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WO2020050626A1 - O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역을 포함하는 융합 폴리펩타이드 - Google Patents

O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역을 포함하는 융합 폴리펩타이드 Download PDF

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WO2020050626A1
WO2020050626A1 PCT/KR2019/011409 KR2019011409W WO2020050626A1 WO 2020050626 A1 WO2020050626 A1 WO 2020050626A1 KR 2019011409 W KR2019011409 W KR 2019011409W WO 2020050626 A1 WO2020050626 A1 WO 2020050626A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
polypeptide
seq
glycosylable
amino acid
amino acids
Prior art date
Application number
PCT/KR2019/011409
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김연철
이승주
고종욱
김규용
정샘
손영덕
Original Assignee
주식회사 엘지화학
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 엘지화학 filed Critical 주식회사 엘지화학
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Priority to EP19857094.7A priority patent/EP3848388A4/en
Priority to JP2021512245A priority patent/JP2021535746A/ja
Priority to US17/273,591 priority patent/US20210340281A1/en
Publication of WO2020050626A1 publication Critical patent/WO2020050626A1/ko
Priority to JP2023068787A priority patent/JP7562209B2/ja

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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Definitions

  • a fusion polypeptide comprising a target polypeptide and an O-glycosylable polypeptide region, a pharmaceutical composition comprising the fusion polypeptide, and a step of fusing the O-glycosylable polypeptide region of the desired polypeptide It relates to a method of increasing the duration of living body.
  • U.S. Patent No. 5,416,017 is a sustained release injection of erythropoietin using a gel with a hyaluronic acid concentration of 0.01 to 3%
  • Japanese Patent Publication No. Hei 1-287041 discloses insulin with hyaluronic acid.
  • Japanese Patent Publication No. Hei 2-213 discloses a sustained-release formulation containing calcitonin, elkatonin, or a human target polypeptide in a 5% concentration of hyaluronic acid. .
  • the protein drug dissolved in the gel of hyaluronic acid can exhibit a sustained release effect because it passes through a gel matrix having a large viscosity at a slow rate, but due to the high viscosity, it is not easy to administer by injection, and injection
  • the gel is easily diluted or decomposed by body fluids and the release of the drug is difficult to last for more than 1 day.
  • solid microparticles are prepared by an emulsion solvent extraction method using a hyaluronic acid derivative having hydrophobicity (eg, hyaluronic acid-benzyl ester)
  • a hyaluronic acid derivative having hydrophobicity eg, hyaluronic acid-benzyl ester
  • NNK hyaluronic acid-benzyl ester
  • the O-glycosylable polypeptide (eg, a hinge region of an immunoglobulin, etc.) is linked to a desired polypeptide to form a fusion polypeptide, thereby forming an O-glycosylable poly
  • a technique is provided for increasing the half-life in the body of the target polypeptide to enhance the duration in the body, thereby increasing the administration interval.
  • One example provides a fusion polypeptide comprising a target polypeptide and an O-glycosylable polypeptide region.
  • the O-glycosylable polypeptide region may be included at the N-terminal, C-terminal, or both ends of the target polypeptide.
  • the total number of O-glycosylable polypeptide regions included in the fusion polypeptide is 1 or more, for example, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 6, 1 to 4, 2 Dogs 10, 2-8, 2-6, 2-4 (e.g. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 Dogs or 10 dogs).
  • the fusion polypeptide can be represented by the following general formula:
  • N ' is the N-terminal of the fusion polypeptide
  • C' is the C-terminal of the fusion polypeptide
  • Y is the desired polypeptide
  • Z is an O-glycosylable polypeptide region
  • n is the number of O-glycosylable polypeptide regions located at the N-terminus of the fusion polypeptide (bound to the N-terminus of the target polypeptide), 0 to 10 (i.e., 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10), 0 to 7, 0 to 5, 1 to 10, 1 to 7, 1 to 5, or an integer from 1 to 3,
  • m is the number of O-glycosylable polypeptide regions located at the C-terminus of the fusion polypeptide (bound to the C-terminus of the target polypeptide), 0 to 10 (i.e., 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10), 0 to 7, 0 to 5, 1 to 10, 1 to 7, 1 to 5, or an integer from 1 to 3,
  • n and m are nonzero
  • n + m is the total number of O-glycosylable polypeptide regions contained in the fusion polypeptide, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 6, 1 to 4, 2 to 10, 2 to 8, 2 to 6 Or an integer from 2 to 4.
  • Each of the n + m O-glycosylable polypeptide regions included in the fusion polypeptide may be independently selected from polypeptide regions including O-glycosylable amino acid residues.
  • the polypeptide region including the O-glycosylable amino acid residue may be a hinge region of an immunoglobulin.
  • the O-glycosylable polypeptide regions are each independently composed of a hinge region of immunoglobulin D (Immunoglobulin D; IgD) and a hinge region of immunoglobulin A (Immunoglobulin A; IgA, such as IgA1). Can be selected (ie, the hinge regions of n + m immunoglobulins may be the same or different from each other).
  • the target polypeptide fused with the O-glycosylable polypeptide region is compared to the target polypeptide in which the O-glycosylable polypeptide region is not fused, and thus has stability (duration) in the body (or blood). ) Is increased (e.g., increase in half life or in the blood).
  • Another example provides a nucleic acid molecule encoding the fusion polypeptide.
  • Another example provides a recombinant vector comprising the nucleic acid molecule.
  • Another example provides a recombinant cell comprising the recombinant vector.
  • Another example comprises the step of expressing the recombinant vector in a cell, a method for preparing a target polypeptide having an increased half-life in the body (or blood), or a fusion comprising a target polypeptide having an increased half-life in the body (or blood).
  • a method for producing a polypeptide is provided.
  • Another example is a method for increasing the bio-duration of a target polypeptide, comprising the step of fusing (or linking or binding) a target polypeptide and an O-glycosylable polypeptide region, or a target polypeptide (protein or peptide) drug It provides a method for enhancing the stability of the body (or blood) and / or increasing the half-life of the body (or blood).
  • the fusing step comprises fusing (or linking or binding) one or more O-glycosylable polypeptide regions to the N-terminus, C-terminus, or both ends of the desired polypeptide, with or without a linker. It can contain.
  • the fusion (or linking or binding) step may be performed in vitro.
  • Another example is a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one member selected from the group consisting of the fusion polypeptide, a nucleic acid molecule encoding the fusion polypeptide, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the recombinant vector.
  • Another example is a pharmaceutical composition using at least one selected from the group consisting of the fusion polypeptide, the nucleic acid molecule encoding the fusion polypeptide, the recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and the recombinant cell containing the recombinant vector. It provides a method of manufacturing.
  • Another example is to prepare a pharmaceutical composition comprising one or more selected from the group consisting of the fusion polypeptide, the nucleic acid molecule encoding the fusion polypeptide, the recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and the recombinant cell containing the recombinant vector Provides use for use in.
  • Another example provides the use of the target polypeptide (protein or peptide) drug in the O-glycosylable polypeptide region to enhance the in vivo (or blood) stability and / or increase the in vivo (or blood) half-life.
  • one example provides a composition for enhancing the in vivo (or blood) stability and / or increasing the in vivo (or blood) half-life of a target polypeptide (protein or peptide) drug comprising an O-glycosylable polypeptide region.
  • the target polypeptide is provided in the form of a fusion polypeptide in which an O-glycosylable polypeptide region such as a hinge region of an immunoglobulin is fused, thereby providing stability and / or stability in the body (or blood) when applied to the target polypeptide in vivo.
  • One example provides a fusion polypeptide comprising a target polypeptide and an O-glycosylable polypeptide region.
  • the O-glycosylable polypeptide region may be included at the N-terminal, C-terminal, or both ends of the target polypeptide.
  • the total number of O-glycosylable polypeptide regions included in the fusion polypeptide is 1 or more, for example, 1 to 10, 1 to 8, 1 to 6, 1 to 4, 2 Dogs 10, 2-8, 2-6, 2-4 (e.g. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 Dogs or 10 dogs).
  • the fusion polypeptide can be represented by the following general formula:
  • N ' is the N-terminal of the fusion polypeptide
  • C' is the C-terminal of the fusion polypeptide
  • Y is the desired polypeptide
  • Z is an O-glycosylable polypeptide region
  • n is the number of O-glycosylable polypeptide regions located at the N-terminus of the fusion polypeptide (bound to the N-terminus of the target polypeptide), 0 to 10 (i.e., 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10), 0 to 7, 0 to 5, 1 to 10, 1 to 7, 1 to 5, or an integer from 1 to 3,
  • m is the number of O-glycosylable polypeptide regions located at the C-terminus of the fusion polypeptide (bound to the C-terminus of the target polypeptide), 0 to 10 (i.e., 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10), 0 to 7, 0 to 5, 1 to 10, 1 to 7, 1 to 5, or an integer from 1 to 3,
  • n and m are non-zero (e.g., m is non-zero if n is 0, and n is non-zero if m is 0),
  • n + m is the total number of O-glycosylable polypeptide regions included in the fusion polypeptide, 1 to 10 (i.e., 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10), 1 to 8, 1 to 6, 1 to 4, 2 to 10, 2 to 8, 2 to 6, or 2 to 4.
  • the O-glycosylable polypeptide region when the active site of the desired polypeptide is located at the N-terminus, the O-glycosylable polypeptide region may be fused to the C-terminus (i.e., n is 0, m is not 0) , When the active site is located at the C-terminus, the O-glycosylable polypeptide region may be fused to the N-terminus (ie, n is not 0, m is 0).
  • the n + m O-glycosylable polypeptide regions included in the fusion polypeptide may each be independently selected from polypeptides comprising O-glycosylable amino acid residues.
  • the polypeptide region including the O-glycosylable amino acid residue may be a hinge region of an immunoglobulin.
  • the O-glycosylable polypeptide regions each independently, consists of a hinge region of immunoglobulin D (Immunoglobulin D; IgD) and a hinge region of immunoglobulin A (Immunoglobulin A; IgA; e.g., IgA1) It can be selected from the group.
  • the hinge regions of the n + m immunoglobulins may be the same or different from each other.
  • O-glycosylable polypeptide regions included in the fusion polypeptide are located at both the N-terminal and C-terminal of the fusion polypeptide (ie, N- of the fusion polypeptide)
  • the O-glycosylable polypeptide region located at the N-terminus and O-glycosylation located at the C-terminus may be the same or different from each other, and in one embodiment, one or more (eg, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, located at the N-terminus) Or 10) all O-glycosylable polypeptide regions are all hinge regions of IgD or hinge regions of IgA (e.g.
  • IgA1 may include a hinge region of IgA (eg, IgA1) in various orders, and may include one or more immunoglobulins located at the C-terminus.
  • the hinge regions may all be hinge regions of IgD or hinge regions of IgA (eg, IgA1), or one or more hinge regions of IgD and one or more hinge regions of IgA (eg, IgA1).
  • O-glycosylable polypeptide regions included in the fusion polypeptide are located only at the N-terminus of the fusion polypeptide (ie, at least one N-terminus of the fusion polypeptide) O-glycosylable polypeptide regions, if present, one or more (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10) of O-glycosylable polypeptides
  • the regions are all hinge regions of IgD or hinge regions of IgA, or one or more hinge regions of IgD (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10).
  • 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 may include the hinge regions of IgA in various orders.
  • all of the n + m O-glycosylable polypeptide regions included in the fusion polypeptide are located only at the C-terminus (ie, at least one O-glycosylation is performed only at the C-terminus of the fusion polypeptide)
  • all of the one or more (eg, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10) O-glycosylable polypeptide regions are IgD
  • One or more hinge regions of IgA e.g., IgA1
  • one or more (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10) hinge regions of IgD may include hinge regions of IgA (eg, IgA1) in various orders.
  • the O-glycosylable polypeptide region (each region when two or more O-glycosylable polypeptide regions are present) has one or more O-glycosylated residues (O-glycosylable amino acid residues), two or more , 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, or 7 or more (The upper limit is 100, 50, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15 , 14, 13, 12, 11, 10, 9, or 8) (e.g. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, or 8) ).
  • the O-glycosylable polypeptide region (each region when there are two or more O-glycosylable polypeptide regions) comprises 1 to 10 O-glycosylated residues (O-glycosylable amino acid residues) or It may be one containing 3 to 10.
  • the O-glycosylable polypeptide region may be one or more selected from hinge regions of immunoglobulins (eg, human immunoglobulins), such as an IgD hinge region, an IgA hinge region, or a combination thereof You can.
  • immunoglobulins eg, human immunoglobulins
  • the IgD may be human IgD (eg, UniProKB P01880 (constant region; SEQ ID NO: 7), etc.), and the hinge region of the IgD may be:
  • polypeptides comprising or consisting essentially of 7 or more, 10 or more, 15 or more, 20 or more, 22 or more, or 24 or more (upper limit is 34 or 33) amino acids ("IgD Part of the hinge "; eg, a polypeptide comprising 5 or more consecutive amino acids comprising" SSVPT "(SEQ ID NO: 9) in SEQ ID NO: 1 or 7 or more consecutive comprising" TTAPATT "(SEQ ID NO: 10) A polypeptide comprising an amino acid), and
  • IgD e.g., SEQ ID NO: 7
  • amino acids comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (IgD hinge) or at least 7 contiguous, 10 comprising at least part of the IgD hinge
  • a polypeptide comprising or consisting essentially of at least, at least 15, at least 20, at least 22, or at least 24 amino acids
  • IgD hinge extensions eg, in IgD (SEQ ID NO: 7)
  • ESPKAQASS VPTAQPQAEG SLAKATTAPA TTRNTGRGGE EKKKEKEKEE QEERETKTP (SEQ ID NO: 11) or a polypeptide comprising at least 34 contiguous or at least 35 amino acids comprising part of the IgD hinge
  • It may be one or more selected from the group consisting of.
  • the IgA may be human IgA (eg, IgA1 (UniProKB P01876, constant region; SEQ ID NO: 8), etc.), and the hinge region of the IgA may be:
  • IgA e.g., IgA1 (SEQ ID NO: 8)
  • 19 or more consecutive 20 or more consecutive amino acids comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (IgA (e.g., IgA1) hinge), or IgA (e.g., IgA1 )
  • Polypeptides comprising or consisting essentially of the sequence of 7 or more, 10 or more, 12 or more, 15 or more, 17 or more, or 18 or more amino acids constituting a part of the hinge (IgA "hinge Extension of ")
  • It may be one or more selected from the group consisting of.
  • the O-glycosylable polypeptide region is an O-glycosylable amino acid residue in the protein illustrated in Table 1 (e.g., a protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 23 to 113).
  • O-glycosylation site 1 or more, 2 or more, 5 or more, 7 or more, 10 or more, 12 or more, 15 or more, 17 or more, 20 or more, or 22 or more (e.g., 1 To 10, 3 to 10; or 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 Dogs, 15 pieces, 16 pieces, 17 pieces, 18 pieces, 15 pieces, 16 pieces, 17 pieces, 18 pieces, 19 pieces, 20 pieces, 21 pieces, 22 pieces, 23 pieces, 24 pieces or 25 pieces) 5 or more consecutive, 7 or more, 10 or more, 12 or more, 15 or more, 17 or more, 20 or more, 22 or more, 25 or more, 27 or more, 30 or more, 32 or more, or 35 or more (upper limit 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, or total amino acids of each protein) or amino acids It may be a polypeptide region consisting essentially.
  • the O-glycosylable polypeptide region does not affect the function of the target polypeptide.
  • the O-glycosylable polypeptide region of the protein illustrated in Table 1 below may be selected from regions that are not involved in the original function of the full-length protein, and thus the O-glycosylable poly The peptide region can only serve to increase the half-life without affecting the function of the desired polypeptide :
  • the total number of O-glycans actually included in the fusion polypeptide is 13 or more, 14 or more, 15 or more, 16 or more, 17 or more, 18 or more, 19 or more, 20 or more, or 21 O or more (maximum value is determined by the number of O-glycosylable polypeptide regions described above and the number of O-glycosylated residues contained in each O-glycosylable polypeptide region), or theoretically included O -The total number of glycans is 20 or more, 21 or more, 23, or 24 or more (the maximum value is the number of O-glycosylable polypeptide regions described above and the respective O-glycosylable polypeptide regions.
  • the total number of O-glycans actually included in the fusion polypeptide may be related to stability when administered in the body (eg, in the blood).
