d’enzyme par rapport au poids de protéines dans l’isolat. On peut également ajouter une quantité d’enzyme supérieure à 0,5%. On obtiendra alors donnera un résultat identique mais dans un temps plus court. L’homme du métier saura ajuster la quantité d’enzyme pour atteindre un temps réactionnel désiré.
[0042] Après ajout de l’enzyme, la réaction d’hydrolyse peut être réalisée sous agitation. Selon un mode de réalisation particulier, l’hydrolyse est réalisée pendant une durée de 30 min à 2 heures, de préférence environ une heure. Comme décrit ci-dessus, ce temps peut être réduit en augmentant la quantité d’enzyme. Cet ajustement sera accessible de manière évidente pour l’homme du métier.
[0043] Selon un mode de réalisation particulier, l’hydrolyse est réalisée à une température de 45 à 65°C, de préférence de 50 à 60°C, plus préférentiellement environ 55°C. Le chauffage peut être réalisé à l’aide de toute installation bien connue de l’homme de l’art telle qu’un échangeur thermique immergé. De préférence, la température est ajustée de 45 à 65°C avant l’ajout de l’enzyme et est ensuite régulée à +/- 2°C pendant la durée de l’hydrolyse.
[0044] Selon un mode de réalisation particulier, l’hydrolyse est réalisée à un pH de 8 à 10, préférentiellement environ 9. Le pH peut être ajusté par ajout d’acide et/ou de base, par exemple de soude ou d’acide chlorhydrique. L’utilisation d’une solution tampon, bien que non nécessaire, est envisageable. De préférence, le pH est ajusté de 8 à 10 avant l’ajout de l’enzyme et est ensuite régulé à +/- 0,5 unités pH pendant la durée de l’hydrolyse.
[0045] Optionnellement, une fois la réaction d’hydrolyse achevée, l’enzyme peut être inhibée. Pour ce faire, par exemple, le milieu réactionnel peut être ajusté à pH 7 et à 90°C pendant 5 min. [0046] Optionnellement, la protéine de légumineuse hydrolysée peut être séchée par tout procédé bien connu de séchage tel que l’atomisation (simple ou multiple effets) ou la lyophilisation. Ce séchage peut éventuellement être précédé d’une étape de filtration permettant d’éliminer des particules solides indésirables.
[0047] La protéine de légumineuse de l’invention peut être utilisée pour la préparation d’une composition alimentaire humaine ou animale, d’une composition cosmétique ou d’une composition pharmaceutique.
[0048] En effet, du fait de son excellente solubilité à pH acide, une telle protéine de légumineuse est d’un intérêt certain dans de nombreuses applications industrielles, en particulier dans l’industrie agroalimentaire, cosmétique ou pharmaceutique, et en nutrition animale.
[0049] Selon un mode de réalisation particulier, la protéine de légumineuse selon l’invention est utilisée pour la préparation d’une boisson acide, par exemple un soda.
[0050] L’incorporation de la protéine selon l’invention dans une boisson acide est particulièrement avantageuse. En effet, contrairement à une protéine standard, celle-ci restera solubilisée et n’aura pas tendance à précipiter dans le temps de stockage. Ainsi l’utilisation de la protéine selon l’invention permet d’obtenir une boisson acide stable au stockage.
[0051] Par « composition alimentaire » on entend une composition destinée à l’alimentation humaine ou animale. Le terme composition alimentaire englobe les produits alimentaires, les compléments alimentaires et les boissons. Par « composition cosmétique » on entend une composition destinée à un usage cosmétique. Par « composition pharmaceutique » on entend une composition destinée à un usage thérapeutique.
[0052] L’invention sera mieux comprise à l’aide des exemples suivants.
Exemples
[0053] Procédés de test
[0054] Test A de solubilité [0055] Dans un bêcher de 400 ml_, on introduit 150 g d’eau distillée à une température de 20°C +/- 2°C sous agitation avec un barreau magnétique et on ajoute précisément 5 g d’échantillon de protéine de légumineuse à tester. Si besoin, on ajuste le pH à la valeur souhaitée avec NaOH 0,1 N. On complète le contenu en eau pour atteindre 200 g d’eau. On mélange pendant 30 minutes à 1000 rpm et on centrifuge pendant 15 minutes à 3000 g. On collecte 25 g du surnageant que l’on introduit dans un cristallisoir préalablement séché et taré. On place le cristallisoir dans une étuve à 103°C +/- 2°C pendant 1 heure. On le place ensuite dans un dessiccateur (avec agent déshydratant) pour refroidir à température ambiante et on le pèse.
[0056] La solubilité correspond au contenu en matières sèches solubles, exprimé en % en poids par rapport au poids de l’échantillon. La solubilité est calculée avec la formule suivante :
[0057] [Math. 1]
(ml— ml) x (200 + P)
% solubilité = x 100
PI x P
où :
P = poids, en g, de l’échantillon = 5 g
m1 = poids, en g, du cristallisoir après séchage
m2 = poids, en g, du cristallisoir vide
P1 = poids, en g, de l’échantillon collecté = 25 g
[0058] Test B de degré d’hydrolyse (Test dit OPA)
[0059] On détermine tout d’abord la teneur en azote aminé (NH2 libre) sur l’échantillon de protéines selon l’invention avec le kit MEGAZYME (référence K- PANOPA). On détermine également la teneur en azote protéique (azote total) de l’échantillon. On peut alors calculer le degré d’hydrolyse.
