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WO2019122267A1 - Zusammensetzung zur behandlung eines an einer mit chronischen entzündungen einhergehenden atemwegserkrankung leidenden patienten sowie herstellungsverfahren und verwendung der zusammensetzung - Google Patents

Zusammensetzung zur behandlung eines an einer mit chronischen entzündungen einhergehenden atemwegserkrankung leidenden patienten sowie herstellungsverfahren und verwendung der zusammensetzung Download PDF

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WO2019122267A1
WO2019122267A1 PCT/EP2018/086438 EP2018086438W WO2019122267A1 WO 2019122267 A1 WO2019122267 A1 WO 2019122267A1 EP 2018086438 W EP2018086438 W EP 2018086438W WO 2019122267 A1 WO2019122267 A1 WO 2019122267A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
composition
dnazyme
solution
concentration
Prior art date
Application number
PCT/EP2018/086438
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English (en)
French (fr)
Inventor
Jonas Renz
Original Assignee
Sterna Biologicals Gmbh & Co. Kg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sterna Biologicals Gmbh & Co. Kg filed Critical Sterna Biologicals Gmbh & Co. Kg
Priority to CA3086718A priority Critical patent/CA3086718A1/en
Priority to JP2020554591A priority patent/JP2021507942A/ja
Priority to RU2020119597A priority patent/RU2020119597A/ru
Priority to US16/955,806 priority patent/US20210161939A1/en
Priority to BR112020012668A priority patent/BR112020012668A8/pt
Priority to CN201880083222.0A priority patent/CN111683718A/zh
Priority to KR1020207020797A priority patent/KR20200103739A/ko
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    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/35—Special therapeutic applications based on a specific dosage / administration regimen

Definitions

  • compositions for treating a patient suffering from a respiratory disease associated with chronic inflammatory disease and method of making and using the composition
  • the invention relates to a composition for the treatment of a patient suffering from a chronic respiratory disease associated with respiratory disease according to claim 1, a method for producing the composition according to claim 10 and the use of such a composition according to claim 12.
  • Chronic inflammation is of increasing importance in medicine. Accordingly, it is important to find therapies for diseases such as respiratory diseases, which are associated with chronic inflammation.
  • respiratory diseases are for example allergic immediate type reactions, asthma or chronic obstructive pulmonary diseases (COPD).
  • COPD chronic obstructive pulmonary diseases
  • Th 1 cell-specific transcription factor Tbet induces the specific development of Th 1 cells;
  • GATA-3 induces the specific development of Th2 cells.
  • the balance between Th1 and Th2 cells is thus shifted by the expression of GATA-3 or by the inhibition of Tbet in favor of Th2 cells.
  • the inhibition of GATA-3 and the expression of Tbet cause an increasing Th1 cell level.
  • DNAzymes represent a relatively new class of antisense molecules.
  • sense molecules refers to molecules that are capable of specific and substantially complementary to bind single-stranded nucleic acids (usually mRNA).
  • mRNA single-stranded nucleic acids
  • a special feature of DNAzymes is that they also have a catalytic function in addition to this binding function. They are thus able to specifically cleave and thus degrade single-stranded target DNA or RNA (Sei et al., 2008). In this case, one also speaks of post-transcriptional inhibition, because the inhibition of gene expression takes place at the mRNA level, ie even before the translation of the mRNA into a protein can follow
  • DNAzymes of the 10-23 model are used (Sontoro et al., 1997). Such DNAzymes have a catalytic domain of 15 nucleotides flanked by two substrate binding domains.
  • the catalytic domain may in particular comprise the conserved sequence ggctagctacaacga (SEQ ID No. 154).
  • the specified sequence ggctagctacaacga is merely a preferred embodiment.
  • DNAzymes of the 10-23 modified catalytic domain model may have comparable biological activity.
  • the length of the substrate binding domains is variable, whereby two corresponding substrate binding domains may differ from one another.
  • the length of the Substrate binding domains between 6 and 14 nucleotides, with a length of 9 nucleotides being particularly preferred.
  • Such DNAzymes have a specific sequence such as nnnnnnnnggctagctacaacgannnnnnnn.
  • the substrate binding domains are completely complementary to the regions flanking the intended cleavage site of the target mRNA - however, to bind and cleave the target RNA, the DNAzyme need not necessarily be completely complementary.
  • DNAzymes of the 10-23 type cleave the target mRNA to purine-pyrimidine sequence sequences.
  • DNAzymes are known as well as their use for the specific inhibition of the expression of GATA-3 or Tbet.
  • WO 2005/033314 A2 describes the mode of action of various DNAzymes.
  • the disclosure of WO 2005/033314 is considered to be the technological background of the present invention.
  • nucleic acids tend to rapidly degrade, for example, by enzymatic degradation or physical stress - this is especially true for single-stranded nucleic acids, which include DNAzyme.
  • an active substance for therapeutic purposes is followed by the question of the applicability of the active substance.
  • a locally targeted application is needed, you want to fight the inflammatory focus efficiently or reach the target cells targeted.
  • an active agent is most effective if it can be ingested via the lungs.
  • Inhalation allows patients to take agents into the lungs or through the target cells in the lungs, allowing the agent to be site-specific or to be rapidly absorbed into the bloodstream via the alveoli. This method can reduce the risks of side effects in the rest of the body. In addition, a lower dose is necessary because a much larger dose proportion reaches the site of action than by non-specific application.
  • Inflammatory diseases are limited mainly to drugs that have a strong immunosuppressive effect. Examples of such agents are
  • Corticosteroids mesalazine (5-aminosalicylic acid), ciclosporin, tacrolimus or TNHa antibodies. None of the above-mentioned therapeutic options is suitable for targeted use. Rather, the substances used for their strong immunosuppressive effect are known. In addition, the substances are associated with common side effects such as immunosuppression, hepatotoxicity, myocardial hypertrophic gastrointestinal disorders, fatigue and dizziness, diarrhea, vomiting, nephrotoxicity, neurotoxicity, tremor, hypertension, insomnia, depression, convulsions, masking of infections , Hyperkalemia, hyperglycemia, increased risk of tumors - just to name a few.
  • the invention is therefore based on the object of providing a DNAzyme-containing composition for the treatment of a patient suffering from a chronic inflammatory disease associated with respiratory disease, which is suitable for targeted application.
  • the composition should be able to be absorbed via the lungs of the patient to be treated, which is why it should be easy to nebulize.
  • the drug should minimize the risk of side effects.
  • compositions for the treatment of a patient suffering from a respiratory disease associated with chronic inflammation comprising at least one DNAzyme which specifically down-regulates the expression of GATA-3 and / or comprises at least one DNAzyme containing the Expression of Tbet downregulated specifically.
  • the composition is characterized in that the DNAzyme is present in the composition in a concentration which is lower than 75 mg / ml.
  • the composition can be applied as an aerosol, which is absorbed via the lungs.
  • the composition may be a liquid or a solution, alternatively a powder. It is known to the person skilled in the art that a downregulation of an expression can be understood to mean both partial and complete inhibition of the expression.
  • expression is significantly reduced compared to the natural level of expression.
  • the specific DNAzymes bind and cleave in vivo the mRNA of the transcription factors GATA-3 and / or Tbet, whose proteins represent key key molecules for the development of Th1- or Th2-dependent chronic inflammatory diseases. Due to this cleavage of the mRNA, the mRNAs can no longer be translated into functional proteins. Consequently, the level of GATA-3 and Tbet protein is significantly minimized.
  • composition of the invention having a DNAzyme concentration lower than 75 mg / ml, is ideally suited for the treatment of patients suffering from respiratory disease associated with chronic inflammation. This is mainly because compositions with DNAzyme concentrations exceeding 75 mg / ml are associated with drug loss. The reason for this is that such highly concentrated compositions can no longer readily be atomized due to their increased viscosity (for example via an inhalation device). Hand inhalers customary in medicine generally work with an atomization pressure of 40 bar to 45 bar. For such an inhaler, the surface tension of a solution having a DNAzyme concentration of over 75 mg / ml is too high to be still atomizable.
  • compositions with a DNAzyme concentration of 75 mg / ml show a drug loss of about 6% when administered by means of an inhaler.
  • compositions with a DNAzyme concentration of 20 mg / ml to 50 mg / ml have an optimal effect effect when treated with an inhaler, because compositions with such concentrations can easily be sprayed.
  • a composition is preferred according to the invention, which has a DNAzyme concentration of 20 mg / ml to 50 mg / ml.
  • the composition according to the invention can be present in particular as an inhalation solution which can be administered as an aerosol into the lungs of a patient, which is of particular advantage in the treatment of respiratory diseases, which are triggered by allergic inflammatory reactions.
  • the active ingredients DNAzymes
  • the composition according to the invention in aerosol form Place the inflammation to be applied.
  • the composition is a liquid or a solution.
  • the composition may be a powder.
  • the feature according to the invention is of great advantage in particular when using DNAzymes.
  • concentrations are usually possible which far exceed 75 mg / ml, without significantly increasing the viscosity of the solution.
  • smaller DNA molecules ⁇ 1,000 bp
  • DNAzyme can be present in concentrations of more than 100 mg / ml, without the solutions becoming particularly viscous.
  • DNAzymes In DNAzymes, however, the surprising effect that DNAzyme-containing solutions become disproportionately viscous even at concentrations of at least 75 mg / ml. At concentrations above 75 mg / ml, they even fail. The reason for this is above all the three-dimensional structure of the DNAzyme, which is characterized by the formation of a "loops" or a "loop". Due to this particular structure, DNAzymes, promoted by their single-strandedness, can form a kind of polymer structure and easily clump together, which in turn results in an overall poor solubility of high amounts of DNAzyme.