  • the fusion polypeptide is the total number of O-glycans actually included. As the number increases, the stability of the fusion polypeptide or the target polypeptide contained in the fusion polypeptide increases in the body (i.e., increases the half-life in the body (in blood) and / or increases the concentration in the body (in blood) and / or in the body (in blood) ) Decomposition rate, etc.).
  • the fusion polypeptide adds a peptide linker between the target polypeptide and the O-glycosylable polypeptide region and / or between the O-glycosylable polypeptide region when two or more O-glycosylable polypeptide regions are included.
  • the peptide linker may be a GS linker that repeatedly includes one or more Gly (G) and one or more Ser (S), for example, (GGGGS) n (n is the number of repetitions of GGGGS (SEQ ID NO: 13)) As may be an integer of 1 to 10 or 1 to 5 (for example, 1, 2, 3, 4, or 5), but is not limited thereto.
  • Another example provides a nucleic acid molecule encoding the fusion polypeptide.
  • Another example provides a recombinant vector comprising the nucleic acid molecule.
  • Another example provides a recombinant cell comprising the recombinant vector.
  • Another example comprises the step of expressing the recombinant vector in a cell, a method for preparing a target polypeptide having an increased half-life in the body (or blood), or a fusion comprising a target polypeptide having an increased half-life in the body (or blood).
  • a method for producing a polypeptide is provided.
  • Another example provides a method of increasing the bio-duration of a target polypeptide comprising fusing (or linking or binding) a target polypeptide with an O-glycosylable polypeptide region.
  • the fusing step comprises fusing (or linking or linking) one or more O-glycosylable polypeptide regions at the N-terminus, C-terminus or both ends of the desired polypeptide with or without a linker. It can contain.
  • the fusion (or linking or binding) step may be performed in vitro.
  • Another example is a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one member selected from the group consisting of the fusion polypeptide, a nucleic acid molecule encoding the fusion polypeptide, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the recombinant vector.
  • Another example provides the use of a polypeptide (protein or peptide) drug of the O-glycosylable polypeptide region to enhance the in vivo (or blood) stability and / or increase the in vivo (or blood) half-life.
  • a composition for enhancing in vivo (or blood) stability and / or increasing in vivo (or blood) half-life of a polypeptide (protein or peptide) drug comprising an O-glycosylable polypeptide region As used herein, increased stability and / or increased half-life means improved stability and / or increased half-life compared to a polypeptide (protein or peptide) that does not include an O-glycosylable polypeptide region. do.
  • the target polypeptide (Y) may be at least one selected from all soluble proteins.
  • the target polypeptide is a protein having a desired activity in a living body (e.g., prevention, alleviation of specific diseases or symptoms, and / or therapeutic activity or activity as a marker, or activity that replaces a biomaterial) Or a peptide (e.g., comprising about 100 or less or about 50 or less amino acids), e.g., an enzyme-activated protein or peptide (e.g., a protease, kinase, phosphatase, etc.), a receptor protein or peptide, a transporter protein, or Peptides, sterile and / or endotoxin-binding polypeptides, structural proteins or peptides, immune polypeptides, antibody-mimetic proteins (e.g.
  • the target polypeptide is a hormone, cytokine, tissue plasminogen activator, immunoglobulin (e.g., antibody or antigen-binding fragment or variant thereof), antibody-mimetic protein (e.g., protein scaffold) (protein scaffold), fc-fusion protein, etc.).
  • the target polypeptide is growth hormone (eg, human growth hormone (hGH)), p40, BMP-1 (bone morphogenetic protein-1), growth hormone release hormone, growth hormone release peptide, interferon (eg , Interferon-alpha, -beta, -gamma, etc., interferon receptors (e.g., water-soluble type I interferon receptor, etc.), G-CSF (granulocyte colony stimulating factor), GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor), glucagon -Glucagon-like peptides (e.g.
  • growth hormone eg, human growth hormone (hGH)
  • p40 BMP-1 (bone morphogenetic protein-1)
  • growth hormone release hormone eg. Interferon-alpha, -beta, -gamma, etc.
  • interferon receptors e.g., water-soluble type I interferon receptor, etc.
  • G-CSF granulocyte colon
  • GLP-1 insulin-like growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • G-protein-coupled receptor interleukin
  • interleukin E.g., interleukin-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, 28, -29, -30, etc.
  • interleukin receptors Eg, IL-1 receptor, IL-4 receptor, etc.
  • enzymes e.g.
  • glucocerebrosidase gluco cerebrosidase
  • iduronate-2-sulfatase alpha-galactosidase-A, agalsidase alpha and beta, alpha- L-iduronidase, alpha-L-iduronidase, butyrylcholinesterase, chitinase, glutamate decarboxylase, imiglucerase, lipase ), Freecase (uricase), platelet-activating factor acetylhydrolase, neutral endopeptidase, myeloperoxidase, etc., interleukin or cytokine binding protein (Eg, IL-18bp, TNF-binding protein, etc.), macrophage activation factor, macrophage peptide, B cell factor, T cell factor, protein A, allergy inhibitor, cell necrosis glycoprotein (cell nec) rosis glycoproteins), immunotoxins, lymphotoxins, tumor necrosis factor, tumor suppressors, metasta
  • TNF Receptors e.g., TNFR (p75), TNFR (p55), etc.
  • IL-1 receptors e.g., IL-1 receptors
  • VEGF receptors e.g., VEGF receptors
  • EGF receptors e.g., EGF receptors
  • B cell activating factor receptors e.g., B cell activating factor receptors
  • receptor antagonists IL1-Ra, etc.
  • cell surface antigens e.g. , CD2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69, etc.
  • antivirus antigens e.g., antibodies (e.g., monoclonal antibodies, multiple Clone antibodies), antibody fragments (e.g.
  • scFv Fab, Fab ', F (ab') 2 and Fd
  • virus derived vaccine anti Original virus derived vaccine anti Original
  • variants / fragments thereof e.g., variants / fragments that maintain desired functions and / or structures
  • antibody-mimetic proteins e.g., protein scaffolds, fc-fusion proteins, etc.
  • the antibody may be of any isotype (e.g., IgA (IgA1, IgA2, etc.), IgD, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, etc.), IgM or IgE), wherein the antibody fragment is the antigen binding of the original antibody Any fragment of an antibody (e.g., CDR, Fab, Fab ', F (ab) 2, Fd, Fv, that comprises about 20 or more amino acids, such as about 100 or more amino acids, as an antigen-binding fragment that retains the ability. scFv, scFv-Fc, etc.).
  • IgA IgA1, IgA2, etc.
  • IgD IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, etc.)
  • IgM or IgE IgM or IgE
  • the antibody fragment is the antigen binding of the original antibody
  • Any fragment of an antibody e.g., CDR, Fab
  • the Fab fragment comprises the variable domain (VL) and constant domain (CL) of the light chain and the variable domain (VH) and the first constant domain (CH1) of the heavy chain.
  • Fab 'fragments differ from Fab fragments in that amino acid residues comprising one or more cysteine residues have been added from the hinge region to the carboxyl terminus of the CH1 domain.
  • the Fd fragment contains only the VH and CH1 domains, and the F (ab ') 2 fragment is prepared by pairing Fab' fragments through disulfide bonds or chemical reactions.
  • the scFv (single-chain Fv) fragment contains VL and VH domains linked by a peptide linker, so it exists as a single polypeptide chain.
  • the antibody mimic protein may mean all proteins that include a site capable of binding to a specific antigen other than an antibody, for example, an antibody-mimetic protein scaffold, a nanobody, such as a repebody ), Peptibody (peptibody), such as Fc-fusion protein (Fc and antigen-binding polypeptide fusion protein) may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the target polypeptide may be one or more selected from the group consisting of all secreted proteins.
  • the above-described target polypeptide may be a mammal-derived (isolated from a mammal) polypeptide, including a primate such as a human or a monkey, a rodent such as a mouse, a rat, etc., for example, a human-derived (isolated from human) poly It may be a peptide.
  • a fusion polypeptide comprising a target polypeptide and an O-glycosylable polypeptide region provided herein, the target polypeptide and an O-glycosylable polypeptide region, and / or two or more O-glycosylable polypeptides
  • the regions may be covalently or non-covalently linked directly (eg, without a linker), or may be linked via a suitable linker (eg, a peptide linker).
  • the peptide linker may be a polypeptide consisting of any amino acid of 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 2 to 20, 2 to 15, or 2 to 10 amino acids, and the type of amino acids contained therein There is no limit.
  • the peptide linker may include, for example, Gly, Asn and / or Ser residues, and may include neutral amino acids such as Thr and / or Ala, but is not limited thereto, and an amino acid sequence suitable for the peptide linker is It is known in the art.
  • the peptide linker may be a GS linker that repeatedly includes one or more Gly (G) and one or more Ser (S), for example, (GGGGS) n (n is the number of repetitions of GGGGS (SEQ ID NO: 13)) As may be an integer of 1 to 10 or an integer of 1 to 5 (1, 2, 3, 4, or 5), but is not limited thereto.
  • the fusion polypeptide has a total of one or more or two or more total O-glycosylable polypeptide regions (e.g., 2 to 10, 2 to 8, 2 to 6, 2 to 5, 2 to 2) 4, 2 or 3).
  • the fusion polypeptide comprises two or more O-glycosylable polypeptide regions
  • the fusion polypeptide has two or more O-glycosylable polypeptide regions bound to the N or C terminal of the desired polypeptide
  • One or more O-glycosylable polypeptide regions may be independently coupled to the N- and C-terminals of the target polypeptide (in this case, the hinge region bound to the N- and C-terminals of the target polypeptide) The type and number of may be the same or different).
  • the above-described peptide linker may be further included between the O-glycosylable polypeptide region and / or between the O-glycosylable polypeptide region and the human target polypeptide.
  • the fusion polypeptide provided herein may be recombinantly or synthetically produced, and may not be naturally occurring.
  • the half-life of the target polypeptide contained in the fusion polypeptide provided herein in a mammal (in blood) in a mammal is about 1.5 times or more, compared to the target polypeptide in which the O-glycosylable polypeptide region is not fused. 2 times or more, about 2.5 times or more, about 3 times or more, about 3.5 times or more, about 4 times or more, about 5 times or more, about 6 times or more, about 7 times or more, about 8 times or more, about 9 times or more, or It may be increased by about 10 times or more.
  • the target polypeptide in the form of a fusion polypeptide in which the O-glycosylable polypeptide region is bound by the increased target polypeptide half-life is a target polypeptide in the form in which the O-glycosylable polypeptide region is not linked. Compared with, there is an advantage that the administration interval can be long.
  • Fusion polypeptides comprising a target polypeptide and an O-glycosylable polypeptide region can be prepared by conventional chemical synthesis methods or recombinant methods.
  • vector refers to an expression means for expressing a gene of interest in a host cell, such as plasmid vector, cosmid vector, and bacteriophage vector, adenovirus vector, retrovirus vector, and Adeno-associated viral vectors, such as viral vectors, and the like.
  • vectors that can be used in the recombinant vector include plasmids (e.g., pcDNA series, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8 / 9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX series, pET series, pUC19, etc.), phage (e.g., ⁇ gt4 ⁇ B, ⁇ -Charon, ⁇ z1, M13, etc.) or viruses (e.g., SV40, etc.) may be produced based on, but are not limited to.
  • plasmids e.g., pcDNA series, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8 / 9, pUC6, pBD9, pHC
  • the nucleic acid molecule encoding the fusion polypeptide in the recombinant vector can be operably linked to a promoter.
  • operatively linked refers to a functional binding between a nucleic acid expression control sequence (eg, promoter sequence) and another nucleic acid sequence.
  • the regulatory sequence can be operatively linked to control transcription and / or translation of other nucleic acid sequences.
  • the recombinant vector can be constructed, typically as a vector for cloning or as an expression vector for expression.
  • the expression vector may be a conventional one used in the art to express foreign proteins in plants, animals or microorganisms.
  • the recombinant vector can be constructed through various methods known in the art.
  • the recombinant vector can be expressed using a eukaryotic cell as a host.
  • the recombinant vector includes a nucleic acid molecule to be expressed and a promoter described above, a ribosome binding site, a secretion signal sequence (see Publication No. 2015-0125402) and / or transcription /
  • the origin of replication operating in eukaryotic cells may include the origin of replication of f1, origin of replication of SV40, origin of replication of pMB1, origin of replication of Adeno, origin of replication of AAV, and / or origin of BBV replication, but is not limited thereto. no.
  • a promoter derived from the genome of a mammalian cell e.g., a metallothionine promoter
  • a promoter derived from a mammalian virus e.g., adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, Cytomegalovirus promoter and HSV's tk promoter
  • any secretion signal sequence that can be commonly used as a secretion signal sequence can be used.
  • the secretion signal sequence described in Korean Patent Publication No. 2015-0125402 can be used. It is not limited thereto, and may include a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.
  • the recombinant cells may be obtained by introducing (transforming or transfecting) the recombinant vector into an appropriate host cell.
  • the host cell can be selected from all eukaryotic cells capable of stably and continuously cloning or expressing the recombinant vector.
  • Eukaryotic cells that can be used as hosts include yeast ( Saccharomyces cerevisiae ), insect cells, plant cells, and animal cells, for example, mice (eg, COP, L, C127, Sp2 / 0, NS-0, NS-1, At20, or NIH3T3), rats (e.g. PC12, PC12h, GH3, or MtT), hamsters (e.g.
  • COS COS1, COS3, COS7, etc.
  • Vero e.g. HeLa, HEK-293, retinal-derived PER-C6, cells derived from diploid fibroblasts, myeloma cells or HepG2
  • other animal cells e.g. , MDCK, etc.
  • insect cells eg
  • a target polypeptide with improved stability in the body or a fusion polypeptide comprising the same can be prepared by comparing with a non-fused form.
  • the method for preparing the fusion polypeptide may include culturing a recombinant cell containing the nucleic acid molecule. The step of culturing may be performed under normal culture conditions. In addition, the preparation method may further include the step of isolating and / or purifying the fusion polypeptide from the culture after the step of culturing.
  • a delivery method well known in the art can be used.
  • a micro-injection method, a calcium phosphate precipitation method, an electroporation method, a liposome-mediated transfection method, and a gene bombardment may be used, but is not limited thereto. .
  • the method of selecting the transformed (introduced recombination vector) host cell can be easily carried out according to a method well known in the art using a phenotype expressed by a selection label.
  • the selection marker is a specific antibiotic resistance gene, it is possible to easily select recombinant cells into which the vector of manufacture has been introduced by culturing in a medium containing the antibiotic.
  • the fusion polypeptide may be used for the prevention and / or treatment of all diseases related to the target polypeptide deficiency and / or dysfunction, or which can be treated, reduced, or improved by the activity of the target polypeptide.
  • the fusion polypeptide, a nucleic acid molecule encoding the fusion polypeptide, a pharmaceutical vector comprising at least one selected from the group consisting of a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the recombinant vector Compositions are provided.
  • the pharmaceutical composition may be a pharmaceutical composition for the prevention and / or treatment of a disease related to a target polypeptide deficiency and / or functional abnormality contained in the fusion protein or a disease in which the target polypeptide has a therapeutic and / or prophylactic effect.
  • the fusion protein contains one or more selected from the group consisting of the fusion polypeptide, a nucleic acid molecule encoding the fusion polypeptide, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a recombinant cell containing the recombinant vector.
  • a method for preventing and / or treating a disease related to a target polypeptide deficiency and / or dysfunction included or a disease in which the target polypeptide has a therapeutic and / or prophylactic effect is provided.
  • the method requires the prevention and / or treatment of a disease related to a target polypeptide deficiency and / or dysfunction contained in the fusion protein or a disease in which the target polypeptide has a therapeutic and / or prophylactic effect, prior to the administration step. It may further include the step of identifying the patient.
  • the pharmaceutical composition may include at least one active ingredient selected from the group consisting of the fusion polypeptide, nucleic acid molecule, recombinant vector, and recombinant cell in a pharmaceutically effective amount.
  • the pharmaceutically effective amount means the content or dosage of the active ingredient capable of obtaining the desired effect.
  • the content or dosage of the active ingredient in the pharmaceutical composition depends on factors such as formulation method, mode of administration, patient's age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, interval of administration, route of administration, rate of excretion and response sensitivity. It can be variously prescribed by.
  • a single dose of the active ingredient may range from 0.001 to 1000 mg / kg, 0.01 to 100 mg / kg, 0.01 to 50 mg / kg, 0.01 to 20 mg / kg, or 0.01 to 1 mg / kg, It is not limited.
