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WO2019078432A1 - 세균 메타게놈 분석을 통한 림프종 진단방법 - Google Patents

세균 메타게놈 분석을 통한 림프종 진단방법 Download PDF

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Publication number
WO2019078432A1
WO2019078432A1 PCT/KR2018/004798 KR2018004798W WO2019078432A1 WO 2019078432 A1 WO2019078432 A1 WO 2019078432A1 KR 2018004798 W KR2018004798 W KR 2018004798W WO 2019078432 A1 WO2019078432 A1 WO 2019078432A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
derived
extracellular vesicles
bacterial
lymphoma
Prior art date
Application number
PCT/KR2018/004798
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김윤근
Original Assignee
주식회사 엠디헬스케어
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020180047607A external-priority patent/KR102007783B1/ko
Application filed by 주식회사 엠디헬스케어 filed Critical 주식회사 엠디헬스케어
Priority to CN201880067789.9A priority Critical patent/CN111373058A/zh
Priority to US16/757,231 priority patent/US11708615B2/en
Priority to EP18867803.1A priority patent/EP3690065A4/en
Priority to JP2020521551A priority patent/JP7112125B2/ja
Publication of WO2019078432A1 publication Critical patent/WO2019078432A1/ko

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing lymphoma through the analysis of a bacterial metagenome, and more specifically, by analyzing a bacterial metagenome using a sample derived from a normal person and an examinee to analyze a change in the content of a specific bacterium-derived extracellular vesicle, And the like.
  • Lymphoma is a kind of blood cancer originating from lymphatic cells, mainly originating from the lymph node, but can occur anywhere in the lymphoid tissue. Typical symptoms include lymphadenopathy, night sweats, fever, weight loss, and tiredness. The enlarged lymph nodes are painless, which distinguishes them from inflated lymph node enlargement. Surgical treatment is usually not expected because it is basically a cancer of the blood. Instead, chemotherapy or radiotherapy is heard well. According to the data released by the Korean Central Cancer Registry in 2011, 192,561 cases of cancer occurred annually in Korea. Among them, malignant lymphomas accounted for 2.13% of the total cancer incidence, 4,093 cases per year.
  • the number of male and female cases was 2,313 cases per year for men and 1,780 cases for women. By age group, males and females showed the greatest number of males in their 60s (22.1%), fifties and seventies (19.3%) and fifties (15.4%).
  • lymphoma associated with acquired immune deficiency virus lymphoma associated with acquired immune deficiency virus
  • chronic hepatitis C-associated lymphoma chronic hepatitis C-associated lymphoma
  • Burkitt lymphoma and NK / T lymphoma associated with EB virus lymphoma associated with Helicobacter pylori
  • lymphoma associated with Helicobacter pylori lymphoma may occur even in the condition of decreased immunity, and the incidence is higher in organ transplantation, acquired immunodeficiency syndrome, congenital immunodeficiency syndrome, and autoimmune disease.
  • Lymphomas are usually diagnosed by lymph node biopsy. When pathological tissues are obtained, immunohistochemical staining is carried out in addition to basic staining. Other long-term involvement can be found through PET-CT.
  • microorganisms that are symbiotic to the human body is 10 times more than that of human cells, and the number of microorganisms is known to be over 100 times that of human genes.
  • Microbiota refers to microbial communities that include bacteria, archaea, and eukarya in a given settlement. Intestinal microbial guns play an important role in human physiology , And it is known to have a great influence on human health and disease through interaction with human cells. Bacteria that coexist in our body secrete nanometer-sized vesicles to exchange information such as genes, proteins, and low molecular compounds into other cells.
  • the mucous membrane forms a physical barrier that can not pass through particles of 200 nanometers (nm) or larger and can not pass through the mucous membrane when the bacteria are symbiotic to the mucous membrane.
  • the bacterial-derived vesicles are usually 100 nanometers or less in size, It is freely absorbed into our body through the mucosa.
  • Metagenomics also called environmental genomics, can be said to be an analysis of metagenomic data obtained from samples taken in the environment (Korean Patent Laid-Open Patent No. 2011-073049).
  • 16s ribosomal RNA (16s rRNA) base sequence-based method has been able to catalog the bacterial composition of human microbial genome.
  • the 16s rDNA nucleotide sequence of 16s ribosomal RNA can be sequenced by next generation sequencing , NGS) platform.
  • the present inventors extracted genes from bacterial-derived extracellular vesicles present in blood, which is a sample derived from normal persons and subjects, and conducted metagenome analysis to diagnose the causative factors and risk of developing lymphoma. As a result, Derived vesicles capable of acting as a factor were identified. Based on this finding, the present invention was completed.
  • the present invention provides a method for providing information for lymphoma diagnosis, comprising the following steps.
  • the present invention also provides a method of diagnosing a lymphoma, comprising the steps of:
  • the present invention also provides a method for predicting the risk of developing lymphoma, comprising the following steps.
  • step (c) one or more phylum bacterial-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of Cyanobacteria, Thermi, and Euryarchaeota, Of lymphomas by comparing the increase or decrease in the amount of lymphoma.
  • the normal person and the subject sample may be blood.
  • step (c) in step (c), at least one class bacterium selected from the group consisting of Deinococci, Chloroplast, and Betaproteobacteria And to diagnose lymphoma by comparing the increase or decrease in the content of the extracellular vesicles.
  • step (c) at least one of Deinococcales, Rickettsiales, Streptophyta, Rhizobiales, Oceanospirillales, , Pasteurellales, and Neisseriales in order to diagnose lymphoma by comparing the increase or decrease in the content of at least one out of the bacterium-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of Pseudomonas aeruginosa, Pasteurellales, and Neisseriales.
  • step (c) Erythrobacteraceae, Rhodospirillaceae, Deinococcaceae, Nocardioidaceae, ), Oxalobacteraceae, mitochondria, Lactobacillaceae, Ruminococcaceae, Halomonadaceae, Micrococcaceae, and the like. But are not limited to, Corynebacteriaceae, Propionibacteriaceae, Prevotellaceae, Burkholderiaceae, Actinomycetaceae, Tissierella spp. Tissierellaceae, Pasteurellaceae, Carnobacteriaceae, Neisseriaceae, and Alcanivoracaceae.
  • the term " familial " y) may be to diagnose lymphoma by comparing the increase or decrease in the content of extracellular vesicles derived from bacteria.
  • Extracellular vesicles derived from one or more classes of bacteria selected from the group consisting of Deinococci, Chloroplast, and Betaproteobacteria,
  • One or more order bacterial-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of:
  • Prevotellaceae Prevotellaceae, Burkholderiaceae, Actinomycetaceae, Tissierellaceae, Pasteurellaceae, Carnobacteriaceae, One or more family bacterial-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of Carnobacteriaceae, Neisseriaceae, and Alcanivoraceae, or
  • Rothia Actinomyces, Haemophilus, Peptoniphilus, Capnocytophaga, Lautropia, Granulicatella
  • step (c) as compared with a sample derived from a normal person,
  • Betaproteobacteria Bacteria-derived extracellular vesicles from the class
  • One or more order bacterial-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of Oceanospirillales, Pasteurellales, and Neisseriales,
  • Micrococcaceae Corynebacteriaceae, Propionibacteriaceae, Prevotellaceae, Burkholderiaceae, Actinomycetaceae, Actinomycetaceae, Bacillus thuringiensis, Selected from the group consisting of Tissierellaceae, Pasteurellaceae, Carnobacteriaceae, Neisseriaceae, and Alcanivoraceae.
  • Micrococcus Such as Micrococcus, Corynebacterium, Propionibacterium, Anaerococcus, Porphyromonas, Prevotella, Veillonella, but are not limited to, Rothia, Actinomyces, Haemophilus, Peptoniphilus, Capnocytophaga, Lautropia, Granulicatella, The amount of one or more genus bacterial extracellular vesicles selected from the group consisting of Finegoldia, Neisseria, Selenomonas, and Alcanivorax is increased Lymphomas can be diagnosed.
  • step (c) as compared with a sample derived from a normal person,
  • One or more phylum bacterial-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of Cyanobacteria, Thermi, and Euryarchaeota,
  • One or more order bacterial extracellular vesicles selected from the group consisting of Deinococcales, Rickettsiales, Streptophyta, and Rhizobiales,
  • Extracellular vesicles derived from one or more family members selected from the group consisting of Lactobacillaceae, Ruminococcaceae, and Halomonadaceae, or
  • Lymphocytes can be diagnosed when the content of one or more genus bacterial-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of the cells is decreased.
  • the blood may be whole blood, serum, plasma, or blood mononuclear cells.
  • the extracellular vesicles secreted by bacteria present in the environment are absorbed into the body and can directly affect cancer development, and lymphoma is difficult to treat effectively because it is difficult to diagnose early before symptoms occur.