  • the composition according to the invention is of great advantage because it is not too viscous due to a DNAzyme concentration of less than 75 mg / ml and therefore easily administered as an aerosol leaves.
  • the composition has a DNAzyme concentration of 20 mg / ml to 50 mg / ml.
  • a DNAzyme concentration of 20 mg / ml to 50 mg / ml ensures that even when using handheld inhalers or similar inhalers sufficient amounts of active ingredient can be absorbed by the patient.
  • DNAzyme concentrations below 20 mg / ml there is a risk that the quantities of active substance delivered by a single triggering or actuation of an inhaler will not be sufficient to achieve the desired treatment result - it will be simple per triggering of the inhaler too few active ingredients delivered. Consequently, patients must operate the inhaler several times, which on the one hand represents a possible burden for the patients to be treated and on the other hand ensures a higher wear of the inhalers. Due to a high concentration of active ingredients several applications per inhaler are possible.
  • composition according to the invention thus ensures an ideal compromise, especially in this preferred embodiment: on the one hand, the DNAzyme concentration of less than 50 mg / ml is still low enough to be atomized by an inhalation device, on the other hand the DNAzyme concentration is more as high as 20 mg / ml sufficiently high that, for example, when using handheld inhalers sufficient drug levels can be delivered after a few operations.
  • the composition has a viscosity which is lower than 3.5 mPa ⁇ s.
  • a viscosity has the consequence that the composition can be applied without problems and without significant loss of active ingredient as an aerosol, for example as inhalation solution of an inhaler.
  • a higher viscosity has the consequence that the pressure which must be used to atomize the composition is too high to be exerted by a conventional inhaler.
  • a composition with a viscosity of over 3.5 mPa.s may cause the nebulizers of the inhalers, which are usually used to treat corresponding patients, clogging or smearing after a short time. It is therefore advantageous that the viscosity of the composition is in a range which ensures the highest possible concentration of active ingredient (DNAzyme) at relatively low viscosity.
  • DNAzymes of the earlier application DE 103 46 487 are mentioned as DNAzymes and included in this application. These DNAzymes are directed against the mRNA of GATA-3 and T-bet proteins and disclosed for the production of an anti-inflammatory agent.
  • DNAzymes are used (each alone or in combination with the others): Name of the DNAzyme against GATA-3 mRNA sequence:
  • the DNAzyme is selected from a group comprising the DNAzyme hgd1 to hgd70 (cf., also Table 2) and / or from a group comprising the DNAzyme td1 to td78 (see Table 2).
  • DNAzymes with either of these sequences are found to be particularly efficient for specific in vivo inhibition of the expression of the pro-inflammatory transcription factors GATA-3 and Tbet, respectively.
  • the sequences are preferred, the substrate binding domains are fully complementary to the flanking regions of the cleavage site of a particular target mRNA.
  • a DNAzyme need not be fully complementary to bind and cleave a target mRNA - smaller complementary sequences may be required within the overall homologous substrate binding domain.
  • composition which has the DNAzyme hgd40 GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG (SEQ ID No. 40) for downregulation of the expression of the transcription factor GATA-3.
  • This sequence shows a particularly high enzyme activity and cleaves GATA-3 mRNA with a high specificity and with high efficiency. Consequently, a DNAzyme with the sequence hgd40 (SEQ ID No. 40) is excellently suitable for the targeted and effective treatment of respiratory diseases which are Th2-dependent, that is to say corresponding to an elevated GATA-3 level.
  • the composition may have at least one nuclease inhibitor, wherein the at least one nuclease inhibitor in particular specifically inactivates deoxyribonucleases, ie a DNase inhibitor.
  • the at least one DNAzyme is protected from enzymatic degradation which can be caused by DNases.
  • composition comprises at least one salt and / or at least one cation.
  • Such a composition is advantageously suitable for use in the therapy of patients suffering from a respiratory disease associated with chronic inflammation, because the composition thereby has a physiologically favorable environment and is thus easily tolerated by patients.
  • a phosphate buffered saline solution PBS
  • the inorganic and / or organic additive is preferably selected from the group comprising the substances sodium chloride (NaCl), potassium chloride (KCl), disodium hydrogen phosphate (Na 2 HPO 4 ), disodium hydrogen phosphate dihydrate, potassium dihydrogen phosphate (KH 2 PO 4 ), TRIS and EDTA.
  • the cation may be selected from the group consisting of Na, Mg, K, Li, Ca, Fe, Cu and Ag.
  • an organic cation may be provided, such as Mg (N (S0 2 CF 3) 2) 2 or Mg (0S0 2 CF 3). 2
  • a bivalent cation can be provided.
  • Such a buffered composition is particularly suitable for the protection of the DNAzyme, because the DNAzyme is stabilized by the inorganic and / or organic additive and protected from enzymatic degradation.
  • the salt allows a good uptake into the target cells.
  • the bivalent cations as cofactors of DNAzymes, can increase DNAzyme activity since the DNAzymes have a catalytic domain dependent on bivalent cations (preferably Mg 2+). Thus, bivalent cations act as enhancers or enhancers.
  • the composition may comprise at least one inorganic and / or organic additive and / or a solubilizer and / or a preservative.
  • the solubilizer mainly serves to form the complex. In addition, it improves the solvent properties of the composition.
  • the solubilizers may preferably be glycerol derivatives and / or polyethylene glycols or else lecithins.
  • the preservative may be, for example, paraben.
  • additives may be provided which cause, for example, a change in the surface tension of the composition or a decrease in the viscosity of the composition.
  • An additional aspect of this invention is the process for preparing the composition according to the invention, wherein it is provided that the process comprises at least the following steps:
  • step b) filtering the solution from step a) until the solution has a DNAzyme concentration of less than 75 mg / ml;
  • the filtration step is advantageous because it removes unwanted (non-sterile) substances as well as undissolved active substance particles (ie undissolved DNAzymes).
  • the composition must be sterile for the treatment of a patient suffering from a chronic inflammatory respiratory disease.
  • Other sterilization methods radiation, heating, autoclaving, etc.
  • the solution is sterilized by filtration.
  • a filter is preferably used, the PES membrane having a pore diameter of 0.20 to 0.25 pm. Particularly preferred is a PES membrane, with a pore diameter of 0.22 pm.
  • the method comprises at least one further method step, namely selected from one of the following steps:
  • Such a method conveniently provides for the preparation of a composition that can be used to treat a patient suffering from a respiratory disease associated with chronic inflammation. By selecting the steps, the process can be individually adapted to specific needs.
  • a further aspect of the invention is the use of the above-mentioned composition as a medicament for the treatment of a patient suffering from a respiratory disease associated with chronic inflammatory diseases.
  • the composition can be present in particular as an inhalation solution.
  • other forms are also conceivable, such as a powder for use in powder inhalers.
  • the composition can be applied in the form of an aerosol.
  • an applied composition may be site-specific in the lung of a patient suffering from a respiratory disease associated with chronic inflammatory disease. This can increase the effectiveness of the drug. At the same time, the risk of side effects is minimized.
  • Table 1 is a list of GATA-3 specific DNAzymes
  • Table 2 is a list of Tbet-specific DNAzymes
  • Table 3 shows an example of a composition according to the invention
  • Table 4 possible additional components of the composition from Table 3;
  • Figure 1 is a graphical representation of the viscosity of a DNAzyme-containing composition depending on their concentration;
  • FIG. 2 Viscosity measurement results of a DNAzyme-containing composition as a function of its concentration;
  • FIG. 3 Measurement results of a FAT of compositions with different
  • FIG. 4 shows measurement results of a FAT of the composition according to the invention
  • DNAzyme concentrations of 20 mg / ml and 50 mg / ml, respectively.
  • FIG. 1 shows a graphic representation of the viscosity of a DNAzyme-containing composition as a function of its concentration.
  • the DNAzyme can specifically downregulate the expression of GATA-3 and / or specifically down-regulate the expression of Tbet.
  • DNAzymes from a group comprising the DNAzymes hgd1 to hgd70 or from a group comprising the DNAzymes td 1 to td78 are provided.
  • the DNAzyme hgd40 (SEQ ID No. 40) is to be used which has the sequence GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG and which specifically inhibits the expression of GATA-3.
  • the graph of Figure 1 shows the viscosity of a hgd40-containing composition.
  • the viscosity of the composition in mPa-s is plotted, the X-axis indicates the DNAzyme concentration of the composition. From the illustration it can be seen that the viscosity of the composition increases substantially exponentially. In this case, especially from a concentration of 50 mg / ml and higher, a strong increase in viscosity can be observed. Even at a concentration of about 75 mg / ml, a viscosity of 3.5 mPa-s is recorded.
  • FIG. 2 shows viscosity measurement results of a DNAzyme-containing composition as a function of its concentration. They illustrate the same relationship of concentration and viscosity as the graph of Figure 2.
  • the viscosity increases at a DNAzyme concentration between 50 mg / ml and 100 mg / ml exponentially. This correlation is usually not so pronounced for other DNA molecules;
  • the viscosity of a DNA-containing solution increases substantially linearly with increasing DNA concentration.
  • FIG. 3 shows measurement results of a FAT of compositions with different DNAzyme concentrations in tabular form.