  • the pharmaceutical composition in addition to the active ingredient, may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the carrier is commonly used for the formulation of drugs containing proteins, nucleic acids, or cells, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, It may be one or more selected from the group consisting of microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, etc. However, it is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may further include one or more selected from the group consisting of diluents, excipients, lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc., which are commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • the administration target of the pharmaceutical composition may be a mammal, or a cell, tissue, cell culture or tissue culture derived therefrom, including a primate including human, monkey, etc., a rodent including mouse, rat, or the like.
  • the pharmaceutical composition may be administered by oral administration or parenteral administration, or may be administered by contact with cells, tissues, or body fluids.
  • parenteral administration intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, and rectal administration may be administered.
  • proteins or peptides are digested, so oral compositions must be formulated to coat the active agent or to protect it from degradation in the stomach.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of a solution, suspension, syrup or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be formulated in the form of ex-agent, powder, granule, tablet or capsule, and dispersant or stable for formulation. It may further include a topic.
  • the target polypeptide fused with the O-glycosylable polypeptide region provided in the present specification has a long duration when administered in the body, so that the administration interval can be increased and the dose can be reduced, thereby facilitating administration and / or economical aspects. It has an advantageous effect and can be usefully applied to fields in which target polypeptide treatment is required.
  • IgD-hGH-His DHDD-8His
  • IgD-hGH DHDD
  • IgA-hGH AHAA
  • IgD-hGH-IgA DHAA
  • IgA-hGH- IgA-hGH- according to one embodiment It is a schematic diagram schematically showing the structure of IgD (AHDD).
  • Figure 2 is a graph showing the results of analyzing the fusion polypeptide IgD-hGH according to an embodiment by Q-TOF Mass Spectrometry.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of analyzing the fusion polypeptide IgD-hGH-His according to an embodiment by Q-TOF Mass Spectrometry.
  • Figure 5 is a schematic diagram schematically showing the structure of the fusion polypeptide Dulaglutide-ID and Dulaglutide-ID2 according to an embodiment.
  • Figure 6 shows the results showing the isomer distribution of the fusion polypeptide Dulaglutide-ID2 analyzed by IEF (Isoelectric focusing).
  • FIG. 7 is a graph showing the change in blood concentration over time after administration of fusion polypeptide IgD-hGH compared to administration of hGH.
  • FIG. 8 is a graph showing the change in blood concentration over time after administration of the fusion polypeptide IgD-hGH-His compared to the administration of hGH.
  • FIG. 9 is a graph showing changes in blood concentration over time after administration of the fusion polypeptides IgA-hGH F3, IgA-hGH F4, and IgA-hGH F5.
  • FIG 10 is a graph showing the change in blood concentration over time after administration of Dulaglutide (Trulicity) after administration of the fusion polypeptide Dulaglutide-ID2 (pGIgG4DD).
  • IgD hinge ESPKAQA SS VP T AQPQAEGSLAKA TT APA TT RNT; SEQ ID NO: 1), IgA1 hinge (VP ST PP T P S P S TPP T P S P S ; SEQ ID NO: 2), or a combination of the hinge of IgD and IgA1 hinge Fusion polypeptide IgD-hGH-His (DHDD-8His), IgD-hGH (DHDD), IgA-hGH (AHAA), IgD-hGH- fused with this target polypeptide (human growth hormone: hGH; SEQ ID NO: 3) IgA (DHAA), and IgA-hGH-IgD (AHDD) (see FIG. 1; the underlined portions of the sequences of IgD and IgA1 are O-Glycosylation capable sites) were prepared.
  • the amino acid sequence of each part included in the fusion polypeptide is summarized in Table 2 below.
  • the plasmid pAF-D1G1 (which contains Promoter of KR10-1868139B1), a variant of pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, Cat. No. V790-20), is Bam HI (restriction site: GGATCC) and Not I (restriction site).
  • the prepared recombinant vector pDHDD-D1G1 was introduced into ExpiCHO-S TM cells (Thermo Fisher Scientific) and cultured in ExpiCHO Expression Medium (Thermo Fisher Scientific; 400 mL) for 12 days (Fed-Batch Culture; Day 1 & Day 5 Feeding)
  • a fusion polypeptide IgD-hGH was produced.
  • the fusion polypeptide IgD-hGH has a theoretical molecular weight of 32.2 kDa (excluding O-Glycan) and 21 O-Glycans.
  • the fusion polypeptide IgD-hGH produced through the recombinant vector expression was purified, and O-Glyan site Occupancy was analyzed using Q-TOF Mass Spectrometry.
  • the first step of purification was performed by mounting a column made of CaptureSelect TM Human Growth Hormone Affinity Matrix (Life Technologies) with Binding Specificity to hGH and loading the sample in AKTA TM Purifier (GE Healthcare Life Sciences).
  • the first washing was performed with an equilibration buffer, followed by elution using 20mM Citric acid pH 3.0 or 0.1M Acetic acid pH 3.0, and the Elution solution was immediately frozen after the next purification process by adjusting the pH to 7.0 using 2M Tris Buffer immediately after the process. .
  • the purification 2 process was performed using Anion Exchange Chromatography and TMAE as Resin. After melting the frozen sample at the end of the 1st process, the conductivity was measured, diluted with water for injection to a conductivity suitable for loading, and pretreated with 0.22um PES Filtration System (Corning, USA). AKTA Avant (GE Healthcare Life Sciences) was equipped with Columns and samples were loaded. For separation according to the conductivity, it was made to be elution in a gradient form, and the fraction was divided and pooled with reference to the elution peak.
  • concentration or buffer exchange was performed to prepare analytical samples and animal samples. After adding the sample to the Amicon Ultra System (Millipore), centrifugation was performed at low temperature to perform concentration or diafiltration. As a buffer for analysis, 25 mM sodium phosphate pH 7.0 was used, and PBS buffer was used for sample preparation for animal experiments.
  • the concentration of samples was calculated by using the amino acid sequence to calculate the extinction coefficient of the material and absorbance at 280 nm and 340 nm in a UV Spectrophotometer (G1103A, Agilent Technologies). .
  • Samples for animal experiments were diluted to a predetermined concentration using PBS buffer and filtered with a 0.22um Syringe Filter (Millex-GV, 0.22um, Millipore) in a Biosafety Cabinet before administration, and stored frozen until administration.
  • a 0.22um Syringe Filter Millex-GV, 0.22um, Millipore
  • IgD-hGH analysis by Q-TOF Mass Spectrometry are shown in FIG. 2 (Y-axis:%; X-axis: mass; 7-21 values indicated on the peaks are O-Glycan numbers). As shown in Figure 2, IgD-hGH was distributed from 7 to 21 O-Glycans, and the average number of O-Glycans was 13.5.
  • the fusion polypeptide IgD-hGH-His produced through the recombinant vector expression was purified, and O-Glycan site Occupancy was analyzed using IEF (Isoelectric focusing) analysis and Q-TOF Mass Spectrometry.
  • the primary column used in the purification process was TMAE, which is an anion exchange resin, and partially separated IgD-hGH-His from the culture medium to elute as a primary eluent.
  • the primary eluate was supplied to a secondary column, a metal affinity resin, HIS-Tag binding column, to selectively elute IgD-hGH-His as a secondary eluent.
  • the secondary eluate was supplied to TMAE, an anion exchange resin, which is a tertiary column, and the fraction with a low sialic acid content was removed to elute the tertiary eluate.
  • the tertiary eluate was supplied to a gel filtration column, which is a quaternary column, to remove multimers and fragmented proteins to obtain a quaternary eluent.
  • Step 3 Dialysis filtration
  • the isomer distribution for the obtained quaternary eluate is shown in FIG. 3.
  • the theoretical pI value of IgD-hGH-His is 6.65, and lower than that means that IgD-hGH-His is O-Glycosylation, and sialic acid is bound to this O-Glycan, which is further acidic.
  • Recombinant vector pDHDD-D1G1 prepared in Example 1.1.1, the coding genes of three IgD hinges (one N- and C-terminals of hGH, a total of three) were replaced with coding genes of the IgA1 hinge, respectively.
  • Recombinant vector pAHAA-D1G1 was constructed to have the same configuration except that, and expressed in the same manner as in Example 1.1.1, IgA1 hinge (IgA; SEQ ID NO: 2) -human growth hormone (hGH; SEQ ID NO: 3)- A fusion polypeptide having the configuration of IgA1 hinge (IgA; SEQ ID NO: 2) -IgA1 hinge (IgA; SEQ ID NO: 2) (see FIG.
  • 'IgA-hGH' The fusion polypeptide IgA-hGH theoretically has 24 O-Glycans.
  • the fusion polypeptide IgA-hGH produced through the expression of the recombinant vector was purified with reference to the method described in Example 1.1.1.
  • the recombinant vector pDHDD-D1G1 prepared in Example 1.1.1 was cut to 7574 bp vector cut with BamHI and NotI, and the 489 bp Insert I cut with pDHDD-D1G1 cut to BamHI and KasI and the recombinant vector pAHAA used in Example 1.1.3.
  • the recombinant vector pDHAA-D1G1 was constructed to have the same configuration except that the two ends were replaced with the coding gene of the IgA1 hinge.
  • IgD hinge IgD; SEQ ID NO: 1 -human growth hormone (hGH; SEQ ID NO: 3) -IgA1 hinge (IgA; SEQ ID NO: 2)
  • hGH human growth hormone
  • IgA IgA; SEQ ID NO: 2
  • 'IgD-hGH-IgA' A fusion polypeptide having the configuration of -IgA1 hinge (IgA; SEQ ID NO: 2) (see FIG. 1; hereinafter referred to as 'IgD-hGH-IgA') was produced.
  • the fusion polypeptide IgD-hGH-IgA has 23 O-Glycans in theory.
  • the recombinant vector pDHDD-D1G1 prepared in Example 1.1.1 was cut into BamHI and NotI in a vector of 7574 bp, and pAHAA-D1G1 used in Example 1.1.3 was cut into BamHI and KasI in 444 bp Insert I and Example 1.1
  • a recombinant vector pAHDD-D1G1 was constructed to have the same configuration except that one of the 5 'end side was replaced with the coding gene of the IgA1 hinge, and expressed in the same manner as in Example 1.1.1, and the IgA1 hinge (IgA ; SEQ ID NO: 2) -Human growth hormone (hGH; SEQ ID NO: 3) -IgD
  • Target protein GLP-1-Fc fusion protein (GLP-1-Fc)
  • a fusion polypeptide in which an IgD hinge (ESPKAQA SS VP T AQPQAEGSLAKA TT APA TT RNT; SEQ ID NO: 1) is fused with a target polypeptide (Glucagon-like peptide-1) -Fc fusion protein: GLP-1-Fc) Dulaglutide-ID (including one IgD hinge region) and Dulaglutide-ID2 (including two IgD hinge regions) (see FIG. 5) were prepared.
  • GLP-1-Fc fusion protein exists as a dimer.
  • the amino acid sequences encoded are summarized in Table 4 below.
  • pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, Cat. No. V790-20)
  • an expression vector pGIg4 expressing GLP-1-Fc, a variant (including the promoter of KR10-1868139B1) is used as a template.
  • PCR was performed using Primers IgG4mCH2_F and IgG4ID_R of 4 to obtain PCR product (mIgG4) of 659 bp Modified IgG4.
  • PCR was performed using the pDHDD-D1G1 prepared in Example 1.1.1 as a template, PCR was performed using Primers IgG4ID_F and ID_NotR in Table 4 to obtain PCR products of 129 bp (ID1) and 231 bp (ID2).
  • the pDHDD-D1G1 prepared in Example 1.1.1 was inserted into a 7574 bp vector cut with BamHI and NotI, a 607 bp Insert I cut with pGIg4 with BamHI and BsrGI, and a 770 bp PCR product obtained by overlapping PCR on the BsrGI and NotI
  • a recombinant vector pGIg4D-D1G1 for preparation of 'Dulaglutide-ID1' was prepared.
  • the 659 bp mIgG4 PCR product and 231 bp ID2 PCR product obtained in Example 1.2.1 were used as templates, and the overlapping PCR was performed using Primers IgG4mCH2_F and ID_NotR in Table 4 to perform the 882 bp PCR product ('(N end )-[Modified IgG4 Fc portion (including BsrGI restriction site)-IgD hinge (IgDH1; SEQ ID NO: 1)- An IgD hinge (IgDH1; SEQ ID NO: 1) -Not I restriction site]-(gene encoding the C terminal) 'was obtained.
  • the pDHDD-D1G1 prepared in Example 1.1.1 was inserted into a 7574 bp vector cut with BamHI and NotI, a 607 bp Insert I cut with pGIg4 with BamHI and BsrGI, and a 882 bp PCR product obtained by overlapping PCR on the BsrGI and NotI
  • a fusion polypeptide comprising 2 hinge regions of the target polypeptide (GLP-1-Fc) and immunoglobulin (IgD) by Ligation of the inserted 505 bp Insert II (total 343 aa (excluding signal peptide); O-Glycosylation) Possible sites-a total of 14, present as a Dimer, finally 28);
  • a recombinant vector pGIg4DD-D1G1 for preparation of 'Dulaglutide-ID2' was prepared.
  • the fusion polypeptide Dulaglutide-ID2 produced through the recombinant vector expression was purified, and O-Glyan site Occupancy was analyzed using IEF (Isoelectric focusing) analysis and Q-TOF Mass Spetrometry.
  • the protein was separated and purified through Protein A affinity chromatography using the Fc region of the material, followed by sequentially performing anion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography.
  • the culture solution was filtered using a 0.22um filter membrane, injected into Protein A affinity resin equilibrated with an equilibration buffer (10 mM Sodium phosphate, 150 mM Sodium chloride, pH7.4), and then washed with an equilibration buffer. After washing, the protein was eluted with an elution buffer (100 mM Sodium citrate pH 3.5) and peaks were collected.
  • an equilibration buffer 10 mM Sodium phosphate, 150 mM Sodium chloride, pH7.4
  • the collected eluate was buffer exchanged with 20 mM Tris pH 8.0.
  • the buffer exchanged sample was purified by injection into anion exchange chromatography (Source 15Q, GE Healthcare).
  • the equilibration buffer and elution buffer used were 20 mM Tris, pH 8.0, 20 mM Tris, 0.5 M NaCl, pH 8.0, respectively. Proteins were eluted in a concentration gradient condition using an equilibration buffer and an elution buffer as A and B channels, respectively, and peaks were collected.
  • the collected protein solution was further purified using hydrophobic interaction chromatography (Butyl sepharose, GE Healthcare).
  • the equilibration buffer and elution buffer used were 0.1 M Sodium phosphate pH 6.0, 1.8 ammonium sulfate, pH 8.0, and 0.1 M Sodium phosphate pH 6.0, respectively. Proteins were eluted in a concentration gradient condition using an equilibration buffer and an elution buffer as A and B channels, respectively, and peaks were collected.
  • Dulaglutide-ID2 The isomer distribution of Dulaglutide-ID2 obtained by analyzing the collected peaks by isoelectric focusing (IEF) is shown in FIG. 6.
  • the theoretical pI value of Dulaglutide-ID2 is 5.78, but in the case of Fraction # 3, lower than this means that Dulaglutide-ID2 is O-Glycosylation and is attached to sialic acid to O-Glycan to be more acidic.
  • the final purified protein solution contains the same excipient components as Trulicity (Sodium citrate hydrate: 2.74 mg / mL, Anhydrous citric acid: 0.14 mg / mL, D-mannitol: 46.4 mg / mL, polysorbate 80: 0.20 mg / mL, pH 6.0- 7.0) to perform buffer exchange and concentration was used as a test material for the animal PK test.
  • Trulicity Sodium citrate hydrate: 2.74 mg / mL, Anhydrous citric acid: 0.14 mg / mL, D-mannitol: 46.4 mg / mL, polysorbate 80: 0.20 mg / mL, pH 6.0- 7.0
  • Target protein human growth hormone (hGH)
  • PK results of hGH and IgD-hGH are shown in Table 6 and FIG. 7.
  • hGH fused with the hinge region (IgD-hGH) can be confirmed that the half-life increased by about 3.3 times compared to hGH not fused with the hinge region.
  • Table 8 and FIG. 9 show the PK results for each IgA-hGH fraction to see the effect of PK on the number of O-glycan.