[0060] Détermination de la teneur en azote aminé :
[0061] Les groupes « azote aminé » des acides aminés libres de l’échantillon réagissent avec le N-acétyl-L-cystéine et l’OPhthaldialdéhyde (OPA) pour former des dérivés d’isoindole. [0062] La quantité de dérivé d’isoindole formée au cours de cette réaction est stoechiométrique avec la quantité d’azote aminé libre. C’est le dérivé d’isoindole qui est mesuré par l’augmentation de l’absorbance à 340 nm.
[0063] Dans un bêcher de 100 mL, on introduit une prise d’essai P*, exactement pesée, de l’échantillon à analyser. Cette prise d’essai sera de 0,5 à 5,0 g en fonction de la teneur en azote aminé de l’échantillon. On ajoute environ 50 mL d’eau distillée, on homogénéise et on transvase dans une fiole jaugée de 100 mL. On ajoute 5 mL de dodécyle sulfate de sodium (SDS) à 20% et on complète avec de l’eau distillée pour atteindre un volume de 100 mL. On agite pendant 15 minutes avec un agitateur magnétique à 1000 rpm. On prépare une solution n°1 en dissolvant un comprimé du flacon 1 du kit Megazyme dans 3 mL d’eau distillée et on agite jusqu'à dissolution complète. Il faut prévoir un comprimé par essai. La solution n°1 est préparée extemporanément.
[0064] On prépare un blanc, un standard et un échantillon directement dans les cuves du spectrophotomètre dans les conditions suivantes :
- blanc : introduire 3,00 ml de la solution n°1 et 50 pl d’eau distillée
- standard : introduire 3,00 ml de la solution n°1 et 50 pl du flacon 3 du kit Megazyme
- échantillon : introduire 3,00 ml de la solution n°1 et 50 mI de la préparation de l’échantillon.
[0065] On mélange le contenu de chaque cuve et on lit la mesure d’absorbance (A1 ) des solutions après 2 mn environ au spectrophotomètre à 340 nm (spectrophotomètre équipé de cuves de 1 ,0 cm de trajet optique, pouvant mesurer à une longueur d’onde de 340 nm, et vérifié selon le mode opératoire décrit dans le manuel technique du constructeur qui s’y rapporte).
[0066] On amorce ensuite les réactions immédiatement en ajoutant 100 mI de la solution n°2 qui correspond à la solution d’OPA du flacon 2 du kit Megazyme dans chaque cuve de spectrophotomètre.
[0067] On mélange le contenu de chaque cuve et on les place environ 20 minutes dans l’obscurité. [0068] On lit ensuite la mesure d’absorbance A2 du blanc, du standard et de l’échantillon au spectrophotomètre à 340 nm.
[0069] La teneur en azote aminé libre, exprimée en pourcentage en poids par rapport au poids du produit, est donnée par la formule suivante :
[0070] [Math. 2]
( AAech - AAblc) x 3,15 x 14,01 x V x 100
% azote aminé =
6803 x 0,05 x m x 1000
[0071] [Math. 3]
(AAech - AAblc) x 12,974 x V
% azote aminé = - ———- m x 1000
[0072]
AAech =Aech2 - Aechl
AAblc =Ablc2 - Ablc1
Aech2 = absorbance de l’échantillon après ajout de la solution n°2
Aechl = absorbance de l’échantillon après ajout de la solution n°1
Ablc2 = absorbance du blanc après ajout de la solution n°2
Ablc1 = absorbance du blanc après ajout de la solution n°1
V = volume de la fiole
m = masse de la prise d’essai en g
6803 = coefficient d’extinction du dérivé d’isoindole à 340 nm (en L.mol-1.cm-1 ). 14,01 = masse molaire de l’azote (en g.mol-1 )
3,15 = volume final dans la cuve (en ml_)
0,05 = prise d’essai dans la cuve (en ml_)
[0073] Détermination de la teneur en azote protéique :
[0074] La teneur d’azote protéique est déterminée selon la méthode de DUMAS selon la norme ISO 16634 (2016). Elle est exprimée en pourcentage en poids par rapport au poids du produit.
[0075] Calcul du degré d’hydrolyse
[0076] Le degré d’hydrolyse (DH) est calculé avec la formule suivante:
[0077] [Math. 4] % azote aminé
DH x 100
% azote protéique
[0078] Exemple 1 : Réalisation d’un isolat de protéine selon l’invention
[0079] On utilise un isolat de protéines de pois commercial NUTRALYS® S85F produit par la société ROQUETTE. L’isolat comprend 83% en poids de protéines par rapport au poids de matière sèche.