  • a FAT Fractory Acceptance Test
  • the table proves that a DNAzyme concentration of more than 75 mg / ml in the composition according to the invention can no longer be atomized by the inhalation devices from the test (second result line of the table from FIG. 3). If a composition with a DNAzyme concentration of 75 mg / ml is filtered sterile prior to the test run, the concentration is lowered to less than 75 mg / ml.
  • a composition having such a DNAzyme concentration can be atomized with the atomizers used in the test, as can be seen from the fourth and fifth result lines of the table of FIG.
  • the FAT indicates the viscosity in dP / ml. This should be less than 5% to pass the FAT conducted here.
  • the abbreviation "WFI" in the first and third line stands for "Water for Injection” and is to be understood as a control - correspondingly corresponds to the "WFI" controls with a viscosity of 1 dP / ml.
  • FIG. 4 shows measurement results of a FAT of the composition according to the invention with DNAzyme concentrations of 20 mg / ml and 50 mg / ml, respectively.
  • the results show that such compositions pass the FAT (status FAT test) and can be atomized by means of common inhalation devices ("passed" in the result lines).
  • composition of the invention with a DNAzyme concentrations of below 75 mg / ml is ideally suited for the treatment of a patient suffering from a chronic respiratory disease associated respiratory disease, because such a composition can be atomized and thus used as an aerosol.
  • DNAzyme concentrations of 20 mg / ml to 50 mg / ml are used.
  • the invention relates to a composition for the treatment of a patient suffering from a respiratory disease associated with chronic inflammation, the composition comprising at least one DNAzyme which specifically down-regulates the expression of GATA-3 and / or comprises at least one DNAzyme, which specifically downregulates the expression of Tbet.
  • the composition is characterized in that the concentration of the DNAzyme in the composition is lower than 75 mg / ml, wherein the concentration of the DNAzyme in the composition is preferably between 20 mg / ml and 50 mg / ml.
  • the invention also relates to a method for producing the composition according to the invention which comprises at least one DNAzyme which specifically down-regulates the expression of GATA-3 and / or comprises at least one DNAzyme which specifically down-regulates the expression of Tbet.
  • concentration of the DNAzyme in the composition will be less than 75 mg / ml, preferably less than 3.5 mPa ⁇ s.
  • composition is directed to a medicament used to treat a patient suffering from a respiratory disease associated with chronic inflammatory disease.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Behandlung eines Patienten, der an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Atemwegserkrankung leidet, wobei die Zusammensetzung mindestens ein DNAzym umfasst, das die Expression von GATA-3 spezifisch herunterreguliert und/oder mindestens ein DNAzym umfasst, das die Expression von Tbet spezifisch herunterreguliert. Die Zusammensetzung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des DNAzyms in der Zusammensetzung niedriger als 75 mg/ml ist. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung sowie eine Verwendung der Zusammensetzung Arzneimittel zur Behandlung eines an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Atemwegserkrankung leidenden Patienten.

Description

Zusammensetzung zur Behandlung eines an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Atemwegserkrankung leidenden Patienten sowie Herstellungsverfahren und Verwendung der Zusammensetzung
Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Behandlung eines an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Atemwegserkrankung leidenden Patienten nach Anspruch 1 , ein Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung nach Anspruch 10 sowie die Verwendung einer solchen Zusammensetzung nach Anspruch 12.
Falls nicht anders angegeben, werden die Begriffe„Expression“ und„Genexpression“ im Folgenden synonym verwendet.
Chronische Entzündungen sind in der Medizin von zunehmender Bedeutung. Entsprechend wichtig ist es, Therapien für Erkrankungen wie zum Beispiel Erkrankungen der Atemwege zu finden, die mit chronischen Entzündungen einhergehen. Solche Atemwegserkrankungen sind zum Beispiel allergische Soforttypreaktionen, Asthma oder chronisch-obstruktive Lungenerkrankungen (COPD).
An der Entstehung von chronischen Entzündungsreaktionen sowie von (oftmals auch entzündungsabhängigen) Autoimmunerkrankungen sind unter anderem zwei Transkriptionsfaktoren beteiligt: der Th 1 -zellspezifische Transkriptionsfaktor Tbet und der Th2-zellspezifische Transkriptionsfaktor GATA-3. Dabei induziert Tbet die spezifische Entwicklung von Th 1 -Zellen; GATA-3 induziert hingegen die spezifische Entwicklung von Th2-Zellen. Die Balance zwischen Th1- und Th2-Zellen wird also durch die Expression von GATA-3 bzw. durch die Inhibition von Tbet zugunsten der Th2-Zellen verschoben. Analog sorgen die Inhibition von GATA-3 bzw. die Expression von Tbet für ein steigendes Th1-Zellen-Niveau. Zu dem speziellen Gleichgewicht zwischen GATA-3 und Tbet bzw. zwischen Th1- und Th2-Zellen sind zahlreiche wissenschaftliche Publikationen erschienen.
Folglich sind in den letzten Jahren Versuche unternommen worden, die Transkriptionsfaktoren GATA-3 und Tbet spezifisch zu hemmen bzw.„auszuschalten“. Eine Möglichkeit, das zu bewerkstelligen, stellt die Inhibition der Genexpression dieser beiden Transkriptionsfaktoren dar, wozu die moderne Gentechnologie diverse „Werkzeuge“ zur Verfügung stellt. Eines dieser Werkzeuge sind DNAzyme.
DNAzyme repräsentieren eine verhältnismäßig neue Klasse von antisense- Molekülen. Als anf/'sense-Moleküle werden Moleküle bezeichnet, die fähig sind, einzelsträngige Nukleinsäuren (i.d.R. mRNA) spezifisch und im Wesentlichen komplementär zu binden. Eine Besonderheit von DNAzymen ist dabei, dass sie neben dieser Bindefunktion auch eine katalytische Funktion aufweisen. Sie sind also in der Lage, spezifisch einzelsträngige Ziel-DNA oder -RNA zu spalten und somit abzubauen (Sei et al. 2008). Man spricht in diesem Fall auch von posttranskriptioneller Inhibition, weil die Inhibition der Genexpression auf mRNA-Ebene stattfindet, also noch bevor sich die Translation der mRNA zu einem Protein anschließen kann
Üblicherweise werden dazu DNAzyme des 10-23-Modells verwendet (Sontoro et al., 1997). Derartige DNAzyme besitzen eine katalytische Domäne von 15 Nukleotiden, welche von zwei Substratbindungsdomänen flankiert wird. Die katalytische Domäne kann dabei insbesondere die konservierte Sequenz ggctagctacaacga umfassen (SEQ ID No. 154). Die angegebene Sequenz ggctagctacaacga ist lediglich eine bevorzugte Ausführungsform. Dem Fachmann ist bekannt, dass DNAzyme des 10-23-Modells mit abgewandelter katalytischer Domäne eine vergleichbare biologische Aktivität besitzen können. Die Länge der Substratbindungsdomänen ist hingegen variabel, wobei sich auch zwei korrespondierende Substratbindungsdomänen voneinander unterscheiden können. In einer bevorzugten Ausführung, beträgt die Länge der Substratbindungsdomänen zwischen 6 und 14 Nukleotide, wobei eine Länge von 9 Nukleotiden besonders bevorzugt wird. Solche DNAzyme weisen eine spezifische Sequenz wie zum Beispiel nnnnnnnnnggctagctacaacgannnnnnnnn auf. In der Regel sind die Substratbindungsdomänen vollständig komplementär zu den Regionen, die die vorgesehene Spaltstelle der Ziel-mRNA flankieren - um die Ziel-RNA zu binden und zu spalten, muss das DNAzym jedoch nicht unbedingt vollständig komplementär sein. DNAzyme des 10-23 Typs spalten die Ziel-mRNA an Purin-Pyrimidin Abfolge- Sequenzen.
DNAzyme sind ebenso bekannt wie ihre Verwendung zur spezifischen Inhibition der Expression von GATA-3 bzw. Tbet. So wird zum Beispiel in der WO 2005/033314 A2 die Wirkweise verschiedener DNAzyme beschrieben. Der Offenbarungsgehalt der WO 2005/033314 wird als technologischer Hintergrund der vorliegenden Erfindung angesehen.
Probleme, die bei der Verwendung von DNAzymen als Wirkstoff auftreten können, sind oftmals auf die verhältnismäßig hohe Instabilität und die Sensibilität von Nukleinsäuren zurückzuführen. Sofern sie nicht in physiologisch günstigen Lösungen vorliegen, neigen Nukleinsäuren zur schnellen Degradierung, etwa durch enzymatischen Abbau oder physikalischen Stress - dies gilt insbesondere für einzelsträngige Nukleinsäuren, zu denen auch DNAzyme zählen.
Darüber hinaus schließt sich bei jeder Verwendung eines Wirkstoffs zu Therapiezwecken die Frage nach der Applizierbarkeit des Wirkstoffs an. So ist vor allem im Bereich der Atemwegserkrankungen, die mit Entzündungen einhergehen, eine örtlich gezielte Applikation nötig, möchte man den Entzündungsherd effizient bekämpfen bzw. die Zielzellen gezielt erreichen. Dementsprechend ist etwa im Falle von allergischen Soforttypreaktionen, Asthma, oder COPD ein Wirkstoff dann am effektivsten, wenn er über die Lunge aufgenommen werden kann.