  • the metagenome analysis of the extracellular vesicles derived from the bacterium using the human-derived sample according to the present invention can diagnose the risk factor of the lymphoma and diagnose the risk of the disease early, thereby diagnosing the early stage of the lymphoma, Or prevent the onset. In addition to this, early diagnosis can be performed after the onset of the disease, so that the incidence of lymphoma can be lowered and the therapeutic effect can be enhanced.
  • metagenome analysis can be used to diagnose the causative agent, , There is an advantage to prevent recurrence.
  • FIG. 1A is a photograph of distribution patterns of bacteria and vesicles after oral administration of intestinal bacteria and bacterial-derived vesicles (EV) to a mouse
  • FIG. 1B is a photograph of blood And various organs were extracted to evaluate the distribution patterns of bacteria and vesicles in the body.
  • FIG. 2 shows the distribution of bacterial-derived vesicles (EVs), which have significant diagnostic performance at the phylum level, by performing a metagenome analysis after separating bacterial-derived vesicles from lymphoma patients and normal blood.
  • EVs bacterial-derived vesicles
  • FIG. 3 shows the distribution of bacterial-derived vesicles (EVs) with diagnostic performance at the class level by performing a metagenome analysis after separating bacterial-derived vesicles from lymphoma patients and normal blood.
  • EVs bacterial-derived vesicles
  • Figure 4 shows the distribution of bacterial-derived vesicles (EVs) with diagnostic performance at the order level by performing a metagenome analysis after separating bacterial-derived vesicles from lymphoma and normal human blood.
  • EVs bacterial-derived vesicles
  • FIG. 5 is a graph showing the distribution of bacterial-derived vesicles (EVs) having a diagnostic performance at the family level by performing a metagenome analysis after separating bacterial-derived vesicles from lymphoma patients and normal blood.
  • EVs bacterial-derived vesicles
  • FIG. 6 shows the distribution of bacterial-derived vesicles (EVs), which have a diagnostic performance at the genus level by performing a metagenome analysis after separating bacterial-derived vesicles from lymphoma patients and normal blood.
  • EVs bacterial-derived vesicles
  • the present invention relates to a method for diagnosing lymphoma through the analysis of a bacterial metagenome.
  • the present inventors extracted a gene from a bacterial-derived extracellular vesicle using a sample derived from a normal person and an examinee, conducted a metagenome analysis thereof, The extracellular vesicles derived from bacteria that could act as factors were identified.
  • the present invention provides a method for detecting abnormalities in a sample, comprising the steps of: (a) extracting DNA from extracellular vesicles present in a normal person and a sample of a subject;
  • diagnosis of lymphoma means to determine whether the patient is likely to develop lymphoma, whether the likelihood of developing lymphoma is relatively high, or whether the lymphoma has already developed.
  • the method of the present invention can be used to slow the onset or prevent the onset of disease through special and appropriate management as a patient with a high risk of developing lymphoma in any particular patient.
  • the method of the present invention can be used clinically to determine treatment by early diagnosis of lymphoma and by selecting the most appropriate treatment regime.
  • metagenome refers to the total of genomes including all viruses, bacteria, fungi, etc. in an isolated area such as soil, It is used as a concept of a genome to explain the identification of many microorganisms at once by using a sequencer to analyze microorganisms that are not cultured mainly.
  • a metagenome is not a genome or a genome of a species, but a kind of mixed genome as a dielectric of all species of an environmental unit. This is a term derived from the viewpoint that when defining a species in the course of omics biology development, it functions not only as an existing species but also as a species that interacts with various species to form a complete species.
  • metagenomic analysis was carried out preferably using extracellular vesicles derived from bacteria isolated from blood.
  • the normal person and the subject sample may be blood or urine, and the blood may be preferably whole blood, serum, plasma, or blood mononuclear cells, but is not limited thereto.
  • the metagenomic analysis of the extracellular vesicles derived from the bacterium was performed and analyzed at the level of phylum, class, order, family, and genus, respectively To identify bacterial - derived vesicles that could actually act as a cause of lymphoma development.
  • the analysis of the bacterial metagenomes on vesicles present in blood samples from the subject revealed that the content of extracellular vesicles derived from Cyanobacteria, Thermi, and Euryarchaeota germs was significantly higher in patients with lymphoma There was a significant difference between normal subjects (see Example 4).
  • the bacterial metagenomes were analyzed at the river level for vesicles present in blood samples from the subject, and the results showed that the content of extracellular vesicles derived from Deinococci, Chloroplast, and Betaproteobacteria strong bacteria was significantly higher in patients with lymphoma There was a significant difference between normal subjects (see Example 4).
  • the bacterial metagenomes were analyzed at the neck level for vesicles present in a blood sample from the subject, and as a result, Deinococcales, Rickettsiales, Streptophyta, Rhizobiales, Oceanospirillales, Pasteurellales, and Neisseriales There was a significant difference in the content of outer vesicles between lymphoma patients and normal subjects (see Example 4).
  • the bacterial metagenomes were analyzed at a high level against vesicles present in a blood sample from a subject, and as a result, it was found that the bacteria metagenomes were identified as Erythrobacteraceae, Rhodospirillaceae, Deinococcaceae, Nocardioidaceae, Oxalobacteraceae, Mitochondria, Lactobacillaceae, Ruminococcaceae, Halomonadaceae, The contents of micrococcaceae, Corynebacteriaceae, Propionibacteriaceae, Prevotellaceae, Burkholderiaceae, Actinomycetaceae, Tissierellaceae, Pasteurellaceae, Carnobacteriaceae, Neisseriaceae, and Alcanivoraceae and bacterial-derived extracellular vesicles were significantly different between lymphoma patients and normal subjects (see Example 4).
  • the bacterial metagenomes were analyzed at a low level against the vesicles present in blood samples from the subject.
  • the bacterial metagenomes were found to be in the order of Cupriavidus, Deinococcus, Clostridium, Dialister, Faecalibacterium, Lactobacillus, Citrobacter, Micrococcus, Corynebacterium, The contents of extracellular vesicles derived from bacteria belonging to the genus of Propionibacterium, Anaerococcus, Porphyromonas, Prevotella, Veillonella, Rothia, Actinomyces, Haemophilus, Peptoniphilus, Capnocytophaga, Lautropia, Granulicatella, Finegoldia, Neisseria, Selenomonas and Alcanivorax were significantly (See Example 4).
  • Example 1 Analysis of intestinal absorption, distribution, and excretion of intestinal bacteria and bacterial-derived vesicles
  • blood was first added to a 10 ml tube and centrifuged (3,500 xg, 10 min, 4 ° C) to resuspend the supernatant and recover the supernatant. I moved.
  • Bacteria and foreign substances were removed from the recovered supernatant using a 0.22 mu m filter, transferred to centripreigugal filters 50 kD, centrifuged at 1500 xg for 15 minutes at 4 DEG C to discard substances smaller than 50 kD, ≪ / RTI > After removing bacteria and debris using a 0.22 ⁇ m filter, the supernatant was discarded using a Type 90 rotator at 150,000 x g for 3 hours at 4 ° C, and the supernatant was discarded. The pellet was dissolved in physiological saline (PBS) A vesicle was obtained.
  • PBS physiological saline
  • PCR was performed using the 16S rDNA primer shown in Table 1 to amplify the gene and perform sequencing (Illumina MiSeq sequencer).
  • the result is output to the Standard Flowgram Format (SFF) file and the SFF file is converted into the sequence file (.fasta) and the nucleotide quality score file using the GS FLX software (v2.9) (20 bps) and less than 99% of the average base call accuracy (Phred score ⁇ 20).
  • SFF Standard Flowgram Format
  • GS FLX software v2.9
  • clustering is performed based on sequence similarity of 94% for the genus, 90% for the family, 85% for the order, 80% for the class, and 75% for the phylum Bacteria with a sequence similarity of 97% or more were analyzed using the 16S DNA sequence database (108,453 sequence) of BLASTN and GreenGenes (QIIME).
  • Example 4 Isolated from blood Bacterial origin parcel Meta genome Analysis-based lymphoma diagnosis model
  • metagenomic sequencing was performed after separating vesicles from blood of 53 normal persons who matched 63 lymphoma patients with age and sex.
  • the diagnostic model first the p value between the two groups was less than 0.05 and the difference between the two groups was more than 2 times, and the logistic regression analysis was used to determine the diagnostic performance index AUC under curve, sensitivity, and specificity.
  • Bacterial-derived vesicles in the blood were analyzed at the family level and found to be in the order of Erythrobacteraceae, Rhodospirillaceae, Deinococcaceae, Nocardioidaceae, Oxalobacteraceae, Mitochondria, Lactobacillaceae, Ruminococcaceae, Halomonadaceae, Micrococcaceae, Corynebacteriaceae, Propionibacteriaceae, Prevotellaceae, Burkholderiaceae, Actinomycetaceae, Tissierellaceae, Pasteurellaceae, When diagnostic models were developed with Carnobacteriaceae, Neisseriaceae, and Alcanivoracaceae and bacterial biomarkers, the diagnostic performance of lymphomas was significant (see Table 5 and Figure 5).