[0080] On introduit 150 g de cet isolat avec 1290 g d’eau potable à 20°C dans un réacteur agité d’un volume d’1 ,5 litres. On ajuste sa température à 55°C à l’aide d’un système de tubulures internes plongeantes, raccordées à un système de régulation de la température. On rectifie le pH à 9 à l’aide de solutions de HCl et NaOH 1 M et d’un pH-mètre convenablement étalonné.
[0081] On introduit ensuite 0,3 g d’enzyme Formea® CTL600 (serine protéase chymotrypsin-like) de la société NOVOZYMES.
[0082] La réaction est contrôlée ainsi pendant 1 heure, sous agitation permanente.
[0083] Le pH est ensuite régulé à 7 et la température à 90°C, ce pendant 5 minutes afin d’inhiber l’enzyme.
[0084] Le produit est séché par lyophilisation et correspond au « Produit selon l’invention n°1 ».
[0085] Exemple 2 : Réalisation d’un second isolat de protéine selon l’invention
[0086] Le « Produit selon l’invention n°2 » est obtenu selon l’exemple 1 en utilisant 0,6 g d’enzyme Formea® CTL600 au lieu de 0,3 g.
[0087] Exemple 3 : Réalisation d’isolat de protéine hors invention à but comparatif
[0088] Les protocoles d’hydrolyse de cet exemple sont dérivés de l’exemple 1 ci- dessus. Les modifications par rapport à l’exemple sont détaillées dans le tableau ci-dessous. La quantité d’enzyme est exprimée en pourcentage en poids par rapport au poids de protéines dans l’isolat. [0089] [Tableau 1]
Figure imgf000015_0001
[0090] Il est à noter que les enzymes utilisées dans cet exemple comparatif ne sont pas des sérines protéases chymotrypsin-like.
[0091] Exemple 4 : Comparaison des différents produits obtenus
[0092] Pour chaque échantillon, on mesure le degré d’hydrolyse (DH), la solubilité à pH 5 et la solubilité à pH 7 selon les tests décrits précédemment.
[0093] Les résultats sont synthétisés dans le tableau ci-dessous :
[0094] [Tableau 2]
Figure imgf000015_0002
Figure imgf000016_0001
[0095] Il y apparaît clairement que seule l’utilisation d’une sérine protéase chymotrypsin-like permet d’obtenir un isolat de protéine de légumineuse, ici le pois, qui présente une solubilité à pH 5 supérieure à 80% et une solubilité à pH 7 supérieure à 80%, tout en ayant un degré d’hydrolyse inférieur à 12.

Claims

Revendications
[Revendication 1] Protéine de légumineuse contenant plus de 90% en poids de globulines par rapport au poids total de protéines, caractérisée en ce que ladite protéine de légumineuse présente :
- une solubilité à pH 5 supérieure à 80%, préférentiellement supérieure à 85%, encore plus préférentiellement supérieure à 90% ; et
- un degré d’hydrolyse inférieur à 15%, préférentiellement inférieur à 12%.
[Revendication 2] Protéine de légumineuse selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu’elle présente une solubilité à pH 7 supérieure à 80%, préférentiellement supérieure à 85%, encore plus préférentiellement supérieure à 90%.
[Revendication 3] Protéine de légumineuse selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite protéine de légumineuse est une protéine de féverole ou une protéine de pois, préférentiellement une protéine de pois.
[Revendication 4] Protéine de légumineuse selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite protéine de légumineuse est un isolat dont la teneur en protéines est supérieure à 80% en poids par rapport au poids de matière sèche.
[Revendication 5] Procédé de préparation de la protéine de légumineuse telle que définie à l’une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes :
- mise en œuvre d’un isolat de protéine de légumineuse en solution aqueuse ;
- hydrolyse de l’isolat par ajout d’une enzyme sérine protéase chymotrypsin-like de manière à obtenir une protéine de légumineuse hydrolysée présentant un degré d’hydrolyse inférieur à 15%, préférentiellement inférieur à 12% ;
- optionnellement inhibition de l’enzyme ;
- optionnellement séchage de la protéine de légumineuse hydrolysée.
[Revendication 6] Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la quantité d’enzyme ajoutée est supérieure à 0,2%, préférentiellement de 0,25% à 0,50%, en poids d’enzyme par rapport au poids de protéines dans l’isolat.
[Revendication 7] Procédé selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que l’hydrolyse est réalisée à un pH de 8 à 10, préférentiellement environ 9.
[Revendication 8] Procédé selon l’une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que l’hydrolyse est réalisée à une température de 45 à 65°C, de préférence de 50 à 60°C, plus préférentiellement environ 55°C.
[Revendication 9] Procédé selon l’une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que l’hydrolyse est réalisée pendant une durée de 30 min à 2 heures, de préférence environ 1 heure.
[Revendication 10] Utilisation de la protéine de légumineuse telle que définie à l’une quelconque des revendications 1 à 4, pour la préparation d’une composition alimentaire humaine ou animale, d’une composition cosmétique ou d’une composition pharmaceutique, en particulier pour la préparation d’une boisson à pH acide, par exemple un soda.
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