Eine Möglichkeit, Atemwegserkrankungen gezielt zu bekämpfen, ist zum Beispiel die Inhalation. Über die Inhalation können Patienten Wirkstoffe in die Lunge bzw. über die Zielzellen in der Lunge aufnehmen, wodurch der Wirkstoff ortsspezifisch wirken oder rasch über die Alveolen in den Blutkreislauf aufgenommen werden kann. Diese Methode kann die Risiken für Nebenwirkungen im restlichen Organismus verringern. Zusätzlich ist eine geringere Dosis notwendig, weil ein wesentlich größerer Dosisanteil den Wirkungsort erreicht als durch unspezifische Applikation.
In der Praxis übliche Behandlungsstrategien von Patienten mit
Entzündungserkrankungen beschränken sich vor allem auf Wirkstoffe, die eine stark immunsuppressive Wirkung besitzen. Beispiele für solche Wirkstoffe sind
Corticosteroide, Mesalazin (5-Aminosalicylsäure), Ciclosporin, Tacrolimus oder TNHa- Antikörper. Dabei eignet sich keiner der vorbenannten Therapiewege dazu, gezielt eingesetzt zu werden. Vielmehr sind die eingesetzten Substanzen für ihre stark immunsuppressive Wirkung bekannt. Darüber hinaus stehen die Stoffe mit häufig auftretenden Nebenwirkungen in Verbindung, wie zum Beispiel Immunsuppression, Hepatotoxizität, Myokard hypertroph ie gastrointestinale Beschwerden, Müdigkeit und Schwindel, Diarrhö, Erbrechen, Nephrotoxizität, Neurotoxizität, Tremor, Hypertonie, Insomnie, Depressionen, Krämpfe, Maskierung von Infektionen, Hyperkaliämie, Hyperglykämie, erhöhtes Tumorrisiko - um nur einige zu nennen.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine DNAzym-haltige Zusammensetzung zur Behandlung eines an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Atemwegserkrankung leidenden Patienten bereitzustellen, die sich zur gezielten Applikation eignet. Insbesondere soll die Zusammensetzung über die Lunge des zu behandelnden Patienten aufgenommen werden können, weshalb sie leicht zu zerstäuben sein sollte. Darüber hinaus soll der Wirkstoff das Risiko von Nebenwirkungen geringhalten.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Zusammensetzung zur Behandlung eines Patienten gelöst, der an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Atemwegserkrankung leidet, wobei die Zusammensetzung mindestens ein DNAzym umfasst, das die Expression von GATA-3 spezifisch herunterreguliert und/oder mindestens ein DNAzym umfasst, das die Expression von Tbet spezifisch herunterreguliert. Dabei ist die Zusammensetzung dadurch gekennzeichnet, dass das DNAzym in der Zusammensetzung in einer Konzentration vorliegt, die niedriger als 75 mg/ml ist. Es kann insbesondere vorgesehen sein, dass die Zusammensetzung als Aerosol applizierbar ist, das über die Lunge aufgenommen wird. Vorzugsweise kann die Zusammensetzung eine Flüssigkeit oder eine Lösung sein, alternativ ein Pulver. Dem Fachmann ist bekannt, dass unter einer Herunterregulation einer Expression sowohl eine teilweise als auch eine vollständige Inhibition der Expression verstanden werden kann. In jedem Fall wird die Expression im Vergleich zum natürlichen Expressionsniveau signifikant verringert. Vorliegend binden und spalten die spezifischen DNAzyme in vivo die mRNA der Transkriptionsfaktoren GATA-3 und/oder Tbet, deren Proteine zentrale Schlüsselmoleküle für die Entstehung von Th1- bzw. Th2-abhängigen chronischen Entzündungserkrankungen darstellen. Durch diese Spaltung der mRNA können die mRNAs nicht mehr in funktionale Proteine translatiert werden. Folglich wird das GATA-3- bzw. Tbet-Proteinniveau signifikant minimiert.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung mit einer DNAzym-Konzentration, die niedriger ist als 75 mg/ml, lässt sich dabei ideal zur Behandlung von Patienten einsetzen, die an einer mit chronischen Entzündung einhergehenden Atemwegserkrankung leiden. Das liegt vor allem daran, dass Zusammensetzungen mit DNAzym-Konzentrationen, die 75 mg/ml übersteigen, mit einem Wirkstoffverlust verbunden sind. Grund hierfür ist, dass sich derart hochkonzentrierte Zusammensetzungen aufgrund ihrer erhöhten Viskosität nicht mehr problemlos zerstäuben lassen (etwa über ein Inhalationsgerät). In der Medizin übliche Handinhalatoren arbeiten in der Regel mit einem Zerstäubungsdruck von 40 bar bis 45 bar. Für ein derartiges Inhalationsgerät ist die Oberflächenspannung einer Lösung mit einer DNAzym-Konzentration von über 75 mg/ml zu hoch, um noch zerstäubbar zu sein. Als Folge zeigen bereits Zusammensetzungen mit einer DNAzym-Konzentration von 75 mg/ml einen Wirkstoffverlust von etwa 6 %, wenn sie mittels eines Inhalationsgeräts appliziert werden. Demgegenüber besitzen insbesondere Zusammensetzungen mit einer DNAzym-Konzentration von 20 mg/ml bis 50 mg/ml einen optimalen Wirkungseffekt bei der Behandlung mit einem Inhalator, weil sich Zusammensetzungen mit derartigen Konzentrationen einfach zerstäuben lassen. Entsprechend wird erfindungsgemäß eine Zusammensetzung bevorzugt, die eine DNAzym-Konzentration von 20 mg/ml bis 50 mg/ml aufweist.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann dabei insbesondere als Inhalationslösung vorliegen, die als Aerosol in die Lunge eines Patienten appliziert werden kann, was vor allem bei der Behandlung von Atemwegserkrankungen von Vorteil ist, die durch allergische Entzündungsreaktionen ausgelöst werden. Bei solchen Atemwegserkrankungen können die Wirkstoffe (DNAzyme) durch eine erfindungsgemäße Zusammensetzung in Aerosolform im Wesentlichen an Ort und Stelle der Entzündung appliziert werden. Als Folge ergibt sich daraus eine höhere Effizienz bei der Behandlung entsprechender Patienten. Dazu ist insbesondere vorgesehen, dass die Zusammensetzung eine Flüssigkeit oder eine Lösung ist. Alternativ kann die Zusammensetzung ein Pulver sein.
Das erfindungsgemäße Merkmal, wonach die DNAzym-Konzentration niedriger ist als 75 mg/ml, ist dabei insbesondere bei der Verwendung von DNAzymen von großem Vorteil. Für wässrige DNA-Lösungen sind üblicherweise Konzentrationen möglich, die 75 mg/ml weit übersteigen, ohne dass dabei die Viskosität der Lösung signifikant erhöht wird. So können gerade kleinere DNA-Moleküle (< 1.000 bp), zu denen auch DNAzyme zählen, in Konzentrationen von über 100 mg/ml vorliegen, ohne dass die Lösungen dabei besonders viskos werden.
Bei DNAzymen zeigt sich jedoch der überraschende Effekt, dass DNAzym-haltige Lösungen bereits bei Konzentrationen von mindestens 75 mg/ml überproportional stark viskos werden. Bei Konzentrationen von über 75 mg/ml fallen sie sogar aus. Grund hierfür ist vor allem die dreidimensionale Struktur der DNAzyme, die durch die Ausbildung eines„loops“ oder einer„Schlaufe“ gekennzeichnet ist. Aufgrund dieser besonderen Struktur können DNAzyme - befördert durch ihre Einzelsträngigkeit - eine Art Polymerstruktur ausbilden und leicht miteinander verklumpen, was wiederum eine insgesamt schlechte Löslichkeit hoher DNAzym-Mengen zur Folge hat. Für die ortsspezifische Behandlung von Patienten, die an einer mit chronischen Entzündung einhergehenden Atemwegserkrankung leiden, ist die erfindungsgemäße Zusammensetzung also von großem Vorteil, weil sie aufgrund einer DNAzym- Konzentration von unter 75 mg/ml nicht zu viskos ist und sich leicht daher als Aerosol verabreichen lässt.
Es ist insbesondere vorgesehen, dass die Zusammensetzung eine DNAzym- Konzentration von 20 mg/ml bis 50 mg/ml aufweist. Mit einer derartigen Zusammensetzung wird gewährleistet, dass auch bei der Verwendung von Handinhalatoren oder vergleichbaren Inhalationsgeräten ausreichende Mengen an Wirkstoff durch den Patienten aufgenommen werden können. Bei Zusammensetzungen mit DNAzym-Konzentrationen von unter 20 mg/ml besteht nämlich das Risiko, dass die Wirkstoffmengen, die durch eine einzelne Auslösung oder Betätigung eines Inhalators abgegeben werden, nicht ausreichen, um den erwünschten Behandlungserfolg herbeizuführen - es werden pro Auslösung des Inhalators schlicht zu wenige Wirkstoffe abgegeben. Folglich müssen Patienten das Inhalationsgerät mehrmals betätigen, was zum einen eine mögliche Belastung für die zu behandelnden Patienten darstellt und zum anderen für einen höheren Verschleiß der Inhalatoren sorgt. Durch eine hohe Wirkstoffkonzentration sind außerdem mehrere Applikationen pro Inhalator möglich.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung gewährleistet also vor allem in dieser bevorzugten Ausführungsform einen idealen Kompromiss: Einerseits ist die DNAzym- Konzentration mit weniger als 50 mg/ml noch niedrig genug, um noch durch ein Inhalationsgerät zerstäubt werden zu können, andererseits ist die DNAzym- Konzentration mit mehr als 20 mg/ml hoch genug, dass zum Beispiel bei der Verwendung von Handinhalatoren bereits nach wenigen Betätigungen ausreichende Wirkstoffmengen abgegeben werden können.