  • Bacterial-derived vesicles in the blood were analyzed at the genus level and found to be in the order of Cupriavidus, Deinococcus, Clostridium, Dialister, Faecalibacterium, Lactobacillus, Citrobacter, Micrococcus, Corynebacterium, Propionibacterium, Anaerococcus, Porphyromonas, Prevotella, Veillonella, Rothia, Actinomyces, Haemophilus, When diagnostic models were developed with bacterial biomarkers from genus Peptoniphilus, Capnocytophaga, Lautropia, Granulicatella, Finegoldia, Neisseria, Selenomonas, and Alcanivorax, diagnostic performance for lymphoma was significant (see Table 6 and Figure 6).
  • the method of providing information on the diagnosis of lymphoma through the analysis of the bacterial metagenome according to the present invention is carried out by analyzing the bacterial metagenomes using samples derived from normal persons and the subject to analyze the increase and decrease of the content of the extracellular vesicles derived from a specific bacterium, And can be used to diagnose lymphoma.

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Abstract

본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 림프종을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 정상인 및 피검자 유래 샘플을 이용해 세균 메타게놈 분석을 수행하여 특정 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 림프종을 진단하는 방법 등에 관한 것이다. 환경에 존재하는 세균에서 분비되는 세포밖 소포는 체내에 흡수되어 암세포 발생에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며, 림프종은 증상이 나타나기 전 조기진단이 어려워 효율적인 치료가 어려운 실정이다. 이에, 본 발명에 따른 인체 유래 샘플을 이용한 세균 유래 세포밖　소포의 메타게놈 분석을 통해 림프종 발병의 위험도를 미리 예측함으로써 림프종의 위험군을 조기에 진단 및 예측하여 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있으며, 발병 후에도 조기진단 할 수 있어 림프종의 발병률을 낮추고 치료효과를 높일 수 있다.

Description

세균 메타게놈 분석을 통한 림프종 진단방법
본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 림프종을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 정상인 및 피검자 유래 샘플을 이용해 세균 메타게놈 분석을 수행하여 특정 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 림프종을 진단하는 방법 등에 관한 것이다.
림프종은 림프계 세포에서 기원한 혈액암의 일종으로서, 주로 림프절(Lymph node)에서 기원하지만 림프 관련 조직이면 어디서든지 발생할 수 있다. 대표적인 증상으로는 림프절 종대, 야간 발한, 열, 체중 감소, 피곤함 등이 있다. 커진 림프절은 통증이 없는데, 이를 통해 감염에 의한 림프절 종대와 구분된다. 기본적으로 혈액암이기 때문에 수술적 치료는 대개 기대할 수 없고, 대신 항암화학요법이나 방사선 치료 등이 잘 듣는다. 2011년에 발표된 한국중앙암등록본부 자료에 의하면 2009년에 우리나라에서는 연평균 192,561건의 암이 발생되었는데, 그 중 악성림프종은 남녀를 합쳐서 연 평균 4,093건으로 전체 암 발생의 2.13%를 차지하였다. 남녀 발생건수는 남자가 연평균 2,313건, 여자가 연 평균 1,780건이었다. 남녀를 합쳐서 본 연령대별로는 60대가 22.1%로 가장 많고, 50대와 70대가 19.3%, 40대가 15.4%의 순이다.
림프종의 위험요인으로 감염이나 비정상 면역조절이 림프종 발생의 원인 중 하나로 알려져 있다. HTLV-1 감염, 후천성면역결핍바이러스와 연관된 림프종, 만성C형 간염 연관 림프종, EB 바이러스와 연관된 버킷림프종과 NK/T 림프종, 헬리코박터균과 연관된 림프종 등이 감염과 관련이 있다고 알려져 있다. 또한, 면역이 저하된 상태에서도 림프종이 발생할 수 있으며, 장기 이식, 후천면역결핍증, 선천면역결핍증후군, 자가면역질환 등에서 발생빈도가 증가하는 것으로 알려져 있다. 림프종 진단은 대개 림프절 생검으로 진단할 수 있고, 병리조직을 얻으면 기본적인 염색과 더불어 면역조직화학염색을 시행하여 종류를 구분한다. 타 장기 관여 여부는 PET-CT 등을 통해 알 수 있다.
한편, 인체에 공생하는 미생물은 100조에 이르러 인간 세포보다 10배 많으며, 미생물의 유전자수는 인간 유전자수의 100배가 넘는 것으로 알려지고 있다. 미생물총(microbiota)은 주어진 거주지에 존재하는 세균(bacteria), 고세균(archaea), 진핵생물(eukarya)을 포함한 미생물 군집(microbial community)을 말하고, 장내 미생물총은 사람의 생리현상에 중요한 역할을 하며, 인체 세포와 상호작용을 통해 인간의 건강과 질병에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 우리 몸에 공생하는 세균은 다른 세포로의 유전자, 단백질, 저분자화합물 등의 정보를 교환하기 위하여 나노미터 크기의 소포(vesicle)를 분비한다. 점막은 200 나노미터(nm) 크기 이상의 입자는 통과할 수 없는 물리적인 방어막을 형성하여 점막에 공생하는 세균인 경우에는 점막을 통과하지 못하지만, 세균 유래 소포는 크기가 대개 100 나노미터 크기 이하라서 비교적 자유롭게 점막을 통과하여 우리 몸에 흡수된다.
환경 유전체학이라고도 불리는 메타게놈학은 환경에서 채취한 샘플에서 얻은 메타게놈 자료에 대한 분석학이라고 할 수 있다(국내공개특허 제2011-073049호). 최근 16s 리보솜 RNA(16s rRNA) 염기서열을 기반으로 한 방법으로 인간의 미생물총의 세균 구성을 목록화하는 것이 가능해졌으며, 16s 리보솜 RNA의 유전자인 16s rDNA 염기서열을 차세대 염기서열분석 (next generation sequencing, NGS) 플랫폼을 이용하여 분석한다. 그러나 아직까지 림프종 발병에 있어서, 혈액 또는 소변 등의 인체 유래물에서 세균 유래 소포에 존재하는 메타게놈 분석을 통해 림프종의 원인인자를 동정하고 림프종을 예측하거나 혹은 진단하는 방법에 대해서는 보고된 바가 없다.
본 발명자들은 림프종의 원인인자 및 발병 위험도를 미리 진단하기 위하여, 정상인 및 피검자 유래 샘플인 혈액에 존재하는 세균 유래 세포밖 소포로부터 유전자를 추출하고 이에 대하여 메타게놈 분석을 수행하였으며, 그 결과 림프종의 원인인자로 작용할 수 있는 세균 유래 세포밖 소포를 동정하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 세균 유래 세포밖 소포에 대한 메타게놈 분석을 통해 림프종을 진단하기 위한 정보제공방법, 림프종 진단방법, 및 림프종 발병 위험도 예측 방법 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 림프종 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
(a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 PCR (Polymerase Chain Reaction) 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 림프종 진단방법을 제공한다.
(a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 PCR (Polymerase Chain Reaction) 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 림프종 발병 위험도 예측방법을 제공한다.