  • Target protein GLP-1-Fc fusion protein (GLP-1-Fc, Dulaglutide)
  • the serum collected by time-point is centrifuged to obtain Serum, and ELISA is performed using GLP-1 antibody (NovousBio) and Anti-Human IgG4 Fc Antibody (Sigma-Aldrich). Then, the concentration of Dulaglutide and fusion polypeptide Dulaglutide-ID2 in blood by time-point was confirmed. Using this data, the values of parameters including area under the curve (AUC) were obtained using PK analysis software (WinNonlin (Certara L.P.), etc.).
  • GLP-1-Fc Dulaglutide-ID2 fused with the hinge region was increased by about 1.5 times compared to Dulaglutide not fused with the hinge region.
  • Cmax was about 1/5 level
  • AUClast was about 1/3 level.

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Abstract

목적 폴리펩타이드 및 면역글로불린의 힌지 영역을 포함하는 융합 폴리펩타이드, 상기 융합 폴리펩타이드를 포함하는 약학적 조성물, 및 면역글로불린의 힌지 영역을 융합시키는 단계를 포함하는 목적 폴리펩타이드의 생체 지속 기간을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

Description

O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역을 포함하는 융합 폴리펩타이드
목적 폴리펩타이드 및 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역을 포함하는 융합 폴리펩타이드, 상기 융합 폴리펩타이드를 포함하는 약학적 조성물, 및 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역을 융합시키는 단계를 포함하는 목적 폴리펩타이드의 생체 지속 기간을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
단백질 또는 펩타이드 약물은 대부분 체내에서 활성이 유지되는 기간이 짧고, 정맥 투여 이외의 방법으로 투여시에는 흡수율이 낮아서, 장기간 약물을 투여하는 치료가 필요한 경우에 이들 약물을 반복해서 짧은 투여 간격으로 계속적으로 주사하여야 하는 불편한 점이 있다. 이와 같은 불편을 해소하기 위하여 1 회 투여로 약물을 지속적으로 방출시키는 기술의 개발이 요구된다. 이러한 요구에 부응하기 위한 일환으로 지속적 방출을 위한 서방성 제형이 개발되고 있다.
예컨대, 단백질 또는 펩타이드 약물을 생분해성 고분자 매트릭스로 둘러 싼 형태의 미세 입자를 제조하여, 이의 투여시 매트릭스 물질이 체내에서 서서히 분해되어 제거되면서 약물이 서서히 방출되도록 하는 서방성 제형에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
예를 들어, 미국 특허 제5,416,017 호에는 히알루론산의 농도가 0.01 내지 3 %인 젤을 사용한 적혈구 형성 자극인자(erythropoietin)의 서방성 주사제가, 일본 특허 공개 평1-287041호에는 인슐린을 히알루론산의 농도가 1%인 젤에 함유시킨 서방성 주사제, 일본 특허 공개 평2-213호에는 칼시토닌, 엘카토닌, 또는 인간 목적 폴리펩타이드를 5 % 농도의 히알루론산에 함유시킨 서방성 제형이 기재되어 있다. 이와 같은 제형에 있어서, 히알루론산의 젤내에 용해되어 있는 단백질 약물은 점도가 큰 젤 매트릭스를 느린 속도로 통과하므로 지속적인 방출 효과를 나타낼 수 있으나, 높은 점도로 인하여 주사로 투여하는 것이 용이하지 않고, 주사 후에 체액에 의해 쉽게 젤이 희석되거나 분해되어 약물의 방출이 1일 이상 지속되기 어렵다는 단점이 있다.
한편, 소수성을 지닌 히알루론산 유도체 (예컨대, 히알루론산-벤질에스터)를 사용하여 에멀젼 용매추출법으로 고체상의 미세입자를 제조한 예들이 있다 (N.S. Nightlinger, et al., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 22nd, Paper No. 3205 (1995); L. Ilum, et al., J. Controlled Rel ., 29 , 133(1994)). 소수성 히알루론산 유도체를 사용하여 약물 방출 제형 입자 제조시에 유기용매를 사용하여야 하므로, 단백질 약물이 유기 용매와 접촉하여 변성의 우려가 있고, 히알루론산 유도체의 소수성으로 인한 단백질의 변성 가능성이 높다.
따라서, 단백질 또는 펩타이드 약물의 체내 지속성을 개선하기 위하여 기존의 연구와 다른 측면으로의 접근이 요구된다.
본 명세서에서, O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 (예컨대, 면역글로불린의 힌지 영역(hinge region) 등)을 목적 폴리펩타이드 (polypeptide of interest)에 연결시켜 융합 폴리펩타이드를 형성함으로써, O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역과 융합되지 않은 경우와 비교하여, 목적 폴리펩타이드의 체내 반감기를 증가시켜 체내 지속 기간을 증진시키고, 이를 통하여 투여 간격을 증가시키는 기술이 제공된다.
일 예는 목적 폴리펩타이드와 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공한다.
상기 융합 폴리펩타이드에 있어서, 상기 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역은 상기 목적 폴리펩타이드의 N-말단, C-말단, 또는 양 말단 모두에 포함될 수 있다.
상기 융합 폴리펩타이드에 포함된 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역의 총 개수는 1 개 이상, 예컨대, 1 개 내지 10 개, 1 개 내지 8 개, 1 개 내지 6 개, 1 개 내지 4 개, 2 개 내지 10 개, 2 개 내지 8 개, 2 개 내지 6 개, 2 개 내지 4 개 (예컨대, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개)일 수 있다.
일 예에서, 상기 융합 폴리펩타이드는 하기의 일반식으로 표현될 수 있다:
Figure PCTKR2019011409-appb-I000001
상기 식에서,
N' 은 융합 폴리펩타이드의 N-말단이고, C'는 융합 폴리펩타이드의 C-말단이며,
Y 는 목적 폴리펩타이드이고,
Z 는 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역이며,
n 은 융합 폴리펩타이드의 N-말단에 위치하는 (목적 폴리펩타이드의 N-말단에 결합된) O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역의 개수로서, 0 내지 10 (즉, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10), 0 내지 7, 0 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 7, 1 내지 5, 또는 1 내지 3의 정수이고,
m 은 융합 폴리펩타이드의 C-말단에 위치하는 (목적 폴리펩타이드의 C-말단에 결합된) O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역의 개수로서, 0 내지 10 (즉, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10), 0 내지 7, 0 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 7, 1 내지 5, 또는 1 내지 3의 정수이며,
n 과 m 중 하나 이상은 0이 아니고,
n+m 은 융합 폴리펩타이드에 포함된 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역의 총 개수로서, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 또는 2 내지 4의 정수이다.
상기 융합 폴리펩타이드에 포함된 n+m 개의 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역은 각각 독립적으로 O-글리코실화 가능한 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩타이드 부위들 중에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 O-글리코실화 가능한 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩타이드 부위는 면역글로불린의 힌지 영역일 수 있다. 일 예에서, 상기 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역은, 각각 독립적으로, 면역글로불린 D (Immunoglobulin D; IgD)의 힌지 영역 및 면역글로불린 A (Immunoglobulin A; IgA, 예컨대 IgA1)의 힌지 영역으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다 (즉, n+m 개의 면역글로불린의 힌지 영역은 서로 동일하거나 다를 수 있다).
상기 융합 폴리펩타이드에서, O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역과 융합된 목적 폴리펩타이드는, O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역이 융합되지 않은 목적 폴리펩타이드와 비교하여, 체내 (또는 혈중) 안정성(지속기간)이 증가된 것을 특징으로 한다 (예컨대, 채내 또는 혈중 반감기 증가).
다른 예는 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
다른 예는 상기 재조합 벡터를 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는, 체내 (또는 혈중) 반감기가 증가된 목적 폴리펩타이드의 제조 방법, 또는 상기 체내 (또는 혈중) 반감기가 증가된 목적 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드의 제조 방법을 제공한다.
다른 예는 목적 폴리펩타이드와 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역을 융합(또는 연결 또는 결합)시키는 단계를 포함하는 목적 폴리펩타이드의 생체 지속 기간을 증가시키는 방법, 또는 목적 폴리펩타이드(단백질 또는 펩타이드) 약물의 체내(또는 혈중) 안정성 증진 및/또는 체내(또는 혈중) 반감기 증가 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 융합시키는 단계는 목적 폴리펩타이드의 N 말단, C 말단 또는 양 말단에 하나 이상의 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역을 링커를 통하거나 통하지 않고 융합(또는 연결 또는 결합)시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 융합(또는 연결 또는 결합)시키는 단계는 생체 외(in vitro)에서 진행되는 것일 수 있다.
다른 예는 상기 융합 폴리펩타이드, 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 융합 폴리펩타이드, 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 사용하여 약학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
다른 예는 상기 융합 폴리펩타이드, 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 포함하는 약학적 조성물 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
다른 예는 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역의 목적 폴리펩타이드(단백질 또는 펩타이드) 약물의 체내(또는 혈중) 안정성 증진 및/또는 체내(또는 혈중) 반감기 증가 용도를 제공한다. 구체적으로, 일 예는 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역을 포함하는 목적 폴리펩타이드(단백질 또는 펩타이드) 약물의 체내(또는 혈중) 안정성 증진 및/또는 체내(또는 혈중) 반감기 증가용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서는 목적 폴리펩타이드에 면역글로불린의 힌지 영역과 같은 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역을 융합시킨 융합 폴리펩타이드 형태로 제공함으로써, 목적 폴리펩타이드의 체내 적용시에 체내 (또는 혈중) 안정성 및/또는 체내 (또는 혈중) 지속 기간을 증진시키고 투여 간격을 증가시킬 수 있는 기술을 제공한다.
일 예는 목적 폴리펩타이드와 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공한다.
상기 융합 폴리펩타이드에 있어서, 상기 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역은 상기 목적 폴리펩타이드의 N-말단, C-말단, 또는 양 말단 모두에 포함될 수 있다.
상기 융합 폴리펩타이드에 포함된 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역의 총 개수는 1 개 이상, 예컨대, 1 개 내지 10 개, 1 개 내지 8 개, 1 개 내지 6 개, 1 개 내지 4 개, 2 개 내지 10 개, 2 개 내지 8 개, 2 개 내지 6 개, 2 개 내지 4 개 (예컨대, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개)일 수 있다.
일 예에서, 상기 융합 폴리펩타이드는 하기의 일반식으로 표현될 수 있다:
Figure PCTKR2019011409-appb-I000002
상기 식에서,
N' 은 융합 폴리펩타이드의 N-말단이고, C'는 융합 폴리펩타이드의 C-말단이며,
Y 는 목적 폴리펩타이드이고,
Z 는 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역이며,
n 은 융합 폴리펩타이드의 N-말단에 위치하는 (목적 폴리펩타이드의 N-말단에 결합된) O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역의 개수로서, 0 내지 10 (즉, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10), 0 내지 7, 0 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 7, 1 내지 5, 또는 1 내지 3의 정수이고,
m은 융합 폴리펩타이드의 C-말단에 위치하는 (목적 폴리펩타이드의 C-말단에 결합된) O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역의 개수로서, 0 내지 10 (즉, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10), 0 내지 7, 0 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 7, 1 내지 5, 또는 1 내지 3의 정수이며,
n 과 m 중 하나 이상은 0이 아니고 (예, n이 0인 경우 m은 0이 아니고, m이 0인 경우 n은 0이 아님),
n+m 은 융합 폴리펩타이드에 포함된 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역의 총 개수로서, 1 내지 10 (즉, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10), 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 4, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 또는 2 내지 4의 정수이다.
일 예에서, 목적 폴리펩타이드의 활성부위가 N-말단에 위치하는 경우 상기 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역은 C-말단에 융합될 수 있고 (즉, n 은 0이고, m 은 0이 아님), 활성부위가 C-말단에 위치하는 경우 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역은 N-말단에 융합될 수 있다(즉, n 은 0이 아니고, m 은 0임).
상기 융합 폴리펩타이드에 포함된 n+m 개의 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역은 각각 독립적으로 O-글리코실화 가능한 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩타이드들 중에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 O-글리코실화 가능한 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩타이드 부위는 면역글로불린의 힌지 영역일 수 있다. 일 예에서, 상기 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역은, 각각 독립적으로, 면역글로불린 D (Immunoglobulin D; IgD)의 힌지 영역 및 면역글로불린 A (Immunoglobulin A; IgA; 예컨대, IgA1)의 힌지 영역으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 n+m개의 면역글로불린의 힌지 영역은 서로 동일하거나 다를 수 있다.
일 구체예에서, 상기 융합 폴리펩타이드에 포함된 n+m 개의 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역이 융합 폴리펩타이드의 N-말단 및 C-말단 모두에 위치하는 경우 (즉, 융합 폴리펩타이드의 N-말단과 C-말단에 각각 독립적으로 하나 이상의 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역이 존재하는 경우), N-말단에 위치하는 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역과 C-말단에 위치하는 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역의 종류 및 개수는 서로 같거나 다를 수 있으며, 일 구체예에서, N-말단에 위치하는 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개)의 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역은 모두 IgD 의 힌지 영역 또는 IgA(예컨대, IgA1)의 힌지 영역이거나, 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개)의 IgD 의 힌지 영역 및 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개)의 IgA(예컨대, IgA1)의 힌지 영역을 다양한 순서로 포함하는 것일 수 있고, C-말단에 위치하는 하나 이상의 면역글로불린의 힌지 영역은 모두 IgD 의 힌지 영역 또는 IgA(예컨대, IgA1)의 힌지 영역이거나, 하나 이상의 IgD 의 힌지 영역 및 하나 이상의 IgA(예컨대, IgA1)의 힌지 영역을 다양한 순서로 포함하는 것일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 융합 폴리펩타이드에 포함된 n+m 개의 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역이 모두 융합 폴리펩타이드의 N-말단에만 위치하는 경우 (즉, 융합 폴리펩타이드의 N-말단에만 하나 이상의 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역이 존재하는 경우), 상기 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개)의 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역은 모두 IgD 의 힌지 영역 또는 IgA 의 힌지 영역이거나, 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개)의 IgD 의 힌지 영역과 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개)의 IgA 의 힌지 영역을 다양한 순서로 포함하는 것일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 융합 폴리펩타이드에 포함된 n+m 개의 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역이 모두 C-말단에만 위치하는 경우 (즉, 융합 폴리펩타이드의 C-말단에만 하나 이상의 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역이 존재하는 경우), 상기 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개)의 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역은 모두 IgD 의 힌지 영역 또는 IgA(예컨대, IgA1)의 힌지 영역이거나, 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개)의 IgD 의 힌지 영역과 하나 이상(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개)의 IgA(예컨대, IgA1)의 힌지 영역을 다양한 순서로 포함하는 것일 수 있다.
상기 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역(O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역이 2 개 이상의 경우 각각의 영역)은 O-글리코실화 잔기(O-글리코실화 가능한 아미노산 잔기)를 1 개 이상, 2 개 이상, 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 6 개 이상, 또는 7 개 이상 (상한값은 100개, 50개, 25 개, 20 개, 19 개, 18 개, 17 개, 16 개, 15 개, 14 개, 13 개, 12 개, 11 개, 10 개, 9 개, 또는 8 개임) (예컨대, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 또는 8 개) 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역(O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역이 2 개 이상의 경우 각각의 영역)은 O-글리코실화 잔기 (O-글리코실화 가능한 아미노산 잔기)를 1 내지 10 개 또는 3 내지 10 개 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역은 면역글로불린 (예컨대, 인간 면역글로불린)의 힌지 영역들 중에서 하나 이상 선택된 것일 수 있으며, 예컨대, IgD 힌지 영역, IgA 힌지 영역, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 IgD는 인간 IgD (예컨대, UniProKB P01880 (불변영역; 서열번호 7) 등)일 수 있으며, 상기 IgD 의 힌지 영역은,
"N'-ESPKAQA SS VP T AQPQAEGSLAKA TT APA TT RNT-C'(서열번호 1); 굵은 글씨로 표시한 아미노산 잔기는 O-글리코실화 가능 잔기임 (총 7 개)"의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어지는 폴리펩타이드 ("IgD 힌지"),
상기 서열번호 1의 아미노산 서열 중, O-글리코실화 잔기를 1 개 이상, 2 개 이상, 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 6 개 이상, 또는 7 개 포함하는 연속하는 5 개 이상, 7 개 이상, 10 개 이상, 15 개 이상, 20 개 이상, 22 개 이상, 또는 24 개 이상(상한값은 34 개 또는 33 개임)의 아미노산을 포함하거나 상기 아미노산들로 필수적으로 이루어지는 폴리펩타이드 ("IgD 힌지의 일부"; 예컨대, 서열번호 1중의 "SSVPT"(서열번호 9)를 포함하는 연속하는 5 개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드 또는 "TTAPATT"(서열번호 10)를 포함하는 연속하는 7 개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드), 및
IgD (예컨대, 서열번호 7) 중, 서열번호 1의 아미노산 서열 (IgD 힌지)을 포함하는 연속하는 34 개 이상 또는 35 개 이상의 아미노산 또는 상기 IgD 힌지의 일부를 포함하는 연속하는 7 개 이상, 10 개 이상, 15 개 이상, 20 개 이상, 22 개 이상, 또는 24 개 이상의 아미노산을 포함하거나 상기 아미노산들로 필수적으로 이루어지는 폴리펩타이드 ("IgD 힌지의 연장부"; 예컨대, IgD (서열번호 7) 중 "ESPKAQASS VPTAQPQAEG SLAKATTAPA TTRNTGRGGE EKKKEKEKEE QEERETKTP" (서열번호 11) 내의 서열번호 1 또는 상기 IgD 힌지의 일부를 포함하는 연속하는 34 개 이상 또는 35 개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드)
로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있다.