Gemäß einer vorteilhaften Weiterentwicklung kann außerdem vorgesehen sein, dass die Zusammensetzung eine Viskosität aufweist, die niedriger ist als 3,5 mPa-s. Eine derartige Viskosität hat zur Folge, dass sich die Zusammensetzung problemlos und ohne signifikanten Wirkstoffverlust als Aerosol applizieren lässt, etwa als Inhalationslösung eines Inhalators. Eine höhere Viskosität hat zur Folge, dass der Druck, der zum Zerstäuben der Zusammensetzung aufgewendet werden muss, zu hoch ist, um noch durch ein gewöhnliches Inhalationsgerät ausgeübt werden zu können. Somit kann eine Zusammensetzung mit einer Viskosität von über 3,5 mPa-s dazu führen, dass die Zerstäuber der Inhalatoren, die üblicherweise zur Behandlung entsprechender Patienten eingesetzt werden, bereits nach kurzer Zeit verstopfen oder verschmieren. Es ist also vorteilhaft, dass die Viskosität der Zusammensetzung in einem Bereich liegt, der eine möglichst hohe Wirkstoffkonzentration (DNAzyme) bei verhältnismäßig geringer Viskosität gewährleistet.
Beispielhaft aber nicht abschließend werden als DNAzyme die DNAzyme der früheren Anmeldung DE 103 46 487 genannt und in diese Anmeldung aufgenommen. Diese DNAzyme sind gegen die mRNA der Proteine GATA-3 und T-bet gerichtet und zur Herstellung eines Mittels gegen entzündliche Erkrankungen offenbart.
Beispielsweise werden folgende DNAzyme verwendet (jedes einzeln oder in Kombination mit den anderen): Name der DNAzyme gegen GATA-3 mRNA-Sequenz:
SEQ ID No: 1 hgd1 5'-TCGGTCAGAggctagctacaacgaTGCGTTGCT-3'
SEQ ID No: 2 hgd2 5'-GGCGTACGAggctagctacaacgaCTGCTCGGT-3' SEQ ID No: 3 hgd3 5'-GGCGGCGTAggctagctacaacgaGACCTGCTC-3' SEQ ID No: 4 hgd4 5'-CTCGGGTCAggctagctacaacgaCTGGGTAGC-3' SEQ ID No: 5 hgd5 5'-TCCTCTGCAggctagctacaacgaCGGGGTCCT-3' SEQ ID No: 6 hgd6 5'-ACTCTGCAAggctagctacaacgaTCTGCGAGC-3' SEQ ID No: 7 hgd7 5'-GGGCGACGAggctagctacaacgaTCTGCAATT-3' SEQ ID No: 8 hgd8 5'-AAGGGGCGAggctagctacaacgaGACTCTGCA-3' SEQ ID No: 9 hgd9 5'-AAAACGGGAggctagctacaacgaCAGGTTGTA-3' SEQ ID o: 10 hgd10 5'-AGAATAAAAggctagctacaacgaGGGACCAGG-3' SEQ ID No: 11 hgd11 5'-ATGGCAGAAggctagctacaacgaAAAACGGGA-3' SEQ ID No: 12 hgd 12 5'-AACT GGGTAggctagctacaacgaGGCAGAATA-3' SEQ ID No: 13 hgd13 5'-ATCCAAAAAggctagctacaacgaTGGGTATGG-3' SEQ ID No: 14 hgd 14 5'-AGGGGAAGAggctagctacaacgaAAAAAT CCA-3' SEQ ID No: 15 hgd 15 5'-TTTTAAAAAggctagctacaacgaTATCTTGGA-3' SEQ ID No: 16 hgd 16 5'-GTGGGGGGAggctagctacaacgaGGGAAGGCT-3' SEQ ID No: 17 hgd 17 5'-GTT GAAT GAggctagctacaacgaTTGCTTTCG-3' SEQ ID No: 18 hgd 18 5'-GTCGTTGAAggctagctacaacgaGATTTGCTT-3' SEQ ID No: 19 hgd 19 5'-GGCCCGGAAggctagctacaacgaCCGCGCGCG-3' SEQ ID No: 20 hgd20 5'-TCACCTCCAggctagctacaacgaGGCCTCGGC-3' SEQ ID No: 21 hgd21 5'-CCGCCGTCAggctagctacaacgaCTCCATGGC-3' SEQ ID No: 22 hgd22 5'-GGTGGCTCAggctagctacaacgaCCAGCGCGG-3' SEQ ID No: 23 hgd23 5 -CGTTGAGCAggctagctacaacgaGGCGGGGTG-3' SEQ ID No: 24 hgd24 5'-CCGCGTCCAggctagctacaacgaGTAGGAGTG-3' SEQ ID No: 25 hgd25 5'-CAGCGGGTAggctagctacaacgaTGCGCCGCG-3' SEQ ID No: 26 hgd26 5'-GCACAT CCAggctagctacaacgaCTCCTCCGG-3' SEQ ID No: 27 hgd27 5'-AAAAGCACAggctagctacaacgaCCACCTCCT-3' SEQ ID No: 28 hgd28 5'-TAAAAAGCAggctagctacaacgaATCCACCTC-3' SEQ ID No:29 hgd29 5'-GACCGTCGAggctagctacaacgaGTTAAAAAG-3' SEQ ID No: 30 hgd30 5 -TTGCCTT G AggctagctacaacgaCGT CGAT GT-3' SEQ ID No: 31 hgd31 5 -AGGGCGGGAggctagctacaacgaGTGGTTGCC-3’ SEQ ID No: 32 hgd 32 5 -T GGCCCT GAggctagctacaacgaCGAGTTTCC-3' SEQ ID No: 33 hgd33 5'-ACCTCTGCAggctagctacaacgaCGTGGCCCT-3' SEQ ID No: 34 hgd34 5'-CGGAGGGTAggctagctacaacgaCTCTGCACC-3' SEQ ID No: 35 hgd35 5'-GGCGGCACAggctagctacaacgaCTGGCTCCC-3' SEQ ID No: 36 hgd36 5’-CGGGCGGCAggctagctacaacgaACCTGGCTC-3' SEQ ID No: 37 hgd37 5 -AGG GAT CCAggctagctacaacgaGAAGCAGAG-3' SEQ ID No: 38 hgd38 5'-GGGTAGGGAggctagctacaacgaCCATGAAGC-3' SEQ ID No: 39 hgd39 5'-GGGCTGAGAggctagctacaacgaTCCAGGGGG-3' SEQ ID No: 40 hgd40 5'-GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG-3' SEQ ID No: 41 hgd41 5'-CGTGGTGGAggctagctacaacgaGGACGTCTT-3' SEQ ID No: 42 hgd42 5'-GGGGGTAGAggctagctacaacgaGGAGAGGGG-3' SEQ ID No: 43 hgd43 5'-GGAGGAGGAggctagctacaacgaGAGGCCGGG-3' SEQ ID No: 44 hgd44 5'-GCCCCCCGAggctagctacaacgaAAGGAGGAG-3' SEQ ID No: 45 hgd45 5'-CCGGGGAGAggctagctacaacgaGTCCTTCGG-3' SEQ ID No: 46 hgd46 5'-GGACAGCGAggctagctacaacgaGGGTCCGGG-3' SEQ ID No: 47 hgd47 5'-TGGGGTGGAggctagctacaacgaAGCGATGGG-3' SEQ ID No: 48 hgd48 5'-CTTGAGGCAggctagctacaacgaTCTTTCTCG-3' SEQ ID No: 49 hgd49 5'-CACCTGGTAggctagctacaacgaTTGAGGCAC-3' SEQ ID No: 50 hgd50 5'-GCAGGGGCAggctagctacaacgaCTGGTACTT-3' SEQ ID No: 51 hgd51 5'-CCAGCTTCAggctagctacaacgaGCTGTCGGG-3' SEQ ID No: 52 hgd52 5'-GTGGGACGAggctagctacaacgaTCCAGCTTC-3' SEQ ID No: 53 hgd53 5'-GGAGTGGGAggctagctacaacgaGACTCCAGC-3' SEQ ID No: 54 hgd54 5'-ATGCTGCCAggctagctacaacgaGGGAGTGGG-3' SEQ ID No: 55 hgd55 5'-GGGCGGTCAggctagctacaacgaGCTGCCACG-3' SEQ ID No: 56 hgd56 5 -GAGGCT CCAggctagctacaacgaCCAGGGCGG-3' SEQ ID No: 57 hgd57 5'-GTGGGTCGAggctagctacaacgaGAGGAGGCT-3' SEQ ID No: 58 hgd58 5'-AGGTGGTGAggctagctacaacgaGGGGTGGTG-3' SEQ ID No: 59 hgd59 5'-ACTCGGGCAggctagctacaacgaGTAGGGCGG-3' SEQ ID No: 60 hgd60 5'-GGAGCTGTAggctagctacaacgaTCGGGCACG-3' SEQ ID No: 61 hgd61 5'-GGACTTGCAggctagctacaacgaCCGAAGCCG-3' SEQ ID No: 62 hgd62 5'-GGGCCTGGAggctagctacaacgaTTGCATCCG-3' SEQ ID No: 63 hgd63 5'-TGTGCTGGAggctagctacaacgaCGGGCCTTG-3' SEQ ID No: 64 hgd64 5'-GTT CACACAggctagctacaacgaT CCCTGCCT-3' SEQ ID No: 65 hgd65 5'-CAGTTCACAggctagctacaacgaACTCCCTGC-3' SEQ ID No: 66 hgd66 5'-CACAGTTCAggctagctacaacgaACACTCCCT-3' SEQ ID No: 67 hgd67 5'-GTTGCCCCAggctagctacaacgaAGTTCACAC-3' SEQ ID No: 68 hgd68 5'-T CGCCGCCAggctagctacaacgaAGT GGGGTC-3' SEQ ID No: 69 gd69 5'-CCCGTGCCAggctagctacaacgaCTCGCCGCC-3' SEQ ID No: 70 hgd70 5'-GGCGTTGCAggctagctacaacgaAGGTAGTGT-3' Name der DNAzyme gegen T-bet mRNASequenz:
SEQ ID No: 71 td 1 5'-TGGCTT CT AggctagctacaacgaGCCCT CGT C-3' SEQ ID No: 72 td2 5'-GGGCTCTGAggctagctacaacgaGCCTGGCTT-3' SEQ ID No: 73 td3 5'-GGGACCCCAggctagctacaacgaCGGAGCCCG-3' SEQ ID No: 74 td4 5'-GGTGGGGGAggctagctacaacgaCCCACCGGA-3' SEQ ID No: 75 td5 5'-GGCGGGGGAggctagctacaacgaCCGAGGGCC-3' SEQ ID No: 76 td6 5'-GGGCTGGGAggctagctacaacgaGGGCAGGGA-3' SEQ ID No: 77 td7 5'-CGTCGAGGAggctagctacaacgaCCGCCCCTC-3' SEQ ID No: 78 td8 5'-GGGCTGGCAggctagctacaacgaCTTCCCGTA-3' SEQ ID No: 79 td9 5'-CGATGCCCAggctagctacaacgaCCGGGGCGG-3' SEQ ID No: 80 td 10 5'-GCTCCACGAggctagctacaacgaGCCCATCCG-3' SEQ ID No: 81 td 1 1 5'-CCGGCTCCAggctagctacaacgaGATGCCCAT-3' SEQ ID No: 82 td 12 5'-TCTCCGCAAggctagctacaacgaCCGGCTCCA-3' SEQ ID No: 83 td 13 5'-CCGT CAGCAggctagctacaacgaGT CT CCGCA-3' SEQ ID No: 84 td14 5'-TCCCCGGCAggctagctacaacgaCGGCTCGGT-3' SEQ ID No: 85 td 15 5'-CCCCCGCGAggctagctacaacgaGCTCGTCCG-3' SEQ ID No: 86 td16 5'-GTAGGGAGAggctagctacaacgaCCCAGGCTG-3' SEQ ID No: 87 td 17 5'-GGGCGGGCAggctagctacaacgaCAAGGCGCC-3' SEQ ID No: 88 td 18 5'-CGGGAAGGAggctagctacaacgaTCGCCCGCG-3' SEQ ID No: 89 td19 5'-TAGTCCTCAggctagctacaacgaGCGGCCCCG-3' SEQ ID No: 90 td20 5'-TCCCCGACAggctagctacaacgaCTCCAGTCC-3' SEQ ID No: 91 td21 5'-TTT CCCCGAggctagctacaacgaACCT CCAGT -3' SEQ ID No: 92 td22 5'-T GAGCGCGAggctagctacaacgaCCT CAGTTT -3' SEQ ID No: 93 td23 5'-GGACCACAAggctagctacaacgaAGGTGGTTG-3' SEQ ID No: 94 td24 5'-CTTGGACCAggctagctacaacgaAACAGGTGG-3' SEQ ID No: 95 td25 5'-AAACTTGGAggctagctacaacgaCACAACAGG-3' SEQ ID No: 96 td26 5'-CT GATT AAAggctagctacaacgaTTGGACCAC-3' SEQ ID No: 97 td27 5'-TGGTGCTGAggctagctacaacgaTAAACTTGG-3' SEQ ID No: 98 td28 5'-T GAT GAT CAggctagctacaacgaCT CT GT CT G-3' SEQ ID No: 99 td29 5'-TGGT GAT GAggctagctacaacgaCAT CT CT GT -3' SEQ ID No: 100 td30 5'-GCTTGGT GAggctagctacaacgaGAT CAT CT C-3' SEQ ID No: 101 td31 5'-ATGGGAACAggctagctacaacgaCCGCCGTCC-3' SEQ ID No: 102 td32 5'-GAATGGGAAggctagctacaacgaATCCGCCGT-3' SEQ ID No: 103 td33 5'-TGACAGGAAggctagctacaacgaGGGAACATC-3' SEQ ID No: 104 td34 5'-AGTAAATGAggctagctacaacgaAGGAATGGG-3' SEQ ID No: 105 td35 5'-CACAGTAAAggctagctacaacgaGACAGGAAT-3' SEQ ID No: 106 td36 5'-GCCCGGCCAggctagctacaacgaAGTAAATGA-3' SEQ ID No: 107 td37 5'-CCACAAACAggctagctacaacgaCCTGTAGTG-3' SEQ ID No: 108 td38 5'-GT CCACAAAggctagctacaacgaAT CCT GT AG-3' SEQ ID No: 109 td39 5 -CCACGT CCAggctagctacaacgaAAACATCCT -3' SEQ ID No: 110 td40 5'-CCAAGACCAggctagctacaacgaGT CCACAAA-3' SEQ ID No: 111 td41 5'-CCACCAAGAggctagctacaacgaCACGTCCAC-3' SEQ ID No: 112 td42 5'-GCTGGTCCAggctagctacaacgaCAAGACCAC-3' SEQ ID No: 1 13 td43 5'-GCTCTGGTAggctagctacaacgaCGCCAGTGG-3' SEQ ID No: 114 td44 5'-CTGCACCCAggctagctacaacgaTTGCCGCTC-3' SEQ ID No: 115 td45 5'-CACACTGCAggctagctacaacgaCCACTTGCC-3' SEQ ID No: 116 td46 5'-CTTT CCACAggctagctacaacgaT GCACCCAC-3' SEQ ID No: 1 17 td47 5'-GCCTTTCCAggctagctacaacgaACTGCACCC-3' SEQ ID No: 1 18 td48 5'-TTCCTGGCAggctagctacaacgaGCTGCCCTC-3' SEQ ID No: 119 td49 5'-GTGGACGTAggctagctacaacgaAGGCGGTTT-3' SEQ ID No: 120 td50 5'-CCGGGTGGAggctagctacaacgaGTACAGGCG-3' SEQ ID No: 121 td51 5'-CCTGGCGCAggctagctacaacgaCCAGTGCGC-3' SEQ ID No: 122 td52 5'-CAAATGAAAggctagctacaacgaTTCCTGGCG-3' SEQ ID No: 123 td53 5'-TTT CCCAAAggctagctacaacgaGAAACTT CC-3' SEQ ID No: 124 td54 5'-ATTGTTGGAggctagctacaacgaGCCCCCTTG-3' SEQ ID No: 125 td55 5'-TGGGT CACAggctagctacaacgaT GTTGGACG-3' SEQ ID No: 126 td56 5'-T CTGGGT CAggctagctacaacgaATT GTT GGA-3 SEQ ID No: 127 td57 5 -GCACAAT CAggctagctacaacgaCT GGGT CAC-3' SEQ ID No: 128 td58 5'-GGAGCACAAggctagctacaacgaCATCTGGGT-3' SEQ ID No: 129 td59 5'-ACT GGAGCAggctagctacaacgaAAT CAT CT G-3' SEQ ID No: 130 td60 5'-ATGGAGGGAggctagctacaacgaTGGAGCACA-3' SEQ ID No: 131 td61 5'-TGGTACTTAggctagctacaacgaGGAGGGACT-3' SEQ ID No: 132 td62 5'-GGGCTGGTAggctagctacaacgaTTATGGAGG-3' SEQ ID No: 133 td63 5'-TCAACGATAggctagctacaacgaGCAGCCGGG-3' SEQ ID No: 134 td64 5'-CCTCAACGAggctagctacaacgaATGCAGCCG-3' SEQ ID No: 135 td65 5'-T CACCT CAAggctagctacaacgaGAT ATGCAG-3' SEQ ID No: 136 td66 5'-CGT CGTT CAggctagctacaacgaCT CAACGAT -3' SEQ ID No: 137 td67 5'-GTAAAGATAggctagctacaacgaGCGTGTTGG-3' SEQ ID No: 138 td68 5'-AAGT AAAGAggctagctacaacgaAT GCGT GTT -3' SEQ ID No: 139 td69 5'-GGCAAT GAAggctagctacaacgaT GGGTTT CT -3' SEQ ID No: 140 td70 5'-TCACGGCAAggctagctacaacgaGAACTGGGT-3' SEQ ID No: 141 td71 5'-AGGCAGTCAggctagctacaacgaGGCAATGAA-3'
SEQ ID No: 142 td72 5'-AT CT CGGCAggctagctacaacgaT CTGGT AGG-3'
SEQ ID No: 143 td73 5'-GCTGAGTAAggctagctacaacgaCTCGGCATT-3'
SEQ ID No: 144 td74 5'-T ATT AT CAAggctagctacaacgaTTT CAGCT G-3'
SEQ ID No: 145 td75 5'-GGGTTATTAggctagctacaacgaCAATTTTCA-3'
SEQ ID No: 146 td76 5'-AAGGGGTTAggctagctacaacgaTATCAATTT-3'
SEQ ID No: 147 td77 5'-CTCCCGGAAggctagctacaacgaCCTTTGGCA-3'
SEQ ID No: 148 td78 5'-GTACATGGAggctagctacaacgaTCAAAGTTC-3'
Entsprechend sieht eine vorteilhafte Ausführungsform vor, dass das DNAzym ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend die DNAzyme hgd1 bis hgd70 (vgl .auch Tabelle 2) und/oder aus einer Gruppe umfassend die DNAzyme td1 bis td78 (vgl. Tabelle 2).