(a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 PCR (Polymerase Chain Reaction) 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
본 발명의 구현예로, 상기 (c) 단계에서 시아노박테리아(Cyanobacteria), 써미(Thermi), 및 유리아케오타(Euryarchaeota)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하여 림프종을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 정상인 및 피검자 샘플은 혈액일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 데이노코키(Deinococci), 클로로플라스트(Chloroplast), 및 베타프로테오박테리아(Betaproteobacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하여 림프종을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 데이노코카레스(Deinococcales), 리케치아레스(Rickettsiales), 스트렙토피타(Streptophyta), 리조비알레스(Rhizobiales), 오세아노스피릴라레스(Oceanospirillales), 파스테우렐라레스(Pasteurellales), 및 나이세리아레스(Neisseriales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하여 림프종을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 에리스로박테라시에(Erythrobacteraceae), 로도스피릴라시에(Rhodospirillaceae), 데이노코카시에(Deinococcaceae), 노카르디오이다시에(Nocardioidaceae), 옥살로박테라시에(Oxalobacteraceae), 미토콘드리아(mitochondria), 락토바실라시에(Lactobacillaceae), 루미노코카시에(Ruminococcaceae), 할로모나다시에(Halomonadaceae), 마이크로코카세아에(Micrococcaceae), 코리네박테리아시에(Corynebacteriaceae), 프로피박테리아시에(Propionibacteriaceae), 프레보텔라시에(Prevotellaceae), 버크홀데리아시에(Burkholderiaceae), 엑티노마이세타시에(Actinomycetaceae), 티시에렐라시에(Tissierellaceae), 파스테우렐라시에(Pasteurellaceae), 카르노박테리아시에(Carnobacteriaceae), 나이세리아시에(Neisseriaceae), 및 알카니보락사시에(Alcanivoracaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하여 림프종을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 쿠프리아비두스(Cupriavidus), 데이노코커스(Deinococcus), 클로스트리듐(Clostridium), 디알리스터(Dialister), 패칼리박테리움(Faecalibacterium), 락토바실러스(Lactobacillus), 시트로박터(Citrobacter), 마이크로코커스(Micrococcus), 코리네박테리움(Corynebacterium), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 아내로코커스(Anaerococcus), 포르피로모나스(Porphyromonas), 프레보텔라(Prevotella), 베일로넬라(Veillonella), 로티아(Rothia), 엑티노마이세스(Actinomyces), 헤모필루스(Haemophilus), 펩토니펠러스(Peptoniphilus), 카프노사이토파가(Capnocytophaga), 라우트로피아(Lautropia), 그라눌리카텔라(Granulicatella), 피네골디아(Finegoldia), 나이세리아(Neisseria), 셀레노모나스(Selenomonas), 및 알카니보락스(Alcanivorax)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하여 림프종을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 시아노박테리아(Cyanobacteria), 써미(Thermi), 및 유리아케오타(Euryarchaeota)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
데이노코키(Deinococci), 클로로플라스트(Chloroplast), 및 베타프로테오박테리아(Betaproteobacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
데이노코카레스(Deinococcales), 리케치아레스(Rickettsiales), 스트렙토피타(Streptophyta), 리조비알레스(Rhizobiales), 오세아노스피릴라레스(Oceanospirillales), 파스테우렐라레스(Pasteurellales), 및 나이세리아레스(Neisseriales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
에리스로박테라시에(Erythrobacteraceae), 로도스피릴라시에(Rhodospirillaceae), 데이노코카시에(Deinococcaceae), 노카르디오이다시에(Nocardioidaceae), 옥살로박테라시에(Oxalobacteraceae), 미토콘드리아(mitochondria), 락토바실라시에(Lactobacillaceae), 루미노코카시에(Ruminococcaceae), 할로모나다시에(Halomonadaceae), 마이크로코카세아에(Micrococcaceae), 코리네박테리아시에(Corynebacteriaceae), 프로피박테리아시에(Propionibacteriaceae), 프레보텔라시에(Prevotellaceae), 버크홀데리아시에(Burkholderiaceae), 엑티노마이세타시에(Actinomycetaceae), 티시에렐라시에(Tissierellaceae), 파스테우렐라시에(Pasteurellaceae), 카르노박테리아시에(Carnobacteriaceae), 나이세리아시에(Neisseriaceae), 및 알카니보락사시에(Alcanivoracaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
쿠프리아비두스(Cupriavidus), 데이노코커스(Deinococcus), 클로스트리듐(Clostridium), 디알리스터(Dialister), 패칼리박테리움(Faecalibacterium), 락토바실러스(Lactobacillus), 시트로박터(Citrobacter), 마이크로코커스(Micrococcus), 코리네박테리움(Corynebacterium), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 아내로코커스(Anaerococcus), 포르피로모나스(Porphyromonas), 프레보텔라(Prevotella), 베일로넬라(Veillonella), 로티아(Rothia), 엑티노마이세스(Actinomyces), 헤모필루스(Haemophilus), 펩토니펠러스(Peptoniphilus), 카프노사이토파가(Capnocytophaga), 라우트로피아(Lautropia), 그라눌리카텔라(Granulicatella), 피네골디아(Finegoldia), 나이세리아(Neisseria), 셀레노모나스(Selenomonas), 및 알카니보락스(Alcanivorax)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여,
베타프로테오박테리아(Betaproteobacteria) 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
오세아노스피릴라레스(Oceanospirillales), 파스테우렐라레스(Pasteurellales), 및 나이세리아레스(Neisseriales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
마이크로코카세아에(Micrococcaceae), 코리네박테리아시에(Corynebacteriaceae), 프로피박테리아시에(Propionibacteriaceae), 프레보텔라시에(Prevotellaceae), 버크홀데리아시에(Burkholderiaceae), 엑티노마이세타시에(Actinomycetaceae), 티시에렐라시에(Tissierellaceae), 파스테우렐라시에(Pasteurellaceae), 카르노박테리아시에(Carnobacteriaceae), 나이세리아시에(Neisseriaceae), 및 알카니보락사시에(Alcanivoracaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
마이크로코커스(Micrococcus), 코리네박테리움(Corynebacterium), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 아내로코커스(Anaerococcus), 포르피로모나스(Porphyromonas), 프레보텔라(Prevotella), 베일로넬라(Veillonella), 로티아(Rothia), 엑티노마이세스(Actinomyces), 헤모필루스(Haemophilus), 펩토니펠러스(Peptoniphilus), 카프노사이토파가(Capnocytophaga), 라우트로피아(Lautropia), 그라눌리카텔라(Granulicatella), 피네골디아(Finegoldia), 나이세리아(Neisseria), 셀레노모나스(Selenomonas), 및 알카니보락스(Alcanivorax)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 증가되어 있는 경우 림프종으로 진단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여,
시아노박테리아(Cyanobacteria), 써미(Thermi), 및 유리아케오타(Euryarchaeota)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
데이노코키(Deinococci) 및 클로로플라스트(Chloroplast)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
데이노코카레스(Deinococcales), 리케치아레스(Rickettsiales), 스트렙토피타(Streptophyta), 및 리조비알레스(Rhizobiales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
에리스로박테라시에(Erythrobacteraceae), 로도스피릴라시에(Rhodospirillaceae), 데이노코카시에(Deinococcaceae), 노카르디오이다시에(Nocardioidaceae), 옥살로박테라시에(Oxalobacteraceae), 미토콘드리아(mitochondria), 락토바실라시에(Lactobacillaceae), 루미노코카시에(Ruminococcaceae), 및 할로모나다시에(Halomonadaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
쿠프리아비두스(Cupriavidus), 데이노코커스(Deinococcus), 클로스트리듐(Clostridium), 디알리스터(Dialister), 패칼리박테리움(Faecalibacterium), 락토바실러스(Lactobacillus), 및 시트로박터(Citrobacter)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소되어 있는 경우 림프종으로 진단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 혈액은 전혈, 혈청, 혈장, 또는 혈액 단핵구일 수 있다.
환경에 존재하는 세균에서 분비되는 세포밖 소포는 체내에 흡수되어 암 발생에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며, 림프종은 증상이 나타나기 전 조기진단이 어려워 효율적인 치료가 어려운 실정이다. 이에, 본 발명에 따른 인체 유래 샘플을 이용한 세균 유래 세포밖　소포의 메타게놈 분석을 통해 림프종의 원인인자 및 발병의 위험도를 미리 진단함으로써 림프종의 위험군을 조기에 진단하여 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있다. 이에 더하여, 발병 후에도 조기진단 할 수 있어 림프종의 발병률을 낮추고 치료효과를 높일 수 있을 뿐 아니라, 림프종으로 진단받은 환자에서 메타게놈 분석을 통해 원인인자를 진단하여 노출을 피함으로써 질병의 경과를 좋게 하거나, 재발을 막을 수 있는 장점이 있다.
도 1a는, 마우스에 장내 세균과 세균유래 소포 (EV)를 구강으로 투여한 후, 시간별로 세균과 소포의 분포양상을 촬영한 사진이고, 도 1b는 구강으로 투여한 후 12시간째에, 혈액 및 여러 장기를 적출하여, 세균과 소포의 체내 분포양상을 평가한 그림이다.
도 2는 림프종환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 문(phylum) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 3은 림프종환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 강(class) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 4는 림프종환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 목(order) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 5는 림프종환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 과(family) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 6은 림프종환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 속(genus) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 림프종을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명자들은 정상인 및 피검자 유래 샘플을 이용해 세균 유래 세포밖 소포로부터 유전자를 추출하고 이에 대하여 메타게놈 분석을 수행하였으며, 림프종의 원인인자로 작용할 수 있는 세균 유래 세포밖 소포를 동정하였다.