상기 IgA는 인간 IgA (예컨대, IgA1 (UniProKB P01876, 불변영역; 서열번호 8) 등)일 수 있으며, 상기 IgA의 힌지 영역은,
"N'-VP ST PP T P S P S TPP T P S P S -C'(서열번호 2); 굵은 글씨로 표시한 아미노산 잔기는 O-글리코실화 가능 잔기임 (총 8 개)"의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어지는 폴리펩타이드 ("IgA 힌지"),
상기 서열번호 2의 아미노산 서열 중 O-글리코실화 잔기를 1 개 이상, 2 개 이상, 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상, 6 개 이상, 7 개 이상 또는 8 개 포함하는 연속하는 5 개 이상, 6 개 이상, 7 개 이상, 8 개 이상, 9 개 이상, 10 개 이상, 12 개 이상, 15 개 이상, 17 개 이상, 또는 18 개의 아미노산을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어지는 폴리펩타이드 ("IgA 힌지의 일부"; 예컨대 서열번호 2중의 "STPPTPSP"(서열번호 12)를 포함하는 8 개 이상 또는 9 개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드), 및
IgA (예컨대, IgA1(서열번호 8)) 중, 서열번호 2 의 아미노산 서열(IgA(예컨대, IgA1) 힌지)을 포함하는 연속하는 19 개 이상 또는 20 개 이상의 연속하는 아미노산, 또는 IgA(예컨대, IgA1) 힌지의 일부를 포함하는 연속하는 7 개 이상, 10 개 이상, 12 개 이상, 15 개 이상, 17 개 이상, 도는 18 개 이의 아미노산을 포함하거나 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어지는 폴리펩타이드 (IgA "힌지의 연장부")
로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상일 수 있다.
다른 예에서 상기 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역은 다음의 표 1 에 예시된 단백질 (예컨대, 서열번호 23 내지 113으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질) 중의 O-글리코실화 가능한 아미노산 잔기 (O-glycosylation site)를 1 개 이상, 2 개 이상, 5 개 이상, 7 개 이상, 10 개 이상, 12 개 이상, 15 개 이상, 17 개 이상, 20 개 이상, 또는 22 개 이상 (예컨대, 1 내지 10 개, 3 내지 10 개; 또는 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개 또는 25 개)를 포함하는 연속하는 5 개 이상, 7 개 이상, 10 개 이상, 12 개 이상, 15 개 이상, 17 개 이상, 20 개 이상, 22 개 이상, 25 개 이상, 27 개 이상, 30 개 이상, 32 개 이상 또는 35 개 이상 (상한값은 40 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 150 개, 200 개, 250 개, 300 개, 또는 각 단백질의 총 아미노산 개수)의 아미노산을 포함하거나 상기 아미노산들로 필수적으로 이루어지는 폴리펩타이드 영역일 수 있다. 본 명세서에서, O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역은 목적 폴리펩타이드의 기능에 영향을 미치지 않는 것이 좋다. 아래의 표 1에 예시된 단백질의 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역은 전장(full-length) 단백질의 본래적 기능에 관여하지 않는 영역들 중에서 선택된 것일 수 있으며, 이로 인하여 상기 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역은 목적 폴리펩타이드의 기능에는 아무런 영향 없이 단지 반감기를 증가시키는 역할을 수행할 수 있다:
Figure PCTKR2019011409-appb-T000001
Figure PCTKR2019011409-appb-I000003
Figure PCTKR2019011409-appb-I000004
Figure PCTKR2019011409-appb-I000005
Figure PCTKR2019011409-appb-I000006
Figure PCTKR2019011409-appb-I000007
Figure PCTKR2019011409-appb-I000008
Figure PCTKR2019011409-appb-I000009
Figure PCTKR2019011409-appb-I000010
Figure PCTKR2019011409-appb-I000011
Figure PCTKR2019011409-appb-I000012
상기 융합 폴리펩타이드는 실제로 포함하는 O-글리칸의 총 개수가 13 개 이상, 14 개 이상, 15 개 이상, 16 개 이상, 17 개 이상, 18 개 이상, 19 개 이상, 20 개 이상, 또는 21 개 이상이거나 (최대 값은 상기 기재된 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역의 개수 및 각각의 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역에 포함된 O-글리코실화 잔기 개수에 의하여 결정된다), 이론상으로 포함되는 O-글리칸의 총 개수가 20 개 이상, 21 개 이상, 23 개, 또는 24 개 이상(최대 값은 상기 기재된 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역의 개수 및 각각의 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역에 포함된 O-글리코실화 잔기 개수에 의하여 결정된다)일 수 있다. 또한, 융합 폴리펩타이드는 실제로 포함된 O-글리칸의 총 개수는 체내 (예컨대, 혈액내) 투여시 안정성과 관련이 있을 수 있으며, 구체적으로, 융합 폴리펩타이드는 실제로 포함된 O-글리칸의 총 개수가 많아질수록 융합 폴리펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드에 포함된 목적 폴리펩타이드의 체내 안정성이 증가 (즉, 체내 (혈액 내) 반감기 증가 및/또는 체내 (혈액 내) 농도 증가 및/또는 체내 (혈액 내) 분해율 감소 등)될 수 있다.
상기 융합 폴리펩타이드는 목적 폴리펩타이드와 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역 사이 및/또는 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역이 2 개 이상 포함되는 경우 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역 사이에 펩타이드 링커를 추가로 포함할 수 있다. 일 예에서, 상기 펩타이드 링커는 하나 이상의 Gly(G)와 하나 이상의 Ser(S)을 반복적으로 포함하는 GS 링커일 수 있으며, 예컨대, (GGGGS)n (n은 GGGGS(서열번호 13)의 반복 회수로서 1 내지 10 또는 1 내지 5 의 정수 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 또는 5)임)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 융합 폴리펩타이드에서, O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역과 융합된 목적 폴리펩타이드는, O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역이 융합되지 않은 목적 폴리펩타이드와 비교하여, 체내 (또는 혈중) 안정성이 증가된 것을 특징으로 한다 (예컨대, 체내 또는 혈중 반감기 증가).
다른 예는 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
다른 예는 상기 재조합 벡터를 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는, 체내 (또는 혈중) 반감기가 증가된 목적 폴리펩타이드의 제조 방법, 또는 상기 체내 (또는 혈중) 반감기가 증가된 목적 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드의 제조 방법을 제공한다.
다른 예는 목적 폴리펩타이드와 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역을 융합(또는 연결 또는 결합)시키는 단계를 포함하는 목적 폴리펩타이드의 생체 지속 기간을 증가시키는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 융합시키는 단계는 목적 폴리펩타이드의 N 말단, C말단 또는 양 말단에 하나 이상의 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역을 링커를 통하거나 통하지 않고 융합(또는 연결 또는 결합)시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 융합(또는 연결 또는 결합)시키는 단계는 생체 외(in vitro)에서 진행되는 것일 수 있다.
다른 예는 상기 융합 폴리펩타이드, 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
다른 예는 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역의 폴리펩타이드(단백질 또는 펩타이드) 약물의 체내(또는 혈중) 안정성 증진 및/또는 체내(또는 혈중) 반감기 증가 용도를 제공한다. 구체적으로, 일 예는 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역을 포함하는 폴리펩타이드(단백질 또는 펩타이드) 약물의 체내(또는 혈중) 안정성 증진 및/또는 체내(또는 혈중) 반감기 증가용 조성물을 제공한다. 본 명세서에 사용된 바로서, 안정성 증진 및/또는 반감기 증가는 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역을 포함하지 않는 폴리펩타이드 (단백질 또는 펩타이드)와 비교하여 안정성이 증진되거나 및/또는 반감기가 증가한 것을 의미한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다:
상기 목적 폴리펩타이드 (Y)는 모든 가용성 단백질들 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 목적 폴리펩타이드는 생체에서 목적하는 활성 (예컨대 특정 질병 또는 증상의 예방, 경감, 및/또는 치료 활성 또는 마커로서의 활성, 또는 생체 필요 물질을 대체하는 활성)을 갖는 단백질 및/또는 펩타이드 (예컨대, 약 100개 이하 또는 약 50개 이하의 아미노산 포함)일 수 있으며, 예컨대, 효소 활성의 단백질 또는 펩타이드 (예컨대, 프로테아제, 키나제, 포스파타제 등), 수용체 단백질 또는 펩타이드, 수송체 단백질 또는 펩타이드, 살균 및/또는 내독소-결합 폴리펩타이드, 구조 단백질 또는 펩타이드, 면역 폴리펩타이드, 항체 모사 단백질 (antibody-mimetic protein, 예컨대, 단백질 스캐폴드 (protein scaffold), fc-융합 단백질 등), 독소, 항생제, 호르몬, 성장 인자, 백신 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서, 상기 목적 폴리펩타이드는 호르몬, 사이토카인, 조직 플라스미노겐 활성인자, 면역글로불린 (예컨대, 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 변이체), 항체 모사 단백질 (antibody-mimetic protein, 예컨대, 단백질 스캐폴드 (protein scaffold), fc-융합 단백질 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 목적 폴리펩타이드는 성장호르몬 (예컨대, 사람 성장 호르몬(hGH)), p40, BMP-1 (bone morphogenetic protein-1), 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론류 (예컨대, 인터페론-alpha, -beta, -gamma 등), 인터페론 수용체류 (예컨대, 수용성 타입 Ⅰ 인터페론 수용체 등), G-CSF (granulocyte colony stimulating factor), GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor), 글루카곤-유사 펩타이드 (glucagon-like peptides)(예, GLP-1, 등), 인슐린-유사 성장 인자 (insulin-like growth factor; IGF), G-단백질-결합 수용체 (G-protein-coupled receptor), 인터루킨류 (예, 인터루킨-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, 28, -29, -30 등), 인터루킨 수용체류 (예, IL-1 수용체, IL-4 수용체, 등), 효소 (예, 글루코세레브로시데이즈 (glucocerebrosidase), 이듀로네이트-2-설파테이즈 (iduronate-2-sulfatase), 알파-갈락토시데이즈 A (alpha-galactosidase-A), 아갈시데이즈 알파 및 베타 (agalsidase alpha and beta), 알파-L-이듀로니데이즈 (alpha-L-iduronidase), 뷰티릴콜리네스터레이즈 (butyrylcholinesterase), 키티네이즈 (chitinase), 글루타메이트 디카르복실레이즈 (glutamate decarboxylase), 이미글루세라제 (imiglucerase), 라이페이즈 (lipase), 유리케이즈 (uricase), 혈소판-활성화 인자 아세틸하이드롤레이즈 (platelet-activating factor acetylhydrolase), 중성 엔도펩티데이즈 (neutral endopeptidase), 마이엘로페록시데이즈 (myeloperoxidase), 등), 인터루킨 또는 사이토카인 결합 단백질 (예, IL-18bp, TNF-결합 단백질 등), 대식세포 (macrophage) 활성화 인자, 대식세포 펩타이드, B 세포 인자, T 세포 인자, 단백질 A, 알레르기 억제제, 세포 괴사 글라이코단백질 (cell necrosis glycoproteins), 면역독소 (immunotoxin), 림프독소 (lymphotoxin), 종양 괴사 인자 (tumor necrosis factor), 종양 억제제 (tumor suppressors), 전이 성장 인자 (metastasis growth factor), 알파-1 안티트립신 (alpha-1 antitrypsin), 알부민 (albumin), 알파-락트알부민 (alpha-lactalbumin), 아포리포단백질-E (apolipoprotein-E), 적혈구생성인자 (erythropoietin), 고당쇄화 적혈구생성인자 (highly glycosylated erythropoietin), 엔지오포이에틴 (angiopoietins); 헤모글로빈 (hemoglobin), 트롬빈 (thrombin), 트롬빈 수용체 활성 펩타이드 (thrombin receptor activating peptide), 트롬보모듈린 (thrombomodulin), 혈액 인자 VII, 혈액 인자 VIIa, 혈액 인자 VIII, 혈액 인자 IX, 혈액 인자 XIII, 플라스미노겐 활성화 인자 (plasminogen activating factor), 피브린-결합 펩타이드 (fibrin-binding peptide), 유로키나아제 (urokinase), 스트렙토카이네이즈 (streptokinase), 히루딘 (hirudin), 단백질 C (protein C), C-반응성 단백질, (C-reactive protein), 레닌 억제제 (renin inhibitor), 콜라게네이즈 억제제 (collagenase inhibitor), 슈퍼옥사이드 디스뮤테이이즈(superoxide dismutase), 렙틴 (leptin), 혈소판-유래 성장 인자 (platelet-derived growth factor), 상피 성장 인자 (epithelial growth factor), 외피 성장 인자 (epidermal growth factor), 앤지오스타틴 (angiostatin), 앤지오텐신 (angiotensin), 뼈 성장 인자 (bone growth factor), 뼈 촉진 단백질 (bone stimulating protein), 칼시토닌 (calcitonin), 인슐린 (insulin), 아트리오펩틴 (atriopeptin), 연골 유도 인자 (cartilage inducing factor), 엘카토닌 (elcatonin), 결합 조직 활성 인자 (connective tissue activating factor), 조직 인자 경로 억제제 (tissue factor pathway inhibitor), 여포 자극 호르몬 (follicle stimulating hormone), 황체형성 호르몬 (luteinizing hormone), 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 (luteinizing hormone releasing hormone), 신경 성장 인자류 (nerve growth factor) (예, 신경 성장 인자, 섬모 신경영양 인자 (ciliary neurotrophic factor), AF-1 (axogenesis factor-1), 뇌-나트륨이뇨 펩타이드 (brain-natriuretic peptide), 신경 아교세포계 유래 향신경 인자 (glial derived neurotrophic factor), 네트린 (netrin), 호중구 억제 인자 (neutrophil inhibitor factor), 향신경 인자 (neurotrophic factor), 뉴튜린 (neuturin) 등), 부갑상선 호르몬 (parathyroid hormone), 렐랙신 (relaxin), 세크레틴 (secretin), 소마토메딘 (somatomedin), 부신피질 호르몬 (adrenocortical hormone), 글루카곤 (glucagon), 콜레시스토키닌 (cholecystokinin), 췌장 폴리펩타이드 (pancreatic polypeptide), 가스트린 방출 펩타이드 (gastrin releasing peptide), 코르티코트로핀 방출 인자 (corticotropin releasing factor), 갑상선 자극 호르몬 (thyroid stimulating hormone), 오토탁신 (autotaxin), 락토페린 (lactoferrin), 미오스타틴 (myostatin), 수용체류(예, TNF 수용체 (예컨대, TNFR(p75), TNFR(p55) 등), IL-1 수용체, VEGF 수용체, EGF 수용체, B 세포 활성화 인자 수용체, 등), 수용체 길항제 (IL1-Ra 등), 세포 표면 항원 (예, CD2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69 등), 바이러스 백신 항원, 항체 (예컨대, 단일클론 항체, 다중클론 항체), 항체 단편 (예, scFv, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fd), 바이러스 유래 백신 항원, 및 이들의 변이체/단편(예컨대, 소망하는 기능 및/또는 구조를 유지하는 변이체/단편), 항체 모사 단백질 (antibody-mimetic protein, 예컨대, 단백질 스캐폴드 (protein scaffold), fc-융합 단백질 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 항체는 임의의 이소타입 (예컨대, IgA (IgA1, IgA2 등), IgD, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등), IgM 또는 IgE)의 것일 수 있으며, 상기 항체 단편은 본래 항체의 항원 결합 능력을 보유하는 항원결합단편으로, 약 20개 이상의 아미노산, 예컨대, 약 100개 이상의 아미노산을 포함하는 항체의 임의의 단편 (예컨대, CDR, Fab, Fab', F(ab)2, Fd, Fv, scFv, scFv-Fc 등)일 수 있다. 상기 Fab 단편은 경쇄의 가변 도메인 (VL) 및 불변 도메인 (CL) 및 중쇄의 가변 도메인 (VH) 및 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 힌지 영역으로부터 CH1 도메인의 카르복실 말단까지 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 아미노산 잔기가 첨가되었다는 점에서 Fab 단편과는 상이하다. Fd 단편은 VH 및 CH1 도메인만을 포함하며, F(ab')2 단편은 이황화 결합 또는 화학반응을 통하여 Fab' 단편이 쌍을 이룸으로써 제조된다. scFv (single-chain Fv) 단편은 펩타이드 링커로 연결된 VL 및 VH 도메인을 포함하므로 단일 폴리펩타이드 사슬로 존재한다. 상기 항체 모사 단백질은 항체 이외의 특정 항원과 결합 가능한 부위를 포함하는 모든 단백질을 의미하는 것일 수 있으며, 예컨대, 레피바디 (repebody) 등의 단백질 스캐폴드 (antibody-mimetic protein scaffold), 나노바디 (nanobody), 펩티바디 (peptibody) 등의 Fc-융합 단백질 (Fc와 항원결합폴리펩타이드의 융합 단백질) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 상기 목적 폴리펩타이드는 모든 분비 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기한 목적 폴리펩타이드는 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등을 포함하는 포유동물 유래 (포유동물로부터 분리된) 폴리펩타이드일 수 있으며, 예컨대, 인간 유래 (인간에서 분리된) 폴리펩타이드일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 목적 폴리펩타이드와 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역을 포함하는 융합 폴리펩타이드에서, 목적 폴리펩타이드와 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역, 및/또는 2 이상의 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드영역들은 공유적 또는 비공유적으로 직접 (예컨대, 링커 없이) 연결되거나, 적절한 링커 (예컨대, 펩타이드 링커)를 통하여 연결된 것일 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 1 내지 20 개, 1 내지 15 개, 1 내지 10 개, 2 내지 20개, 2 내지 15 개, 또는 2 내지 10 개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다. 상기 펩타이드 링커는, 예컨대, Gly, Asn 및/또는 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및/또는 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 펩타이드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당 업계에 공지되어 있다. 일 예에서, 상기 펩타이드 링커는 하나 이상의 Gly(G)와 하나 이상의 Ser(S)을 반복적으로 포함하는 GS 링커일 수 있으며, 예컨대, (GGGGS)n (n은 GGGGS(서열번호 13)의 반복 회수로서 1 내지 10의 정수 또는 1 내지 5의 정수 (1, 2, 3, 4, 또는 5)임)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 융합 폴리펩타이드는 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역을 총 1개 이상 또는 총 2개 이상 (예컨대, 2 내지 10개, 2 내지 8개, 2 내지 6개, 2 내지 5개, 2 내지 4개, 2개 또는 3개) 포함하는 것일 수 있다. 융합 폴리펩타이드가 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역을 2개 이상 포함하는 경우, 상기 융합 폴리펩타이드는 2개 이상의 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역이 목적 폴리펩타이드의 N말단 또는 C말단에 결합되어 있거나, 목적 폴리펩타이드의 N말단 및 C말단에 각각 독립적으로 1개 이상의 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역이 결합되어 있는 것일 수 있다 (이 경우, 목적 폴리펩타이드의 N말단 및 C말단에 결합된 힌지 영역의 종류 및 개수는 같거나 다를 수 있다). 이 때, O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역 간 및/또는 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역과 인간 목적 폴리펩타이드 간에는 앞서 설명한 펩타이드 링커가 추가로 포함될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 융합 폴리펩타이드는 재조합적 또는 합성적으로 생산된 것일 수 있으며, 천연 유래(naturally occurring)의 것이 아닐 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 융합 폴리펩타이드에 포함된 목적 폴리펩타이드의 포유류에서의 체내(혈중) 반감기는, O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역이 융합되지 않은 목적 폴리펩타이드와 비교하여, 약 1.5배 이상, 약 2배 이상, 약 2.5배 이상, 약 3배 이상, 약 3.5배 이상, 약 4배 이상, 약 5배 이상, 약 6배 이상, 약 7배 이상, 약 8배 이상, 약 9배 이상, 또는 약 10배 이상 증가된 것일 수 있다.