DNAzyme mit einer dieser Sequenzen erweisen sich als besonders effizient zur spezifischen in v/Vo-lnhibition der Expressionen der entzündungsfördernden Transkriptionsfaktoren GATA-3 bzw. Tbet. Generell werden dabei die Sequenzen bevorzugt, deren Substratbindungsdomänen vollständig komplementär zu den flankierenden Regionen der Spaltstelle einer bestimmten Ziel-mRNA sind. Ein DNAzym muss allerdings nicht vollständig komplementär sein, um eine Ziel-mRNA zu binden und spalten - es reichen gegebenenfalls kleinere komplementäre Sequenzabschnitte innerhalb der insgesamt homologen Substratbindungsdomäne.
Als besonders bevorzugte Variante ist eine Zusammensetzung vorgesehen, die zur Herunterregulation der Expression des Transkriptionsfaktors GATA-3 das DNAzym hgd40 GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG (SEQ ID No. 40) aufweist.
Diese Sequenz zeigt eine besonders hohe Enzymaktivität und spaltet GATA-3-mRNA mit einer hohen Spezifität sowie mit hoher Effizienz. Folglich eignet sich ein DNAzym mit der Sequenz hgd40 (SEQ ID No. 40) hervorragend zur gezielten und effektiven Behandlung von Atemwegserkrankungen, die Th2-abhängig sind, die also mit einem erhöhten GATA-3-Spiegel korrespondieren.
Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung kann die Zusammensetzung mindestens einen Nuklease-Inhibitor aufweisen, wobei der mindestens eine Nuklease-Inhibitor insbesondere Desoxyribonukleasen spezifisch inaktiviert, also ein DNase Inhibitor ist. Durch einen derartigen Nuklease-Inhibitor wird das mindestens eine DNAzym vor dem enzymatischen Abbau geschützt, der durch DNasen verursacht werden kann.
Es ist außerdem von Vorteil, wenn die Zusammensetzung mindestens ein Salz und/oder mindestens ein Kation umfasst.
Eine derartige Zusammensetzung eignet sich auf vorteilhafte Art und Weise zur Anwendung bei der Therapie von Patienten, die an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Atemwegserkrankung leiden, weil die Zusammensetzung dadurch ein physiologisch günstiges Milieu aufweist und somit für Patienten leicht verträglich ist. Dabei ist insbesondere eine Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) vorgesehen. Es können aber auch andere gepufferte Lösungen vorgesehen sein, in denen Nukleinsäuren in physiologisch günstigem Milieu gelöst vorliegen können, wie zum Beispiel TE-Puffer. Entsprechend ist der anorganische und/oder organische Zusatz bevorzugterweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend die Stoffe Natriumchlorid (NaCI), Kaliumchlorid (KCl), Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HP04), Dinatriumhydrogenphosphat Dihydrat, Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4), TRIS und EDTA. Das Kation kann dabei ausgewählt sein aus der Gruppe umfassend Na, Mg, K, Li, Ca, Fe, Cu und Ag. Des Weiteren kann auch ein organisches Kation vorgesehen sein, wie zum Beispiel Mg(N(S02CF3)2)2 oder Mg(0S02CF3)2. Ferner kann ein bivalentes Kation vorgesehen sein.
Eine derartig gepufferte Zusammensetzung eignet sich besonders zum Schutz der DNAzyme, weil das DNAzym durch den anorganischen und/oder organischen Zusatz stabilisiert und vor enzymatischem Abbau geschützt wird. Darüber hinaus wird durch das Salz eine gute Aufnahme in die Zielzellen ermöglicht. Die bivalenten Kationen können als Co-Faktoren der DNAzyme die DNAzym-Aktivität steigern, da die DNAzyme eine von bivalenten Kationen (vorzugsweise Mg2+) abhängige katalytische Domäne aufweisen. Somit wirken bivalente Kationen als Enhancer oder Verstärker.
Nach einer vorteilhaften Weiterentwicklung kann die Zusammensetzung mindestens einen anorganischen und/oder organischen Zusatz und/oder einen Lösungsvermittler und/oder einen Konservierungsstoff umfassen. Der Lösungsvermittler dient dabei vor allem der Komplexbildung. Darüber hinaus verbessert er die Lösemitteleigenschaften der Zusammensetzung. Als Lösungsvermittler können bevorzugterweise Glycerolderivate und/oder Polyethylenglycole oder auch Lecithine vorgesehen sein. Der Konservierungsstoff kann zum Beispiel Paraben sein. Ferner können Zusätze vorgesehen sein, die zum Beispiel eine Veränderung der Oberflächenspannung der Zusammensetzung oder eine Senkung der Viskosität der Zusammensetzung bewirken.
Ein zusätzlicher Aspekt dieser Erfindung ist das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung, wobei vorgesehen ist, dass das Verfahren zumindest die folgenden Schritte umfasst:
a) Ansetzen einer DNAzym-haltigen Lösung, wobei die DNAzym-Konzentration in der wässrigen Lösung 80 mg/ml nicht übersteigt;
b) Filtration der Lösung aus Schritt a), bis die Lösung eine DNAzym-Konzentration von unter 75 mg/ml aufweist;
Der Filtrationsschritt ist von Vorteil, weil dadurch unerwünschte (unsterile) Stoffe sowie ungelöste Wirkstoffpartikel (also ungelöste DNAzyme) entfernt werden. Die Zusammensetzung muss zur Behandlung eines an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Atemwegserkrankung leidenden Patienten steril sein. Andere Sterilisationsverfahren (Strahlung, Erhitzen, Autoklavieren etc.) sind hier nicht anwendbar, weil dadurch auch die DNAzyme zerstört würden. Aus diesem Grund ist vorgesehen, dass die Lösung mittels Filtration sterilisiert wird. Dabei wird bevorzugterweise ein Filter verwendet, der PES-Membran mit einem Porendurchmesser von 0,20 bis 0,25 pm aufweist. Besonders bevorzugt ist eine PES- Membran, mit einem Porendurchmesser von 0,22 pm.
Nach einer weiteren Ausgestaltung ist vorgesehen, dass das Verfahren mindestens einen weiteren Verfahrensschritt umfasst, namentlich ausgewählt aus einem der folgenden Schritte:
Hinzufügen eines Nuklease-Inhibitors zur Lösung aus Schritt b);
Hinzufügen des mindestens einen Salzes und/oder des mindestens einen Kations zur Lösung aus Schritt b);
Hinzufügen des anorganischen und/oder organischen Zusatzes zur Lösung aus Schritt b);
Hinzufügen des Lösungsvermittlers und/oder des Konservierungsstoffs zur Lösung aus Schritt b). Ein derartiges Verfahren gewähreistet auf einfache Art und Weise die Herstellung einer Zusammensetzung, die zur Behandlung eines Patienten eingesetzt werden kann, der an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Atemwegserkrankung leidet. Durch die Auswahl der Schritte lässt sich das Verfahren individuell an spezifische Bedürfnisse anpassen.
Einen weiteren Aspekt der Erfindung stellt die Verwendung der vorbenannten Zusammensetzung als Arzneimittel zur Behandlung eines an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Atemwegserkrankung leidenden Patienten dar. Dazu kann die Zusammensetzung insbesondere als Inhalationslösung vorliegen. Denkbar sind aber auch andere Formen, wie etwa ein Pulver zu Anwendung in Pulverinhalatoren.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Zusammensetzung in Form eines Aerosols appliziert werden kann. Eine derartig applizierte Zusammensetzung kann ortsspezifisch in der Lunge eines an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Atemwegserkrankung leidenden Patienten wirken. Dadurch kann die Effektivität des Arzneimittels erhöht werden. Gleichzeitig wird das Risiko von Nebenwirkungen minimiert.
Weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus dem Wortlaut der Ansprüche sowie aus der folgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen.
Es zeigen:
Tabelle 1 eine Liste der GATA-3-spezifischen DNAzyme;
Tabelle 2 eine Liste der Tbet-spezifischen DNAzyme;
Tabelle 3 ein Beispiel einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung;
Tabelle 4 mögliche zusätzliche Komponenten der Zusammensetzung aus Tabelle 3; Figur 1 grafische Darstellung der Viskosität einer DNAzym-haltigen Zusammensetzung in Abhängigkeit ihrer Konzentration; Figur 2 Viskositätsmessergebnisse einer DNAzym-haltigen Zusammensetzung in Abhängigkeit ihrer Konzentration;
Figur 3 Messergebnisse eines FATs von Zusammensetzungen mit unterschiedlichen
DNAzym-Konzentrationen;
Figur 4 Messergebnisse eines FATs der erfindungsgemäßen Zusammensetzung mit
DNAzym-Konzentrationen von 20 mg/ml bzw. 50 mg/ml.