이에, 본 발명은 (a) 정상인 및 피검자 샘플에 존재하는 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 포함하는 림프종을 진단하기 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "림프종 진단" 이란 환자에 대하여 림프종이 발병할 가능성이 있는지, 림프종이 발병할 가능성이 상대적으로 높은지, 또는 림프종이 이미 발병하였는지 여부를 판별하는 것을 의미한다. 본 발명의 방법은 임의의 특정 환자에 대한 림프종 발병 위험도가 높은 환자로써 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하는데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 림프종을 조기에 진단하여 가장 적절한 치료방식을 선택함으로써 치료를 결정하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "메타게놈(metagenome)"이란 "군유전체"라고도 하며, 흙, 동물의 장 등 고립된 지역 내의 모든 바이러스, 세균, 곰팡이 등을 포함하는 유전체의 총합을 의미하는 것으로, 주로 배양이 되지 않는 미생물을 분석하기 위해서 서열분석기를 사용하여 한꺼번에 많은 미생물을 동정하는 것을 설명하는 유전체의 개념으로 쓰인다. 특히, 메타게놈은 한 종의 게놈 또는 유전체를 말하는 것이 아니라, 한 환경단위의 모든 종의 유전체로서 일종의 혼합유전체를 말한다. 이는 오믹스적으로 생물학이 발전하는 과정에서 한 종을 정의할 때 기능적으로 기존의 한 종뿐만 아니라, 다양한 종이 서로 상호작용하여 완전한 종을 만든다는 관점에서 나온 용어이다. 기술적으로는 빠른 염기서열분석법을 이용해서, 종에 관계없이 모든 DNA, RNA를 분석하여, 한 환경 내에서의 모든 종을 동정하고, 상호작용, 대사작용을 규명하는 기법의 대상이다. 본 발명에서는 바람직하게 혈액에서 분리한 세균 유래 세포밖　소포를 이용하여 메타게놈 분석을 실시하였다.
본 발명에 있어서, 상기 정상인 및 피검자 샘플은 혈액 또는 소변일 수 있고, 상기 혈액은 바람직하게 전혈, 혈청, 혈장, 또는 혈액 단핵구일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예에서는 상기 세균 유래 세포밖 소포에 대한 메타게놈 분석을 실시하였으며, 문(phylum), 강(class), 목(order), 과(family), 및 속(genus) 수준에서 각각 분석하여 실제로 림프종 발생의 원인으로 작용할 수 있는 세균 유래 소포를 동정하였다.
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 문 수준에서 분석한 결과, Cyanobacteria, Thermi, 및 Euryarchaeota 문 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 림프종환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 강 수준에서 분석한 결과, Deinococci, Chloroplast, 및 Betaproteobacteria 강 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 림프종환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 목 수준에서 분석한 결과, Deinococcales, Rickettsiales, Streptophyta, Rhizobiales, Oceanospirillales, Pasteurellales, 및 Neisseriales 목 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 림프종환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 과 수준에서 분석한 결과, Erythrobacteraceae, Rhodospirillaceae, Deinococcaceae, Nocardioidaceae, Oxalobacteraceae, mitochondria, Lactobacillaceae, Ruminococcaceae, Halomonadaceae, Micrococcaceae, Corynebacteriaceae, Propionibacteriaceae, Prevotellaceae, Burkholderiaceae, Actinomycetaceae, Tissierellaceae, Pasteurellaceae, Carnobacteriaceae, Neisseriaceae, 및 Alcanivoracaceae 과 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 림프종환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 피검자 유래 혈액 샘플에 존재하는 소포에 대하여 세균 메타게놈을 속 수준에서 분석한 결과, Cupriavidus, Deinococcus, Clostridium, Dialister, Faecalibacterium, Lactobacillus, Citrobacter, Micrococcus, Corynebacterium, Propionibacterium, Anaerococcus, Porphyromonas, Prevotella, Veillonella, Rothia, Actinomyces, Haemophilus, Peptoniphilus, Capnocytophaga, Lautropia, Granulicatella, Finegoldia, Neisseria, Selenomonas, 및 Alcanivorax 속 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 림프종환자와 정상인에 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
상기 실시예 결과를 통해 상기 동정된 세균 유래 세포밖 소포의 분포 변수가 림프종 발생 예측에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 장내 세균 및 세균 유래 소포의 체내 흡수, 분포, 및 배설 양상 분석
장내 세균과 세균 유래 소포가 위장관을 통해 전신적으로 흡수되는 지를 평가하기 위하여 다음과 같은 방법으로 실험을 수행하였다. 마우스의 위장에 형광으로 표지한 장내세균과 장내 세균 유래 소포를 각각 50 μg의 용량으로 위장관으로 투여하고 0분, 5분, 3시간, 6시간, 12시간 후에 형광을 측정하였다. 마우스 전체 이미지를 관찰한 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 상기 세균(Bacteria)인 경우에는 전신적으로 흡수되지 않았지만, 세균 유래 소포(EV)인 경우에는, 투여 후 5분에 전신적으로 흡수되었고, 투여 3시간 후에는 방광에 형광이 진하게 관찰되어, 소포가 비뇨기계로 배설됨을 알 수 있었다. 또한, 소포는 투여 12시간까지 체내에 존재함을 알 수 있었다.
장내세균과 장내 세균유래 소포가 전신적으로 흡수된 후, 여러 장기로 침윤된 양상을 평가하기 위하여, 형광으로 표지한 50 μg의 세균과 세균유래 소포를 상기의 방법과 같이 투여한 다음 12시간째에 마우스로부터 혈액(Blood), 심장(Heart), 폐(Lung), 간(Liver), 신장(Kidney), 비장(Spleen), 지방조직(Adipose tissue), 및 근육(Muscle)을 적출하였다. 상기 적출한 조직들에서 형광을 관찰한 결과, 도1b에 나타낸 바와 같이, 상기 장내 세균(Bacteria)은 각 장기에 흡수되지 않은 반면, 상기 장내 세균 유래 세포밖 소포(EV)는 혈액, 심장, 폐, 간, 신장, 비장, 지방조직, 및 근육에 분포하는 것을 확인하였다.
실시예 2. 혈액으로부터 세포밖 소포 분리 및 DNA 추출
혈액에 존재하는 소포를 분리하고 DNA를 추출하기 위해, 먼저 10 ㎖ 튜브에 혈액을 넣고 원심분리(3,500 x g, 10min, 4℃)를 실시하여 부유물을 가라앉혀 상등액만을 회수한 후 새로운 10 ㎖ 튜브에 옮겼다. 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 상기 회수한 상등액으로부터 세균 및 이물질을 제거한 후, 센트리프랩튜브(centripreigugal filters 50 kD)에 옮기고 1500 x g, 4℃에서 15분간 원심분리하여 50 kD 보다 작은 물질은 버리고 10 ㎖까지 농축 시켰다. 다시 한 번 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 박테리아 및 이물질을 제거한 후, Type 90ti 로터로 150,000 x g, 4℃에서 3시간 동안 초고속원심분리방법을 사용하여 상등액을 버리고 덩어리진 pellet을 생리식염수(PBS)로 녹여 소포를 수득하였다.
상기 방법에 따라 혈액으로부터 분리한 소포 100 ㎕를 100℃에서 끓여서 내부의 DNA를 지질 밖으로 나오게 한 후 얼음에 5분 동안 식혔다. 다음으로 남은 부유물을 제거하기 위하여 10,000 x g, 4℃에서 30분간 원심분리하고 상등액 만을 모은 후 Nanodrop을 이용하여 DNA 양을 정량하였다. 이후 상기 추출된 DNA에 세균 유래 DNA가 존재하는지 확인하기 위하여 하기 표 1에 나타낸 16s rDNA primer로 PCR을 수행하여 상기 추출된 유전자에 세균 유래 유전자가 존재하는 것을 확인하였다.
primer 서열 서열번호
16S rDNA 16S_V3_F 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3' 1
16S_V4_R 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3' 2
실시예 3. 혈액에서 추출한 DNA를 이용한 메타게놈 분석
상기 실시예 2의 방법으로 유전자를 추출한 후, 상기 표1에 나타낸 16S rDNA 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하여 유전자를 증폭시키고 시퀀싱(Illumina MiSeq sequencer)을 수행하였다. 결과를 Standard Flowgram Format(SFF) 파일로 출력하고 GS FLX software(v2.9)를 이용하여 SFF 파일을 sequence 파일(.fasta)과 nucleotide quality score 파일로 변환한 다음 리드의 신용도 평가를 확인하고, window(20 bps) 평균 base call accuracy가 99% 미만(Phred score <20)인 부분을 제거하였다. 질이 낮은 부분을 제거한 후, 리드의 길이가 300 bps 이상인 것만 이용하였으며(Sickle version 1.33), 결과 분석을 위해 Operational Taxonomy Unit(OTU)은 UCLUST와 USEARCH를 이용하여 시퀀스 유사도에 따라 클러스터링을 수행하였다. 구체적으로 속(genus)은 94%, 과(family)는 90%, 목(order)은 85%, 강(class)은 80%, 문(phylum)은 75% 시퀀스 유사도를 기준으로 클러스터링을 하고 각 OTU의 문, 강, 목, 과, 속 레벨의 분류를 수행하고, BLASTN와 GreenGenes의 16S DNA 시퀀스 데이터베이스(108,453 시퀀스)를 이용하여 97% 이상의 시퀀스 유사도 갖는 박테리아를 분석하였다(QIIME).
실시예 4. 혈액에서 분리한 세균유래 소포 메타게놈 분석 기반 림프종 진단모형
상기 실시예 3의 방법으로, 림프종환자 63명과 나이와 성별을 매칭한 정상인 53명의 혈액에서 소포를 분리한 후 메타게놈 시퀀싱을 수행하였다. 진단모형 개발은 먼저 t-test에서 두 군 사이의 p값이 0.05 이하이고, 두 군 사이에 2배 이상 차이가 나는 균주를 선정하고 난 후, logistic regression analysis 방법으로 진단적 성능 지표인 AUC(area under curve), 민감도, 및 특이도를 산출하였다.