이와 같이, 증가된 목적 폴리펩타이드 반감기에 의하여, O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역이 결합된 융합 폴리펩타이드 형태의 목적 폴리펩타이드는, O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역이 연결되지 않은 형태의 목적 폴리펩타이드와 비교하여, 투여 간격을 길게 가져갈 수 있다는 이점이 있다.
목적 폴리펩타이드와 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역을 포함하는 융합 폴리펩타이드는 통상적인 화학적 합성 방법 또는 재조합적 방법에 의하여 제조될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 발현 수단을 의미하는 것으로, 예컨대, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 일 예에서, 상기 재조합 벡터에 사용될 수 있는 벡터는 플라스미드 (예컨대, pcDNA 시리즈, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19 등), 파지 (예컨대, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1, M13 등) 또는 바이러스 (예컨대, SV40 등)를 기본으로 하여 제작될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 재조합 벡터에서 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 발현 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 진핵 세포를 숙주로 하여 발현될 수 있다. 진핵 세포를 숙주로 발현시키고자 하는 경우에는, 재조합 벡터는, 발현시키고자 하는 핵산 분자 및 앞서 설명한 프로모터, 라이보좀 결합 자리, 분비 신호 서열(공개특허 제2015-0125402호 참조) 및/또는 전사/해독 종결 서열 이외에, 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, 및/또는 BBV 복제원점 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 분비 신호 서열로서 통상적으로 사용 가능한 모든 분비 신호 서열을 사용할 수 있으며 예컨대, 공개특허 제2015-0125402호에 기재된 분비 신호 서열을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다.
상기 재조합 세포는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입(형질전환 또는 형질감염)시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 벡터를 안정적이면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 모든 진핵 세포 중에서 선택될 수 있다. 숙주로 사용 가능한 진핵 세포로는, 효모(Saccharomyces cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포, 및 동물 세포 등이 있으며, 예를 들어, 마우스 (예컨대, COP, L, C127, Sp2/0, NS-0, NS-1, At20, 또는 NIH3T3), 래트 (예컨대, PC12, PC12h, GH3, 또는 MtT), 햄스터 (예컨대, BHK, CHO, GS 유전자 결함 CHO, 또는 DHFR 유전자 결함 CHO), 원숭이 (예컨대, COS (COS1, COS3, COS7 등), CV1 또는 Vero), 인간 (예컨대, HeLa, HEK-293, 망막-유래 PER-C6, 이배체 섬유모세포로부터 유래된 세포, 골수종 세포 또는 HepG2), 그 외 동물 세포 (예컨대, MDCK 등), 곤충세포 (예컨대, Sf9 세포, Sf21 세포, Tn-368 세포, BTI-TN-5B1-4 세포 등), 하이브리도마 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원 명세서에 제공되는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 앞서 설명한 적절한 숙주 세포에서 발현시킴으로써, 융합되지 않은 형태와 비교하여, 체내 안정성이 증진된 목적 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 상기 융합 폴리펩타이드의 제조 방법은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 배양하는 단계는 통상적인 배양 조건에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 제조 방법은 상기 배양하는 단계 이후에, 배양물로부터 융합 폴리펩타이드를 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 핵산 분자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 형질 전환(재조합 벡터 도입)된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 배양함으로써 제조합 벡터가 도입된 재조합 세포를 용이하게 선별할 수 있다.
상기 융합 폴리펩타이드는 목적 폴리펩타이드 결핍 및/또는 기능 이상과 관련되거나, 목적 폴리펩타이드의 활성에 의하여 치료, 경감, 또는 개선이 가능한 모든 질병의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 일 예에서, 상기 융합 폴리펩타이드, 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 상기 약학 조성물은 상기 융합 단백질에 포함된 목적 폴리펩타이드 결핍 및/또는 기능 이상과 관련된 질병 또는 상기 목적 폴리펩타이드가 치료 및/또는 예방 효과를 갖는 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물일 수 있다. 다른 예는 상기 융합 폴리펩타이드, 상기 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 상기 융합 단백질에 포함된 목적 폴리펩타이드 결핍 및/또는 기능 이상과 관련된 질병 또는 상기 목적 폴리펩타이드가 치료 및/또는 예방 효과를 갖는 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 융합 단백질에 포함된 목적 폴리펩타이드 결핍 및/또는 기능 이상과 관련된 질병 또는 상기 목적 폴리펩타이드가 치료 및/또는 예방 효과를 갖는 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 투여하는 단계 이전에, 상기 융합 단백질에 포함된 목적 폴리펩타이드 결핍 및/또는 기능 이상과 관련된 질병 또는 상기 목적 폴리펩타이드가 치료 및/또는 예방 효과를 갖는 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 상기 융합 폴리펩타이드, 핵산 분자, 재조합 벡터, 및 재조합 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유효 성분을 약학적 유효량으로 포함할 수 있다. 상기 약학적 유효량은 소망하는 효과를 얻을 수 있는 유효성분의 함유량 또는 투여량을 의미한다. 상기 약학 조성물 내의 유효 성분의 함유량 또는 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 상기 유효성분의 1회 투여량은 0.001 내지 1000 mg/kg, 0.01 내지 100 mg/kg, 0.01 내지 50 mg/kg, 0.01 내지 20 mg/kg, 또는 0.01 내지 1mg/kg 범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 약학 조성물은, 상기 유효 성분 이외에, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 담체는 단백질, 핵산, 또는 세포를 포함하는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여 대상은 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등을 포함하는 포유류, 또는 이들로부터 유래하는 세포, 조직, 세포 배양물 또는 조직 배양물일 수 있다.
상기 약학 조성물은 경구 투여 또는 비경구적 투여에 의하여 투여되거나, 세포, 조직, 또는 체액에 접촉시킴으로써 투여되는 것일 수 있다. 구체적으로, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다.
또한 상기 약학 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역과 융합된 목적 폴리펩타이드는 체내 투여시 지속 기간이 길어서 투여 간격을 늘릴 수 있고 이를 통하여 투여 용량을 줄일 수 있으므로, 투여 편의성 및/또는 경제적 측면에서 유리한 효과를 가지며, 목적 폴리펩타이드 치료가 필요한 분야에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 융합 폴리펩타이드 IgD-hGH-His (DHDD-8His), IgD-hGH (DHDD), IgA-hGH (AHAA), IgD-hGH-IgA (DHAA), 및 IgA-hGH-IgD (AHDD)의 구조를 개략적으로 보여주는 모식도이다.
도 2는 일 실시예에 따른 융합 폴리펩타이드 IgD-hGH를 Q-TOF Mass Spectrometry로 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 IEF (Isoelectric focusing)에 의하여 분석된 융합 폴리펩타이드 IgD-hGH-His의 이성질체 분포를 보여주는 결과이다.
도 4는 일 실시예에 따른 융합 폴리펩타이드 IgD-hGH-His를 Q-TOF Mass Spectrometry로 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 일 실시예에 따른 융합 폴리펩타이드 Dulaglutide-ID와 Dulaglutide-ID2의 구조를 개략적으로 보여주는 모식도이다.
도 6은 IEF (Isoelectric focusing)에 의하여 분석된 융합 폴리펩타이드 Dulaglutide-ID2의 이성질체 분포를 보여주는 결과를 보여준다.
도 7은 융합 폴리펩타이드 IgD-hGH 투여 후 시간에 따른 혈중 농도 변화를 hGH 투여시와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 융합 폴리펩타이드 IgD-hGH-His 투여 후 시간에 따른 혈중 농도 변화를 hGH 투여시와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 융합 폴리펩타이드 IgA-hGH F3, IgA-hGH F4, 및 IgA-hGH F5 투여 후 시간에 따른 혈중 농도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 10은 융합 폴리펩타이드 Dulaglutide-ID2 (pGIgG4DD)투여 후 시간에 따른 혈중 농도 변화를 Dulaglutide (Trulicity) 투여시와 비교하여 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 융합 폴리펩타이드의 제조
1.1. 목적 폴리펩타이드로서 인간 성장 호르몬 (hGH)을 포함하는 융합 폴리펩타이드의 제조
IgD 힌지 (ESPKAQA SS VP T AQPQAEGSLAKA TT APA TT RNT; 서열번호 1), IgA1 힌지 (VP ST PP T P S P S TPP T P S P S ; 서열번호 2), 또는 IgD의 힌지와 IgA1 힌지의 조합이 목적 폴리펩타이드 (인간 성장호르몬: hGH; 서열번호 3)와 융합된 융합 폴리펩타이드 IgD-hGH-His (DHDD-8His), IgD-hGH (DHDD), IgA-hGH (AHAA), IgD-hGH-IgA (DHAA), 및 IgA-hGH-IgD (AHDD)(도 1 참조; IgD 및 IgA1의 서열 중 밑줄로 표시된 부분이 O-Glycosylation 가능 부위임)를 제조하였다. 상기 융합 폴리펩타이드에 포함된 각 부분의 아미노산 서열을 아래의 표 2에 정리하였다.
Figure PCTKR2019011409-appb-T000002
1.1.1. IgD-hGH (DHDD)
pcDNA3.1(+) (Invitrogen, Cat. No. V790-20)의 변형체인 플라스미드 pAF-D1G1(KR10-1868139B1 의 Promoter 를 포함하고 있음) 을 BamHI (제한부위: GGATCC) 및 NotI (제한부위: GCGGCCGC)으로 처리하고, 여기에 '(N말단)-[BamHI 제한부위-시그널 펩타이드(서열번호 4)-IgD 힌지(IgDH1; 서열번호 1)-인간 성장호르몬(hGH; 서열번호 3)-IgD 힌지(IgDH1; 서열번호 1)-IgD 힌지(IgDH1; 서열번호 1)-NotI 제한부위]-(C 말단)'의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 삽입하여, 목적 폴리펩타이드(인간 성장호르몬)와 면역글로불린(IgD)의 힌지 영역을 포함하는 융합 폴리펩타이드(총 293 aa (signal peptide 제외); O-Glycosylation 가능 부위 - 총 21 개); 이하, 'IgD-hGH'라 칭함)의 제조를 위한 재조합 벡터 pDHDD-D1G1 을 준비하였다.
상기 준비된 재조합 벡터 pDHDD-D1G1 를 ExpiCHO-STM 세포 (Thermo Fisher Scientific)에 도입하고 ExpiCHO Expression Medium (Thermo Fisher Scientific; 400 mL)에서 12일 동안 배양(Fed-Batch Culture; Day 1 & Day 5 Feeding)하여, 융합 폴리펩타이드 IgD-hGH 를 생산하였다. 융합 폴리펩타이드 IgD-hGH 는 이론상 32.2 kDa 의 분자량 (O-Glycan 제외) 및 21 개의 O-Glycan 을 갖는다.
상기 재조합 벡터 발현을 통하여 생산된 융합 폴리펩타이드 IgD-hGH 를 정제하고 Q-TOF Mass Spectrometry 를 이용하여 O-Glyan site Occupancy 를 분석하였다.
구체적으로, 정제 제 1 공정은 hGH 에 Binding Specificity 를 가지는 CaptureSelectTM Human Growth Hormone Affinity Matrix (Life Technologies)로 제작된 Column 을 AKTATM Purifier (GE Healthcare Life Sciences)에 장착하고 샘플을 Loading 하여 수행하였다. 평형 버퍼로 1 차 Washing 을 실시하고 20mM Citric acid pH 3.0 또는 0.1M Acetic acid pH 3.0 을 이용하여 Elution 하였으며 Elution 용액은 공정이 끝난 후 곧바로 2M Tris Buffer 를 이용하여 pH 7.0 으로 맞추어 다음 정제공정 전까지 얼려두었다.