Ausführungsbeispiele
Tabelle 1 - GATA-3-spezifische DNAzyme
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000020_0001
Tabelle 2 - Tbet-spezifische DNAzyme
Figure imgf000020_0002
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
Tabelle 3 Beispiel einer erfindungsgemäßen
Zusammensetzung
[%
Substanz
w/w]
0,01-
DNAzym
0,75
Nuklease-Inhibitor variabel Beispiel : DNase-lnhibitor Tabelle 4 - Mögliche zusätzliche Komponenten der
Zusammensetzung aus Tabelle 3
[%
Substanz
w/w]
Salz und/oder Kation variabel
Beispiel·. Na, Mg, K, Li, Ca, Fe, Cu, Ag, HPO42 , H2PO4 ,
EDTA variabel
TRIS variabel
Lösungsvermittler variabel
Beispiel· Glycerolderivate, Polyethylenglycole, Lecithine
Konservierungsstoff variabel
Beispiel· Paraben
ln Figur 1 ist eine grafische Darstellung der Viskosität einer DNAzym-haltigen Zusammensetzung in Abhängigkeit ihrer Konzentration gezeigt. Das DNAzym kann dabei die Expression von GATA-3 spezifisch herunterregulieren und/oder die Expression von Tbet spezifisch herunterregulieren.
Nach bevorzugter Ausführung sind vor allem DNAzyme aus einer Gruppe umfassend die DNAzyme hgd1 bis hgd70 oder aus einer Gruppe umfassend die DNAzyme td 1 bis td78 vorgesehen. Insbesondere soll das DNAzym hgd40 (SEQ ID No. 40) eingesetzt werden, das die Sequenz GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG aufweist und das die Expression von GATA-3 spezifisch inhibiert.
Der Graph aus Figur 1 zeigt die Viskosität einer hgd40-haltigen Zusammensetzung. Entlang der Y-Achse des Graphen aus Figur 1 wird die Viskosität der Zusammensetzung in mPa-s aufgetragen, die X-Achse gibt die DNAzym-Konzentration der Zusammensetzung an. Aus der Darstellung ergibt sich, dass die Viskosität der Zusammensetzung im Wesentlichen exponentiell zunimmt. Dabei ist insbesondere ab einer Konzentration von 50 mg/ml und höher ein starker Anstieg der Viskosität zu beobachten. Bereits bei einer Konzentration von etwa 75 mg/ml ist eine Viskosität von 3,5 mPa-s zu verzeichnen.
In Figur 2 sind Viskositätsmessergebnisse einer DNAzym-haltigen Zusammensetzung in Abhängigkeit ihrer Konzentration gezeigt. Sie verdeutlichen denselben Zusammenhang von Konzentration und Viskosität wie die Grafik aus Figur 2. So steigt die Viskosität bei einer DNAzym-Konzentration zwischen 50 mg/ml und 100 mg/ml exponentiell an. Diese Korrelation ist für andere DNA-Moleküle in der Regel nicht derart ausgeprägt zu beobachten; üblicherweise steigt die Viskosität einer DNA- haltigen Lösung im Wesentlichen linear mit steigender DNA-Konzentration.
Bei einer Viskosität von über 3,5 mPa-s ist der Druck, den ein gängiges Inhalationsgerät zum Zerstäuben der Zusammensetzung ausüben müsste, zu hoch. Das kann dazu führen, dass die Inhalatoren, die üblicherweise für die Behandlung entsprechender Patienten verwendet werden, bereits nach kurzer verstopfen oder verschmieren. Dieses Risiko wird durch eine Zusammensetzung, deren DNAzym- Konzentration niedriger ist als 75 mg/ml, signifikant minimiert.
In Figur 3 sind Messergebnisse eines FATs von Zusammensetzungen mit unterschiedlichen DNAzym-Konzentrationen in tabellarischer Form dargestellt. Ein FAT („Factory Acceptance Test“) ist mit einer Werksabnahme vergleichbar, in der die Anwendbarkeit eines Produkts getestet werden soll. Die Tabelle belegt, dass eine DNAzym-Konzentration von über 75 mg/ml in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung nicht mehr durch die Inhalationsgeräte aus dem Test zerstäubt werden kann (zweite Ergebniszeile der Tabelle aus Figur 3). Wird eine Zusammensetzung mit einer DNAzym-Konzentration von 75 mg/ml im Vorfeld des Testlaufs steril gefiltert, so wird die Konzentration auf unter 75 mg/ml herabgesenkt. Eine Zusammensetzung mit einer derartigen DNAzym-Konzentration kann mit den im Test verwendeten Zerstäubern zerstäubt werden, wie der vierten und fünften Ergebniszeile der Tabelle aus Figur 3 entnommen werden kann. Der FAT gibt die Viskosität in dP/ml an. Diese sollte zum Bestehen des hier durchgeführten FATs unter 5 % liegen. Die Abkürzung„WFI“ in der ersten und dritten Zeile steht für„Water for Injection“ und ist als Kontrolle zu verstehen - entsprechend korrespondieren die„WFI“- Kontrollen mit einer Viskosität von 1 dP/ml.
In Figur 4 sind Messergebnisse eines FATs der erfindungsgemäßen Zusammensetzung mit DNAzym-Konzentrationen von 20 mg/ml bzw. 50 mg/ml gezeigt. Die Ergebnisse belegen, dass derartige Zusammensetzungen den FAT bestehen (Status FAT Test) und sich mittels gängiger Inhalationsgeräte zerstäuben lassen („bestanden“ in den Ergebniszeilen).
Die Messergebnisse aus den Figuren 3 und 4 belegen also, dass sich die erfindungsgemäße Zusammensetzung mit einer DNAzym-Konzentrationen von unter 75 mg/ml ideal zur Behandlung eines an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Atemwegserkrankung leidenden Patienten eignet, weil eine derartige Zusammensetzung zerstäubt und somit als Aerosol verwendet werden kann. Dabei werden bevorzugterweise DNAzym-Konzentrationen von 20 mg/ml bis 50 mg/ml eingesetzt.
Man erkennt mithin, dass die Erfindung eine Zusammensetzung zur Behandlung eines Patienten betrifft, der an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Atemwegserkrankung leidet, wobei die Zusammensetzung mindestens ein DNAzym umfasst, das die Expression von GATA-3 spezifisch herunterreguliert und/oder mindestens ein DNAzym umfasst, das die Expression von Tbet spezifisch herunterreguliert. Die Zusammensetzung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des DNAzyms in der Zusammensetzung niedriger als 75 mg/ml ist, wobei die Konzentration des DNAzyms in der Zusammensetzung vorzugsweise zwischen 20 mg/ml und 50 mg/ml liegt.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung, diese mindestens ein DNAzym umfasst, das die Expression von GATA-3 spezifisch herunterreguliert und/oder mindestens ein DNAzym umfasst, das die Expression von Tbet spezifisch herunterreguliert. Auch hierbei ist vorgesehen, dass die Konzentration des DNAzyms in der Zusammensetzung niedriger als 75 mg/ml ist, vorzugsweise niedriger ist als 3,5 mPa-s.
Die Verwendung der Zusammensetzung ist auf ein Arzneimittel gerichtet, das zur Behandlung eines an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Atemwegserkrankung leidenden Patienten eingesetzt wird.

Claims

Patentansprüche
1. Zusammensetzung zur Behandlung eines Patienten, der an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Atemwegserkrankung leidet, wobei die Zusammensetzung mindestens ein DNAzym umfasst, das die Expression von GATA-3 spezifisch herunterreguliert und/oder mindestens ein DNAzym umfasst, das die Expression von Tbet spezifisch herunterreguliert, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des DNAzyms in der Zusammensetzung niedriger als 75 mg/ml ist.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des DNAzyms in der Zusammensetzung zwischen 20 mg/ml und 50 mg/ml ist.
3. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung eine Viskosität aufweist, die niedriger ist als 3,5 mPa-s.
4. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das DNAzym ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend die DNAzyme hgd1 bis hgd70 (SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 70) und/oder aus einer Gruppe umfassend die DNAzyme td1 bis td78 (SEQ ID No. 71 bis SEQ ID No. 148).
5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das DNAzym die Sequenz hgd40 GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG (SEQ ID No. 40) aufweist.
6. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung mindestens einen Nuklease- Inhibitor aufweist.
7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Nuklease-Inhibitor Desoxyribonukleasen spezifisch inaktiviert.
8. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung mindestens ein Salz und/oder mindestens ein Kation umfasst.
9. Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung mindestens einen anorganischen und/oder organischen Zusatz und/oder einen Lösungsvermittler und/oder einen Konservierungsstoff umfasst.
10. Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zumindest die folgenden Schritte umfasst:
a) Ansetzen einer DNAzym-haltigen Lösung, wobei die DNAzym- Konzentration in der Lösung 80 mg/ml nicht übersteigt;
b) Filtration der Lösung aus Schritt a), bis die Lösung eine DNAzym- Konzentration von unter 75 mg/ml aufweist;
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren außerdem mindestens einen der folgenden Schritte umfasst:
• Hinzufügen des mindestens einen Nuklease-Inhibitors zu der Lösung aus Schritt b);
• Hinzufügen des mindestens einen Salzes und/oder des mindestens einen Kations zur Lösung aus Schritt b);
• Hinzufügen des mindestens einen anorganischen und/oder organischen Zusatzes zur Lösung aus Schritt b);
• Hinzufügen des Lösungsvermittlers und/oder des Konservierungsstoffs zur Lösung aus Schritt b).
12. Verwendung der Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 als Arzneimittel zur Behandlung eines an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Atemwegserkrankung leidenden Patienten.
13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung in Form eines Aerosols appliziert wird.
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