혈액 내 세균유래 소포를 문(phylum) 수준에서 분석한 결과, Cyanobacteria, Thermi, 및 Euryarchaeota 문 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 림프종에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 2 및 도 2 참조).
　 대조군 림프종 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC Accuracy sensitivity specificity
p__Cyanobacteria 0.0232 0.0369 0.0059 0.0142 0.0022 0.25 0.74 0.66 0.40 0.87
p__[Thermi] 0.0030 0.0059 0.0002 0.0008 0.0016 0.08 0.71 0.66 0.34 0.94
p__Euryarchaeota 0.0009 0.0022 0.0000 0.0002 0.0039 0.03 0.63 0.63 0.21 0.98
혈액 내 세균유래 소포를 강(class) 수준에서 분석한 결과, Deinococci, Chloroplast, 및 Betaproteobacteria 강 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 림프종에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 3 및 도 3 참조).
　 대조군 림프종 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC Accuracy sensitivity specificity
c__Deinococci 0.0030 0.0059 0.0002 0.0008 0.0016 0.08 0.71 0.66 0.34 0.94
c__Chloroplast 0.0216 0.0365 0.0057 0.0142 0.0043 0.26 0.71 0.67 0.40 0.90
c__Betaproteobacteria 0.0408 0.0440 0.1045 0.0486 0.0000 2.56 0.91 0.88 0.87 0.89
혈액 내 세균유래 소포를 목(order) 수준에서 분석한 결과, Deinococcales, Rickettsiales, Streptophyta, Rhizobiales, Oceanospirillales, Pasteurellales, 및 Neisseriales 목 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 림프종에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 4 및 도 4 참조).
　 대조군 림프종 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC Accuracy sensitivity specificity
o__Deinococcales 0.0026 0.0059 0.0002 0.0008 0.0054 0.09 0.66 0.65 0.30 0.94
o__Rickettsiales 0.0017 0.0033 0.0003 0.0014 0.0048 0.19 0.65 0.63 0.26 0.94
o__Streptophyta 0.0211 0.0364 0.0057 0.0142 0.0055 0.27 0.70 0.66 0.38 0.90
o__Rhizobiales 0.0125 0.0161 0.0040 0.0062 0.0007 0.32 0.73 0.66 0.45 0.84
o__Oceanospirillales 0.0079 0.0101 0.0176 0.0130 0.0000 2.24 0.75 0.68 0.66 0.70
o__Pasteurellales 0.0050 0.0059 0.0240 0.0245 0.0000 4.80 0.77 0.71 0.77 0.65
o__Neisseriales 0.0170 0.0447 0.0899 0.0486 0.0000 5.29 0.94 0.90 0.89 0.90
혈액 내 세균유래 소포를 과(family) 수준에서 분석한 결과, Erythrobacteraceae, Rhodospirillaceae, Deinococcaceae, Nocardioidaceae, Oxalobacteraceae, mitochondria, Lactobacillaceae, Ruminococcaceae, Halomonadaceae, Micrococcaceae, Corynebacteriaceae, Propionibacteriaceae, Prevotellaceae, Burkholderiaceae, Actinomycetaceae, Tissierellaceae, Pasteurellaceae, Carnobacteriaceae, Neisseriaceae, 및 Alcanivoracaceae 과 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 림프종에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 5 및 도 5 참조).
　 대조군 림프종 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC Accuracy sensitivity specificity
f__Erythrobacteraceae 0.0038 0.0069 0.0000 0.0001 0.0002 0.00 0.71 0.71 0.38 0.98
f__Rhodospirillaceae 0.0011 0.0023 0.0001 0.0004 0.0036 0.07 0.64 0.64 0.25 0.97
f__Deinococcaceae 0.0026 0.0059 0.0002 0.0008 0.0056 0.09 0.66 0.64 0.28 0.94
f__Nocardioidaceae 0.0021 0.0037 0.0002 0.0012 0.0008 0.11 0.70 0.65 0.30 0.94
f__Oxalobacteraceae 0.0094 0.0143 0.0013 0.0022 0.0002 0.14 0.73 0.66 0.43 0.84
f__mitochondria 0.0017 0.0032 0.0003 0.0014 0.0055 0.19 0.64 0.63 0.26 0.94
f__Lactobacillaceae 0.0450 0.0527 0.0126 0.0129 0.0001 0.28 0.77 0.72 0.57 0.86
f__Ruminococcaceae 0.0678 0.0531 0.0221 0.0228 0.0000 0.33 0.78 0.73 0.55 0.89
f__Halomonadaceae 0.0075 0.0099 0.0030 0.0055 0.0050 0.40 0.64 0.67 0.42 0.89
f__Micrococcaceae 0.0095 0.0094 0.0195 0.0147 0.0000 2.04 0.73 0.62 0.62 0.62
f__Corynebacteriaceae 0.0602 0.1119 0.1262 0.0852 0.0007 2.09 0.81 0.78 0.74 0.83
f__Propionibacteriaceae 0.0276 0.0296 0.0607 0.0318 0.0000 2.20 0.82 0.78 0.79 0.76
f__Prevotellaceae 0.0120 0.0187 0.0363 0.0412 0.0001 3.02 0.73 0.67 0.75 0.60
f__Burkholderiaceae 0.0013 0.0026 0.0043 0.0067 0.0019 3.19 0.65 0.57 0.68 0.48
f__Actinomycetaceae 0.0017 0.0027 0.0062 0.0076 0.0000 3.65 0.71 0.61 0.68 0.56
f__[Tissierellaceae] 0.0059 0.0113 0.0270 0.0230 0.0000 4.59 0.85 0.78 0.79 0.76
f__Pasteurellaceae 0.0050 0.0059 0.0240 0.0245 0.0000 4.81 0.77 0.71 0.77 0.65
f__Carnobacteriaceae 0.0007 0.0018 0.0037 0.0060 0.0003 5.12 0.63 0.61 0.83 0.43
f__Neisseriaceae 0.0170 0.0447 0.0899 0.0486 0.0000 5.29 0.94 0.90 0.89 0.90
f__Alcanivoracaceae 0.0004 0.0014 0.0146 0.0117 0.0000 39.30 0.93 0.91 0.94 0.87
혈액 내 세균유래 소포를 속(genus) 수준에서 분석한 결과, Cupriavidus, Deinococcus, Clostridium, Dialister, Faecalibacterium, Lactobacillus, Citrobacter, Micrococcus, Corynebacterium, Propionibacterium, Anaerococcus, Porphyromonas, Prevotella, Veillonella, Rothia, Actinomyces, Haemophilus, Peptoniphilus, Capnocytophaga, Lautropia, Granulicatella, Finegoldia, Neisseria, Selenomonas, 및 Alcanivorax 속 세균 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 림프종에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 6 및 도 6 참조).