정제 2 공정은 Anion Exchange Chromatography 를 적용하였으며 Resin 으로 TMAE 를 사용하여 수행하였다. 얼려두었던 1 공정 종료 시료를 녹인 후 전도도를 측정하고 Loading 에 적합한 전도도가 되도록 주사용수를 이용하여 희석하고 0.22um PES Filtration System (Corning, USA)으로 전처리를 실시하였다. AKTA Avant (GE Healthcare Life Sciences)에 Column 을 장착하고 샘플을 Loading 하였다. 전도도에 따른 분리를 위해 Gradient 형태로 Elution 이 되도록 하였고 Fraction 을 나누어 Elution Peak 를 참조하여 Pooling 하였다.
정제공정 중 분석 시료와 동물 실험용 샘플 준비를 위해 농축 또는 Buffer 교환을 실시하였다. Amicon Ultra System (Millipore)에 샘플을 넣은 후 저온에서 원심분리를 실시하여 농축 또는 Diafiltration 을 실시하였으며 분석을 위한 Buffer 로는 25mM Sodium Phosphate pH 7.0 을 이용하였고 동물 실험용 샘플 준비를 위해서는 PBS Buffer 를 이용하였다.
정제공정, 농축공정 또는 Diafiltration 후 시료들의 농도 측정은 아미노산서열을 이용하여 물질의 Extinction Coefficient 를 계산하고 UV Spectrophotometer (G1103A, Agilent Technologies)에서 280nm 와 340nm 의 흡광도를 측정하여, 아래의 계산식을 통해 구하였다.
Figure PCTKR2019011409-appb-I000013
동물실험용 시료의 경우 PBS Buffer 를 이용하여 정해진 농도로 희석하였으며 투여 전에 Biosafety Cabinet 내에서 0.22um Syringe Filter (Millex-GV, 0.22um, Millipore)로 Filtering 을 실시한 후, 투여시까지 냉동보관 하였다.
IgD-hGH 를 Q-TOF Mass Spectrometry 로 분석한 결과를 도 2 에 나타내었다 (Y 축: %; X 축: mass; 피크 위에 표시된 7~21 수치가 O-Glycan 개수임). 도 2 에 나타난 바와 같이, IgD-hGH에 O-Glycan 이 7 개에서 21 개까지 분포되어 있었으며 평균 O-Glycan 수는 13.5 개 이었다.
1.1.2. IgD-hGH-His
정제 편의성을 위하여 IgD-hGH(실시예 1.1.1)의 C-말단에 8His-tag 을 추가하기 위하여 표 3 의 Primers 를 합성하였다.
Figure PCTKR2019011409-appb-T000003
각각의 Primers 를 이용하여 PCR 을 수행한 후 다시 적당한 Primers 조합으로 Overlapping PCR 을 수행하여 최종적으로 693 bp 의 PCR 산물 ('(N말단)-[PstI 제한부위-시그널 펩타이드(서열번호 4)-IgD 힌지(IgDH1; 서열번호 1)-인간 성장호르몬(hGH; 서열번호 3)-IgD 힌지(IgDH1; 서열번호 1)-IgD 힌지(IgDH1; 서열번호 1)-8His-NotI 제한부위]-(C 말단)'를 암호화하는 유전자)을 얻은 후, pDHDD-D1G1 과 PCR 산물을 각각 PstI 과 NotI 으로 처리한 후 Ligation 하여, 최종적으로 목적 폴리펩타이드(인간 성장호르몬)와 면역글로불린(IgD)의 힌지 영역 및 8His Tag 을 포함하는 융합 폴리펩타이드(총 301 aa (signal peptide 제외); O-Glycosylation 가능 부위 - 총 21 개); 이하, 'IgD-hGH-His'라 칭함)의 제조를 위한 재조합 벡터 pDHDD-8His-D1G1 을 준비하였다.
상기 재조합 벡터 발현을 통하여 생산된 융합 폴리펩타이드 IgD-hGH-His 를 정제하고 IEF (Isoelectric focusing) 분석 및 Q-TOF Mass Spectrometry 를 이용하여 O-Glycan site Occupancy 를 분석하였다.
구체적으로 정제 공정에 사용된 1 차 칼럼은 음이온 교환 수지인 TMAE 로서 배양액으로부터 IgD-hGH-His 를 부분적으로 분리하여 1 차 용출액으로 용출시켰다. 그 다음, 1 차 용출액은 2 차 칼럼인 금속 친화 수지인 HIS-Tag 결합 칼럼에 공급하여 선택적으로 IgD-hGH-His 를 2 차 용출액으로 용출시켰다. 그 다음, 2 차 용출액은 3 차 칼럼인 음이온 교환 수지인 TMAE에 공급하여 시알산의 함량이 낮은 분획을 제거하여 3 차 용출액으로 용출시켰다. 그 다음, 3 차 용출액은 4 차 칼럼인 겔 여과 칼럼에 공급하여 다량체 및 절편화된 단백질을 제거하여 4 차 용출액을 수득하였다.
더 상세하게는, 다음과 같은 단계를 포함한다.
단계 1: TMAE, 0.5x25 cm(4 mL), v= 150 cm/hr, 10 mM 트롤아민 (pH 7.0)을 포함하는 완충액으로 평형화시킴. 배양액을 로딩 후, 칼럼은 평형완충액으로 1회 세척하고, 10 mM 트롤아민, 250 mM 염화나트륨(pH 7.0)을 포함하는 용출 완충액을 선형 구배로 용출시켜 1차 용출액을 수득했다.
단계 2: Ni-NTA His*Bind, 1.0 x 5 cm(4 mL), v= 80 cm/hr, 10 mM 인산나트륨, 1M 염화나트륨, 10 mM 이미다졸 (pH 7.0)을 포함하는 완충액으로 평형화 시킴. 1차 용출액을 로딩 후 칼럼은 평형완충액으로 1회 세척하고, 10 mM 인산나트륨, 1M 염화나트륨, 500 mM 이미다졸 (pH 7.0)을 포함하는 용출 완충액을 선형 구배로 용출시켜 2차 용출액을 수득하였다.
단계 3: 투석 여과
단계 4: TMAE, 0.5x25 cm(4 mL), v= 150 cm/hr, 10 mM 트롤아민 (pH 7.0)을 포함하는 완충액으로 평형화시킴. 2차 용출액을 로딩 후, 칼럼은 평형완충액으로 1회 세척하고, 10 mM 트롤아민, 100 mM 염화나트륨(pH 7.0)을 포함하는 용출 완충액을 선형 구배로 용출시켜 3차 용출액을 수득했다.
단계 5: 한외 여과
단계 6: 세파크릴 S-100, 1.6 x 30 cm (60 mL), v= 30 cm/hr, 20 mM 인산나트륨 140 mM 염화나트륨(pH 7.0)을 포함하는 완충액으로 평형화시킴. 3차 용출액을 로딩 후 평형 완충액으로 단량체 분획을 용출시켜 4차 용출액을 수득하였다.
상기 수득된 4 차 용출액에 대한 이성질체 분포를 도 3 에 나타내었다. 도 3 에서, IgD-hGH-His 의 이론적 pI 값은 6.65 인데, 이보다 낮은 것은 IgD-hGH-His 이 O-Glycosylation 이 되어 있고 이 O-Glycan 에 시알산이 결합되어 더욱 acidic 해진 것을 의미한다.
IgD-hGH-His 를 Q-TOF Mass Spectrometry 로 분석한 결과를 도 4 에 나타내었다(Y 축: %; X 축: mass; 피크 위에 표시된 7~21 수치가 O-Glycan 개수임). 도 4 에서와 같이, IgD-hGH-His 에서 O-Glycan 은 8 개 내지 21 개까지 분포되어 있었으며 평균 O-Glycan 수는 14.7 개 이었다.
1.1.3. IgA-hGH (AHAA)
실시예 1.1.1 에서 제작된 재조합 벡터 pDHDD-D1G1 중 3 개의 IgD 힌지 (hGH 의 N 말단쪽 1 개 및 C 말단쪽 2 개, 총 3 개)의 암호화 유전자가 각각 IgA1 힌지의 암호화 유전자로 대체된 것을 제외하고 동일한 구성을 갖도록 재조합 벡터 pAHAA-D1G1 를 제작하고, 실시예 1.1.1 의 방법과 동일하게 발현시켜, IgA1 힌지(IgA; 서열번호 2)-인간 성장호르몬(hGH; 서열번호 3)-IgA1 힌지(IgA; 서열번호 2)-IgA1 힌지(IgA; 서열번호 2)의 구성을 갖는 융합 폴리펩타이드 (도 1 참조; 이하 'IgA-hGH'라고 칭함)를 생산하였다. 융합 폴리펩타이드 IgA-hGH 는 이론상 24 개의 O-Glycan 을 갖는다. 상기 재조합 벡터 발현을 통하여 생산된 융합 폴리펩타이드 IgA-hGH를 실시예 1.1.1 에 기재된 방법을 참조하여 정제하였다.
정제된 IgA-hGH 를 Q-TOF Mass Spectrometry 로 분석한 결과, IgA-hGH 에서의 평균 O-Glycan 수는 Fraction 3 에서 12.8 개, Fraction 4 에서 14.3 개, Fraction 5 에서 15.6 개였다.
1.1.4. IgD-hGH-IgA (DHAA)
실시예 1.1.1 에서 제작된 재조합 벡터 pDHDD-D1G1 을 BamHI 과 NotI 으로 자른 7574 bp 의 vector 에 pDHDD-D1G1 을 BamHI 과 KasI 으로 자른 489 bp 의 Insert I 과 실시예 1.1.3 에서 사용된 재조합 벡터 pAHAA-D1G1 을 KasI 과 NotI 으로 자른 383 bp 의 Insert II 를 Ligation 하여, 재조합 벡터 pDHDD-D1G1 중의 3 개의 IgD 힌지 (hGH의 N 말단쪽 1 개 및 C 말단쪽 2 개, 총 3 개) 암호화 유전자 중 3' 말단쪽 2 개가 IgA1 힌지의 암호화 유전자로 대체된 것을 제외하고 동일한 구성을 갖도록 하여, 재조합 벡터 pDHAA-D1G1 를 제작하였다. 상기 재조합 벡터 pDHAA-D1G1 를 실시예 1.1.1 의 방법과 동일하게 발현시켜, IgD 힌지(IgD; 서열번호 1)-인간 성장호르몬(hGH; 서열번호 3)-IgA1 힌지(IgA; 서열번호 2)-IgA1 힌지(IgA; 서열번호 2)의 구성을 갖는 융합 폴리펩타이드 (도 1 참조; 이하 'IgD-hGH-IgA'라고 칭함)를 생산하였다. 융합 폴리펩타이드 IgD-hGH-IgA는 이론상 23 개의 O-Glycan 을 갖는다.
1.1.5. IgA-hGH-IgD (AHDD)
실시예 1.1.1 에서 제작된 재조합 벡터 pDHDD-D1G1 을 BamHI 과 NotI 으로 자른 7574 bp 의 vector 에 실시예 1.1.3 에서 사용된 pAHAA-D1G1 을 BamHI 과 KasI 으로 자른 444 bp 의 Insert I 과 실시예 1.1.1 에서 사용된 재조합 벡터 pDHDD-D1G1 을 KasI 과 NotI 으로 자른 473 bp 의 Insert II 를 Ligation 하여 3 개의 IgD 힌지 (hGH의 N 말단쪽 1 개 및 C 말단쪽 2 개, 총 3 개)의 암호화 유전자 중 5' 말단쪽 1 개가 IgA1 힌지의 암호화 유전자로 대체된 것을 제외하고 동일한 구성을 갖도록 하여, 재조합 벡터 pAHDD-D1G1 를 제작하고, 실시예 1.1.1 의 방법과 동일하게 발현시켜, IgA1 힌지(IgA; 서열번호 2)-인간 성장호르몬(hGH; 서열번호 3)-IgD 힌지(IgD; 서열번호 1)-IgD 힌지(IgD; 서열번호 1)의 구성을 갖는 융합 폴리펩타이드 (도 1 참조; 이하 'IgA-hGH-IgD'라고 칭함)를 생산하였다. 융합 폴리펩타이드 IgA-hGH-IgD 는 이론상 22 개의 O-Glycan 을 갖는다.
1.2. 목적 단백질: GLP-1-Fc 융합 단백질 (GLP-1-Fc)
IgD 힌지 (ESPKAQA SS VP T AQPQAEGSLAKA TT APA TT RNT; 서열번호 1)가 목적 폴리펩타이드 (GLP-1(Glucagon-like peptide-1)-Fc 융합단백질: GLP-1-Fc)와 융합된 융합 폴리펩타이드 Dulaglutide-ID (IgD 힌지 영역 1개 포함)와 Dulaglutide-ID2 (IgD 힌지 영역 2개 포함) (도 5 참조)를 제조하였다. GLP-1-Fc 융합단백질은 dimer로 존재한다. 암호화되는 아미노산 서열을 아래의 표 4에 정리하였다.
Figure PCTKR2019011409-appb-T000004
1.2.1. Dulaglutide-ID1
pcDNA3.1(+) (Invitrogen, Cat. No. V790-20)의 변형체인 GLP-1-Fc 를 발현하는 발현벡터 pGIg4(KR10-1868139B1 의 Promoter 를 포함하고 있음))를 Template 로 사용하고, 표 4 의 Primers IgG4mCH2_F 와 IgG4ID_R 를 이용하여 PCR 을 수행하여 659 bp 의 Modified IgG4 의 PCR Product (mIgG4)를 얻었다. 그리고 실시예 1.1.1 에서 제조된 pDHDD-D1G1 을 Template 로 사용하고, 표 4 의 Primers IgG4ID_F 와 ID_NotR 을 이용하여 PCR 을 수행하여 129 bp (ID1)와 231 bp (ID2)의 PCR Products 를 얻었다. 얻어진 659 bp 의 mIgG4 PCR Product 와 129 bp 의 ID1 PCR Product 를 정제 후 이 들을 Template 로 사용하고, 표 5 의 Primers IgG4mCH2_F 와 ID_NotR 을 이용하여 Overlapping PCR 을 수행하여 770 bp 의 PCR 산물 ('(N말단)-[Modified IgG4 Fc 일부 (BsrGI 제한 부위 포함)-IgD 힌지(IgDH1; 서열번호 1)-NotI 제한부위]-(C말단)'을 암호화하는 유전자)을 얻었다.
Figure PCTKR2019011409-appb-T000005
실시예 1.1.1 에서 제조된 pDHDD-D1G1 을 BamHI 과 NotI 으로 자른 7574 bp 의 vector 에 pGIg4 를 BamHI 과 BsrGI 으로 자른 607 bp 의 Insert I 과 위에서 Overlapping PCR 을 통해 얻어진 770 bp 의 PCR 산물을 BsrGI 과 NotI 으로 자른 403 bp 의 Insert II 를 Ligation 하여 목적 폴리펩타이드(GLP-1-Fc)와 면역글로불린(IgD)의 힌지 영역 1 개를 포함하는 융합 폴리펩타이드(총 309 aa (signal peptide 제외); O-Glycosylation 가능 부위 - 총 7 개, Dimer 로 존재하므로 최종적으로 14 개); 이하, 'Dulaglutide-ID1'라 칭함)의 제조를 위한 재조합 벡터 pGIg4D-D1G1 을 준비하였다.
1.2.2. Dulaglutide-ID2
실시예 1.2.1 에서 얻어진 659 bp 의 mIgG4 PCR 산물과 231 bp 의 ID2 PCR 산물을 Template 로 하고, 표 4 의 Primers IgG4mCH2_F 와 ID_NotR 을 이용하여 Overlapping PCR 을 수행하여 882 bp 의 PCR 산물 ('(N 말단)-[Modified IgG4 Fc 일부 (BsrGI 제한 부위 포함)- IgD 힌지(IgDH1; 서열번호 1)- IgD 힌지(IgDH1; 서열번호 1)-NotI 제한부위]-(C 말단)'을 암호화하는 유전자)을 얻었다.
실시예 1.1.1 에서 제조된 pDHDD-D1G1 을 BamHI과 NotI 으로 자른 7574 bp 의 vector 에 pGIg4 를 BamHI 과 BsrGI 으로 자른 607 bp의 Insert I 과 위에서 Overlapping PCR 을 통해 얻어진 882 bp 의 PCR 산물을 BsrGI 과 NotI 으로 자른 505 bp 의 Insert II 를 Ligation 하여 목적 폴리펩타이드(GLP-1-Fc)와 면역글로불린(IgD)의 힌지 영역 2 개를 포함하는 융합 폴리펩타이드(총 343 aa (signal peptide 제외); O-Glycosylation 가능 부위 - 총 14 개, Dimer 로 존재하므로 최종적으로 28 개); 이하, 'Dulaglutide-ID2'라 칭함)의 제조를 위한 재조합 벡터 pGIg4DD-D1G1 을 준비하였다.