　 대조군 림프종 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC Accuracy sensitivity specificity
g__Cupriavidus 0.0048 0.0105 0.0003 0.0011 0.0032 0.05 0.68 0.67 0.36 0.94
g__Deinococcus 0.0026 0.0059 0.0002 0.0008 0.0056 0.09 0.66 0.64 0.28 0.94
g__Clostridium 0.0064 0.0120 0.0007 0.0021 0.0013 0.11 0.68 0.66 0.38 0.90
g__Dialister 0.0037 0.0061 0.0006 0.0015 0.0007 0.16 0.68 0.65 0.38 0.87
g__Faecalibacterium 0.0074 0.0100 0.0014 0.0025 0.0001 0.18 0.69 0.70 0.45 0.90
g__Lactobacillus 0.0441 0.0527 0.0126 0.0129 0.0001 0.29 0.77 0.73 0.58 0.86
g__Citrobacter 0.0043 0.0058 0.0013 0.0033 0.0014 0.30 0.70 0.65 0.40 0.86
g__Micrococcus 0.0029 0.0045 0.0059 0.0049 0.0010 2.04 0.71 0.63 0.64 0.62
g__Corynebacterium 0.0602 0.1119 0.1262 0.0852 0.0007 2.09 0.81 0.78 0.74 0.83
g__Propionibacterium 0.0275 0.0295 0.0607 0.0318 0.0000 2.21 0.82 0.78 0.79 0.76
g__Anaerococcus 0.0035 0.0080 0.0092 0.0098 0.0011 2.60 0.77 0.75 0.83 0.68
g__Porphyromonas 0.0017 0.0040 0.0044 0.0063 0.0064 2.61 0.63 0.61 0.79 0.46
g__Prevotella 0.0120 0.0187 0.0363 0.0412 0.0001 3.02 0.73 0.67 0.75 0.60
g__Veillonella 0.0066 0.0145 0.0202 0.0214 0.0001 3.07 0.78 0.73 0.81 0.67
g__Rothia 0.0028 0.0040 0.0113 0.0122 0.0000 4.08 0.73 0.70 0.79 0.62
g__Actinomyces 0.0013 0.0023 0.0061 0.0076 0.0000 4.58 0.72 0.65 0.74 0.57
g__Haemophilus 0.0047 0.0059 0.0219 0.0232 0.0000 4.68 0.77 0.72 0.79 0.67
g__Peptoniphilus 0.0010 0.0034 0.0048 0.0093 0.0040 4.75 0.70 0.67 0.85 0.52
g__Capnocytophaga 0.0005 0.0014 0.0022 0.0039 0.0015 4.81 0.61 0.55 0.81 0.33
g__Lautropia 0.0007 0.0020 0.0037 0.0059 0.0005 4.94 0.67 0.62 0.81 0.46
g__Granulicatella 0.0007 0.0018 0.0037 0.0059 0.0003 5.36 0.64 0.62 0.83 0.44
g__Finegoldia 0.0012 0.0026 0.0128 0.0178 0.0000 10.61 0.83 0.76 0.85 0.68
g__Neisseria 0.0012 0.0019 0.0130 0.0141 0.0000 10.79 0.79 0.75 0.85 0.67
g__Selenomonas 0.0001 0.0005 0.0012 0.0032 0.0066 13.94 0.66 0.59 0.55 0.62
g__Alcanivorax 0.0004 0.0014 0.0146 0.0117 0.0000 39.30 0.93 0.91 0.94 0.87
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 따른 세균 메타게놈 분석을 통해 림프종 진단에 대한 정보를 제공하는 방법은 정상인 및 피검자 유래 샘플을 이용해 세균 메타게놈 분석을 수행하여 특정 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 림프종의 발병 위험도를 예측하고 림프종을 진단하는데 이용할 수 있다.

Claims (20)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 림프종 진단을 위한 정보제공방법:
    (a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 시아노박테리아(Cyanobacteria), 써미(Thermi), 및 유리아케오타(Euryarchaeota)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 데이노코키(Deinococci), 클로로플라스트(Chloroplast), 및 베타프로테오박테리아(Betaproteobacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 데이노코카레스(Deinococcales), 리케치아레스(Rickettsiales), 스트렙토피타(Streptophyta), 리조비알레스(Rhizobiales), 오세아노스피릴라레스(Oceanospirillales), 파스테우렐라레스(Pasteurellales), 및 나이세리아레스(Neisseriales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 에리스로박테라시에(Erythrobacteraceae), 로도스피릴라시에(Rhodospirillaceae), 데이노코카시에(Deinococcaceae), 노카르디오이다시에(Nocardioidaceae), 옥살로박테라시에(Oxalobacteraceae), 미토콘드리아(mitochondria), 락토바실라시에(Lactobacillaceae), 루미노코카시에(Ruminococcaceae), 할로모나다시에(Halomonadaceae), 마이크로코카세아에(Micrococcaceae), 코리네박테리아시에(Corynebacteriaceae), 프로피박테리아시에(Propionibacteriaceae), 프레보텔라시에(Prevotellaceae), 버크홀데리아시에(Burkholderiaceae), 엑티노마이세타시에(Actinomycetaceae), 티시에렐라시에(Tissierellaceae), 파스테우렐라시에(Pasteurellaceae), 카르노박테리아시에(Carnobacteriaceae), 나이세리아시에(Neisseriaceae), 및 알카니보락사시에(Alcanivoracaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 쿠프리아비두스(Cupriavidus), 데이노코커스(Deinococcus), 클로스트리듐(Clostridium), 디알리스터(Dialister), 패칼리박테리움(Faecalibacterium), 락토바실러스(Lactobacillus), 시트로박터(Citrobacter), 마이크로코커스(Micrococcus), 코리네박테리움(Corynebacterium), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 아내로코커스(Anaerococcus), 포르피로모나스(Porphyromonas), 프레보텔라(Prevotella), 베일로넬라(Veillonella), 로티아(Rothia), 엑티노마이세스(Actinomyces), 헤모필루스(Haemophilus), 펩토니펠러스(Peptoniphilus), 카프노사이토파가(Capnocytophaga), 라우트로피아(Lautropia), 그라눌리카텔라(Granulicatella), 피네골디아(Finegoldia), 나이세리아(Neisseria), 셀레노모나스(Selenomonas), 및 알카니보락스(Alcanivorax)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 정상인 및 피검자 샘플은 혈액인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 시아노박테리아(Cyanobacteria), 써미(Thermi), 및 유리아케오타(Euryarchaeota)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
    데이노코키(Deinococci), 클로로플라스트(Chloroplast), 및 베타프로테오박테리아(Betaproteobacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
    데이노코카레스(Deinococcales), 리케치아레스(Rickettsiales), 스트렙토피타(Streptophyta), 리조비알레스(Rhizobiales), 오세아노스피릴라레스(Oceanospirillales), 파스테우렐라레스(Pasteurellales), 및 나이세리아레스(Neisseriales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
    에리스로박테라시에(Erythrobacteraceae), 로도스피릴라시에(Rhodospirillaceae), 데이노코카시에(Deinococcaceae), 노카르디오이다시에(Nocardioidaceae), 옥살로박테라시에(Oxalobacteraceae), 미토콘드리아(mitochondria), 락토바실라시에(Lactobacillaceae), 루미노코카시에(Ruminococcaceae), 할로모나다시에(Halomonadaceae), 마이크로코카세아에(Micrococcaceae), 코리네박테리아시에(Corynebacteriaceae), 프로피박테리아시에(Propionibacteriaceae), 프레보텔라시에(Prevotellaceae), 버크홀데리아시에(Burkholderiaceae), 엑티노마이세타시에(Actinomycetaceae), 티시에렐라시에(Tissierellaceae), 파스테우렐라시에(Pasteurellaceae), 카르노박테리아시에(Carnobacteriaceae), 나이세리아시에(Neisseriaceae), 및 알카니보락사시에(Alcanivoracaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
    쿠프리아비두스(Cupriavidus), 데이노코커스(Deinococcus), 클로스트리듐(Clostridium), 디알리스터(Dialister), 패칼리박테리움(Faecalibacterium), 락토바실러스(Lactobacillus), 시트로박터(Citrobacter), 마이크로코커스(Micrococcus), 코리네박테리움(Corynebacterium), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 아내로코커스(Anaerococcus), 포르피로모나스(Porphyromonas), 프레보텔라(Prevotella), 베일로넬라(Veillonella), 로티아(Rothia), 엑티노마이세스(Actinomyces), 헤모필루스(Haemophilus), 펩토니펠러스(Peptoniphilus), 카프노사이토파가(Capnocytophaga), 라우트로피아(Lautropia), 그라눌리카텔라(Granulicatella), 피네골디아(Finegoldia), 나이세리아(Neisseria), 셀레노모나스(Selenomonas), 및 알카니보락스(Alcanivorax)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여,
    베타프로테오박테리아(Betaproteobacteria) 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
    오세아노스피릴라레스(Oceanospirillales), 파스테우렐라레스(Pasteurellales), 및 나이세리아레스(Neisseriales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
    마이크로코카세아에(Micrococcaceae), 코리네박테리아시에(Corynebacteriaceae), 프로피박테리아시에(Propionibacteriaceae), 프레보텔라시에(Prevotellaceae), 버크홀데리아시에(Burkholderiaceae), 엑티노마이세타시에(Actinomycetaceae), 티시에렐라시에(Tissierellaceae), 파스테우렐라시에(Pasteurellaceae), 카르노박테리아시에(Carnobacteriaceae), 나이세리아시에(Neisseriaceae), 및 알카니보락사시에(Alcanivoracaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
    마이크로코커스(Micrococcus), 코리네박테리움(Corynebacterium), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 아내로코커스(Anaerococcus), 포르피로모나스(Porphyromonas), 프레보텔라(Prevotella), 베일로넬라(Veillonella), 로티아(Rothia), 엑티노마이세스(Actinomyces), 헤모필루스(Haemophilus), 펩토니펠러스(Peptoniphilus), 카프노사이토파가(Capnocytophaga), 라우트로피아(Lautropia), 그라눌리카텔라(Granulicatella), 피네골디아(Finegoldia), 나이세리아(Neisseria), 셀레노모나스(Selenomonas), 및 알카니보락스(Alcanivorax)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 증가되어 있는 경우 림프종으로 진단하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여,
    시아노박테리아(Cyanobacteria), 써미(Thermi), 및 유리아케오타(Euryarchaeota)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
    데이노코키(Deinococci) 및 클로로플라스트(Chloroplast)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
    데이노코카레스(Deinococcales), 리케치아레스(Rickettsiales), 스트렙토피타(Streptophyta), 및 리조비알레스(Rhizobiales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
    에리스로박테라시에(Erythrobacteraceae), 로도스피릴라시에(Rhodospirillaceae), 데이노코카시에(Deinococcaceae), 노카르디오이다시에(Nocardioidaceae), 옥살로박테라시에(Oxalobacteraceae), 미토콘드리아(mitochondria), 락토바실라시에(Lactobacillaceae), 루미노코카시에(Ruminococcaceae), 및 할로모나다시에(Halomonadaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
    쿠프리아비두스(Cupriavidus), 데이노코커스(Deinococcus), 클로스트리듐(Clostridium), 디알리스터(Dialister), 패칼리박테리움(Faecalibacterium), 락토바실러스(Lactobacillus), 및 시트로박터(Citrobacter)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소되어 있는 경우 림프종으로 진단하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  11. 하기의 단계를 포함하는, 림프종 진단방법:
    (a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 시아노박테리아(Cyanobacteria), 써미(Thermi), 및 유리아케오타(Euryarchaeota)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 진단방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 데이노코키(Deinococci), 클로로플라스트(Chloroplast), 및 베타프로테오박테리아(Betaproteobacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 진단방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 데이노코카레스(Deinococcales), 리케치아레스(Rickettsiales), 스트렙토피타(Streptophyta), 리조비알레스(Rhizobiales), 오세아노스피릴라레스(Oceanospirillales), 파스테우렐라레스(Pasteurellales), 및 나이세리아레스(Neisseriales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 진단방법.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 에리스로박테라시에(Erythrobacteraceae), 로도스피릴라시에(Rhodospirillaceae), 데이노코카시에(Deinococcaceae), 노카르디오이다시에(Nocardioidaceae), 옥살로박테라시에(Oxalobacteraceae), 미토콘드리아(mitochondria), 락토바실라시에(Lactobacillaceae), 루미노코카시에(Ruminococcaceae), 할로모나다시에(Halomonadaceae), 마이크로코카세아에(Micrococcaceae), 코리네박테리아시에(Corynebacteriaceae), 프로피박테리아시에(Propionibacteriaceae), 프레보텔라시에(Prevotellaceae), 버크홀데리아시에(Burkholderiaceae), 엑티노마이세타시에(Actinomycetaceae), 티시에렐라시에(Tissierellaceae), 파스테우렐라시에(Pasteurellaceae), 카르노박테리아시에(Carnobacteriaceae), 나이세리아시에(Neisseriaceae), 및 알카니보락사시에(Alcanivoracaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 진단방법.
  16. 제11항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 쿠프리아비두스(Cupriavidus), 데이노코커스(Deinococcus), 클로스트리듐(Clostridium), 디알리스터(Dialister), 패칼리박테리움(Faecalibacterium), 락토바실러스(Lactobacillus), 시트로박터(Citrobacter), 마이크로코커스(Micrococcus), 코리네박테리움(Corynebacterium), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 아내로코커스(Anaerococcus), 포르피로모나스(Porphyromonas), 프레보텔라(Prevotella), 베일로넬라(Veillonella), 로티아(Rothia), 엑티노마이세스(Actinomyces), 헤모필루스(Haemophilus), 펩토니펠러스(Peptoniphilus), 카프노사이토파가(Capnocytophaga), 라우트로피아(Lautropia), 그라눌리카텔라(Granulicatella), 피네골디아(Finegoldia), 나이세리아(Neisseria), 셀레노모나스(Selenomonas), 및 알카니보락스(Alcanivorax)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 진단방법.
  17. 제11항에 있어서,
    상기 정상인 및 피검자 샘플은 혈액인 것을 특징으로 하는, 진단방법.
  18. 제11항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 시아노박테리아(Cyanobacteria), 써미(Thermi), 및 유리아케오타(Euryarchaeota)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
    데이노코키(Deinococci), 클로로플라스트(Chloroplast), 및 베타프로테오박테리아(Betaproteobacteria)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
    데이노코카레스(Deinococcales), 리케치아레스(Rickettsiales), 스트렙토피타(Streptophyta), 리조비알레스(Rhizobiales), 오세아노스피릴라레스(Oceanospirillales), 파스테우렐라레스(Pasteurellales), 및 나이세리아레스(Neisseriales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
    에리스로박테라시에(Erythrobacteraceae), 로도스피릴라시에(Rhodospirillaceae), 데이노코카시에(Deinococcaceae), 노카르디오이다시에(Nocardioidaceae), 옥살로박테라시에(Oxalobacteraceae), 미토콘드리아(mitochondria), 락토바실라시에(Lactobacillaceae), 루미노코카시에(Ruminococcaceae), 할로모나다시에(Halomonadaceae), 마이크로코카세아에(Micrococcaceae), 코리네박테리아시에(Corynebacteriaceae), 프로피박테리아시에(Propionibacteriaceae), 프레보텔라시에(Prevotellaceae), 버크홀데리아시에(Burkholderiaceae), 엑티노마이세타시에(Actinomycetaceae), 티시에렐라시에(Tissierellaceae), 파스테우렐라시에(Pasteurellaceae), 카르노박테리아시에(Carnobacteriaceae), 나이세리아시에(Neisseriaceae), 및 알카니보락사시에(Alcanivoracaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
    쿠프리아비두스(Cupriavidus), 데이노코커스(Deinococcus), 클로스트리듐(Clostridium), 디알리스터(Dialister), 패칼리박테리움(Faecalibacterium), 락토바실러스(Lactobacillus), 시트로박터(Citrobacter), 마이크로코커스(Micrococcus), 코리네박테리움(Corynebacterium), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 아내로코커스(Anaerococcus), 포르피로모나스(Porphyromonas), 프레보텔라(Prevotella), 베일로넬라(Veillonella), 로티아(Rothia), 엑티노마이세스(Actinomyces), 헤모필루스(Haemophilus), 펩토니펠러스(Peptoniphilus), 카프노사이토파가(Capnocytophaga), 라우트로피아(Lautropia), 그라눌리카텔라(Granulicatella), 피네골디아(Finegoldia), 나이세리아(Neisseria), 셀레노모나스(Selenomonas), 및 알카니보락스(Alcanivorax)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 진단방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여,
    베타프로테오박테리아(Betaproteobacteria) 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
    오세아노스피릴라레스(Oceanospirillales), 파스테우렐라레스(Pasteurellales), 및 나이세리아레스(Neisseriales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
    마이크로코카세아에(Micrococcaceae), 코리네박테리아시에(Corynebacteriaceae), 프로피박테리아시에(Propionibacteriaceae), 프레보텔라시에(Prevotellaceae), 버크홀데리아시에(Burkholderiaceae), 엑티노마이세타시에(Actinomycetaceae), 티시에렐라시에(Tissierellaceae), 파스테우렐라시에(Pasteurellaceae), 카르노박테리아시에(Carnobacteriaceae), 나이세리아시에(Neisseriaceae), 및 알카니보락사시에(Alcanivoracaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
    마이크로코커스(Micrococcus), 코리네박테리움(Corynebacterium), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 아내로코커스(Anaerococcus), 포르피로모나스(Porphyromonas), 프레보텔라(Prevotella), 베일로넬라(Veillonella), 로티아(Rothia), 엑티노마이세스(Actinomyces), 헤모필루스(Haemophilus), 펩토니펠러스(Peptoniphilus), 카프노사이토파가(Capnocytophaga), 라우트로피아(Lautropia), 그라눌리카텔라(Granulicatella), 피네골디아(Finegoldia), 나이세리아(Neisseria), 셀레노모나스(Selenomonas), 및 알카니보락스(Alcanivorax)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 증가되어 있는 경우 림프종으로 진단하는 것을 특징으로 하는, 진단방법.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서, 정상인 유래 샘플과 비교하여,
    시아노박테리아(Cyanobacteria), 써미(Thermi), 및 유리아케오타(Euryarchaeota)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
    데이노코키(Deinococci) 및 클로로플라스트(Chloroplast)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
    데이노코카레스(Deinococcales), 리케치아레스(Rickettsiales), 스트렙토피타(Streptophyta), 및 리조비알레스(Rhizobiales)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
    에리스로박테라시에(Erythrobacteraceae), 로도스피릴라시에(Rhodospirillaceae), 데이노코카시에(Deinococcaceae), 노카르디오이다시에(Nocardioidaceae), 옥살로박테라시에(Oxalobacteraceae), 미토콘드리아(mitochondria), 락토바실라시에(Lactobacillaceae), 루미노코카시에(Ruminococcaceae), 및 할로모나다시에(Halomonadaceae)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
    쿠프리아비두스(Cupriavidus), 데이노코커스(Deinococcus), 클로스트리듐(Clostridium), 디알리스터(Dialister), 패칼리박테리움(Faecalibacterium), 락토바실러스(Lactobacillus), 및 시트로박터(Citrobacter)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량이 감소되어 있는 경우 림프종으로 진단하는 것을 특징으로 하는, 진단방법.
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