상기 재조합 벡터 발현을 통하여 생산된 융합 폴리펩타이드 Dulaglutide-ID2 를 정제하고 IEF (Isoelectric focusing) 분석 및 Q-TOF Mass Spetrometry 를 이용하여 O-Glyan site Occupancy 를 분석하였다.
구체적으로, 물질의 Fc region 을 활용하여 Protein A affinity chromatography 를 통해 단백질을 분리 정제 한 후 음이온 교환 크로마토그래피 (Anion exchange chromatography)와 소수성 상호작용 크로마토그래피 (Hydrophobic interaction chromatography)를 순차적으로 수행하여 정제하였다.
배양액을 0.22um 의 여과막을 이용하여 여과하고, 평형 버퍼 (10mM Sodium phosphate, 150mM Sodium chloride, pH7.4 )로 평형화된 Protein A affinity resin 에 주입 후 평형버퍼로 세척하였다. 세척 후 용출 버퍼 (100mM Sodium citrate pH 3.5)로 단백질을 용출시키고 피크를 수집하였다.
수집된 용출액은 20mM Tris pH 8.0으로 버퍼 교환을 실시하였다.
버퍼교환이 완료된 시료는 음이온 교환 크로마토그래피(Source 15Q, GE Healthcare)에 주입하여 정제하였다.
사용된 평형 버퍼와 용출 버퍼는 각각 20mM Tris, pH 8.0, 20mM Tris, 0.5 M NaCl, pH 8.0 였다. 평형 버퍼와 용출버퍼를 각각 A 와 B channel 로 사용하여 농도구배조건으로 단백질을 용출시키고 피크를 수집하였다.
수집된 단백질은 용액은 소수성 상호작용 크로마토그래피(Butyl sepharose, GE Healthcare 를 이용하여 추가 정제하였다.
사용된 평형 버퍼와 용출 버퍼는 각각 0.1M Sodium phosphate pH 6.0, 1.8 ammonium sulfate, pH 8.0, 0.1M Sodium phosphate pH 6.0 였다. 평형 버퍼와 용출버퍼를 각각 A와 B channel 로 사용하여 농도구배조건으로 단백질을 용출시키고 피크를 수집하였다.
상기 수집된 피크를 IEF(Isoelectric focusing)로 분석하여 얻어진 Dulaglutide-ID2 의 이성질체 분포를 도 6에 나타내었다. 도 6 에서, Dulaglutide-ID2의 이론적 pI 값은 5.78 인데 Fraction #3 의 경우 이보다 낮은 것은 Dulaglutide-ID2 이 O-Glycosylation 이 되어 있고 이 O-Glycan 에 시알산에 붙어 더 acidic 해 진 것을 의미한다.
Dulaglutide-ID2 Fraction #3 를 Q-TOF Mass Spectrometry 로 분석한 결과 최대 26 개까지 ID 할 수 있었으며, 평균 O-Glycan 수는 17.5 개 이었다.
최종 정제된 단백질 용액은 Trulicity 와 동일한 부형제 성분 (Sodium citrate hydrate: 2.74 mg/mL, Anhydrous citric acid: 0.14 mg/mL, D-mannitol: 46.4 mg/mL, polysorbate 80: 0.20 mg/mL, pH 6.0-7.0)으로 버퍼 교환을 실시하고 농축하여 동물 PK 시험의 시험물질로 사용하였다.
실시예 2: 융합 폴리펩타이드의 약동학적 특성 (PK Profile) 시험 ( in vivo )
2-1. 목적 단백질: 인간 성장 호르몬 (hGH)
실시예 1.1 에서 준비된 융합 폴리펩타이드 IgD-hGH, IgD-hGH-His, IgA-hGH F3 (실시예 1.1.3 의 Fraction 3), IgA-hGH F4 (실시예 1.1.3 의 Fraction 4), 및 IgA-hGH F5 (실시예 1.1.3 의 Fraction 5)를 SD Rat (오리엔트바이오, 7 주령, 약300g; n=3)에 2mg/kg 의 양으로 피하 투여하여 Pharmacokinetics 를 시험하였다. Sampling 은 0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 시간에 하였고, 비교를 위하여, 상기와 동일한 방법으로 hGH (유트로핀, LG화학)을 2mg/kg 의 양으로 피하 투여하여 시험하였다.
상기와 같이 SD Rat에 투여한 후, Time-point별로 채취한 혈액을 원심분리하여 Serum을 얻고, Human Growth Hormone Quantikine ELISA Kit(R&D Systems)를 이용하여 ELISA를 수행하여, Time-point별 혈액 내의 hGH 및 융합폴리펩타이드(IgD-hGH, IgD-hGH-His, IgA-hGH FP3, IgA-hGH FP4 및 IgA-hGH FP5)의 농도를 확인하였다. 이 자료를 이용하여 PK 분석용 소프트웨어 (WinNonlin (Certara L.P.) 등)를 이용하여 AUC (area under the curve)를 포함한 Parameter들의 값을 구하였다.
2-1-1. hGH vs. IgD-hGH
hGH와 IgD-hGH의 PK 결과를 표 6 및 도 7에 나타내었다.
Figure PCTKR2019011409-appb-T000006
(Cmax: 최고혈중농도, Tmax: 최고혈중농도도달시간, AUCinf: 측정 가능한 마지막 채혈시점에서 무한대 시간까지 외삽하여 계산한 혈중 농도-시간 곡선하 면적, AUClast: 측정 가능 한 마지막 채혈시점까지의 혈중농도-시간 곡선하 면적, T1/2: 소실반감기, AUCExtp(%): [(AUCinf-AUClast)/AUCinf]*100)
표 6과 도 7에서 확인되는 바와 같이, 힌지 영역과 융합된 hGH(IgD-hGH)는 힌지 영역과 융합되지 않은 hGH와 비교하여, 반감기가 약 3.3배 증가한 것을 확인할 수 있다.
2-1-2. hGH vs. IgD-hGH-His
hGH와 IgD-hGH-His의 PK 결과를 표 7과 도 8 에 나타내었다.
Figure PCTKR2019011409-appb-T000007
(Cmax: 최고혈중농도, Tmax: 최고혈중농도도달시간, AUCinf: 측정 가능한 마지막 채혈시점에서 무한대 시간까지 외삽하여 계산한 혈중 농도-시간 곡선하 면적, AUClast: 측정 가능 한 마지막 채혈시점까지의 혈중농도-시간 곡선하 면적, T1/2: 소실반감기, AUCExtp(%): [(AUCinf-AUClast)/AUCinf]*100)
표 7과 도 8 에서 확인되는 바와 같이, His-Tag이 있는 힌지 영역과 융합된 hGH (IgD-hGH-His)는 힌지 영역과 융합되지 않은 hGH와 비교하여, 반감기가 약 2.6배 증가한 것을 확인할 수 있다.
2-1-3. IgA-hGH (O-Glycan 수에 따른 PK에의 영향)
O-glycan 수에 따른 PK에의 영향을 보기 위해 IgA-hGH fraction 별 PK 결과를 표 8과 도 9 에 나타내었다.
Figure PCTKR2019011409-appb-T000008
(Cmax: 최고혈중농도, Tmax: 최고혈중농도도달시간, AUCinf: 측정 가능한 마지막 채혈시점에서 무한대 시간까지 외삽하여 계산한 혈중 농도-시간 곡선하 면적, AUClast: 측정 가능 한 마지막 채혈시점까지의 혈중농도-시간 곡선하 면적, T1/2: 소실반감기, AUCExtp(%): [(AUCinf-AUClast)/AUCinf]*100)
표 8 과 도 9 에서 확인되는 바와 같이, O-glycan 수가 증가함에 따라 반감기가 증가함을 알 수 있다.
2-2. 목적 단백질: GLP-1-Fc 융합 단백질 (GLP-1-Fc, Dulaglutide)
실시예 1.2 에서 준비된 융합 폴리펩타이드 Dulaglutide-ID2 를 SD Rat (오리엔트바이오, 7 주령, 약 300g; n=3)에 0.1 mg/kg 의 양으로 피하 투여하여 Pharmacokinetics 를 시험하였다. Sampling 은 0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 96 그리고 144 시간에 하였고, 비교를 위하여, 상기와 동일한 방법으로 Dulaglutide (트루리시티, 한국릴리)을 0.1 mg/kg 의 양으로 피하 투여하여 시험하였다.
상기와 같이 SD Rat에 투여한 후, Time-point별로 채취한 혈액을 원심분리하여 Serum을 얻고, GLP-1 antibody (NovousBio)와 Anti-Human IgG4 Fc Antibody (Sigma-Aldrich)를 이용하여 ELISA를 수행하여, Time-point별 혈액 내의 Dulaglutide 및 융합폴리펩타이드 Dulaglutide-ID2의 농도를 확인하였다. 이 자료를 이용하여 PK 분석용 소프트웨어 (WinNonlin (Certara L.P.) 등)를 이용하여 AUC (area under the curve)를 포함한 Parameter들의 값을 구하였다.
상기 얻어진 결과를 표 9와 도 10 에 나타내었다.
Figure PCTKR2019011409-appb-T000009
(Cmax: 최고혈중농도, Tmax: 최고혈중농도도달시간, AUCinf: 측정 가능한 마지막 채혈시점에서 무한대 시간까지 외삽하여 계산한 혈중 농도-시간 곡선하 면적, AUClast: 측정 가능 한 마지막 채혈시점까지의 혈중농도-시간 곡선하 면적, T1/2: 소실반감기, AUCExtp(%): [(AUCinf-AUClast)/AUCinf]*100)
표 9와 도 10 에서 확인되는 바와 같이, 힌지 영역과 융합된 GLP-1-Fc (Dulaglutide-ID2)는 힌지 영역과 융합되지 않은 Dulaglutide와 비교하여, 반감기가 약 1.5배 증가한 것을 확인할 수 있다. 또한 Cmax는 약 1/5 수준이며, AUClast는 약 1/3 수준이었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (17)

  1. 목적 단백질, 및
    상기 목적 단백질의 N-말단, C-말단, 또는 양 말단 모두에 결합된, 총 1 내지 10개의 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역
    을 포함하고,
    상기 1 내지 10개의 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역은 각각 O-글리코실화 가능한 아미노산 잔기를 3 내지 10개 포함하는 폴리펩타이드인, 융합 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 하기의 식으로 표현되는, 융합 폴리펩타이드:
    Figure PCTKR2019011409-appb-I000014
    상기 식에서,
    N'은 융합 폴리펩타이드의 N-말단이고, C'는 융합 폴리펩타이드의 C-말단이며,
    Y는 목적 폴리펩타이드이고,
    Z는 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역이며,
    n 은 목적 폴리펩타이드의 N-말단에 결합된 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역의 개수로서, 0 내지 10 의 정수이고,
    m 은 목적 폴리펩타이드의 C-말단에 결합된 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역의 개수로서, 0 내지 10 의 정수이며,
    n 과 m 은 동시에 0 이 아니고,
    n+m 은 융합 폴리펩타이드에 포함된 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역의 총 개수로서, 1 내지 10 의 정수임.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 1 내지 10개의 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역은 1 내지 10개의 면역글로불린의 힌지 영역 또는 서열번호 23 내지 113의 단백질 중에서 O-글리코실화 가능한 아미노산 잔기를 3 내지 10개 포함하는 연속하는 10개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드 영역인, 융합 폴리펩타이드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 1 내지 10개의 면역글로불린의 힌지 영역은 각각 독립적으로 면역글로불린 D (Immunoglobulin D; IgD)의 힌지 영역 및 면역글로불린 A (Immunoglobulin A; IgA)의 힌지 영역으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 융합 폴리펩타이드.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 1 내지 10개의 면역글로불린의 힌지 영역은 각각 독립적으로 다음으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 융합 폴리펩타이드:
    (1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드,
    (2) 서열번호 1의 아미노산 서열 중 O-글리코실화 잔기를 3개 내지 7개 포함하는 연속하는 5개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드,
    (3) IgD 중 상기 (1) 또는 (2)의 폴리펩타이드를 포함하는 연속하는 34개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드,
    (4) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드,
    (5) 서열번호 2의 아미노산 서열 중 O-글리코실화 잔기를 3개 내지 8개 포함하는 연속하는 8개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드, 및
    (6) IgA 중 상기 (4) 또는 (5)의 폴리펩타이드를 포함하는 연속하는 19개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드.
  6. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 1 내지 10개의 면역글로불린의 힌지 영역은 각각 독립적으로 다음으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 융합 폴리펩타이드:
    (1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드,
    (2) 서열번호 1의 아미노산 서열 중 서열번호 9를 포함하는 연속하는 5개 이상의 아미노산 또는 서열번호 10을 포함하는 연속하는 7개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드,
    (3) IgD 중 상기 (1) 또는 (2)의 폴리펩타이드를 포함하는 연속하는 34개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드,
    (4) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드,
    (5) 서열번호 2의 아미노산 서열 중 서열번호 12를 포함하는 연속하는 8개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드, 및
    (6) IgA 중 상기 (4) 또는 (5)의 폴리펩타이드를 포함하는 연속하는 19개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드 내의 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역과 결합된 목적 폴리펩타이드는, O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역과 결합되지 않은 목적 폴리펩타이드와 비교하여, 체내 반감기가 1.5배 이상 증가한 것인, 융합 폴리펩타이드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자.
  9. 제8항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  10. 제9항의 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포.
  11. 제10항의 재조합 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 목적 폴리펩타이드 및 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역을 포함하는, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드의 제조 방법.
  12. 생체 외에서, 총 1 내지 10개의 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역을 목적 폴리펩타이드의 N 말단, C 말단, 또는 양 말단 모두에 연결시키는 단계를 포함하고,
    상기 1 내지 10개의 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역은 각각 O-글리코실화 가능한 아미노산 잔기를 3 내지 10개 포함하는 폴리펩타이드인,
    목적 폴리펩타이드의 체내 안정성 증진 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 1 내지 10개의 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역은 1 내지 10개의 면역글로불린의 힌지 영역 또는 서열번호 23 내지 113의 단백질 중에서 O-글리코실화 잔기를 3 내지 10개 포함하는 연속하는 10개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드 영역인, 목적 폴리펩타이드의 체내 안정성 증진 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 1 내지 10개의 면역글로불린의 힌지 영역은 각각 독립적으로 면역글로불린 D (Immunoglobulin D; IgD)의 힌지 영역 및 면역글로불린 A (Immunoglobulin A; IgA)의 힌지 영역으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 목적 폴리펩타이드의 체내 안정성 증진 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 1 내지 10개의 면역글로불린의 힌지 영역은 각각 독립적으로 다음으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 목적 폴리펩타이드의 체내 안정성 증진 방법:
    (1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드,
    (2) 서열번호 1의 아미노산 서열 중 O-글리코실화 잔기를 3개 내지 7개 포함하는 연속하는 5개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드,
    (3) IgD 중 상기 (1) 또는 (2)의 폴리펩타이드를 포함하는 연속하는 34개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드,
    (4) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드,
    (5) 서열번호 2의 아미노산 서열 중 O-글리코실화 잔기를 3개 내지 8개 포함하는 연속하는 8개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드, 및
    (6) IgA 중 상기 (4) 또는 (5)의 폴리펩타이드를 포함하는 연속하는 19개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드.
  16. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 1 내지 10개의 면역글로불린의 힌지 영역은 각각 독립적으로 다음으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 목적 폴리펩타이드의 체내 안정성 증진 방법:
    (1) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드,
    (2) 서열번호 1의 아미노산 서열 중 서열번호 9를 포함하는 연속하는 5개 이상의 아미노산 또는 서열번호 10을 포함하는 연속하는 7개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드,
    (3) IgD 중 상기 (1) 또는 (2)의 폴리펩타이드를 포함하는 연속하는 34개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드,
    (4) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드,
    (5) 서열번호 2의 아미노산 서열 중 서열번호 12를 포함하는 연속하는 8개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드, 및
    (6) IgA 중 상기 (4) 또는 (5)의 폴리펩타이드를 포함하는 연속하는 19개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드.
  17. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드를 포함하는, 목적 폴리펩타이드 결핍 또는 기능 이상과 관련된 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
PCT/KR2019/011409 2018-09-05 2019-09-04 O-글리코실화 가능한 폴리펩타이드 영역을 포함하는 융합 폴리펩타이드 WO2020050626A1 (ko)

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